KR20120059492A - 주형 ｄｎａ의 복제, 증폭 및 서열화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생명공학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 이용하여 데옥시리보핵산을 복제, 증폭 또는 서열화하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생명공학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 이용하여 데옥시리보핵산을 복제, 증폭 또는 서열화하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다.
게놈을 복제하기 위해 박테리오파지 Φ29에서 요구되는 단 하나의 효소는 그의 DNA 폴리머라아제로, 이는 합성된 가닥의 복제 개시 및 신장(elongation)을 모두 촉매할 수 있는 66KDa 모노머성 단백질이다. 개시를 위하여, 이 폴리머라아제는 "말단"(TP)으로서 알려진 단백질에 결합되어, Φ29 DNA의 말단을 인식하고 TP-dAMP 공유결합 복합체의 형성을 촉매한다. 10개의 뉴클레오티드들의 중합 후, 상기 DNA 폴라머라아제/TP 이종이합체(heterodimer)는 해리되고, DNA로부터의 가닥의 신장이 실시된다.
복제성 DNA 폴리머라아제들은 효소 및 DNA간의 결합을 안정화시키는 보조(accessory) 단백질들과의 상호작용을 필요로 한다(Kuriyan and O'Donnell. J Mol Biol. 1993; 234: 915~925). 한편, 상기 DNA 폴리머라아제들은, 헬리카제(helicase) 유형 단백질들에 기능적 연합을 요구하기 때문에 복제되지 않는 DNA 가닥의 분리시 상기 중합에 연결될 필요가 있다. 이러한 의미에서, 상기 박테리오파지 Φ29의 DNA 폴리머라아제는 그를 독특하게 만드는 다양한 고유한 기능적 특징들을 갖는다:
a) 높은 가공성 (결합시 통합되는 뉴클레오티드들의 수로써 정의됨).
b) 높은 가닥 분리능, 이는 헬리카제 유형의 보조단백질들의 부재시 상기 박테리오파지의 게놈을 복제하는 것을 가능하게 한다. 이러한 두가지 특징들, 즉 가공성 및 가닥 분리는 Φ29 DNA 폴리머라아제가 길이 70kb 초과의 DNA 가닥들을 합성하는 것을 가능하게 한다(Blanco 등. J Biol Chem. 1989; 264: 8935~8940).
c) 새로운 가닥 중 뉴클레오티드의 삽입에서의 높은 정확성(Esteban 등. J Biol Chem. 1993; 268: 2719~2726).
이러한 모든 특징들은, 이 폴리머라아제의 이용에 근거하여 이중가닥 DNA(dsDNA)를 증폭하는 매우 다양한 등온과정(즉, 항온)의 프로토콜들의 개발을 이끌어왔다. 간단한 구조에서, 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제의 환형의 단일가닥 DNA(ssDNA)를 이용하는 능력은 롤링 서클법(rolling circle method)(또는 RCA-롤링 서클 증폭)에 의한 DNA의 증폭을 가능하게 하여, 긴 길이의 ssDNA 분자들을 생산하고, 10개 초과의 상기 환형 주형의 복제물들을 포함한다 (Blanco 등. J Biol Chem. 1989; 264: 8935~8940; US 5001050, US 5198543 및 US 5576204). Amersham Biosciences/Molecular Staging에 의해 개발된 dsDNA 증폭 방법에서(Dean 등. Genome Res. 2001; 11: 1095~1099; Dean 등. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 5261~5266), 육량체(헥사-뉴클레오티드들) 랜덤 서열 프라이머들의 이용과 Φ29 DNA 폴리머라아제의 이용의 조합은, 환형 플라스미드 DNA [GE Healthcare의 Templiphi™]의 피코그램으로부터 또는 10나노그램의 게놈 DNA [GE Healthcare의 Genomiphi™ 및 Qiagen의 Repli-G®]로부터 출발하여 104~106의 증폭 지수들(factors)을 수득하는 것을 가능하게 한다. 생산된 생성물들은 고품질이고, 미리 정제할 필요 없이 직접 분해(digestion) 또는 서열화될 수 있으며, Φ29 DNA 폴리머라아제가 이러한 목적에 대해 가장 강건한 효소라는 것이 증명되었다. Φ29 DNA 폴리머라아제와의 증폭 반응들을 실시하기 위한 일반적인 버퍼는 트리스-HCl (pH 7.5)에 더하여 상이한 농도(밀리몰 단위)의 NaCl 또는 KCl 및 MgCl2를 포함한다(US 200310207267). 그러나, 이러한 프로토콜들의 만족성에도 불구하고, 보다 적은 양의 DNA 양으로부터 출발하는 것을 가능하게 하는 다른 프로토콜들의 개발에 대한 요구가 늘고 있다.
