CN103695554A - 一种g6pd缺乏症基因检测膜条以及pcr引物 - Google Patents

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明涉及G6PD缺乏症用的基因检测膜条及相关引物，具体涉及一种G6PD缺乏症基因检测膜条以及PCR引物，共包括17个突变位点共20种突变类型进行检测，所述20种突变类型分别为：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A，所述PCR引物包括7对共14条引物，分别简写为G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R，本发明将大大降低患者漏检的频率，保护患者生命和健康，并且该检测膜条检测迅速准确，极少出现假阳性或假阴性。

Description

一种G6PD缺乏症基因检测膜条以及PCR引物
技术领域
本发明涉及医学上葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）缺乏症用的基因检测膜条及相关引物，具体涉及一种G6PD缺乏症基因检测膜条以及用于扩增待检样品基因片段的PCR引物。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）缺乏症是全球最常见的一种X连锁不完全显性遗传病，估计全球有4亿人受累。该病的高发区包括地中海沿岸、非洲、东南亚及我国的南部省区。G6PD缺乏症临床上表现为新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血和非球形细胞溶血性贫血等疾病，在儿童及婴幼儿期集中表现为蚕豆病和新生儿黄疸，往往病情较重，如不及时救治将危及患儿生命。
目前临床上常用的G6PD缺乏症检测方法包括高铁血红蛋白还原试验、G6PD活性试验、G6PD定量比值法等，这些化学试验方法过程简单、价格低廉，适宜在基层医院开展，但准确性较差，存在假阳性或假阴性，特别对隐性携带者的孕妇易漏诊，从而造成未对出生的患儿进行应有的临床指导，危及患儿的健康或生命。
在本申请之前，已有用PCR-膜条杂交技术方法检测G6PD基因突变的技术方法，其中中国授权专利，专利号为：201110069362，公开了一种方法能检测12种突变类型，分别为：A95G、G392T、G487A、A493G、C592T、G871A、C1004T、C1024T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。中国授权专利，专利号为：201210363243专利公开了一种方法能检测13种突变类型，分别为：A95G、G392A、A493G、C592T、G871A、C1004T、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。这两个专利都未包括中国人群中较为重要的突变类型，因此，以上两个专利的产品都将造成较为严重的漏检，可导致影响部分患者的生命和健康的严重后果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种G6PD缺乏症基因检测膜条，其检测范围为17个突变位点共20种突变类型（其中三个突变位点各有两种突变类型），不仅包括了现有技术中的所有突变类型，而且增加了中国人群中较为重要的突变类型。因此，应用本申请产品进行检测，将大大降低患者漏检的频率，保护患者生命和健康，并且该检测膜条检测迅速准确，极少出现假阳性或假阴性。
本发明的另一发明目的是，提供用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，该PCR引物针对17个突变位点共20种突变类型重新设计得出，完全根据中国人群突变频率较高的的突变基因型T517C、C519T、C519G、A835G、A835T、C1004A设计，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的临床指导意义。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种G6PD缺乏症的基因检测膜条，包括基底膜条以及在所述基底膜条上固定有特异性的突变探针和正常对照探针，共包括20条突变探针和13条正常对照探针，20个突变探针对应共17个突变位点，所述20条突变探针分别为：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。
其中，所述突变探针的3’端或5’端带有氨基标记，所述突变探针的具体序列为：
A95G       GGATACACGCATATTCATCA
G392T       CTCCACCTGGTGTCACAG
G871A       AGGTCAAGATGTTGAAATG
C1004T   CACCACCGTCACTTTTGCA
C1004A   CACCACCGACACTTTTGCA
C1024T      AGCCGTCGTCTTCTATGT
C1360T   GCACTTCGTGTGCAGGTGA
G1376T   GAGCTCCTTGAGGCCTGG
