CN104862403B - 一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法 - Google Patents

一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104862403B
CN104862403B CN201510288801.7A CN201510288801A CN104862403B CN 104862403 B CN104862403 B CN 104862403B CN 201510288801 A CN201510288801 A CN 201510288801A CN 104862403 B CN104862403 B CN 104862403B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
introns
mycobacterium tuberculosis
gyra
spoligotyping
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510288801.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104862403A (zh
Inventor
李庆阁
曾小红
许晔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen Zeesan Biotech Co.,Ltd.
Original Assignee
Xiamen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen University filed Critical Xiamen University
Priority to CN201510288801.7A priority Critical patent/CN104862403B/zh
Publication of CN104862403A publication Critical patent/CN104862403A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104862403B publication Critical patent/CN104862403B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，涉及结核分枝杆菌。1)在直接重复序列上设计一对通用引物扩增所有间隔子；在GyrA保守区域设计一对引物；2)根据43个间隔子序列、GyrA序列设计与之特异杂交的双标记荧光探针，并将探针设计为4组，每组配备相同的荧光基团，通过调整探针长度和/或碱基组成对每条探针的熔点值进行人为控制；3)将荧光探针分布在三个反应管，通过反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，每个间隔子分别形成一个三维编码并由软件自动读取结果。只需一步操作，操作简便、特异性高、重复性好、耗时短，价格相对低廉，将为探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力的工具。

