KR20120052954A

KR20120052954A - 파지 φ29 ｄｎａ 폴리머라아제 키메라

Info

Publication number: KR20120052954A
Application number: KR1020127002884A
Authority: KR
Inventors: 마가리타 살라스 팔그라스; 미구엘 드 베가 호세; 호세 엠 라자로 볼로스; 루이스 블랑코 다빌라; 마리오 멘시아 카발레로
Original assignee: 콘세호 수페리오르 데 인베스티가시오네스 시엔티피카스
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2012-05-24
Anticipated expiration: 2030-07-01
Also published as: CA2766725A1; ES2438786T3; MX2012000133A; JP5778671B2; HRP20131163T1; IL217324A0; US20120190014A1; HK1173188A1; US8404808B2; US20130236886A1; KR101751554B1; EP2450436B1; ES2359058B1; PL2450436T3; PT2450436E; ES2359058A1; CN102648275B; AU2010267954A1; CY1114747T1; EP2450436A1

Abstract

본 발명은 생명공학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 아미노말단(N-말단) 영역 및 연결 아미노산 서열을 통하여 결합된 적어도 하나의 HhH 도메인을 포함하는 카르복시-말단(C-말단) 영역을 포함하는 DNA 폴리머라아제 키메라 및 주형 DNA를 복제, 증폭 또는 서열화하기 위한 이의 이용에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명은 상기 DNA 폴리머라아제 키메라를 이용하여 데옥시리보핵산을 복제, 증폭 또는 서열화하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다.

Description

파지 Φ29 ＤＮＡ 폴리머라아제 키메라{PHAGE Φ29 DNA POLYMERASE CHIMERA}

게놈을 복제하기 위해 박테리오파지 Φ29에서 요구되는 단 하나의 효소는 그의 DNA 폴리머라아제로, 이는 합성된 가닥의 복제 개시 및 신장(elongation)을 모두 촉매할 수 있는 66KDa 모노머성 단백질이다. 개시를 위하여, 이 폴리머라아제는 "말단"(TP)으로서 알려진 단백질에 결합되어, Φ29 DNA의 말단을 인식하고 TP-dAMP 공유결합 복합체의 형성을 촉매한다. 10개의 뉴클레오티드들의 중합 후, 상기 DNA 폴라머라아제/TP 이종이합체(heterodimer)는 해리되고, DNA로부터의 가닥의 신장이 실시된다.

복제성 DNA 폴리머라아제들은 효소 및 DNA간의 결합을 안정화시키는 보조(accessory) 단백질들과의 상호작용을 필요로 한다(Kuriyan and O'Donnell. J Mol Biol. 1993; 234: 915~925). 한편, 상기 DNA 폴리머라아제들은, 헬리카제(helicase) 유형 단백질들에 기능적 연합을 요구하기 때문에 복제되지 않는 DNA 가닥의 분리시 상기 중합에 연결될 필요가 있다. 이러한 의미에서, 상기 박테리오파지 Φ29의 DNA 폴리머라아제는 그를 독특하게 만드는 다양한 고유한 기능적 특징들을 갖는다:

a) 높은 가공성 (결합시 통합되는 뉴클레오티드들의 수로써 정의됨).

b) 높은 가닥 분리능, 이는 헬리카제 유형의 보조단백질들의 부재시 상기 박테리오파지의 게놈을 복제하는 것을 가능하게 한다. 이러한 두가지 특징들, 즉 가공성 및 가닥 분리는 Φ29 DNA 폴리머라아제가 길이 70kb 초과의 DNA 가닥들을 합성하는 것을 가능하게 한다(Blanco 등. J Biol Chem. 1989; 264: 8935~8940).

c) 새로운 가닥 중 뉴클레오티드의 삽입에서의 높은 정확성(Esteban 등. J Biol Chem. 1993; 268: 2719~2726).

이러한 모든 특징들은, 이 폴리머라아제의 이용에 근거하여 이중가닥 DNA(dsDNA)를 증폭하는 매우 다양한 등온과정(즉, 항온)의 프로토콜들의 개발을 이끌어왔다. 간단한 구조에서, 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제의 환형의 단일가닥 DNA(ssDNA)를 이용하는 능력은 롤링 서클법(rolling circle method)(또는 RCA-롤링 서클 증폭)에 의한 DNA의 증폭을 가능하게 하여, 긴 길이의 ssDNA 분자들을 생산하고, 10개 초과의 상기 환형 주형의 복제물들을 포함한다 (Blanco 등. J Biol Chem. 1989; 264: 8935~8940; US 5001050, US 5198543 및 US 5576204). Amersham Biosciences/Molecular Staging에 의해 개발된 dsDNA 증폭 방법에서(Dean 등. Genome Res. 2001; 11: 1095~1099; Dean 등. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 5261~5266), 육량체(헥사-뉴클레오티드들) 랜덤 서열 프라이머들의 이용과 Φ29 DNA 폴리머라아제의 이용의 조합은, 환형 플라스미드 DNA [GE Healthcare의 Templiphi™]의 피코그램으로부터 또는 10나노그램의 게놈 DNA [GE Healthcare의 Genomiphi™ 및 Qiagen의 Repli-G^®]로부터 출발하여 10⁴~10⁶의 증폭 지수들(factors)을 수득하는 것을 가능하게 한다. 생산된 생성물들은 고품질이고, 미리 정제할 필요 없이 직접 분해(digestion) 또는 서열화될 수 있으며, Φ29 DNA 폴리머라아제가 이러한 목적에 대해 가장 강건한 효소라는 것이 증명되었다. Φ29 DNA 폴리머라아제와의 증폭 반응들을 실시하기 위한 일반적인 버퍼는 트리스-HCl (pH 7.5)에 더하여 상이한 농도(밀리몰 단위)의 NaCl 또는 KCl 및 MgCl₂를 포함한다(US 2003/10207267). 그러나, 이러한 프로토콜들의 만족성에도 불구하고, 보다 적은 양의 DNA 양으로부터 출발하는 것을 가능하게 하는 다른 프로토콜들의 개발에 대한 요구가 늘고 있다.

상기 HhH ("helix-hairpin-helix"(나선-헤어핀-나선)) 모티프들은 그의 서열에 무관하게 상기 DNA에 결합하고, 다양한 DNA 폴리머라아제들, 리가아제들 및 글리코실라아제들에서 발견된다(Shao and Grishin. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2643~2650; Doherty 등. Nucleic Acids Res. 1996; 24:2488~2497). 이들 모티프들은 "헤어핀(hairpin)"형 고리에 의해 연결된 항-평행(anti-parallel) α-나선의 짝을 포함한다. 두번째 α-나선은 상기 구조로부터 돌출되지 않으며, 따라서 다른 DNA 결합 모티프들과 달리 DNA의 주요 홈(groove) 내에 삽입될 수 없다. 결정학적 연구들은, 단백질-DNA 상호작용들은 2개의 α-나선들 사이의 "고리"를 통하여 구축됨을 제시한다. 이 고리는 DNA와의 비특이적 상호작용들을 수립하는데 관련되며, 컨센서스(consensus) 서열 GhG를 정상적으로 포함하며, 상기 h는 정상적으로 I, V 또는 L의 소수성 잔기이다. 결정학적 구조들의 해상(resolution)은, 폴리펩티드 가닥의 질소와 DNA의 인산의 산소 간에 상호작용이 구축된다는 것을 제안한다. 나아가, 인산기들과의 추가적인 상호작용들을 구축할 수 있는 극성 아미노산들은 두번째 G에 대하여 2 및 3위치에 존재하는 경향이 있다. 컨센서스 서열의 마지막 G는 두번째 α-나선의 N-말단을 형성하고, 소수성 잔기 h는 모티프의 2개의 α-나선들간의 상호작용에 기여한다. 상기 두 개의 α-나선들은 패키지되어(packaged) 서로 25~50°의 각도를 형성하여, 상기 서열들에서 특징적인 소수성 패턴을 좌우한다. 상기 HhH 모티프들은 일반적으로, α-나선에 의해 결합된 2개의 HhH 모티프들로 구성된 (HhH)₂ 로 알려진 주요 구조들의 일부를 형성하여, DNA에 대하여 거울 대칭성을 형성하여, DNA에 대한 그의 안정한 결합을 용이하게 한다(Shao and Grishin. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2643~2650; Doherty 등. Nucleic Acids Res. 1996; 24:2488~2497; Thayer 등. EMBO J. 1995; 14: 4108~4120).

Taq와 Pfu와 같은 열안정성 DNA 폴리머라아제들과 비특이적 DNA 결합 모티프들간의 키메라들의 형성은, 상기 폴리머라아제들에 의한 DNA 결합능을 증가시키기 위하여 이전에 사용되어 왔다(Pavlov 등. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 13510~13515; WO20041013279; Wang 등. Nucleic Acids Res. 2004; 32: 1197~1207).

Φ29 DNA 폴리머라아제 구조의 결정학적 해상은, 이 효소의 특이적인 특성인 가닥 분리물(detachment)에 커플링되는 가공성 중합(processive polymerization)의 원인이 되는 분자적 염기들을 제공한다.(Kamtekar 등. 2006; EMBO J 25: 1335~1343).

진핵생물형(B 군)의 기타 DNA 폴리머라아제들과의 비교 분석은 유사한 일반적인 접힘을 나타낸다: 보편적인 서브도메인들(subdomains)인 fingers, palm 및 thumb에 의해 형성되고, 그 DNA가 결합되는 채널을 형성하는 C-말단 중합 도메인; 및 중합 동안 잘못 통합된 뉴클레오티드를 제거하는 역할을 하는 3'-5' N-말단 엑소뉴클레아제 도메인. 알려진 구조의 DNA 폴리머라아제들과 Φ29의 DNA 폴리머라아제들간의 주요한 구조적 차이는, 후자에 있어서 그의 중합 도메인에 있는 두 개의 추가적인 서브도메인들의 존재로, 이들 둘 모두는 프라이머로서 TPR1 및 TPR2로 명명되는 단백질을 이용하여 DNA 폴라머라아제들의 하위군에서의 보존 서열의 삽입체들에 해당한다. TPR1은 상기 서브도메인 palm에 가깝게 위치하고, DNA 듀플렉스(duplex)와 접촉한다. β-헤어핀 구조를 갖는 상기 서브도메인 TPR2는, 서브도메인 thumb, palm 및 fingers에 가까우며, 새롭게 합성된 DNA를 완전히 둘러쌀 수 있는 환상(annular) 구조로, 가공적(prociessive) 방식의 복제에 요구되는, DNA 폴리머라아제를 DNA에 결합시킨다. 유사하게, 서브도메인 TPR2는, 서브도메인들 fingers , palm 및 엑소뉴클레아제 도메인과 함께, 좁은 채널의 형성에 참여하는데, 주형 가닥은 이 채널을 통하여 지나가서 복제 동안 활성 중심에 접근하고, 폴리머라아제가 전위됨에 따라 이중가닥 DNA의 분리를 강제하고, 헬리카제가 작용하는 방식과 유사한 방식으로 작용하여, 중합물을 가닥 분리물에 커플링시키는 능력을 상기 폴리머라아제에 제공한다(Kamtekar 등. 2006; EMBO J 25: 1335~1343; Rodriguez 등. 2005; Proc Natl Acad Sci USA 102: 6407~6412). 다른 것들과 비교하여, 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제의 중합 도메인에서의 이러한 현저한 차이점들은, 그의 C-말단에서의 펩티드의 융합이 중합 및 DNA에서의 그의 예측불가능한 결합 성질들을 가질 것이라는 효과를 갖는다.

