WO2005056777A1

WO2005056777A1 - 接着性幹細胞分画並びにその分離方法、品質管理方法及び品質管理装置

Info

Publication number: WO2005056777A1
Application number: PCT/JP2004/018153
Authority: WO
Inventors: Satoshi Ozawa; Kenko Uchida
Original assignee: Hitachi Medical Corporation
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2004-12-06
Publication date: 2005-06-23

Abstract

　未分化な接着性幹細胞集団における純粋で均質な幹細胞分画を提供することを目的とする。　接着性幹細胞集団について細胞膜表面におけるABCトランスポーターの発現を指標とし、ABCトランスポーターに特異的な抗体が結合することを特徴とする幹細胞分画を分離する。

Description

明細書

接着性幹細胞分画並びにその分離方法、品質管理方法及び品質管理技術分野

[0001] 本発明は、例えば再生医療に使用できる、接着性幹細胞集団における特定の細胞分画並びにその分離方法、品質管理方法及び品質管理装置に関する。

背景技術

[0002] 幹細胞は、自己複製能と様々な細胞型や組織への分化能 (多分化能)を有する未分化な細胞である。今日において、幹細胞は、再生医療における 3要素（幹細胞、足場材料及び分化誘導因子)のうち最も重要な原料である。

[0003] 幹細胞は、発生段階の胚組織力作出される胚性幹細胞 (ES細胞)などと、成体から分離される成体幹細胞とに大別される。成体幹細胞は、患者力採取し、必要な細胞型に分化させた後、当該患者に移植して治療を行う、いわゆる自家移植型の再生医療に適用可能である。患者自身に由来する成体幹細胞は、倫理的制約の少ない幹細胞源として注目されてヽる。

[0004] 成体幹細胞のうち、間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cell,以下「\«じ」と呼ぶ）は骨髄などにわずかに存在する接着性幹細胞である。 MSCは骨、軟骨、脂肪、筋、腱、骨髄間質などの主に中胚葉系の様々な細胞や組織へ分ィ匕誘導できることが明らかにされており、応用範囲の広い成体幹細胞として注目されている。また MSCの一部は培養後に中枢神経細胞などの外胚葉系の細胞組織や、肝細胞などの内胚葉系の各種細胞組織へ分ィ匕する能力を保持するとの報告もある (ジアング Y(Yuehua Jiang)ら、ネーチヤ一 (Nature)、 2002年、第 418卷 (6893)、 p.41- 49)。なお、 MSCは培養の際に、プラスチック製の培養容器底面に接着する性質がある。この接着性を利用して、血球細胞や造血系細胞などを含む骨髄から MSCを分離する方法が提案されているが、この方法では MSC以外にも接着性の細胞が混入する可能性があるため、 MSCを骨髄などの成体組織から分離、同定する様々な研究が従来行われてきた。

[0005] 例えば特許文献 1によると、骨髄細胞から、上記の培養容器底面への接着性に基づいて分離した後に一定期間の培養を行うことにより、骨、軟骨や脂肪細胞など間葉系組織への多分化能 (幹細胞としての性質)を有する細胞集団が得られる。この細胞集団は、特定の抗体と均一な結合能を示すことから、 MSCと命名している。特に、特許文献 1には、 SH2、 SH3及び SH4モノクローナル抗体と呼ばれるハイプリドーマによつて産生される抗体力 SMSCを特徴づける特異的抗体であると記載されて、る。同様に非特許文献 1には、 SB-10モノクローナル抗体等のハイプリドーマによって産生される抗体が MSCを特徴づける特異的抗体であることが記載されている。

[0006] その後の研究により、上記抗体は実は既知の CD抗原を認識することが明らかにされた。具体的には、 SH2モノクローナル抗体は CD105、即ちエンドダリンを認識する抗体であること（非特許文献 2)、また SH3及び SH4モノクローナル抗体は CD73、即ちェタト- 5'-ヌクレオチダーゼを認識する抗体であることが明らかにされた (非特許文献 3) 。なお、 SH3モノクローナル抗体と SH4モノクローナル抗体は、 CD73の異なるェピトープを認識する抗体であることが示されている (非特許文献 3)。さらに、 SB-10モノクロ一ナル抗体は CD166、即ち ALCAMを認識する抗体であることが報告された (非特許文献 4)。これらの抗原は MSC以外の他の細胞にも発現している。従って、上記抗体は MSCを特徴づける特異的抗体ではないことが明らかになり、また MSCの特異性、均質性について疑問が提示された。

[0007] このように、 MSCの評価及び同定方法は研究途上の段階である。従来の方法で分離された MSCは、純粋かつ均質な細胞種である力、あるいは異なる性質を有する複数の細胞群にさらに分割可能な集団である力否かが不明確である。従来の MSCの評価及び同定方法にお!ヽては、十分な MSCの指標が存在してヽなかった。

[0008] 一方、特許文献 2には、造血幹細胞を BCRPの発現に基づ、て分離、同定する方法が記載されている。なお、 BCRPは ABCG2、 Bcrpl、 Mxr又は Abcpとも呼ばれる。 BCRPは、 ATP結合領域 (ATP- inding cassette region)を有する ABCトランスポータ一ファミリーに属する膜タンパク質である。一方、従来の研究において、 SP細胞と呼ばれる未分化な造血幹細胞の分画が見出されていた。 SP細胞は Hoechst 33342色素を排出する能力が高く染色されにくいという性質 (SP表現型)を示す。特許文献 2〖こおいて、この SP表現型は BCRPに起因することが示された。 SP細胞は BCRPを高発現しており、 BCRPの膜輸送機能により Hoechst 33342色素が排出されるため、 SP細胞は SP表現型を示すと説明されている。また、 BCRP抗原に対する特異的抗体を用いることにより、 SP細胞に相当する未分ィ匕な造血幹細胞を同定、分離する方法が記載されている。

[0009] 特許文献 2の趣旨は、造血幹細胞の一種である SP細胞の細胞マーカーが BCRPであることである。特許文献 2に記載される主な実施例は、造血幹細胞（実施例 1)や白血病細胞（実施例 2)などの骨髄中の血液細胞における BCRPの発現に関するものである。ここで一般に血液の細胞は非付着性であり、また骨や軟骨などの間葉系組織とは異なる系譜に属することから、 MSCなどの付着性細胞とは異なる細胞である。一方、例えば、骨格筋中の SP細胞における BCRP遺伝子の発現解析を行い、 BCRP遺伝子の発現強度が比較的高力つたことが示されている。しかしながら、対照となる非 SP 細胞における BCRP遺伝子の発現強度は示されてヽなヽ (特許文献 2、段落番号 [0114])。従って、骨格筋中の SP細胞のマーカーとしての BCRPの有効性は不明である。また、培養 ES細胞における非 SP細胞の BCRP発現強度は、 ES細胞における SP細胞の BCRP発現強度と同等であったことが記載されている (特許文献 2、段落番号 [0116])。従って、 ES細胞における SP細胞のマーカーとしての BCRPの有効性も不明である。このように、 BCRPが骨格筋や ES細胞など、造血幹細胞以外においては SP表現型の同定に有効か否かは不明確である。さらに、特許文献 2は、 MSCなどの接着性幹細胞と BCRPとの関係に関しては記載してヽな、。

[0010] 以上のように、 MSCなどの接着性幹細胞にぉ、て BCRPが発現して、る力、発現して、るとすればどのような発現パターンを示すのかにっヽては従来全く知られてヽなかった。

特許文献 1：米国特許第 5486359号明細書

特許文献 2：米国特許出願公開第 20020102244号明細書

非特許文献 1 :ブルーダー SP(Bruder SP)ら、「ボーン（Bone)」、 1997年、第 21卷、 p.225-235

非特許文献 2 :フランク Pノリー (Frank P. Barry)ら、「バイオケミカルアンドバイオフィンカルリサーテコュ-グーシヨンズ (Biochemical and Biophysical Research Communications)] , 1999年、第 265卷、 p.134-139

非特許文献 3 :フランクバリー (Frank Barry)ら、「バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサ ~~テコ^ュニケ ~~ンヨンズ (Biochemical and Biophysical Research

Communications)] , 2001年、第 289卷、 p.519- 524

非特許文献 4 :ブルーダー SP(Bruder SP)ら、「ジャーナルォブボーンアンドミネラルリサーチ（Journal of Bone and Mineral Research)」、 1998年、第 13卷、 p.655- 663 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 上述したように、従来の技術によって分離、同定された骨髄由来の MSCなどの接着性成体幹細胞は、純粋かつ均質な細胞種であるか否かが不明確であると、う問題があった。また、 MSCにおいて、細胞膜表面における BCRPなどの ABCトランスポーターの発現にっヽては知られておらず、 MSC等の接着性幹細胞の評価及び同定のために ABCトランスポーターに特異的な抗体が有効か否かが不明であった。