Description

一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法
技术领域
本发明涉及结核分枝杆菌，尤其是涉及一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法。
背景技术
结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，其中以肺结核最为常见，已成为全球性重大公共卫生问题。结核分枝杆菌复合群包括人型结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。传统上结核分枝杆菌复合群的分类是依据不同种的分枝杆菌在生长、形态、生化特性上的差异进行分类，但这一分类方法已远远不能满足现代结核病预防控制工作的需要。随着科技的进步和结核分枝杆菌基因组测序工作的完成，人们对结核分枝杆菌种间基因的变异情况有了深入的理解。通过对结核分枝杆菌菌株基因型的鉴定，可用于研究结核病暴发流行、传染源的寻找和追踪、耐药菌株的传播和实验室污染等，对于了解结核病的传播模式具有重要的意义。
目前，被广泛应用于结核分枝杆菌的分型方法以Spoligotyping[1]、MIRU-VNTR[2]和IS6110-RFLP[3]三种方法最具有代表性。目前国内外临床上常用的结核分枝杆菌的分型方案通常是多种分型方法联合检测以同时保证临床检测的效率和分型结果的准确性[4]。首先，采用Spoligotyping分型方法对待检菌株的基因型进行初步划分，图谱不一致的两个菌株则直接归类于不同间隔子寡核苷酸分型簇，即不同的基因型。具有相同图谱的菌株则视为归属于同一分型簇；进而，采用VNTR和IS6110-RFLP分型方法对同种分型簇菌株的基因型再次细分；最后，根据三种分型方法的结果共同确定待检菌株的基因型。因此，Spoligotyping已被公认为结核菌分型的一线方法[5]。
Spoligotyping分型方法，即间隔寡核苷酸分型方法，是通过识别结核分枝杆菌基因组DNA间隔子序列来划分结核分枝杆菌的类型[1]。Spoligotyping中的一个重要环节是间隔子PCR产物的识别，传统的Spoligotyping采用固相膜杂交技术来识别间隔子PCR产物。传统的固相膜杂交技术虽然具备检测流程成熟及试剂成本低廉的优点，但是需要较多的人工操作、检测时间长，并且样本检测通量也不能够满足临床需要。这两个技术瓶颈严重阻碍了Spoligotyping的临床推广，对此科学工作者提出了采用基因芯片[6,7]、编码微球[8,9]和质谱检测[10,11]等技术来替代固相膜杂交技术，目前已报道的Spoligotyping改进技术虽然提高了通量，检测时间也大大缩短，但是这些技术均未摆脱PCR开管后处理的检测模式，容易造成PCR产物的污染，并且由于需要一些大型仪器，难以在临床上得到广泛应用。因此，开发更为快速、简便、高通量的间隔子PCR产物识别技术成为了Spoligotyping发展的关键。
综上所述，开发出一种新型、高通量、易用且标准化的结核菌溯源新技术将对探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力工具，为建立结核病监测网络，实现结核菌感染的实时监控和传播途径的及时确认提供技术支撑，对于结核病的防控具有重要的意义和价值。
参考文献：
1.Kamerbeek J,Schouls L,Kolk A,van Agterveld M,van Soolingen D,Kuijper S,et al.Simultaneous detection and strain differentiation ofmycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology.Journal of ClinicalMicrobiology1997；35:907-14.
2.Supply P,Magdalena J,Himpens S,Locht C.Identification of novelintergenic repetitive units in a mycobacterial two‐component systemoperon.Molecular microbiology 2003；26:991-1003.
3.Braden CR,Morlock GP,Woodley CL,Johnson KR,Colombel AC,Cave MD,etal.Simultaneous infection with multiple strains of mycobacteriumtuberculosis.Clinical Infectious Diseases 2001；33:e42-e7.
4.Goguet de la Salmoniere Y-O,Li HM,Torrea G,Bunschoten A,Van EmbdenJ,Gicquel B.Evaluation of spoligotyping in a study of the transmission ofmycobacterium tuberculosis.Journal of Clinical Microbiology 1997；35:2210-4.
5.Kremer K,Van Soolingen D,Frothingham R,Haas W,Hermans P,Martin C,etal.Comparison of methods based on different molecular epidemiological markersfor typing of mycobacterium tuberculosis complex strains:Interlaboratorystudy of discriminatory power and reproducibility.Journal of ClinicalMicrobiology1999；37:2607-18.
6.Song EJ,Jeong HJ,Lee SM,Kim CM,Song ES,Park YK,et al.A DNA chip-based spoligotyping method for the strain identification of mycobacteriumtuberculosis isolates.Journal of microbiological methods 2007；68:430-3.
