ES2351294B1

ES2351294B1 - Metodo para la replicación, amplificación, o secuenciación de un adn molde.

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Publication number: ES2351294B1
Application number: ES200930412A
Authority: ES
Inventors: Jose Maria Lazaro Bolos; Miguel De Vega Jose; Luis Blanco Davila; Margarita Salas Figueras; Mario Mencia Caballero
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2029-07-02
Also published as: ES2351294A1; JP2012531221A; IN2012DN00172A; MX2012000152A; WO2011000998A2; CA2766728A1; EP2450453B1; CO6480969A2; BRPI1014001A2; AU2010267955A1; EP2450453A2; SG177411A1; DK2450453T3; KR20120059492A; IL217325A0; EP2450453A4; CL2011003313A1; CN102648289A; US20120178092A1; ES2351294B8

Abstract

Método para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde.#La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a un método para llevar a cabo la replicación, la amplificación o la secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con una ADN polimerasa del tipo {ph}29 y a un kit para llevar a cabo dicho método.

Description

Método para la replicación, ampliﬁcación o secuenciación de un ADN molde.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Especíﬁcamente, se reﬁere a un método para llevara cabola replicación,la ampliﬁcaciónola secuenciaciónde un ácido desoxirribonucleico con unaADN polimerasa del tipo φ29ya un kit para llevara cabo dicho método.

Estado de la técnica anterior

La única enzima requerida por el bacteriófago φ29 para replicar su genoma es su ADN polimerasa, una proteína monomérica de 66 KDa, capaz de catalizar tanto la iniciación de la replicación como la elongación de la cadena sintetizada.Parala iniciación,esta polimerasaseuneauna proteína denominada “terminal”(TP), reconoceelextremo del ADN de φ29ycatalizala formacióndeun complejocovalente TP-dAMP.Trasla polimerizaciónde10 nucleótidos, se disociael heterodímero ADN polimerasa/TPyse llevaa cabola elongacióndela cadena nacientede ADN.

Las ADN polimerasas replicativas requieren la interacción con proteínas accesorias que estabilizan la unión entre la enzimayel ADN(KuriyanyO’Donnell.JMol Biol. 1993; 234: 915-925). Por otro lado, dichas ADN polimerasas necesitan acoplar la polimerización al desplazamiento de la cadena de ADN que no está siendo copiada, para lo cual requieren su asociación funcionala proteínas tipo helicasa.En este sentido,laADN polimerasa del bacteriófago φ29 presenta varias características funcionales intrínsecas que la hacen única:

a) Elevada procesividad (deﬁnida como el número de nucleótidos incorporados por evento de unión).

b) Alta capacidad de desplazamiento de cadena, lo quelepermite replicar el genoma de dicho bacteriófago en ausencia de proteínas accesorias tipo helicasa. Estas dos características, procesividad y desplazamiento de cadena permiten que la ADN polimerasa de φ29 sea capaz de sintetizar cadenas de ADN de más de 70 kb de longitud (Blanco et al.JBiol Chem. 1989; 264: 8935-8940).

c) Alta ﬁdelidad en la inserción de nucleótidos en la nueva cadena (Esteban et al.JBiol Chem. 1993; 268: 27192726).

Todas estas característicashan conducidoal desarrollodeunagranvariedadde protocolosde procesos isotérmicos (a temperatura constante) para la ampliﬁcación de ADN de doble cadena (ADNbc), basados en el uso de esta polimerasa. En una conﬁguración simple, la capacidad de la ADN polimerasa de φ29 para usar ADN de cadena sencilla (ADNmc)circularpermiteunaampliﬁcacióndeADNporelmétododel circulo rodante(o,RCAdelassiglaseninglés de rolling-circle ampliﬁcation), originando moléculasde ADNmcde gran longitudyque contienen másde10 copias del molde circular (Blanco et al.JBiol Chem. 1989; 264: 8935-8940; US5001050, US5198543yUS5576204).Enel procedimiento de ampliﬁcación de ADNbc desarrollado por Amersham Biosciences/Molecular Staging (Dean et al. Genome Res. 2001; 11: 1095-1099; Dean et al. Proc NatlAcad SciUSA. 2002; 99: 5261-5266), la combinación del uso de la ADN polimerasa de φ29 con el de hexámeros (hexa-nucleótidos) cebadores de secuencias al azar, permiten obtenerfactoresde ampliﬁcaciónde104-106 partiendodepicogramosdeADN plasmídicocircular[Templiphi™de GE Healthcare]ode10 nanogramosdeADN genómico [Genomiphi™deGEHealthcareyRepli-G®de Qiagen],Los productos originados sonde alta calidadypueden digerirseo ser secuenciados directamentesin necesidadde puriﬁcaciónprevia, habiéndosedemostradoquelaADN polimerasade φ29 es la enzima más robusta para este ﬁn. El tampón habitual para llevar a cabo las reacciones de ampliﬁcación con la ADNpolimerasa de φ29 contieneTris-HCI(pH 7,5) más distintas concentraciones(enel orden milimolar)de NaCloKClyMgCl2 (US20030207267).Sin embargo,a pesardela bondadde estos protocolosen situacionesmuydiversas,esuna necesidad crecienteel desarrollar otrosque permitan partir de cantidades menores de ADN.

Explicación de la invención

La presente invención se reﬁere a un método para llevar a cabo la replicación, la ampliﬁcación o la secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con una ADN polimerasa del tipo φ29y a un kit para llevara cabo dicho método.

La ADN polimerasa del fago φ29 presenta varias características de gran interés para la ampliﬁcación de ADN como son: una elevada procesividad sin necesidad del concurso de ninguna proteína accesoriay una alta capacidad de desplazamiento de cadena que le permiten replicar el genoma de dicho bacteriófago en un solo evento de unión al ADN, así como una alta ﬁdelidad en la inserción de nucleótidos en la nueva cadena. Estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos para la ampliﬁcación isotérmica de ADN, basados en el usode esta polimerasaque permitenla obtenciónde productosde alta calidadque pueden digerirseo ser secuenciados directamentesin necesidadde puriﬁcaciónprevia.Sin embargo,existe una necesidadde protocolosque permitanla ampliﬁcaciónde ADNa partirde cantidades menoresdel mismo.La presenteinvención respondea esta necesidad mediante el desarrollo de un método de ampliﬁcación de ADN que mejora signiﬁcativamente la especiﬁcidady el rendimiento de la reacción.

En los ejemplos de esta patente se muestra que la adición simultánea de monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween®20)yunasaldeamonioaltampónusado habitualmenteparala ampliﬁcaciónconlaADN polimerasade φ29, por unlado,evitala ampliﬁcación inespecíﬁcade ADNy, por otro, permitela ampliﬁcación detectableyespecíﬁcaa partirde cantidades límitede0,1 femtogramos(fg)deADN plasmídicoy10fgdeADN genómico como molde.

Un primer aspectodela presenteinvenciónse reﬁereaun métodode replicación, ampliﬁcaciónosecuenciaciónde un ADN molde que comprendeponer en contacto dicho ADN con una mezclade reacciónque comprende,al menos:

a) una ADN polimerasa del tipo φ29,

b) monolaurato de sorbitán polioxietilenado,

c) una sal de amonio,

d) un tampón,

e) cloruro magnésico,

f) un cebador,y

g) nucleósidos trifosfato.