본 발명은 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제를 이용하여 데옥시리보핵산을 복제, 증폭 또는 서열화하는 방법 및 상기 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다.
상기 파지 Φ29 DNA 폴리머라아제는 다음과 같은 DNA의 증폭에 대해 큰 이득이 되는 몇가지 특징들을 갖는다: 임의의 보조 단백질의 참여가 필요 없는 높은 가공성 및 상기 DNA에 대한 일회 결합시 상기 박테리오파지의 게놈을 복제하는 것을 가능하게 하는 높은 가닥 분리능 및 새로운 가닥에서 뉴클레오티드의 삽입에서의 높은 정확성. 이러한 특징들은 이 폴리머라아제의 이용에 기초한 DNA의 등온 증폭을 위한 매우 다양한 프로토콜들의 개발을 이끌어왔으며, 이는 예비 정제의 필요없이, 직접 분해되거나 또는 서열화될 수 있는 고품질의 생성물들의 수득을 가능하게 한다. 그러나, 보다 적은 양으로부터 DNA의 증폭을 가능하게 하는 프로토콜들이 요구되고 있다. 본 발명은 반응의 특이성 및 수율을 현저히 향상시키는 DNA 증폭 방법을 개발하므로써 이러한 요구에 부응하는 것이다.
본 특허출원의 실시예들에서는, 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트(Tween®20) 및 암모늄염을 Φ29 DNA 폴리머라아제를 이용한 증폭에 일반적으로 사용되는 버퍼에 동시 첨가하므로써, 한편으로는 비특이적 DNA 증폭을 방지하고, 다른 한편으로는 주형으로서, 한정된 양의 0.1펨토그램(femtograms: fg)의 플라스미드 DNA 및 10fg의 게놈 DNA로부터 검출가능한 특이적인 증폭을 가능하게 한다.
본 발명의 제 1 측면은, 주형 DNA를 적어도 다음을 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함하는 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 관한 것이다:
a) Φ29 유형 DNA 폴리머라아제,
b) 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트,
c) 암모늄염,
d) 버퍼,
e) 염화마그네슘,
f) 프라이머, 및
g) 뉴클레오시드 트리포스페이트.
본 발명의 측면의 바람직한 구체예는 상기 DNA를 상기 언급된 성분들 (a)~(g)를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함하고, 나아가 칼륨염을 더 포함하는 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 칼륨염은 염화칼륨 또는 아세트산칼륨이다.
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "DNA 폴리머라아제"라는 용어는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합을 촉매할 수 있는 효소를 의미한다. 일반적으로, 상기 효소는 주형 DNA 서열과 혼성화된 프라이머의 3'말단에서 합성을 개시하고, 주형 DNA 가닥의 5' 말단으로 진행된다.
본 발명에서 사용된 것과 같은, "Φ29 유형 DNA 폴리머라아제"라는 용어는 폴리머라아제에 가공적 중합을 가닥 분리물에 커플링시키는 능력을 제공하는, 중합 도메인 내에 TPR1 및 TPR2 서브도메인들을 포함하는 임의의 DNA 폴리머라아제를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제들의 예들은 다음의 파지들로부터 분리된 DNA 폴리머라아제들을 포함하는 리스트로부터 선택된다: Φ29, Cp-1, PRD-1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 또는 아시디아누스 병모양 바이러스(Acidianus Bottle-shaped virus:ABV).
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 다음 파지들로부터 분리된 DNA 폴리머라아제들로부터 선택된다: Φ29, Cp-1, PRD-1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 또는 아시디아누스 병모양 바이러스(ABV).
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는다.
