CN115505639A - 一种地中海贫血基因检测质控品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地中海贫血基因检测质控品及其制备方法。本方法通过提取地中海贫血血液样品的白细胞，获取地中海贫血某一亚型细胞的全部基因序列，通过EB病毒转染白细胞，利用EB病毒中的数条潜伏基因改变白细胞的生命周期，并提高端粒酶活性，然后对转染后白细胞进行培养、传代选择使得白细胞永生化，并确定永生化细胞分型，制备得到地中海贫血基因检测质控品。本方法操作简单，制备得到的质控品包含地中海贫血的全长遗传序列细胞系，易于扩大培养，成本较低且更接近临床样本；由于包含地中海贫血的全长遗传序列，因此其适用范围广、可兼容多方法和技术平台；比质粒质控品稳定性高、偏差小，污染小，无生物传染性，便于推广形成统一标准。

Description

一种地中海贫血基因检测质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，更具体地，涉及一种地中海贫血基因检测质控品及其制备方法。

背景技术

随着基因检测技术的发展，市面上出现了大量的基因检测产品，基因检测产品需要质控品对产品性能和效果进行验证，同时室间质量评价、实验室基因检测问题识别、新的基因检测方法的有效性和可比性、新开实验室检测项目的性能确认、室内质量控制等均需要质控品作为标准来衡量，因此制备基因检测质控品尤其重要。

地中海贫血（Thalassemia）简称“地贫”，又称珠蛋白生成障碍性贫血，其发病原因是珠蛋白基因缺陷或者点突变导致血红蛋白中的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，使得血红蛋白的组分和含量发生改变，影响到红细胞的携氧能力，从而导致不同程度的溶血，使患者发生贫血，一般以常染色体隐形遗传的方式遗传，其中以 α、β 地中海贫血最多见。据WHO 估计，世界人口约有4.5%的人群携带有地中海贫血基因，在我国南方省份为高发地区。

目前，市面上的地中海贫血基因检测质控品种类繁多，一方面以地中海贫血的临床样本作为质控品，虽然临床样品质控品的准确性较高，但临床样品有限且不能稳定生产，不易获得和产业化，价格居高不下；另一方面，在明确地中海贫血相关的突变位点或者缺失位点的前提下，以质粒或基因片段进行制备的质控品，如专利申请《一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用》；但不同厂家会根据自身产品的检测位点设计质控品，没有形成统一标准，并且质粒可插入的DNA片段的长度有限，过长的基因片段无法插入，这样导致不同基因检测厂家生产的质控品往往仅应用到某一产品，应用范围窄，不同厂家质控品之间不通用，质粒结构比较简单，不接近临床样本，存在检测偏差，另外质粒质控品的稳定性比较差，会因为放置过久或者反复冻融而降解，不易长时间保存，且具有生物传染性。

因此克服现有技术质粒样品和临床样品的限制，开发一款可以兼容多方法和多技术平台，且最接近临床样品的稳定可比量值单位的参考品，对整个地中海贫血基因检测行业都具有重要意义。

现有技术中出现了对于地中海贫血质控品细胞株的构建，如专利申请《HBB基因CD17突变细胞及其制备方法与应用》，通过基因剪切技术来构建β-地中海贫血细胞株的方法，通过一系列的基因剪切、引物设计等较为复杂的步骤，最终实现细胞株呈现β地中海病人的细胞学特性，但经过编辑后构建得到的细胞株与临床样品存在明显差异。专利申请《CRISPR/Cas9系统及其在构建α、β和α&β地中海贫血模型猪细胞系中的应用》针对猪HBA和HBB基因各设计了一对靶点序列，利用靶点序列构建了三种表达载体；将表达载体分别转入猪成纤维细胞，筛选得到α、β和α&β地中海贫血模型猪细胞系。同样其利用了非同源（猪成纤维细胞）的细胞系，且是经过靶点序列构建得到的，其同样和临床样品存在差异。专利申请《一种α地中海贫血基因检测遗传参考物质及其制备方法》通过将贫血基因插入酵母细胞，来制备参考物质，同样存在基因片段短、与临床细胞有较大差异的缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种操作简单、成本较低的制备地中海贫血基因检测质控品的方法，所得质控品接近临床样本且适用范围广、可兼容多方法和技术平台，比质粒质控品稳定性高、偏差小，污染小，无生物传染性，便于推广形成统一标准。

