CN105803052A - 检测乙醇耐受基因的方法和试剂盒 - Google Patents
检测乙醇耐受基因的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105803052A CN105803052A CN201410847860.9A CN201410847860A CN105803052A CN 105803052 A CN105803052 A CN 105803052A CN 201410847860 A CN201410847860 A CN 201410847860A CN 105803052 A CN105803052 A CN 105803052A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- primer
- seqidno
- snp site
- genotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测乙醇耐受基因的方法，包括：获取受检者核酸，所述核酸包含DNA片段；检测以下至少两个SNP位点的基因型，ALDH2基因c.1510G>A、ADH2基因c.143A>G、ADH2基因c.1108T>C、ADH3基因c.900G>A、ADH3基因c.1133G>T、CYP2E1基因c.7668T>A、CYP2E1基因c.1295G>C，其中包括，利用第一引物扩增包含所述SNP位点的DNA片段，获得扩增产物，将第二引物与所述扩增产物结合，延伸一个碱基，获得延伸产物，依据所述延伸产物与所述第二引物的分子量差异，确定所述SNP位点的碱基类型。本发明还公开一种检测乙醇耐受基因的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体的，本发明涉及一种检测乙醇耐受基因的方法和一种试剂盒。
背景技术
研究表明,适当的饮酒在一定程度上有利于身体健康，但是饮酒过量、酗酒则会引起机体的生理异常或组织器官严重的病理状态。乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase,ALDH)的基因，已经被证实是能影响饮酒行为的主要基因；另外，微粒体乙醇氧化酶系的细胞色素2E1酶(CYP2E1s)对乙醇耐受的影响也较为明确。
饮酒后，乙醇在体内主要通过胃和小肠吸收进行代谢，大部分乙醇主要经乙醇脱氢酶(ADH)作用生成乙醛，再经乙醛脱氢酶(ALDH)作用生成乙酸，然后进入氧化循环反应,最终代谢生成二氧化碳和水；一部分乙醇则由微粒体乙醇氧化酶系的细胞色素2E1酶(CYP2E1)代谢为乙醛，但该途径会产生损害性羟基，损伤肝细胞；很少部分乙醇以原形经呼吸道、尿液、汗液直接排出。
目前传统的酒精耐受基因检测方法包括单链构象多态性(PCR-SSCP)、限制性片段长度多态(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、直接测序、基因芯片。这些检测方法存在较多局限性，或者检测能力低、或者通量低耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是，这些方法除基因芯片的方法，难以同时将不同基因的多个突变位点进行高通量的检测，而基因芯片成本相对高。且目前市面常见方法基因检测ALDH2一个基因，不能全面的评估乙醇代谢能力。
有必要建立一种成本低、操作简单、检测内容全面的乙醇耐受基因检测方法，以实现或者辅助实现对易饮酒人群的饮酒指导，从而减少由于饮酒过量、酗酒等引起个体的生理异常或组织器官病变，减少其对家庭以及社会和谐的不良影响。
发明内容
依据本发明的一方面，本发明提供一种检测乙醇耐受基因的方法，包括：获取受检者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或游离DNA；检测以下7个所述乙醇耐受基因的至少两个SNP位点的基因型，ALDH2基因c.1510G>A、ADH2基因c.143A>G、ADH2基因c.1108T>C、ADH3基因c.900G>A、ADH3基因c.1133G>T、CYP2E1基因c.7668T>A、CYP2E1基因c.1295G>C，其中包括，利用第一引物扩增包含所述SNP位点的DNA片段，获得扩增产物，将第二引物与所述扩增产物结合，延伸一个碱基，获得延伸产物，依据所述延伸产物与所述第二引物的分子量差异，确定所述SNP位点的碱基类型。受检者可以是人或者其它哺乳动物。上述7个SNP位点是发明人经过多次收集、筛选组合获得的与个体乙醇耐受差异有较强相关性的多态性位点。上述SNP位点是根据HGVS命名法标注该位点在参考cDNA上的位置来表示的，是为简便指代某个特定SNP位点，一个SNP位点还可以有其它表示方式，如以下会出现的的以“rs”开头的SNP位点表示方式，rs671与ALDH2基因c.1510G>A(G1510A)表示同一个位点，该方式是GenBankSNP数据库的命名方法，以rs加7位阿拉伯数字来表示一个SNP，本领域普通技术人员知道，采用其它命名方式比如以该SNP在参考gDNA上的位置来标注指代与本发明一样的SNP或SNP组合也属于本发明范围。根据数据库如SNP数据库中确定并获得特定SNP位点在基因序列上的位置信息的同时，也获得其前后序列、分布频率等。本发明利用上述7个SNP位点中的至少两个，确定各SNP位点的前后序列，依据其前后序列设计第一引物和第二引物，利用第一引物扩增待检核酸样本，能够将待检核酸样本中的包含对应SNP位点的DNA片段扩增出来，接着基于扩增出来的包含上述位点的DNA片段，利用第二引物利用单碱基延伸方法检测那些位点的碱基类型，获得那些位点的基因型。