Φ29 유형 DNA 폴리머라아제들의 엑소뉴클레아제 도메인은 알려져 있으며, 높은 가공성 및 가닥 분리능을 보유하면서 상기 엑소뉴클레아제 활성이 감소되도록 변형될 수 있다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 엑소뉴클레아제 도메인에서 변형을 가지며, 상기 변형된 DNA 폴리머라아제는 바람직하게는, 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제 또는 "야생형"의 활성보다 10% 미만의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 변형된 DNA 폴리머라아제는 바람직하게는, 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제의 활성보다 1% 미만의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 변형된 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제에 비하여, 검출가능한 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제(천연 또는 엑소뉴클레아제 도메인에서 변형된)의 농도는 5nM 내지 75nM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제(천연 또는 엑소뉴클레아제 도메인에서 변형된)의 농도는 25nM 내지 60nM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제(천연 또는 엑소뉴클레아제 도메인에서 변형된)의 농도는 약 50nM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트 (Tween®20)의 농도는 반응물의 총 부피 중 0.003% 내지 0.1%이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 반응물의 총 부피 중 0.006% 내지 0.05%이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 반응물의 총 부피 중 0.01% 내지 0.03%이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 반응물의 총 부피 중 약 0.025%의 비율이다. "반응물의 총 부피"는 주형 DNA를 상기 반응 혼합물에 첨가 후 얻어지는 결과물의 부피로서 이해되어야 한다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택된다: 황화암모늄, 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 황화암모늄이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 황화암모늄의 농도는 30mM 내지 60mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 황화암모늄의 농도는 40mM 내지 50mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 황화암모늄의 농도는 약 45mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 염화암모늄이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화암모늄의 농도는 60mM 내지 120mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화암모늄의 농도는 약 90mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 암모늄염은 아세트산 암모늄이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 60mM 내지 120mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 약 90mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 pH 7.0 내지 8.5이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 pH 7.2 내지 8이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 약 pH 7.5이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 버퍼는 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES이다. 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼는 pH 7.0 내지 8.5이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼는 pH 7.2 내지 8이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼는 pH 약 7.5이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 25mM 내지 50mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 약 40mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 30mM 내지 70mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 약 50mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 염화 마그네슘의 농도는 2mM 내지 20mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 염화 마그네슘의 농도는 약 10mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.01% 내지 0.03%의 비율이고, 상기 황화암모늄의 농도는 40mM 내지 50mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM, pH 7.2 내지 8.0이며, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 총 부피의 0.025%이고, 상기 황화암모늄의 농도는 45mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 40mM 및 pH 7.5이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 10mM이고, 상기 염화 칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 50mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.01% 내지 0.03%의 비율이고, 상기 염화암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM 및 pH 7.2 내지 8.0이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 및 15mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.025%이고, 상기 염화암모늄의 농도는 90mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 40mM 및 pH 7.5이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 10mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 50mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 총 부피의 0.01% 내지 0.03%의 비율이고, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 30mM 내지 45mM 및 pH 7.2 내지 8.0이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트의 농도는 총 부피의 0.025%이고, 상기 아세트산 암모늄의 농도는 90mM이고, 상기 트리스-염산, 트리스-아세트산 또는 HEPES 버퍼의 농도는 40mM 및 pH 7.5이고, 상기 염화 마그네슘의 농도는 10mM이고, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 50mM이다.
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "복제"라는 용어는 주형 DNA로부터 상보적인 DNA의 합성을 의미한다.
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "증폭"이라는 용어는 주형 DNA의 복제물들의 수의 증가를 의미한다.
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "서열화"라는 용어는 주형 DNA의 뉴클레오티드들의 순서의 결정을 의미한다.
"접촉"이라 함은 주형 DNA와 반응 혼합물이 프라이머 연장 조건하에서 인큐베이션되는 사실로 이해되어야 한다.
여기 사용된 것과 같은 "프라이머"라는 용어는, 프라이머 연장 조건 하에 있는 경우 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 바람직하게는, 상기 프라이머는 데옥시리보오스 올리고뉴클레오티드이다.
프라이머들은, 이에 제한되지는 않지만, 직접적인 화학합성을 포함하는 임의의 적당한 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 프라이머들은 주형 DNA내 특이적 데옥시뉴클레오티드 서열들과 혼성화하도록 설계되거나(특이적 프라이머들) 또는 랜덤 합성될 수 있다(임의(arbitrary) 프라이머들).
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "특이적 프라이머"라는 용어는 증폭되는 주형 DNA 내 특이적인 데옥시뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열의 프라이머를 의미한다.
"상보적"이라 함은 프라이머가, 프라이머 연장 조건 하에 있는 경우 주형 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있도록 주형 DNA의 영역과 혼성화될 수 있다는 사실로서 이해된다. 바람직하게는, 상기 영역은 주형 DNA의 영역과 100% 상보성을 갖는다. 즉, 프라이머와 상보성인 영역에서 각 뉴클레오티드는 단일 가닥 주형에 존재하는 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다. 그러나, 당업자는 주형 DNA에 대하여 100% 미만의 상보성을 갖는 영역을 갖는 프라이머들이 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법을 실시하는데 기능할 것이라는 것을 이해할 것이다.
"임의 프라이머"라는 용어는 임의적으로 합성된 서열을 갖고, 주형 DNA의 임의의 위치에들에서 상기 DNA의 합성을 개시하는데 사용되는 프라이머를 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에서는, 임의 프라이머들의 군이 사용된다. "임의 프라이머들"이라는 용어는 랜덤서열을 갖고, 주형 DNA의 임의의 위치들에서 상기 DNA의 합성을 개시하는데 사용되는 프라이머들의 세트를 의미한다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머는 특이적이다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머는 임의적이다. 바람직하게는, 상기 임의 프라이머는 3'-5' 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호된다. 보다 바람직하게는, 상기 임의 프라이머는 3'-5' 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호되는 6개의 올리고뉴클레오티드들인, "헥사뉴클레오티드" 또는 "헥사머(hexamer)"이다.