7.Ruettger A,Nieter J,Skrypnyk A,Engelmann I,Ziegler A,Moser I,etal.Rapid spol igotyping of mycobacterium tuberculosis complex bacteria by useof a microarray system with automatic data processing and assignment.Journalof Clinical Microbiology 2012；50:2492-5.
8.Cowan LS,Diem L,Brake MC,Crawford JT.Transfer of a mycobacteriumtuberculosis genotyping method,spoligotyping,from a reverse line-blothybridization,membrane-based assay to the luminex multianalyte profilingsystem.Journal of Clinical Microbiology 2004；42:474-7.
9.Abadia E,Zhang J,Ritacco V,Kremer K,Ruimy R,Rigouts L,et al.The useof microbead-based spoligotyping for mycobacterium tuberculosis complex toevaluate the quality of the conventional method:Providing guidelines forquality assurance when working on membranes.BMC infectious diseases 2011；11:110.
10.Honisch C,Mosko M,Arnold C,Gharbia SE,Diel R,Niemann S.Replacingreverse line blot hybridization spoligotyping of the mycobacteriumtuberculosis complex.Journal of Clinical Microbiology 2010；48:1520-6.
11.Shitikov E,Ilina E,Chernousova L,Borovskaya A,Rukin I,Afanas’ev M,et al.Mass spectrometry based methods for the discrimination and typing ofmycobacteria.Infection,Genetics and Evolution 2011.
发明内容
本发明的目的在于建立一种新型、高通量、易用且标准化的结核菌溯源新技术，提供一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法。
本发明包括如下步骤：
(1)引物设计：在结核分枝杆菌基因组中高度同源的直接重复序列上设计一对通用引物，并利用这对通用引物扩增出所有间隔子；在结核分枝杆菌管家基因GyrA序列中选取保守区域设计一对扩增引物，引物序列如表1所示；
表1.引物序列
(2)探针设计：根据结核分枝杆菌复合群43个间隔子的DNA序列设计43条能够与之特异杂交的双标记荧光探针，在GyrA引物扩增产物选取保守区域设计一条与之特异杂交的双标记荧光探针；同时将探针设计为4组，每组的探针配备相同的荧光基团和淬灭基团作为一个检测通道，并通过调整探针的长度和/或碱基组成对每条探针的熔点温度值进行人为控制，使得同一检测通道内针对不同间隔子序列的荧光探针的熔点温度值都间隔合适的差值，探针序列及探针修饰如表2所示；
表2.探针序列
(3)三维编码：将43个间隔子对应的双标记荧光探针分布在三个反应管中，通过所在反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，每个间隔子形成一个与之对应的三维编码，43个间隔子对应43个三维编码；三个反应管中均含有GyrA双标记荧光探针，GyrA基因对应3个三维编码；43个间隔子及GyrA基因对应的三维编码如表3所示；
表3. 43个间隔子的三维编码
(4)软件判读：当PCR扩增产物中存在目标序列时，相应的双标记荧光探针就能与之杂交形成特征的熔解曲线峰。自动判读软件首先判读GyrA基因对应的三维编码内是否具有熔点温度值，接着依次根据每个间隔子对应的三维编码进行判读，若对应的三维编码中有熔点值，则该间隔子存在，表示为“1”；若无熔点值，则该间隔子缺失，表示为“0”；最后，软件按照间隔子1→间隔子43的顺序输出待检结核分枝杆菌的基因型。
在步骤(1)中，除了设计一对通用引物用于扩增所有间隔子序列外，还设计一对引物用于扩增GyrA基因保守区域作为内控信号，以保证所检样品中含有结核菌基因组DNA，并且浓度达到检测要求，以确保体系的有效性及分型结果的可靠性。
在步骤(2)中，所述43条双标记荧光探针是与43个间隔子的DNA序列能够特异杂交的，并形成特征的熔解曲线峰。
在步骤(2)中，所述检测通道即仪器对不同荧光基团的分辨能力，设计的检测通道为4个，用于检测43个间隔子。
在步骤(2)中，所述荧光基团的类型包括但不限于：FAM、HEX、ROX、CY5；用于以上荧光基团的淬灭基团包括但不限于BHQ、ECLIPSE或TAMAR。
在步骤(2)中，同一检测通道中相邻探针的熔点温度值的间隔差值为4～10℃。
本发明与传统固相膜杂交spoligotyping方法相比具有以下优点：
(1)一步操作、耗时短：本发明在三管四色PCR反应体系中即可完成43个间隔子序列检测，使用者只需把结核菌株基因组DNA加入PCR反应体系中，并放入实时荧光PCR仪器中进行PCR扩增以及熔解曲线分析就可知道菌株的基因型，耗时2～3h，人工操作时间少于10min；而传统固相膜杂交spoligotyping方法则需要经过PCR扩增、杂交、显影等步骤，耗时6～8h，人工操作时间2～3h。