[0012] そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、未分化な接着性幹細胞集団における純粋で均質な幹細胞分画を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0013] 上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、接着性幹細胞集団について細胞膜における ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーの発現を解析したところ、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体が結合することを特徴とする幹細胞分画を見出し、本発明を完成するに至った。

[0014] すなわち、本発明は、接着性幹細胞集団において、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体が結合することを特徴とする幹細胞分画である。本発明に係る幹細胞分画としては、間葉系幹細胞集団において、より未分化な間葉系幹細胞分画が挙げられる。また、本発明は、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体を用いて、接着性幹細胞集団から所定の幹細胞分画を分離する方法である。さらに本発明は、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバ一に特異的な抗体を用いて、接着性幹細胞集団において所定の幹細胞分画を標識し、標識された幹細胞分画に属する細胞比率を計測することを特徴とする幹細胞の品質管理方法である。さらに本発明は、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体により標識された所定の幹細胞分画を含む接着性幹細胞集団を供給する供給部と、標識された上記所定の幹細胞分画を検出する検出部とを備え、上記検出部で検出された上記所定の幹細胞分画に属する細胞比率を計測することを特徴とする幹細胞分画の品質管理装置である。

発明の効果

[0015] 本発明により、未分化な接着性幹細胞集団における純粋で均質な幹細胞分画が提供される。本発明に係る未分化な幹細胞分画は、幹細胞としての性質がより強く維持され、かつ、より広範な分化能を有する未分化な幹細胞の分画であるため、自家及び他家にかかわらず再生医療において効果的に使用できる。

[0016] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003-412367号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1]幹細胞分画の品質管理装置の模式図である。

[図 2]幹細胞分画の品質管理工程のフローチャートである。

[図 3]実施例 1にお、て、染色試料 1に含まれる個々の細胞にっ、て観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロッ卜である。

[図 4]実施例 1において、染色試料 1における個々の細胞について観測された FITC 及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 5]実施例 1にお、て、染色試料 1に含まれる個々の細胞にっ、て観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロッ卜である。

[図 6]実施例 1において、図 5の細胞集団 20に関して観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 7]実施例 1において、図 5の細胞集団 19に関して観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 8]比較例において、染色試料 2に含まれる個々の細胞について観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸にプロットした 2次元プロットである。

[図 9]比較例において、図 8の細胞集団 23に関して観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 10]比較例において、図 8の細胞集団 22に関して観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 11]実施例 3において、染色試料 4に含まれる個々の細胞について観測された SS と FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 12]実施例 3において、図 11の細胞集団 27に関して観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 13]実施例 4において、染色試料 5に含まれる個々の細胞について観測された SS と FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 14]実施例 4において、図 13の細胞集団 29に関して観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 15]実施例 5にお、て、染色試料 6に含まれる個々の細胞につ、て観測された SS と FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロットである。

[図 16]実施例 5において、図 15の細胞集団 31に関して観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットである。符号の説明

1:幹細胞分画の品質管理装置

2:シース液導入路

3:吐出口

4:フローセル

5:細胞試料導入路

6:電極

7:レーザー光源

8:光検出器

9a、b:偏向電極板

10a、 b、 c:細胞回収管

11:制御部

12:高圧電源

13a、b:偏向電源

14:液柱

15:液滴

16:染色試料の全細胞集団

17a, 17b、 17c、 17d、 17e:細胞集団 16、 20、 27及び 29のうち CD166+/ABCG2 一の細胞集団

18a、 18b、 18c、 18d、 18e:細胞集団 16、 20、 27及び 29のうち CD166+/ABCG2 +の細胞集団

19:細胞集団 16のうち、 FS、 SSともに信号強度が低い細胞集団

20:細胞集団 16のうち、 FS、 SSともに信号強度が高い細胞集団

21：細胞集団 19のうち、じ0166 + /—かっ 8じ。2—の細胞集団

22:染色試料 2のうち、 FS、 SSともに信号強度が低い細胞集団

23:染色試料 2のうち、 FS、 SSともに信号強度が高い細胞集団

24:細胞集団 23のうち、 CD166+/CD105 +の細胞集団

25:細胞集団 22のうち、 CD166 + /—かつ CD105 + /—の細胞集団 26 :染色試料 4のうち、 FS、 SSともに信号強度が低い細胞集団

27 :染色試料 4のうち、 FS、 SSともに信号強度が高い細胞集団

28 :染色試料 5のうち、 FS、 SSともに信号強度が低い細胞集団

29 :染色試料 5のうち、 FS、 SSともに信号強度が高い細胞集団

30 :染色試料 6のうち、 FS、 SSともに信号強度が低い細胞集団

31 :染色試料 6のうち、 FS、 SSともに信号強度が高い細胞集団

発明を実施するための最良の形態

[0019] 以下、本発明を詳細に説明する。

[0020] 本発明に係る幹細胞分画を分離する方法 (以下、「本発明に係る幹細胞分画の分離方法」と呼ぶ)により、種々の接着性幹細胞集団の中から特定の幹細胞分画を高精度に分離することができる。ここで、特定の幹細胞分画とは、接着性幹細胞集団において、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体が結合することを特徴とする幹細胞分画である。換言すれば、特定の幹細胞分画は、接着性幹細胞集団において、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーを細胞膜表面に発現することを特徴とする幹細胞分画ということができる。

[0021] なお、「接着性幹細胞集団」とは、成体幹細胞のうち、培養中に培養容器底面に接着する性質を有する幹細胞の集団を意味する。接着性幹細胞集団が接着できる培養容器底面の材料としては、プラスチック、ガラス、シリコン、金属など各種の素材が挙げられる。特に、低毒性、堅牢性、製造や取扱いの容易性、観察の容易さ (透明性 )、価格、滅菌性などの点から、ポリスチレンなどのプラスチックが特に好適に使用される。

[0022] また、接着性幹細胞集団は、例えば、ヒトを含む哺乳動物における、成体の骨髄において当初その存在が確認されたが、その後臍帯血を含む血液、胎盤、筋肉、脂肪組織などの組織にもその存在が報告されてヽる。具体的な接着性幹細胞集団としては、例えば骨髄に存在する間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cell,以下「MSC」と呼ぶ）、並びに MSCに関連する細胞が各種報告されている。しかし、幹細胞については現在まだ精力的に研究されつつある段階にあり、報告の間には互!ヽに矛盾するものや、追試が待たれるものも多ぐ詳細な解明が待たれている。なお、市販されている接着性幹細胞集団としては、例えば、 Cambrex社製のヒト骨髄由来の MSCが挙げられる。

[0023] MSCは、骨髄、血液、胎盤、筋肉、脂肪組織などに存在が報告されている接着性幹細胞であり、骨、軟骨、脂肪、筋、腱、骨髄間質などの主に中胚葉系の様々な細胞や組織へ分化誘導できる。 MSCは細胞表面マーカーとして CD73(「ェタト- 5' -ヌクレォチダーゼ」とも呼ばれる)、 CD105(「エンドダリン」とも呼ばれる)及び CD166 (「 ALCAMJとも呼ばれる）などを細胞膜表面に発現すると報告されて、る。

[0024] 本発明に係る幹細胞分画の分離方法によれば、接着性幹細胞集団の MSC細胞集団の中から、より未分ィ匕な MSC分画を分離することができる。ここで、「より未分化な MSC分画」とは、従来単一の細胞集団と考えられていた MSC力 ABCトランスポータ一ファミリーに属するメンバーの細胞膜表面における発現により 2つの分画に分離されたうちの当該メンバー陽性の幹細胞分画である。なお、「より未分ィ匕な」とは、もう一方の当該メンバー陰性の幹細胞分画と比較した際のより未分ィ匕な、即ちより多くの細胞に分化する能力（多分化能)を有する、より幼若な、幹細胞としての能力の高い状態をいう。

[0025] 細胞の未分ィ匕な状態は、従来その細胞が多分ィ匕能を有するかどうかにより評価されてきた。しかしながら多分ィ匕能の評価は煩雑な分ィ匕誘導実験を行った後で初めて結果が得られる。従って、遡及的に結論づけることは出来ても、予見的に (細胞を変ィ匕させずに)確認することは出来ない、という課題がある。細胞の未分化な状態を予見的に確認する方法としては、未分化な細胞に特有の表面マーカーを確認する方法がある。特に造血細胞においては、 CD34抗原等が幹細胞表面マーカーとして有名であり、抗 CD34抗体を用いて、未分ィ匕状態にある造血系細胞 (即ち造血幹細胞）の評価同定が行われて、る。また血液系幹細胞における未分ィ匕状態の指標として近年報告された SP表現型は、蛍光色素 Hoechst 33342の排出能力により定義される。 Hoechst 33342の排出能力の評価も予見的に行える。