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "엑소뉴클레오티드들의 작용에 대하여 보호되는"이라는 표현은 본 발명의 DNA 폴리머라아제에 존재하는 임의의 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성에 의한 뉴클레오티드 분해에 저항성이도록 변형된 프라이머를 의미한다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에서, 하나 이상의 프라이머가 사용될 수 있으며, 특이적 및/또는 임의 프라이머들을 사용할 수 있다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 2μM 내지 100μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 20μM 내지 80μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 40μM 내지 60μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머의 농도는 약 50μM이다.
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "뉴클레오시드 트리포스페이트"라는 용어는 펜토오스, 질소 염기 및 3개의 포스페이트기들의 공유결합에 의해 형성된 유기 분자를 의미한다.
상기 뉴클레오시드 트리포스페이트들이라는 용어는, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, 또는 이들의 유도체들과 같은 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(dNTPs)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들은 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP이다. 더욱 바람직하게는, 이들 4개의 dNTPs는 균등 몰 조건이다. 본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들의 농도는 100μM 내지 800μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들의 농도는 200μM 내지 600μM이다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들의 농도는 약 500μM이다.
상기 뉴클레오시드 트리포스페이트들이라는 용어는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(ddNTPs)도 포함하며, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 ddATP, ddCTP, ddITP, ddUTP, ddGTP, ddTTP, 또는 이들의 유도체들이 있다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법의 일부 바람직한 구체예들에서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 하나의 프라이머는 당 기술 분야에서 공지된 기술들을 통하여 표지된다(labelled).
표지된 뉴클레오티드는, 예로서 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트일 수 있다. 검출가능한 라벨들은, 예로서 방사성 동위원소들, 형광 라벨들, 화학발광 라벨들, 생체발광 라벨들 또는 효소 라벨들을 포함한다.
본 발명의 설명에서 사용된 것과 같은, "주형 DNA"라는 용어는 상보적인 DNA 가닥을 합성하기 위해 기질로서의 역할을 할 수 있는 DAN 분자를 의미하며; 즉 복제, 증폭 또는 서열화될 DNA 분자에 대한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 주형 DNA는 플라스미드 DNA다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상기 주형 DNA는 게놈 DNA다.
주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화는 프라이머 연장 조건하에서 실시된다. 상기 "프라이머 연장 조건"이라는 표현은, 프라이머에서 개시되는 주형 DNA-의존적 합성이 일어날 수 있는 조건을 의미한다.
본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 따른 상기 주형 DNA 합성은 열적 사이클링(thermal cycling) 공정을 통하여 또는 본질적으로(essentially) 일정한 온도에서 일어날 수 있다.
"등온 조건들"은 본질적으로 항온으로서 이해되어야 한다. 바람직하게는, 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법에 따른 상기 주형 DNA 합성은 본질적으로 일정한 온도에서 일어난다. 보다 바람직하게는, 25℃ 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 약 30℃의 본질적으로 일정한 온도에서 일어난다.
DNA 복제를 가능하게 하는 다수의 방법들이 당 기술분야에 알려져 있다. 일부 방법들은, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 폴리머라아제 연쇄반응(PCR)과 같은 열적 사이클링 공정을 필요로 한다. 다른 방법들은 열적 사이클링 공정을 요구하지 않는데, 그보다는 이들은 본질적으로 일정한 온도에서 수행되며, 이에 제한되지는 않지만, 예로서 롤링서클증폭(Rolling Circle Amplication:RCA), 다중분리증폭(Multiple Detachment Amplication:MDA), 가닥치환증폭(Strand Displacement Amplication:SDA) 또는 루프매개증폭(Loop Mediated Amplication:LAMP)이 있다. 본 발명의 방법에 따른 주형 DNA의 증폭은 열적 사이클링 공정을 통해 또는 본질적으로 일정한 온도에서 일어날 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 증폭 방법에 따른 주형 DNA의 증폭은 롤링서클증폭(RCA), 다중분리증폭(MDA), 가닥치환증폭(SDA) 또는 루프매개증폭(LAMPA)을 통하여 일어난다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법을 실시하는데 적당한 성분들을 포함하는 키트 또는 장치들에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 다음을 포함하는 본 발명의 복제, 증폭 또는 서열화 방법을 실시하기 위한 키트에 관한 것이다:
a) Φ29 유형의 DNA 폴리머라아제,
b) 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트,
c) 암모늄염,
d) 버퍼, 및
e) 염화 마그네슘.
