WO2006049273A1 - リガンドに特異的に結合するタンパク質を効率的に選別する手法 - Google Patents

リガンドに特異的に結合するタンパク質を効率的に選別する手法 Download PDF

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Kunihiro Ohta
Hidetaka Seo
Takehiko Shibata
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Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting a protein that specifically binds to a specific ligand.
  • Non-Patent Document 1 Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 3576— 3580, 1 992
  • Non-Patent Document 2 Cumbers et al., Nat. Biotechnol., 20: 1129— 1134, 2002 Disclosure of the Invention
  • the present inventors conducted extensive research on a method for selecting a protein exhibiting specific binding to a target ligand from a diversified library, and as a result, identified a protein that specifically binds to the target ligand.
  • the present invention has found a method that can be facilitated and made efficient.
  • the present invention relates to a method for selecting a protein that specifically binds to a target ligand from a diversified library.
  • the present inventors When screening proteins using the affinity for a ligand as an index, the present inventors non-specifically determine the target ligand non-specifically by measuring and comparing not only the target ligand but also the affinity for the control ligand at the same time. Thus, the present inventors have completed a method for easily and efficiently identifying a desired protein.
  • the present invention relates to the following (1) to (11).
  • the invention according to the first embodiment of the present invention is a method for selecting at least one protein that specifically binds to a target ligand from a diversified library
  • step (b) contacting the target ligand with at least several proteins selected in step (a), incubating a mixture of the protein and the target ligand, and confirming the binding properties of the protein and the target ligand;
  • step (c) contacting at least some proteins selected in step (a) with one or two specific control ligands, incubating a mixture of the protein and control ligand, and then reacting the protein and control ligand Determining whether or not are combined, and
  • step (d) a step of selecting a protein that has been confirmed to bind to the target ligand in step (b) and has not bound to the control ligand in step (c);
  • a method comprising:
  • the invention according to the second embodiment of the present invention is as follows: “The protein to be contacted with the target ligand in the step (a) is presented on the surface of a host (1 ) ”.
  • the invention according to the third embodiment of the present invention is as described in (1) or (2) above, wherein the target ligand and Z or control ligand are bound to a carrier. It's a method.
  • the invention according to the fourth embodiment of the present invention is “the method according to (3) above, wherein the carrier is a magnetic bead”.
  • the invention according to the fifth embodiment of the present invention is as follows: “Determination of the presence or absence of binding in the step (b) is performed by ELISA method, RIA method, surface plasmon resonance (SPR) method, blotting method, ligand bead The method described in (1) above and (4) above, which is carried out by a method selected from the group consisting of methods using a process.
  • the invention according to the sixth embodiment of the present invention is “the method according to (5) above, wherein the target ligand and / or the control ligand are labeled”.
  • the invention according to the eighth embodiment of the present invention is “the method according to (7) above, wherein the protein expression library is an antibody expression library”.
  • the invention according to the ninth embodiment of the present invention is characterized in that the“ antibody expression library is a library constituted by cells presenting antibodies on the cell surface ” 8) The described method ”.
  • the invention according to the tenth embodiment of the present invention is “the method according to (9) above, wherein the cell is a DT40 cell”
  • the invention according to the eleventh embodiment of the present invention is “a protein selected by the method according to any one of (1) to (10) above”.
  • the invention's effect [0007] By using the method according to the present invention, a protein that specifically binds to a target ligand can be rapidly and efficiently selected from a diversified library.
  • Fig. 1 shows the production of antibodies that specifically bind to streptavidin using streptavidin magnetic beads from a diversified library of chicken DT40 cells displaying various antibody molecules on the cell surface. The results of ELISA using the cell culture supernatant are shown. The 22nd clone (arrow) is SD-10.
  • FIG. 2 shows the results of ELISA using an egg white lysozyme rather than ovalbumin as a target antigen when selecting anti-rabbit IgG antibodies.
  • Fig. 3 shows the detailed examination of the specificity of the antibodies finally selected in Fig. 1 for various ligands (streptavidin, ovalbumin, WgG (human IgG), skim milk) by ELISA. Show.
  • the “diversified library” in the present invention means a library that can display a wide variety of proteins.
  • the method according to the present invention can be applied to any library that can present a wide variety of proteins.
  • a phage library capable of expressing various proteins and a library of cells capable of displaying various proteins on the cell surface are available.
  • a library of cells capable of presenting antibody molecules is suitable.
  • the “cell library” a library composed of chicken-derived DT40 cells capable of presenting various antibody molecules on the cell surface can be used (WO2004 / 011644).
  • the “protein” in the present invention includes, in addition to naturally-occurring proteins, two or more amino acids such as mutants thereof, polypeptides constituting a part thereof, and artificially synthesized peptides. , A peptide bond) and the like.
  • the “protein expression library” in the present invention is the above-mentioned “diversification library”. It is a concept that represents a host population that is included and can express a wide variety of proteins.
  • the “host” includes a force S that can be assumed by those skilled in the art based on common general technical knowledge, such as prokaryotic cells, eukaryotic cells, phages or viruses.
  • the protein expressed by the “host” may be expressed on the cell surface or in the cell of the “host”, or the protein may be cultured by culturing the “host”. May be expressed in a medium suitable for expressing.
  • a “protein expression library” that can be applied to the method according to the present invention can be purchased commercially.
