CN103320507A

CN103320507A - 利用dpo-pcr方法检测沙门氏菌的dpo引物序列及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN103320507A
Application number: CN2013101655805A
Authority: CN
Inventors: 徐义刚; 刘忠梅; 吴岩; 李丹丹; 李苏龙
Original assignee: HEILONGJIANG CENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE TECHNICAL CENTER
Current assignee: HEILONGJIANG CENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE TECHNICAL CENTER
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: CN103320507B

Abstract

本发明涉及一种利用DPO-PCR方法检测沙门氏菌的DPO引物序列和诊断试剂盒。所述的DPO引物序列为：SA-DPOF5′-TATTTTCCGGAAAACGTACCGCAIIIIIGCATTCCGC-3′，SA-DPOR：5′-AGCCATACGGATAAACTGTGTTATIIIIIAGCGGAGGT-3′；诊断试剂盒，它含有如上所述的DPO引物对、阳性对照品、阴性对照品、TaqDNAPolymerase和PCR反应液。本发明具有可操作性强、检测结果精确的优点。

Description

利用DPO-PCR方法检测沙门氏菌的DPO引物序列及其检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用DPO-PCR方法检测沙门氏菌的DPO引物序列及其检测试剂盒。

背景技术

沙门氏菌是一种重要的人畜共患病致病菌，在自然界中分布极为广泛，主要经消化道感染，引起以伤寒、副伤寒和急性胃肠炎为特征的临床症状。人类经食用被沙门氏菌污染的食物而感染发病，主要表现为呕吐、腹痛及腹泻，常见的有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等，在公共卫生上具有十分重要的意义。

目前，对沙门氏菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。再者，沙门氏菌血清型多且复杂，为沙门氏菌的快速精准检测增加了难度。为满足致病菌快速检测的要求，发展了酶联荧光免疫检测法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶链式反应(PCR)、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、胶体金试纸法和API法均存在特异性差、灵敏度低等缺陷，而没有得到广泛应用；LAMP法，作为一种新兴的检测方法，尽管极大地提高了检测效率，又降低了检测成本，但是产生的假阳性率较高；PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等, 而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素。常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，以防止非特异性扩增，特别是涉及多重PCR时，需要大量的实验以验证检测方法的特异性，费时又费力。

Dual priming oligonucleotide (DPO) 引物设计方法，简化了建立常规PCR方法的操作步骤。该引物的设计分为两部分，中间用多聚次黄嘌呤肌苷连接，5'-端长18-25bp，3'-端长6-15bp。由于该类引物特殊的结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，试验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化。同时，DPO引物与模板发生错配的几率小，因为只要有3个以上碱基发生错配，就不会成功扩增，比常规PCR引物的特异性更强，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其检测结果比常规PCR方法更为精确。

在此情况下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法对致病性微生物实施精准检测，对保障公共卫生安全具有现实意义。本发明根据沙门氏菌FimY靶基因的保守区设计合成了一对DPO引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了沙门氏菌DPO-PCR精准检测方法。本发明可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供利用DPO-PCR方法检测沙门氏菌的DPO引物序列及其检测试剂盒。

本发明所采用的技术如下：

一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法检测用引物对，

上游引物SA-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物SA-DPOR：如序列表Seq No.2所示。

本发明还具有如下特征：

1、一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物对，

上游引物SA-CGF：如序列表Seq No.3所示，

下游引物SA-CGR：如序列表Seq No.4所示。

2、一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-FimY，如序列表Seq No.5所示。

3、一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-FimY的制备方法，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：沙门氏菌基因组DNA的提取和纯化；

（2）、选择沙门氏菌FimY基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上引物SA-CGF ，如序列表Seq No.3所示和下引物SA-CGR，如序列表Seq No.4所示，并进行靶基因的PCR扩增；

（3）、阳性对照品pMD-T-FimY的制备；

步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTP (2.5mM for each)	2.0μL
上游引物SA-CGF(10μM)	1.0μL
		下游引物SA-CGR(10μM)	1.0μL
Taq DNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
		DNA模板	0.5μL
ddH₂O	17.5μL

PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、57.6℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸10min。

步骤（3）中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤（2）中所得PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化大肠杆菌感受态JM109，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD-T-FimY作为阳性对照品。