G1381A  GAGCTCCGTGAGACCTGG
C1387 A  CCTGGAGTATTTTCACCCC
G1388A  CCTGGCATATTTTCACCCC
G487A       GCTCCCAGCAGAAGCT
A493G       CTGGGACCGCATCAT
T517C        CTCCCGAGGGGCTTC
C519T        CTCCCAAAGGGCTTCTC
C519G  CTCCCCAAGGGCTTCTC
C592T        ATCTACTGCATCGACCA
A835G       CGCCTCCGCCAACTCA
A835T        CGCCTCCTCCAACTCA
C1311T   TGACGCCTATGAGCGC；
所述正常对照探针的具体序列为：
95N GGATACACACATATTCATCA
392N       CTCCACCTGGGGTCACAG
871N       AGGTCAAGGTGTTGAAATG
1004N     CACCACCGCCACTTTTGCA
1024N     AGCCGTCGTCCTCTATGT
1360N     GCACTTCGTGCGCAGGTGA
1376/1381N   GAGCTCCGTGAGGCCTGG
1387/1388N       CCTGGCGTATTTTCACCCC
487/493N         CAGAGGCTGGAACCG
517/519N         CTCCCGAAGGGCTTCTC
592N           ATCTACCGCATCGAC
835N         CGCCTCCACCAACTCA
1311N         TGACGCCTACGAGCG。
本发明设计了新增检测的突变探针和正常对照探针。同时，由于本发明的所有33条探针都必须能在同一个杂交条件下杂交，而现有技术的杂交条件与本发明并不一致，因此，本发明对所有的探针都进行了重新设计和优化。
其中，所述基因检测膜条由以下方法制备而成：
a.    用打印机在基底膜条上打印位点阵列；
b.   用EDAC溶液泡打印后的膜条，将浸泡后的膜条置于水平摇床上轻摇浸泡30min，以活化膜条表面的羧基基团；
c.    用探针稀释液将33条探针稀释至5μmol/L；
d.   将探针点加在膜条相应位点上，探针上的氨基与膜条表面的羧基发生交联反应；
e.    待膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH溶液泡膜条5分钟，以封闭膜条表面未反应的羧基；
f.    纯水洗涤膜条，干燥后即可。
用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，所述PCR引物的扩增产物包含17个位点20种基因型的DNA模板，所述PCR引物包括7对共14条引物，分别简写为G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R，相应的扩增产物分别包括如下位点：引物G1F和G1R扩增位点为cDNA392，G2F和G2R扩增位点为cDNA487、cDNA493、cDNA517、cDNA519、cDNA592，G3F和G3R扩增位点为cDNA95，G4F和G4R扩增位点为cDNA871、cDNA1004、cDNA1024，G5F和G5R扩增位点为cDNA1376、cDNA1381、cDNA1387、cDNA1388，G6F和G6R扩增位点为cDNA835，G7F和G7R扩增位点为cDNA1311、cDNA1360。
其中，所述引物的5’端带有生物素标记，便于对该引物进行检测。
其中，所述14条引物序列为：
G1F：5’-CCACCCCAGAGGAGAAG-3’
G1R：5’-GACACGCTCATAGAGTGG-3’
G2F：5’-CTCACTCCCCGAAGAGGGG-3’
G2R：5’-CCCCACCTCAGCACCAT-3’
G3F：5’-GTGTGAGACCCCAGAGGAAC-3’
G3R：5’-TGCACACCAGGTAGAGCCG-3’
G4F：5’-CCACAGTCATCCCTGCAC-3’
G4R：5’-TGCCTTGCTGGGCCTCG-3’
G5F：5’-CCTGCATACCTGTGGGC-3’
G5R：5’-CCCCACCCTTTCCTCAC-3’
G6F：5’-CACTAGGAAGCCTTGTTTGG-3’
G6R：5’-TCAGTGCCTCGTCACAGAT-3’
G7F：5’-GGTGGCAGGCAGTGGCATCA-3’
G7R：5’-ACAGGGAGGGAGGGCAAAGG-3’。
其中，所述PCR引物由以下方法扩增而成：
步骤1：合成14条引物，配制成25μL的PCR反应液，PCR反应液含有各成份及浓度分别为：14条引物浓度为0.2μmol/L、Taq酶为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2为1.5mmol/L、UNG酶（尿嘧啶-N- 糖基化酶）为0.01U/μL、dN（U）TP为0.2mmol/L、模板DNA约为2ng/μL。
