CN107299091B - 一种突变型a型dna聚合酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生。本发明提供了一种与未经改造突变的A型DNA聚合酶相比具有增强的dUTP掺入速度的突变型A型DNA聚合酶，其掺入dUTP的效果明显好于对照A型DNA聚合酶，因此更加适用于一些用dUTP取代dTTP的核酸扩增体系中，使该体系在防止核酸扩增产物污染的同时又不损失目的产物的扩增效率，从而满足食品、动物检疫、人类疾病筛查等多重PCR领域、法医领域及科研应用需求。

Description

一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用。

背景技术

DNA聚合酶是以核苷酸链为模板在有镁离子的情况下通过形成新的‘3-5’磷酸二酯键将dNTP掺入到新合成的核苷酸链中，从而复制DNA。在体内，DNA聚合酶参与包括DNA的复制，DNA的修复等复杂的反应。在体外，通过PCR(聚合酶链式反应)技术，DNA聚合酶可以大量合成DNA。

DNA聚合酶作为DNA生命的最基本的酶促反应，随着生命的进化而进化。所有的DNA聚合酶家族都有一个共同的双二价离子催化中心，但在其他结构上则有较大的差别。不考虑这些DNA聚合酶构象上的明显差异，所有的聚合酶结构在组成上都可以看做是一个“右手”的结构。这个结构包括“Thumb”“palm”“fingers”三个结构域。其中，palm结构域最为保守，这里有聚合酶的催化中心区域。

除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性部位也被证明是相对易变的，能够容纳某些氨基酸置换而不显著降低DNA聚合酶活性。这些突变型DNA聚合酶可以改善DNA聚合酶的某些性能，例如提高保真性、抗盐能力等，从而满足工业和研究应用中的不同需求。

在扩增实验室，最常见的污染物是核酸扩增产物的污染，造成核酸扩增产物污染的形式最可能是气溶胶污染，核酸扩增反应体系在开盖、摇动、吸样过程中与空气接触形成气溶胶，造成严重的核酸扩增产物污染现象。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳使实验结果判断为假阳性。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题[Avoiding false positives with PCR-Nature 1989Jun 8；339(6224):490.]。

为了防止核酸扩增产物的污染，避免PCR结果的假阳性，专利US5035996提出了dUTP取代dTTP的核酸扩增体系，这样的核酸扩增体系扩增后的核酸扩增产物都是含有dU的DNA链。在下次PCR扩增开始前，体系中加入尿嘧啶糖基化酶(简称UNG酶)，其可降解核酸链中的尿嘧啶碱基，但不降解反应体系中游离的dUTP，并增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。随后UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA。这一体系被广泛地应用于诊断试剂中，并起到了较好的效果。

目前这个体系存在的问题是，当用dUTP取代dTTP时，野生型Taq DNA聚合酶对dUTP的掺入速率要比dTTP低很多，导致目的产物的扩增效率较低，因此需要把dUTP加入量提高2到3倍来提高Taq DNA聚合酶对目的产物的扩增效率(例如：dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：2和dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：3)。当游离镁离子浓度低的时候，野生型Taq DNA聚合酶的这个问题尤其严重。因此，在用dUTP代替dTTP进行核酸扩增的体系中，野生型Taq DNA聚合酶结构上的缺陷，使其在此应用领域受到限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种突变型A型DNA聚合酶，使得该突变型A型DNA聚合酶在dUTP取代dTTP的核酸扩增体系中，能够具备更高的对dUTP的掺入效率，从而实现更佳的扩增效果，同时保证突变型A型DNA聚合酶的活力和热稳定性与野生型A型DNA聚合酶无显著差异。

本发明的另外一个目的在于提供上述突变型A型DNA聚合酶的编码基因以及重组载体、宿主细胞。

本发明的另外一个目的在于提供所述突变型A型DNA聚合酶在核酸扩增中的相关应用，如生产核酸扩增试剂盒、进行核酸扩增等。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种突变型A型DNA聚合酶，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生。

现有技术虽然有对DNA聚合酶进行突变的方案，但是突变后的效果多是体现在聚合酶的保真度、抗抑制性和扩增速度等方面，针对dUTP取代dTTP的核酸扩增体系的dUTP掺入效率较差的问题，目前还未有相关的研究报道。本发明在已有的A型DNA聚合酶基础上(包括野生型和突变型)进行特殊的氨基酸位点突变，获得了相应的突变型A型DNA聚合酶，提高了dUTP掺入效率。

作为优选，所述保守motif选自A型DNA聚合酶第656-667位氨基酸位点。进一步优选地，所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点。其中，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为除T以外的任意氨基酸；更进一步地，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为T、M、I、L、P之外的任意氨基酸；在本发明具体实施方式中，所述A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点为R、K、Q或V。

作为优选，所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第656-667位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第500-514位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第736-762位氨基酸位点。其中，A型DNA聚合酶第500-514位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第736-762位氨基酸位点可具体为A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点。

在本发明具体实施方式中，所述A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点为K，所述A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点为K。

本发明所述A型DNA聚合酶指具备如下特征的一列DNA聚合酶：

由Thumb(拇指区)、palm(手掌区)、fingers(手指区)三个结构域组成，具有N端的5’核酸外切酶区，以及位于C端聚合区与N端5’核酸外切酶区之间的3’核酸外切酶区。

以Taq DNA聚合酶为例简单说明，其结构上属于A型DNA聚合酶。TaqDNA聚合酶的聚合酶区与所有的A型DNA聚合酶都有相同的结构特征，其形状就像人的右手一样，由拇指区、手掌区和手指区组成。掌心区的功能是催化磷酰基转移反应，手指区的功能则是促进三磷酸核苷酸与模板配对，拇指区控制双链DNA的位置移动和子链延伸。Taq DNA聚合酶与其他A型DNA聚合酶一样具有N端的5’核酸外切酶区，以及位于C端聚合区与N端5’核酸外切酶区之间的3’核酸外切酶区。