Una realización preferida de este aspecto de la invención, se reﬁere a un método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprendeloselementos(a)-(g) mencionados anteriormenteyqueademáscomprendeunasaldepotasio. Preferiblemente, dicha sal de potasio es cloruro potásico o acetato potásico.

El término“ADNpolimerasa”,taly comose utilizaenla presente descripción,se reﬁerea una enzima capazde catalizar la polimerización de desoxinucleósidos trifosfato. Generalmente, la enzima inicia la síntesis en el extremo 3’ deun cebador hibridadoconuna secuenciadeADNmolde,yprocedeen direcciónalextremo5’delahebradelADN molde.

El término “ADN polimerasa del tipo φ29”, taly como se utiliza enla presenteinvención, se reﬁerea cualquier ADN polimerasa que contiene subdominios TPR1 y TPR2 en su dominio de polimerización, que proporcionan a la polimerasa la capacidad de acoplar la polimerización procesiva al desplazamiento de cadena. Ejemplos deADN polimerasas del tipo φ29 que pueden ser empleadas en la presente invención se seleccionan de la lista que comprende las ADN polimerasas aisladasde los siguientesfagos: φ29, Cp-1, PRD-1, φ15, φ21, PZE, PZA,Nf, M2Y,B103,GA1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5,PR722, L17o Acidianus Bottle-shaped virus (ABV).

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la ADN polimerasa del tipo φ29se seleccionade entrelasADN polimerasas aisladasdelos siguientesfagos: φ29, Cp-1, PRD1, φ15, φ21,PZE,PZA,Nf,M2Y, B103,GA-1,SF5,Cp-5,Cp-7,PR4,PR5, PR722,L17o Acidianus Bottle-shaped virus (ABV).

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la ADN polimerasa del tipo φ29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidadde,al menos,el 80% con la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, la ADN polimerasa deltipo φ29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 90% con la SEQ ID NO: 1. En una realización aún más preferida, la ADN polimerasa del tipo φ29 tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

El dominio exonucleasa de las ADNpolimerasas del tipo φ29 es conocidoy puede ser modiﬁcado para reducirla actividadexonucleasa reteniendo una alta procesividadycapacidadde desplazamientode cadena. EstasADN polimerasas modiﬁcadas son especialmente útiles para secuenciar moléculas largas.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la ADN polimerasa del tipo φ29 presenta una modiﬁcación en el dominio exonucleasa, donde dicha ADN polimerasa modiﬁcadatiene menosdel10%deactividadexonucleasaquela correspondienteADN polimerasadeorigen naturalo“wild type”. En una realización más preferida, la ADN polimerasa del tipo φ29 modiﬁcada tiene menos del 1% de actividad exonucleasaquela correspondienteADN polimerasadeorigen natural.Enuna realizaciónaúnmás preferida,laADN polimerasa del tipo φ29 modiﬁcada carecedeactividadexonucleasadetectablecon respectoala correspondienteADN polimerasa de origen natural.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la ADN polimerasa del tipo φ29 (naturalo modiﬁcada enel dominioexonucleasa) estáa una concentraciónde entre5nMy 75nM.En una realizaciónmás preferida,laADNpolimerasadeltipo φ29 (naturalo modiﬁcada en el dominio exonucleasa) estáa una concentraciónde entre25nMy60nM.En una realizaciónaúnmáspreferida,laADN polimerasa del tipo φ29 (natural o modiﬁcada en el dominio exonucleasa) está a una concentración de aproximadamente 50 nM.

En una realización preferidadel métodode replicación, ampliﬁcacióno secuenciacióndelainvención,el monolauratode sorbitán polioxietilenado(Tween®20)estáaunaconcentracióndeentreel0,003%yel0,1%delvolumentotal de la reacción. En una realización más preferida, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entreel 0,006%yel 0,05% delvolumen totaldela reacción.En una realización aún más preferida,el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporciónde entreel0,01%yel 0,03% delvolumen totaldela reacción.En una realizaciónaúnmás preferida,elmonolauratode sorbitán polioxietilenadoestáenunaproporciónde aproximadamente 0,025% del volumen total de la reacción. Por “volumen total de la reacción”, se entiende el volumen resultante tras la adición del ADN molde a la mezcla de reacción.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la sal de amonio se selecciona de la lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio o acetato de amonio.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la sal de amonioes sulfatode amonio.En una realizaciónmás preferida,el sulfatode amonio estáa una concentracióndeentre 30mMy60mM.En una realizaciónaúnmás preferida,elsulfatode amonio estáa una concentraciónde entre40mM y50 mM. En una realización aún más preferida, el sulfato de amonio está a una concentración de aproximadamente 45 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la sal de amonio es cloruro de amonio. En una realización más preferida, el cloruro de amonio está a una concentración de entre60mMy 120 mM.En una realización aún más preferida,el clorurode amonio estáa una concentraciónde entre80mMy 100 mM.En una realización aún más preferida,el clorurode amonio estáa una concentraciónde aproximadamente 90 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, la sal de amonio es acetatode amonio.En una realización más preferida,el acetatode amonio estáa una concentraciónde entre60mMy120mM.En una realizaciónaúnmás preferida,el acetatode amonio estáa una concentraciónde entre80mMy100mM.En una realizaciónaúnmás preferida,el acetatode amonio estáa una concentraciónde aproximadamente 90 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el tampón estáaunpHde entre7,0y8,5.Enuna realizaciónmás preferida,eltampónestáaunpHde entre7,2y8.Enuna realización aún más preferida,el tampón estáa unpHde aproximadamente 7,5.

Enuna realización preferidadel métodode replicación, ampliﬁcaciónosecuenciacióndelainvención,eltampónes Tris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPES.En una realización más preferida del métodode replicación, ampliﬁcación

o secuenciación de la invención, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES está a un pH de entre 7,0 y 8,5.Enuna realizaciónaúnmás preferida,eltampónTris-Clorhídrico,Tris-AcéticooHEPESestáaunpHdeentre 7,2y8.En una realización aúnmás preferida,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPES estáa unpHde aproximadamente 7,5.