본 발명은 Φ29형 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 N-말단 영역 및 연결 아미노산 서열에 의해 결합되는 적어도 하나의 HhH 도메인을 포함하는 C-말단 영역을 포함하는 DNA 폴리머라아제 키메라, 및 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화에의 그의 이용에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명은 상기 DNA 폴리머라아제 키메라를 이용하여 데옥시리보핵산을 복제, 증폭 또는 서열화하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다.

상기 파지 Φ29 DNA 폴리머라아제는 다음과 같은 DNA의 증폭에 대해 큰 이득이 되는 몇가지 특징들을 갖는다: 임의의 보조 단백질의 참여가 필요 없는 높은 가공성 및 상기 DNA에 대한 일회 결합시 상기 박테리오파지의 게놈을 복제하는 것을 가능하게 하는 높은 가닥 분리능 및 새로운 가닥에서 뉴클레오티드의 삽입에서의 높은 정확성. 이러한 특징들은 이 폴리머라아제의 이용에 기초한 DNA의 등온 증폭을 위한 매우 다양한 프로토콜들의 개발을 이끌어왔으며, 이는 예비 정제의 필요없이, 직접 분해되거나 또는 서열화될 수 있는 고품질의 생성물들의 수득을 가능하게 한다. 그러나, 보다 적은 양으로부터 DNA의 증폭을 가능하게 하는 프로토콜들이 요구되고 있다. 본 발명은 두 가지 접근방식들에 의하여 이러한 요구에 부응하는 것이다: 1) 반응의 특이성 및 수율을 현저히 향상시키는 조성물의 개발, 2) 효소의 DNA 결합능을 증가시키는, Φ29 DNA 폴리머라아제와 비특이적 DNA 결합 모티프들간의 키메라들의 형성.

본 특허출원의 실시예들에서는, 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트(Tween®20) 및 암모늄염을 Φ29 DNA 폴리머라아제를 이용한 증폭에 일반적으로 사용되는 버퍼에 동시 첨가하므로써, 한편으로는 비특이적 DNA 증폭을 방지하고, 다른 한편으로는 주형으로서, 한정량의 0.1펨토그램(femtograms: fg)의 플라스미드 DNA 및 10fg의 게놈 DNA로부터 검출가능한 특이적인 증폭을 가능하게 한다.

DNA 결합능의 증가와 관련하여, 본 발명에서는 메타노파이러스 칸들레리(Methanopyrus kandleri)의 토포아이소머라아제 V의 HhH 모티프들을, 4개의 상이한 키메라들로부터 기원하는 연결 서열 또는 링커(linker)를 통하여 Φ29 DNA 폴리머라아제의 카르복시 말단에 융합시킨다. 이들 키메라들은 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제에 요구되는 것보다 적은 양으로부터 주형 DNA를 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 제 1 측면은 다음을 포함하는 DNA 폴리머라아제 키메라 (이하, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라라고 함)에 관한 것이다:

a) 그의 C-말단에 의해 하기 b)에 연결되는 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 아미노산 서열;

b) 그의 C-말단에 의해 하기 c)에 연결되는 연결 아미노산 서열; 및

c) 적어도 하나의 나선-헤어핀-나선 도메인(HhH)을 포함하는 아미노산 서열.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "DNA 폴리머라아제"라는 용어는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 촉매할 수 있는 효소를 의미한다. 일반적으로, 상기 효소는 주형 DNA 서열과 혼성화된 프라이머의 3'말단에서 합성을 개시하고, 주형 DNA 가닥의 5' 말단으로 진행된다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "키메라"라는 용어는 그의 아미노산 서열이 적어도 두 개의 상이한 단백질들의 아미노산 서열들의 융합 생성물인, 단백질을 의미한다. 키메라성 단백질은 키메라성 아미노산 서열을 암호화하는 키메라성 DNA로부터의 그의 발현을 통하여 생산되는 것이 일반적이다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "DNA 폴리머라아제 키메라" 또는 "키메라성 DNA 폴리머라아제"라는 용어는, 그의 아미노산 서열이 적어도 두 개의 상이한 단백질들의 아미노산 서열들의 융합 생산물인 단백질로, 상기 두 개의 상이한 단백질들 중 하나는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들의 중합을 촉매할 수 있는 DNA 폴리머라아제이다. 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라는 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 N-말단 영역 (a), 및 연결 아미노산 서열 (b)를 통하여 결합되는 적어도 하나의 HhH 도메인을 포함하는 C-말단 영역 (c)를 포함한다.

본 발명에서 사용된 것과 같은, "Φ29 유형 DNA 폴리머라아제"라는 용어는 가공적 중합물을 가닥 분리물에 커플링시키는 능력을 폴리머라아제에 제공하는, 중합 도메인 내에 TPR1 및 TPR2 서브도메인들을 포함하는 임의의 DNA 폴리머라아제를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제들의 예들은 다음의 파지들로부터 분리된 DNA 폴리머라아제들을 포함하는 리스트로부터 선택된다: Φ29, Cp-1, PRD-1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 또는 아시디아누스 병모양 바이러스(Acidianus Bottle-shaped virus:ABV).

본 발명의 제 1 측면의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라 (a)의 아미노산 서열은 다음의 파지들로부터 분리된 DNA 폴리머라아제들로부터 선택되는 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 암호화한다: Φ29, Cp-1, PRD-1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 또는 아시디아누스 병모양 바이러스(ABV).

바람직하게는, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라 (a)의 아미노산 서열은 서열번호: 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 키메라 (a)의 아미노산 서열은 서열번호: 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 키메라 (a)의 아미노산 서열은 서열번호: 1이다.

Φ29 유형 DNA 폴리머라아제들의 엑소뉴클레아제 도메인은 알려져 있으며, 높은 가공성 및 가닥 분리능을 보유하면서 상기 엑소뉴클레아제 활성이 감소되도록 변형될 수 있다.

본 발명의 제 1 측면의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라 (a)의 아미노산 서열은 엑소뉴클레아제 도메인에서의 변형을 갖는 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 암호화하며, 여기에서 상기 변형된 DNA 폴리머라아제는 바람직하게는, 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제 또는 "야생형"의 활성보다 10% 미만, 더욱 바람직하게는, 1% 미만의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 상기 변형된 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제에 비하여, 검출가능한 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있다.

상기 HhH ("나선-헤어핀-나선" 모티프들)은 서열 의존적인 DNA 결합 모티프들이 아니다. 구조적으로, 상기 HhH 모티프들은 후크형(hook-type) 루프 항-평행 α-나선들의 짝에 의해 형성된다. 이 루프는 상기 DNA와의 상호작용에 연관되며, 일반적으로 글리신-소수성 아미노산-글리신(GhG)으로 이루어지는 컨센서스 서열을 갖고, 상기 식 중 h는 일반적으로 류신, 이소류신 또는 발린인 소수성 아미노산 잔기이다. 상기 컨센서스 서열의 마지막 글리신은 두번째 α-나선의 N-말단 잔기로서 작용하고, 상기 소수성 잔기 h는 상기 모티프의 두 개의 α-나선들간의 상호작용들에 기여한다.

그 서열에서 HhH 모티프를 갖는 단백질들의 예들은, 이에 제한되지는 않지만, 메타노파이러스 칸들레리의 DNA 토포아이소머라아제 V, 대장균(Escherichia coli)의 단백질들인 MutY, Nth, MutM/Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE 또는 DnIJ, 또는 효모들의 단백질들인 RAD1, RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1, OGG1, NTG1, NTG2, DIN-7 또는 EXO-1, 및 이에 제한되지는 않지만, 예로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 카에노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 메타노코커스 자나스키(Methanococcus jannaschii), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 메타노박테리움 써모포르미쿰(Methanobacterium thermoformicum) 또는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)과 같은 다른 생물들에서의 이들 단백질들의 동족체들이 있다.

따라서, 본 발명의 제 1 측면의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라인 (c)의 아미노산 서열은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택되는 단백질의 적어도 하나의 HhH 도메인을 포함한다:

- M. 칸들레리의 토포아이소머라아제 V,

- 대장균의 MutY, Nth, MutM/Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE 또는 DnIJ,

- 효모들의 RAD1, RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1, OGG1, NTG1, NTG2, DIN-7 또는 EXO-1, 또는

- B. 서브틸리스 , C. 엘레간스 , H. 인플루엔자에, M. 자나스키 , M. 루테우스 , M. 써모포르미쿰 또는 S. 티피무리움에서의 상기의 동종성 단백질.

M. 칸들레리의 토포아이소머라아제 V의 C-말단 끝은 약 50개의 아미노산들의 12개의 반복부들로 조직되어 있으며, 이들은 각각 A-L 도메인들로 알려져 있으며, 각각 2개의 HhH 모티프들을 갖는다.

본 발명의 제 1 측면의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라인 (c)의 아미노산 서열은, 서열번호: 2의 아미노산 서열인, M. 칸들레리의 토포아이소머라아제 V로부터 유도된 적어도 하나의 HhH 도메인을 포함한다.

본 발명의 제 1 측면의 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라인 (c)의 아미노산 서열은, M. 칸들레리의 토포아이소머라아제 V의 H 도메인의 서열에 대응하는 서열번호: 3이다.

본 발명의 제 1 측면의 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라인 (c)의 아미노산 서열은, 그의 C-말단 끝에 의해, M. 칸들레리의 토포아이소머라아제 V의 I 도메인에 결합된, M. 칸들레리의 토포아이소머라아제 V의 H 도메인 서열에 해당하는 서열번호: 4에 그의 C-말단 끝에 의해 결합된 서열번호: 3이다.

본 발명에서 사용된 것과 같은, "연결 아미노산 서열"이라는 용어는 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라의 (a) 및 (c)의 아미노산 서열들의 기능성 유지를 가능하게 하는, 길이가 적어도 아미노산 2개인 짧은 아미노산 서열을 의미한다. 바람직하게는, 상기 연결 아미노산 서열 (b)는 6개의 아미노산들이다. 더욱 바람직하게는, 상기 연결 아미노산 서열 (b)는 서열번호: 5 또는 서열번호: 6이다.

본 발명의 또다른 측면은, 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화를 위한 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라의 이용에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 측면은, 주형 DNA를 적어도 다음을 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함하는 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 관한 것이다:

a) 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라,

b) 버퍼,

c) 염화마그네슘,

d) 프라이머, 및

e) 뉴클레오시드 트리포스페이트.