本发明适合于所有A型DNA聚合酶，特别是来源于嗜热细菌(thermophilicbacteria)的野生型或天然存在的聚合酶；或通过对所述来源于嗜热细菌(thermophilicbacteria)的野生型或天然存在的聚合酶进行氨基酸置换、插入、缺失或其它修饰衍生出的聚合酶；或与所述来源于嗜热细菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的聚合酶具备至少60％、70％、80％、90％、95％或更多氨基酸同一性的聚合酶。而在这其中，优选为热稳定的A型DNA聚合酶。

其中，所述嗜热细菌(thermophilic bacteria)选自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、黄栖热菌(Thermusflavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌属种Sps17(Thermussp.sps17)、栖热菌属种Z05(Thermus sp.Z05)、耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)。

在本发明具体实施过程中，所述A型DNA聚合酶选自如下之一的聚合酶或与如下之一的聚合酶具有至少60％、70％、80％、90％、95％或更多氨基酸同一性的聚合酶：

(a)水生嗜热杆菌DNA聚合酶(Taq)(序列如SEQ ID NO:1)；

(b)栖热菌属种Z05 DNA聚合酶(Z05)(序列如SEQ ID NO:2)；

(c)丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)(序列如SEQ ID NO:3)；

(d)黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)(序列如SEQ ID NO:4)；

(e)栖热菌属种sps17 DNA聚合酶(Sps17)(序列如SEQ ID NO:5)；

(f)嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)(序列如SEQ ID NO:6)；

(g)Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)(序列如SEQ ID NO:7)；

(h)水生嗜热杆菌DNA聚合酶突变型142N(野生型Taq第142位突变为N的突变型Taq，序列如SEQ ID NO:8)。

本发明提供的突变型A型DNA聚合酶，其酶学性能表现经过验证，与未经改造突变的对照DNA聚合酶相比对，dUTP的掺入效率有明显的提高,从而解决了目前一些用dUTP取代dTTP的核酸扩增体系中野生DNA聚合酶对dUTP掺入效率较低，导致目的产物量低的问题，使该体系在抗污染的同时又不损失目的产物的扩增效率。

基于上述优异的技术效果，本发明提供了所述突变型A型DNA聚合酶在核酸扩增、制备核酸扩增试剂盒、制备表达载体和/或制备宿主细胞中的应用。

同时，本发明还提供了编码所述突变型A型DNA聚合酶的核酸序列。由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列。因此，只要能够根据本发明公开的突变型A型DNA聚合酶的氨基酸序列获得相应的编码核酸序列都包括在本发明的范围内。

根据上述应用，本发明提供一种表达载体，包含编码所述突变型A型DNA聚合酶的核酸序列。在此基础上，本发明还提供一种宿主细胞，转化有所述表达载体。依据所述表达载体和宿主细胞，本发明提供了所述突变型A型DNA聚合酶的制备方法，培养所述宿主细胞进行蛋白表达，收集并破碎宿主细胞，纯化蛋白，获得所述突变型A型DNA聚合酶。

鉴于本发明所述突变型A型DNA聚合酶在核酸扩增中的优异表现，本发明针对其带来的优异效果提出了一种核酸扩增的方法，在包含dUTP的核酸扩增体系中，采用本发明所述突变型A型DNA聚合酶进行扩增，获得目标核苷酸序列。在本发明具体实施方式中，所述包含dUTP的核酸扩增体系中dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：(1-3)，镁离子浓度为1.5-2.4mM。

在本发明具体地PCR反应体系中，总体积为25ul，dATP，dCTP，dGTP，dTTP或dUTP各含有200uM，正向引物，反向引物浓度均为200nM，1个单位的A型DNA聚合酶或者突变型A型DNA聚合酶。

同时，本发明还提供了一种用于产生延伸的多核苷酸的试剂盒，包含所述突变型A型DNA聚合酶。作为一种更加完善的试剂盒，其还可以包括：寡核苷酸、三磷酸核苷、适合于寡核苷酸延伸的缓冲液。其中，所述三磷酸核苷至少包含dUTP。

此外，本发明还提供一种反应混合物，其包含所述的突变型A族DNA聚合酶、至少一种寡核苷酸、多核苷酸模板和三磷酸核苷。其中，所述三磷酸核苷至少包含dUTP。

由以上技术方案可知，本发明提供了一种与未经改造突变的A型DNA聚合酶相比具有增强的dUTP掺入速度的突变型A型DNA聚合酶，其掺入dUTP的效果明显好于对照A型DNA聚合酶，因此更加适用于一些用dUTP取代dTTP的核酸扩增体系中，使该体系在防止核酸扩增产物污染的同时又不损失目的产物的扩增效率，从而满足食品、动物检疫、人类疾病筛查等多重PCR领域、法医领域及科研应用需求。

附图说明

图1所示为不同A型DNA聚合酶之间的同源比对；其中方框处为第664位氨基酸位点；

图2所示为不同A型DNA聚合酶之间的同源比对；其中方框处依次为第500-514位氨基酸、736-762位氨基酸位点；

图3所示为pTrc99A质粒图谱；

图4所示为突变型142N(T664V)和野生型142N分别在底物全是dTTP和底物中dTTP：dUTP＝3:1时，扩增1000bp产物的核酸电泳图；

图5所示为突变型142N(T664V)和野生型142N分别在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2和1：1：1：3时，扩增500bp产物的核酸电泳图；

图6所示为突变型Taq酶(A661V、A661T、R660Y、T664N)和野生型Taq酶分别在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2和1：1：1：3时，扩增500bp产物的核酸电泳图；

图7所示为突变型Taq酶(T664F、T664M、T664I、T664L)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图8所示为突变型Taq酶(T664F、T664M、T664I、T664L)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图9所示为突变型Taq酶(T664Q)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图10所示为突变型Taq酶(T664Q)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图11所示为突变型Taq酶(T664Q)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2时的扩增结果；

图12所示为突变型Taq酶(T664Q)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3时的扩增结果；

图13所示为突变型Taq酶(T664R)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图14所示为突变型Taq酶(T664R)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图15所示为突变型Taq酶(T664R)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2时的扩增结果；