[0026] 一方、「ABCトランスポーターファミリー」とは、 ATP結合領域（厶 TP- inding cassette )を有する ABCトランスポーターと呼ばれる輸送体タンパク質の一群を意味する。ヒトの ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーとしては、 ABCトランスポーターのサブファミリー G(White)のメンバー 2である ABCG2の他、同メンバー 1,メンバー 4,メンバー 5,メンバー 8が知られている。また、 ABCトランスポーターに属する他のサブフアミリーとしては、 A(ABC1)、 B (MDR)、 C (MDP)、 D (ALD)、 E (OABP)、 F (GCN20) が知られており、それぞれについて多くのメンバーがあるため、ヒトについては合計約 50のメンバーが知られて!/、る。

[0027] 本発明に係る幹細胞分画の分離方法により、以上のように説明した幹細胞分画を分離することができる。本発明に係る幹細胞分画の分離方法に従えば、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体を用いて、接着性幹細胞集団から所定の幹細胞分画を分離する。

[0028] なお、接着性幹細胞集団 (原料)としては、上記市販のものか、又は試料から分離したものを使用することができる。ここで、「試料」とは、ヒトを含む哺乳動物における、成体の骨髄、臍帯血、血液、胎盤、筋肉、脂肪組織などの器官、組織及び細胞をい

[0029] 例えば、試料カゝら得られる細胞を適切な培地を含む培養容器に入れ、 1時間一 3週間後、好ましくは 12時間一 2日後に培養容器底面に接着した細胞を残して上清中の非付着性細胞を廃棄し、付着した細胞の培養を継続することにより、接着性幹細胞集団が得られる。

[0030] 試料から得られた細胞を元に、接着性幹細胞集団を他の細胞から分離する他の方法としては、接着性幹細胞集団に発現する細胞表面マーカー (以下、単に「接着幹細胞表面マーカー」と呼ぶ)に基づく方法がある。なお、接着性幹細胞表面マーカーとしては、接着性幹細胞集団に含まれる細胞の細胞膜表面に発現するタンパク質、例えば CD73、 CD155、 CD166, CD29、 CD44、 CD71、 CD90、 CD106、 CD120a、 CD124、 CD49a— 49d、 CD62L、 CD54などの抗原が報告されている。

[0031] 分離方法としては、例えば、接着性幹細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いた抗原抗体反応とフローサイトメトリーの原理に基づくセルソーターが挙げられる。接着性幹細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いて、接着性幹細胞を標識する。この抗体は、 PEや FITCなどの蛍光色素により予め標識し、或いは PEや FITCなどの蛍光色素をコンジュゲートした二次抗体を用いて標識することにより、接着性幹細胞をその接着性幹細胞表面マーカーの発現量に応じて蛍光色素により標識する（蛍光染色)。フローサイトメトリーにより、細胞の側方散乱光 (以下、「ss」と呼ぶ)と前方散乱光（以下、「FS」と呼ぶ)の信号強度を測定する。ここで SSは、レーザーがサンプルに当たつたときに直角方向に散乱する光であり、細胞の粒度の指標である。一方、 FSは、レ一ザ一がサンプルに当たったときに直進方向に散乱する光であり、細胞の大きさの指標である。試料力も得られた細胞をフローサイトメトリーに供し、得られた SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール)にプロットし、 2次元プロットを構築する。個々のドットは、それぞれ細胞に対応する。得られたプロットの特定の領域を設定し、特定の粒度と大きさを有する細胞集団のみを、蛍光色素の蛍光強度に基づいて分析することができる。当該細胞集団が接着性幹細胞集団である力否かを、当該接着性幹細胞表面マーカーに特異的に結合した抗体が有する蛍光色素の蛍光強度から確認する。例えば、細胞を 2重標識した場合には、上記細胞集団において観測されたそれぞれの蛍光色素力の蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸にプロットすることで 2次元プロットを構築する。この 2次元プロットより、接着性幹細胞表面マーカーの発現強度が高い細胞集団として、接着性幹細胞集団を同定することができる。次いで、接着性幹細胞集団を含む特定の領域を設定し、セルソーターにより接着性幹細胞集団を分離することができる。なお、接着性幹表面マーカーに対する単一の抗体を用いて細胞を標識することにより、セルソーターにより接着性幹細胞集団を分離することちできる。

[0032] また、セルソーター以外の分離手段としては、例えば、磁気ビーズ及びァフィ二ティ一クロマトグラフィーが挙げられる。

[0033] 分離手段として磁気ビーズを用いる第 1の方法として、磁気ビーズ表面に接着性幹細胞表面マーカーに特異的な抗体を固定ィ匕する。当該抗体が固定化された磁気ビーズを、試料カゝら得られた細胞を含む溶液に添加して、抗原抗体反応を生じさせる。次いで、溶液に対して磁場を作用させることにより、磁気ビーズ上の抗体に結合した接着性幹細胞集団を選択的に捕集することができる（ポジティブセレクション)。第 2 の方法として、磁気ビーズ表面に接着性幹細胞以外の共存する細胞の表面マーカ一に特異的な抗体を固定ィ匕し、上記同様の手順によって共存細胞を磁気ビーズとともに捕集除去することにより、残された接着性幹細胞を回収することも可能である (ネガティブセレクション）。

[0034] 分離手段としてァフィ二ティークロマトグラフィーを用いる場合には、接着性幹細胞表面マーカーに特異的な抗体をァガロースゲルなどの担体に固定ィ匕する。次ヽで、当該抗体が固定化された担体をカラムに充填し、当該カラムを用いたァフィユティークロマトグラフィーに試料カゝら得られた細胞を含む溶液を供することで、接着性幹細胞集団を分離することができる（ポジティブセレクション)。また上記同様、ネガティブセレクションも可能である。

[0035] 接着性幹細胞集団が、単一の細胞集団として得られた力否かは、フローサイトメトリ一により確認することができる。例えば、接着性幹細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いて、抗原抗体反応により細胞を標識し、フローサイトメトリーにより確認することがでさる。

[0036] 他の確認方法としては、免疫組織化学的方法、免疫沈降法、 ELISA及びウェスタンブロッテイングなどが挙げられる。例えば、免疫組織学的方法においては、接着性幹細胞表面マーカーに特異的な抗体を用いて、抗原抗体反応により細胞を標識し、標識した細胞を蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡等を用いて観察し、記録する。

[0037] ところで、本発明に係る幹細胞分画に含まれる幹細胞の細胞膜表面上の ABCファミリ一に属するメンバーの発現は、継代を定期的に行い、また培養期間が短い程維持されやすい。従って、本発明に係る幹細胞分画の分離方法に用いる接着性幹細胞集団は、試料から分離した後、継代回数力 ¾一 7回、特に好ましくは 3— 5回であり、また培養期間力 S1—約 90日間、特に好ましくは約 7—約 20日間の接着性幹細胞集団を使用することが好ましい。

[0038] 接着性幹細胞集団を培養する際には、培養期間中、継代操作を 3— 10日間隔、好ましくは 4一 7日間隔で定期的に培地交換とともに行うことが好ましい。接着性幹細胞集団の培養温度は、当該細胞が生育する温度であれば、ずれの範囲でもよ、が、 25— 40°Cの範囲、好ましくは 34— 38°Cである。また、培養時の pHは、 6.8— 7.6の範囲、好ましくは 7.0— 7.4である。また、接着性幹細胞集団の培養方法は、一般的に接着性細胞を培養する際に用いられる方法であってょ、。 [0039] 以上に説明した接着性幹細胞集団から ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体を用いて、所定の幹細胞分画を分離することできる。分離方法は、上記に説明した接着性幹細胞集団の分離方法と同様である。すなわち、幹細胞分画の細胞膜表面に特異的に発現する ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体を接着性幹細胞表面マーカーに特異的な抗体の代わりに使用し、セルソーター、磁気ビーズ及びァフィ二ティークロマトグラフィー等を分離手段として接着性幹細胞集団から特定の幹細胞分画を分離することができる。

[0040] また、分離した幹細胞分画の培養条件、培養方法等は、上記で説明した接着性幹細胞集団のものと同様である。

[0041] 本発明に係る幹細胞分画は、従来単一の細胞集団であると考えられてきた MSCから、 ABCG2等の ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーの細胞膜表面における発現量を指標とし、 2つの分画に分離した細胞の内、 ABCトランスポーターファミリ一に属するメンバーが陽性である幹細胞分画である。一方、造血系幹細胞は白血球やリンパ球、赤血球、血小板など、非接着性の血液系の細胞へ分化する幹細胞であり、骨、軟骨、腱、筋、脂肪細胞などへ分ィ匕する接着性の MSCとは種類の全く異なる細胞である。この造血系の幹細胞の一つ SP細胞は ABCG2を細胞膜表面に発現し、 ABCG2の輸送機能により分ィ匕誘導因子類を排出し、未分化状態を維持するという仮説が提案されている。本発明により、接着性を有する MSCにおいて、新たに ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーが陽性である幹細胞分画が見出された。この新しヽ接着性幹細胞分画に含まれる幹細胞にぉ、ても、 ABCトランスポーターは分化誘導因子類を排出する機能を有すると考えられる。即ち、本発明に係る接着性幹細胞分画に含まれる幹細胞は、幹細胞としての性質がより強く維持され、より広範な分化能を有する未分化な幹細胞と考えられる。よって、本発明に係る接着性幹細胞分画は、自家及び他家にかかわらず広く再生医療に有用である。