본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예는 상기 언급된 성분들 (a)~(e)를 포함하고, 나아가 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트, 암모늄염, 칼륨염 또는 이들 중 임의의 조합을 더 포함하는 반응 혼합물과 상기 DNA를 접촉시키는 것을 포함하는 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 관한 것이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라의 농도는 5nM 내지 75nM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 DNA 폴리머라아제 키메라의 농도는 25nM 내지 60nM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 DNA 폴리머라아제 키메라의 농도는 50nM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트 (Tween^®20)의 농도는 반응물의 총 부피 중 0.003% 내지 0.1%이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 반응물의 총 부피 중 0.006% 내지 0.05%이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 반응물의 총 부피 중 0.01% 내지 0.03%이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 반응물의 총 부피 중 약 0.025%의 비율이다. "반응물의 총 부피"는 주형 DNA를 상기 반응 혼합물에 첨가 후 얻어지는 결과물의 부피로서 이해되어야 한다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택된다: 황화암모늄, 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 황화암모늄이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 황화암모늄의 농도는 30mM 내지 60mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 황화암모늄의 농도는 40mM 내지 50mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 황화암모늄의 농도는 약 45mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 염화암모늄이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화암모늄의 농도는 60mM 내지 120mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화암모늄의 농도는 약 90mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 아세트산 암모늄이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 60mM 내지 120mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 약 90mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 pH 7.0 내지 8.5이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 pH 7.2 내지 8이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 약 pH 7.5이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES이다. 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼는 pH 7.0 내지 8.5이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼는 pH 7.2 내지 8이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼는 pH 약 7.5이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 25mM 내지 50mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 약 40mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 칼륨염은 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 30mM 내지 70mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 약 50mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 염화 마그네슘의 농도는 2mM 내지 20mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 염화 마그네슘의 농도는 약 10mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.01% 내지 0.03%의 비율이고, 상기 황화암모늄의 농도는 40mM 내지 50mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM, pH 7.2 내지 8.0이며, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 총 부피의 0.025%이고, 상기 황화암모늄의 농도는 45mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 40mM 및 pH 7.5이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 10mM이고, 상기 염화 칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 50mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.01% 내지 0.03%의 비율이고, 상기 염화암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM 및 pH 7.2 내지 8.0이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 및 15mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.025%이고, 상기 염화암모늄의 농도는 90mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 40mM 및 pH 7.5이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 10mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 50mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.01% 내지 0.03%의 비율이고, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM 및 pH 7.2 내지 8.0이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 총 부피의 0.025%이고, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 90mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 40mM 및 pH 7.5이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 10mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 50mM이다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "복제"라는 용어는 주형 DNA로부터 상보적인 DNA의 합성을 의미한다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "증폭"이라는 용어는 주형 DNA의 복제물들의 수의 증가를 의미한다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "서열화"라는 용어는 주형 DNA의 뉴클레오티드들의 순서의 결정을 의미한다.

"접촉"이라 함은 주형 DNA와 반응 혼합물이 프라이머 연장 조건하에서 인큐베이션되는 사실로 이해되어야 한다.

여기 사용된 것과 같은 "프라이머"라는 용어는, 프라이머 연장 조건 하에 있는 경우 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 바람직하게는, 상기 프라이머는 데옥시리보오스 올리고뉴클레오티드이다.

프라이머들은, 이에 제한되지는 않지만, 직접적인 화학합성을 포함하는 임의의 적당한 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 프라이머들은 주형 DNA내 특이적 데옥시뉴클레오티드 서열들과 혼성화하도록 설계되거나(특이적 프라이머들) 또는 랜덤 합성될 수 있다(임의(arbitrary) 프라이머들).

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "특이적 프라이머"라는 용어는 증폭되는 주형 DNA 내 특이적인 데옥시뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열의 프라이머를 의미한다.

"상보적"이라 함은 프라이머가, 프라이머 연장 조건 하에 있는 경우 주형 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있도록 주형 DNA의 영역과 혼성화될 수 있다는 사실로서 이해된다. 바람직하게는, 상기 영역은 주형 DNA의 영역과 100% 상보성을 갖는다. 즉, 프라이머와 상보성인 영역에서 각 뉴클레오티드는 단일 가닥 주형에 존재하는 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다. 그러나, 당업자는 주형 DNA에 대하여 100% 미만의 상보성을 갖는 영역을 갖는 프라이머들이 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법을 실시하는데 기능할 것이라는 것을 이해할 것이다.

"임의(arbitrary) 프라이머"라는 용어는 임의적으로 합성된 서열을 갖고, 주형 DNA의 임의의 위치에들에서 상기 DNA의 합성을 개시하는데 사용되는 프라이머를 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에서는, 임의 프라이머들의 군이 사용된다. "임의 프라이머들"이라는 용어는 랜덤서열을 갖고, 주형 DNA의 임의의 위치들에서 상기 DNA의 합성을 개시하는데 사용되는 프라이머들의 세트를 의미한다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머는 특이적이다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머는 임의적이다. 바람직하게는, 상기 임의 프라이머는 3'-5' 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호된다. 보다 바람직하게는, 상기 임의 프라이머는 3'-5' 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호되는 6개의 올리고뉴클레오티드들인, "헥사뉴클레오티드" 또는 "헥사머(hexamer)"이다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "엑소뉴클레오티드들의 작용에 대하여 보호되는"이라는 표현은 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라에 존재하는 임의의 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성에 의한 뉴클레오티드 분해에 저항성이도록 변형된 프라이머를 의미한다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에서, 하나 이상의 프라이머가 사용될 수 있으며, 특이적 및/또는 임의 프라이머들을 사용할 수 있다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 2μM 내지 100μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 20μM 내지 80μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 40μM 내지 60μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 약 50μM이다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "뉴클레오시드 트리포스페이트"라는 용어는 펜토오스, 질소 염기 및 3개의 포스페이트기들의 공유결합에 의해 형성된 유기 분자를 의미한다.

상기 뉴클레오시드 트리포스페이트들이라는 용어는, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, 또는 이들의 유도체들과 같은 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(dNTPs)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들은 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP이다. 더욱 바람직하게는, 이들 4개의 dNTPs는 균등 몰 조건이다. 본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들의 농도는 100μM 내지 800μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들의 농도는 200μM 내지 600μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들의 농도는 약 500μM이다.

상기 뉴클레오시드 트리포스페이트들이라는 용어는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(ddNTPs)도 포함하며, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 ddATP, ddCTP, ddITP, ddUTP, ddGTP, ddTTP, 또는 이들의 유도체들이 있다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 일부 바람직한 구체예들에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 하나의 프라이머는 당 기술 분야에서 공지된 기술들을 통하여 표지된다(labelled).

표지된 뉴클레오티드는, 예로서 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트일 수 있다. 검출가능한 라벨들은, 예로서 방사성 동위원소들, 형광 라벨들, 화학발광 라벨들, 생체발광 라벨들 또는 효소 라벨들을 포함한다.

본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "주형 DNA"라는 용어는 상보적인 DNA 가닥을 합성하기 위해 기질로서의 역할을 할 수 있는 DAN 분자를 의미하며; 즉 복제, 증폭 또는 서열화될 DNA 분자에 대한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 주형 DNA는 플라스미드 DNA다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 주형 DNA는 게놈 DNA다.

주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화는 프라이머 연장 조건하에서 실시된다. 상기 "프라이머 연장 조건"이라는 표현은, 프라이머에서 개시되는 주형 DNA-의존적 합성이 일어날 수 있는 조건을 의미한다.

본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 따른 상기 주형 DNA 합성은 열적 사이클링(thermal cycling) 공정을 통하여 또는 본질적으로(essentially) 일정한 온도에서 일어날 수 있다.

"등온 조건들"은 본질적으로 항온으로서 이해되어야 한다. 바람직하게는, 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 따른 상기 주형 DNA 합성은 본질적으로 일정한 온도에서 일어난다. 보다 바람직하게는, 25℃ 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 약 30℃의 본질적으로 일정한 온도에서 일어난다.

DNA 복제를 가능하게 하는 다수의 방법들이 당 기술분야에 알려져 있다. 일부 방법들은, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)과 같은 열적 사이클링 공정을 필요로 한다. 다른 방법들은 열적 사이클링 공정을 요구하지 않는데, 그보다는 이들은 본질적으로 일정한 온도에서 수행되며, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 롤링서클증폭(Rolling Circle Amplication:RCA), 다중분리증폭(Multiple Detachment Amplication:MDA), 가닥치환증폭(Strand Displacement Amplication:SDA) 또는 루프매개증폭(Loop Mediated Amplication:LAMP)이 있다. 본 발명의 방법에 따른 주형 DNA의 증폭은 열적 사이클링 공정을 통해 또는 본질적으로 일정한 온도에서 일어날 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 증폭 방법에 따른 주형 DNA의 증폭은 롤링서클증폭(RCA), 다중분리증폭(MDA), 가닥치환증폭(SDA) 또는 루프매개증폭(LAMPA)을 통하여 일어난다.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법을 실시하는데 적당한 성분들을 포함하는 키트 또는 장치들에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 측면은 다음을 포함하는 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다:

a) 본 발명의 DNA 폴리머라아제 키메라,

b) 버퍼, 및

c) 염화 마그네슘.

본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트, 암모늄염, 칼륨염 또는 상기 임의의 조합을 더 포함한다.

바람직하게는, 상기 암모늄 염은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택된다: 황화암모늄, 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄.

바람직하게는, 상기 칼륨염은 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨이다.

본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 프라이머를 더 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머는 3'-5' 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호된 임의 프라이머이다.

본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 뉴클레오시드 트리포스페이트들을 더 포함한다. 예로서, 본 발명의 본 측면의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들 및/또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 더 포함한다.

본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 적어도 하나의 트리포스페이트 뉴클레오시드 또는 하나의 표지된 프라이머를 포함한다. 상기 표지된 뉴클레오시드는 예로서, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트일 수 있다.

상기 키트는, 이에 제한되지는 않지만, 버퍼들, 오염방지제들 등을 더 포함할 수 있다. 한편, 상기 키트는 실시 및 최적화에 필요한 모든 지지물(support) 및 수용기(recipient)들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위한 지시설명서를 더 포함한다.