  • the "antibody expression library” in the present invention is included in the above-mentioned "protein expression library” and is a concept representing a host population capable of expressing a wide variety of antibody molecules.
  • the term “host” includes any force that can be assumed by those skilled in the art based on common general knowledge, such as prokaryotic cells, eukaryotic cells, phages or viruses, and preferably eukaryotic cells and phages. More preferred are animal cells and phages, and particularly preferred are DT40 cells and Ramos cells.
  • target ligand and control ligand in the present invention are not particularly limited as long as they bind to a protein.
  • proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates, low molecular compounds, etc. Include all that can be envisioned by those skilled in the art.
  • control ligand” in the present invention may be any as long as it binds to a protein, and is not limited.
  • control ligand used in the present invention may be one type or a plurality of types, but is not limited. For example, it may be two types or less, preferably one type. It is possible to select egg white lysozyme or ovalbumin, etc., in relation to the “target ligand”, such as multiple types of proteins, lipids, and carbohydrates contained in luc.
  • target ligand or “control ligand” may be labeled, and any method and substance may be used as long as the label is a method and a labeled compound usually used in the art. Although not limited, a fluorescent label etc. can be used conveniently. 3. Selection of proteins that bind to the target ligand
  • a protein that binds to a target ligand can be selected based on ordinary knowledge in the art.
  • the target ligand is bound to an appropriate carrier, the bound target ligand is brought into contact with the protein present in the diversified library, incubated under appropriate conditions, and the resulting carrier-target ligand-protein complex. Can be recovered by centrifugation or the like, and a protein that binds to the target ligand can be selected.
  • a protein that binds to the target ligand is obtained, if the host that expresses the protein is not a single clone, a single clone can be obtained by the limiting dilution method and subculture. Some of the proteins thus obtained bind with a different affinity to the target ligand.
  • carrier used herein is not limited, and suitable ones such as sepharose beads, agarose beads, glass substrates, magnetic beads, etc. can be used, but magnetic beads are particularly preferred.
  • Conditions for allowing the target ligand to bind to the protein can be set by those skilled in the art depending on the target ligand. Although there is no particular limitation, for example, when the protein to be selected is an antibody molecule, conditions for incubation at about 4 ° C to 37 ° C for about 15 minutes to 24 hours are set. can do.
  • the protein force obtained as binding to the target ligand can be confirmed by a method well known in the art, for example, ELISA, RIA, surface, and the like.
  • a plasmon resonance (SPR) method, a blotting method, a method using ligand beads, and the like can be used.
  • the target ligand used here may be a labeled one.
  • a substance that specifically binds to a protein that specifically binds to the target ligand for example, a protein such as an antibody, a nucleic acid, a lipid, etc.
  • the binding specificity between the target ligand and the protein can be confirmed by an ordinary method using the non-substance.
  • control ligand used here may be labeled.
  • a substance that specifically binds to a protein that specifically binds to the control ligand for example, a protein such as an antibody, a nucleic acid, a lipid, etc.
  • the binding specificity between the control ligand and the protein can be confirmed by a conventional method using the non-existing substance.
  • a protein binds to the target ligand but does not bind to the control ligand depends on the method used.For example, the strength of the binding is expressed by the OD value (binding between the protein and the ligand). (Absorbance measured at a wavelength suitable for detecting), etc., indicating the binding with the target ligand. ⁇ D. Value / OD value indicating the binding with the control ligand is at least 2 or more, when ovalbumin is used as a control ligand, at least 1.0 or more, and when egg white lysozyme is used as a control ligand, when it is at least 0.7 or more, it specifically binds to the target ligand and Can be determined to be a protein having no binding property.
  • the protein obtained through the above steps can be determined to be a protein that specifically binds to the target ligand.
  • an antibody that specifically binds to streptavidin from a population of DT40 cells that induces somatic cell recombination at an immunoglobulin locus and produces various immunoglobulin molecules A method for selecting molecules will be described. See WO2004 / 011644 for the method of preparing the DT40 cell population.
  • MDM medium (Invitrogen) was used with the addition of 10% FBS, 1% chicken serum, 100 units of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin, and 55 ⁇ of 2-mercaptoethanol.
  • Trichostatin ⁇ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in methanol at 5 mg / ml as a stock and diluted with a suitable medium so that the final concentration was 2.5 ng / ml. Culturing was continued while maintaining the cell concentration at 10 5 to 10 6 cells / ml.
  • Dynabeads M-280 Tosylactivated (Dynal) was used as the magnetic bead, and Dynal MPC (Dynal) was used as the magnetic stand. Wash 200 ⁇ 1 of beads 3 times with 500 ⁇ 1 of buffer ⁇ (0.1 M sodium diphosphate, pH 7.4), and then use 240 xg streptavidin (Nacalai Tester) in 400 ⁇ of Nouffer ⁇ . For 24 hours at 37 ° C with stirring by rotation. The beads were then washed twice with 500 xl of buffer C (10 mM sodium phosphate, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% BSA). Thereafter Buffer D (0. 2M Tri s-HCl , pH8. 5, 0.
  • Dynabeads M-280 Tosylactivated (Dynal) was used as the magnetic bead, and Dynal MPC (Dynal) was used as the magnetic stand. Wash 200 ⁇ l of beads 3 times with 500 ⁇ l of buffer A (0.1 M sodium phosphate, pH 7.4), and then add 150 g of Usagi IgG (SIGMA) with Knoffer A at 200 mm. The reaction was carried out at 37 ° C with stirring by rotation. The beads were then washed twice with 200 C l of buffer C (10 mM sodium phosphate, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% BSA).