本发明的目的是提供一种地中海贫血基因检测质控品的制备方法。

本发明的另一目的是提供该方法制备得到的永生化细胞质控品及其应用。

本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案：

一种地中海贫血基因检测质控品的制备方法，包括如下步骤：

S1.分离提取地中海贫血血液样本中的白细胞（优选地白细胞为淋巴细胞，更优选为B淋巴细胞）；

S2.制备EB病毒液；

S3.利用步骤S2的EB病毒转染步骤S1的白细胞，然后传代培养，产生永生化细胞株；

S4.分离永生化细胞，并确定永生化细胞的地中海贫血基因分型，即得到相应的地中海贫血基因检测质控品。

本方案通过提取相应的地中海贫血的血液样品，获取地中海贫血某一亚型细胞的全部基因序列，通过EB病毒转染白细胞，利用EB病毒中的数条潜伏基因改变白细胞的生命周期，并提高端粒酶活性，并对转染白细胞培养、传代选择使得白细胞永生化，并确定永生化细胞分型，制备得到地中海贫血基因检测质控品。

进一步的，步骤S1中所述地中海贫血血液样本的突变类型选自：缺失型α-地中海贫血、突变型α-地中海贫血、突变型β-地中海贫血中的一种。

更具体地，所述缺失型α-地中海贫血包括--SEA、-α3.7和-α4.2；

所述突变型α-地中海贫血包括 CS、QS、WS；

所述突变型β-地中海贫血包括β-地中海贫血15个突变位点，分别为：IVS-II-654(C-T)、-28(A-G)、-29(A-G)、CD14/15（+G）、CD17(A-T)、CD27/28（+C）、βE(G-A)、CD41/42 (-TTCT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T, G-A)、IVS-I-5(G-C)、Cap(-AAAC)、Int（T-G）、CD31(-C)。

另外，作为优选的方案，步骤S1中分离提取地中海贫血血液样本中的白细胞的分离提取方法可选择：通过离心将白细胞与血液中其他物质分离。

更进一步的，所述分离提取方法为：地中海贫血血液使用RPMI1640基础培养基稀释后，加入分离液中，进行离心，使血液分层后去除上层血清层，得到的白膜层即为白细胞。

优选地，所述分离液为Solarbio的人外周血淋巴细胞分离液（货号：P8610）。

优选地，所述白膜层的离心提取中降速过程中不制动。

更优选地，离心的升速加速度为中速档位（即从0转速到上述离心设定转速加速时间在5-15秒），减速加速度为最低速档位（即无制动从设定速度降至0）。

优选地，所述离心的参数为1500-1800转/分离心15-25分钟（优选1730转/分离心20分钟，相对离心力为510g-570g）。

进一步地，所得白膜层使用PBS清洗即得白细胞。具体清洗的方法：所得白膜层中加入PBS，吹打清洗细胞，并800-1500转/分离心8-15分钟（优选1000转/分离心10分钟），去除上层PBS层；重复清洗3次。

另外，作为可选择的优选方案，所述步骤S2中制备EB病毒液的方法为：

（1）用含20%血清的1640完全培养基复苏B95-8细胞，37℃、5% CO₂条件培养，然后换含10%FBS的1640完全培养基传代培养，至足够实验量时，用RPMI-1640基础培养基调整细胞浓度2×10⁶个/ml；