본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 걸쳐 사용된 "포함한다"라는 단어 및 이의 변형들은, 다른 기술적 특징들, 첨가물들, 성분들 또는 단계들을 배제하는 것이 아니다. 당업자에게는, 본 발명의 기타 목적들, 장점들 및 특징들을 부분적으로는 본 명세서의 설명으로부터, 그리고 부분적으로는 본 발명의 실시로부터 추측할 수 있을 것이다. 하기 도면들 및 실시예들은 예시적으로 제공되며, 이들이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

도 1은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능에서 Tween^®20과 (NH₄)₂SO₄의 효과를 보여준다. 상기 분석은 나타낸 양의 플라스미드 DNA(4.2kpb)의 존재 하에서 하기에 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 30℃에서 5시간 동안 인큐베이션 한 후, 반응물들을 실시예에서 설명된 것과 같이 분석하였다. 왼쪽에서, HindIII를 이용하여 Φ29 DNA를 분해한 후 수득된 선형 DNA 단편들을 DNA 길이 마커들로서 사용하였다.
도 2는 Tween^®20와 (NH₄)₂SO₄의 존재 하에서 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의한, 상이한 양의 플라스미드 DNA(펨토그램 수준)의 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween^®20 및 45mM (NH₄)₂SO₄의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 3은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능에서 NH₄ ⁺ 이온의 효과를 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween^®20 및 나타낸 암모늄염 및 나타낸 양의 플라스미드 DNA(4.2kpb)의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 30℃에서 6시간 동안 인큐베이션 후, 반응물들을 주요 설명에 설명된 것과 같이 분석하였다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 4는 Tween^®20과 (NH4)₂SO₄의 존재 하에서 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의해 상이한 양의 바실러스 서브틸리스 게놈 DNA의 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween^®20 및 45mM (NH₄)₂SO₄의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 5는 Φ29 DNA 폴리머라아제에 기초한 DNA 증폭을 위한 상업적 키트(General Electrics HealthCare사의 Illustra 키트)의 현 반응 버퍼에 0.025% Tween^®20 및 45mM (NH₄)₂SO₄의 첨가에 의해 나타난 현저한 개선을 나타낸다. 상기 분석은 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 6은 키메라들 HAY, HGT, HIAY 및 HIGT를 구축하는 상이한 단계들의 도해를 나타낸다.
도 7은 천연 및 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들에 의한 프라이머/주형 DNA 분자들의 겔에서의 지연(retardation)을 나타낸다. 5'에서 라벨된 15염기들/21염기들의 혼성 분자(dsDNA)는, 실시예에 설명된 조건에서 나타낸 것과 같이 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제 또는 키메라성 DNA 폴리머라아제와 함께 인큐베이션되었다. 자유 dsDNA 및 폴리머라아제-DNA 복합체의 운동성들은, 4%(중량/부피) 천연 폴리아크릴아미드겔들(80:1=모노머: 비스아크릴아미드) 내 전기영동에 의한 그의 분리 후 자기방사법에 의해 검출하였다.
도 8은 천연 및 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들의 가공적 복제를 나타낸다. (A) 천연 및 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들에 의해, 가닥 분리물에 커플링된 M13 DNA의 복제. 단일 프라이머를 이용한 250ng의 M13 DNA의 복제를, 천연 또는 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들(30nM)을 이용하여, 실시예에 설명된 것과 같이 실시하였다. 길이에서 M13 DNA 단위의 위치를 오른쪽에 나타내었다. (B) 천연 및 키메라성Φ29 DNA 폴리머라아제들에 의한 가공적 합성. 상기 분석은, 나타낸 DNA 폴리머라아제의 농도를 감소시키면서 사용하여, (A)에서와 동일한 조건하에 실시하였다. 30℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 샘플들을 (A)에 설명된 것과 같이 처리하였다.
도 9는 천연 및 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들에 의한 10fg 플라스미드 DNA의 다중 프라이밍(multiple priming)을 이용한 롤링서클 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 나타낸 버퍼 B 및 50nM의 DNA 폴리머라아제 존재하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. DNA 길이 마커들은 도 1에 나타낸 것과 동일하다.
도 10은 천연 및 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들을 이용하여 100fg의 B. 서브틸리스 게놈 DNA의 다중 프라이밍을 갖는 전체 게놈의 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 나타낸 버퍼 B 및 50nM의 DNA 폴리머라아제 존재하에서, 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. DNA 길이 마커들은 도 1에 나타낸 것과 동일하다.

본 명세서에서 제공된 하기의 특이적 예들은 본 발명의 성질을 예시한다. 이들 실시예들은 단지 예시적인 목적을 위해 포함된 것이지, 본 명세서에서 특허청구된 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 하기 설명된 예들은 본 출원의 분야를 제한함이 없이 본 발명을 예시하는 것이다.

실시예 1. Φ29 DNA 폴리머라아제에 의한 다중 프라이밍을 이용한 DNA 증폭을 위한 실험 조건의 최적화.

Φ29 DNA 폴리머라아제는 수 피코그램의 원형 DNA로부터 출발하여 10⁴~10⁶배 증폭되는 것으로 나타났다. 이러한 목적을 위하여, 40mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50mM KCl 및 10mM MgCl₂를 포함하는 반응 버퍼(이하, 버퍼 A)를 사용하였다. 상이한 세제 및 염 조건들의, Φ29 DNA 폴리머라아제의 DNA 증폭능에 대한 영향을 시험한 결과, 버퍼 A에 0.025% Tween^®20 및 45mM (NH₄)₂SO₄를 동시 첨가하는 것에 의해, 제공된 한정된 양의 DNA의 증폭이 매우 개선되는 것이 발견되었다.

플라스미드 DNA를 증폭시키기 위한 반응 조건들. - 12.5㎕의 버퍼 A, 3'-5' 엑소뉴클레아제의 작용에 대하여 보호된 50μM의 헥사머들, 각각 500μM의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP), 나타낸 양의 플라스미드 DNA(크기 4.2kbp), 지시된 경우, (NH₄)₂SO₄ 45mM 또는 0.025% Tween^®20 또는 이들 모두의 조합을 포함한 인큐베이션 혼합물을 첨가하였다. DNA를 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하고, 이어서 5분 동안 빙냉시켜 변성시켰다. 50 nM Φ29 DNA 폴리머라아제를 첨가하여 반응을 개시하고, 30℃에서 인큐베이션한 후 65℃에서 10분 동안 가열하므로써 반응을 중단시켰다. 결과를 분석하기 위하여, 1㎕의 샘플들을 반응물들로부터 취하고, 증폭된 DNA를 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키고, 0.7% 아가로오스 겔에서 전기영동시켰다. 브롬화 에티디움(ethidium bromide)으로 겔을 염색하므로써 DNA를 검출하였다.

게놈 DNA를 증폭시키기 위한 반응 조건들. - 인큐베이션 혼합물은 12.5㎕의 A, 45mM (NH₄)₂SO₄, 0.025% Tween^®20, 3'-5' 엑소뉴클레아제의 작용에 대하여 보호된 50μM의 헥사머들, 각각 500μM의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP) 및 나타낸 양의 바실러스 서브틸리스 게놈 DNA(크기 4Mpb)를 포함하였다. DNA를 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하고, 이어서 5분 동안 빙냉시켜 변성시켰다. 50 nM Φ29 DNA 폴리머라아제를 첨가하여 반응을 개시하고, 30℃에서 인큐베이션한 후 65℃에서 10분 동안 가열하므로써 반응을 중단시켰다. 결과를 분석하기 위하여, 1㎕의 샘플들을 반응물들로부터 취하고, 0.7% 아가로오스 겔에서 전기영동시켰다. 브롬화 에티디움으로 겔을 염색하므로써 DNA를 검출하였다.

도 1은 제공된 소량의 플라스미드 DNA의 증폭에서 45mM (NH₄)₂SO₄ 및 0.025% Tween^®20의 첨가 효과를 나타낸다. 나타낸 것과 같이, Φ29 DNA 폴리머라아제는 100fg의 제공된 DNA가 사용된 경우, 표준 버퍼 A로 검출가능한 임의의 증폭 산물을 제공하지 않았다. 이들 반응 조건들에서, DNA의 부재 하에서 0.025% Tween^®20의 첨가는 미량(trace) DNA 생성물들의 출현을 일으켰으며, 이는 아마도 랜덤 헥사머 프라이머들의 혼성화 및 신장에 의해 유발된 비특이적 DNA 증폭의 결과로 인한 것일 것이다. 동일한 미량이 제공된 10fg의 DNA에서도 관찰되었다. 그러나, 제공된 100fg의 DNA의 존재 하에서, 0.025% Tween^®20의 첨가는 Φ29 DNA 폴리머라아제가 증폭된 플라스미드의 검출가능한 양을 생산하는 것을 가능하게 하였다. 특이적 또는 비특이적인 증폭된 DNA의 총 생산은 버퍼 A에 0.025% Tween®20의 첨가가 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능을 증강시킨다는 것을 나타내었다. 유사한 효과가 NP40 세제에서도 관찰되었다. 대조적으로, Triton X100 및 Triton X114와 같은 다른 분석된 세제들은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능을 증강시키지 않았다(미도시). 버퍼 A에 0.025% Tween^®20과 45mM (NH₄)₂SO₄의 동시 첨가는 증폭된 산물들의 수율 및 특이성에서 두가지 결과들을 나타내었다: 1) 제공된 DNA의 부재 하에서 DNA 증폭은 검출되지 않았다; 2) DNA 제공량이 10fg 정도로 적은 경우에도, 단위 길이의 수 mg의 플라스미드 DNA가 증폭에 의해 수득되었다. 대조구로서, 버퍼 A에 45mM (NH₄)₂SO₄를 첨가한 것은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능에서 어떠한 개선도 제공하지 않았다.

따라서, 버퍼 A에 0.025% Tween^®20과 45mM (NH₄)₂SO₄를 동시 첨가한 것(이하, 버퍼 B)은 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의한 원형 DNA의 다중 프라이밍을 이용한 증폭을 실시하기 위한 실험 조건들의 명백한 최적화를 생성하고, 제공된 DNA의 한정된 양(10fg)을 증폭시키는데 이들 두가지 모두가 절대적으로 필요한 반응물이라고 결론지을 수 있다. 실제로, 도 2에 나타낸 것과 같이, 버퍼 B의 사용은, 6시간의 반응 후 0.1fg(약 24 분자) 정도로 낮은 플라스미드의 제공된 양을 이용하므로써, 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제가 마이크로그램 양의 DNA를 합성하는 것을 가능하게 하였다. 성질 대조구로서, EcoRI를 이용한 증폭 산물의 분해는 4.2kb의 dsDNA 단편들을 생성하였으며, 이는 증폭 산물들이 실제로 원래 플라스미드의 탠덤 반복부들(tandem repeats)이었다는 것을 나타내는 것이다. 또한, 상기 버퍼 B는 비특이적 DNA 증폭도 방지하였다(도 2에서, 제공된 DNA 없이 실시된 반응물들에 해당하는 래인들(lanes) 참조).

도 3은 암모늄 이온들과 0.025% Tween^®20이 소량의 플라스미드 DNA의 증폭을 개선시키는 효과를 보여준다. 상기 분석은 0.025% Tween^®20과 나타낸 암모늄 염의 존재 하에서 이전에 언급된 조건 하에서 실시되었다. 도 3에서 관찰될 수 있는 바와 같이, NH₄Cl 및 NH₄CH₃COO는 모두 증폭 산물들의 수율 및 특이성 모두에서 (NH₄)₂SO₄와 유사한 효과를 가졌다. 이러한 결과는, 플라스미드 DNA의 한정량의 증폭에서 (NH₄)₂SO₄의 상기 언급된 효과는 NH₄ ⁺ 이온들로 인한 것임을 나타낸다.