在本发明的一个实施例中，所述第一引物包括多条第一序列，用于分别扩增包含不同目标SNP位点的DNA片段，所有所述第一序列的5’端都包含相同的标签，利于扩增产物的识别，在本发明的一个实施例中，所带的标签都为acgttggatg(SEQIDNO：22)。在本发明的一个实施例中，扩增产物为约100bp的DNA片段。
在本发明的一个实施例中，在延伸反应之前，还包括利用虾碱性磷酸酶(SAP)去除扩增反应体系中的的dNTP，防止dNTP参与下一步的单碱基延伸PCR反应。
在本发明的一个实施例中，所述第二引物包括多条第二序列，用于分别对包含不同目标SNP位点的扩增片段进行单碱基延伸，任两条所述第二序列的分子量差异不小于30Da，以使能够一起使用同时检测出各自延伸的碱基。在本发明的一个实施例中，所述第二序列的长度为17～28nt，有利于多条第二序列在同一反应体系各自进行单碱基延伸，使获得的延伸产物的3’端碱基为相应SNP位点，以使能够准确检测出位点的碱基类型。
在本发明的一个实施例中，所述第二序列的5’端包含不多于5个不能结合上所述扩增产物的核苷酸。这里，所说的5’端包括从一条序列的5’末端的首个碱基到该序列的中心碱基的部分，剩下部分可相应的称为3’端。所说的不能结合上指不能互补配对。
在本发明的一个实施例中，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸序列的分子量差异不小于30Da，利于检测出各延伸序列上所带的延伸单碱基的类型。
较佳的，本发明中的第一引物的多条第一序列之间或者第二引物的多条第二序列之间无严重的二聚物(dimer)、错配(mismatch)或发卡结构(hairpin)。在本发明的一个实施例中，提供一组包含至少4条能够能够在同一反应体系中一起使用的具体序列，例如，当所述SNP位点包含ALDH2基因c.1510G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，所述第二引物包含SEQIDNO：3；当所述SNP位点包含ADH2基因c.143A>G，所述第一引物包含SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，所述第二引物包含SEQIDNO：6；当所述SNP位点包含ADH2基因c.1108T>C，所述第一引物包含SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，所述第二引物包含SEQIDNO：9；当所述SNP位点包含ADH3基因c.900G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，所述第二引物包含SEQIDNO：12；当所述SNP位点包含ADH3基因c.1133G>T，所述第一引物包含SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，所述第二引物包含SEQIDNO：15；当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.7668T>A，所述第一引物包含SEQIDNO：16和SEQIDNO：17，所述第二引物包含SEQIDNO：18；当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.1295G>C，所述第一引物组包含SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，所述第二引物组包含SEQIDNO：21。上述各第一引物或第二引物包含的序列能够扩增或延伸包含各自所包含的SNP位点的DNA片段，而且上述任两个、任三个、任四个、任五个、任六个或全部七个第一引物都能够在同一反应体系中扩增各自的目标DNA片段，上述任两个、任三个、任四个、任五个、任六个或全部七个第二引物都能够在同一反应体系中单碱基延伸各自的目标扩增产物。SEQIDNO：1～21及其与位点的对应关系如表1所示。
表1
在本发明的一个实施例中，利用质谱确定所述SNP位点的碱基类型，例如，通过MALDI-TOF质谱检测纯化后延伸产物的分子量。所以，较佳的，在本发明的一个实施例中，在单碱基延伸之后，对所述延伸产物进行纯化，例如利用阳离子交换树脂纯化以减少阳离子对质谱检测准确度的影响。延伸产物分子量的检测过程包括：通过点样设备将纯化后的延伸产物转移到芯片的基质上，延伸产物分子和基质形成共结晶薄膜，基质在激光激发下电离，产物分子带上等量电荷，通过高压电场通道到达信号接收器。产物分子通过高压电场通道的时间和产物分子量成正比。通过比较延伸产物和延伸引物分子量的差值，根据ATCG碱基之间道尔顿分子量的差异，进行目的位点的基因分型。