（2）然后饥饿培养7-10天；

（3）饥饿处理后进行冷冻结冰（优选-70℃冷冻至完全结冰），再解冻至完全溶解（优选37℃解冻至完全溶解），反复冻融3次；

（4）2500转/分（相对离心力1230g）离心15分钟，取上清液，过滤（优选可选用0.22um针头过滤器过滤）即得到EB病毒液。

在本发明上述方法中，优选地，步骤S3培养所使用的容器大小按照如下标准计算：以T25培养瓶为例，T25培养瓶装入2ml进行培养。

更优选地，步骤S3的具体方法为：

a. 将EB病毒液与白细胞混合后于36-38℃水浴1-3小时；

b. 加入含有免疫抑制剂的培养基，于36-38℃、5% CO₂条件下培养15-20天。

其中优选地，步骤a中，EB病毒液与白细胞的比例为：每5ml全血当量白细胞加入0.5-2ml EB病毒液。

更优选地，步骤a中，EB病毒液与白细胞的比例为：每5ml全血当量白细胞加入1mlEB病毒液。

优选地，步骤a中水浴条件：于37℃水浴2小时。

更进一步地，步骤a中将EB病毒液与白细胞混合后进行吹打重悬后水浴，其条件保持37℃水浴2小时，期间每20分钟晃动使细胞悬起。

优选地，步骤b中培养基为每5ml全血当量加2ml含20%胎牛血清的1640完全培养基。

优选地，步骤b中加入培养基的量为EB病毒液体积的3倍。

优选地，步骤b中培养条件：于37℃、5% CO₂条件下培养15-20天。

更优选地，步骤b中培养条件：于37℃、5% CO₂条件下培养不低于16天，优选为16-20天。

优选地，所述免疫抑制剂为环孢霉素A。

优选地，所述免疫抑制剂的终浓度低于2ug/ml。

更优选地，所述免疫抑制剂的终浓度为1ug/ml。

优选地，步骤b中培养15-20天期间，不断更换或补充相同的含有免疫抑制剂的培养基。

优选地，更换或补充培养基的标准为：当培养第二天时，补充培养基和免疫抑制剂2ml。

优选地，更换或补充培养基的标准为：当培养第四天时，补充培养基和免疫抑制剂4ml。

优选地，更换或补充培养基的标准为：当培养基变黄时，补充培养基和免疫抑制剂2ml。

优选地，更换或补充培养基的标准为：当培养基体积达到上限，培养基颜色变橙色时，更换培养基并补充免疫抑制剂4ml。

转染后的白细胞分裂周期缩短，黏附性增加，但早期还无法有效将其与其他细胞分离，未成功转染的细胞无法适应体外环境，生长速度慢，在细胞株培养16天，其它未永生化的细胞将开始凋亡坏死，形成凋亡小体和其他产物，该类产物会对存活细胞产生毒性，影响细胞生长，通过重新分离可有效除去，获得的细胞株即为所需的永生化的白细胞。

EB病毒感染白细胞后，将主要表达六种潜伏基因，分别有EBNA1、EBNA2、EBNA-LP、EBNA3A、EBNA3C和潜伏膜蛋白LMP1，其中EBNA1和EBNA2是诱导B淋巴细胞永生化的必须元件，EBNA1可在潜伏期和裂解周期中表达，维持病毒的复制和分离，而EBNA2可以在病毒感染后首先表达，上调病毒基因和宿主基因的表达，由于EB病毒感染后还表达潜伏膜蛋白LMP1，会引起T淋巴细胞的细胞免疫，因而需要使用相应的免疫抑制剂。

另外，本发明上述方法中，步骤S4中分离永生化细胞的时机可优选为：步骤S3培养至可见较多细胞团，培养基背景变浑浊，见背景有大量不活动黑色小颗粒，贴壁且不易晃起时，开始分离细胞。具体分离方法如下：

S41.培养的细胞吹打重悬，细胞悬液以1000转/分离心5分钟，去上清至剩余3-5ml培养基；

S42.吹打重悬细胞，细胞悬液加入分离液（Solarbio的人外周血淋巴细胞分离液），使两者分层，然后1500-1800转/分离心8-15分钟（优选1730转/分离心10分钟）；优选地离心升速加速度为中速档位，所述离心的升速加速度为中速档位（即从0转速到上述离心设定转速加速时间在5-15秒），减速加速度为最低速档位（即无制动从设定速度降至0）。

S43.离心结束后，取白膜层，使用PBS清洗；优选清洗的方法：所得白膜层中加入PBS，吹打清洗细胞，并800-1500转/分离心4-10分钟（优选1000转/分离心5分钟）；优选清洗2次；

S44.用含20%胎牛血清的1640完全培养基重悬细胞，次日可见部分细胞聚集成团，所得细胞即为永生化细胞株；置于37℃、5% CO₂条件下培养数天，细胞团持续增大；