En una realización preferida de este aspecto del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPES estáa una concentraciónde entre25mMy50mM.En una realización más preferida,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPES estáa una concentraciónde entre 30mMy45mM.Enunarealizaciónaúnmás preferida,eltampónTris-Clorhídrico,Tris-AcéticooHEPESestáauna concentración de aproximadamente 40 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el cloruro potásicooel acetatopotásicoestáaunaconcentracióndeentre30mMy70mM.Enunarealizaciónmás preferida,el cloruropotásicooel acetato potásico estáa una concentraciónde entre40mMy60 mM.En una realización aúnmás preferida, el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de aproximadamente 50 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el cloruro magnésico estáa una concentraciónde entre2mMy20 mM.En una realización más preferida,elcloruro magnésico estáa una concentraciónde entre5mMy15 mM.En una realización aúnmás preferida,el cloruro magnésicoestá aproximadamente a 10 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el monolauratode sorbitánpolioxietilenadose encuentraenuna proporciónde entreel0,01%yel0,03%delvolumentotal, elsulfatode amoniose encuentraauna concentracióndeentre40mMy50mM,eltampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPESse encuentraa unaconcentraciónde entre30mMy45mMy aunpHde entre7,2y8,0,el cloruro magnésico estáa una concentración entre5mMy15mMyel cloruro potásicooel acetato potásicose encuentraa una concentraciónde entre40y60 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una concentración del 0,025% del volumen total, el sulfato de amoniose encuentraa una concentraciónde45mM,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPESse encuentra auna concentraciónde40mMyaunpHde7,5,el cloruro magnésicoestáauna concentraciónde10mMyelcloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de 50 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el monolauratode sorbitánpolioxietilenadose encuentraen una proporciónde entreel 0,01%yel 0,03%delvolumen total, el clorurode amoniose encuentraa una concentraciónde entre80mMy100mM,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPESse encuentraa unaconcentraciónde entre30mMy45mMy aunpHde entre7,2y8,0,el cloruro magnésico estáa una concentraciónde entre5mMy15mMyel cloruro potásicooel acetato potásico se encuentraa una concentraciónde entre40y60 mM.

En una realización más preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una concentración del 0,025% del volumen total, el cloruro de amoniose encuentraa una concentraciónde90mM,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPESse encuentra auna concentraciónde40mMyaunpHde7,5,el cloruro magnésicoestáauna concentraciónde10mMyel cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de 50 mM.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el monolauratode sorbitánpolioxietilenadose encuentraen una proporciónde entreel 0,01%yel 0,03%delvolumen total, el acetatode amoniose encuentraa una concentraciónde entre80mMy100mM,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPESse encuentraa unaconcentraciónde entre30mMy45mMy aunpHde entre7,2y8,0,el cloruro magnésico estáa una concentraciónde entre5mMy15mMyel cloruro potásicooel acetato potásico se encuentraa una concentraciónde entre40y60 mM.

En unamás realización preferidadel métodode replicación, ampliﬁcacióno secuenciacióndelainvención,el monolauratode sorbitán polioxietilenado se encuentra en una concentración del 0,025%delvolumen total,el acetatode amoniose encuentraa una concentraciónde90mM,el tampónTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPESse encuentra auna concentraciónde40mMyaunpHde7,5,el cloruro magnésicoestáauna concentraciónde10mMyel cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de 50 mM.

El término “replicación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se reﬁere a la síntesis de un ADN complementario a partir de un ADN molde.

El término “ampliﬁcación”, taly como se utiliza en la presente descripción, se reﬁere al aumento del número de copias de un ADN molde.

El término “secuenciación”,talycomose utilizaenla presente descripción,se reﬁereala determinacióndel orden de los nucleótidos de un ADN molde.

Por “poner en contacto” se entiende que el ADN moldey la mezcla de reacción se incuban en condiciones de extensión del cebador.

El término “cebador”, como se utiliza aquí, se reﬁere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio dela síntesisdeADN cuandose encuentraen condicionesdeextensióndel cebador. Preferiblemente,el cebadoresun oligonucleótido de desoxirribosa.

Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse, a la síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias especíﬁcas de deoxinucleótidos enel ADN molde(cebadores especíﬁcos)o pueden ser sintetizadosal azar (cebadores arbitrarios).

El término “cebador especíﬁco”,taly comose utilizaenla presente descripción,se reﬁereauncebadorcuya secuencia es complementaria a una secuencia especíﬁca de deoxinucleótidos en el ADN molde que se quiere ampliﬁcar.

Por “complementaria” se entiende que el cebador puede hibridar con una región del ADN molde de forma que puede actuar como puntode iniciodela síntesisdeADN cuandose encuentraen condicionesdeextensióndel cebador. Preferentemente, esa región tiene una complementariedad del 100% con una región del ADN molde. Esto es, cada nucleótido en la región de complementariedad con el cebador puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido presente en el molde de hebra sencilla. Sin embargo, aquellos con una experiencia normal en el campo reconocerán que cebadores que posean una región con complementariedad menor al 100% respecto al ADN molde funcionarán para llevar a cabo el método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la presente invención.

El término “cebador arbitrario” se reﬁere a un cebador cuya secuencia es sintetizada al azary que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ADN molde. Por lo general, en el método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la presente invención se emplea una población de cebadores arbitrarios. El término “cebadores arbitrarios” se reﬁerea un conjuntode cebadores con una secuencia aleatoriayque se usan para iniciarla síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ADN molde.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el cebador es especíﬁco.

En otra realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el cebador es arbitrario. Preferiblemente,el cebador arbitrario estáprotegido frenteala accióndeexonucleasas 3’-5’.Ymáspreferiblemente,el cebador arbitrario es un oligonucleótidode6nucleótidos, “hexanucleótido”o “hexámero” protegido frente a la acción de exonucleasas 3’-5’.

La expresión “protegido frente a la acción de exonucleasas”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se reﬁere a un cebador modiﬁcado de forma que es resistente a la degradación nucleolítica por cualquier actividad exonucleasa 3’-5’ presente en la ADN polimerasa.

En el método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención puede emplearse más de un cebador, pudiendo emplearse cebadores especíﬁcos y/o arbitrarios.

En una realización preferida del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, el cebador estáauna concentraciónde entre2 µMy100µM.Enuna realizaciónmás preferida,el cebadorestáauna concentración de entre 20 µMy80µM.En una realización aúnmás preferida,el cebador estáa una concentraciónde entre40y60 µM. En una realización aún más preferida, el cebador están a una concentración de aproximadamente 50 µM.

El término “nucleósidos trifosfato”,talycomose utilizaenla presente descripciónse reﬁerea moléculasorgánicas formadas porla unión covalentede una pentosa, una base nitrogenadaytres grupos fosfato.

El término nucleósidos trifosfato incluye desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs) como, por ejemplo, pero sin limitarse,dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP,dTTP,o derivadosde los mismos. Preferiblemente, los desoxinucleósidos trifosfato son dATP, dTTP, dGTPydCTP. Aún más preferiblemente, estos cuatro dNTPs están en condiciones equimolares.En una realizaciónpreferidade este aspectodelainvención, los desoxinucleósidos trifosfato estánauna concentración de entre 100 µMy800µM. En una realización más preferida, los desoxinucleósidos trifosfato están a una concentración de entre 200 µMy600µM. En una realización aún más preferida, los desoxinucleósidos trifosfato están a una concentración de aproximadamente 500 µM.

El término nucleósidos trifosfato también incluye didesoxinucleósidos trifosfato (ddNTPs) como, por ejemplo, pero sin limitarse, ddATP, ddCTP, ddITP, ddUTP, ddGTP, ddTTP, o derivados de los mismos.

En algunas realizaciones preferidas del método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la invención, al menos,un nucleósido trifosfatooun cebadorestá marcado mediante técnicasbien conocidasenel estadodela técnica. El nucleótido marcado puede ser, por ejemplo, un desoxinucleósido trifosfato o un didesoxinucleósido trifosfato. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas ﬂuorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas.