상기 설명된 최적화된 조건들이 게놈 DNA의 증폭에 적용되는지의 여부를 결정하기 위하여, 한정된 농도의 B. 서브틸리스 게놈 DNA (길이 4Mpb) 존재하에서 수행된 동일한 유형의 분석들을 실시하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 버퍼 B 중 0.025% Tween^®20과 45mM (NH₄)₂SO₄의 존재는, 한편으로는 비특이적 DNA 증폭(제공된 DNA가 없는 래인들)을 방지하였지만, 다른 한편으로는, 제공된 DNA가 10fg으로, 즉 현재 상업적인 게놈 증폭 키트들에서 권장되는 양보다 10⁶배 더 낮은 양으로 사용된 경우에도, Φ29 DNA 폴리머라아제가 검출가능한 특이적인 게놈 DNA 증폭을 제공하는 것을 가능하게 하였다.

0.025% Tween^®20 및 45mM (NH₄)₂SO₄의 동시 첨가가, Φ29 DNA 폴리머라아제를 기초로 한 DNA 증폭을 위한 현행 상업적 키트의 증폭 효능을 증가시키는지의 여부를 결정하기 위하여, 도 1, 2 및 3에 설명된 플라스미드 DNA 증폭 분석들의 동일한 유형을 실시하였다. 도 5는 Illustra 키트(GE HealthCare)의 현 반응 버퍼에 0.025% Tween^®20 및 45mM (NH₄)₂SO₄의 첨가에 의해 나타나는 현저한 개선들을 보여준다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 공급자의 권장에 따라, Illustra 키트를 이용하여, 10pg 균등량 또는 그 이상의 양의 플라스미드를 아가로오스 젤에서 검출가능한 방식으로 증폭시킬 수 있다. 대조적으로, Illustra 키트의 반응 버퍼에 0.025% Tween^®20 및 45mM (NH₄)₂SO₄의 동시 첨가는 증폭될 DNA 요구량을 현저히 감소시킬 수 있어서, 증폭에서 4자릿수의 개선을 포함하는, 제공된 플라스미드 DNA 1fg으로부터 증폭산물들이 관찰된다.

실시예 2. HhH 도메인들의 첨가에 의한 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능의 개선///수정 완료

Φ29 DNA 폴리머라아제를 1 또는 2개의 HhH 도메인들과 융합하여, 개선된 DNA 결합능을 가져, 제공되는 DNA를 적은양으로 사용하는 것을 가능하게 하는 신규 DNA 폴리머라아제들을 구축하였다. Φ29 DNA 폴리머라아제의 구조의 검사는 이 효소의 C-말단 끝과 상기 HhH 도메인들의 융합을 선발하는 것으로 이어지며, 이는, 상기 말단 끝(서브도메인 thumb의 끝)이 상단 dsDNA 서열의 터널 입구와 가깝기 때문이다. 생화학 및 구조 데이터가 부모 DNA의 풀림이 아미노 말단 부근에서 일어난다는 것을 증명하였으므로, 상기 HhH 도메인들의 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제의 N-말단 끝과의 융합은 가닥 분리물의 고유능력을 보완할 수 있을 것이다. 또한, N-말단 끝에 HhH 도메인들의 배치는 주형 DNA와 헥사머 프라이머의 혼성화에 의해 형성된 dsDNA 부분의 결합을 개선시키기 위해 적당한 것이 아닐 것이다. 이러한 의미에서, Φ29 DNA 폴리머라아제의 N-말단 끝에서 서열 (His)₆의 융합은 증폭에 손상효과를 갖는다.

2.1 키메라성 DNA 폴리머라아제 구축물 .

HIAY 및 HIGT을 만들기 위하여, HhH 도메인들인, M. 칸들레리의 토포아이소머라아제 V의 H (56개 아미노산들) 및 I (51개 아미노산들) (GenBank 코드 AF311944 및 Pavlov 등. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 13510~13515)를 암호화하는 뉴클레오티드들을 포함한 DNA 단편의 합성을 GenScript사에 의뢰하였으며, I는 상업적 벡터 pUC57의 EcoRV 자리들 사이에 클로닝되었다. 결과의 플라스미드 pUC57-HhH를 PCR에 의해 H 및 I 도메인들을 암호화하는 DNA 단편을 증폭하기 위한 주형으로서 사용하였다. 따라서, 프라이머 1(서열번호: 8) 또는 프라이머 2(서열번호: 9)와 함께, 프라이머 3(서열번호: 7)은 각각 369bp의 DNA I 및 II 단편들을 제공하였다. 두 개의 프라이머들 모두에 의해 도입된 KasI 자리에 추가하여, 프라이머 1은 서열번호: 5 연결자(connector)를 암호화하는 서열도 도입하였으며(Pavlov 등. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 13510~13515), 반면 프라이머 2는 서열번호: 6 연결자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도입하였다(서열번호: 10 연결자 유도체, 이는 이전에 Sun 등 Proteins. 2006; 65: 231~238에서 설명됨). 상기 프라이머 3은 6개의 히스티딘 잔기들을 암호화하는 서열에 이어, 정지 코돈 및 BamHI 자리를 포함하였다(도 6에서, 키메라성 DNA 폴리머라아제 구축물을 단순화하여 나타낸 도해 참조).

동시에, Φ29 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 유전자(572개 아미노산들)를 포함하는 pJLw2 플라스미드 유도체(Lazaro 등. Methods Enzymol. 1995; 262: 42~49)를, 5' HindIII 자리 및 프라이머 5(서열번호: 12) 또는 프라이머 6(서열번호: 13)을 포함하는 프라이머 4(서열번호: 11)를 이용하여 실시되는 PCR에 대한 주형으로서 사용하여, 각각 1757 bp의 단편 III 및 단편 IV를 수득하였다. 단편 III 및 단편 IV는, 따라서 Φ29 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 DNA에 이어, KasI 자리도 포함하는 서열번호: 5 (단편 III) 및 서열번호: 6 (단편 IV) 서열들을 포함한다. 상기 단편들 I∼IV를 0.7% 아가로오스 겔에서 정제하고, 그 후 KasI로 분해시켰다. 분해된 DNA 단편들 I과 III, 및 II와 IV를 T4 DNA 리가아제로 결찰시켜, 각각 키메라 HIAY (단편 V) 미 HIGT (단편 VI)를 암호화하는 2108bp의 선형 DNA를 수득하였다. 결찰된 생성물들을 0.7% 아가로오스 겔에서 정제하고, 그 후 BamHI과 HindIII를 사용하여 분해시켰다. 상기 분해 산물들을 아가로오스 겔에서 전기영동에 의해 정제하였다. 단편 V 및 단편 VI를 최종적으로 벡터 pT7-4로 클로닝하였다(Tabor 등. Proc Natl Acad Sci USA. 1985; 82: 1074~1078). 상기 키메라들 HIAY (Φ29 DNA 폴리머라아제 + 서열번호: 5 연결자 + topoV의 H 및 I 도메인들) 및 HIGT (Φ29 DNA 폴리머라아제 + 서열번호: 6 연결자 + topoV의 H 및 I 도메인들)을 주형으로서 사용하고, 돌연변이형성 키트에 관한 QuikChange®(Stratagene)를 이용하여 TopoVd의 H 단편 후에 정지 코돈을 삽입하므로써, 키메라들 HGT 및 HAY를 각각 구축하였다. 전체 유전자를 서열화하므로써, DNA 서열 및 추가 돌연변이의 부재의 확인을 실시하였다. 상기 키메라성 DNA 폴리머라아제들을 대장균의 BL21(DE3) 세포들에서 발현시켰으며, 이는 pJLw2 플라스미드 유도체 내에 상기 클로닝된 키메라 유전자를 수용하였고, 그 후 (Lazaro 등. Methods Enzymol. 1995; 262: 42~49)에 설명된 것과 같이 본질적으로 정제되었다.

요약하면, 수득된 상기 키메라성 DNA 폴리머라아제들은 다음과 같았다:

HAY: Φ29 DNA 폴리머라아제 -서열번호: 5- HhH H (635 aa; ~73 kDa)

HGT: Φ29 DNA 폴리머라아제 -서열번호: 6- HhH H (635 aa; ~73 kDa))

HIAY: Φ29 DNA 폴리머라아제 -서열번호: 5- HhH H-I (692 aa; ~80 kDa)

HIGT: Φ29 DNA 폴리머라아제 -서열번호: 6- HhH H-I (692 aa; ~80 kDa)

2.2. 키메라성 DNA 폴리머라아제들의 DNA 결합능 .

Φ29 DNA 폴리머라아제의 끝에서 HhH 모티프들의 융합이 상기 DNA에 상기 키메라들의 개선된 결합능을 부여하였는지의 여부를 확인하기 위하여, 겔 중에서 DNA의 전기영동 이동성의 지연 분석을 실시하였다.

분석 조건. - 15개의 염기들의 올리고뉴클레오티드(서열번호: 14) 및 상기 15개의 염기들의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 서열에 추가하여 6개의 뉴클레오티드들의 5' 연장물들을 갖는 21개의 염기들의 올리고뉴클레오티드(서열번호: 15)를 Isogen으로부터 제공받았다. 상기 15개 염기들의 올리고뉴클레오티드를 5'에서 [γ-³²P] ATP 및 T4 키나아제 폴리뉴클레오티드로 표지하였다. 상기 5'에서 표지된 15개 염기들의 올리고뉴클레오티드를 0.2M NaCl 및 60mM (pH 7.5) 트리스-HCl 존재 하에서 21개 염기들의 올리고뉴클레오티드와 혼성화하였다. 5'에서 표지된 15개 염기들의 올리고뉴클레오티드/21개 염기들의 혼성화된 올리고뉴클레오티드 분자를 사용하여 천연 또는 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들과의 작용을 분석하는데 사용하였다. 최종 부피 20㎕의 상기 인큐베이션 혼합물은 50mM (pH 7.5) 트리스-HCl, 1mM 디티오트레이톨, 10mM MgCl₂, 20mM 황화암모늄, 0.1mg/ml 소 혈청 알부민(BSA), 4% 글리세롤, 1nM의 15염기들/21염기들의 올리고뉴클레오티드 분자, 및 나타낸 농도의 천연 또는 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제를 포함하였다. 4℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 샘플들을 12mM(pH 7.5)의 트리스-아세테이트 및 1mM의 EDTA를 포함하고 동일한 버퍼 중 4℃에서 전개된, 4% 폴리아크릴아미드 겔(중량/부피)(모노머:비스=80:1) 중에서 전기영동시켰으며, 이는 본질적으로 (Carthew 등 Cell. 1985; 43: 439~448)에서 설명된 바에 따랐다. 방사선사진촬영 후, 상기 폴리머라아제-dsDNA 복합체가, 표지된 DNA의 이동 위치에서 운동성(지연성) 분리물로서 검출되었다.