  • buffer A 0.1 M sodium phosphate, pH 7.4
  • SIGMA Usagi IgG
  • Nother D (0.2M Tris-HCl, pH 8.5, 0.1% BSA) (200 zl) was added, and the mixture was allowed to react at 37 ° C for 4 hours with rotation while stirring, followed by blocking. Thereafter, the plate was washed twice with 500 ⁇ of buffer C and then suspended in 200 ⁇ l of buffer C containing 0.02% sodium azide.
  • the cells bound to the magnetic beads were suspended in 500 ⁇ , added to 30 ml of medium, dispensed into a 96-well plate at 300 ⁇ , and cultured at 39.5 ° C.
  • ELISA was performed on the culture supernatant.
  • Table 1 shows the ELISA results for antibodies that react with streptavidin (28 clones in total) as 0 ⁇ D. Values, and the ELISA results for reactivity with ovalbumin from the same clones are also shown as 0 ⁇ D. Values. Show. Figure 1 is a graphic representation of Table 1.
  • the culture supernatant used for analyzing the further specificity by ELISA was a medium prepared as follows in order to remove serum-derived IgM and the like. Immunoglobulin was removed as a precipitate from chicken serum (Invitrogen) with 50% saturated ammonium sulfate, and the supernatant was dialyzed against PBS. The volume increase caused by dialysis was corrected by concentration with Centri Prep (Amicon) to obtain antibody-removed chicken serum. This was prepared in AIM-V serum-free medium (Invitrogen) at a concentration of 6%. Cells were collected here at a concentration of about 10 6 / ml, cultured for 2 days, and the culture supernatant was removed and ELI SA was performed.
  • the plate was washed 5 times with 200 ⁇ l of ELISA wash buffer, and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-negri IgM antibody was diluted 2,000 times with PBS and added in 100 ⁇ l aliquots. After reacting at room temperature for 45 minutes, the plate was washed 5 times with an ELISA wash buffer, and then TMB + was added at 100 / il and reacted at room temperature for 4 minutes. Quantification was performed by measuring absorbance at 450 nm with an mQuant Biomolecular Spectrometer.
  • Figure 2 shows the results of ELISA for specificity verification. It was confirmed that SD-10-1 obtained by ultradiluting SD-10 shown in Fig. 1 reacts strongly only with the initial target streptavidin. When the present invention is not applied, it is necessary to carry out the same process for 28 clones, so it has been found that there is a cost reduction effect of at least 28 times.

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Abstract