S45.保存：所得永生化细胞换新鲜培养基，冻存。优选冻存条件：置于4℃预冷的程序降温盒中，置于-70摄氏度超低温冰箱中过夜，第二天转移至液氮中永久保存。

另外，步骤S4中确定永生化细胞分型的方式为：对已知的分型采用PCR结合导流杂交法对地中海分型进行检测确定，对未确定的分型用一代测序法确定地中海贫血分型。

综上，本发明方法制备得到的永生化细胞质控品也应该在本方案的保护范围之内。

进一步的，以上述的质控品制备得到的质控品、参考品或标准物质也应该在本方案的保护范围之内。

本方案还请求保护以上述的质控品、参考品或标准物质在制备试剂盒阳性参考品方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果体现在：

本发明提供了一种地中海贫血基因检测质控品的制备方法，该方法操作简单，无需进行探针或基因设计；制备得到的质控品包含地中海贫血的全长遗传序列细胞系，易于扩大培养，成本较低且更接近临床样本；由于包含地中海贫血的全长遗传序列，因此其适用范围广、可以兼容多方法和多技术平台；相比质粒质控品其稳定性高、偏差小，污染小，无生物传染性，是最接近临床样品的稳定可比量值单位的参考品，便于推广形成统一标准，对地中海贫血基因检测行业都具有重要意义。

附图说明

图1为实施例2细胞培养显微图（1-23天）；图中标注：a，b，c，d，e，f，g，h，i分别表示细胞培养的第1天，第2天，第4天，第7天，第8天，第17天，第19天，第20天，第23天。

图2为实施例2细胞培养显微图（26-40天）；图中标注：j，k，l，m，n，o，p，q分别表示细胞培养的第26天，第27天，第28天，第33天，第35天，第37天，第38天，第40天。

图3为实施例2细胞杂交鉴定结果图；图中标注：a，b表示两次测定的结果。

图4为实施例3离心制动降速和不制动的白膜层形成图；图中标注：a表示5档制动降速，b无制动降速，W表示白膜层。

图5为实施例4不同培养容器的细胞培养显微图；图中标注：a表示第14天T25瓶内细胞生长情况，b表示第20天T25瓶内细胞生长情况，C表示第14天孔板4倍镜下细胞生长情况，d表示第14天孔板10倍镜下细胞生长情况，e表示第20天孔板细胞生长情况。

图6为实施例5本质控品产品对不同平台适用性测试结果图；图中标注：a、b、g为使用凯普（PCR+导流杂交法）试剂盒检测的结果，c、d、h为使用凯普（PCR+膜杂交法）试剂盒检测的结果，e、f、i为致善生物（熔解曲线法）缺失型a-地中海贫血基因检测试剂盒检测的结果。其中a、c、e为磁珠法的凯普提取试剂盒提取的DNA溶液，b、d、f为天根离心柱法的核酸提取试剂盒提取的DNA溶液；g、h、i为野生型样本溶液。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中用到的实验试剂、材料、仪器包括：

试剂：Gibco成品RPMI-1640基础培养基、Gibco胎牛血清（FBS）、成品瓶装PBS缓冲液、Solarbio人外周血淋巴细胞分离液、无水乙醇（分析纯）、无菌注射用水、环孢霉素A粉末（BBI）、凯普细胞保存液、细胞级DMSO。

材料：一次性血清移液管、15ml灭菌螺盖离心管、50ml灭菌螺盖离心管、0.22um针头过滤器，10ml一次性医用注射器、封口蜡纸、细胞冻存管、T25培养瓶。

仪器：精密天平、生物安全柜、电动移液器、血球计数板、二氧化碳培养箱、-80摄氏度冰箱、-20摄氏度冰箱、4摄氏度冰箱。

实验材料准备：

（1）实验前消毒与灭菌准备：

将需要操作的试剂及耗材用70%乙醇喷洒擦拭，置于生物安全柜中紫外照射30分钟。打开生物安全柜，避光通风5分钟，待气流稳定后，打开照明，用70%乙醇棉球擦拭台面工作区，点燃酒精灯。揭去试剂瓶口的封口蜡纸，用70%乙醇棉球擦拭试剂瓶瓶口，过火。