[0042] 一方、図 1は、本発明に係る幹細胞分画の品質管理装置の構成の一例を示す模式図である。

[0043] 図 1に示すように、幹細胞分画の品質管理装置 1は、上端部にシース液導入路 2及び下端部に吐出口 3を有し、対象の細胞を含む溶液を収容するフローセル 4と、先端部をフローセル 4内部に配設してなる細胞試料導入路 5と、先端部をフローセル 4内部に配設してなる電極 6と、レーザー光源 7と、光検出器 8と、吐出口 3の下方に配設された一対の偏向電極板 9a、 bと、偏向電極板 9a、 bの下方に吐出口 3と対向する位置に配設された細胞回収管 10a、 b、 cと、全体の動作を制御する制御部 11とを備える。

[0044] また、電極 6は高圧電源 12に接続されている。さらに、偏向電極板 9a、 bは、それぞれ偏向電源 13a、 bに接続されている。一方、制御部 11は、レーザー光源 7、光検出器 8、高圧電源 12及び偏向電源 13a、 bに対して制御可能に接続されている。

[0045] レーザー光源 7は、フローセル 4内部に収容された細胞に対してレーザー光を照射できる位置に配設されている。また、光検出器 8は、フローセル 4内部に収容された細胞からの SS、 FS及び各種波長の蛍光等を計測できる位置に配設されて、る。

[0046] シース液導入路 2は、シース液をフローセル 4内部に供給する流路である。シース液導入路 2のフローセル 4接続端部以外のもう一方の端部は、シース液を含有する供給部と接続されて、てもよ、。

[0047] 吐出口 3は、解析が完了したフローセル 4内部の細胞がシース液とともにフローセル 4内部から吐出される開口部であり、吐出口 3から吐出された細胞を含むシース液は、まず液柱 14となって落下する。

[0048] フローセル 4は、超音波振動子 (図示省略)を備える。超音波振動子の作用により液柱 14の先端部において液滴 15が形成される。フローセル 4は、レーザー光源 7から照射されるレーザー光が通過でき、かつ内部に収容された細胞からの SS、 FS及び各種波長の蛍光等が通過できる材料により形成されたものである。

[0049] 細胞試料導入路 5は、対象の細胞を含む溶液をフローセル 4内部に供給する流路である。フローセル 4内部に位置する細胞試料導入路 5の先端部以外のもう一方の端部は、対象の細胞を含む溶液を含有する供給部と接続されて!ヽてもよヽ。

[0050] 電極 6は、液滴 15に電荷を付加するための金属板等から構成される。なお、液滴 1 5に含まれる対象の細胞に応じて、負又は正の電荷を付加することができる。また、対象の細胞によっては、電荷を付加しない場合がある。

[0051] レーザー光源 7は、フローセル内部に収容された対象の細胞に対してレーザー光を照射するための光源である。光検出器 8は、フローセル 4内部に収容された細胞からの前方散乱光、側方散乱光及び各種波長の蛍光等を計測するための光検出器でめる。

[0052] 一対の偏向電極板 9a、 bは、吐出口 3から落下する液滴 15に対して、電場を形成する電極板等から構成される。

[0053] 細胞回収管 10a、 b、 cは、液滴 15の電荷に応じて振分けられた液滴 15を回収するように所定の間隔でそれぞれ配設されて!/ヽる。

[0054] 制御部 11は、幹細胞分画の品質管理装置全体の動作を制御する。制御部 11として、マイクロプロセッサ等を使用して、幹細胞分画の品質管理の過程を全て自動制御するようにしてちょい。

[0055] 以上のように構成された幹細胞分画の品質管理装置を用いて、フローサイトメトリーの原理に基づき、接着性幹細胞集団の光学特性を評価し、その結果に基づいて所定の幹細胞分画の存在の確認とその存在比率を評価することができる。図 2に示すフローチャートに従い、図 1に示す幹細胞分画の品質管理装置を用いた幹細胞の品質管理方法を説明する。

[0056] まず、ステップ 1 (図 2において、「S-1」と記載する。以下同様。）で、評価対象の接着性幹細胞集団を用意する。接着性幹細胞集団としては、上述した市販のものか又は試料力分離したものを使用することができる。

[0057] 次いで、ステップ 2(S-2)において、蛍光標識された ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体を用いて、接着性幹細胞集団を蛍光染色する。ここで、用いられる抗体は、 PEや FITCなどの蛍光色素により予め標識し、或いは PEや FITCなどの蛍光色素をコンジュゲートした二次抗体を用いて標識する。接着性幹細胞集団は、その細胞膜表面における ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーの発現量に応じて蛍光色素により標識される。

[0058] 一方、ステップ 3(S- 3)において、接着性幹細胞集団としてステップ 2に用いたものと同一の試料力別容器に分注した試料にっ、て、蛍光標識された非特異的な陰性対照抗体を用いて、蛍光染色する。ステップ 3は、ステップ 2と同時に行ってもよいし、ステップ 2に前後して行うこともできる。ステップ 3で蛍光染色された接着性幹細胞集団は、以下のステップ 4(S-4)で陰性対照として用いられる。なお、用いられる非特異的な陰性対照抗体は、上述した ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体と同様にして蛍光標識される。

[0059] 次に、ステップ 4にお、て、ステップ 2及びステップ 3で染色された各接着性幹細胞集団の蛍光計測を行い、細胞膜表面に発現される ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーの発現量を陰性対照と比較して計測する。まず、操作者は、品質管理装置の電源を投入する。品質管理装置における以下の動作は、予め操作者が設定した条件に従って制御部 11の制御のもとに実行される。次いで、細胞試料として上記の蛍光染色された接着性幹細胞集団を緩衝液中に分散し、細胞試料導入路 5 から、またシース液をシース液導入路 2から、それぞれフローセル 4に供給する。供給された細胞はシースフローの作用により 1列の流れとなる。 1列の流れの細胞にレーザ一光源 7からのレーザー光を照射し、光検出器 8を用いて個々の細胞からの SS、 FS、各種波長の蛍光などを逐次計測する。次に、ステップ 5(S- 5)では、ステップ 4における計測結果から分化水準の異なる (より未分化な)幹細胞分画に属する細胞比率を求めて含有率を評価するとともに、その含有率が一定基準以上である力否かを判定する。ステップ 5によれば、評価対象の接着性幹細胞集団について、その中に含まれる未分化な幹細胞分画の含有率を指標として、品質を管理することができる。

[0060] また、未分ィ匕な幹細胞分画の比率がある特定の基準範囲に収まっていることが要求される用途においては、下記に示す方法により、未分化な幹細胞分画の比率を制御することにより、品質管理を行っても良い。上記の要求がある用途としては、例えば再生医療における細胞培養工程における原料細胞の入荷検査が一例として挙げられる。この場合には増殖能、多分化能を有する未分化な幹細胞が原料として有効である場合があり、この場合は未分ィ匕な幹細胞分画の比率は高いことが好ましい。再生医療の研究目的の場合、ほぼ純粋で均質な、未分化な幹細胞分画が要求されることもある。一方、例えば再生医療における細胞分ィ匕工程終了後の製品組織の出荷検查においては、細胞は目的糸且織特有の細胞に分ィ匕していることが求められる。この場合は増殖能、多分化能を有する未分化な幹細胞の比率は低!、ことが好まヽ場合もある。また再生医療の研究目的の場合、未分化な幹細胞をまったく含まない分画が対照試料として要求されることもある。このように、未分化な幹細胞分画の比率に関する基準範囲は用途によって異なる。いずれの場合でも、各幹細胞分画を定量的に評価して制御することにより、目的に合致した品質管理方法を採用することができる。具体的には、ステップ 5による判定の後、分化水準の異なる (より未分化な)幹細胞分画に属する細胞比率が当該基準範囲に収まって、る場合 (「YES」）には、ステップ 7(S-7)に進む。分化水準の異なる (より未分化な)幹細胞分画に属する細胞比率が当該基準範囲に収まっていない場合 (「NO」）には、ステップ 6(S- 6)に進む。

[0061] 具体的にステップ 6においては、特定の分化水準の幹細胞分画を分取する。このとき、先ず、制御部 11において、得られた SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール)にプロットし、 2次元プロットを構築する。個々のドットは、それぞれ細胞に対応する。得られたプロットの特定の領域を設定し、特定の粒度と大きさを有する細胞集団のみを、蛍光色素の蛍光強度に基づいて分析する。さらに、 ABCトランスポーターファミリ一に属するメンバーに特異的に結合した抗体が有する蛍光色素の蛍光強度により、特定の分化水準の幹細胞分画を含む領域を選択する。