在本发明的一个实施例中，所述方法还包括：当所述SNP位点的基因型满足(i)中的至少之一，判定所述受检者为乙醇高度不耐受；当所述SNP位点的基因型满足(ii)中至少之一，判定所述受检者为乙醇中度不耐受；当所述SNP位点的基因型满足(iii)中至少之一，判定所述受检者为乙醇低度不耐受；当所述SNP位点的基因型不包含任一(i)-(iii)中的任一基因型，判定所述受检者为乙醇耐受型；(i)ALDH2基因c.1510G>A的基因型为AA，ALDH2基因c.1510G>A的基因型为GA，ADH2基因c.143A>G和c.1108T>C的基因型分别为GG和CC，(ii)ADH2基因c.143A>G和c.1108T>C的基因型分别为GG和TT，ADH3基因c.900G>A和c.1133G>T的基因型分别为AA和GG，CYP2E1基因c.7668T>A的基因型为AA，CYP2E1基因c.1295G>C的基因型为CC，(iii)ADH2基因c.143A>G和c.1108T>C的基因型分别为AG和CT，ADH3基因c.900G>A的基因型为AA，ADH3基因c.1133G>T的基因型为GG，CYP2E1基因c.7668T>A的基因型为TA，CYP2E1基因c.1295G>C的基因型为GC。依此，可以辅助进一步对受检者给出判断建议。表2显示7个位点的基因型对乙醇耐受能力的影响程度。进一步的，由于一般认为乙醇耐受能力是由3个基因共同决定的，受检者的乙醇耐受能力可以根据3个基因的风险等级进行综合评估，在本发明的一个实施例中，表3显示根据一个具体评估方法划分的风险等级，根据评估得的风险等级，可进一步对不同综合风险类型个体给予相应饮酒指导，表4示意可采用的饮酒指导建议类型。
表2
表3
表4
| 检测结果 | 建议 |
| 未发现风险 | 可以饮酒 |
| 低度风险 | 适量饮酒 |
| 中度风险 | 慎重饮酒 |
| 高度风险 | 禁止饮酒 |
利用本发明这一方面的方法检测乙醇耐受基因，具有以下效果：1)成本低，能够实现将多个SNP位点在同一个反应体系中进行检测，检测成本大大降低，2)高通量，本方法在微量反应体系中进行，检测通量高，检测过程自动化程度高，每日通量可达2000例，3)实验操作简单，检测结果自动判读、准确性高，4)与测序相比，具有低成本、高通量、快速、操作简单等优势，5)检测全面，对多个基因多个位点进行检测、综合评估。
依据本发明的另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述引物对能够用以确定以下7个SNP位点中的至少2个的碱基类型：ALDH2基因c.1510G>A、ADH2基因c.143A>G、ADH2基因c.1108T>C、ADH3基因c.900G>A、ADH3基因c.1133G>T、CYP2E1基因c.7668T>A、CYP2E1基因c.1295G>C。在本发明的一些实施例中，所述引物对能够用以确定所述7个SNP位点中的至少4个、5个、6个或者全部7个的碱基类型。上述对本发明一方面的或者任一具体实施方式中的方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的试剂盒，在此不再赘述。
在本发明的一个实施例中，所述第一引物包括多条第一序列，用于分别扩增包含不同目标SNP位点的DNA片段，所有所述第一序列的5’端都包含相同的标签，利于识别扩增产物，在本发明的一个实施例中，所带的标签都为acgttggatg。
在本发明的一个实施例中，所述第二引物包括多条第二序列，用于分别对包含不同目标SNP位点的扩增片段进行单碱基延伸，任两条所述第二序列的分子量差异不小于30Da，以使能够一起使用同时检测出各自延伸的碱基。在本发明的一个实施例中，所述第二序列的长度为17～28nt，有利于多条第二序列在同一反应体系各自进行单碱基延伸，使获得的延伸产物的3’端碱基为相应SNP位点，以使该试剂盒能够准确检测出位点的碱基类型。
在本发明的一个实施例中，所述第二序列的5’端包含不多于5个不能结合上所述扩增产物的核苷酸。这里，所说的5’端包括从一条序列的5’末端的首个碱基到该序列的中心碱基的部分，剩下部分可相应的称为3’端。所说的不能结合上指不能互补配对。
在本发明的一个实施例中，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸序列的分子量差异不小于30Da，利于该试剂盒检测出各延伸序列上所带的延伸单碱基的类型。