图16所示为突变型Taq酶(T664R)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3时的扩增结果；

图17所示为突变型Taq酶(T664K)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图18所示为突变型Taq酶(T664K)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1时的扩增结果；

图19所示为突变型Taq酶(T664K)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2时的扩增结果；

图20所示为突变型Taq酶(T664K)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3时的扩增结果；

图21所示为突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1，镁离子为1.5mM时的扩增结果；

图22所示为突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，镁离子为1.5mM时的扩增结果；

图23所示为突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)和野生型Taq酶在底物dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，镁离子为2.2mM时的扩增结果。

具体实施方式

本发明公开了一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述突变型A型DNA聚合酶及其相关内容已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述突变型A型DNA聚合酶及其相关内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施方式中，本发明以水生嗜热杆菌DNA聚合酶(Taq酶)及其突变型聚合酶(突变型142N)为起始的未经改造突变的A型DNA聚合酶，分别在其第507位氨基酸位点、第664位氨基酸位点和第742位氨基酸位点进行突变，获得了本发明所述突变型A型DNA聚合酶，在dUTP取代dTTP的核酸扩增试验中，突变型Taq酶相对于未经改造突变的Taq酶以及突变型Taq酶142N对目的产物具有更强的扩增效率，即对于dUTP具有更强的掺入效率。

A型DNA聚合酶不仅在整个氨基酸序列上保守，在其dNTP结合区也非常保守。用NCBI对比不同的A型DNA聚合酶(见图1)，其突变部位664位点为A型聚合酶的保守motif：---D(P或G)(L、A或K)RRAAKT(I或V)NFGVLYGM--(序列如SEQ ID NO:9)，下划线处为第664位氨基酸位点，也是突变位点；用NCBI对比不同的A型DNA聚合酶(见图2)，其突变部位507和742位点分别为A型聚合酶的保守motif：--L(P或T)(A或P)(I、L或V)G(K或R)T(E或Q)KTGKRST--(序列如SEQ ID NO:10)，--RV(K或R)SVREAAERMAFNMPVQGTAADLMK--(序列如SEQ ID NO:11)，下划线处依次为第507和742位氨基酸位点，也是突变位点；由于高度保守的序列，故A型不同的聚合酶在此区域进行对应的氨基酸位点突变，可以达到预期一致的效果。

除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。以下的文献中本领域中大部分专业名词的一般定义，本专利中所使用的专业名词与上述文献中对该专业名词描述一致。

名词“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物，例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。

名词“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。如本发明文所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。

名词“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，DNA-RNA杂交体，寡聚核苷酸，适配体(aptamers)，肽核酸(PNAs)，PNA-DNA杂交体，PNA-RNA杂交体等等。包括一切线性形式(单链或双链)或分支状形式的共价相连的核苷酸。一个典型的核酸通常是单链或者双链的，并包含磷酸二脂键。

名词“野生型”指的是从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株(wild typestrain)，简称野生型。野生型经突变后形成的带有新性状(基因型)的菌株,称突变株(mutant，或突变体，突变型)。

名词“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，核酸序列基础扩增(NASBA))等。

在本发明实施例中，扩增指的是聚合酶链式反应(PCR)。模板变性解链，寡聚核苷酸引物与模板退火杂交，伴随着核苷酸加入的延伸，如此反复循环一定轮数，实现目的核苷酸片段的增多。

名词“嗜热酶”指的是对于加热是稳定的促进核苷酸的聚合以形成，多核苷酸延伸产物。通常，在热循环过程中嗜热稳定的聚合酶是常用的，在PCR循环过程中通过高温95℃使双链核苷酸变性。本文描述的有效用于PCR扩增反应的嗜热酶满足至少一个标准，当经受升高的温度为实现双链核苷酸变性所必需的时间时，该酶没有被变性。在一些实验体系中，90℃---100℃嗜热酶将不会变性。

名词“序列同源百分比”通过NCBI的BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov)、Bioedit和clustalx等软件窗口，其中对于两个序列或多个序列的最佳比对，在比较窗口中的序列部分与参照序列(其不包括添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即缺口)。通过确定存在于两个或多个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并用100乘以结果得到序列同源百分比来计算。

名词“CT值”在生物学中，是指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。实时荧光定量PCR方法利用循环阈值(Ct)的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。

在本发明实施例中，核酸扩增实验是普通PCR和荧光定量PCR实验。在荧光定量PCR反应中，衡量扩增的参数是Ct值，较早的Ct值反应的是信号更快的达到阈值。扩增样品中不同核酸变异体之间的Ct差值，往往反映了酶对相同体系的不同扩增效率的差异，进一步反应了扩增优越性。

对扩增产物的检测在本领域中也有很多方法。方法包括使用各种与核酸结合的染料。对扩增产物的检测可以发生在扩增反应完成之后，比如通过凝胶电泳的方法，或者对核酸进行染色的方法。另外，对扩增产物的检测也可以发生在扩增反应的过程之中。

以下就本发明所提供的一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用做进一步说明。

实施例1：突变型Taq酶的制备

利用商品化pTrc99A质粒(质粒图谱见图3)，通过ncoI和pstI两个酶切位点构建Taq聚合酶目的片段，突变酶采用定点突变的方法，上下游引物5’端互补重合10-15个碱基进行突变，进行全质粒PCR。

引物序列(序列依次如SEQ ID NO:12-39)：

664L上游：GGCCAAGCTCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664L下游：GATGAGCTTGGCCGCCCGGCGCAT

664I上游：GGCCAAGATCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664I下游：GATGATCTTGGCCGCCCGGCGCAT

664M上游：GGCCAAGATGATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664M下游：GATCATCTTGGCCGCCCGGCGCAT