步骤2：将步骤1配制好的反应液经过以下程序反应：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；95℃ 45秒，53℃ 45秒，72℃ 30秒，循环35次；最后72℃ 5分钟即可。
本发明为防止前次扩增的PCR产物对下次扩增的污染，在PCR反应体系中增加使用了UNG酶，扩增程序第一步增加50℃ UNG酶2分钟。相应的dNTP改为dN(U)TP，即成份为dATP、dGTP、dCTP和dUTP。
本发明的关键是引物和探针的设计，探针的设计必须符合碱基互补配对规则，Tm值估算规则，各探针间Tm值接近（对一组探针最为重要），尽可能少的强发夹结构，突变位点大致位于探针中部等等。Tm值的一致性对同一张膜条上的探针极为重要，只有这样才能在同一个条件下工作，有任何的差异都将导致结果出现非特异性信号或信号太弱。而Tm值与探针序列的组成、排列顺序、产物的二级结构、杂交时的条件（pH/离子浓度等）都有关，本发明通过无数次的实验和创造性劳动反复测试、修改才能得到一组Tm一致的探针，可共同在一张膜条上使用。而探针是与PCR产物进行杂交的，如果引物改动引起PCR产物变化，也有可能影响到杂交效果，有可能探针也需要再改动。
引物的设计需要符合碱基互补配对规则，Tm值估算规则，各引物间Tm值大致接近，GC%大致接近，尽可能少的强发夹结构，尽可能少的强二聚体，引物3’端最好不要是T，近3’端避免连续相同碱基，扩增长度在100bps-600bps之间、但相互之间应有超过30bps的差异，所要检测的突变点应避免太过靠近扩增产物的两端。这些所谓的规则还有很多，但因为序列是客观存在的，引物只能在序列的相应位置上去选一段，所以，完全符合所有规则的引物几乎是不存在的。所以，本发明的引物是经过无数次的实验和创造性的劳动，才能得出符合本发明的PCR引物。
本发明的有益效果：一、本发明的基因检测膜条包括中国人群中较为重要的突变类型，即突变探针：T517C、C519T、C519G、A835G、A835T、C1004A等，这些类型在中国人群中的突变频率超过3.4%，减少漏检的可能性，提高临床诊断的准确性和及时性。二、本发明能检测出更多的突变基因类型，准确率更高，需要克服的技术难度更大；三、本发明是基于PCR-膜条杂交技术的基因检测方法，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带者等优点。
本发明的另一有益效果：根据待检测的突变基因类型重新设计了14条引物，即在现有技术的基础上新增了4条引物，分别为G6F、G6R、G7F和G7R，由于本发明的所有14条引物都必须能在同一个反应条件下扩增，与现有技术中的扩增环境完全不同，因此，本专利对其它的10条引物也进行了重新设计，技术难度高，得出的引物特异性能好。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是本发明实施例的未检出G6PD基因突变样品结果示例，基因型：N/N；
图2是本发明实施例的检出G6PD基因突变杂合子样品结果示例，基因型：1376M/N；
图3是本发明实施例的检出G6PD基因突变纯合子样品结果示例，基因型：1388M/1388M。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
一种G6PD缺乏症的基因检测膜条，包括基底膜条以及在所述基底膜条上固定有特异性的突变探针和正常对照探针，共包括17个突变位点共20条突变探针即突变类型进行检测，所述20条突变探针分别为：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。
所述突变探针的3’端或5’端带有氨基标记，所述突变探针的具体序列为：
A95G        GGATACACGCATATTCATCA
G392T       CTCCACCTGGTGTCACAG
G871A       AGGTCAAGATGTTGAAATG
C1004T    CACCACCGTCACTTTTGCA
C1004A    CACCACCGACACTTTTGCA
C1024T      AGCCGTCGTCTTCTATGT
C1360T    GCACTTCGTGTGCAGGTGA
G1376T    GAGCTCCTTGAGGCCTGG
G1381A    GAGCTCCGTGAGACCTGG
C1387 A    CCTGGAGTATTTTCACCCC
G1388A    CCTGGCATATTTTCACCCC
G487A       GCTCCCAGCAGAAGCT
A493G       CTGGGACCGCATCAT
T517C        CTCCCGAGGGGCTTC
C519T        CTCCCAAAGGGCTTCTC
C519G     CTCCCCAAGGGCTTCTC
C592T        ATCTACTGCATCGACCA
A835G       CGCCTCCGCCAACTCA
A835T        CGCCTCCTCCAACTCA
C1311T   TGACGCCTATGAGCGC；
所述正常对照探针的具体序列为：
95N GGATACACACATATTCATCA
392N       CTCCACCTGGGGTCACAG