在本发明的一个实施例中，提供一组包含至少6条能够能够在同一反应体系中一起使用的具体序列，例如，当所述SNP位点包含ALDH2基因c.1510G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，所述第二引物包含SEQIDNO：3；当所述SNP位点包含ADH2基因c.143A>G，所述第一引物包含SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，所述第二引物包含SEQIDNO：6；当所述SNP位点包含ADH2基因c.1108T>C，所述第一引物包含SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，所述第二引物包含SEQIDNO：9；当所述SNP位点包含ADH3基因c.900G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，所述第二引物包含SEQIDNO：12；当所述SNP位点包含ADH3基因c.1133G>T，所述第一引物包含SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，所述第二引物包含SEQIDNO：15；当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.7668T>A，所述第一引物包含SEQIDNO：16和SEQIDNO：17，所述第二引物包含SEQIDNO：18；当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.1295G>C，所述第一引物组包含SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，所述第二引物组包含SEQIDNO：21。上述各第一引物或第二引物包含的序列能够扩增或延伸包含各自所包含的SNP位点的DNA片段，而且上述任两个、任三个、任四个、任五个、任六个或全部七个第一引物都能够在同一反应体系中扩增各自的目标DNA片段，上述任两个、任三个、任四个、任五个、任六个或全部七个第二引物都能够在同一反应体系中单碱基延伸各自的目标扩增产物。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明的一个实施例中的对待测样本中的ADH2,c.143A>G位点的检测结果，其中，图1A是位点的检测结果为AA基因型的示意图，图1B是位点的检测结果为AG基因型的示意图；
图2是本发明的一个实施例中的对待测样本中的ADH2,c.1108C>T位点的检测结果为CC基因型的示意图；
图3是本发明的一个实施例中的对待测样本中的ADH3,c.900G>A位点的检测结果，其中，图3A是位点的检测结果为GG基因型的示意图，图3B是位点的检测结果为GA基因型的示意图；
图4是本发明的一个实施例中的对待测样本中的ADH3,c.1133A>G/T位点的检测结果，其中，图4A是位点的检测结果为AA基因型的示意图，图4B为位点的检测结果为AG基因型的示意图；
图5是本发明的一个实施例中的对待测样本中的ALDH2,c.1510G>A位点的检测结果，其中，图5A是位点检测结果为GG基因型的示意图，图5B是位点检测结果为GA基因型的示意图；
图6是本发明的一个实施例中的对待测样本中的CYP2E1,c.7668T>A位点的检测结果，其中图6A是位点检测结果为TT基因型的示意图，图6B是位点检测结果为AT基因型的示意图；
图7是本发明的一个实施例中的对待测样本中的CYP2E1,c.1295G>C位点的检测结果，其中图7A是位点检测结果为GG基因型的示意图，从图7B是位点检测结果为CG基因型的示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明检测方法和/或试剂盒进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的，比如购自Sequenom公司的飞行时间质谱试剂盒来进行质谱检测等。
实施例一引物设计
收集选择ADH2基因c.143A>G、c.1108T>C，ADH3基因c.900G>A、c.1133G>T，ALDH2基因c.1510G>A，CYP2E1基因c.7668T>A、c.1295G>C共7个与酒精耐受相关的位点。以下第一引物也称为扩增引物，第二引物也称为延伸引物，未强调第一或第二引物的引物可以为包含第一引物和/或第二引物。
针对所述7个位点进行扩增引物和延伸引物设计和优化，可在确定目标位点的上下游序列后进行引物设计，使扩增引物或者延伸引物之间无严重的dimer、mismatch和hairpin，使扩增引物长度在30个碱基左右，扩增引物在5’端具有10个碱基acgttggatg的标签序列，延伸引物的长度在17-28个碱基左右，允许延伸引物5’端1-5个碱基与模板(扩增产物)不完全匹配，延伸引物的3’末端碱基与目的检测位点紧相邻的碱基匹配。7个位点的所有延伸引物和/或所延伸产物的分子量差异不小于30道尔顿。
所述每个基因位点各自对应1条F向扩增引物、1条R向扩增和1条延伸引物。所述7个位点和引物之间的对应关系详见表1。
实施例二基因型检测
1)DNA提取
收集了20份干血片样本,使用chelex-100(树脂法)提取DNA。
2)PCR扩增
通过本步PCR扩增,获得包含目的位点的DNA片段。PCR扩增反应体系参见表5。其中，所有试剂购买自美国Sequenom公司，PCR仪为PCRSystem9700Dual384-WellSampleBlockModule.