660Y上游：CGCTATGCGGCCAAGACCATCAACTTCGG

660Y下游：TGGCCGCATAGCGCATCAGGGGGTC

661T上游：CCGGACGGCCAAGACCATCAACTTCGGG

661T下游：TGGCCGTCCGGCGCATCAGGGG

661V上游：CCGGGTGGCCAAGACCATCAACTTCGGG

661V下游：TGGCCACCCGGCGCATCAGGGG

664N上游：GGCCAAGAACATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664N下游：GATGTTCTTGGCCGCCCGGCGCAT

664V上游：GCCAAGGTCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664V下游：GATGACCTTGGCCGCCCGGCGC

664F上游：GGCCAAGTTCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664F下游：GATGAACTTGGCCGCCCGGCGCAT

664W上游：GGCCAAGTGGATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664W下游：GATCCACTTGGCCGCCCGGCGCAT

664K上游：GGCCAAGAAGATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664K下游：TGATCTTCTTGGCCGCCCGGCGCAT

664R上游：GGCCAAGAGGATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664R下游：GATCCTCTTGGCCGCCCGGCGCAT

664H上游：GGCCAAGCATATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664H下游：TGATATGCTTGGCCGCCCGGCGCAT

664Q上游：GGCCAAGCAAATCAACTTCGGGGTCCTCTACGG

664Q下游：GATTTGCTTGGCCGCCCGGCGCAT

反应条件：95℃，30s；30cycles(95℃，30s；60℃，30s，72℃，300s single)

反应试剂采用苏州新海生物科技股份有限公司的Power mix 2x，引物选用200nM，进行反应。经测序后确定突变成功进行转化表达菌种、发酵、纯化，检测酶的性质。

实施例2：突变型142N(T664v)和野生型142N分别以dUTP和dTTP为底物对目的产物的扩增效率对比

在本实施例中比较了突变型142N(T664V)和野生型142N分别以dUTP和dTTP为底物对目的产物的扩增效率，使用的模板为M13噬菌体DNA(SEQ ID NO：40)，加入量为550ng/ul，扩增产物分别为1000bp和500bp大小。

扩增产物为1000bp体系的引物序列

上游引物TACAGTCTGACGCTAAAGGCAAA(SEQ ID NO：41)

下游引物GTACCGCACTCATCGAGAACAAG(SEQ ID NO：42)

扩增产物为500bp体系的引物序列：

上游引物ATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTT(SEQ ID NO：43)

下游引物CAAAGTCAGAGGGTAATTGAGCG(SEQ ID NO：44)

PCR反应体系为25ul，dATP,dCTP,dGTP,dTTP或dUTP各含有200uM，正向引物，反向引物浓度均为200nM，1个单位的TaqDNA聚合酶或者突变的Taq DNA聚合酶。

使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。

扩增产物为1000bp体系的PCR热循环条件为95℃，30s；30cycles*(95℃，30s；50℃，30s，72℃，60s)。

扩增产物为500bp体系的PCR热循环条件为95℃，30s；30cycles*(95℃，5s；50℃，10s，72℃，40s)。

实验结果见图4-图5，实验结果通过扩增产物的电泳条带亮度来体现。

图4为扩增产物为1000bp的核酸电泳结果，在全是dTTP体系中时，野生型142N的扩增亮度高于突变型142N(T664V)，而当dUTP代替dTTP1/4的时候，突变型142N(T664V)的扩增亮度明显高于野生型142N，存在dUTP的时候，野生型142N对目的产物的扩增效率极低，表明当有dUTP代替部分dTTP作为底物时，突变型142N(T664V)对目的产物的扩增效率明显好于野生型142N。

图5为扩增产物为500bp的核酸电泳结果，dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2和1：1：1：3时，突变型142N(T664V)的产物亮度明显高于野生型142N的产物亮度。由此可知突变型142N(T664V)对dUTP的掺入效率好于野生型142N。

以上两个实验说明在以dUTP为底物时，突变型142N(T664V)相对于野生型142N对目的产物具有更强的扩增效率，即突变型142N(T664V)对于dUTP具有更强的掺入效率。

实施例3：突变型Taq酶(T664N、A661V、R660Y、T664V、A661T)和野生型Taq酶分别以不同比例的dATP：dGTP：dCTP：dUTP为底物时对目的产物的扩增效率对比

在本实施例中，体系参照实施例2，比较了不同的突变型Taq酶(T664N、A661V、R660Y、T664V、A661T)和野生型Taq酶分别以dUTP和dTTP为底物时对目的产物M13噬菌体DNA的扩增效率。采用扩增产物为500bp的引物序列dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2和1：1：1：3。

PCR热循环条件为95℃，30s；30cycles(95℃，5s；60℃，10s，72℃，40s single)。

实验结果见图6，实验结果通过扩增产物的电泳条带亮度来体现。

图6可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2和1：1：1：3时，突变型Taq酶(A661V、A661T、R660Y、T664N)和野生型Taq酶都无扩增，只有突变型Taq酶(T664V)有扩增产物，说明突变型Taq酶(T664V)在dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2和1：1：1：3时，对目的产物具有更强的扩增效率，即对dUTP的掺入效率明显优于野生型Taq。

实施例4：突变型Taq酶(T664F、T664M、T664I、T664L)和野生型Taq酶分别以dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1和dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1为底物时对目的产物的扩增效率对比

本实施例比较了突变型Taq酶(T664F、T664M、T664I、T664L)和野生型Taq酶分别以dUTP和dTTP为底物时对目的产物M13噬菌体DNA的扩增效率，使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。实验体系同实施例2，使用扩增产物为500bp的引物序列，实验通过以dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1和dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1为底物时，扩增产物的不同效果，来判断出哪种突变酶对dUTP的掺入效果最好。PCR热循环条件为95℃，30S；40cycles*(95℃，15s；50℃，30s，72℃，60s)。

实验结果见图7-图8，实验结果通过扩增CT值来体现。

图7为dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1时的实验结果，从图7中可知，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1时，突变型Taq酶(T664F、T664M、T664I、T664L)的扩增CT值与野生型Taq酶一致。