871N       AGGTCAAGGTGTTGAAATG
1004N     CACCACCGCCACTTTTGCA
1024N     AGCCGTCGTCCTCTATGT
1360N     GCACTTCGTGCGCAGGTGA
1376/1381N    GAGCTCCGTGAGGCCTGG
1387/1388N       CCTGGCGTATTTTCACCCC
487/493N         CAGAGGCTGGAACCG
517/519N         CTCCCGAAGGGCTTCTC
592N           ATCTACCGCATCGAC
835N          CGCCTCCACCAACTCA
1311N         TGACGCCTACGAGCG。
本发明设计了新增检测的突变探针和正常对照探针。同时，由于本发明的所有33条探针都必须能在同一个杂交条件下杂交，而现有技术的杂交条件与本发明并不一致，因此，本发明对所有的探针都进行了重新设计和优化。
所述基因检测膜条由以下方法制备而成：
a.    用打印机在基底膜条上打印位点阵列；
b.   用EDAC溶液泡打印后的膜条，将浸泡后的膜条置于水平摇床上轻摇浸泡30min，以活化膜条表面的羧基基团；
c.    用探针稀释液将33条探针稀释至5μmol/L；
d.   将探针点加在膜条相应位点上，探针上的氨基与膜条表面的羧基发生交联反应；
e.    待膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH溶液（氢氧化钠）泡膜条5分钟，以封闭膜条表面未反应的羧基；
f.    纯水洗涤膜条，干燥后即可。
用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，所述PCR引物的扩增产物包含17个位点20种基因型的DNA模板，所述PCR引物包括7对共14条引物，分别简写为G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R，相应的扩增产物分别包括如下位点：引物G1F和G1R扩增位点为cDNA392，G2F和G2R扩增位点为cDNA487、cDNA493、cDNA517、cDNA519、cDNA592，G3F和G3R扩增位点为cDNA95，G4F和G4R扩增位点为cDNA871、cDNA1004、cDNA1024，G5F和G5R扩增位点为cDNA1376、cDNA1381、cDNA1387、cDNA1388，G6F和G6R扩增位点为cDNA835，G7F和G7R扩增位点为cDNA1311、cDNA1360。
所述引物的5’端带有生物素标记，具体序列为：
G6F：5’-CACTAGGAAGCCTTGTTTGG-3’
G6R：5’-TCAGTGCCTCGTCACAGAT-3’
G7F：5’-GGTGGCAGGCAGTGGCATCA-3’
G7R：5’-ACAGGGAGGGAGGGCAAAGG-3’。
其中，所述14条引物序列为：
G1F：5’-CCACCCCAGAGGAGAAG-3’
G1R：5’-GACACGCTCATAGAGTGG-3’
G2F：5’-CTCACTCCCCGAAGAGGGG-3’
G2R：5’-CCCCACCTCAGCACCAT-3’
G3F：5’-GTGTGAGACCCCAGAGGAAC-3’
G3R：5’-TGCACACCAGGTAGAGCCG-3’
G4F：5’-CCACAGTCATCCCTGCAC-3’
G4R：5’-TGCCTTGCTGGGCCTCG-3’
G5F：5’-CCTGCATACCTGTGGGC-3’
G5R：5’-CCCCACCCTTTCCTCAC-3’
G6F：5’-CACTAGGAAGCCTTGTTTGG-3’
G6R：5’-TCAGTGCCTCGTCACAGAT-3’
G7F：5’-GGTGGCAGGCAGTGGCATCA-3’
G7R：5’-ACAGGGAGGGAGGGCAAAGG-3’。
33条探针序列为：表1
本发明的技术方案还包括杂交膜条的制备方法，即固定探针的膜条表面带有羧基集团，能与探针中的氨基发生反应。将探针用探针稀释液稀释后，点加于膜条表面相应的位置上，构成检测阵列。
本发明的技术方案还包括PCR产物与膜条的杂交，最终经显色反应，通过肉眼判断，以各位点显色信号的有无来判断待检样品是还存在基因突变，以及是突变纯合子还是杂合子。
1、杂交膜条的制备
a.       用打印机在基底膜条上打印位点阵列；
b.       用EDAC （N-乙基-N’-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺）溶液浸泡膜条：具体操作为将膜条置于水平摇床上轻摇用EDAC浸泡30min，以活化膜条表面的羧基基团；
c.       用探针稀释液分别将33条探针稀释至5μmol/L；
d.       将探针点加在膜条相应位点上，探针上的氨基与膜条表面的羧基发生交联反应；
e.       待膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH溶液泡膜5分钟，以封闭膜条表面未反应的羧基；
f.        纯水洗涤膜条，干燥后备用。