表5
PCR反应条件为94℃,2分钟；94℃变性20秒,56退火30秒,72延伸1分钟，共扩增45个循环；最后72℃延伸5分钟。
在PCR时，使用的阳性对照为已知序列的正常的人类基因组DNA，阴性对照为无菌双蒸水。
3)SAP处理
上步扩增产物使用SAP酶(虾碱性磷酸酶)处理，去除产物中的dNTP，防止残余的dNTP参与下一步的单碱基延伸PCR反应。SAP酶反应体系见表6。所有试剂购买自美国Sequenom公司，PCR仪为PCRSystem9700Dual394-WellSampleBlockModule。
表6
| 试剂 | 浓度/反应 | V/反应 |
| H2O(HPLC级) | —— | 1.53μL |
| SAP Bufer | —— | 0.17μL |
| SAP enzyme(1.7U/μL) | 0.07U | 0.30μL |
| 体积[μL] | 2.00μL | |
| 总体积 | 7.00μL |
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，使SAP酶失活。
4)单碱基延伸PCR反应
在虾碱性磷酸酶处理后的扩增产物中加入延伸引物、ddNTP以及PCR其他反应成分，进行单碱基延伸PCR反应，反应体系如表7。所有试剂购买自美国Sequenom公司，PCR仪为PCRSystem9700Dual394-WellSampleBlockModule。
表7
| 试剂 | 浓度/反应 | V/反应 |
| H2O(HPLC级) | —— | 0.619μL |
| iPLEX Buffer Plus(10x) | 0.222 | 0.200μL |
| iPLEX Termination mix | 1x | 0.200μL |
| iPLEX Extend Primer mix | ——* | 0.940μL |
| iPLEX enzyme | 1x | 0.041μL |
| 体积[μL] | 2.00μL | |
| 总体积 | 9.00μL |
延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
5)树脂纯化
在延伸产物中加入6mg树脂，18.00ul水，垂直摇匀40min。经过本步纯化后，反应体系中的阳离子与树脂充分结合，离心后树脂沉降在反应孔底部，从而实现产物脱盐。上清可用于质谱检测。树脂型号08040，购买自美国Sequenom公司。
6)质谱检测
通过点样仪(型号MassARRAYNanodispenserRS1000，购买自美国Sequenom公司)，将树脂纯化后的延伸产物转移到芯片基质上，基质和产物形成共结晶薄膜，芯片转移至SequenomMALDI-TOF质谱仪(型号MassARRAYAnalyzerCompact，购买自美国Sequenom公司)上进行检测，确定检测位点基因型。
7)质谱检测结果
质谱检测结果如图1-7，所称的“结果与实际一致“是指质谱检测结果与sanger验证结果一致。
图1显示了使用ADH2,c.143A>G位点的延伸引物对待测样本中ADH2,c.143A>G位点的检测结果，从图1A可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6475.2检测到峰，所述峰经分析确认为A，结果与实际一致，从图1B可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6475.2和6491.2检测到峰，所述峰经分析确认为杂合AG，结果与实际一致。
图2显示了使用ADH2,c.1108C>T位点的延伸引物对待测样本ADH2,c.1108C>T位点的检测结果。从图2可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6271.1检测到峰，所述峰经分析确认为C，结果与实际一致。
图3显示了使用ADH3,c.900G>A位点的延伸引物对待测样本ADH3,c.900G>A位点的检测结果。从图3A可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5441.6检测到峰，所述峰经分析确认为G，结果与实际一致。从图3B可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5441.6和5521.5检测到峰，所述峰经分析确认为杂合GA，结果与实际一致。
图4显示了使用ADH3,c.1133A>G/T位点的延伸引物对待测样本ADH3,c.1133A>G/T位点的检测结果。从图4A可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7021.6检测到峰，所述峰经分析确认为A，结果与实际一致。从图4B可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量7021.6和7037.6检测到峰，所述峰经分析确认为杂合AG，结果与实际一致。
图5显示了使用ALDH2,c.1510G>A位点的延伸引物对待测样本ALDH2,c.1510G>A位点的检测结果。从图5A可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5631.7检测到峰，所述峰经分析确认为G，结果与实际一致。从图5B可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量5631.7和5711.6检测到峰，所述峰经分析确认为杂合GA，结果与实际一致。