바람직하게는, 상기 암모늄염은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택된다: 황화암모늄, 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄.
바람직하게는, 본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 칼륨염을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 칼륨염은 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨이다.
본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 프라이머를 더 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 프라이머는 3'-5' 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호된 임의 프라이머이다.
본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 뉴클레오시드 트리포스페이트들을 더 포함한다. 예로서, 본 발명의 본 측면의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들 및/또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 더 포함한다.
본 발명의 본 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 적어도 하나의 트리포스페이트 뉴클레오시드 또는 하나의 표지된 프라이머를 포함한다. 상기 표지된 뉴클레오시드는 예로서, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트일 수 있다.
상기 키트는, 이에 제한되지는 않지만, 버퍼들, 오염방지제들 등을 더 포함할 수 있다. 한편, 상기 키트는 실시 및 최적화에 필요한 모든 지지물(support) 및 수용기(recipient)들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위한 지시설명서를 더 포함한다.
본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에 걸쳐 사용된 "포함한다"라는 단어 및 이의 변형들은, 다른 기술적 특징들, 첨가물들, 성분들 또는 단계들을 배제하는 것이 아니다. 당업자에게는, 본 발명의 기타 목적들, 장점들 및 특징들을 부분적으로는 본 명세서의 설명으로부터, 그리고 부분적으로는 본 발명의 실시로부터 추측할 수 있을 것이다. 하기 도면들 및 실시예들은 예시적으로 제공되며, 이들이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
도 1은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능에서 Tween®20과 (NH4)2SO4의 효과를 보여준다. 상기 분석은 나타낸 양의 플라스미드 DNA(4.2kpb)의 존재 하에서 하기에 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 30℃에서 5시간 동안 인큐베이션 한 후, 반응물들을 실시예에서 설명된 것과 같이 분석하였다. 왼쪽에서, HindIII를 이용하여 Φ29 DNA를 분해한 후 수득된 선형 DNA 단편들을 DNA 길이 마커들로서 사용하였다.
도 2는 Tween®20와 (NH4)2SO4의 존재 하에서 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의한, 상이한 양의 플라스미드 DNA(펨토그램 수준)의 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 3은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능에서 NH4 + 이온의 효과를 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween®20 및 나타낸 암모늄염 및 나타낸 양의 플라스미드 DNA(4.2kpb)의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 30℃에서 6시간 동안 인큐베이션 후, 반응물들을 실시예에 설명된 것과 같이 분석하였다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 4는 Tween®20과 (NH4)2SO4의 존재 하에서 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의해 상이한 양의 바실러스 서브틸리스 게놈 DNA의 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 5는 Φ29 DNA 폴리머라아제에 기초한 DNA 증폭을 위한 상업적 키트(General Electrics HealthCare사의 Illustra 키트)의 현 반응 버퍼에 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 첨가에 의해 나타난 현저한 개선을 나타낸다. 상기 분석은 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 2는 Tween®20와 (NH4)2SO4의 존재 하에서 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의한, 상이한 양의 플라스미드 DNA(펨토그램 수준)의 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 3은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능에서 NH4 + 이온의 효과를 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween®20 및 나타낸 암모늄염 및 나타낸 양의 플라스미드 DNA(4.2kpb)의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 30℃에서 6시간 동안 인큐베이션 후, 반응물들을 실시예에 설명된 것과 같이 분석하였다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 4는 Tween®20과 (NH4)2SO4의 존재 하에서 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의해 상이한 양의 바실러스 서브틸리스 게놈 DNA의 증폭을 나타낸다. 상기 분석은 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 존재 하에서 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
도 5는 Φ29 DNA 폴리머라아제에 기초한 DNA 증폭을 위한 상업적 키트(General Electrics HealthCare사의 Illustra 키트)의 현 반응 버퍼에 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 첨가에 의해 나타난 현저한 개선을 나타낸다. 상기 분석은 실시예에 설명된 것과 같이 실시되었다. 상기 DNA 길이 마커들은 도 1에서 사용된 것과 동일하다.
실시예
Φ29
DNA
폴리머라아제에
의한 다중-
프라이머
증폭을 위한 실험 조건의 최적화.
본 명세서에서 제공된 하기의 특이적 예들은 본 발명의 성질을 예시한다. 이들 실시예들은 단지 예시적인 목적을 위해 포함된 것이지, 본 명세서에서 특허청구된 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 하기 설명된 예들은 본 출원의 분야를 제한함이 없이 본 발명을 예시하는 것이다.