[0062] 次に、ステップ 6において、解析の完了した細胞を含むシース液は、フローセル 4内部から吐出口 3へと吐出され液柱 14となり、フローセル 4に設けた超音波振動子（図示省略)の作用により、さらに液滴 15となる。特定の分化水準の幹細胞分画を分取するには、当該分画を含む液滴 15ができる直前に必要に応じて高圧電源 12を動作させ、電極 6を介して液滴 15に電荷を付与する。例えば、目的の特性 Aを有する細胞については液滴 15形成直前に負、別の特性 Bを有する細胞については正の電荷、それ以外の細胞については電荷を付与しない。目的細胞を含む液滴 15は、偏向電源 13a、 bに接続される偏向電極板 9a、 bの作用により形成された電場中を落下し、液滴の電荷 (負、無、正）に応じてそれぞれ細胞回収管 10a、 b、 cに振り分けられる。即ち、この例では特性 A、 Bを有する細胞がそれぞれ細胞回収管 10a,10bに回収される。以上のように、細胞回収管に特定の分化水準の幹細胞分画を他の分画と分離して回収することができる (ステップ 7)。純粋な幹細胞分画が必要な場合は、回収した細胞をそのまま使用することができる。分化水準の異なる (より未分化な)幹細胞分画に属する細胞の比率がある特定の基準範囲に収まっていることが必要な場合は、上記回収細胞をそれぞれ適切な割合で混合することにより、（より未分ィ匕な)幹細胞分画を所定の比率で含む接着性幹細胞集団を調製、回収することができる (ステップ 7 )。このようにして回収した接着性幹細胞集団について、再度ステップ 4、 5の計測と評価を行ヽ、（より未分化な)幹細胞分画に属する細胞比率を再確認することができる

[0063] なおステップ 5における解析の結果、分化水準の異なる (より未分化な)幹細胞分画に属する細胞比率が所定の基準範囲に収まっている場合には、ステップ 7に進み、細胞試料をそのまま、細胞回収管に回収することもできる。

[0064] このように、ステップ 6、ステップ 7を経ることによって、評価対象の接着性幹細胞集団の品質を調べることが可能である。またさらに当該集団を、分ィ匕水準の異なる (より未分化な)幹細胞分画に属する細胞比率が一定基準範囲に収まるように調製し、品質を管理することもできる。

[0065] なお上記装置、方法は、あくまで幹細胞分画の品質管理装置及び方法の一例であり、本発明に基づく品質管理装置、方法は上記に限定されない。他の品質管理装置及び方法としては、例えば磁気ビーズや、ァフィユティークロマトグラフィー等の分離手段と、一般に用いられる細胞の検出手段とを組み合わせる装置、方法がある。実施例

[0066] 以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

[0067] 〔実施例 1〕

接着件榦細朐奪 fflの焙着

本実施例で実験材料として使用した接着性幹細胞集団は、ヒト骨髄由来の MSCである。この MSCは Cambrex社力購入し、同社推奨プロトコルに従って培養して使用した。添付の技術資料によれば、購入した MSCは、インフォームドコンセントを得て健康なヒトから採取された骨髄に由来し、密度勾配遠心分離法とプラスチック製培養容器底面への接着性に基づいて選択培養することで造血系細胞を除去したものである。なお、購入時の MSCは、 2継代目に凍結保存したものである。

[0068] 上記 MSCを解凍し、 Cambrex社力も購入した培地（商品名 MSCGM、以下、培地） 5mLに懸濁し、遠心分離して、上清を除去した後、細胞を上記培地 30mLに再懸濁し、その一部を使用して細胞数と生細胞率を計測した。次いで、残りの細胞懸濁液を Falcon社の T-25型フラスコ（ポリスチレン製) 6本に播種した。基本的な培養条件として、 37°C、炭酸ガス濃度 5%を採用し、上記フラスコに播種した細胞をウォータージャケット式炭酸ガスインキュベータ中で培養した。なお、細胞密度が約 80%コンフルェントになるたびに継代を繰り返した。さらに継代と継代の間において、 3— 4日に 1回の割合で培地交換を行った。本実施例では、購入後 3回の継代を行った培養日数 23日後の細胞を、以下の細胞試料に使用した。

[0069] 継代の際は、培地を除去した後、 0.05%トリプシン- EDTA含有 PBS (Gibco社) 2mL を注入し、約 3分間 37°Cでインキュベートし、容器に軽く振動を与えて細胞を剥離した。剥離後、直ちに培地 2mLを投入して反応を停止した。得られた細胞懸濁液を遠沈管に移して遠心分離し、上清を除去した後、適量の培地に再懸濁させ、細胞数を計測した後、次世代の培養のために播種を行った。播種密度は概ね 5000個 Zcm²とした。

[0070] 細胞試料及び ,試料の調製

細胞試料を評価する際には、上記培養細胞に対し、継代操作と同様に剥離、反応停止及び上清除去操作を行った後、細胞を PBSlOmLに再懸濁した。次いで、細胞懸濁液に対して、遠心分離、上清除去及び再懸濁の工程からなる洗浄操作を 3回繰り返した。得られた清浄な細胞を PBSに懸濁し、細胞懸濁液 (細胞濃度約 1 X 10⁷個 /mL)を得た。

[0071] 細胞試料を評価するために、目的の抗体を用いて上記細胞試料を蛍光染色した。

なお、陰性対照として、非特異的抗体を用いた細胞試料の染色も並行して行った。本実施例及び比較例にぉ、て使用した蛍光標識抗体及び上記細胞懸濁液 100 μ L( 細胞数約 1 X 10⁶個)に対する抗体容量は以下の通りである：

•CD105-PE:抗ヒト CD105マウスモノクローナル抗体、 R- PE標識、抗体名 SN6、クローン N1- 3A1、 Ancell社、カタログ番号 326- 050 : 2 L。

[0072] 'CD166-FITC :抗ヒト CD166マウスモノクローナル抗体、 FITC標識、クローン 3A6、 RDI社、カタログ番号 RDI- CD166- 3FT: 2 ;z L。 [0073] 'ABCG2-PE:抗ヒト ABCG2マウスモノクローナル抗体、 PE標識、クローン 5D3、 eBioscience社、カタログ番号 12- 8888 : 20 μ L。

[0074] '陰性対照（IgGl- FITC)：マウス IgGl、 FITC標識、コールターィムノテック社、カタ口グ番号 IM0639 : 20 L。

[0075] ·陰性対照 (IgGl-PE)：マウス IgGl、 PE標識、コールターィムノテック社、カタログ番号議670 : 20 。

[0076] ·陰性対照（IgG2b- PE)：マウス IgG2b、 PE標識、 eBioscience社、カタログ番号

[0077] 上記抗体による細胞試料の蛍光染色手順は以下の通りである。チューブに上記蛍光標識抗体 (1種もしくは 2種の目的の抗体及び/又は陰性対照抗体)を所定量分注し、そこに上記細胞懸濁液 100 L (細胞数約 1 X 10⁶個）をカ卩えて、 4°C、 45分間インキュペートした。次いで、抗体及び細胞懸濁液を含むチューブに PBS 2mLを加え、遠心分離し、上清を除去する洗浄工程を 2回繰り返し、最後に PBS 500 Lで再懸濁することにより、蛍光染色試料を調製した。

[0078] セルソーターによる解析

ベックマンコールター社のセルソーター Epics Altra Type I型を、メーカーの推奨条件で使用して、上記蛍光染色試料を測定した。

[0079] 以下、本実施例で採用したセルソーターによる測定についてより詳細に説明する。

488nm、 15mWのアルゴンイオンレーザーをレーザー光源として用いて、 FITC及び PE による蛍光信号強度をそれぞれ 525、 575應のバンドパスフィルターを備えた光検出器で計測した。また FS及び SSの信号強度も光検出器により測定した。なお、 FSが極めて低い場合は、完全な細胞ではなく細胞破壊断片とみなし、データ処理の対象から除外した。

[0080] 陰性対照を用いて、各光検出器の感度を調節した。即ち、 4桁の範囲 (対数で- 1一 +3)の蛍光強度を横軸とするヒストグラムにおいて、陰性対照の集団が、横軸の下 1/4 (対数で- 1一 0)の領域の中央に来るように設定した。また、特定の色素の蛍光が目的以外の蛍光検出器に対して分光干渉を及ぼすことによる誤差を補償するため、計測値を、補正マトリックスを用いる数値演算により補正した。 [0081] 目的の蛍光標識抗体で標識した細胞を評価した結果の一例を、図 3及び図 4に示す。測定した染色試料は、購入後 3回の継代を行った培養日数 23日後の MSCを細胞試料とし、 CD166-FITC、 ABCG2-PEで 2重標識した染色試料 (以下、「染色試料 1」と呼ぶ)である。

[0082] 図 3は、染色試料 1に含まれる個々の細胞について観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロットである。なお、個々のドットはそれぞれ細胞に対応する。