El término “ADN molde”, taly como se utiliza en la presente descripción, se reﬁere a una molécula de ADN que puede servir como sustrato para la síntesis de una cadena de ADN complementaria; es decir, se reﬁere a una molécula de ADN que va a ser replicada, ampliﬁcada o secuenciada. En una realización preferida el ADN molde es ADN plasmídico. En otra realización preferida, el ADN molde es ADN genómico.

La replicación, la ampliﬁcación o la secuenciación del ADN molde se lleva a cabo en condiciones de extensión de cebador. La expresión “condiciones de extensión de cebador” hace referencia a las condiciones en que puede tener lugar la síntesis dependiente de ADN molde iniciada en un cebador.

La síntesis de un ADN molde según el método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la presente invención puede tener lugar mediante un proceso de ciclado térmico o a una temperatura esencialmente constante.

Por “condicionesisotérmicas” se entiende temperatura esencialmente constante. Preferiblemente, la síntesis del ADN moldesegúnel métodode replicación,ampliﬁcacióno secuenciacióndelapresenteinvención tienelugarauna temperatura esencialmenteconstante.Más preferiblemente,a una temperatura esencialmente constantede entre25y 40ºC,yaún más preferiblemente,de aproximadamente 30ºC.

Son conocidos en el estado de la técnica un amplio número de métodos que permiten la ampliﬁcación de ADN. Algunos métodos requieren un proceso de ciclado térmico como, por ejemplo, pero sin limitarse, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otros métodos no requieren un proceso de ciclado térmico, sino que se realizan a una temperatura esencialmente constante como, por ejemplo, pero sin limitarse, la ampliﬁcación por círculo rodante (RCA), la ampliﬁcación de desplazamiento múltiple (MDA), la ampliﬁcación por desplazamiento de cadena (SDA) o la ampliﬁcación mediante lazo (LAMP). La ampliﬁcación de un ADN molde según el método de la presente invención puede tener lugar mediante un proceso de ciclado térmico o a una temperatura esencialmente constante.

Preferiblemente, la ampliﬁcación del ADN molde según el método de ampliﬁcación de la presente invención tiene lugar mediante ampliﬁcación por círculo rodante (RCA), mediante ampliﬁcación de desplazamiento múltiple (MDA), ampliﬁcación por desplazamiento de cadena (SDA) o ampliﬁcación mediante lazo (LAMPA).

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a un kit o dispositivo que comprende elementos apropiados para llevar a cabo el método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a un kit para llevar a cabo el método de replicación, ampliﬁcación

o secuenciación de la presente invención que comprende:

a) una ADN polimerasa del tipo φ29,

b) monolaurato de sorbitán polioxietilenado,

c) una sal de amonio,

d) un tampón,y

e) cloruro magnésico.

Preferiblemente, dicha sal de amonio se selecciona de la lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio

o acetato de amonio.

En una realización preferidade este aspectodelainvención,el kit comprende además una salde potasio. Preferiblemente, dicha sal de potasio es cloruro potásico o acetato potásico.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit comprende además un cebador. En una realización más preferida, el cebador es un cebador arbitrario que está protegido frente a la acción de exonucleasas 3’-5’.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit comprende además nucleósidos trifosfato. Por ejemplo, en una realización más preferida de este aspecto de la invención, el kit comprende además desoxinucleósidos trifosfato y/o un didesoxinucleósido trifosfato.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit comprende, al menos, un nucleósido trifosfato

o un cebador marcado. El nucleósido marcado puede ser, por ejemplo, un desoxinucleósido trifosfato o un didesoxinucleósido trifosfato.

El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, etc. Porotrolado,elkitpuede incluirtodoslos soportesyrecipientes necesariosparasupuestaen marchayoptimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Las siguientesﬁgurasyejemplosse proporcionana modode ilustración,y nosepretendeque sean limitativosdela presente invención.

Descripción de las ﬁguras

Figura1. Muestrael efectodelTween®20ydel(NH4)2SO4enla capacidaddeampliﬁcacióndelaADN polimerasa de φ29.El ensayosellevóa cabo comose describeeneltexto principal,enpresenciadelas cantidades indicadasde ADN plasmídico (4,2 kpb). Despuésde incubara 30ºC durante5h, las reacciones se analizaron comose describeen el texto principal.Ala izquierda, los fragmentos de ADN lineales obtenidos después de digestión del ADN de φ29 con HindIII, usados como marcadores de longitud del ADN.

Figura 2. Muestra la ampliﬁcaciónde distintas cantidades de ADN plasmídico (en el orden de femtogramos) por la ADN polimerasa de φ29en presenciadeTween®20y(NH4)2SO4.El ensayosellevóacabo comose describeenel texto principal,en presenciadeTween®20al 0,025%yde(NH4)2SO445mM.Los marcadoresde longituddelADN son iguales a los usados en la Figura 1.

+

Figura 3. Muestra el efecto del ión NH4 en la capacidad de ampliﬁcación de la ADN polimerasa de φ29. El ensayo sellevóacabocomose describeeneltexto principal,en presenciadeTween®20al 0,025%ydelasalde amonio indicada así comode las cantidades indicadasde ADN plasmídico (4,2 kpb). Despuésde incubara 30ºC durante6h, las reacciones se analizaron como se describe en el texto principal. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en la Figura 1.

Figura 4. Muestra la ampliﬁcación de distintas cantidades de ADN genómico de Bacillus subtilis por la ADN polimerasa de φ29en presenciadeTween®20y(NH4)2SO4.El ensayosellevóa cabo comose describeeneltexto principal, en presencia deTween® 20 al 0,025%yde (NH4)2SO4 45 mM. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en la Figura 1.

Figura5. Muestrala notable mejoraque representael añadirTween®20al 0,025%y(NH4)2SO445mMalactual tampón de reacción de un kit comercial para la ampliﬁcación de ADN basado en la ADN polimerasa de φ29 (Illustra kitde General Electrics HealthCare).El ensayosellevóa cabo comose describeeneltexto principal.Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en la Figura 1.

Ejemplos

Optimizaciónde las condicionesexperimentales para llevara cabola ampliﬁcaciónde ADN con cebado múltiplepor la ADN polimerasa de φ29

Los siguientes ejemplos especíﬁcos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con ﬁnes ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Se ha mostrado que la ADN polimerasa de φ29 realiza una ampliﬁcaciónde104-106veces partiendodevarios picogramosdeADN circular.Paraesteﬁnseempleóuntampónde reacciónque contieneTris-HCI40mM,pH7,5, KCl 50 mMyMgCl2 10 mM (en lo sucesivoTampónA). Después de probarla inﬂuencia de diferentes condiciones de detergentesysales en la capacidad de ampliﬁcación de ADN de la ADN polimerasa de φ29, encontramos que la adición simultánea deTween® 20 al0,025%y(NH4)2SO4 45 mM alTampónAmejora mucho la ampliﬁcación de cantidades limitadas de ADNaportado.