4、一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法检测用引物对，检测沙门氏菌的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer (Mg²⁺ free)	2.5μL
		dNTP	0.2mmol/L
Mg²⁺	2.5mmol/L
		上游引物SA-DPOF	0.2μmol/L
下游引物SA-DPOR	0.2μmol/L
		Taq DNA Polymerase	1.5U
DNA模板	1μL
		无菌去离子水	补充至25μL

PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、45℃～65℃ 20s、72℃ 30s，进行35个循环；72℃延伸10min。

5、一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法检测用引物对SA-DPOF/SA-DPOR对退火温度不敏感，有效温度范围为45℃～65℃。

6、一种基于DPO引物检测沙门菌的PCR方法检测用试剂盒，

包括引物对：上游引物SA-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物SA-DPOR：如序列表Seq No.2所示、

阳性对照品（pMD-T-FimY）：如序列表Seq No.5所示、

阴性对照品(ddH₂O)和

PCR反应液：10×PCR Buffer(Mg²⁺ free)；dNTP，Mg²⁺，上游引物SA-DPOF，下游引物SA-DPOR和Taq DNA Polymerase。

本发明分别以猪霍乱沙门氏菌ATCC10708、肠炎沙门氏菌ATCC14028、嗜水气单胞菌ATCC7966、空肠弯曲菌ATCC33560、单核细胞增生李斯特菌ATCC19111、产气肠杆菌 ATCC13048、变形杆菌 ATCC49027、肠出血性大肠杆菌 O157:H7 ATCC35150、阪崎肠杆菌ATCC51329、志贺氏菌ATCC12022、金黄色葡萄球菌ATCC29213、溶血性链球菌CMCC32121、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC9610、霍乱弧菌ATCC14035、副溶血性弧菌ATCC27519、溶藻性弧菌ATCC33839、创伤弧菌ATCC33149的基因组DNA进行试验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对沙门氏菌进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性。本发明的试剂盒还具有快速简单、精准的优点。

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养的沙门氏菌（菌体浓度为1.17×10⁸CFU/mL）基因组DNA，进行10倍梯度稀释，从每级稀释液中各取1μL作为模板进行DPO-PCR检测。结果表明，该DPO-PCR方法检测沙门氏菌的最低浓度为1.17×10²CFU/mL，说明本发明方法具有高度的灵敏性。

利用本发明方法重复30次检测同一阳性标准品，检测结果均相同；两次（时间间隔60天）检测同一批次制备的阳性标准品，检测结果均相同，可见本发明方法具有良好的重复性和稳定性。

将本发明应用于检验检疫实践工作中，其结果与沙门氏菌国标法（GB/T 4789.4-2008 食品卫生微生物学检验-沙门氏菌检验）进行比较，验证该方法检测的可靠性与实用性。结果显示，利用建立的沙门氏菌DPO-PCR检测方法对采集的175份鸡肉、53份鸭肉、62份猪肉、49份奶类制品、20份牛肉和36份鹅肉样本进行了检测，共检出21份沙门氏菌阳性样本，检测结果与国标法检测结果符合率为100%。

附图说明

图1是沙门氏菌DPO-PCR检测方法的建立示意图，

其中，M为 DNA Marker，1,2为DPO-PCR阳性结果，3,4为DPO-PCR阴性结果。

图2为沙门氏菌DPO-PCR检测方法退火温度不敏感性结果示意图，

其中，M: DNA Marker，1为45℃，2为47℃，3为49℃，4为51℃，5为53℃，6为55℃，7:为57℃，8为59℃，9为 61℃，10为65℃。

图3为沙门氏菌DPO-PCR检测方法特异性结果示意图，

其中，M为DNA Marker；1-17依次为：猪霍乱沙门氏菌ATCC10708、肠炎沙门氏菌ATCC14028、嗜水气单胞菌ATCC7966、空肠弯曲菌ATCC33560、单核细胞增生李斯特菌ATCC19111、产气肠杆菌ATCC13048、变形杆菌ATCC49027、肠出血性大肠杆菌O157:H7 ATCC35150、阪崎肠杆菌ATCC51329、志贺氏菌ATCC12022、金黄色葡萄球菌ATCC29213、溶血性链球菌CMCC32121、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC9610、霍乱弧菌ATCC14035、副溶血性弧菌ATCC27519、溶藻性弧菌ATCC33839、创伤弧菌ATCC33149。