[0083] 図 3から判るように、 SS及び FSは、ともに信号強度が広範囲に分散した。図 3の全領域 (以下、「領域 16」と呼ぶ)）に表示された全てのドット、即ち全ての細胞に関して以降の解析を行った。

[0084] 図 4は、染色試料 1における個々の細胞にっ、て観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも対数スケール）にプロットした 2次元プロットでめる。

[0085] 図 4から判るように、横軸にプロットした FITC、即ち CD166については約 95.4%の細胞が陰性対照と比べて蛍光信号強度が高い陽性領域 (対数で約 0.3— 3)に位置した。即ち、使用した MSCのほとんどは、 CD166陽性（以下「CD166 +」と呼ぶ）であり、上述した非特許文献 4に記載の結果と同様であった。一方、縦軸にプロットした PE、即ち ABCG2については、約 97.7%の細胞が陰性対照と同じ領域に位置した。即ち、 MSCの大多数は、 ABCG2陰性（以下、「ABCG2-」と表記する）であった。図 4おいて、この CD 166 + /ABCG2—である細胞集団が存在する領域を円形の破線で示す (領域 17 。以下、領域 Xとそれに含まれる細胞集団 Xとを同じ記号 Xにより表記する。

[0086] さらに図 4から判るように、 ABCG2について陰性対照と比較して約 2— 3桁発現強度が高い、 ABCG2陽性 (以下、「ABCG2 +」と表記する)の第 2の細胞集団が存在することが見出された。図 4において、この細胞集団が存在する領域を長円形の破線で示す (領域 18a)。

[0087] 図 4から明らかなように、領域 17aと領域 18aは縦方向の中心位置が約 2.5桁離れているばかりでなぐ両領域の間にはほとんど細胞が存在しないことから、それぞれの領域に含まれる細胞集団は ABCG2の発現量が決定的に異なる別の細胞集団と考えられた。領域 17aに含まれる細胞集団 17aと、領域 18aに含まれる細胞集団 18aの数の全体 (細胞集団 16)に対する比率は、それぞれ約 94.6、 1.3であった。細胞集団 17 a及び細胞集団 18aは、いずれも CD166 +の領域に含まれるため、いずれも従来の判断基準によれば MSCの範疇に含められる。従って、本実施例により、 MSCの一分画に ABCG2 +である新たな幹細胞分画が細胞集団 18aとして初めて見出された。

[0088] 細胞の大さごの詳細な解析

以上の解析は、図 3の領域 16、即ち全ての細胞に関して行った。図 3を詳細に観察すると、図の左下に SS、 FSともに信号強度が低い細胞集団が確認される。そこで図 3 を図 5として再掲した上で、図 5において、上記細胞集団が集中する領域 19と、それ以外の SS、 FSともに信号強度が高い細胞が分布する領域 20とを区分した。次いで、それぞれの細胞集団 19、 20について独立に解析を行った。なお、細胞集団 19と細胞集団 20との細胞数の比は、約 5 : 95であった。

[0089] 図 6は、図 5の細胞集団 20について上記細胞集団 16と同様に蛍光計測を行って得られた 2次元プロットである。

[0090] 図 4及び 6から判るように、細胞集団 20は、細胞集団 16と同様の結果であった。横軸の CD166-FITCについては、約 98.8%の細胞が陽性領域に入り、当該細胞のほとんどは CD166 +であった。また縦軸の ABCG2-PEについては、約 97.6%の細胞が陰性領域に入り、当該細胞の大多数は ABCG2—であった。図 6において、この CD166 + /ABCG2-である主な細胞集団が存在する領域を、円形の破線で示した (領域 17b) 。一方、 CD166+/ABCG2 +である細胞集団も確認された。図 6において、この細胞集団が存在する領域を長円形の破線で示す (領域 18b)。細胞集団 17bと、細胞集団 18bの数の全体 (細胞集団 20)に対する比率は、それぞれ約 97.7 : 1.4であった。従って、細胞集団 16と同様に、細胞集団 20においても、 ABCG2 +である新たな幹細胞分画が細胞集団 18bとして見出された。

[0091] 以下において、本発明に係る幹細胞分画である細胞集団 18a又は 18bの細胞を PAAC(pluripotent adhesive adult cell)と表記し、残り大多数の従来の MSCに対応すると考えられる細胞集団 17a又は 17bの細胞を RMSC (remainder MSC)と表記する。

[0092] 図 7は、図 5の細胞集団 19について、上記細胞集団 16と同様の蛍光計測を行って得られた 2次元プロットである。

[0093] 図 4及び 7から判るように、細胞集団 19は、細胞集団 16の 2次元プロットの結果と異なる結果となった。具体的には、横軸の CD166-FITCについては約 36%の細胞が CD166 +で、残りの約 64%は CD166—であった。また縦軸の ABCG2- PEについては、ほとんど 100%の細胞が ABCG2—であった。図 7において、 CD166+もしくは CD166— (以降、「 + Z—」と表記する）であり、かつ ABCG2-である細胞集団が存在する領域を、長円形の破線で示す (領域 21)。

[0094] このように、 MSCのうち、 SS、 FSともに信号強度が低い小さな細胞集団 19には、 ABCG2 +である幹細胞分画は確認されな力つた。

[0095] 〔比較例〕

本比較例においては、従来の MSCマーカーである、 CD166及び CD105に対する蛍光標識抗体を用いて標識した細胞を、実施例 1と同様にして解析を行った。用いた染色試料は、実施例 1で同様に調製した細胞試料を CD166-FITC及び CD105-PEで 2重標識したものである。以下、この染色試料を染色試料 2と記す。

[0096] 図 8は、染色試料 2に含まれる個々の細胞について観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸にプロットした 2次元プロットである。

[0097] 図 3及び 8から判るように染色試料 2は、染色試料 1とほぼ同様のプロット結果となつた。次いで、図 8中、 SS及び FSの信号強度がともに低い領域を領域 22、 SS及び FSの信号強度がともに高い領域を領域 23と区別して、個々に解析した。

[0098] 図 9は、染色試料 2のうち領域 23に含まれる細胞集団について観測された FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (V、ずれも対数スケール)でプロットした 2次元プロットである。

[0099] 図 9から判るように、図 9の横軸にプロットした FITC、即ち CD166については 96.8%以上の細胞が陰性対照と比べて蛍光信号強度が高い陽性領域 (対数で約 0.3— 1.5)に位置した。従って、 MSCのほとんどは CD166 +であり、実施例 1と同様の結果であつた。一方、縦軸にプロットした PE、即ち CD105についても、約 99.5%の細胞が陰性対照と比べて蛍光信号強度が高い陽性領域 (対数で約 1.0— 2.5)に位置した。従って、 MSCの大多数は CD105 +であり、上述した非特許文献 4に記載の結果と同様であつた。図 9において、この CD166+/CD105 +である細胞集団が存在する領域を、円形の破線で示す (領域 24)。細胞集団 24は単一の領域にほぼ均一に分布しており、それ以上分割することは不可能であった。

[0100] また、図 9から判るように、従来の MSCマーカーである、 CD166及び CD105に対する蛍光標識抗体を使用して標識した細胞を用いた評価では、 MSCは単一な細胞集団 24とみなされていた。一方、図 4から判るように、新しいマーカーである ABCG2に対する蛍光標識抗体を使用して標識した細胞を用いた評価では、同一の MSCが細胞集団 17aと 18aとに分割された。即ち、従来単一とみなされていた MSCは、新しいマ一力一 ABCG2の細胞膜における発現の多寡により、 2つの細胞集団に分割可能であることが初めて見出された。

[0101] 図 10は、染色試料 2のうち領域 22に含まれる個々の細胞について観測された

FITC及び PEの蛍光信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (V、ずれも対数スケール)でプロットした 2次元プロットである。

[0102] 図 10の横軸にプロットした FITC、即ち CD166については約 24%の細胞が陰性対照と比べて蛍光信号強度が高い陽性領域に位置した。一方、縦軸にプロットした PE、即ち CD105については、約 60%の細胞が陰性対照と比べて蛍光信号強度が高い陽性領域に位置した。し力しながら、ほとんどの細胞は、図中の領域 25で示した範囲に広がって分布し、特に局在する傾向は認められな力つた。領域 25は FITC、 PEともに陰性と陽性との領域にまたがっているため、この細胞集団 25については、 CD166、 CD105ともに + Z—と判断される。即ち、領域 22に含まれる細胞集団は、従来の MSC とやや異なる性質を有すると考えられた。

[0103] 〔実施例 2〕

PAACの分離

実施例 1にお、て同定された新規な幹細胞分画の細胞である PAACを、フローサイトメトリーの原理に基づくセルソーターを用いて、以下の手順により RMSC力も分離した。

[0104] セルソーターとして上記 Epics Altraを使用し、また、シース液として滅菌済みの PBS を用いた。装置の動作条件は、装置メーカー推奨のプロトコルに準拠して設定した（フローセルの振動周波数 22kHz、ドライブパワー 60、ディレイ 29.7)。