이들 조건 하에서, 상기 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제는 15염기들/21염기들의 표지된 혼성화 올리고뉴클레오티드 분자를 사용하여 단일한 지연 밴드를 생성하였며(도 7 참조), 이는 중합에 대해 적당한 안정한 효소-DNA 복합체로서 해석되었다(Mendez 등. J Biol Chem. 1994; 269: 30030~30038). 상기 키메라들 HAY, HGT 및 HIGT는, 기질의 보다 큰 부분이 약 2배의 더 높은 농도를 필요로 한 천연 DNA 폴리머라아제와 달리 9.5nM 농도를 이용하여 분리되었으므로, 천연 효소보다 더 큰 DNA 결합능을 나타내었다. 상기 키메라 HIAY는 천연 폴리머라아제와 유사하거나 또는 그보다 더 낮은 DNA 결합능을 가졌다. 이들 결과들로부터, 일반적으로, Topo V의 HhH H 및 H+I 도메인들의 Φ29 DNA 폴리머라아제의 C-말단 끝에의 첨가는, 키메라 HIAY의 경우에서와 같이 예외가 있기는 하지만, 개선된 DNA 결합능을 제공한다는 결론을 내릴 수 있다.

2.3. 키메라성 DNA 폴리머라아제들에 의한 롤링서클 복제.

TopoV의 HhH 도메인들의 Φ29 DNA 폴리머라아제의 C-말단 끝에의 첨가에 의해 수득된 DNA 결합에서의 개선이 한편으로는 중합 활성 및 다른 한편으로는 가닥 분리물에 커플링된 DNA의 가공적 합성에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위하여, M13 프라이머를 이용한 복제 분석을 실시하였으며, 여기에서 상기 DNA 폴리머라아제는 DNA 올리고뉴클레오티드의 3'-OH기로부터의 중합을 시작하였다. 이 분석에서, 최초 복제 사이클은 가닥 분리물을 필요로 하지 않지만, 일단 완료된 후에는, 상기 폴리머라아제는 프라이머의 5' 말단에서 발견되며, 따라서 이후의 복제 사이클들을 계속하기 위해서는 활성 분리물을 필요로 한다(롤링서클 유형).

분석 조건.- M13mp18 ssDNA를, 0.2M NaCl 및 60mM (pH 7.5) 트리스-HCl 존재 하에서 범용 프라이머로 혼성화하고, 결과 분자를 프라이머/주형으로서 사용하여 상기 키메라성 DNA 폴리머라아제들에 의해 가닥 분리물에 커플링된 가공적 DNA의 중합을 분석하였다. 상기 인큐베이션 혼합물은, 25㎕ 중에, 50mM(pH 7.5) 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨, 4% 글리세롤, 0.1mg/ml BSA, 40μM dCTP, dGTP, dTTP, 및 [α-³²P]dATP (1μCi), 250ng의, 서열번호: 16의 올리고뉴클레오티드로 프라임화된 M13mp18 ssDNA, 및 30nM의 천연 또는 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제를 포함하였다. 30℃에서 나타낸 시간 동안 인큐베이션한 후, 0.1% EDTA 10mM -SDS의 첨가에 의해 반응을 중단시키고, 샘플들을 Sephadex G-50 컬럼을 통하여 여과시켰다. 상대적 활성을 제외된 부피에 대응하는 Cerenkov 방사로부터 계산하였다. 크기 분석을 위하여, 상기 표지된 DNA를 0.7M NaOH로 처리하여 변성시키고, 0.7% 알칼리성 아가로오스 겔 중에서 전기영동시켰으며, 이는 (McDonell 등. J Mol Biol. 1977; 110: 119~146)에 설명된 바에 따랐다. 전기영동 후, 단위 길이의 M13mp8 ssDNA를, 에티디움 브로마이드로 염색하여 검출하였으며, 겔들을 그 후 건조 및 방사선촬영하였다.

도 8A에 나타낸 것과 같이, HhH 도메인들의 존재가 키메라성 DNA 폴리머라아제들의 가닥 분리능을 간섭하지 않는다는 것은 중요한 발견이다. 키메라들 HAY, HGT, HIAY 및 HIGT에 의해 합성된 DNA의 양은 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의해 합성된 것보다 더 많았다(각각, 4, 5, 5 및 7배). 복제 속도는 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제로 수득된 것과 유사하거나(키메라들 HAY 및 HGT의 경우) 또는 더욱 빨랐다(키메라들 HIGT 및 HIAY). 이러한 결과는, 키메라들 중 Φ29 DNA 폴리머라아제의 C-말단 각각에서 HhH 도메인들의 존재가 상기 롤링서클 복제동안 주형 DNA의 이용을 개선시킨다는 것을 나타낸다.

2.4. 키메라성 DNA 폴리머라아제들에 의한 가공적 중합.

Φ29 DNA 폴리머라아제는, 보조 단백지들의 부재 하에서 DNA로부터 해리됨이 없이 70kb 초과를 통합할 수 있기 때문에, 가공적 DNA 복제에 대한 전형적인 예이다. 따라서, 상기 키메라성 DNA 폴리머라아제들에서 Φ29 DNA 폴리머라아제의 C-말단 끝에서 HhH 도메인들의 융합이 중합 가공성에 영향에 미쳤는지의 여부를 분석하였다.

분석 조건. - 상이한 비율의 효소/DNA를 이용하여 키메라성 DNA 폴리머라아제들의 가공성을 분석하였다. 상기 인큐베이션 혼합물은 25㎕ 중에, 50mM(pH 7.5) 트리스-HCL, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨, 4% 글리세롤, 0.1mg/ml BSA, 40μM dCTP, dGTP, dTTP, 및 [a-³²P]dATP (1μCi), 250ng의 프라임화된 M13mp18 ssDNA, 및 나타낸 감소량의 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제 또는 키메라성 DNA 폴리머라아제들을 포함하였다. 20분 동안 30℃에서 인큐베이션 한 후, 10mM EDTA - 0.1% SDS의 첨가에 의해 반응을 중단시키고, 샘플들을 Sephadex G-50 컬럼을 통하여 여과시켰다. 크기 분석을 위하여, 상기 표지된 DNA를 0.7M NaOH로 처리하여 변성시키고, 0.7% 알칼리성 아가로오스 겔 중에서 전기영동시켰다. 감소하는 비율의 DNA 폴리머라아제/DNA를 이용하여 복제 생성물들의 길이를 분석하므로써 가공성을 평가하였다

도 8B에 나타낸 것과 같이, 감소하는 비율의 효소/DNA는, 가공적 DNA 중합 모델에 따라, 천연 또는 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들에 의해 합성된 신장 생성물들의 길이를 변경시키지 않았다.

2.5. 천연 및 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들에 의한 플라스미드 DNA 의 다중 프라이밍을 이용한 롤링서클증폭 ( RCA ).

이제까지 상기에서 설명된 것과 같이, 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제가 갖는 높은 가공성 및 가닥 분리능은 모두, Amersham Biosciences/Molecular Staging에 의해 등온 ssDNA를 증폭하기 위한 더욱 효율적인 공정들 중 하나의 개발에 대한 기초이며, 여기에서 랜덤 헥사머 프라이머들과 조합된 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제는 피코그램의 원형 플라스미드들의 가닥 분리물에 의해 10⁴ 내지 10⁶배의 등온 및 정확한 증폭을 달성한다[Templiphi™(www.gehealthcare.com)]. 그의 C-말단 끝에 융합된 (His)₆ 서열을 포함한 Φ29 DNA 폴리머라아제를 이용한 결과들은, 그의 효율에도 불구하고, 단일 프라이머를 이용한 롤링서클복제 동안, 다중 프라이밍을 이용하는 RCA 동안 검출가능한 증폭 산물들을 제공할 수 없었음을 보여주었다. 이는 Φ29 DNA 폴리머라아제의 다른 돌연변이 유도체들의 경우도 동일하여, 천연 DNA 폴리머라아제의 수준으로 M13 DNA를 복제하면서 dNTP에 대한 보다 큰 친화도를 나타내었지만, 증폭산물은 제공할 수 없었다. 따라서, Φ29 DNA 폴리머라아제의 C-말단 끝에 HhH 도메인들의 융합은, 단일 프라이머를 이용하여 롤링서클복제를 수행하는 천연 효소의 고유 성능을 개선시켰지만, 다중 프라이밍을 이용한 RCA 동안 유사한 효능 증가는 기대될 수 없었다.

분석 조건. - 인큐베이션 혼합물은, 12.5㎕의 버퍼 B 중에 공급물로서 10fg의 플라스미드 DNA(4.2 kpb)를 포함하였다. 제공된 DNA를 변성시키기 위하여, 샘플들을 95℃에서 3분 동안 인큐베이션시킨 후, 5분 동안 빙냉시켰다. 반응을 50nM 천연 또는 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제를 첨가하므로써 개시하였다. 30℃에서 나타낸 시간 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 65℃에서 10분 동안 인큐베이션시켜 반응을 중지시켰다. 각 반응물 1ml를 EcoRI로 분해시킨 후, 0.7%의 아가로오스 겔 중에서 전기영동하므로써 분석하였다. 전기영동 후, 증폭된 DNA를 에티디움 브로마이드를 이용하여 염색하므로써 검출하였다.

도 9에 나타낸 것과 같이, 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제는 4시간의 반응으로부터 검출가능한 증폭산물을 제공하였다. 상기 키메라 HAY는 4시간 반응으로부터 검출가능한 증폭산물을 제공하였으며, 5시간 후에는 증폭의 총 생산량은 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제를 이용하여 수득되는 것의 2배였다. 상기 키메라 HGT는 키메라 HAY를 이용하여 수득된 양에 필적할 만한 증폭된 DNA의 양을 생산하였다; 최대 증폭 수율이 보다 짧은 시간에(3시간) 수득되었다는 것은 흥미로운 것이다. 키메라s HIAY 및 HIGT를 이용한 증폭된 DNA의 최대량은 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제를 이용하여 수득된 것과 유사하였지만, 키메라 HGT의 경우에서와 같이, 상기 최대 수율은 3시간 반응으로부터 수득되었다. EcoRI로 상기 4개의 키메라들을 갖는 합성 DNA를 분해시킨 후, 80% 초과의 증폭된 DNA는 4.2kb의 dsDNA 단편을 제공하였으며, 이는 증폭산물의 보다 많은 부분이 실제로 원래 플라스미드의 탠덤 반복부들로 이루어졌다는 것을 나타내었다.

이러한 결과는 키메라성 DNA 폴리머라아제들이 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제보다 제한된 양(10fg)의 플라스미드 DNA를 증폭시키는 능력이 더욱 크다는 것을 나타낸다.