图8为dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1时的实验结果，由图8可知，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1时，突变型Taq酶(T664F、T664M、T664I和T664L)的扩增CT值明显低于野生型Taq，表现出扩增效果都低于野生型Taq，由此推断出突变型Taq酶(T664F、T664M、T664I、T664L)对于dUTP的掺入效果较野生型Taq差。

实施例5：突变型Taq酶(T664Q)与野生型Taq分别以不同比例的dATP：dGTP：dCTP：dUTP和dATP：dGTP：dCTP：dTTP为底物时对目的产物的扩增效率对比

实验使用罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。实验通过突变型Taq酶(T664Q)和野生型Taq分别扩增M13噬菌体DNA，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM和当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM，和当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，且镁离子为2.2mM和当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3，且镁离子为2.4mM条件下的不同效果，来判断出哪种突变酶的扩增效果最好。使用实施例2中扩增产物为500bp的引物序列，PCR热循环条件为95℃，30s 40cycles*(95℃，15s；50℃，30s，72℃，60s)。

实验结果见图9-图12，实验结果通过扩增CT值来体现。

图9可见，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM时，突变型Taq酶(T664Q)的扩增CT值与野生型Taq一致。

图10可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM时，突变Taq酶(T664Q)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变Taq酶(T664Q)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

图11可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，且镁离子为2.2mM时，突变型Taq酶(T664Q)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664Q)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

图12可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3，且镁离子为2.4mM，突变型Taq酶(T664Q)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664Q)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

实施例6：突变型Taq酶(T664R)与野生型Taq分别以不同比例的dATP：dGTP：dCTP：dUTP和dATP：dGTP：dCTP：dTTP为底物时对目的产物的扩增效率对比

实验使用罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。实验通过突变型Taq酶(T664R)和野生型Taq分别扩增M13噬菌体DNA，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1,且镁离子为1.5mM，dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM，dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，且镁离子为2.2mM和dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3，且镁离子为2.4mM的不同效果，从而判断出突变型Taq酶(T664R)对dUTP的掺入效果。使用实施例2中扩增产物为500bp的引物序列，PCR热循环条件为95℃，30s 40cycles*(95℃，15s；50℃，30s，72℃，60s)。

实验结果见图13～图16，实验结果通过扩增CT值来体现。

图13可见，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM，突变型Taq酶(T664R)的扩增CT值与野生型Taq一致。

图14可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM时，突变型Taq酶(T664R)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664R)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

图15可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，且镁离子为2.2mM时，突变型Taq酶的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664R)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

图16可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3，且镁离子为2.4mM，突变型Taq酶(T664R)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664R)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

实施例7：突变型Taq酶(T664K)与野生型Taq分别以不同比例的dATP：dGTP：dCTP：dTTP和dATP：dGTP：dCTP：dUTP为底物时对目的产物的扩增效率对比

实验使用罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。实验通过突变型Taq酶(T664K)和野生型Taq分别扩增M13噬菌体DNA，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1,且镁离子为1.5mM，dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM，dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，且镁离子为2.2mM，和dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3，且镁离子为2.4mM的不同效果，从而判断出突变型Taq酶(T664K)对dUTP的扩增效果。采用实施例2中扩增产物为500bp的引物序列，PCR热循环条件为95℃，30s 40cycles*(95℃，15s；50℃，30s，72℃，60s)。

实验结果见图17～图20，实验结果通过扩增CT值来体现。

图17可见，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1，镁离子为1.5mM时，突变型Taq酶(T664K)的扩增CT值与野生型Taq一致。

图18可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，镁离子为1.5mM时，突变型Taq酶(T664K)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664K)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

图19可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，镁离子为2.2mM，突变型Taq酶(T664K)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664K)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

图20可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：3，镁离子为2.4mM，突变型Taq酶(T664K)的扩增CT值明显好于野生型Taq，表明突变型Taq酶(T664K)对dUTP的掺入效果好于野生型Taq。

实施例8：突变型Taq酶(T664Q、T664R、T664K)与野生型Taq酶分别以不同比例的dATP：dGTP：dCTP：dTTP和dATP：dGTP：dCTP：dUTP为底物对目的产物扩增Ct值比较

将实施例5，6，7的实验结果汇总到下表1。

表1不同突变型Taq酶与野生型Taq酶分别以不同比例的dATP：dGTP：dCTP：dTTP和dATP：dGTP：dCTP：dUTP为底物时目的产物M13噬菌体DNA的扩增Ct值

	Taq CT值	T664Q CT值	T664R CT值	T664K CT值
					dATP：dGTP：dCTP：dTTP 1：1：1：1	20.15	20.61	19.91	20.87
dATP：dGTP：dCTP：dUTP 1：1：1：1	32.08	25.47	21.25	21.65
					dATP：dGTP：dCTP：dUTP 1：1：1：2	26.29	25.11	20.76	21.27
dATP：dGTP：dCTP：dUTP 1：1：1：3	25.19	23.77	21.26	20.86

从表1可以看出，随着dUTP的比例增加，野生型Taq的扩增效果一直在增强，这就是目前用dUTP替代dTTP后，需要提高dUTP的比例来提高dUTP的掺入效率，而本专利所述的突变酶的扩增效果几乎与dUTP的比例无任何关系，其对dUTP的扩增效果等同于dNTP的扩增。

实施例9：突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)与野生型Taq酶分别以dATP：dGTP：dCTP：dTTP＝1：1：1：1、dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：1和dATP：dGTP：dCTP：dUTP＝1：1：1：1为底物，检测突变酶的性质

实验通过突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)和野生型Taq酶分别扩增dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM，dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，且镁离子为1.5mM，dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，且镁离子为2.2mM的不同效果，从而判断出突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)对dUTP的扩增效果。采用人类基因组G1471，1ng反应，扩增产物为500bp的引物序列，PCR热循环条件为95℃，300s 50cycles*(95℃，5；60℃，40s)。

SG6上游：GATCACGCTTGGGTGGTGCA(SEQ ID NO：45)

SG6下游：GAAAAAGTGGGAAAAGAGGTCTTGG(SEQ ID NO：46)