[0105] 図 4における RMSCに対応する領域 17a及び PAACに対応する 18aにゲートを設け、染色試料 1と同様に調製した染色試料 (以下、「染色試料 3」と呼ぶ）について、 RMSCと PMSCとがそれぞれ異なる容器に分取するソーティング操作を行った。この際、なお、分取細胞数は 100個に設定し、分取容器には事前に MSC培養用の培地をカロえて力もソーティング操作を行った。領域 18aからは 100個の細胞が回収されたが、領域 17aはコインシデンスストップ（目的外の細胞が近接して流れた際、混入防止のために分取を差し控える機能)などによるロスがあつたため、 87個の細胞が回収された。

[0106] 分離した PAACの培着と Hoechst33342による染色性の評価

上記で得られた RMSC及び PAACをそれぞれ遠心分離してペレット化した。次!、で上清を除去した後、培地 0.4mLに再懸濁して、平底の 24穴型プレートのゥエルに播種し、同一条件で 2週間培養した。 2週間後、細胞を剥離して計数したところ、 PAAC の個数は RMSCよりも約 5倍多力つた。従って、 PAACは RMSCよりも細胞増殖能が高いと考えられた。

[0107] 次に、 RMSC及び PAACの Hoechst33342による染色性を評価した。上記のように剥離した細胞を、 PBSで 2回洗浄した後、 4 gZmLの Hoechst33342溶液中で 37°C、 45 分間インキュベートした。インキュベーション後、蛍光顕微鏡により細胞染色を観察した。なお、蛍光顕微鏡は、励起波長 350nm、検出波長 450nmに設定した。その結果、 PAACは、 RMSCよりも Hoechst33342に基づく蛍光が弱かった。従って、 PAACは RMSCよりも Hoechst33342の排出能力が高いと考えられた。よって、増殖性と

Hoechst33342の排出能力の観点から、 PAACは、 RMSCと比較してより未分化な幹細胞分画であると考えられた。

[0108] 〔実施例 3〕

本実施例は、使用した MSCが実施例 1で用いた MSCと異なる以外は、実施例 1と同様である。具体的には、使用した MSCは、実施例 1の MSCと同じ原料細胞に基づいて平行して培養した。 2週間前の継代時に、本実施例の細胞のみを、最後の 1回の継代を省略して、最後の 2週間の間、培地交換のみを行った。

[0109] 培養終了後、この細胞を剥離し、 CD166-FITC、 ABCG2-PEで 2重標識したものを染色試料 (以下、「染色試料 4」と呼ぶ)とした。

[0110] 次いで、実施例 1と同様にして、セルソーターにより染色試料 4を測定した。結果を図 11に示す。

[0111] 図 11は、染色試料 4に含まれる個々の細胞について観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロットである。図 11から判るように、染色試料 4は、図 5に示される染色試料 1と定性的に同様の結果となった。 SS、 FSともに信号強度が低い細胞が集中する領域 26と、 SS、 FSともに信号強度が高い細胞が分布する領域 27とに区分された。細胞集団 26と 27の数の比は、約 4 : 95であった。

[0112] 図 12は、図 11に示される細胞集団 27についての FITC及び PEの蛍光強度をそれぞれ横軸、縦軸 0、ずれも対数スケール)にプロットした 2次元プロットである。

[0113] 図 12から判るように、細胞集団 27のプロットの結果は図 6に示される細胞集団 20の結果と類似であった。横軸の CD166-FITCについては、約 96.6%の細胞が陽性領域に位置し、ほとんどの細胞が CD166 +であった。また縦軸の ABCG2-PEについては、約 98.9%の細胞が陰性領域に位置し、当該細胞の大多数は ABCG2—であった。図 1 2において、この CD166+/ABCG2—である主な細胞集団が存在する領域を、円形の破線で示す (領域 17c)。また、 CD166+/ABCG2 +である細胞集団を長円形の破線で示す (領域 18c)。細胞集団 17cと、細胞集団 18cの数の細胞集団 27に対する比率は、それぞれ約 97.7、 0.4であった。従って、本実施例においても、 MSCの一分画に、 SS、 FSともに信号強度が強、ABCG2 +である新たな幹細胞分画が細胞集団 18cとして見出された。

[0114] 一方、図 6と図 12とを比較すると、以上の類似点以外にやや異なる点も確認された。例えば、図 6においては CD166—/ ABCG2—である細胞は約 1%とほとんど無いのに対し、図 12においては CD166—/ ABCG2—である細胞の割合が約 3%とやや多かった。これは、本実施例では継代せずに培養を 2週間継続したため、 MSCの性質が一部変化し、 CD166の発現量が低下したためと考えられた。また、図 6に示される細胞集団 18bと比較すると、図 12に示される細胞集団 18cの数の全体に対する比率は低く、また細胞集団 18cと細胞集団 17cとの間に位置する細胞の数もやや多ぐ 18cと 17 cとの区分がやや不明瞭であった。これは PAACの一部が RMSCへと変化しつつあり、 ABCG2発現量が低下したためと考えられた。

[0115] 本実施例により、約 2週間、 MSCを継代せずとも、 MSCの一部は ABCG2を発現し、 PAACが維持されることが見出された。また実施例 1と本実施例の比較によれば、 PAACの比率を高く維持し、 RMSCへの変化を抑制するためには、継代操作を定期的に行い、細胞がコンフルェントである状態を極力回避することが重要であることが新たに見出された。

[0116] 〔実施例 4〕

本実施例は、使用した MSCが実施例 1で用いた MSCと異なる以外は、実施例 1と同様である。具体的には、使用した MSCは、実施例 1の MSCと同じ原料細胞に基づいて並行して培養したが、購入後 7回の継代を行った培養日数 89日後の細胞を使用した。

[0117] 培養終了後、この細胞を剥離し、 CD166-FITC、 ABCG2-PEで 2重標識したものを染色試料 (以下、「染色試料 5」と呼ぶ)とした。

[0118] 次いで、実施例 1と同様にして、セルソーターにより染色試料 5を測定した。結果を図 13に示す。

[0119] 図 13は、染色試料 5に含まれる個々の細胞について観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロットである。図 13カゝら判るように、染色試料 5は、図 5に示される染色試料 1及び図 11に示される染色試料 4と定性的に同様の結果となった。 SS、 FSともに信号強度が低い細胞が集中する領域 28と、 SS、 FSともに信号強度が高い細胞が分布する領域 29とに区分された。細胞集団 28と 29の数の比は、約 5 : 94であった。

[0120] 図 14は、図 13に示される細胞集団 29についての FITC及び PEの蛍光強度をそれぞれ横軸、縦軸 0、ずれも対数スケール)にプロットした 2次元プロットである。

[0121] 図 14力も判るように、細胞集団 29のプロットの結果は図 12に示される細胞集団 27 の結果と類似であった。横軸の CD166-FITCについては、約 98.8%の細胞が陽性領域に位置し、ほとんどの細胞が CD166 +であった。また縦軸の ABCG2-PEについては、約 98.6%の細胞が陰性領域に位置し、当該細胞の大多数は ABCG2—であった。図 14において、この CD166+/ABCG2—である主な細胞集団が存在する領域を、円形の破線で示す (領域 17d)。また、 CD166+/ABCG2 +である細胞集団を長円形の破線で示す (領域 18d)。細胞集団 17d及び細胞集団 18dの数の細胞集団 29に対する比率は、それぞれ約 97.9、 0.4であった。従って、本実施例においても、 MSCの一分画に、 SS、 FSともに信号強度が強い ABCG2 +である新たな幹細胞分画が細胞集団 1 8dとして見出された。

[0122] 一方、図 12に示される細胞集団 27の結果と同様に、図 6と図 14とを比較すると、図 6に示される細胞集団 18bに対し、図 14に示される細胞集団 18dの数は、全体に対する比率が低く、また細胞集団 18dと細胞集団 17dとの間に位置する細胞の数もやや多ぐ 18dと 17dとの区分がやや不明瞭であった。これは PAACの一部が RMSCへと変化しつつあり、 ABCG2発現量が低下したためと考えられた。

[0123] 本実施例により、 12週間以上、 MSCを継代しながら培養しても、 MSCの一部は

ABCG2を発現し、 PAACが維持されることが見出された。また実施例 1と本実施例の比較によれば、 PAACの比率を高く維持し、 RMSCへの変化を抑制するためには、培養期間を短く維持することが重要であることが新たに見出された。

[0124] 〔実施例 5〕

本実施例は、使用した MSCが実施例 1で用いた MSCと異なる以外は、実施例 1と同様である。具体的には、使用した MSCは、実施例 1の MSCと同じ原料細胞に基づいて平行して培養したが、実施例 4と同様に培養日数 89日後の細胞を使用した。ただし、実施例 4とは異なり、最後の継代を 1回省略した。