(2)检测通量高：本发明基于荧光PCR熔解曲线技术，PCR之后只需一个简单的熔解曲线分析步骤，熔解过程在荧光PCR仪上40min以内即可完成，而PCR扩增可以在普通PCR仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，一人一天可轻松完成200份以上结核标本DNA的分型，并且在常规分子实验室即可完成实验，故可以大大提高检测通量，满足临床需要；而传统固相膜杂交spoligotyping方法由于步骤繁琐，需大量人工操作，一人一天完成80份标本分型，并且需要特殊的专用仪器如杂交仪，需要暗室或具有检测化学发光功能的凝胶成像仪的实验室设计才能完成实验。
(3)结果可自动判读：本发明是通过所在反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，赋予每个间隔子一个对应的三维编码，而自动判读软件会自动读取每个间隔子对应的三维编码，并输出待检菌株的基因型，结果客观，不易出错，容易实现全自动化检测；而传统固相膜杂交spoligotyping方法最后的结果需要人工进行比对录入，不仅耗时还可能造成人为的误差。
(4)均相反应、闭管操作：本发明为均相反应体系，PCR扩增及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性，提高了菌株分型结果的准确性；而传统固相膜杂交spoligotyping需要PCR开盖后处理，容易造成PCR产物的污染，导致结果的误判。
综上所述，本发明只需一步操作，在2～3h内即可由软件自动判读得到菌株的基因型，同时整个过程无需PCR后处理，避免PCR产物污染，提高分型结果准确性。本发明提供了一种新型的、高通量的结核分枝杆菌溯源新技术，即利用熔点编码进行结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型。该方法操作简便、特异性高、重复性好，耗时短，价格相对低廉，将为探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力的工具。
附图说明
图1为本发明实施例一的一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法原理示意图；
图2为本发明实施例二的一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法特征熔解峰；
图3为本发明实施例三的一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法灵敏度结果。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明进行进一步的说明。
实施例一：一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法体系设计
一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法的技术原理如图1所示：在结核分枝杆菌基因组中存在一种36bp大小的DNA片段，在基因组中重复出现，称为直接重复序列，记为DR，这些片段被35～41bp大小的间隔子分隔开，这些间隔子的顺序在所有菌株中的顺序几乎是相同的，但是不同菌株会发生某一间隔子的插入或缺失，因此，通过检测间隔子的存在与缺失可以对结核分枝杆菌进行分型鉴定。首先，在结核分枝杆菌基因组中的直接重复序列上设计一对通用引物，记为DR-F和DR-R，利用这对通用引物可以扩增出所含间隔子的PCR产物；同时在管家基因GyrA序列中选取保守区域设计一对扩增引物，记为GyrA-F和GyrA-R，作为体系的内标，指示体系的扩增正常并且待检样品中含有结核菌DNA。其次，根据43个间隔子的DNA序列设计能够与之特异杂交的双标记荧光探针，记为探针1～探针43，根据GyrA引物扩增产物选取保守区域设计一条能够与之特异杂交的双标记荧光探针；同时将这44条探针设计为4组，每组配备相同的荧光基团作为一个检测通道，荧光基团分别标记FAM、HEX、ROX和CY5，淬灭基团标记BHQ。在熔解过程，当PCR扩增产物中含有某一间隔子序列时，相应的荧光探针就能与之杂交并形成特征的熔解曲线峰，如H37Rv基因组DNA中间隔子18、19、22和23存在，则探针18、19、22和23能够分别与对应的PCR扩增产物杂交形成特征熔解峰，进而得到对应的熔点温度值，即Tm值，标记为“1”，表示对应的间隔子存在；反之，H37Rv基因组DNA中间隔子20和21缺失，则没有与探针20和21对应的PCR产物，无特征熔解峰，标记为“0”，表示对应的间隔子缺失。
一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法的特点在于，通过所在反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，赋予每个间隔子一个特定的三维编码，其中HEX通道同时检测内控基因GyrA的信号，如表1所示。自动判读软件会优先读取每个反应HEX通道的内控基因GyrA的三维编码，若GyrA对应的三维编码无熔点值，则说明样品中不含结核分枝杆菌DNA，结果判读为无效；若GyrA对应的三维编码有熔点值，则依次读取每个间隔子对应的三维编码，若对应的三维编码中有熔点值，则该间隔子存在，表示为“1”；若无熔点值，则该间隔子缺失，表示为“0”；并按间隔子1→间隔子43的顺序输出待检菌株的基因型。
实施例一的一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法原理示意图参见图1。
实施例二：一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法对H37Rv和BCG标准株分型
利用本发明对结核分枝杆菌H37Rv标准株和BCG标准株的DNA样品分别进行6次的重复实验，以考察体系检测Tm值的重复性。其中，结核分枝杆菌H37Rv标准株和BCG标准株的DNA样品由中国药品生物制品检定所提供。
本实施例使用SLAN96实时荧光PCR仪完成扩增曲线和熔解曲线分析。
反应体系：