Condiciones de la reacción de ampliﬁcación de ADN plasmídico.-La mezcla de incubación contenía en 12,5 µl de tampón A, 50 µMde hexámeros protegidos contra la acción de la exonucleasa 3’-5’, 500µMde cada uno delos desoxinucleósidos trifosfato (dCTP, dGTP, dTTPydATP), las cantidades indicadas de un ADN plasmídico (con un tamañode4,2kbp)y, dondese indica,se adicionó(NH4)2SO4 45mMoTween®20al 0,025%o una combinaciónde ambos.La desnaturalización del ADN se llevóa cabo por incubacióna 95ºC durante3minutosyposterior enfriamiento enhielo durante5min.Lareacción se inicióal añadir ADN polimerasade φ2950nMy se detuvo despuésde la incubacióna 30ºC mediante calentamientoa 65ºCdurante10 min.Parael análisisdelosresultados,se tomaron muestras de1 µldelasreacciones, se digirióelADN ampliﬁcado conla endonucleasaderestricción EcoRIy se sometióaelectroforesisengelesdeagarosaal0,7%.ElADNsedetectó mediante tincióndelosgelesconbromurode etidio.

Condicionesdelareacciónde ampliﬁcaciónde ADNgenómico.-La mezclade incubación contenía en 12,5 µlde tampón A, (NH4)2SO4 45 mM,Tween® 20 al 0,025%, 50 µMde hexámeros protegidos contra la acción de la exonucleasa 3’-5’, 500 µMde cada uno de los desoxinucleósidos trifosfato (dCTP, dGTP, dTTPydATP)ylas cantidades indicadasde ADNgenómicode Bacillus subtilis (con un tamañode4Mpb).La desnaturalización del ADN se llevóa cabo por incubacióna 95ºC durante3minutosyposterior enfriamiento en hielo durante5min.Lareacción se inició al añadir ADN polimerasa de φ2950nMyse detuvodespuésdela incubacióna 30ºC mediante calentamientoa 65ºC durante10 min.Parael análisisde losresultados, se tomaron muestrasde1 µlde lasreaccionesyse sometierona electroforesis engelesdeagarosaal 0,7%.El ADN se detectó mediante tinciónde losgeles conbromurode etidio.

La Figura1muestra el efecto de añadir (NH4)2SO4 45 mMyTween® 20 al 0,025% en la ampliﬁcación de cantidades pequeñas de ADN plasmídico aportado. Como se muestra, la ADN polimerasa de φ29 no dio ningún producto de ampliﬁcación detectable conelTampónAestándar cuando se usaron 100fgde ADN aportado.En estas condiciones de reacción, la adición deTween® 20 al 0,025% en ausencia de ADN causó la aparición de productos de ADN en forma de rastro, lo más probable como una consecuencia de la ampliﬁcación inespecíﬁca de ADN causadapor la hibridaciónyelongaciónde los cebadoreshexámeros aleatorios.Se observóel mismo rastro con10fgde ADN aportado.Sinembargo,en presenciade100fgdeADN aportado,la adicióndeTween®20al 0,025% permitióque la ADN polimerasa de φ29 produjera una cantidad detectable de plásmido ampliﬁcado. La producción total de ADN ampliﬁcado, especíﬁcoo inespecíﬁco, indicaquela adicióndeTween®20al 0,025%alTampónApotenciala capacidad de ampliﬁcación de la ADN polimerasa de φ29. Se observó un efecto similar con el detergente NP40. Por el contrario, otros detergentes analizados comoTritónX100yTritónX114no potenciabanla capacidadde ampliﬁcación de la ADN polimerasa de φ29(nose muestra).La adición simultáneadeTween®20al 0,025%y(NH4)2SO445mM al tampónA teníados consecuencias enel rendimientoyla especiﬁcidaddelos productos ampliﬁcados:1)nose detectóampliﬁcacióndeADNen ausenciadeADN aportado;2) se obtuvieronpor ampliﬁcaciónvarios µgde ADN plasmídico de unidad longitud, incluso cuando la cantidad de ADN aportado era tan baja como 10 fg. Como control, la adiciónde(NH4)2SO445mMalTampónAno produjo ninguna mejoraenla capacidadde ampliﬁcacióndelaADN polimerasa de φ29.

Porlo tanto, podemos concluirquela adición simultáneadeTween®20al 0,025%y(NH4)2SO445mMalTampón A(enlo sucesivoTampónB)produceunaclara optimizacióndelas condicionesexperimentalesparallevaracabola ampliﬁcación con cebado múltiple de ADN circular por la ADN polimerasa de φ29, siendo ambos reactivos absolutamente necesarios para ampliﬁcar cantidades limitadas (10 fg) de ADN aportado. De hecho, como puede verse en la Figura2,el usodeTampónBpermitióala ADN polimerasade φ29 sintetizar microgramos de ADN usando una cantidaddeplásmido aportadotanbaja como0,1fg(∼24 moléculas) despuésde6horasde reacción. Como controlde calidad, la digestión de los productos de ampliﬁcación con EcoRIgeneró fragmentos de ADNbc lineales de 4,2 kb, que indicabanqueelproductodeampliﬁcacióneran realmente repeticionesentándemdelplásmidooriginal.Denuevo,el TampónBtambiénevitóla ampliﬁcaciónde ADN inespecíﬁco (véase enla Figura2las calles correspondientesalas reacciones llevadas a cabo sin ADN aportado).

La Figura3 muestra el efecto de los iones amonioyTween® 20 al 0,025% en la mejora en la ampliﬁcación de cantidades pequeñas de ADN plasmídico. El ensayo se llevó a cabo en las condiciones anteriormente comentadas en presenciaTween®20al0,025%ydelasaldeamonio indicada.ComosepuedeobservarenlaFigura3tantoelNH4Cl como el NH4CH3COO tuvieron un efecto similar al (NH4)2SO4,tanto en el rendimiento como en la especiﬁcidad de los productos ampliﬁcados. Este resultado indica que el efecto anteriormente descrito del (NH4)2SO4 en la ampliﬁcación

+

de cantidades limitantes de ADN plasmídico es debido a los iones NH4 .

Para determinar si las condiciones optimizadas descritas antes también se aplicaban a la ampliﬁcación de ADN genómico, se llevó a cabo el mismo tipo de ensayos realizados en presencia de concentraciones limitadas de ADN genómico de B. subtilis (4Mpbde longitud).Comose muestraenla Figura4,la presenciadeTween®20al 0,025% y(NH4)2SO4 45 mM en el tampón B, por una parte evitaba la ampliﬁcación inespecíﬁca de ADN (calles sin ADN aportado),ypor otra parte, permitíaalaADN polimerasade φ29 dar ampliﬁcación detectableyespecíﬁca del ADN genómico incluso cuandose usaban10fgdeADN aportado,esdecir,una cantidad106veces inferiorala recomendada en los actuales kits de ampliﬁcación genómica comerciales.