Φ29 DNA 폴리머라아제는 수 피코그램의 원형 DNA로부터 출발하여 104~106배 증폭되는 것으로 나타났다. 이러한 목적을 위하여, 40mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50mM KCl 및 10mM MgCl2를 포함하는 반응 버퍼(이하, 버퍼 A)를 사용하였다. 상이한 세제 및 염 조건들의, Φ29 DNA 폴리머라아제의 DNA 증폭능에 대한 영향을 시험한 결과, 버퍼 A에 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4를 동시 첨가하는 것에 의해, 제공된 한정된 양의 DNA의 증폭이 매우 개선되는 것이 발견되었다.
플라스미드 DNA를 증폭시키기 위한 반응 조건들. - 12.5㎕의 버퍼 A, 3'-5' 엑소뉴클레아제의 작용에 대하여 보호된 50μM의 헥사머들, 각각 500μM의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP), 나타낸 양의 플라스미드 DNA(크기 4.2kbp), 지시된 경우, 45mM (NH4)2SO4 또는 0.025% Tween®20 또는 이들 모두의 조합을 포함한 인큐베이션 혼합물을 첨가하였다. DNA를 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하고, 이어서 5분 동안 빙냉시켜 변성시켰다. 50 nM Φ29 DNA 폴리머라아제를 첨가하여 반응을 개시하고, 30℃에서 인큐베이션한 후 65℃에서 10분 동안 가열하므로써 반응을 중단시켰다. 결과를 분석하기 위하여, 1㎕의 샘플들을 반응물들로부터 취하고, 증폭된 DNA를 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키고, 0.7% 아가로오스 겔에서 전기영동시켰다. 브롬화 에티디움(ethidium bromide)으로 겔을 염색하므로써 DNA를 검출하였다.
게놈 DNA를 증폭시키기 위한 반응 조건들. - 인큐베이션 혼합물은 12.5㎕의 A, 45mM (NH4)2SO4, 0.025% Tween®20, 3'-5' 엑소뉴클레아제의 작용에 대하여 보호된 50μM의 헥사머들, 각각 500μM의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트들(dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP) 및 나타낸 양의 바실러스 서브틸리스 게놈 DNA(크기 4Mpb)를 포함하였다. DNA를 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하고, 이어서 5분 동안 빙냉시켜 변성시켰다. 50 nM Φ29 DNA 폴리머라아제를 첨가하여 반응을 개시하고, 30℃에서 인큐베이션한 후 65℃에서 10분 동안 가열하므로써 반응을 중단시켰다. 결과를 분석하기 위하여, 1㎕의 샘플들을 반응물들로부터 취하고, 0.7% 아가로오스 겔에서 전기영동시켰다. 브롬화 에티디움으로 겔을 염색하므로써 DNA를 검출하였다.
도 1은 제공된 소량의 플라스미드 DNA의 증폭에서 45mM (NH4)2SO4 및 0.025% Tween®20의 첨가 효과를 나타낸다. 나타낸 것과 같이, Φ29 DNA 폴리머라아제는 100fg의 제공된 DNA가 사용된 경우, 표준 버퍼 A로 검출가능한 임의의 증폭 산물을 제공하지 않았다. 이들 반응 조건들에서, DNA의 부재 하에서 0.025% Tween®20의 첨가는 미량(trace) DNA 생성물들의 출현을 일으켰으며, 이는 아마도 랜덤 헥사머 프라이머들의 혼성화 및 신장에 의해 유발된 비특이적 DNA 증폭의 결과로 인한 것일 것이다. 동일한 미량이 제공된 10fg의 DNA에서도 관찰되었다. 그러나, 제공된 100fg의 DNA의 존재 하에서, 0.025% Tween®20의 첨가는 Φ29 DNA 폴리머라아제가 증폭된 플라스미드의 검출가능한 양을 생산하는 것을 가능하게 하였다. 특이적 또는 비특이적인 증폭된 DNA의 총 생산은 버퍼 A에 0.025% Tween®20의 첨가가 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능을 증강시킨다는 것을 나타내었다. NP40 세제와 유사한 효과가 관찰되었다. 대조적으로, Triton X100 및 Triton X114와 같은 다른 분석된 세제들은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능을 증강시키지 않았다(미도시). 버퍼 A에 0.025% Tween®20과 45mM (NH4)2SO4의 동시 첨가는 증폭된 산물들의 수율 및 특이성에서 두가지 결과들을 나타내었다: 1) 제공된 DNA의 부재 하에서 DNA 증폭은 검출되지 않았다; 2) DNA 제공량이 10fg 정도로 적은 경우에도, 단위 길이의 수 mg의 플라스미드 DNA가 증폭에 의해 수득되었다. 대조구로서, 버퍼 A에 45mM (NH4)2SO4를 첨가한 것은 Φ29 DNA 폴리머라아제의 증폭능에서 어떠한 개선도 제공하지 않았다.