2.6 천연 및 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제들에 의한 게놈 DNA 의 다중 프라이밍을 이용한 DNA 의 증폭.

상기 설명된 것과 같은 다중 프라이밍을 이용한 RCA 기술에 추가하여, 다중분리증폭(MDA)으로 알려진 전체 게놈의 증폭 공정을, Φ29 DNA 폴리머라아제의 성질에 기초하여 랜덤 헥사머 프라이머들의 이용과 조합하여 개발하였다(Dean 등. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 5261~5266). Genomiphi™ (GE Healthcare) 및 Repli-G^®(Qiagen) 키트들은, 본 공정을 기초로 하여, 10ng의 게놈 DNA의 최소량을 필요로 하였다. 상기 키메라성 DNA 폴리머라아제들이 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제에 비해 게놈 DNA의 제한된 양을 증폭시키는 개선된 능력을 갖는지의 여부를 조사하기 위하여, B. 서브틸리스 게놈 DNA의 MDA를 수행하였다.

분석 조건. - 인큐베이션 혼합물은, 12.5㎕의 버퍼 B 중에 100fg의 B. 서브 틸리스 게놈 DNA를 포함하였다. DNA를 변성시키기 위하여, 샘플들을 95℃에서 3분 동안 인큐베이션한 후 5분 동안 빙냉시켰다. 반응은 50nM의 천연 또는 키메라성 Φ29 DNA 폴리머라아제를 첨가하므로써 개시하였다. 30℃에서 나타낸 시간 동안 인큐베이션한 후, 샘플들을 65℃에서 10분 동안 인큐베이션하므로써 반응을 중단시켰다. 각 반응물 1㎕를 0.7% 아가로오스 겔에서 전기영동시켜 분석하였다. 전기영동 후, 에티디움 브로마이드로 염색하여 증폭된 DNA를 검출하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 설명된 실험 조건에서, 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제는 5시간의 인큐베이션 후 검출가능한 증폭 산물들을 제공하였다. 상기 키메라 HAY도 이 시간에서 증폭 산물들을 생산하였으나, 6시간 후 증폭된 DNA의 총 양은 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제를 이용하여 수득된 것보다 훨씬 더 많았다. 관찰되는 바와 같이, 나머지 키메라들 HGT, HIAY 및 HIGT는 더욱 짧은 분석 시간(3시간)에 명확한 증폭 산물들을 제공하였으며, 이 시간에서 총 증폭량은 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제를 이용하여 6시간 후 관찰된 것과 유사하거나(HIAY 및 HIGT의 경우) 또는 더 많았다(HGT). 이들 결과들은 상기 HhH 도메인들의 존재가 키메라성 DNA 폴리머라아제들에게, 천연 Φ29 DNA 폴리머라아제에 비해 게놈 DNA를 증폭시키는 향상된 능력을 제공한다는 것을 나타낸다.

2.7 키메라성 DNA 폴리머라아제들의 정확도의 측정.

10fg의 플라스미드 DNA의 다중 롤링서클증폭에 해당하는, 도 9에 나타낸 실험으로부터 각 샘플들 3㎕를 17㎕의 제한효소 혼합물(2㎕ New England Biolabs (NEB) 10× EcoRI 버퍼, 0.5㎕ [10유닛]의 NEB EcoRI 엔도뉴클레아제 및 14.5㎕의 H₂O) 존재하에 인큐베이션하여 증폭된 플라스미드의 선형 단량체들을 수득하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, DNA를 Qiagen 겔 추출 키트 컬럼을 통해 정제하였으며, 30㎕ TE 버퍼(10mM (pH 7.5) 트리스-HCl, 1mM EDTA)로 용리하였다. 각 용리물 10㎕를, 2㎕ NEB 10× 리가제 버퍼, 8㎕ H₂O 및 0.5㎕(200유닛) NEB T4 DNA 리가아제와 함께 인큐베이션하여 재결찰시켰다. 반응물을 16℃에서 하룻밤동안 인큐베이션시키고, 대장균 XL-1 Blue 적격 세포들(competent cells)을 각각 2㎕를 이용하여 형질전환시켰다. 증폭 샘플들 각각을 이용하여 약 1000개의 형질전환체들이 수득된 반면, 동일한 방식으로 처리된 4.2kpb의 10fg의 플라스미드를 포함한 대조구 샘플들로부터는 어떤 것도 수득되지 않았으며, 여기에서 상기 샘플들은 각각 상기 설명된 것과 같았다. 두 개의 클론들을 각 형질전환으로부터 선발하고, 대응 플라스미드들을 정제하고 표준 방법에 따라 서열화하였다. 서열화에 사용된 올리고뉴클레오티드들은 다음과 같았다: pT7-N (서열번호: 17), sp4+10 (서열번호: 18) 및 sp10+7 (서열번호: 19). 모두 합하여, 천연 및 키메라성 DNA 폴리머라아제들에 의해 증폭된 4918개의 비-중복 뉴클레오티드들의 각 플라스미드들을 서열화하였다. 결과를 표 1에 나타내었으며, 이들은 천연 효소에 유사한 키메라성 DNA 폴리머라아제들의 합성 정확도를 나타내었다.

천연 및 키메라성Φ29 DNA 폴리머라아제들의 중합 정확도
폴리머라아제	돌연변이들
천연	0
HAY	0
HGT	0
HIAY	1 (G에서 T로 염기전환)
HIGT	0

천연 및 키메라성 DNA 폴리머라아제들에 의해 증폭된 플라스미드들의 각각의 4918개의 비-중복(non-overlapping) 뉴클레오티드들을 본문에서 설명된 것과 같이 서열화하였다.