Para determinarsila adiciónsimultáneadeTween®20al 0,025%y(NH4)2SO445mMincrementala eﬁciencia de ampliﬁcación de los actuales kits comerciales para la ampliﬁcación de ADN basado en la ADN polimerasa de φ29, sellevóacaboelmismotipode ensayosde ampliﬁcacióndeADN plasmídico descritoenlas Figuras1,2y3.Enla Figura5 se muestra la notable mejora que representa el añadirTween® 20 al 0,025%y(NH4)2SO4 45 mM al actual tampón de reacción del kit Illustra (GE HealthCare). Como se puede observar, siguiendo las recomendaciones del proveedor, con el kit Illustra sólo se puede ampliﬁcar de manera detectable en gel de agarosa cantidades de plásmido aportado igualeso superioresa10pg.Porel contrario,la adición simultáneadeTween®20al 0,025%y(NH4)2SO4 mM al tampón de reacción del kit Illustra disminuye de manera notable la cantidad necesaria de ADN que puede ampliﬁcarse, observándose productos de ampliﬁcación desde 1 fg aportado de ADN plasmídico, suponiendo una mejora de cuatro órdenes de magnitud en la ampliﬁcación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de replicación, ampliﬁcación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos: a) una ADN polimerasa del tipo φ29, b) monolaurato de sorbitán polioxietilenado, c) una sal de amonio, d) un tampón, e) cloruro magnésico,

f) un cebador,y g) nucleósidos trifosfato.
2.

Método segúnla reivindicación1dondela mezclade reacción además comprende una salde potasio.
3.

Método segúnla reivindicación2dondela salde potasio es cloruro potásicoo acetato potásico.
4. Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1 a3dondeel monolauratode sorbitán polioxietilenadoestá en una proporciónde entreel 0,003%yel 0,1% delvolumen totaldela reacción.
5.Métodosegúnlareivindicación4dondeel monolauratode sorbitánpolioxietilenadoestáenuna proporciónde entreel 0,006%yel 0,05% delvolumen totaldela reacción.
6.Métodosegúnlareivindicación5dondeel monolauratode sorbitánpolioxietilenadoestáenuna proporciónde entreel 0,01%yel 0,03% delvolumen totaldela reacción.
7.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la sal de amonio se selecciona de la lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio o acetato de amonio.
8. Método segúnla reivindicación7dondela salde amonio es sulfatode amonio.
9.

Método segúnla reivindicación8dondeel sulfatode amonio estáa unaconcentraciónde entre30mMy60 mM.
10.

Método segúnla reivindicación9dondeel sulfatode amonio estáa una concentracióndeentre40mMy50 mM.
11. Método segúnla reivindicación7dondela salde amonio es clorurode amonioo acetatode amonio.
12.Métodosegúnlareivindicación11dondeel clorurode amoniooelacetatode amonioestáauna concentración de entre60mMy120 mM.
13.Métodosegúnlareivindicación12dondeel clorurode amoniooelacetatode amonioestáauna concentración de entre80mMy100 mM.
14. Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1 a13 dondelaADN polimerasadeltipo φ29 se selecciona de entre las ADN polimerasas aisladas de los siguientesfagos: φ29, Cp-1, PRD-1, φ15, φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7,PR4, PR5, PR722, L17o ABV.
15.Método según la reivindicación 14 donde la ADN polimerasa del tipo φ29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 80% con la SEQ ID NO: 1.
16.Método según la reivindicación 15 donde la ADN polimerasa del tipo φ29 tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 90% con la SEQ ID NO: 1.
17.

Método según la reivindicación 16 donde la ADN polimerasa del tipo φ29 tiene la secuencia aminoacídica SEO ID NO: 1.
18.

Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1 a16 dondelaADN polimerasadeltipo φ29 presenta una modiﬁcacióneneldominioexonucleasaydondedichaADN polimerasa modiﬁcada tiene menosdel10%de actividad exonucleasa que la correspondiente ADN polimerasa de origen natural.
19.

Método según la reivindicación 18 donde la ADN polimerasa del tipo φ29 modiﬁcada tiene menos del 1% de actividad exonucleasa que la correspondiente ADN polimerasa de origen natural.
20.

Método según la reivindicación 19 donde la ADN polimerasa del tipo φ29 modiﬁcada carece de actividad exonucleasa detectable con respecto a la correspondiente ADN polimerasa de origen natural.
21.

Método según cualquieradelas reivindicaciones1 a20 dondeel tampón esTris-Clorhídrico,Tris-Acéticoo HEPES.
22. Método según cualquieradelas reivindicaciones1 a21 dondeel tampón estáa unpHde entre7y8,5.
23. Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1 a22 dondeel cloruro magnésico estáa una concentración de entre2mMy20 mM.
24.Métodosegúnlareivindicación23dondeel cloruromagnésicoestáauna concentracióndeentre5mMy15 mM.
25.

Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones2 a24 dondeel cloruro potásicooel acetato potásico estáa una concentraciónde entre30mMy70 mM.
26.

Método según la reivindicación 25 donde el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de entre40mMy60 mM.
27.

Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1a26dondelosnucleósidos trifosfatosondCTP,dGTP,dTTP ydATP.
28.

Método segúnla reivindicación27 donde los nucleósidos trifosfato dCTP, dGTP, dTTPydATP se encuentran en cantidades equimolares.
29.

Método según cualquieradelas reivindicaciones1 a28 dondeel cebador es arbitrarioyestá protegido contra la acción de exonucleasas.
30.

Método según cualquierade las reivindicaciones1 a29 dondeel ADN molde es ADNplasmídico.
31.

Método según cualquierade las reivindicaciones1 a29 dondeel ADN molde es ADNgenómico.
32.

Método según cualquierade las reivindicaciones1 a31 dondela ampliﬁcación se realizaa una temperatura esencialmente constante entre25y40ºC.
33.

Métodode ampliﬁcacióndeunADN moldesegún cualquieradelasreivindicaciones1 a32 dondelaampliﬁcación tiene lugar mediante ampliﬁcación por círculo rodante (RCA), ampliﬁcación por desplazamiento múltiple (MDA), ampliﬁcación por desplazamiento de cadena (SDA) o ampliﬁcación mediante lazo (LAMPA).
34.

Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1a33 donde,al menos,un nucleósido trifosfatooun cebador está marcado.
35.

Kit para llevara cabo unmétodo según las reivindicaciones1a34 que comprende: a) una ADN polimerasa del tipo φ29, b) monolaurato de sorbitán polioxietilenado, c) una sal de amonio, d) un tampón,y e) cloruro magnésico.
36.

Kit según la reivindicación 35 que además comprende una sal de potasio.
37.

Kit según cualquierade las reivindicaciones35ó36 que además comprende un cebador.
38.

Kit según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 que además comprende el cebador según la reivindicación
29.
39.

Kit según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38 que además comprende nucleósidos trifosfato.
40.

Kit según las reivindicaciones 37 a 39 donde, al menos, un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado.

LISTADE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Cientíﬁcas (CSIC)

<120> Método para la replicación, ampliﬁcación o secuenciación de un ADN molde.