2、PCR（聚合酶链式反应）扩增
合成14条引物，配制成25μL/份的PCR反应液，各成份及浓度分别为：14条引物浓度为0.2μmol/L、Taq酶为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2为1.5mmol/L、UNG酶（尿嘧啶-N- 糖基化酶）为0.01U/μL、dN（U）TP为0.2mmol/L、模板DNA约为2ng/μL。
PCR反应程序为：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；95℃ 45秒，53℃ 45秒，72℃ 30秒，循环35次；最后72℃ 5分钟即可。
3、杂交及显色
a. 杂交
将PCR产物与膜条加入到12mL左右的杂交液（2×SSC、0.1%SDS，pH7.4）中，在杂交箱中45℃杂交4小时以上。
b. 洗膜
将膜条转移到预热至45℃的洗液（0.5×SSC、0.1%SDS，pH7.4）中，于42℃洗涤15分钟。SSC缓冲液，主要由氯化钠、柠檬酸钠组成，主要用于核酸等杂交。SDS的化学名称为十二烷基硫酸钠，为表面活性剂。
c. POD（链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物）孵育
将膜条放入新鲜配制的0.25U/mL的POD溶液中，室温孵育30分钟，洗去POD。
d. 显色
现配显色液（0.1mol/L柠檬酸钠、0.1mg/mL TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）
、0.0015% H2O2），将膜条放入显色液中避光显色约15分钟。
4、           结果判断
4.1膜条上的探针阵列如下：
517N 1376N 1388N 487N 95N 392N 871N 592N
835N 1376M 1388M 487M 95M 392M 871M 1004N
1311N 1381M 1387M 493M 592M 1004M 1024M 1024N
1360N 517M 519M 835M 1311M 1360M    
注：①、“N”代表正常对照探针，共13个。其中1376N为1376位点和1381位点的共同对照，即为1376/1381N；同样的，1388N为1388位点和1387位点的共同对照，即为1387/1388N；517N为517位点和519位点的共同对照，即为517/519N；487N为487位点和493位点的共同对照，即为487/493N。
②、其它17个位点为突变探针，其中1004M位点包含两种突变类型，即对应两个突变探针，分别为C1004T和C1004A；835M位点包含两种突变类型，，即对应两个突变探针，分别为A835G和A835T；519M位点包含两种突变类型，，即对应两个突变探针，分别为C519T和C519G；其余突变位点对应的突变探针见表1。
4.2结果示例图，如图1-3。
    本发明通过研究确定在中国人群中较常发生突变的基因型，重新设计引物，确定了共20条突变探针即20种突变类型，通过本发明的技术手段得到可检测G6PD缺乏症突变探针的膜条，检测准确率更高，时效性更强，降低漏检的风险，对临床诊断提高更准确的指导意义，进一步保证患者的生命及健康安全。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种G6PD缺乏症的基因检测膜条，包括基底膜条以及在所述基底膜条上固定有特异性的突变探针和正常对照探针，其特征在于：共包括20条突变探针型和13条正常对照探针，所述20种突变探针分别为：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。
2.根据权利要求1所述的一种G6PD缺乏症的基因检测膜条，其特征在于：所述突变探针和正常对照探针的3’端或5’端带有氨基标记，所述突变探针的具体序列为：
A95G     GGATACACGCATATTCATCA
G392T    CTCCACCTGGTGTCACAG
G871A     AGGTCAAGATGTTGAAATG
C1004T   CACCACCGTCACTTTTGCA
C1004A CACCACCGACACTTTTGCA
C1024T    AGCCGTCGTCTTCTATGT
C1360T   GCACTTCGTGTGCAGGTGA
G1376T GAGCTCCTTGAGGCCTGG
G1381A GAGCTCCGTGAGACCTGG
C1387 A    CCTGGAGTATTTTCACCCC
G1388A CCTGGCATATTTTCACCCC
G487A     GCTCCCAGCAGAAGCT
A493G     CTGGGACCGCATCAT
T517C     CTCCCGAGGGGCTTC
C519T     CTCCCAAAGGGCTTCTC
C519G      CTCCCCAAGGGCTTCTC
C592T     ATCTACTGCATCGACCA
A835G     CGCCTCCGCCAACTCA
A835T     CGCCTCCTCCAACTCA
C1311T   TGACGCCTATGAGCGC；