　本発明は、特定のリガンドに対し特異的に結合するタンパク質を選別する方法に関する。 　多様化ライブラリーから、目的リガンドに特異的に結合するタンパク質を選択する方法であって、該ライブラリー中に存在するタンパク質と目的リガンドを接触させ、目的リガンドに結合するタンパク質を選択する工程、得られたタンパク質を対照リガンドと接触させ、該タンパク質と対照リガンドとの結合性の有無を判定する工程、および、対照リガンドとの結合性を有しないと判定された該タンパク質を選択する工程、を含んで成る方法。

Description

明 細 書
リガンドに特異的に結合するタンパク質を効率的に選別する手法 技術分野
[0001] 本発明は、特定のリガンドに対し特異的に結合するタンパク質を選別する方法に関 する。
背景技術
[0002] タンパク質、核酸または脂質など、生体内で様々な役割を担っている生体内因子 は、酵素などのように単独でその機能を発揮するものも多いが、生体内因子同士の 相互作用を通じて、情報を伝達してレ、くことで、種々の生体内反応を誘導または制御 していることが知られている。従って、生体内因子同士の相互作用を正確に解明して レ、くことは、生体内反応を理解する上で重要であり、さらに、そのような反応機構に関 する知識の蓄積により、特定の疾患等の治療方法または治療剤などの開発への手 掛力^としても極めて有用なことであると考えられる。
[0003] 生体内因子同士の相互作用、特に、タンパク質 (例えば、抗体、受容体など）とその 特異的リガンド (例えば、タンパク質、低分子化合物、脂質、糖鎖など）を研究する一 つの手法として、ファージディスプレイ等の多様化ライブラリーから特定リガンドに特 異的に結合するタンパク質を選別する方法などを挙げることができる。これらの方法 において特定のリガンドに特異的に結合するタンパク質を同定する場合に、リガンド への特異性や親和性を ELISA (酵素免疫測定法)や RIAによって測定し、 目的リガ ンドに特異的に結合する分子を選別することが多い (非特許文献 1、非特許文献 2)。
[0004] 非特許文献 1 : Gramら， Proc. Natl. Acad. Sci. , 89 : 3576— 3580, 1 992
非特許文献 2 : Cumbersら， Nat. Biotechnol. , 20 : 1129— 1134, 2002 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 多様化ライブラリーが生み出すタンパク質などの生体内因子の多くが、 目的のリガ ンド以外の因子に対しても非特異的な結合性を示すという問題点が確認されている。 これにより、 目的のリガンドへの結合性のみを指標に一次スクリーニングを行うと、過 半が非特異的結合性因子となって、必要とされる特異的結合性を示す因子の取得が 著しく困難になることが判明している。
本発明者らは、上記事情に鑑み、多様化ライブラリーから目的のリガンドに特異的 結合性を示すタンパク質の選別方法について鋭意研究を行った結果、 目的リガンド に特異的に結合するタンパク質の同定を容易化および効率化できる方法を見出した 本発明は、多様化ライブラリーから目的リガンドに特異的に結合するタンパク質を選 別する方法に関する。
課題を解決するための手段
本発明者らは、リガンドに対する親和性を指標にタンパク質のスクリーニングを行な う際に、 目的リガンドのみならず、対照リガンドに対する親和性を同時に測定し、比較 することで、非特異的に目的リガンドに結合するタンパク質を排除し、所望のタンパク 質を容易かつ効率的に同定する方法を完成するに至った。
すなわち、本発明、以下の（1)〜（11)に関する。
(1)本発明の第 1の実施態様に係る発明は、「多様化ライブラリーから、 目的リガンド に特異的に結合する少なくとも一種のタンパク質を選択する方法であって、
(a)該ライブラリ一中に存在する種々のタンパク質と目的リガンドを接触させ、該タン パク質群と目的リガンドの混合物をインキュベートし、少なくとも一種のタンパク質と目 的リガンドの複合体を回収する工程
(b)工程 (a)で選別された少なくとも数種のタンパク質と目的リガンドと接触させ、該タ ンパク質と目的リガンドの混合物をインキュベートし、該タンパク質と目的リガンドの結 合性を確認する工程、
(c)工程 (a)で選別された少なくとも数種のタンパク質を 1種類又は 2種類の特定の対 照リガンドと接触させ、該タンパク質と対照リガンドの混合物をインキュベートし、該タ ンパク質と対照リガンドが結合したかどうかを判別する工程、および、
(d)工程 (b)において目的リガンドとの結合性が確認され、かつ、工程（c)において 対照リガンドと結合しなかったタンパク質を選択する工程、 を含んで成る方法」である。
(2)本発明の第 2の実施態様に係る発明は、「前記工程 (a)において前記目的リガン ドと接触させるタンパク質が、宿主の表面上に提示されていることを特徴とする上記（ 1)に記載の方法」である。
(3)本発明の第 3の実施態様に係る発明は、「前記目的リガンドおよび Zまたは対照 リガンドが担体に結合してレ、ることを特徴とする上記（1)または（2)に記載の方法」で ある。
(4)本発明の第 4の実施態様に係る発明は、「前記担体が磁気ビーズであることを特 徴とする上記（3)に記載の方法」である。
(5)本発明の第 5の実施態様に係る発明は、「前記工程 (b)における結合性の有無 の判定を、 ELISA法、 RIA法、表面プラズモン共鳴（SPR)法、ブロット法、リガンドビ ーズを用いた方法から成る群より選択される方法によって実施されることを特徴とする 上記（1)なレ、し (4)のレ、ずれかに記載の方法」である。
(6)本発明の第 6の実施態様に係る発明は、「前記目的リガンドおよび/または対照 リガンドが標識されていることを特徴とする上記（5)に記載の方法」である。
(7)本発明の第 7の実施態様に係る発明は、「前記多様化ライブラリーが、タンパク質 発現ライブラリーであることを特徴とする上記（1)ないし (6)のいずれかに記載の方法 」である。
(8)本発明の第 8の実施態様に係る発明は、「前記タンパク質発現ライブラリーが、抗 体発現ライブラリーであることを特徴とする上記（7)に記載の方法」である。