实验结果见图21～图23，实验结果通过扩增CT值来体现。

图21可见，当dATP：dGTP：dCTP：dTTP为1：1：1：1，镁离子为1.5mM，突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)的扩增CT值与野生型Taq一致。

图22可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：1，镁离子为1.5mM，突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)的扩增CT值与野生型Taq CT值对比，约提前4个CT值，可见对dUTP扩增效率明显好野生型Taq。

图23可见，当dATP：dGTP：dCTP：dUTP为1：1：1：2，镁离子为2.2mM，突变型Taq酶(E507K T664Q、E742K T664Q)的扩增CT值与野生型Taq CT值对比，约提前3个CT值，可见对dUTP扩增效率明显好野生型Taq。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州新海生物科技股份有限公司

<120> 一种突变型A型DNA聚合酶及其编码基因和应用

<130> MP1715732

<160> 46

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 832

<212> PRT

<213> 水生嗜热杆菌

<400> 1

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 2

<211> 834

<212> PRT

<213> 栖热菌属种Z05

<400> 2

Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

50 55 60

Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln

85 90 95

Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

100 105 110

Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys

115 120 125

Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

130 135 140

Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu

145 150 155 160

Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys

165 170 175

Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

195 200 205

Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

290 295 300

Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

305 310 315 320

Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp

355 360 365

Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

385 390 395 400

Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln

405 410 415

Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

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Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

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Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

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<212> PRT

<213> 丝状栖热菌

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Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu

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Leu Ala Leu Val Lys Arg Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu

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Leu Arg Ala Phe Leu Glu Glu Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu

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Met Trp Ala Glu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Glu Gly Arg Val

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Arg Gly Phe Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly

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Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Ala

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Ser Arg Val Arg Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Ile Ala Met Val

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Lys Leu Phe Pro Arg Leu Lys Pro Leu Gly Ala His Leu Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu Val Pro Glu Asp Arg Ala Glu Glu

785 790 795 800

Ala Lys Ala Leu Val Lys Glu Val Met Glu Asn Thr Tyr Pro Leu Asp

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Val Gly Arg Asp Trp Leu Glu Ala

820 825 830

Lys Gly Asp

835

<210> 4

<211> 830

<212> PRT

<213> 黄栖热菌

<400> 4

Met Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val

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Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly Leu

20 25 30

Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys

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Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Val Val Val Val Val

50 55 60

Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu Ala Tyr

65 70 75 80

Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala

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Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Val Arg Leu Glu Val

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Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys Arg Ala

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Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg Asp Leu

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Leu Ala Leu Ala Gly Ala Trp Glu Gly Arg Leu His Arg Ala Gln Asp

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Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Glu Glu Val

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Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Asp Arg Ala Glu Arg Val Ala Ala

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Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Trp Pro Leu Gln Val Pro Leu

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Glu Val Glu Val Gly Leu Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys

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<211> 830

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<213> 栖热菌属种sps17

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Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly

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Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ala

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Pro Lys Glu Ala Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Gly Gly Ala Phe

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Leu Gly Phe Leu Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp Ala Glu Leu Leu

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Ala Leu Ala Gly Ala Lys Glu Gly Arg Val His Arg Ala Glu Asp Pro

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Val Gly Ala Leu Lys Asp Leu Lys Glu Ile Arg Gly Leu Leu Ala Lys

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Arg Val Ala Glu Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu

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Ile Ala Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Lys Gly Tyr Val Glu Thr

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Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn Ala Arg Val Lys

725 730 735

Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln

740 745 750

Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro

755 760 765

Arg Leu Arg Pro Leu Gly Val Arg Ile Leu Leu Gln Val His Asp Glu

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Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Ala Arg Ala Glu Glu Ala Ala Gln Leu

785 790 795 800

Ala Lys Glu Thr Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ser Val Pro Leu Glu

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Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Ala

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<210> 6

<211> 834

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌

<400> 6

Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

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Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

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Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

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Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

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Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

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Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg

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Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg

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Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg

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Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

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Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu

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Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

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Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

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Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

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Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg

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Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

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Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp

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Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro

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Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp

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Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg

405 410 415

Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

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Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu

785 790 795 800

Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 7

<211> 834

<212> PRT

<213> Thermus caldophilus

<400> 7

Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

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Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly

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Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

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Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe

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Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu

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Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp

180 185 190

Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu

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Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg

210 215 220

Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro

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Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp

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Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg

325 330 335

Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly

340 345 350

Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp

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405 410 415

Asn Leu Leu Lys Arg Leu Gln Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr

420 425 430

His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala

435 440 445

Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu

450 455 460

Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala

465 470 475 480

Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu

485 490 495

Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly

500 505 510

Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His

515 520 525

Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys

530 535 540

Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Asn Thr Gly

545 550 555 560

Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu

565 570 575

Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu

580 585 590

Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu

595 600 605

Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu

610 615 620

Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile

625 630 635 640

His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val

645 650 655

Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu

660 665 670

Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr

675 680 685

Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys

690 695 700

Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly

705 710 715 720

Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn

725 730 735

Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn

740 745 750

Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val

755 760 765

Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln

770 775 780

Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Gly Ala Glu Glu

785 790 795 800

Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala

805 810 815

Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala

820 825 830

Lys Gly

<210> 8

<211> 832

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asn Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro

325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro

355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn

370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu

385 390 395 400

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu

420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly

435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala

450 455 460

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His

465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp

485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

500 505 510

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile

515 520 525

Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr

530 535 540

Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu

545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser

565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln

580 585 590

Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala

595 600 605

Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly

610 615 620

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr

625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro

645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu

675 680 685

Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg

690 695 700

Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val

705 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg

725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro

740 745 750

Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu

755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His

770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala

785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro

805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825 830

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(18)

<223> Xaa（2）=P或G；Xaa（3）=L、A或K；Xaa（10）=I或V

<400> 9

Asp Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Lys Thr Xaa Asn Phe Gly Val Leu Tyr

1 5 10 15

Gly Met

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(15)

<223> Xaa（2）=P或T；Xaa（3）=A或P;Xaa（4）=I、L或V；Xaa（6）=K或R;Xaa（

8）=E或Q

<400> 10

Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Thr Xaa Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(27)

