JP2014507950A5

JP2014507950A5 -

Info

Publication number: JP2014507950A5
Application number: JP2013556801A
Authority: JP
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2015-04-16

Claims

配列決定プライマー、ブロッキング核酸、および、標識化された連鎖停止ヌクレオチド三リン酸を含む、参照配列を有するサンプル中の標的配列を配列決定するためのキットであって、
配列決定プライマーは、標的配列と参照配列の一本鎖の一部に相補的であり、ブロッキング核酸は、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的であり、
配列決定プライマーとブロッキング核酸は、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、ブロッキング核酸は、ポリメラーゼでは伸長できないように、３’末端でブロックされる、ことを特徴とするキット。
ブロッキング核酸は、ハイブリダイズが可能となると、完全に相補的な参照鎖を含むホモ二本鎖と、部分的に相補的な標的鎖を含むヘテロ二本鎖を形成することができ、その結果、ブロッキング核酸と相補的な標的鎖のヘテロ二本鎖は、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖よりも低い温度で変性し、配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で標的鎖にアニーリングされることが可能である、ことを特徴とする請求項１に記載のキット。
配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と結合する参照配列の鎖上の塩基の近くで参照配列の鎖に結合することができ、あるいは、配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも１つに相補的である、ことを特徴とする請求項１または２に記載のキット。
ブロッキング核酸の５’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項１−３のいずれか１つに記載のキット。
ブロッキング核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含み、随意に、ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように選択されるか、あるいは、ブロッキング核酸全体でより一定の融解温度をもたらすように選択される、ことを特徴とする請求項１−４のいずれか１つに記載のキット。
５’−リン酸化プライマーおよび／または５’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼをさらに含み、
５’−リン酸化プライマーは、配列決定プライマーと同じ鎖に相補的ではない、ことを特徴とする請求項１−５のいずれか１つに記載のキット。
標的配列および参照配列は、Ｋ−ＲＡＳエキソン２、コドン１２、および／または１３、ミトコンドリア変異、ＭＥＬＡＳに関連付けられるミトコンドリア変異、ＨＰＶ核酸、および、ＢＲＡＦエキソン１１および／またはエキソン１５の少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項１−６のいずれか１つに記載のキット。
配列決定のためにサンプル中の標的配列を調製するための方法であって、
前記方法は、
ａ）反応混合物を形成するために、ＤＮＡ配列決定反応混合物にサンプルを加える工程であって、
サンプルが参照配列を有し、１以上の標的配列を有する疑いもあり、ＤＮＡ配列決定反応混合物が、配列決定プライマーと、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的な過剰モル量のブロッキング核酸を含み、
ブロッキング核酸と配列決定プライマーが、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、
ブロッキング核酸が、ポリメラーゼによって伸長できないように３’末端でブロックされる、工程、
ｂ）変性した参照鎖と変成した標的鎖を形成するために、参照配列と標的配列の融解温度（Ｔｍ）よりも高い第１の変性温度に、標的配列を有している疑いのある反応混合物をさらす工程、
ｃ）ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖の形成と、ブロッキング配列と標的鎖のヘテロ二本鎖の形成を可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、
ｄ）ブロッキング核酸と相補的な標的鎖の前記ヘテロ二本鎖の変性を可能にするほどには十分であるが、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖を変性させるには不十分である臨界温度（Ｔｃ）まで、反応混合物の温度を上げる工程、
ｅ）配列決定プライマーが反応混合物中の遊離標的鎖および遊離参照鎖にアニーリングされることを可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、および、
ｆ）伸長生成物を生成するために配列決定プライマーを伸長する工程であって、伸長生成物が標的配列の核酸配列の決定を可能にするために解析可能である工程を含む、ことを特徴とする方法。
標的配列の核酸配列を決定する工程をさらに含み、
配列は、ジ−デオキシ配列決定、単一分子配列決定、パイロシーケンシング、または、第２世代ハイスループットシーケンシングによって随意に決定され、
前記方法はサイクル配列決定反応中の２以上のサイクルにわたって随意に繰り返され、
前記反応混合物は核酸検出用色素を随意に含む、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端に結合する参照鎖の塩基の近くで参照鎖に結合し、あるいは、配列決定プライマーの３’末端は、ブロッキング核酸の５’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも１つに相補的であり、あるいは、配列決定プライマーの３’末端とブロッキング核酸の５’末端は、参照鎖の同じ塩基の２つ以上に相補的であり、あるいは、ブロッキング核酸の５’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項８または９のいずれか１つに記載の方法。
ブロッキング核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含み、ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように随意に選択される、ことを特徴とする請求項８−１０のいずれか１つに記載の方法。
標的配列は参照配列に対して少なくとも５０％の相同性を有する、ことを特徴とする請求項８−１１のいずれか１つに記載の方法。
配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で、参照配列の鎖にアニーリングされ得るか、あるいは、配列決定プライマーは、ブロッキング核酸に対して過剰なモルで反応混合物に加えられる、ことを特徴とする請求項８−１２のいずれか１つに記載の方法。
反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、工程ａ）のサンプルとして、増幅産物の少なくとも一部を用いる前に、サンプル中の標的配列の少なくとも１つを増幅する工程、あるいは、反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、サンプル中の標的配列の少なくとも１つを増幅する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項８−１３のいずれか１つに記載の方法。
増幅産物の一本鎖を選択的に分解させる工程をさらに含み、
増幅プライマーが標識化されることによって、結果として生じる標識化された標的鎖が分解可能となり、増幅プライマーは５’リン酸によって随意に標識化され、および、前記方法は、５’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼによって配列決定反応をインキュベートする工程を含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。