<130> ES1641.386.2

<160> 1

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 572

<212> PRT

<213> Bacteriophage phi-29

<400> 1

ES2351 294A1

ES2351 294A1

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud:200930412

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 02.07.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12Q1/68 (01.01.2006)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

SHOAIB, M., BACONNAIS, S., MECHOLD, U. et al. Multiple displacement amplification for complex mixtures of DNA fragments. BMC Genomics. Septiembre 2008, Vol. 9, Nº 1, páginas 415-429. ISSN 1471-2164. En especial discusión, conclusiones y métodos. 1-3,7 8,11,14-40

Y

4-6

A

9,10,12,13

Y

HART, M. C., GREEN, D. H., BRESNAN, E., BOLCH, C. J. Large subunit ribosomal RNA gene variation and sequence heterogeneity of Dinophysis (Dinophyceae) species from Scottish coastal waters. Harmful Algae. Enero 2007, Vol. 6, Nº 2, páginas 271-287. ISSN 1568-9883. <Doi:10.1016/j.hal.2006.10.001>. En especial apartado 2.2. 4-6

A

1,7-13,21-24,

27-31,34,35,37-40

A

BLANCO, L., PRIETO, I., GUTIÉRREZ, J. et al. Effect of NH4+ ions on φ29 DNA-protein p3 replication: formation of a complex between the terminal protein and the DNA polymerase. Journal of Virology. Diciembre 1987, Vol. 61, Nº 12, páginas 3983-3991. ISSN 0022-538X. 1-3,7-17,21-40

A

WO 2001025483 A2 (STRATAGENE) 12.04.2001, páginas 16-19; ejemplo 3. 1-13,21-31,34-40

A

US 5198543 A (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) 30.03.1993, 1,7-24,27-35,

todo el documento.

37-40

A

BLASCO, M. A., BLANCO, L., PARÉS, E., et al. Structural and functional analysis of temperature 1,14-17,21-24,

sensitive mutants of the phage φ29 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. Agosto 1990, Vol. 18, Nº 16, páginas 4763-4770. ISSN 0305-1048. & Base de datos UniProt. Número de acceso Q38545, Versión 44. [en línea] 16.12.2008 [recuperado el 19.10.2010] Recuperado de Internet: <URL:http://www.ebi.ac.uk/uniprot/unisave/?help=0&session=/ebi/extserv/old-work/ SESSION23172-1287478337-1&index=8&view=623246632&issue_date=16-DEC-2008>

27-32,34,35,37-40

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 16.12.2010

Examinador E. Relaño Reyes Página 1/6

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud:200930412

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12Q Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, MEDLINE, BIOSIS, EMBASE, NPL, COMPENDX, INSPEC, XPESP, XPOAC, UniProt, Euro Patents, Japan Patents, Korea Patents, US Patents.

Informe del Estado de la Técnica Página 2/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930412

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 16.12.2010

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 4-6, 9-13, 15-20, 22, 29, 30, 34-40 1-3, 7, 8, 14, 21, 23-28, 31-33 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 9, 10, 12, 13 1-8, 11, 14-40 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930412

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

SHOAIB, M. et al. BMC Genomics. Septiembre 2008, Vol. 9, Nº 1, páginas 415-429. 15.09.2008

D02

HART, M. C. et al. Harmful Algae. Enero 2007, Vol. 6, Nº 2, páginas 271-287. 01.2007

D03

BLANCO, L. et al. Journal of Virology. Diciembre 1987, Vol. 61, Nº 12, páginas 3983-3991. 12.1987

D04

WO 2001025483 A2 12.04.2001

D05

US 5198543 A 30.03.1993

D06

BLASCO, M. A. et al. Nucleic Acids Research. Agosto 1990, Vol. 18, Nº 16, páginas 4763-4770. 08.1990

En D01 se optimiza un procedimiento para amplificar mezclas de moléculas de ADN genómico de pequeño tamaño. Para ello, se realiza una amplificación mediante MDA con la polimerasa de φ29.

D02 presenta un estudio sobre la diversidad génica de diversas especies del género Dinophysis, mediante la amplificación de una región del ADN ribosómico con las enzimas Pfu o Taq.

En D03 se muestra un estudio sobre el efecto de los iones NH4+ en la replicación de φ29. La adición de (NH4)2SO4 20 mM, aumenta la replicación del virus, probablemente por la estabilización del complejo ADN polimerasa-proteína terminal. Los iones K+, también producen un incremento en la replicación de φ29, aunque en menor medida.

D04 divulga un procedimiento de amplificación de ADN en el que se utilizan simultáneamente las polimerasas Pfu y Taq. Con tal fin, ha de optimizarse la mezcla de reacción, para lo cual hay que tener en cuenta el tampón, el pH, la concentración de Tween 20, y la presencia de sales de potasio o de sulfato amónico, entre otros factores. La mezcla de reacción optimizada comprende 0,1% de Tween, MgCl2 2,3 mM, (NH4)2SO4 8 mM y pH 9,1.

En D05 se anticipa una polimerasa de φ29 con mutaciones en el dominio de la exonucleasa, quedando la actividad exonucleasa disminuida a menos del 0,1% con respecto a la enzima silvestre. La mezcla de reacción para las pruebas realizadas, comprende Tris-HCl pH 7,5, MgCl2 10 mM, (NH4)2SO4 20 mM, cebadores y concentraciones equimolares de dTTP, dGTP, dCTP y [α-32P] dATP. Los reactivos se incubaron a 30 ºC durante 60 minutos.

D06 estudia cuatro mutantes de la ADN polimerasa de φ29 sensibles a temperatura. La secuencia Q38545 presenta un 100% de identidad con la SEQ. ID. NO. 1 de la solicitud.
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

El objeto de la presente solicitud, es un método de replicación, amplificación o secuenciación de ADN, que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprenda: la ADN polimerasa de φ29, monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween 20) del 0,01 al 0,03% del volumen total de la reacción; una sal de amonio (sulfato de amonio 40-50 mM, o cloruro amónico o acetato amónico 80-100 mM); un tampón (Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES) a pH 7-8,5; cloruro magnésico 5-15 mM; un cebador arbitrario protegido frente a las exonucleasas; dCTP, dGTP, dTTP y dATP en cantidades equimolares. Adicionalmente, esta mezcla puede incluir cloruro potásico o acetato potásico 40-60 mM, y estar marcado al menos o un cebador o un nucleósido trifosfato (reivindicaciones de la 1 a la 31 y 34). La reacción es a temperatura constante entre 25-40ºC, produciéndose amplificaciones mediante círculo rodante (RCA), por desplazamiento múltiple (MDA), por desplazamiento de cadena (SDA) o mediante lazo (LAMPA) (reivindicaciones 32 y 33). También se incluye un kit que comprende: una ADN polimerasa del tipo φ29, monolaurato de sorbitán polioxietilenado, una sal de amonio, un tampón, cloruro magnésico, una sal de potasio, un cebador arbitrario protegido contra las exonucleasas, y nucleósidos trifosfato, estando al menos marcado un nucleósido trifosfato o un cebador (reivindicaciones de la 35 a la 40).

Informe del Estado de la Técnica Página 4/6

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930412

1. NOVEDAD (Art. 6.1 LP 11/1986)

1.1.REIVINDICACIONES DE LA 1 A LA 3, 7, 8, 14, 21, DE LA 23 A LA 28 Y DE LA 31 A LA 33

El objeto de la presente solicitud, de acuerdo con las reivindicaciones de la 1 a la 3, 7, 8, 14, 21, de la 23 a la 28 y 31, es un método de replicación, amplificación o secuenciación de ADN genómico, que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprenda: la polimerasa de φ29; monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween 20); sulfato de amonio; un tampón (Tris-Clorídrico, Tris-Acético o HEPES); cloruro magnésico entre 5 y 15 mM; un cebador; dCTP, dGTP, dTTP y dATP en cantidades equimolares; y cloruro potásico o acetato potásico entre 40 y 60 mM. La amplificación se realiza a temperatura constante entre 25 y 40 ºC mediante MDA (reivindicaciones 32 y 33).