图6显示了使用CYP2E1,c.7668T>A位点的延伸引物对待测样本CYP2E1,c.7668T>A位点的检测结果。从图6A可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6709.3检测到峰，所述峰经分析确认为T，结果与实际一致。从图6B可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6709.3和6653.4检测到峰，所述峰经分析确认为杂合AT，结果与实际一致。
图7显示了使用CYP2E1,c.1295G>C位点的延伸引物对待测样本CYP2E1,c.1295G>C位点的检测结果。从图7A可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6122检测到峰，所述峰经分析确认为G,结果与实际一致。从图7A可知，MALDI-TOF质谱检测在分子量6122和6082检测到峰，所述峰经分析确认为杂合CG，结果与实际一致。
8)样本乙醇耐受能力综合评估结果见表9。
9)所述样本检测结果都经sanger验证，结果和质谱检测结果完全一致。
表9
Claims (11)
1.一种检测乙醇耐受基因的方法，其特征在于，包括，
获取受检者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或游离DNA；
检测以下所述乙醇耐受基因的至少两个SNP位点的基因型，
ALDH2基因c.1510G>A、ADH2基因c.143A>G、ADH2基因c.1108T>C、ADH3基因c.900G>A、ADH3基因c.1133G>T、CYP2E1基因c.7668T>A、CYP2E1基因c.1295G>C，
其中包括，
利用第一引物扩增包含所述SNP位点的DNA片段，获得扩增产物，
将第二引物与所述扩增产物结合，延伸一个碱基，获得延伸产物，
依据所述延伸产物与所述第二引物的分子量差异，确定所述SNP位点的碱基类型。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述第一引物包括多条第一序列，所有所述第一序列的5’端都包含相同的标签；
任选的，所述标签为acgttggatg。
3.权利要求1的方法，其特征在于，所述第二引物包括多条第二序列，任两条所述第二序列的分子量差异不小于30Da。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述第二序列的长度为17～28nt。
5.权利要求3的方法，其特征在于，所述第二序列的5’端包含不多于5个不能结合上所述扩增产物的核苷酸。
6.权利要求1的方法，其特征在于，所述延伸产物的3’端碱基为所述SNP位点。
7.权利要求1的方法，其特征在于，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸序列的分子量差异不小于30Da。
8.权利要求1-7任一方法，其特征在于，当所述SNP位点包含ALDH2基因c.1510G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，所述第二引物包含SEQIDNO：3；
当所述SNP位点包含ADH2基因c.143A>G，所述第一引物包含SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，所述第二引物包含SEQIDNO：6；
当所述SNP位点包含ADH2基因c.1108T>C，所述第一引物包含SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，所述第二引物包含SEQIDNO：9；
当所述SNP位点包含ADH3基因c.900G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，所述第二引物包含SEQIDNO：12；
当所述SNP位点包含ADH3基因c.1133G>T，所述第一引物包含SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，所述第二引物包含SEQIDNO：15；
当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.7668T>A，所述第一引物包含SEQIDNO：16和SEQIDNO：17，所述第二引物包含SEQIDNO：18；
当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.1295G>C，所述第一引物组包含SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，所述第二引物组包含SEQIDNO：21。
9.权利要求1-8任一方法，其特征在于，利用质谱确定所述SNP位点的碱基类型。
10.权利要求1-9任一方法，其特征在于，还包括，
当所述SNP位点的基因型满足(i)中的至少之一，判定所述受检者为乙醇高度不耐受，
当所述SNP位点的基因型满足(ii)中至少之一，判定所述受检者为乙醇中度不耐受，
当所述SNP位点的基因型满足(iii)中至少之一，判定所述受检者为乙醇低度不耐受，
当所述SNP位点的基因型不包含任一(i)-(iii)中的任一基因型，判定所述受检者为乙醇耐受型，
(i)ALDH2基因c.1510G>A的基因型为AA，ALDH2基因c.1510G>A的基因型为GA，ADH2基因c.143A>G和c.1108T>C的基因型分别为GG和CC，
(ii)ADH2基因c.143A>G和c.1108T>C的基因型分别为GG和TT，ADH3基因c.900G>A和c.1133G>T的基因型分别为AA和GG，CYP2E1基因c.7668T>A的基因型为AA，CYP2E1基因c.1295G>C的基因型为CC，
(iii)ADH2基因c.143A>G和c.1108T>C的基因型分别为AG和CT，ADH3基因c.900G>A的基因型为AA，ADH3基因c.1133G>T的基因型为GG，CYP2E1基因c.7668T>A的基因型为TA，CYP2E1基因c.1295G>C的基因型为GC。