따라서, 버퍼 A에 0.025% Tween®20과 45mM (NH4)2SO4를 동시 첨가한 것(이하, 버퍼 B)은 Φ29 DNA 폴리머라아제에 의한 원형 DNA의 다중 프라이밍을 이용한 증폭을 실시하기 위한 실험 조건들의 명백한 최적화를 생성하고, 제공된 DNA의 한정된 양(10fg)을 증폭시키는데 이들 두가지 모두가 절대적으로 필요한 반응물이라고 결론지을 수 있다. 실제로, 도 2에 나타낸 것과 같이, 버퍼 B의 사용은, 6시간의 반응 후 0.1fg(약 24 분자) 정도로 낮은 플라스미드의 제공된 양을 이용하므로써, 상기 Φ29 DNA 폴리머라아제가 마이크로그램 양의 DNA를 합성하는 것을 가능하게 하였다. 성질 대조구로서, EcoRI를 이용한 증폭 산물의 분해는 4.2kb의 dsDNA 단편들을 생성하였으며, 이는 증폭 산물들이 실제로 원래 플라스미드의 탠덤 반복부들(tandem repeats)이었다는 것을 나타내는 것이다. 또한, 상기 버퍼 B는 비특이적 DNA 증폭도 방지하였다(도 2에서, 제공된 DNA 없이 실시된 반응물들에 해당하는 래인들(lanes) 참조).
도 3은 암모늄 이온들과 0.025% Tween®20이 소량의 플라스미드 DNA의 증폭을 개선시키는 효과를 보여준다. 상기 분석은 0.025% Tween®20과 나타낸 암모늄 염의 존재 하에서 이전에 언급된 조건 하에서 실시되었다. 도 3에서 관찰될 수 있는 바와 같이, NH4Cl 및 NH4CH3COO는 모두 증폭 산물들의 수율 및 특이성 모두에서 (NH4)2SO4와 유사한 효과를 가졌다. 이러한 결과는, 플라스미드 DNA의 한정량의 증폭에서 (NH4)2SO4의 상기 언급된 효과는 NH4 + 이온들로 인한 것임을 나타낸다.
상기 설명된 최적화된 조건들이 게놈 DNA의 증폭에 적용되는지의 여부를 결정하기 위하여, 한정된 농도의 B. 서브틸리스 게놈 DNA (길이 4Mpb) 존재하에서 수행된 동일한 유형의 분석들을 실시하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 버퍼 B 중 0.025% Tween®20과 45mM (NH4)2SO4의 존재는, 한편으로는 비특이적 DNA 증폭(제공된 DNA가 없는 래인들)을 방지하였지만, 다른 한편으로는, 제공된 DNA가 10fg으로, 즉 현재 상업적인 게놈 증폭 키트들에서 권장되는 양보다 106배 더 낮은 양으로 사용된 경우에도, Φ29 DNA 폴리머라아제가 검출가능한 특이적인 게놈 DNA 증폭을 제공하는 것을 가능하게 하였다.
0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 동시 첨가가, Φ29 DNA 폴리머라아제를 기초로 한 DNA 증폭을 위한 현행 상업적 키트의 증폭 효능을 증가시키는지의 여부를 결정하기 위하여, 도 1, 2 및 3에 설명된 플라스미드 DNA 증폭 분석들의 동일한 유형을 실시하였다. 도 5는 Illustra 키트(GE HealthCare)의 현 반응 버퍼에 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 첨가에 의해 나타나는 현저한 개선들을 보여준다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 공급자의 권장에 따라, Illustra 키트를 이용하여, 10pg 균등량 또는 그 이상의 양의 플라스미드를 아가로오스 젤에서 검출가능한 방식으로 증폭시킬 수 있다. 대조적으로, Illustra 키트의 반응 버퍼에 0.025% Tween®20 및 45mM (NH4)2SO4의 동시 첨가는 증폭될 DNA 요구량을 현저히 감소시킬 수 있어서, 증폭에서 4자릿수의 개선을 포함하는, 제공된 플라스미드 DNA 1fg으로부터 증폭산물들이 관찰되었다.
<110> Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC)
<120> Metodo para la replicacion, amplificacion o secuenciacion de un
ADN molde.