En D01 se optimiza un procedimiento para amplificar mezclas de moléculas de ADN genómico de pequeño tamaño. Para ello, se realiza una amplificación mediante MDA con la polimerasa de φ29 utilizando una mezcla de reacción que comprende: Tris-HCl; MgCl2 10 mM; (NH4)2SO4 5 mM; ClK 50 mM; Tween 0,2%; dCTP, dGTP, dTTP y dATP en cantidades equimolares; y un cebador arbitrario. La reacción se produjo a 30ºC durante 6 horas.

Por lo tanto, el objeto de las reivindicaciones de la 1 a la 3, 7, 8, 14, 21, de la 23 a la 28, y de la 31 a la 33, está anticipado de manera inequívoca en D01.

En consecuencia, las reivindicaciones de la 1 a la 3, 7, 8, 14, 21, de la 23 a la 28, y de la 31 a la 33, no cumplen el requisito de novedad.

1.2.

REIVINDICACIONES DE LA 4 A LA 6, DE LA 9 A LA 13, DE LA 15 A LA 20, 22, 29, 30, Y DE LA 34 A LA 40 Las reivindicaciones de la 4 a la 6, de la 9 a la 13, de la 15 a la 20, 22, 29, 30, y de la 34 a la 40, son nuevas.
2.

ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 8.1 LP 11/1986)
2.1. REIVINDICACIONES DE LA 1 A LA 3, 7, 8, 14, 21, DE LA 23 A LA 28, Y DE LA 31 A LA 33

En vista de los motivos expuestos en el apartado 1.1., las reivindicaciones de la 1 a la 3, 7, 8, 14, 21, de la 23 a la 28, y de la 31 a la 33, no presentan actividad inventiva.
2.2. REIVINDICACIONES DE LA 4 A LA 6

Esta solicitud tiene por objeto, según las reivindicaciones de la 4 a la 6, un método de replicación, amplificación o secuenciación de ADN, que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprenda: una polimerasa del tipo φ29, monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween 20) entre 0,01% y el 0,03% del volumen total de la reacción, una sal de amonio, un tampón, cloruro magnésico, un cebador y nucleósidos trifosfato.

D01 se considera el documento más cercano, y anticipa la amplificación de ADN mediante MDA con la polimerasa φ29, en una mezcla de reacción que comprende: Tris-HCl, MgCl2 10 mM, (NH4)2SO4 5 mM, ClK 50 mM, Tween 0,2%, nucleósidos trifosfato y un cebador.

La diferencia entre D01 y la presente solicitud, es que en la solicitud, la concentración de Tween 20 es del 0,01-0,03%, y en D01 del 0,2%.

El efecto técnico, es una optimización de las condiciones de amplificación, replicación o secuenciación de la polimerasa.

Por lo tanto, el problema a resolver es la mejora del procedimiento de replicación, amplificación o secuenciación de una muestra de ADN.

D02 anticipa un procedimiento de amplificación con las polimerasas Pfu o Taq. En ambos casos, las condiciones de la mezcla de reacción fueron Tris-HCl, (NH4)2SO4 20 mM, Tween 0,01% y MgCl2 3 mM.

Dado que la concentración de Tween del 0,01%, es eficaz en varios tipos de polimerasas, entre ellas la Pfu, perteneciente a la misma familia que las polimerasas de tipo φ29 (D02), un experto en la materia, intentaría optimizar el procedimiento de amplificación de ADN que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprenda: la polimerasa φ29, una sal de amonio, un tampón, cloruro magnésico, un cebador y nucleósidos trifosrato (D01), mediante la modificación de la concentración de Tween 20 al 0,01% (D02), con una expectativa razonable de éxito.

Por lo tanto, las reivindicaciones de la 4 a la 6 no cumplen el requisito de actividad inventiva.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930412
2.3. REIVINDICACIONES 9, 10, 12 Y 13

Las reivindicaciones 9, 10, 12 y 13 tienen actividad inventiva.
2.4. REIVINDICACIONES 11, DE LA 15 A LA 20, 22, 29, 30 Y 34

El objeto de la presente solicitud, es un método de replicación, amplificación o secuenciación de ADN, que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprenda: una polimerasa del tipo φ29, monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween 20), una sal de amonio, un tampón, cloruro magnésico, un cebador y nucleósidos trifosfato, en la que: la sal de amonio es cloruro de amonio o acetato de amonio (reivindicación 11); la polimerasa presenta la secuencia SEQ. ID. NO. 1 (reivindicaciones de la 15 a la 17); la polimerasa no tiene actividad exonucleasa detectable (reivindicaciones de la 18 a la 20); el pH se encuentra entre 7 y 8,5 (reivindicación 22); el cebador es arbitrario y está protegido frente a las exonucleasas (reivindicación 29); el ADN molde es plasmídico (reivindicación 30) y al menos se encuentra marcado un nucleósido trifosfato o un cebador (reivindicación 34).

D01 divulga un procedimiento de amplificación de ADN por MDA con la polimerasa de φ29 en una mezcla de reacción que comprende Tris-HCl, MgCl2 10 mM, (NH4)2SO4 5 mM, ClK 50 mM, Tween 0,2%, dCTP, dGTP, dTTP y dATP en concentraciones equimolares, y un cebador arbitrario. En este documento se afirma que la polimerasa φ29 se ha utilizado en la amplificación de ADN plasmídico (reivindicación 30).

Se considera que la elección de cloruro de amonio o acetato de amonio (reivindicación 11) en vez de sulfato de amonio como en D01, es una de las alternativas conocidas por el experto en la materia a la hora de aportar sales amonio a la mezcla de reacción. Así mismo, aunque en D01 no se especifique el pH de la reacción, el intervalo de pH entre 7 y 8,5, (reivindicación 22) es muy frecuente a la hora de realizar este tipo de reacciones, al igual que la protección del cebador frente a las exonucleasas (reivindicación 29) o el marcaje de los cebadores o de los nucleósidos trifosfato (reivindicación 34).

Por otro lado, dado que la secuencia de φ29 (reivindicaciones de la 15 a la 17), así como polimerasas modificadas que carezcan de la actividad exonucleasa (reivindicaciones de la 18 a la 20) están disponibles para el experto en la materia, su elección se considera una alternativa más a la hora de realizar el procedimiento reivindicado.

En consecuencia, las reivindicaciones 11, de la 15 a la 20, 22, 29, 30 y 34, no presentan actividad inventiva.
2.5. REIVINDICACIONES DE LA 35 A LA 40

Las reivindicaciones de la 35 a la 40 tienen por objeto, un kit que comprende: una ADN polimerasa de tipo φ29, Tween 20, una sal de amonio, un tampón, cloruro magnésico, una sal de potasio, un cebador arbitrario protegido frente a las exonucleasas, y nucleósidos trifosfato, estando marcado al menos un nucleósido o un cebador.

Dados los argumentos desarrollados en los puntos 2.1 y 2.4., las reivindicaciones de la 35 a la 40 no cumplen el requisito de actividad inventiva.

Informe del Estado de la Técnica Página 6/6