11.一种试剂盒，其包括引物对，所述引物对包含第一引物和第二引物，所述引物对能够用以确定以下7个SNP位点中的至少2个的碱基类型：ALDH2基因c.1510G>A、ADH2基因c.143A>G、ADH2基因c.1108T>C、ADH3基因c.900G>A、ADH3基因c.1133G>T、CYP2E1基因c.7668T>A、CYP2E1基因c.1295G>C；
任选的，所述引物对能够用以确定所述7个SNP位点中的至少4个的碱基类型；
任选的，所述引物对能够用以确定所述7个SNP位点中的至少6个的碱基类型；
任选的，所述引物对能够用以确定所述7个SNP位点的碱基类型；
任选的，所述第一引物包括多条第一序列，所有所述第一序列的5’端都包含相同的标签；
任选的，所述标签为acgttggatg；
任选的，所述第二引物包括多条第二序列，任两条所述第二序列的分子量差异不小于30Da；
任选的，所述第二序列的长度为17～28nt；
任选的，所述第二序列的5’端包含不多于5个不能结合上所述扩增产物的核苷酸；
任选的，所述延伸产物的3’端碱基为所述SNP位点；
任选的，所述延伸产物包括多条延伸序列，任两条所述延伸序列的分子量差异不小于30Da；
任选的，当所述SNP位点包含ALDH2基因c.1510G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，所述第二引物包含SEQIDNO：3，
当所述SNP位点包含ADH2基因c.143A>G，所述第一引物包含SEQIDNO：4和SEQIDNO：5，所述第二引物包含SEQIDNO：6，
当所述SNP位点包含ADH2基因c.1108T>C，所述第一引物包含SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，所述第二引物包含SEQIDNO：9，
当所述SNP位点包含ADH3基因c.900G>A，所述第一引物包含SEQIDNO：10和SEQIDNO：11，所述第二引物包含SEQIDNO：12，
当所述SNP位点包含ADH3基因c.1133G>T，所述第一引物包含SEQIDNO：13和SEQIDNO：14，所述第二引物包含SEQIDNO：15，
当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.7668T>A，所述第一引物包含SEQIDNO：16和SEQIDNO：17，所述第二引物包含SEQIDNO：18，
当所述SNP位点包含CYP2E1基因c.1295G>C，所述第一引物组包含SEQIDNO：19和SEQIDNO：20，所述第二引物组包含SEQIDNO：21。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410847860.9A CN105803052A (zh) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | 检测乙醇耐受基因的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410847860.9A CN105803052A (zh) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | 检测乙醇耐受基因的方法和试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105803052A true CN105803052A (zh) | 2016-07-27 |
Family
ID=56420447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410847860.9A Pending CN105803052A (zh) | 2014-12-31 | 2014-12-31 | 检测乙醇耐受基因的方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105803052A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109949868A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-06-28 | 深圳乐土生物科技有限公司 | 基于耐受性分析的基因等级排序方法和装置 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101435002A (zh) * | 2008-12-12 | 2009-05-20 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法 |
| CN102409089A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-04-11 | 深圳华大基因科技有限公司 | 检测dna样品中预定位点的突变的试剂盒、方法及应用 |
| CN103849681A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-06-11 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法 |
-
2014
- 2014-12-31 CN CN201410847860.9A patent/CN105803052A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101435002A (zh) * | 2008-12-12 | 2009-05-20 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法 |