<110> Consejor Superior de Investigaciones Cientificas <120> Quimera de ADN polimerasa del fago phi29 <130> ES1641.386.1 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 572 <212> PRT <213> Bacteriophage phi-29 <400> 1 Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr Thr Lys Val 1 5 10 15 Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile Glu Asp His 20 25 30 Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met Ala Trp Val 35 40 45 Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys Phe Asp Gly 50 55 60 Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys Trp Ser Ala 65 70 75 80 Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg Met Gly Gln 85 90 95 Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys Arg Lys Ile 100 105 110 His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe Pro Val Lys 115 120 125 Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly Asp Ile Asp 130 135 140 Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro Glu Glu Tyr 145 150 155 160 Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Arg Leu Leu Ile 165 170 175 Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser Asp Ser Leu 180 185 190 Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys Lys Val Phe 195 200 205 Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr Ala Tyr Arg 210 215 220 Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys Glu Ile Gly 225 230 235 240 Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala Gln Met Tyr 245 250 255 Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu Gly Lys Tyr 260 265 270 Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile Arg Cys Glu 275 280 285 Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile Lys Arg Ser 290 295 300 Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly Gly Glu Ile 305 310 315 320 Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met Lys Glu His 325 330 335 Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Phe Lys Ala 340 345 350 Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr Tyr Ile Lys 355 360 365 Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu Met Leu Asn 370 375 380 Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr Gly Lys Val 385 390 395 400 Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu Gly Glu Glu 405 410 415 Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe Ile Thr Ala 420 425 430 Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys Tyr Asp Arg 435 440 445 Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly Thr Glu Ile 450 455 460 Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Trp 465 470 475 480 Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Val Lys Tyr Leu Arg Gln Lys Thr 485 490 495 Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys Leu Val Glu 500 505 510 Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val Lys Cys Ala 515 520 525 Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu Asn Phe Lys 530 535 540 Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln Val Pro Gly 545 550 555 560 Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys 565 570 <210> 2 <211> 984 <212> PRT <213> Methanopyrus kandleri <400> 2 Met Ala Leu Val Tyr Asp Ala Glu Phe Val Gly Ser Glu Arg Glu Phe 1 5 10 15 Glu Glu Glu Arg Glu Thr Phe Leu Lys Gly Val Lys Ala Tyr Asp Gly 20 25 30 Val Leu Ala Thr Arg Tyr Leu Met Glu Arg Ser Ser Ser Ala Lys Asn 35 40 45 Asp Glu Glu Leu Leu Glu Leu His Gln Asn Phe Ile Leu Leu Thr Gly 50 55 60 Ser Tyr Ala Cys Ser Ile Asp Pro Thr Glu Asp Arg Tyr Gln Asn Val 65 70 75 80 Ile Val Arg Gly Val Asn Phe Asp Glu Arg Val Gln Arg Leu Ser Thr 85 90 95 Gly Gly Ser Pro Ala Arg Tyr Ala Ile Val Tyr Arg Arg Gly Trp Arg 100 105 110 Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Ile Asp Glu Glu Asp Val Pro Ala Ile 115 120 125 Glu Val Arg Ala Val Lys Arg Asn Pro Leu Gln Pro Ala Leu Tyr Arg 130 135 140 Ile Leu Val Arg Tyr Gly Arg Val Asp Leu Met Pro Val Thr Val Asp 145 150 155 160 Glu Val Pro Pro Glu Met Ala Gly Glu Phe Glu Arg Leu Ile Glu Arg 165 170 175 Tyr Asp Val Pro Ile Asp Glu Lys Glu Glu Arg Ile Leu Glu Ile Leu 180 185 190 Arg Glu Asn Pro Trp Thr Pro His Asp Glu Ile Ala Arg Arg Leu Gly 195 200 205 Leu Ser Val Ser Glu Val Glu Gly Glu Lys Asp Pro Glu Ser Ser Gly 210 215 220 Ile Tyr Ser Leu Trp Ser Arg Val Val Val Asn Ile Glu Tyr Asp Glu 225 230 235 240 Arg Thr Ala Lys Arg His Val Lys Arg Arg Asp Arg Leu Leu Glu Glu 245 250 255 Leu Tyr Glu His Leu Glu Glu Leu Ser Glu Arg Tyr Leu Arg His Pro 260 265 270 Leu Thr Arg Arg Trp Ile Val Glu His Lys Arg Asp Ile Met Arg Arg 275 280 285 Tyr Leu Glu Gln Arg Ile Val Glu Cys Ala Leu Lys Leu Gln Asp Arg 290 295 300 Tyr Gly Ile Arg Glu Asp Val Ala Leu Cys Leu Ala Arg Ala Phe Asp 305 310 315 320 Gly Ser Ile Ser Met Ile Ala Thr Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Lys Asp 325 330 335 Val Cys Pro Asp Leu Thr Leu Glu Glu Ala Lys Ser Val Asn Arg Thr 340 345 350 Leu Ala Thr Leu Ile Asp Glu His Gly Leu Ser Pro Asp Ala Ala Asp 355 360 365 Glu Leu Ile Glu His Phe Glu Ser Ile Ala Gly Ile Leu Ala Thr Asp 370 375 380 Leu Glu Glu Ile Glu Arg Met Tyr Glu Glu Gly Arg Leu Ser Glu Glu 385 390 395 400 Ala Tyr Arg Ala Ala Val Glu Ile Gln Leu Ala Glu Leu Thr Lys Lys 405 410 415 Glu Gly Val Gly Arg Lys Thr Ala Glu Arg Leu Leu Arg Ala Phe Gly 420 425 430 Asn Pro Glu Arg Val Lys Gln Leu Ala Arg Glu Phe Glu Ile Glu Lys 435 440 445 Leu Ala Ser Val Glu Gly Val Gly Glu Arg Val Leu Arg Ser Leu Val 450 455 460 Pro Gly Tyr Ala Ser Leu Ile Ser Ile Arg Gly Ile Asp Arg Glu Arg 465 470 475 480 Ala Glu Arg Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Gly Tyr Ser Lys Val Arg Glu 485 490 495 Ala Gly Val Glu Glu Leu Arg Glu Asp Gly Leu Thr Asp Ala Gln Ile 500 505 510 Arg Glu Leu Lys Gly Leu Lys Thr Leu Glu Ser Ile Val Gly Asp Leu 515 520 525 Glu Lys Ala Asp Glu Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Ala Ser Ala Val 530 535 540 Arg Arg Leu Pro Val Glu Glu Leu Arg Glu Leu Gly Phe Ser Asp Asp 545 550 555 560 Glu Ile Ala Glu Ile Lys Gly Ile Pro Lys Lys Leu Arg Glu Ala Phe 565 570 575 Asp Leu Glu Thr Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Arg Tyr Gly Ser Leu Lys 580 585 590 Glu Ile Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Leu Glu Leu Gly Ala 595 600 605 Thr Pro Lys Ala Ala Ala Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Leu 610 615 620 Leu Asn Ile Glu Gly Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Leu Glu 625 630 635 640 Ala Val Asp Tyr Asp Leu Glu Arg Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Glu 645 650 655 Leu Ala Glu Lys Val Glu Gly Leu Gly Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val 660 665 670 Val Tyr Ala Ala Arg Glu Arg Val Glu Ser Arg Arg Lys Ser Gly Arg 675 680 685 Gln Glu Arg Ser Glu Glu Glu Trp Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Val 690 695 700 Gly Glu Gly Arg Ala Arg Arg Leu Ile Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Gly 705 710 715 720 Glu Val Gly Lys Leu Val Glu Asn Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Glu 725 730 735 Val Pro Gly Ile Gly Asp Glu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro Gly Tyr 740 745 750 Lys Thr Leu Arg Asp Ala Gly Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Arg Val 755 760 765 Leu Lys Arg Tyr Gly Ser Val Ser Lys Val Gln Glu Gly Ala Thr Pro 770 775 780 Asp Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Gly Asp Ala Lys Ile Ala Arg Ile 785 790 795 800 Leu Gly Leu Arg Ser Leu Val Asn Lys Arg Leu Asp Val Asp Thr Ala 805 810 815 Tyr Glu Leu Lys Arg Arg Tyr Gly Ser Val Ser Ala Val Arg Lys Ala 820 825 830 Pro Val Lys Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Ser Asp Arg Lys Ile Ala 835 840 845 Arg Ile Lys Gly Ile Pro Glu Thr Met Leu Gln Val Arg Gly Met Ser 850 855 860 Val Glu Lys Ala Glu Arg Leu Leu Glu Arg Phe Asp Thr Trp Thr Lys 865 870 875 880 Val Lys Glu Ala Pro Val Ser Glu Leu Val Arg Val Pro Gly Val Gly 885 890 895 Leu Ser Leu Val Lys Glu Ile Lys Ala Gln Val Asp Pro Ala Trp Lys 900 905 910 Ala Leu Leu Asp Val Lys Gly Val Ser Pro Glu Leu Ala Asp Arg Leu 915 920 925 Val Glu Glu Leu Gly Ser Pro Tyr Arg Val Leu Thr Ala Lys Lys Ser 930 935 940 Asp Leu Met Arg Val Glu Arg Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile 945 950 955 960 Arg Ala Ala Gly Lys Arg Tyr Val Glu Glu Arg Arg Ser Arg Arg Glu 965 970 975 Arg Ile Arg Arg Lys Leu Arg Gly 980 <210> 3 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dominio H de la topoisomerasa V de Methanopyrus kandleri <400> 3 Trp Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Val Gly Glu Gly Arg Ala Arg Arg 1 5 10 15 Leu Ile Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Gly Glu Val Gly Lys Leu Val Glu 20 25 30 Asn Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Glu Val Pro Gly Ile Gly Asp Glu 35 40 45 Ala Val Ala Arg Leu Val Pro Gly 50 55 <210> 4 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dominio I de la topoisomerasa V de Methanopyrus kandleri <400> 4 Tyr Lys Thr Leu Arg Asp Ala Gly Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Arg 1 5 10 15 Val Leu Lys Arg Tyr Gly Ser Val Ser Lys Val Gln Glu Gly Ala Thr 20 25 30 Pro Asp Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Gly Asp Ala Lys Ile Ala Arg 35 40 45 Ile Leu Gly 50 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secuencia aminoacidica conectora <400> 5 Ala Tyr Val Asp Gly Ala 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secuencia aminoacidica conectora <400> 6 Gly Thr Gly Ser Gly Ala 1 5 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador 3 <400> 7 ggcgggatcc ttaatgatga tgatgatgat ggcc 34 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador 1 <400> 8 gcgtatgatg tgggcgccgg 20 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador 2 <400> 9 ggcaccggct ctggcgcctg gaaagaatgg ctggaacg 38 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secuencia aminoacidica conectora <400> 10 Gly Thr Gly Ser Gly Ala 1 5 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador 4 <400> 11 ccgtctccgg gagctgcatg tg 22 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador 5 <400> 12 ggcgcccaca tcatacgctt tgattgtgaa tgtgtcatca acc 43 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador 6 <400> 13 ggcgccagag ccggtgcctt tgattgtgaa tgtgtcatca acc 43 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotido de 15 pares de bases <400> 14 gatcacagtg agtac 15 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotido de 21 pares de bases <400> 15 tctattgtac tcactgtgat c 21 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador <400> 16 gttttcccag tcacgac 17 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador pT7-N <400> 17 ccgtctccgg gagctgcatg tg 22 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador sp4+10 <400> 18 ccggatgaca gcaggcagtg acagtc 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cebador sp10+7 <400> 19 ggtaagttag tagaaggtag tccag 25

Claims

다음을 포함하는 DNA 폴리머라아제 키메라:
a) 그의 C-말단 끝에 의해 하기 b)에 결합된, Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 아미노산 서열,
b) 그의 C-말단 끝에 의해 하기 c)에 결합된 연결 아미노산 서열,
c) 적어도 하나의 나선-헤어핀-나선(HhH) 도메인을 포함하는 아미노산 서열.
제 1항에 있어서, 상기 (c)의 아미노산 서열은 하기를 포함하는 리스트로부터 선택된 단백질의 적어도 하나의 HhH 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라:
- 메타노파이러스 칸들레리의 토포아이소머라아제 V,
- 대장균의 MutY, Nth, MutM/Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE 또는 DnIJ,
- 효모들의 RAD1, RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1, OGG1, NTG1, NTG2, DIN-7 또는 EXO-1, 또는
- 바실러스 서브틸리스 , 카에노르하브디티스 엘레간스 , 헤모필루스 인플루엔자에, 메타노코커스 자나스키 , 마이크로코커스 루테우스 , 메타노박테리움 써모포르미쿰 또는 살모넬라 티피무리움에서의 상기의 동종성 단백질.
제 2항에 있어서, 상기 (c)의 아미노산 서열은 메타노파이러스 칸들레리의 토포아이소머라아제 V로부터 유도된 적어도 하나의 HhH 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 3항에 있어서, 상기 (c)의 아미노산 서열은 서열번호: 3인 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 3항에 있어서, 상기 (c)의 아미노산 서열은 그의 C-말단 끝에 의해 서열번호: 4에 결합된 서열번호: 3인 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b)의 연결 아미노산 서열은 서열번호: 5 또는 서열번호: 6인 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 다음 파지들로부터 분리된 DNA 폴리머라아제들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라: Φ29, Cp-1, PRD-1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 또는 ABV.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 8항에 있어서, 상기 (a)의 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 9항에 있어서, 상기 (a)의 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a)의 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 엑소뉴클레아제 도메인에서의 변형을 가지며, 상기 변형된 DNA 폴리머라아제는 대응하는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제보다 엑소뉴클레아제 활성이 10% 미만인 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 11항에 있어서, 상기 (a)의 변형된 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 대응하는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제보다 엑소뉴클레아제 활성이 1% 미만인 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 12항에 있어서, 상기 (a)의 변형된 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 대응하는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제에 비하여 검출가능한 엑소뉴클레아제 활성이 없는 것을 특징으로 하는 DNA 폴리머라아제 키메라.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라아제 키메라의, 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화를 위한 용도.
주형 DNA를 적어도 다음을 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함하는 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화 방법:
a) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라아제 키메라,
b) 버퍼,
c) 염화 마그네슘,
d) 프라이머, 및
e) 뉴클레오시드 트리포스페이트들.
제 15항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 암모늄염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 칼륨염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 칼륨염은 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 19항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 상기 반응물 총 부피의 0.003% 내지 0.1%의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 상기 반응물 총 부피의 0.006% 내지 0.05%의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 상기 반응물 총 부피의 0.01% 내지 0.03%의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암모늄염은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법: 황화암모늄, 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄.
제 23항에 있어서, 상기 암모늄염은 황화암모늄인 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항에 있어서, 상기 황화암모늄의 농도는 30mM 내지 60mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 황화암모늄의 농도는 40mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 암모늄염은 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄인 것을 특징으로 하는 방법.
제 27항에 있어서, 상기 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄의 농도는 60mM 내지 120mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼는 트리스-염산, 트리스-아세트산, 또는 HEPES인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼는 pH 7.0 내지 8.5인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염화 마그네슘의 농도는 2mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 30mM 내지 70mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 34항에 있어서, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 트리포스페이트들은 dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 상기 dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP 뉴클레오시드 트리포스페이트들은 균등몰 량인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 임의의 것이고, 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호된 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 DNA는 플라스미드DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 DNA는 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭은 25℃ 내지 40℃의 본질적으로 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭은 롤링서클증폭(RCA), 다중분리증폭(MDA), 가닥치환증폭(SDA) 또는 루프매개증폭(LAMPA)을 통하여 일어나는 것을 특징으로 하는 주형 DNA의 증폭 방법.
제 15항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 하나의 프라이머는 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
다음을 포함하는 제 15항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실시하기 위한 키트:
a) 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 DNA 폴리머라아제 키메라,
b) 버퍼, 및
c) 염화 마그네슘.
제 44항에 있어서, 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 44항 또는 제 45항에 있어서, 암모늄염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 44항 또는 제 47항에 있어서, 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 제 38항에 따른 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 44항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오시드 트리포스페이트들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 48항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 하나의 프라이머는 표지된 것을 특징으로 하는 키트.