<130> ES1641.386.2
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 572
<212> PRT
<213> Bacteriophage phi-29
<400> 1
Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr Thr Lys Val
1 5 10 15
Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile Glu Asp His
20 25 30
Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met Ala Trp Val
35 40 45
Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys Phe Asp Gly
50 55 60
Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys Trp Ser Ala
65 70 75 80
Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg Met Gly Gln
85 90 95
Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys Arg Lys Ile
100 105 110
His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe Pro Val Lys
115 120 125
Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly Asp Ile Asp
130 135 140
Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro Glu Glu Tyr
145 150 155 160
Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Arg Leu Leu Ile
165 170 175
Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser Asp Ser Leu
180 185 190
Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys Lys Val Phe
195 200 205
Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr Ala Tyr Arg
210 215 220
Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys Glu Ile Gly
225 230 235 240
Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala Gln Met Tyr
245 250 255
Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu Gly Lys Tyr
260 265 270
Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile Arg Cys Glu
275 280 285
Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile Lys Arg Ser
290 295 300
Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly Gly Glu Ile
305 310 315 320
Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met Lys Glu His
325 330 335
Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Phe Lys Ala
340 345 350
Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr Tyr Ile Lys
355 360 365
Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu Met Leu Asn
370 375 380
Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr Gly Lys Val
385 390 395 400
Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu Gly Glu Glu
405 410 415
Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe Ile Thr Ala
420 425 430
Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys Tyr Asp Arg
435 440 445
Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly Thr Glu Ile
450 455 460
Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Trp
465 470 475 480
Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Val Lys Tyr Leu Arg Gln Lys Thr
485 490 495
Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys Leu Val Glu
500 505 510
Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val Lys Cys Ala
515 520 525
Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu Asn Phe Lys
530 535 540
Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln Val Pro Gly
545 550 555 560
Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys
565 570
Claims (40)
- 적어도 다음을 포함하는 반응 혼합물과 주형 DNA를 접촉시키는 것을 포함하는 주형 DNA의 복제, 증폭 또는 서열화 방법:
a) Φ29 유형 DNA 폴리머라아제,
b) 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트,
c) 암모늄염,
d) 버퍼,
e) 염화마그네슘,
f) 프라이머, 및
g) 뉴클레오시드 트리포스페이트. - 제 1항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 칼륨염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 칼륨염은 염화칼륨 또는 아세트산칼륨인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 상기 반응물의 총 부피 중 0.003% 내지 0.1%의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 상기 반응물의 총 부피 중 0.006% 내지 0.05%의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트는 상기 반응물의 총 부피 중 0.01% 내지 0.03%의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암모늄염은 다음을 포함하는 리스트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법: 황화암모늄, 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄.
- 제 7항에 있어서, 상기 암모늄염은 황화암모늄인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 황화암모늄의 농도는 30mM 내지 60mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 황화암모늄의 농도는 40mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 암모늄염은 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄의 농도는 60mM 내지 120mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 염화암모늄 또는 아세트산 암모늄의 농도는 80mM 내지 100mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 다음 파지들로부터 분리된 DNA 폴리머라아제들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법: Φ29, Cp-1, PRD-1, Φ15, Φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 또는 ABV.
- 제 14항에 있어서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 엑소뉴클레아제 도메인에서 변형을 가지며, 상기 변형된 DNA 폴리머라아제는 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제의 활성보다 10% 미만의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 변형된 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제의 활성보다 1% 미만의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 변형된 Φ29 유형 DNA 폴리머라아제는 대응되는 자연발생적인 DNA 폴리머라아제의 활성에 대해 검출가능한 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼는 트리스-염산, 트리스-아세트산, 또는 HEPES인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼는 pH 7.0 내지 8.5인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염화 마그네슘의 농도는 2mM 내지 20mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 상기 염화 마그네슘의 농도는 5mM 내지 15mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 30mM 내지 70mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 25항에 있어서, 상기 염화칼륨 또는 아세트산 칼륨의 농도는 40mM 내지 60mM인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 트리포스페이트들은 dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 27항에 있어서, 상기 dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP 뉴클레오시드 트리포스페이트들은 균등몰 량인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 임의의 것이고, 엑소뉴클레아제들의 작용에 대하여 보호된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 DNA는 플라스미드DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 DNA는 게놈 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭은 25℃ 내지 40℃의 본질적으로 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭은 롤링서클증폭(RCA), 다중분리증폭(MDA), 가닥치환증폭(SDA) 또는 루프매개증폭(LAMPA)을 통하여 일어나는 것을 특징으로 하는 주형 DNA의 증폭 방법.
- 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 하나의 프라이머는 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음을 포함하는 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실시하기 위한 키트:
a) Φ29 유형 DNA 폴리머라아제,
b) 폴리옥시에틸렌화 소르비탄 모노라우레이트,
c) 암모늄염,
d) 버퍼, 및
e) 염화마그네슘. - 제 35항에 있어서, 칼륨염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 35항 또는 제 36항에 있어서, 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 제 29항에 따른 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 35항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오시드 트리포스페이트들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 37항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 하나의 프라이머는 표지된 것을 특징으로 하는 키트.
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