(9)本発明の第 9の実施態様に係る発明は」、「前記抗体発現ライブラリーが、抗体を 細胞表面上に提示した細胞によって構成されるライブラリーであることを特徴とする上 記（8)記載の方法」である。
(10)本発明の第 10の実施態様に係る発明は、「前記細胞が DT40細胞であることを 特徴とする上記（9)に記載の方法」
(11)本発明の第 11の実施態様に係る発明は、「上記（1)ないし（10)のいずれかに 記載の方法により選択されたタンパク質」である。
発明の効果 [0007] 本発明に係る方法を用いることにより、多様化ライブラリーから、 目的のリガンドに特 異的に結合するタンパク質を迅速、かつ、効率的に選別することができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1は、種々の抗体分子をそれぞれ細胞表面に提示したニヮトリ DT40細胞の 多様化ライブラリーから、ストレプトアビジン磁気ビーズによりストレプトアビジンに特異 的に結合性を示す抗体を産生する細胞を選択し、細胞培養上清を用いて ELISAを 行った結果を示す。 22番クローン（矢印）が、 SD— 10。
[図 2]図 2は、抗ゥサギ IgG抗体を選別する際、オボアルブミンではなく卵白リゾチ一 ムを対象抗原として用い ELISAを行った結果を示す。
[図 3]図 3は、図 1で最終的に選別された抗体の種々のリガンド (ストレプトアビジン、ォ ボアルブミン、 WgG (ヒト IgG)、スキムミルク）に対する特異性を ELISAにより詳細に 検討した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 1.多様化ライブラリー
本発明における「多様化ライブラリー」とは、多種多様なタンパク質を提示することが できるライブラリーのことを意味する。多種多様なタンパク質を提示することができるラ イブラリーであれば如何なるものに対しても、本発明に係る方法を適用することができ る。限定はしないが、例えば、多様なタンパク質を発現することができるファージライ ブラリー、細胞表面に多様なタンパク質を提示することができる細胞のライブラリーな どが利用可能であり、特に、細胞表面に多様化抗体分子を提示することができる細 胞のライブラリーなどが適している。ここで、前記「細胞のライブラリー」としては、細胞 表面上に多様な抗体分子を提示することができるニヮトリ由来の DT40細胞によって 構成されるライブラリーなどが利用可能である（WO2004/011644)。
本発明における「タンパク質」には、天然由来のタンパク質以外に、その変異体、そ の一部を構成するポリペプチド、さらには、人工的に合成されたペプチドなど、 2以上 アミノ酸が共有結合 (例えば、ペプチド結合)などによって結合された分子が含まれる 概念である。
本発明における「タンパク質発現ライブラリー」とは、上述の「多様化ライブラリー」に 含まれるものであって、多種多様なタンパク質を発現することができる宿主集団など を表す概念である。ここで「宿主」としては、当業者が技術常識に基づいて想定可能 もものの全てが含まれる力 S、例えば、原核細胞、真核細胞、ファージまたはウィルス、 などが含まれる。また、「宿主」により発現されるタンパク質は、該「宿主」の細胞内で 発現されてもよぐ細胞表面上に発現されもよぐまたは、該「宿主」を培養して該タン ノ ク質を発現させるために適した培地中に発現されてもよい。本発明に係る方法に 適用することができる「タンパク質発現ライブラリー」は市販品を購入することもできる
[0010] 本発明における「抗体発現ライブラリー」とは、上述の「タンパク質発現ライブラリー」 に含まれるものであって、多種多様な抗体分子を発現することができる宿主集団など を表す概念である。宿主」としては、当業者が技術常識に基づいて想定可能もものの 全てが含まれる力 例えば、原核細胞、真核細胞、ファージまたはウィルス、などが含 まれ、好ましくは、真核細胞、ファージであり、より好ましくは、動物細胞、ファージであ り、特に好ましくは、 DT40細胞および Ramos細胞である。
[0011] 2. 目的リガンドおよび対照リガンド
本発明における「目的リガンド」および「対照リガンド」は、タンパク質と結合するもの であれば如何なるものであってもよぐ限定はしないが、例えば、タンパク質、核酸、 脂質、糖質、低分子化合物など、当業者が想定し得るものの全てを包含する。また、 本発明における「対照リガンド」は、タンパク質と結合するものであれば如何なるもの であってもよく、限定はしないが、例えば、タンパク質、核酸、脂質、糖質、低分子化 合物など、当業者が想定し得るものの全てを包含するが、好ましくは、「目的リガンド」 との関係において、「目的リガンド」のアミノ酸配列との間にけるアミノ酸同一性が低く (およそ 30%以下、より好ましくは、 20%以下、さらに好ましくは 10%以下である）、 かつその「対照リガンド」自体が非特異的な結合活性を有さなレ、ものである。本発明 において用いられる「対照リガンド」は、 1種類であっても、複数種類であってもよぐ 限定はしないが、例えば、 2種類以下、好ましくは 1種類であってもよぐまた、スキムミ ルクに含まれる複数種類のタンパク質、脂質、糖質など、卵白リゾチーム又はオボァ ルブミンなどを「目的リガンド」との関係において選択することが可能である。 また、「目的リガンド」または「対照リガンド」は、標識されていてもよぐ該標識は当該 技術分野において通常用いられる方法および標識化合物であれば、如何なる方法 および物質を用レ、てもよい。限定はしないが、蛍光標識などが好適に使用できる。 3. 目的リガンドに結合するタンパク質の選択