反应A：反应总体积为25μL，包括1×PCR buffer(750mM Tris-HCl，200mM(NH4)2SO4，0.1％(v/v)Tween 20)，4mmol/L MgCl2，每种dNTP 0.5mmol/L，0.5mmol/L dUTP，1.2UTaqHS酶，0.06U UNG酶，0.4μmol/L DR-F，4.0μmol/L DR-R，0.1μmol/L GyrA-F，1.0μmol/LGyrA-R，0.04～0.32μmol/L检测探针(包括间隔区SP4、SP6、SP7、SP14、SP15、SP17、SP19、SP21、SP28、SP35、SP36、SP37、SP39、SP41和GyrA检测探针)，5μL基因组DNA模板。同时以5μLH37Rv基因组DNA模板(约103个拷贝)作为阳性对照，以5μL灭菌超纯水作为阴性对照。
反应B：反应总体积为25μL，包括1×PCR buffer(750mM Tris-HCl，200mM(NH4)2SO4，0.1％(v/v)Tween 20)，4mmol/L MgCl2，每种dNTP 0.5mmol/L，0.5mmol/L dUTP，1.2UTaqHS酶，0.06U UNG酶，0.4μmol/L DR-F，4.0μmol/L DR-R，0.1μmol/L GyrA-F，1.0μmol/LGyrA-R，0.04～0.32μmol/L检测探针(包括间隔区SP1、SP2、SP3、SP5、SP9、SP11、SP20、SP22、SP25、SP29、SP32、SP33、SP38、SP42、SP43和GyrA检测探针)，5μL基因组DNA模板。同时以5μLH37Rv基因组DNA模板(约103个拷贝)作为阳性对照，以5μL灭菌超纯水作为阴性对照。
反应C：反应总体积为25μL，包括1×PCR buffer(750mM Tris-HCl，200mM(NH4)2SO4，0.1％(v/v)Tween 20)，4mmol/L MgCl2，每种dNTP 0.5mmol/L，0.5mmol/L dUTP，1.2UTaqHS酶，0.06U UNG酶，0.4μmol/L DR-F，4.0μmol/L DR-R，0.1μmol/L GyrA-F，1.0μmol/LGyrA-R，0.04～0.32μmol/L检测探针(包括间隔区SP8、SP10、SP12、SP13、SP16、SP18、SP23、SP24、SP26、SP27、SP30、SP31、SP34、SP40和GyrA检测探针)，5μL基因组DNA模板。同时以5μLH37Rv基因组DNA模板(约103个拷贝)作为阳性对照，以5μL灭菌超纯水作为阴性对照。
反应程序：
实时PCR扩增程序为：50℃ 5min；95℃ 5min预变性；循环周期为95℃ 15s，57℃15s，72℃ 15s，共50个循环，在每个循环退火阶段采集FAM、HEX、ROX和CY5通道荧光数据。实时PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，程序为：95℃变性2min，35℃保温1min，随后按0.04℃/continue的升温速率从35℃递增至90℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM、HEX、ROX和CY5通道的荧光数据。
实验流程如下：
(1)PCR扩增与熔解曲线分析：PCR扩增与熔解曲线分析的反应体系如前面所述，每次实验分别往反应体系中加入5μl浓度为104拷贝/μl的基因组DNA，反应程序如前面所述。
(2)结果判读：H37Rv和BCG标准株都有各自特异的熔解曲线峰组合，如图2所示，每个熔解峰上方所显示的数字编号为熔解峰所对应的间隔子。对6次重复实验的结果进行统计，同一检测通道内相邻的两个熔解曲线的熔点温度差值均大于4℃，而且各间隔子的熔点温度的标准偏差均在0～0.5℃之间，如表4所示，因此所有相邻的熔解曲线熔点在结果判读时不会互相干扰，体系的重复性良好。
表4. 43个间隔子序列的特征熔点温度及其标准偏差
实施例二的一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法特征熔解峰参见图2。
实施例三：一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法灵敏度度分析
利用本发明对结核分枝杆菌H37Rv标准株的DNA样品进行实验，以考察体系对结核菌标本进行基因分型的有效模板浓度范围。其中，结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA样品由中国药品生物制品检定所提供。
本实施例使用SLAN96实时荧光PCR仪完成扩增曲线和熔解曲线分析。
实验流程如下：
(1)H37Rv标准株梯度稀释：将H37Rv标准株的基因组DNA模板10倍梯度稀释，使每个梯度加入的基因组DNA浓度分别为1×106拷贝/μl、1×105拷贝/μl、1×104拷贝/μl、1×103拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×101拷贝/μl、1×100拷贝/μl。
(2)PCR扩增与熔解曲线分析：PCR扩增与熔解曲线分析的反应体系如实施例二所述，每个梯度分别往反应体系中加入5μl基因组DNA，反应程序如实施例二所述。
(3)结果判读：如图3所示，101拷贝/μl～106拷贝/μl的H37Rv标准株DNA的内控信号和各个间隔子的熔解峰信号均正常，软件能够很好判读；而100拷贝/μl的H37Rv标准株DNA无内控熔解峰，自动判读软件判定该样品无效。因此，该体系对结核菌标本的基因型的最低模板浓度要求为50拷贝/反应。
本发明公开了一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其包括如下步骤：(1)在直接重复序列上设计一对通用引物扩增所有间隔子；在GyrA保守区域设计一对引物。(2)根据43个间隔子序列、GyrA序列设计与之特异杂交的双标记荧光探针，并将探针设计为4组，每组配备相同的荧光基团，通过调整探针长度和/或碱基组成对每条探针的熔点值进行人为控制。(3)将荧光探针分布在三个反应管，通过反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，每个间隔子分别形成一个三维编码并由软件自动读取结果。该方法操作简便、特异性高、重复性好、耗时短，价格相对低廉。本发明将为探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力的工具。