（2）配制细胞培养基及免疫抑制剂环孢霉素A工作液：

配制细胞培养基：取50ml离心管若干，用一次性血清移液管加入5ml FBS，加入RPMI-1640基础培养基补充至50ml，制备1640完全培养基（10%血清）；取50ml离心管若干，用一次性血清移液管加入10ml FBS，加入RPMI-1640基础培养基补充至50ml，制备1640完全培养基（20%血清）；取50ml离心管若干，分装成品1640基础培养基；取50ml离心管，加入15mlFBS，加入30ml1640基础培养基，加入5ml DMSO，上下颠倒混匀，制备1640冻存培养基，各培养基于4℃储存备用，2个月内使用。

配制环孢霉素A工作液：先用无水乙醇:灭菌注射用水=7:3混合，用0.22um针头过滤器过滤，分装于15ml离心管中备用。将15ml离心管精密称取环孢霉素A粉末0.2000g，加入上述配置的无菌70%乙醇1000ul，漩涡震荡溶解，获得环孢霉素A母液（200mg/ml）。再将移液枪取50ul环孢霉素A母液，加入于4950ul上述无菌70%乙醇中，漩涡震荡混匀，获得环孢霉素A工作液（2ug/ul），用0.22um针头过滤器过滤，分装于细胞冻存管，每管1ml，置于-20摄氏度保存备用。

实施例1 本发明制备地中海贫血基因检测质控品的方法

一种地中海贫血基因检测质控品的制备方法，包括如下步骤：

S1.分离提取地中海贫血血液样本中的B淋巴细胞；

地中海贫血血液样本的突变类型选自：缺失型α-地中海贫血--SEA，根据需要，也可以为突变型α-地中海贫血CS或突变型β-地中海贫血IVS-II-654(C-T)；

对上述地中海贫血血液进行离心，离心参数为1730转/分离心20分钟；将B淋巴细胞与血液中其他物质分离，血液分层后去除上层血清层，除上层血清层后，用PBS清洗，并1000转/分离心10分钟来去除上层PBS层，重复清洗3次；得到的白膜层即为B淋巴细胞。

S2.制备EB病毒液；

对培养基中的浓度为2×10⁶个/ml的B95-8细胞用RPMI-1640基础培养基培养7-10天来进行饥饿处理，对包含饥饿处理后的B95-8细胞的培养基进行冻融破裂，即将饥饿结束的B95-8细胞及培养基置于-70℃冷冻至完全结冰，再置于37℃解冻至完全溶解，反复冻融3次；经2500转每分离心15分钟后，取上层清液用0.22um过滤，得到EB病毒。过滤收集冻融破裂后的培养基，得到EB病毒液。

S3. EB病毒转染B淋巴细胞；

转染B淋巴细胞的方法为：将EB病毒液与步骤S1中的B淋巴细胞混合，EB病毒量为每5ml全血当量B淋巴细胞加入1ml EB病毒；得到EB病毒和B淋巴细胞混合体系；将混合体系中的细胞吹打重悬，吹打悬浮条件为保持37℃水浴2小时，每20分钟使B淋巴细胞悬起一次；然后加入3倍EB病毒体积的完全培养基进行稀释，并加入免疫抑制剂。

S4.转染后的B淋巴细胞经培养、传代选择出永生化细胞，对已知的分型采用PCR结合导流杂交法对地中海分型进行检测确定，对未确定的分型用一代测序法确定地中海贫血分型；即得到地中海贫血基因检测质控品。

对转染B淋巴细胞培养、传代选择永生化细胞，其方法为：转染EB病毒后的B淋巴细胞分成同体积的多份，在相同培养条件。下平行培养，温度为37℃、二氧化碳浓度为5%的培养箱中进行培养；分别在第2天、第4天加入等体积的新鲜培养基，并补充免疫抑制剂环孢霉素A，培养基中添加至其终浓度为1ug/ml；继续培养至16天，直至出现较多细胞团，培养基背景变浑浊，有大量不活动黑色小颗粒，贴壁且不易晃起，同体积的多份B淋巴细胞现象一致；分离提取任一份B淋巴细胞，传一新瓶培养，获得的细胞株即为永生化细胞株。