| CN102409089A (zh) * | 2011-10-08 | 2012-04-11 | 深圳华大基因科技有限公司 | 检测dna样品中预定位点的突变的试剂盒、方法及应用 |
| CN103849681A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-06-11 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 一种指导硝酸甘油用药及健康饮酒的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| R´EKA T´OTH等: "Combined effect of ADH1B rs1229984,rs2066702 and ADH1C rs1693482/ rs698 alleles on alcoholism and chronic liver diseases", 《DISEASE MARKERS》 * |
| 赵丽娟: "酒精代谢相关基因多态性与酒依赖综合征的关联性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109949868A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-06-28 | 深圳乐土生物科技有限公司 | 基于耐受性分析的基因等级排序方法和装置 |
| CN109949868B (zh) * | 2019-03-01 | 2020-10-16 | 深圳乐土生物科技有限公司 | 基于耐受性分析的基因等级排序方法和装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2020000237A (ja) | まれな変異およびコピー数多型を検出するためのシステムおよび方法 | |
| CN107447013B (zh) | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 | |
| CN111004862B (zh) | 用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用 | |
| CN108004345A (zh) | 高通量检测小麦抗赤霉病基因分型的方法及其试剂盒 | |
| CN106048008A (zh) | 一种egfr基因超低频突变检测试剂盒 | |
| CN111118138A (zh) | 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法 | |
| CN106011302A (zh) | Atp7b基因突变检测引物组和试剂盒、其检测方法及应用 | |
| CN109593847B (zh) | 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法 | |
| CN114317728B (zh) | 用于检测sma中多种突变的引物组、试剂盒、方法和系统 | |
| CN101886117A (zh) | 用以鉴别目标核酸的单核苷酸多态性的检验套组 | |
| CN105803052A (zh) | 检测乙醇耐受基因的方法和试剂盒 | |
| WO2023087790A1 (zh) | 一种用于筛选总多糖含量高的黄绿卷毛菇的dna条形码 | |
| WO2023087788A1 (zh) | 一种筛选黄绿卷毛菇总可溶性蛋白含量指标的dna条形码 | |
| WO2023087783A1 (zh) | 一种用于筛选总脂肪含量高的黄绿卷毛菇的dna条形码 | |
| CN112481379B (zh) | 一种检测Ph样ALL融合基因的引物探针组合与试剂盒 | |
| CN116064775A (zh) | TRECs、KRECs和SMN1的检测试剂盒和检测方法 | |
| KR20150100468A (ko) | 알콜 대사 유전자 검측 방법 및 키트 | |
| CN108588201A (zh) | 一种结直肠癌西妥昔单抗耐药性痕量dna突变检测的方法及装置 | |
| CN105986010B (zh) | 检测叶酸代谢相关基因的方法和试剂盒 | |
| CN113652474A (zh) | 一种dmd基因外显子拷贝数变异的检测方法及其应用 | |
| US10450618B2 (en) | Method for identifying variety of hop | |
| CN110423799A (zh) | 一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法 | |
| CN111518918B (zh) | 一种筛选不同乳铁蛋白含量奶牛的方法及其使用的试剂盒 | |
| CN110272987A (zh) | 一种mthfr基因c677t位点快速分型检测试剂盒及方法 | |
| CN108977524A (zh) | 一种hla-b＊5801基因的检测方法及检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1227066 Country of ref document: HK |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160727 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1227066 Country of ref document: HK |