Claims (5)

1.一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，所述方法不用于疾病诊断，其特征在于包括如下步骤：
(1)引物设计：在结核分枝杆菌基因组中高度同源的直接重复序列上设计一对通用引物，并利用这对通用引物扩增出所有间隔子；在结核分枝杆菌管家基因GyrA序列中选取保守区域设计一对扩增引物，引物序列如下所示：
DR-F：5'-3'CCGAGAGGGGACGGAAAC，
DR-R：5'-3'GGTTTTGGGTCTGACGAC，
GyrA-F1：5'-3'TGAGGACCAGTCTAGCGATC，
GyrA-R1：5'-3'ACGTAATAGCGGATCAGCTG；
除了设计一对通用引物用于扩增所有间隔子序列外，还设计一对引物用于扩增GyrA基因保守区域作为内控信号，以保证所检样品中含有结核菌基因组DNA，并且浓度达到检测要求，以确保体系的有效性及分型结果的可靠性；
(2)探针设计：根据结核分枝杆菌复合群43个间隔子的DNA序列设计43条能够与之特异杂交的双标记荧光探针，在GyrA引物扩增产物选取保守区域设计一条与之特异杂交的双标记荧光探针；同时将探针设计为4组，每组的探针配备相同的荧光基团和淬灭基团作为一个检测通道，并通过调整探针的长度和/或碱基组成对每条探针的熔点温度值进行人为控制，使得同一检测通道内针对不同间隔子序列的荧光探针的熔点温度值都间隔合适的差值，探针序列及探针修饰如下所示：
(3)三维编码：将43个间隔子对应的双标记荧光探针分布在三个反应管中，通过所在反应管、荧光基团和熔点温度值的组合，每个间隔子形成一个与之对应的三维编码，43个间隔子对应43个三维编码；三个反应管中均含有GyrA双标记荧光探针，GyrA基因对应3个三维编码；43个间隔子及GyrA基因对应的三维编码如下所示：
(4)软件判读：当PCR扩增产物中存在目标序列时，相应的双标记荧光探针就能与之杂交形成特征的熔解曲线峰，自动判读软件首先判读GyrA基因对应的三维编码内是否具有熔点温度值，接着依次根据每个间隔子对应的三维编码进行判读，若对应的三维编码中有熔点值，则该间隔子存在，表示为“1”；若无熔点值，则该间隔子缺失，表示为“0”；最后，软件按照间隔子1→间隔子43的顺序输出待检结核分枝杆菌的基因型。
2.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，所述43条能够与之特异杂交的双标记荧光探针是与43个间隔子的DNA序列能够特异杂交的，并形成特征的熔解曲线峰。
3.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，所述检测通道表示仪器对不同荧光基团的分辨能力，设计的检测通道为4个，用于检测43个间隔子。
4.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，所述荧光基团的类型包括但不限于：FAM、HEX、ROX、CY5；用于以上荧光基团的淬灭基团包括BHQ、ECLIPSE或TAMAR。
5.如权利要求1所述一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法，其特征在于在步骤(2)中，同一检测通道中相邻探针的熔点温度值的间隔差值为4～10℃。
CN201510288801.7A 2015-05-29 2015-05-29 一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法 Active CN104862403B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510288801.7A CN104862403B (zh) 2015-05-29 2015-05-29 一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510288801.7A CN104862403B (zh) 2015-05-29 2015-05-29 一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104862403A CN104862403A (zh) 2015-08-26
CN104862403B true CN104862403B (zh) 2019-01-04