[0125] 培養終了後、この細胞を剥離し、 CD166-FITC、 ABCG2-PEで 2重標識したものを染色試料 (以下、「染色試料 6」と呼ぶ)とした。

[0126] 次いで、実施例 1と同様にして、セルソーターにより染色試料 6を測定した。結果を図 15に示す。

[0127] 図 15は、染色試料 6に含まれる個々の細胞について観測された SSと FSの信号強度をそれぞれ横軸、縦軸 (いずれも真数スケール）にプロットした 2次元プロットである。図 15から判るように、染色試料 6は、図 5に示される染色試料 1、図 11に示される染色試料 4及び図 13に示される染色試料 5と定性的に同様の結果となった。 SS、 FSともに信号強度が低い細胞が集中する領域 30と、 SS、 FSともに信号強度が高い細胞が分布する領域 31とに区分された。細胞集団 30と 31の数の比は、約 6 : 93であった。

[0128] 図 16は、図 15に示される細胞集団 31についての FITC及び PEの蛍光強度をそれぞれ横軸、縦軸 0、ずれも対数スケール)にプロットした 2次元プロットである。

[0129] 図 16から判るように、細胞集団 31のプロットの結果は図 14に示される細胞集団 29 の結果と類似であった。横軸の CD166-FITCについては、約 98%の細胞が陽性領域に位置し、ほとんどの細胞が CD166 +であった。また縦軸の ABCG2-PEについては、約 97.6%の細胞が陰性領域に位置し、当該細胞の大多数は ABCG2—であった。図 1 6において、この CD166+/ABCG2—である主な細胞集団が存在する領域を、円形の破線で示す (領域 17e)。また、 CD166+/ABCG2 +である細胞集団を長円形の破線で示す (領域 18e)。細胞集団 17e及び細胞集団 18eの数の細胞集団 31に対する比率は、それぞれ約 96.9、 0.5であった。従って、本実施例においても、 MSCの一分画に、 SS、 FSともに信号強度が強い ABCG2 +である新たな幹細胞分画が細胞集団 18 eとして見出された。

[0130] 一方、図 12に示される細胞集団 27の結果及び図 14に示される細胞集団 29の結果と同様に、図 6と図 16とを比較すると、図 6に示される細胞集団 18bに対し、図 16 に示される細胞集団 18eの数は、全体に対する比率がやや低ぐまた細胞集団 18e と細胞集団 17eとの間に位置する細胞の数もやや多ぐ 18eと 17eとの区分がやや不明瞭であった。これは PAACの一部が RMSCへと変化しつつあり、 ABCG2発現量が低下したためと考えられた。

[0131] 本実施例により、 12週間以上、 MSCを継代しながら培養し、最後の継代を省略しても、 MSCの一部は ABCG2を発現し、 PAACが維持されることが見出された。また実施例 1と本実施例の比較によれば、 PAACの比率を高く維持し、 RMSCへの変化を抑制するためには、継代操作を定期的に行い、細胞がコンフルェントである状態を極力回避するとともに、培養期間を短く維持することが重要であることが新たに見出された。

[0132] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

[I] 接着性幹細胞集団において、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体が結合することを特徴とする幹細胞分画。

[2] 接着性幹細胞集団において、 ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーを細胞膜表面に発現して!/ヽることを特徴とする幹細胞分画。

[3] 間葉系幹細胞集団において、より未分ィ匕な間葉系幹細胞分画であることを特徴とする、請求項 1又は 2記載の幹細胞分画。

[4] 上記接着性幹細胞集団は抗 CD73抗体、抗 CD105抗体及び抗 CD166抗体力成る群から選択される 1以上の抗体が結合することを特徴とする、請求項 1又は 2記載の幹細胞分画。

[5] 上記接着性幹細胞集団は CD73、 CD105及び CD166から成る群力も選択される 1以上の抗原を細胞膜表面に発現していることを特徴とする、請求項 1又は 2記載の幹細胞分画。

[6] 上記接着性幹細胞集団は成体の骨髄由来であることを特徴とする、請求項 1又は 2 記載の幹細胞分画。

[7] 上記接着性幹細胞集団は培養の間に培養容器底面に接着したものであることを特徴とする、請求項 1又は 2記載の幹細胞分画。

[8] 前記培養容器底面はプラスチック製であることを特徴とする、請求項 7記載の幹細胞分画。

[9] 上記メンバーは ABCG2であることを特徴とする、請求項 1又は 2記載の幹細胞分画

[10] ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体を用いて、接着性幹細胞集団から所定の幹細胞分画を分離する方法。

[II] 間葉系幹細胞集団において、より未分化な間葉系幹細胞分画を分離することを特徴とする、請求項 10記載の幹細胞分画を分離する方法。

[12] 上記接着性幹細胞集団は抗 CD73抗体、抗 CD105抗体及び抗 CD166抗体力成る群から選択される 1以上の抗体が結合することを特徴とする、請求項 10記載の幹細胞分画を分離する方法。

[13] 上記接着性幹細胞集団は CD73、 CD105及び CD166から成る群力も選択される 1以上の抗原を細胞膜表面に発現して、ることを特徴とする、請求項 10記載の幹細胞分画を分離する方法。

[14] 上記接着性幹細胞集団は成体の骨髄由来であることを特徴とする、請求項 10記載の幹細胞分画を分離する方法。

[15] 試料から接着性幹細胞集団を分離する工程を含む、請求項 10記載の幹細胞分画を分離する方法。

[16] 前記工程は、培養の間に培養容器底面に接着した接着性幹細胞集団を分離する工程であることを特徴とする、請求項 15記載の幹細胞分画を分離する方法。

[17] 前記培養容器底面はプラスチック製であることを特徴とする、請求項 16記載の幹細胞分画を分離する方法。

[18] 上記メンバーは ABCG2であることを特徴とする、請求項 10記載の幹細胞分画を分離する方法。

[19] ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体を用いて、接着性幹細胞集団にぉ、て所定の幹細胞分画を標識し、

標識された幹細胞分画に属する細胞比率を計測することを特徴とする幹細胞の品質管理方法。

[20] 上記所定の幹細胞分画は、間葉系幹細胞集団においてより未分ィ匕な間葉系幹細胞分画であることを特徴とする、請求項 19記載の幹細胞の品質管理方法。

[21] 上記接着性幹細胞集団は抗 CD73抗体、抗 CD105抗体及び抗 CD166抗体力成る群から選択される 1以上の抗体が結合することを特徴とする、請求項 19記載の幹細胞の品質管理方法。

[22] 上記接着性幹細胞集団は CD73、 CD105及び CD166から成る群力も選択される 1以上の抗原を細胞膜表面に発現していることを特徴とする、請求項 19記載の幹細胞の品質管理方法。

[23] 上記接着性幹細胞集団は成体の骨髄由来であることを特徴とする、請求項 19記載の幹細胞の品質管理方法。

[24] 接着性幹細胞集団から所定の幹細胞分画を分取する工程を含む、請求項 19記載の幹細胞の品質管理方法。

[25] 上記メンバーは ABCG2であることを特徴とする、請求項 19記載の幹細胞の品質管理方法。

[26] ABCトランスポーターファミリーに属するメンバーに特異的な抗体により標識された所定の幹細胞分画を含む接着性幹細胞集団を供給する供給部と、

標識された上記所定の幹細胞分画を検出する検出部とを備え、

上記検出部で検出された上記所定の幹細胞分画に属する細胞比率を計測することを特徴とする、幹細胞分画の品質管理装置。

[27] 回収部を備え、

上記所定の幹細胞分画に属する細胞比率を計測した後に、上記回収部で上記接着性幹細胞集団を回収することを特徴とする、請求項 26記載の幹細胞分画の品質管

[28] 上記供給部と上記回収部との間に配設された分離部を備え、

上記所定の幹細胞分画に属する細胞比率を計測した後に、上記分離部で上記接着性幹細胞集団を幹細胞分画毎に分離し、上記回収部で上記所定の幹細胞分画を回収することを特徴とする、請求項 27記載の幹細胞分画の品質管理装置。

[29] 上記所定の幹細胞分画は、間葉系幹細胞集団においてより未分ィ匕な間葉系幹細胞分画であることを特徴とする、請求項 26記載の幹細胞分画の品質管理装置。

[30] 上記接着性幹細胞集団は抗 CD73抗体、抗 CD105抗体及び抗 CD166抗体力成る群から選択される 1以上の抗体が結合することを特徴とする、請求項 26記載の幹細胞分画の品質管理装置。

[31] 上記接着性幹細胞集団は CD73、CD105及び CD166から成る群力も選択される 1以上の抗原を細胞膜表面に発現して、ることを特徴とする、請求項 26記載の幹細胞分画の品質管理装置。

[32] 上記接着性幹細胞集団は成体の骨髄由来であることを特徴とする、請求項 26記載の幹細胞分画の品質管理装置。

[33] 上記メンバーは ABCG2であることを特徴とする、請求項 26記載の幹細胞分画の品