以下实施例2展示一种突变类型质控品的制备。

实施例2 制备地中海贫血东南亚型缺失基因型(--SEA/aa)永生化细胞系标准品

1.实验血样

实验血样由凯普医药科技有限公司提供，血样取自携带地贫基因--SEA/aa的外周血，采血时间不超过22小时。

实验方法

实验方法同实施例1。更加具体的实验操作如下：

（1）分离提取地中海贫血血液中的B淋巴细胞

取15ml离心管2支，加入B淋巴细胞分离液5ml备用（分离液为Solarbio的人外周血淋巴细胞分离液，货号：P8610）。轻轻上下晃动采血管使血样混匀，开盖后用巴氏吸管轻缓吹打混匀，取5ml外周血置于15ml离心管中，加入5ml RPMI1640基础培养基稀释血样。分别取5ml稀释血样，缓慢加入含有B淋巴细胞分离液的15ml离心管中，使两者分层。将血样缓慢至于低速离心机中，分离B淋巴细胞的离心参数为1730转每分（相对离心力约为500g），离心升速加速度为中速挡位，减速加速度设为离心机的最低速挡位（无制动），离心20分钟。分离后先用巴氏吸管缓慢吸去上层血清层，换用新巴氏吸管再吸取全部白膜层，将两管的白膜层都加入于含有5ml PBS的15ml离心管中，补充PBS至10ml，吹打清洗细胞。置于低速离心机以1000转/分（相对离心力约为170g）离心10分钟，取出后用巴氏吸管一边观察液体一边小心吸去上层PBS，若见有细胞悬起则停止去上清，加入新鲜PBS吹打清洗第二次，重复清洗三次，第二和第三次用5ml PBS清洗，离心等待时准备病毒转染所需试剂。最后一次清洗后，尽可能吸去所有PBS，残留PBS体积应小于100ul。

（2）制备EB病毒上清液

用含血清20%的1640完全培养基复苏B95-8细胞一株，传代至T25培养瓶，置于细胞培养箱中以37摄氏度，5%二氧化碳条件培养，后续换液加液传代操作使用含10%FBS的1640完全培养基，待足够实验量后，吹散取少量悬液计数，用RPMI-1640基础培养基将B95-8调整细胞浓度为2x10⁶个/ml，置于培养箱中饥饿培养7至10天；将饥饿结束的细胞及培养基置于-70摄氏度冰箱冷冻至完全结冰，再置于37摄氏度培养箱解冻至完全溶解，反复冻融3次。收集冻融破裂后的培养基，用低速离心机以2500转每分（相对离心力约1230g）离心15分钟后，取上层清夜用0.22um针头过滤器过滤，分装于细胞冻存管，每管1.5ml，置于-70摄氏度以下保存备用。

（3）转染B淋巴细胞

取备用的EB病毒上清液一管，置于37摄氏度水浴解冻，此步骤于清洗第3次离心时进行。将解冻好的EB病毒加入到清洗结束的B淋巴细胞中，按比例每5ml全血当量淋巴细胞加入1ml EB病毒上清液重悬。将细胞吹打重悬，置于37摄氏度水浴锅中水浴，每20分钟轻轻晃动使细胞悬起，水浴2小时。结束后加入3倍EB病毒上清液体积的含20%胎牛血清的1640完全培养基稀释，根据培养基体积加入环孢霉素A工作液至环孢素终浓度为1ug/ml。