本発明において、 目的リガンドと結合するタンパク質の選択は当該技術分野におけ る通常の知識に基づいて行なうことができる。例えば、適当な担体に目的リガンドを 結合させ、結合した目的リガンドを多様化ライブラリーに存在するタンパク質と接触さ せ、適切な条件下でインキュベートした後、生じた担体一目的リガンドータンパク質の 複合体を遠心分離などにより回収し、 目的リガンドと結合するタンパク質を選択するこ とができる。 目的リガンドと結合するタンパク質が得られた場合において、該タンパク 質を発現する宿主が単一クローンでないときには、限界希釈法及びサブカルチャー により単一クローンを得ることができる。このようして得られた幾つかのタンパク質は、 目的リガンドと異なる親和性により結合するものである。
ここで用いられる「担体」としては、限定はしないが、セファロースビーズ、ァガロース ビーズ、ガラス基質、磁気ビーズなど、適切なものを使用することができるが、特に、 磁気ビーズが好ましい。
目的リガンドとタンパク質との結合を行なわせる条件としては、 目的リガンドに応じて 当業者において設定することができる。特に限定はしないが、例えば、選択を望むタ ンパク質が抗体分子である場合には、約 4°C〜37°C程度の温度にて、約 15分〜 24 時間程度インキュベートする条件などを設定することができる。
さらに、 目的リガンドと結合するものとして得られたタンパク質力 目的リガンドと結合 することを確認する方法としては、当該技術分野において周知の方法により行なうこ とができ、例えば、 ELISA法、 RIA法、表面プラズモン共鳴（SPR)法、ブロット法、リ ガンドビーズを用いた方法などが利用可能である。ここで用いられる目的リガンドは標 識されているものを用いてもよい。あるいは、 目的リガンドに特異的に結合するタンパ ク質に特異的に結合する物質 (例えば、抗体などのタンパク質、核酸、脂質など)など が入手可能な場合には、標識されているか、またはされていない該物質を用いて通 常の方法により目的リガンドと該タンパク質との結合特異性を確認することができる。 [0013] 4. 目的リガンドと結合するタンパク質と対照リガンドとの結合性の判定 目的リガンドとの結合性を指標にして選択されたタンパク質と対照リガンドとの結合 性を判定する方法としては、当該技術分野において周知の方法により行なうことがで きる。
例えば、 ELISA法、 RIA法、表面プラズモン共鳴（SPR)法、ブロット法、リガンドビ ーズを用いた方法などが利用可能である。ここで用いられる対照リガンドは標識され ているものを用いてもよい。あるいは、対照リガンドに特異的に結合するタンパク質に 特異的に結合する物質 (例えば、抗体などのタンパク質、核酸、脂質など)などが入 手可能な場合には、標識されている力、またはされていない該物質を用いて通常の 方法により対照リガンドと該タンパク質との結合特異性を確認することができる。
ここで、 目的リガンドとは結合するが対照リガンドとは結合しないタンパク質であるか 否かの判定は、用いる方法によって異なる力 例えば、結合の強さを O. D.値 (タン ノ ク質とリガンドとの結合を検出するのに適した波長により測定される吸光度）などで 表現した場合において、 目的リガンドとの結合性を示す〇. D.値/対照リガンドとの 結合性を示す O. D.値の値が、少なくとも 2以上、オボアルブミンを対照リガンドとし たときには少なくとも 1. 0以上、卵白リゾチームを対照リガンドとしたときには、少なくと も 0. 7以上である場合に、 目的リガンドと特異的に結合し、対照リガンドとは結合性を 有しないタンパク質であると判定することができる。
以上のような工程を経て得られたタンパク質は、 目的リガンドに対して特異的に結 合するタンパク質であると判断することができる。
[0014] 以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例
[0015] 本実施例においては、免疫グロブリン遺伝子座において体細胞組換えを誘発させ 、種々のィムノグロブリン分子を産生している DT40細胞集団の中から、ストレプトアビ ジンに特異的に結合する抗体分子を選別する方法について説明する。該 DT40細 胞集団の調製方法にっレヽては、 WO2004/011644を参照のこと。
[0016] 1.ストレプトアビジンに特異的に結合する抗体の選別 DT40糸田胞は、 5%の C〇恒温槽にて 5%の CO 、 39. 5°Cで培養した。培地は、 I
2 2
MDM培地（Invitrogen社）を用レヽ、 10%FBS、 1 %ニヮトリ血清、ペニシリン 100単位 ml,ストレプトマイシン 100 μ g/ml, 2 _メルカプトエタノール 55 μ Μを加えて使 用した。また、トリコスタチン Α (和光純薬）は、メタノールに 5mg/mlに溶解したもの をストックとし、最終濃度が 2. 5ng/mlとなるように適宜培地で希釈して用いた。細胞 濃度は 105〜106個/ mlに保ちながら培養を続けた。
[0017] ストレプトアビジン磁気ビーズの作製：
磁気ビーズは Dynabeads M— 280 Tosylactivated (Dynal社)を、また磁気ス タンドは Dynal MPC (Dynal社)を用いた。ビーズ 200 μ 1を 500 μ 1のバッファー Α( 0. 1M ジン酸ナ卜リウム、 pH7. 4)で 3回洗った後、ノくッファー Α、 400 μ ΐ中で 240 x gのストレプトアビジン (ナカライテスタ社)と 37°Cで 24時間、回転により攪拌しなが ら反応させた。次にビーズをバッファー C (10mM リン酸ナトリウム、 pH7. 4, 150m M NaCl, 0. 1 % BSA) 500 x lで 2回洗浄した。その後バッファー D (0. 2M Tri s-HCl, pH8. 5, 0. 1 % BSA) 500 μ 1をカロえ、 370Cで 4時間、回転により攪拌し ながら反応させ、ブロッキングを行った。その後 500 μ ΐのバッファー Cで 2回洗浄した 後、 0· 02%アジ化ナトリウムを含むバッファー C、 400 μ ΐに懸濁した。
[0018] ゥサギ IgG磁気ビーズの作製：