<223> Xaa（3）=K或R

<400> 11

Arg Val Xaa Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met

1 5 10 15

Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys

20 25

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggccaagctc atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gatgagcttg gccgcccggc gcat 24

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggccaagatc atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gatgatcttg gccgcccggc gcat 24

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggccaagatg atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatcatcttg gccgcccggc gcat 24

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgctatgcgg ccaagaccat caacttcgg 29

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tggccgcata gcgcatcagg gggtc 25

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccggacggcc aagaccatca acttcggg 28

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tggccgtccg gcgcatcagg gg 22

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccgggtggcc aagaccatca acttcggg 28

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tggccacccg gcgcatcagg gg 22

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggccaagaac atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gatgttcttg gccgcccggc gcat 24

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gccaaggtca tcaacttcgg ggtcctctac gg 32

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gatgaccttg gccgcccggc gc 22

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggccaagttc atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gatgaacttg gccgcccggc gcat 24

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggccaagtgg atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gatccacttg gccgcccggc gcat 24

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggccaagaag atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgatcttctt ggccgcccgg cgcat 25

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ggccaagagg atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gatcctcttg gccgcccggc gcat 24

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ggccaagcat atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgatatgctt ggccgcccgg cgcat 25

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

ggccaagcaa atcaacttcg gggtcctcta cgg 33

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gatttgcttg gccgcccggc gcat 24

<210> 40

<211> 6407

<212> DNA

<213> M13噬菌体

<400> 40

aacgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60

atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120

cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180

gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240

tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300

ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360

tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420

cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480

tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540

aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600

ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660

aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720

atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780

tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840

caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900

ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960

aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020

tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080

gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140

caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200

caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260

gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320

caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380

cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440

tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500

attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560

tttttggaga ttttcaacat gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc 1620

tattctcact ccgctgaaac tgttgaaagt tgtttagcaa aaccccatac agaaaattca 1680

tttactaacg tctggaaaga cgacaaaact ttagatcgtt acgctaacta tgagggttgt 1740

ctgtggaatg ctacaggcgt tgtagtttgt actggtgacg aaactcagtg ttacggtaca 1800

tgggttccta ttgggcttgc tatccctgaa aatgagggtg gtggctctga gggtggcggt 1860

tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt actaaacctc ctgagtacgg tgatacacct 1920