（4）永生化细胞培养、传代、分离

将上述转染结束的B淋巴细胞等份接种于两瓶T25培养瓶中并标识，每瓶约2ml，仅平铺培养瓶半片细胞平面，避免晃动，置于细胞培养箱中以37摄氏度、二氧化碳浓度5%条件下培养，具体培养流程如表1。转染后第2天加入当前培养基等体积的含20%胎牛血清的1640培养基，并补充环孢霉素A至相应终浓度，转染后第4天加入当前培养基等体积的新鲜培养基，并补充环孢霉素A至终浓度1ug/ml。培养至15-20天，期间视细胞生长情况进行换液和加液操作。培养至转染后16天左右，预计可见较多细胞团，培养基背景变浑浊，见背景有大量不活动黑色小颗粒，贴壁且不易晃起，两瓶现象一致，此时开始重新分离细胞，培养期间的细胞照片如图1和图2。取出培养瓶，用巴氏吸管吹打使细胞分散重悬，吸取全部细胞悬液于15ml离心管，以1000转每分离心5分钟，去上清至剩余3到5ml培养基。吹打重悬细胞，吸取全部细胞悬液缓慢置于含有5mlB淋巴细胞分离液的15ml离心管中，使两者分层。至于低速离心机中，以1730转每分（相对离心力约500g），升速加速度中等挡位，减速加速度最小挡位（无制动），离心10分钟。离心结束后，用巴氏吸管吸取全部白膜层置于含有5ml PBS的15 ml离心管中，加入PBS至10 ml，缓慢吹打清洗细胞，置于离心机中以1000转每分离心5分钟，去上清，同法用5ml PBS清洗第二次。用6 ml含20%胎牛血清的1640完全培养基重悬细胞，接种于一新T25培养瓶，次日见部分细胞聚集成团，获得的细胞株即为永生化细胞株。置于细胞培养箱中，以5%二氧化碳，37摄氏度条件继续培养至35天，细胞团持续增大。

（5）细胞冻存

冻存前一天（第37天开始冻存，在第40天全部冻存完成）全部换液。吹散混匀细胞，取少量细胞悬液计数。吸取一定体积的细胞悬液，置于15ml离心管中，1000转每分离心5分钟，去除部分上清液，调整细胞浓度为1.2x10⁷个细胞每毫升。吹打重悬细胞，分装于1.8ml规格细胞冻存管，每管0.5ml每冻存管加入0.5ml冻存培养基，吹打混匀。上盖，用封口蜡纸封口，置于4摄氏度预冷的程序降温盒中，置于-70摄氏度超低温冰箱中过夜，第二天转移至液氮中永久保存。

（6）细胞传代与收集

当细胞密度过高时，进行1/6或1/8传代。将细胞吹打混匀，取5/6至7/8细胞悬液于离心管中，取少量细胞悬液计数，记录培养基体积。置于离心机中以1000转每分离心5分钟，弃去上清液，取已知体积的细胞保存液重悬细胞，计算细胞细胞密度，标识细胞名称、收集日期、细胞密度，置于-20摄氏度冰箱中保存。原瓶中加入新鲜20%完全培养基至原体积，置于细胞培养箱中培养。

（7）确定永生化细胞分型

根据杂交法对地中海贫血型别进行检测，使用凯普生物已上市试剂盒α-、β-地中海贫血基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法），膜条上的探针序列见表2，对培养完成的细胞进行2次杂交鉴定，杂交鉴定的结果如图3。

表1 转染细胞培养

表2杂交膜膜条探针排列顺序

3.实验结果

对上述方法的细胞显微观察如图1-图2，可见随着时间推移，细胞逐渐成团，可得结论转化细胞成功适应体外环境并能生长，在16天左右，可见较多细胞团，培养基背景变浑浊，见背景有大量不活动黑色小颗粒。

对培养完成的细胞进行2次杂交鉴定，杂交鉴定的结果如图3，对照表2杂交膜膜条探针排列顺序，可以看出：--SEA杂交点显色，表示该样本为携带地贫基因--SEA/aa阳性，可得结论成功永生化细胞仍可稳定保留遗传病信息。

实施例3 离心制动降速对白膜层形成的影响

1.实验方法

按实施例1步骤S1操作对B淋巴细胞进行分离，分离后取两支血样，其中一支血样离心结束后，以5档制动降速（即从设定转速降至0需要10-15秒），另一支降速时不制动，待降速完成后，观察血样的白膜层完整情况。

实验结果

实验结果见图4，可以看出5档制动的血样中白膜层被破坏不清晰（图4中的a），不制动提取的白膜层形状完整，用W表示（图4中的b），因此在白膜层的提取过程降速步骤如果采取制动，会破坏白膜层的形成，白膜层的细胞得率减少，因此白膜层的提取中降速过程中不能制动。