磁気ビーズは Dynabeads M— 280 Tosylactivated (Dynal社)を、また磁気ス タンドは Dynal MPC(Dynal社)を用いた。ビーズ 200 μ 1を 500 μ 1のバッファー A (0 . 1M リン酸ナ卜リウム、 pH7. 4)で 3回洗った後、ノ ッファー A、 200〃冲で120 gのゥサギ IgG(SIGMA社)と 37°Cでー晚、回転により攪拌しながら反応させた。次にビ ーズをバッファー C (10mM リン酸ナトリウム、 pH7. 4, 150mM NaCl, 0. 1% B SA) 200 z lで 2回洗净した。その後ノ ッファー D (0. 2M Tris -HCl, pH8. 5, 0. 1% BSA) 200 z lを加え、 37°Cで 4時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッ キングを行った。その後 500 μ ΐのバッファー Cで 2回洗浄した後、 0. 02%アジ化ナト リウムを含むバッファー C、 200 x lに懸濁した。
[0019] ストレプトアビジン磁気ビーズおよびゥサギ IgG磁気ビーズによるセレクション：
トリコスタチン A、 2. 5ng/mlで 7週間処理した野生型 DT40細胞約 5 X 107個を洗 浄バッファー（1%BSAを含む PBS) 10mlで 1回、さらに lmlで一回洗浄したのち、 1 mlの洗浄バッファ一中でストレプトアビジン磁気ビーズ（ゥサギ IgG磁気ビーズによる セレクションの場合はゥサギ IgG磁気ビーズ） 5 X 106個と混合し、 4°Cで 30分間、穏 やかに回転させつつインキュベートした。その後 lmlの洗浄バッファーで 5回洗浄し た。最後に、磁気ビーズに結合した細胞を 500 μ ΐに懸濁し、これを 30mlの培地に加 えたのち、 96穴プレートに 300 μ ΐずつ分注し、 39. 5°Cで培養した。 1週間後、培養 上清で ELISAを行った。
[0020] 2枚のプレートによる ELISA:
2枚の 96穴ィムノプレート 'マキシソープ（NaigeNunc社）を用意し、それぞれに 5 μ g /mlのストレプトアビジン（ナカライテスタ）およびオボアルブミン（Sigma社） (V、ずれも PBSに溶解）を 200 μ 1カ卩え、室温でー晚放置してプレートに固定した（ゥサギ IgG磁 気ビーズによるセレクションの場合は、ゥサギ IgG (SIGMA社）および卵白リゾチーム（ SIGMA社）を用いた）。その後 0. 5%スキムルク 200 μ ΐにより室温で 1時間ブロッキン グし、 ELISA洗浄バッファー（0. 05% Tween20を加えた PBS) 200 μ 1で 3回洗浄 した。ここに細胞培養上清 100 μ 1を加え、室温で 1時間反応させた。なお、ここで培 養上清は、同じものをストレプトアビジン固定プレートとオボアルブミン固定プレートの 両方に（ゥサギ IgG磁気ビーズセレクションの場合はゥサギ IgG固定プレートと卵白リ ゾチーム固定プレート） 100 μ 1ずつ分注した。その後 ELISA洗浄バッファー 200 μ 1 で 5回洗浄し、ホースラディッシュペルォキシダーゼ共役ャギ抗ニヮトリ IgM抗体（Bet hyl社）を PBSにより 2000倍に希釈して 100 μ 1ずつ加えた。室温で 45分間反応後、 ELISA洗浄バッファーで 5回洗浄し、その後 TMB + (Dako社）を 100 μ 1カ卩え、室温 で 4分間反応させた後、 1N硫酸 100 μ ΐにより反応を停止させた。定量は、 mQuant Biomolecular Spectrometer (Bio-Tek Instruments社) (こより 450nmの吸光を 測定して行った。
[0021] [表 1] クローン番号 オボアルブミン (吸光度） ストレプトアビジン (吸光度）
1 0.764 0.724
2 2.26 1.611
3 0.543 0.47
4 0.185 0.155
5 1.378 1.204
6 0.185 0.217
7 0.137 0.131
8 0.276 0.184
9 0.085 0.216
10 0.655 0.506
11 0.183 0, 124
12 0.123 0.051
13 0.079 0.069
14 0.175 0.128
15 0.084 0.079
16 0.057 0.067
17 0.966 0.968
18 0.2 0.153
19 0.833 0.819
20 0.11 0.152
21 0.554 0.282
22 0.176 1.66
23 0.76 0.673
24 0.517 0.432
25 2.883 2.836
26 0.142 0.096
27 0.31 0.288
28 0.134 0.156
ELISAの結果を表 1および図 1に示す。表 1は、ストレプトアビジンに反応する抗体 (全部で 28クローン）の ELISAの結果を 0· D.値で示すと共に、同じクローンのオボ アルブミンとの反応性に関する ELISAの結果も 0. D.値で示している。また、表 1を グラフィ匕したものが、図 1である。
ストレプトアビジンと反応した全 28クローンのうち、その多くがオボアルブミンにも反 応していることが明ら力となった。これらのクローンの一つ（クローン 22:クローン SD—
二のみ特異的に反応することが示された (表 1 中、クローン 22、図 1中、矢印で示すグラフを参照）。ストレプトアビジンに対し高い親 和性を示しているクローンはいずれもオボアルブミンに対しても強く反応しているため 、ストレプトアビジンに対する親和性のみを指標に選別を行うと、どのようなリガンドに も非特異的に結合する抗体を選別する確率が極めて高いことが実験的に明らかにな つた。一方、本発明の方法を用いれば、こうした非特異的な抗体を当初から効率的 に除外できることが確認された。実際、ストレプトアビジン単独でアツセィを行うと 28ク ローンが候補として選別される力 そのほとんどがオボアルブミンに対しても強く結合 する。そのようなクローンを除外することにより、即座に 1クローンに限定することが可 能になった。本実験では目的リガンドをストレブトアビジン、対照リガンドをオボアルブ ミンにしている力 それ以外の特定タンパク質との組み合わせ（例えば、 目的リガンド： 対照リガンド =ゥサギ IgG：スキムミルク、卵白リゾチーム：スキムミルク）でもこの手法 が有効であることが確認されている。実際に卵白リゾチームを用いた結果も図 2に示 す。 96穴プレートの 53個のゥエルに細胞の存在が認められた。このうちゥサギ IgGに 対し 0. D.値が 1以上で反応したものは 6クローンあった（クローン 3、 13、 31、 35、 3 8、 47)。リゾチームへの反応性を同時に検討した事により、これら 6クローンがゥサギ I gGに特異的であるかどうかが即座に判別できた。