attccgggct atacttatat caaccctctc gacggcactt atccgcctgg tactgagcaa 1980

aaccccgcta atcctaatcc ttctcttgag gagtctcagc ctcttaatac tttcatgttt 2040

cagaataata ggttccgaaa taggcagggg gcattaactg tttatacggg cactgttact 2100

caaggcactg accccgttaa aacttattac cagtacactc ctgtatcatc aaaagccatg 2160

tatgacgctt actggaacgg taaattcaga gactgcgctt tccattctgg ctttaatgag 2220

gatccattcg tttgtgaata tcaaggccaa tcgtctgacc tgcctcaacc tcctgtcaat 2280

gctggcggcg gctctggtgg tggttctggt ggcggctctg agggtggtgg ctctgagggt 2340

ggcggttctg agggtggcgg ctctgaggga ggcggttccg gtggtggctc tggttccggt 2400

gattttgatt atgaaaagat ggcaaacgct aataaggggg ctatgaccga aaatgccgat 2460

gaaaacgcgc tacagtctga cgctaaaggc aaacttgatt ctgtcgctac tgattacggt 2520

gctgctatcg atggtttcat tggtgacgtt tccggccttg ctaatggtaa tggtgctact 2580

ggtgattttg ctggctctaa ttcccaaatg gctcaagtcg gtgacggtga taattcacct 2640

ttaatgaata atttccgtca atatttacct tccctccctc aatcggttga atgtcgccct 2700

tttgtcttta gcgctggtaa accatatgaa ttttctattg attgtgacaa aataaactta 2760

ttccgtggtg tctttgcgtt tcttttatat gttgccacct ttatgtatgt attttctacg 2820

tttgctaaca tactgcgtaa taaggagtct taatcatgcc agttcttttg ggtattccgt 2880

tattattgcg tttcctcggt ttccttctgg taactttgtt cggctatctg cttacttttc 2940

ttaaaaaggg cttcggtaag atagctattg ctatttcatt gtttcttgct cttattattg 3000

ggcttaactc aattcttgtg ggttatctct ctgatattag cgctcaatta ccctctgact 3060

ttgttcaggg tgttcagtta attctcccgt ctaatgcgct tccctgtttt tatgttattc 3120

tctctgtaaa ggctgctatt ttcatttttg acgttaaaca aaaaatcgtt tcttatttgg 3180

attgggataa ataatatggc tgtttatttt gtaactggca aattaggctc tggaaagacg 3240

ctcgttagcg ttggtaagat tcaggataaa attgtagctg ggtgcaaaat agcaactaat 3300

cttgatttaa ggcttcaaaa cctcccgcaa gtcgggaggt tcgctaaaac gcctcgcgtt 3360

cttagaatac cggataagcc ttctatatct gatttgcttg ctattgggcg cggtaatgat 3420

tcctacgatg aaaataaaaa cggcttgctt gttctcgatg agtgcggtac ttggtttaat 3480

acccgttctt ggaatgataa ggaaagacag ccgattattg attggtttct acatgctcgt 3540

aaattaggat gggatattat ttttcttgtt caggacttat ctattgttga taaacaggcg 3600

cgttctgcat tagctgaaca tgttgtttat tgtcgtcgtc tggacagaat tactttacct 3660

tttgtcggta ctttatattc tcttattact ggctcgaaaa tgcctctgcc taaattacat 3720

gttggcgttg ttaaatatgg cgattctcaa ttaagcccta ctgttgagcg ttggctttat 3780

actggtaaga atttgtataa cgcatatgat actaaacagg ctttttctag taattatgat 3840

tccggtgttt attcttattt aacgccttat ttatcacacg gtcggtattt caaaccatta 3900

aatttaggtc agaagatgaa attaactaaa atatatttga aaaagttttc tcgcgttctt 3960

tgtcttgcga ttggatttgc atcagcattt acatatagtt atataaccca acctaagccg 4020

gaggttaaaa aggtagtctc tcagacctat gattttgata aattcactat tgactcttct 4080

cagcgtctta atctaagcta tcgctatgtt ttcaaggatt ctaagggaaa attaattaat 4140

agcgacgatt tacagaagca aggttattca ctcacatata ttgatttatg tactgtttcc 4200

attaaaaaag gtaattcaaa tgaaattgtt aaatgtaatt aattttgttt tcttgatgtt 4260

tgtttcatca tcttcttttg ctcaggtaat tgaaatgaat aattcgcctc tgcgcgattt 4320

tgtaacttgg tattcaaagc aatcaggcga atccgttatt gtttctcccg atgtaaaagg 4380

tactgttact gtatattcat ctgacgttaa acctgaaaat ctacgcaatt tctttatttc 4440

tgttttacgt gctaataatt ttgatatggt tggttcaatt ccttccataa ttcagaagta 4500

taatccaaac aatcaggatt atattgatga attgccatca tctgataatc aggaatatga 4560

tgataattcc gctccttctg gtggtttctt tgttccgcaa aatgataatg ttactcaaac 4620

ttttaaaatt aataacgttc gggcaaagga tttaatacga gttgtcgaat tgtttgtaaa 4680

gtctaatact tctaaatcct caaatgtatt atctattgac ggctctaatc tattagttgt 4740

tagtgcacct aaagatattt tagataacct tcctcaattc ctttctactg ttgatttgcc 4800

aactgaccag atattgattg agggtttgat atttgaggtt cagcaaggtg atgctttaga 4860

tttttcattt gctgctggct ctcagcgtgg cactgttgca ggcggtgtta atactgaccg 4920

cctcacctct gttttatctt ctgctggtgg ttcgttcggt atttttaatg gcgatgtttt 4980

agggctatca gttcgcgcat taaagactaa tagccattca aaaatattgt ctgtgccacg 5040

tattcttacg ctttcaggtc agaagggttc tatctctgtt ggccagaatg tcccttttat 5100

tactggtcgt gtgactggtg aatctgccaa tgtaaataat ccatttcaga cgattgagcg 5160

tcaaaatgta ggtatttcca tgagcgtttt tcctgttgca atggctggcg gtaatattgt 5220

tctggatatt accagcaagg ccgatagttt gagttcttct actcaggcaa gtgatgttat 5280

tactaatcaa agaagtattg ctacaacggt taatttgcgt gatggacaga ctcttttact 5340

cggtggcctc actgattata aaaacacttc tcaagattct ggcgtaccgt tcctgtctaa 5400

aatcccttta atcggcctcc tgtttagctc ccgctctgat tccaacgagg aaagcacgtt 5460

atacgtgctc gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 5520

gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 5580

tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 5640

gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 5700

atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 5760

cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 5820

ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 5880

aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa 5940

tttaaatatt tgcttataca atcttcctgt ttttggggct tttctgatta tcaaccgggg 6000

tacatatgat tgacatgcta gttttacgat taccgttcat cgattctctt gtttgctcca 6060

gactctcagg caatgacctg atagcctttg tagacctctc aaaaatagct accctctccg 6120

gcatgaattt atcagctaga acggttgaat atcatattga tggtgatttg actgtctccg 6180

gcctttctca cccttttgaa tctttaccta cacattactc aggcattgca tttaaaatat 6240

atgagggttc taaaaatttt tatccttgcg ttgaaataaa ggcttctccc gcaaaagtat 6300

tacagggtca taatgttttt ggtacaaccg atttagcttt atgctctgag gctttattgc 6360

ttaattttgc taattctttg ccttgcctgt atgatttatt ggatgtt 6407

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tacagtctga cgctaaaggc aaa 23

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gtaccgcact catcgagaac aag 23

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

atggtaatgg tgctactggt gattt 25

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

caaagtcaga gggtaattga gcg 23

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gatcacgctt gggtggtgca 20

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gaaaaagtgg gaaaagaggt cttgg 25

Claims (10)

1.一种突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为K或Q，所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

2.根据权利要求1所述突变型A型DNA聚合酶，其特征在于，所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K。

3.突变型A型DNA聚合酶在用dUTP取代dTTP的核酸扩增、制备用dUTP取代dTTP的核酸扩增试剂盒、制备表达载体和/或制备宿主细胞中的应用；

所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K，所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

4.编码权利要求1-2任意一项所述突变型A型DNA聚合酶的核酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述核酸序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，转化有权利要求5所述表达载体。

7.权利要求1-2任意一项所述突变型A型DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求6所述的宿主细胞进行蛋白表达，收集并破碎宿主细胞，纯化蛋白，获得所述突变型A型DNA聚合酶。

8.一种核酸扩增的方法，其特征在于，在包含dUTP的核酸扩增体系中，采用突变型A型DNA聚合酶进行扩增，获得目标核苷酸序列；所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K；所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

9.一种用于产生延伸的多核苷酸的试剂盒，其特征在于，包含突变型A型DNA聚合酶、核苷酸、至少包含dUTP的三磷酸核苷、适合于寡核苷酸延伸的缓冲液；所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K；所述A型DNA聚合酶序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示。

10.一种反应混合物，其包含突变型A族DNA聚合酶、至少一种寡核苷酸、多核苷酸模板和至少含dUTP的三磷酸核苷；所述突变型A型DNA聚合酶由A型DNA聚合酶在dNTP结合区的保守motif发生氨基酸位点突变产生；所述保守motif选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点，该位点突变为R、V、K或Q，或所述保守motif在选自A型DNA聚合酶第664位氨基酸位点基础上，还包括选自A型DNA聚合酶第507位氨基酸位点和/或A型DNA聚合酶第742位氨基酸位点，507位氨基酸位点突变为K，742位氨基酸位点突变为K；所述A型DNA聚合酶序列如SEQ IDNO:1-8任意一项所示。

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