实施例4培养基体积对质控品制备的影响

1.实验方法

按实施例1中S1-S3的操作获得转染的B淋巴细胞，分别按2×10⁵个细胞/ml等浓度接种于同种康宁品牌的T25培养瓶2mL/瓶和孔板0.5mL/孔。然后参照实施例1中培养条件，对两种不同体积的容器进行培养，观察细胞的生长情况。

实验结果

结果如图5，可见2.5mL培养瓶中细胞出现悬浮细胞团（图5中的a），继续培养数天后细胞团变大（图5中的b）；孔板中见细胞团贴附于壁面，周围环绕贴壁的内皮细胞，继续培养后细胞团未增大（图5中的c、图5中的d、图5中的e），而内皮细胞数量增加。因此不同培养瓶培养会对细胞生长产生影响，体积较小的培养容器内皮细胞生长慢、不易消化收集，不适用于生产，T25培养瓶更适合进行原代培养操作。

实施例5质控品产品的平台适用性测试

1.实验方法

按实施例2方法制备得到的标准品（即质控品），分别使用磁珠法的凯普DNA-L提取试剂盒、离心柱法的天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，各提取一份DNA。

分别使用凯普a-地中海贫血和β-地中海贫血基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法）、a-地中海贫血和β-地中海贫血基因检测试剂盒（PCR+膜杂交法）、致善生物缺失型a-地中海贫血基因检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）分别对2份提取DNA，根据说明书进行检测，并对野生型样本进行上述测定。

实验结果

结果如图6所示，图6中a、c、e为磁珠法的凯普提取试剂盒提取的DNA溶液，b、d、f为天根离心柱法的核酸提取试剂盒提取的DNA溶液；g、h、i为野生型样本溶液。

a、b、g为使用凯普（PCR+导流杂交法）试剂盒检测的结果，c、d、h为使用凯普（PCR+膜杂交法）试剂盒检测的结果，e、f、i为致善生物缺失型a-地中海贫血基因检测试剂盒检测的结果。结果可见，图6中a、b、c、d凯普试剂盒杂交膜左下角--SEA/aa位点均显色，图6中e、f致善生物试剂盒可见--SEA地贫杂合突变型双峰。

上述结果说明，制备的地中海贫血阳性基因质控品具有很好的多平台适用性，能适用于不同原理的提取试剂盒及检测试剂盒。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种地中海贫血基因检测质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.分离提取地中海贫血血液样本中的白细胞；

S2.制备EB病毒液；

S3.EB病毒转染白细胞，然后传代培养；

S4.分离永生化细胞，并确定永生化细胞的地中海贫血基因分型，即得到相应的地中海贫血基因检测质控品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中地中海贫血血液样本的突变类型选自：缺失型α-地中海贫血、突变型α-地中海贫血、突变型β-地中海贫血中的一种。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述缺失型α-地中海贫血包括--SEA、-α3.7和-α4.2；所述突变型α-地中海贫血包括 CS、QS、WS；所述突变型β-地中海贫血包括β-地中海贫血15个突变位点，分别为：IVS-II-654(C-T)、-28(A-G)、-29(A-G)、CD14/15（+G）、CD17(A-T)、CD27/28（+C）、βE(G-A)、CD41/42 (-TTCT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T, G-A)、IVS-I-5(G-C)、Cap(-AAAC)、Int（T-G）、CD31(-C)。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述白细胞为淋巴细胞。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述淋巴细胞为B淋巴细胞。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3的具体方法为：

a.将EB病毒液与白细胞混合后于36-38℃水浴1-3小时；

b.加入含有免疫抑制剂的培养基，于36-38℃、5% CO₂条件下培养15-20天。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，EB病毒液与白细胞的比例为：每5ml全血当量白细胞加入0.5-2ml EB病毒液。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述免疫抑制剂为环孢霉素A，步骤b中培养15-20天期间，不断更换或补充相同的含有免疫抑制剂的培养基。

9.根据权利要求1-8任一方法制备得到的永生化细胞质控品。

10.权利要求9所述永生化细胞质控品在制备地中海贫血基因检测阳性参考品或制备地中海贫血基因检测试剂盒方面的应用。

Images