[0023] 2.特異性の確認
ストレプトアビジン特異性検証のための ELIS A用培養上清の作製：
さらなる特異性を ELISAにより解析するのに用いた培養上清は、血清由来の IgM 等を除去するため、以下のようにして調製した培地を用いた。ニヮトリ血清（Invitrogen 社)から 50%飽和硫安によりィムノグロブリンを沈殿として除去し、上清を PBSに透析 した。透析により生じた体積増加を Centri Prep (Amicon社）による濃縮で補正し、 抗体除去ニヮトリ血清とした。これを AIM— V無血清培地（Invitrogen社）に 6%の濃 度でカ卩えた。ここに約 106/mlの濃度で細胞をカ卩え、 2日培養し、培養上清をとり ELI S Aを行った。
[0024] ストレプトアビジン特異性検証のための ELISA :
96穴ィムノプレート 'マキシソープに 5 μ g/mlのストレプトアビジン、オボアルブミン 、ヒト IgG (Sigma社）、また 0. 5%スキムミルク（Difco社）（いずれも PBSに溶解）を 200 μ ΐ加え、室温でー晚放置してプレートに固定した。その後 0. 5%スキムノレク 200 μ ΐ により室温で 1時間ブロッキングし、 ELISA洗浄バッファー 200 μ 1で 3回洗浄した。こ こに細胞培養上清を 1倍から 3, 125倍まで、 6段階に 5倍ずつ希釈したものを 100 μ 1加え、室温で 1時間反応させた。なお、ここで用いたクローンは、さきの SD10を一度 限界希釈して得られたクローン SD10— 1を用いた。その後 ELISA洗浄バッファー 2 00 μ 1で 5回洗浄し、ホースラディッシュペルォキシダーゼ共役ャギ抗ニヮトリ IgM抗 体を PBSにより 2, 000倍に希釈して 100 μ ΐずつ加えた。室温で 45分間反応後、 EL ISA洗浄バッファーで 5回洗浄し、その後 TMB +を 100 /i l加え、室温で 4分間反応 させた後、 1N硫酸 100 μ ΐにより反応を停止させた。定量は、 mQuant Biomolecul ar Spectrometerにより 450nmの吸光を測定して行った。
特異性検証のための ELISAの結果を図 2に示す。図 1に示される SD— 10を限外 希釈して得られた SD— 10— 1が、当初目的としたストレプトアビジンにのみ強く反応 することが確認された。なお、本発明を適用しない場合は同様のアツセィを 28クロー ンについて行う必要があることから、少なくとも 28倍のコスト削減効果があることが判 明した。

Claims

請求の範囲
[1] 多様化ライブラリーから、 目的リガンドに特異的に結合する少なくとも一種のタンパ ク質を選択する方法であって、
(a)該ライブラリ一中に存在する種々のタンパク質と目的リガンドを接触させ、該タン パク質群と目的リガンドの混合物をインキュベートし、少なくとも一種のタンパク質と目 的リガンドの複合体を回収する工程
(b)工程 (a)で選別された少なくとも数種のタンパク質と目的リガンドと接触させ、該タ ンパク質と目的リガンドの混合物をインキュベートし、該タンパク質と目的リガンドの結 合性を確認する工程、
(c)工程 (a)で選別された少なくとも数種のタンパク質を 1種類又は 2種類の特定の対 照リガンドと接触させ、該タンパク質と対照リガンドの混合物をインキュベートし、該タ ンパク質と対照リガンドが結合したかどうかを判別する工程、および、
(d)工程 (b)において目的リガンドとの結合性が確認され、かつ、工程（c)において 対照リガンドと結合しなかったタンパク質を選択する工程、
を含んで成る方法。
[2] 前記工程（a)におレ、て前記目的リガンドと接触させるタンパク質が、宿主の表面上 に提示されていることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
[3] 前記目的リガンドおよび/または対照リガンドが担体に結合していることを特徴とす る請求項 1または 2に記載の方法。
[4] 前記担体が磁気ビーズであることを特徴とする請求項 3に記載の方法。
[5] 前記工程 (b)における結合性の有無の判定を、 ELISA法、 RIA法、表面ブラズモ ン共鳴（SPR)法、プロット法、リガンドビーズを用いた方法から成る群より選択される 方法によって実施されることを特徴とする請求項 1ないし 4のいずれかに記載の方法
[6] 前記目的リガンドおよび/または対照リガンドが標識されていることを特徴とする請 求項 5に記載の方法。
[7] 前記多様化ライブラリーが、タンパク質発現ライブラリーであることを特徴とする請求 項 1なレ、し 6のレ、ずれかに記載の方法。
[8] 前記タンパク質発現ライブラリーが、抗体発現ライブラリーであることを特徴とする請 求項 7に記載の方法。
[9] 前記抗体発現ライブラリーが、抗体を細胞表面上に提示した細胞によって構成され るライブラリーであることを特徴とする請求項 8に記載の方法。
[10] 前記細胞が DT40細胞であることを特徴とする請求項 9に記載の方法。
[11] 請求項 1ないし 10のいずれかに記載の方法により選択されたタンパク質。
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