Family

ID=53908573

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510288801.7A Active CN104862403B (zh) 2015-05-29 2015-05-29 一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104862403B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105400778B (zh) * 2015-09-25 2019-01-04 深圳市疾病预防控制中心 同时检测10种致病性弧菌的试剂盒及检测方法
CN108977503B (zh) * 2018-06-25 2021-11-05 河南省疾病预防控制中心 一种寡核苷酸探针杂交的结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型方法
CN112501321B (zh) * 2020-11-19 2022-07-15 厦门大学 结核分枝杆菌的分子分型方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1936019A (zh) * 2005-10-18 2007-03-28 厦门大学 用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法
CN102559868B (zh) * 2011-11-28 2014-11-05 厦门大学 一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法
CN104651529A (zh) * 2015-03-24 2015-05-27 厦门大学 一种检测核酸分子缺失突变的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1936019A (zh) * 2005-10-18 2007-03-28 厦门大学 用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法
CN102559868B (zh) * 2011-11-28 2014-11-05 厦门大学 一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法
CN104651529A (zh) * 2015-03-24 2015-05-27 厦门大学 一种检测核酸分子缺失突变的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
间隔区寡聚核甘酸分型技术(spoligotyping)的建立及其对结核分支杆菌菌株北京基因型的初步鉴定;郭艳玲等;《中国防痨杂志》;20031031;第25卷;55-56

Also Published As

Publication number Publication date
CN104862403A (zh) 2015-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107937502B (zh) 一种筛选微生物高多态性分子标记位点的方法
CN112626272B (zh) 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测和分子分型方法及试剂盒
CN104862403B (zh) 一种熔点编码的结核分枝杆菌间隔寡核苷酸分型方法
CN106191311B (zh) 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo-3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂
CN106011246A (zh) 基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用
CN103714267A (zh) 基于种特有序列的检测或辅助检测待测菌株的方法
CN103740824B (zh) 一种两核苷酸实时合成测序图谱鉴定微生物种群的方法
CN106434996A (zh) 一种检测鲍曼不动杆菌dna的试剂盒及检测方法
CN110551607A (zh) 基于rca扩增的结核分枝杆菌耐药基因多重检测方法
CN109234419A (zh) 炭疽杆菌双重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN105349664A (zh) 检测中枢神经系统细菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒
CN113817871B (zh) 冠状病毒的检测方法及试剂盒
CN105603084B (zh) 检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点的引物、探针及方法
CN113718052A (zh) 5000个snp位点组合的应用及小麦品种真实性身份鉴定的方法
CN105603081B (zh) 一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法
CN102094077A (zh) 结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒
CN108932401A (zh) 一种测序样本的标识方法及其应用
KR20190017698A (ko) 결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 결핵의 진단방법
CN111554349B (zh) 一种基于高通量测序的物种鉴定系统和方法
CN108531556A (zh) 基于微流控芯片检测多种病原体的试剂盒及其使用方法
CN109486983A (zh) 土沉香、云南沉香、马来沉香的snp分子标记及应用
CN110551623A (zh) 用于核酸检测的纸质微流体芯片、装置、试剂盒及其应用
CN105331718A (zh) 检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒
CN115725784A (zh) 检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒及方法
CN106319091B (zh) 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210618

Address after: 361000 Building 1, No. 3701, Xiang'an North Road, Xiang'an Industrial Zone, torch hi tech Zone, Xiamen City, Fujian Province

Patentee after: Xiamen Zeesan Biotech Co.,Ltd.

Address before: Xiamen City, Fujian Province, 361005 South Siming Road No. 422

Patentee before: XIAMEN University

TR01 Transfer of patent right