所述正常对照探针的具体序列为：
95N GGATACACACATATTCATCA
392N   CTCCACCTGGGGTCACAG
871N   AGGTCAAGGTGTTGAAATG
1004N  CACCACCGCCACTTTTGCA
1024N  AGCCGTCGTCCTCTATGT
1360N  GCACTTCGTGCGCAGGTGA
1376/1381N   GAGCTCCGTGAGGCCTGG
1387/1388N    CCTGGCGTATTTTCACCCC
487/493N     CAGAGGCTGGAACCG
517/519N     CTCCCGAAGGGCTTCTC
592N       ATCTACCGCATCGAC
835N     CGCCTCCACCAACTCA
1311N      TGACGCCTACGAGCG。
3.根据权利要求1所述的一种G6PD缺乏症的基因检测膜条，其特征在于：所述基因检测膜条由以下方法制备而成：
a.  用打印机在基底膜条上打印位点阵列；
b.  用EDAC溶液浸泡打印后的膜条：将浸泡后的膜条置于水平摇床上轻摇浸泡30min，以活化膜条表面的羧基基团；
c.  分别用探针稀释液将33条探针稀释至5μmol/L；
d.  将探针点加在膜条相应位点上，探针上的氨基与膜条表面的羧基发生交联反应；
e.  待膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH溶液浸泡膜条5分钟，以封闭膜条表面未反应的羧基；
f.  纯水洗涤膜条，干燥后即可。
4.根据权利要求1所述的一种G6PD缺乏症的基因检测膜条，其特征在于：所述检测膜条上的探针阵列具体从左至右包括4行8列依次排列，共30个探针位点，第一行的探针排列为：517N、1376N、1388N、487N、95N、392N、871N、92N；第二行的探针排列为：835N、1376M、1388M、487M、95M、392M、871M、1004N；第三行的探针排列为：1311N、1381M、1387M、493M、592M、1004M、1024M、1024N；第四行的探针排列为：1360N、517M、519M、835M、1311M、360M。
5.用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，其特征在于：所述PCR引物的扩增产物含有权利要求1所述的17个突变位点共20种突变类型，所述PCR引物包括7对共14条引物，分别简写为G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R，相应的扩增产物分别包括如下位点：引物G1F和G1R扩增位点为cDNA392，G2F和G2R扩增位点为cDNA487、cDNA493、cDNA517、cDNA519、cDNA592，G3F和G3R扩增位点为cDNA95，G4F和G4R扩增位点为cDNA871、cDNA1004、cDNA1024，G5F和G5R扩增位点为cDNA1376、cDNA1381、cDNA1387、cDNA1388，G6F和G6R扩增位点为cDNA835，G7F和G7R扩增位点为cDNA1311、cDNA1360。
6.根据权利要求5所述的PCR引物，其特征在于：所述引物的5’端带有生物素标记。
7.根据权利要求6所述的PCR引物，其特征在于：所述14条引物序列为：
G1F：5’-CCACCCCAGAGGAGAAG-3’
G1R：5’-GACACGCTCATAGAGTGG-3’
G2F：5’-CTCACTCCCCGAAGAGGGG-3’
G2R：5’-CCCCACCTCAGCACCAT-3’
G3F：5’-GTGTGAGACCCCAGAGGAAC-3’
G3R：5’-TGCACACCAGGTAGAGCCG-3’
G4F：5’-CCACAGTCATCCCTGCAC-3’
G4R：5’-TGCCTTGCTGGGCCTCG-3’
G5F：5’-CCTGCATACCTGTGGGC-3’
G5R：5’-CCCCACCCTTTCCTCAC-3’
G6F：5’-CACTAGGAAGCCTTGTTTGG-3’
G6R：5’-TCAGTGCCTCGTCACAGAT-3’
G7F：5’-GGTGGCAGGCAGTGGCATCA-3’
G7R：5’-ACAGGGAGGGAGGGCAAAGG-3’。
8.根据权利要求6所述的PCR引物，其特征在于：所述PCR引物由以下方法扩增而成：
步骤1：合成14条引物，配制成25μL的PCR反应液，PCR反应液含有各成份及浓度分别为：14条引物浓度为0.2μmol/L、Taq酶为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2为1.5mmol/L、UNG酶（尿嘧啶-N- 糖基化酶）为0.01U/μL、dN（U）TP为0.2mmol/L、模板DNA约为2ng/μL；
步骤2：将步骤1配制好的反应液经过以下程序反应：50℃ 2分钟；95℃ 10分钟；95℃ 45秒，53℃ 45秒，72℃ 30秒，循环35次；最后72℃ 5分钟即可。
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