图4为沙门氏菌DPO-PCR检测方法灵敏度结果示意图，

其中，M为DNA Marker 100 ladder；1为模板浓度 1.17×10⁷CFU/mL；2为模板浓度 1.17×10⁶CFU/mL；3为模板浓度1.17×10⁵CFU/mL；4为模板浓度1.17×10⁴CFU/mL；5为模板浓度1.17×10³CFU/mL；6为模板浓度 1.17×10²CFU/mL；7为模板浓度 1.17×10¹CFU/mL；8为模板浓度1.17×10⁰CFU/mL）。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1

沙门氏菌DNA模板的制备

参照TIANamp Bacteria DNA Kit 说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化，按顺序加入相应试剂：

（1）取1.5mL菌液，10000r/min 离心1min，弃上清，加入200μL缓冲液GA，彻底悬浮菌体；

（2）加入20μL蛋白酶K (20mg/mL)，并加入220μL 缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴作用10min；

（3）加入220μL无水乙醇，充分混匀15s，简短离心后将所得溶液（包括絮状沉淀）转移至吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（4）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（5）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（6）重复上步操作；

（7）将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，室温放置2-5min，晾干残留的漂洗液；

（8）将吸附柱CB3转入新的收集管中，在吸附膜中央加入100μL缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，收集DNA洗脱液。

实施例2 PCR引物的设计与合成

选择沙门氏菌FimY基因作为靶基因，并经过BLAST分析，设计合成下列引物：

（1）沙门氏菌FimY基因阳性对照品制备PCR扩增引物（PCR产物大小为227bp）：

SA-CGF：5′-TATTTTCCGGAAAACGTACCGCAGCATTCCGC-3′

SA-CGR：5′-AGCCATACGGATAAACTGTGTTATAGCGGAGGT-3′

（2）沙门氏菌DPO-PCR方法鉴定用DPO引物（PCR产物大小为237bp）：

SA-DPOF：5′-TATTTTCCGGAAAACGTACCGCAIIIIIGCATTCCGC-3′，

SA-DPOR：5′-AGCCATACGGATAAACTGTGTTATIIIIIAGCGGAGGT-3′；

实施例3 阳性对照品的制备

以SA-CGF和 SA-CGR为引物，采用PCR法扩增沙门氏菌FimY基因。

利用靶基因扩增引物SA-CGF / SA-CGR，采用PCR法扩增沙门氏菌FimY基因，PCR的反应体系为：

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTP (2.5mM for each)	2.0μL
上游引物SA-CGF(10μM)	1.0μL
		下游引物SA-CGR(10μM)	1.0μL
TaqDNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
		DNA模板	0.5μL
ddH₂O	17.5μL

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，PCR产物大小为227bp。

将PCR产物与pMD-19-T vector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得阳性重组菌，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒：

（1）挑取阳性克隆单菌落，接种于5mL含100μg/mL Amp^r的LB培养基中，37℃培养过夜；

（2）取1～3mL过夜培养菌液，12000r/min离心5min，弃上清，加入250μL 的Buffer P1（含RNase）充分振荡菌体沉淀至其彻底悬浮；

（3）加入250μL 的Buffer P2，立即温和地上下颠倒离心管6-10次，混匀，室温静置2-4min；

（4）加入350μL 的Buffer P3，温和反复颠倒离心管6-10次，混匀，12000r/min离心10min；

（5）将上清液移入吸附柱中，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（6）加入500μL B1液，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（7）加入500μL W1液（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（8）加入500μL W1液（含无水乙醇），室温静置1min，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min空载离心1min；

（9）将吸附柱转移至一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入150μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心1min，洗脱收集质粒DNA。

将提取的质粒DNA进行定量，作为试剂盒阳性质控标准品-20℃保存备用。定量计算公式为：阳性质粒拷贝数copies/μL= (OD₂₆₀×50×10^-9×稀释倍数×6.02×10²³) / (660×碱基数)，式中：50代表用直径1cm比色杯在OD₂₆₀等于1时相对应的双链DNA浓度为50μg/mL；660代表双链DNA碱基对平均分子量。

实施例4 DPO-PCR检测反应体系的建立与优化

反应体系为25μL：10×PCR Buffer (Mg²⁺free) 2.5μL，将Mg²⁺、dNTP、Taq DNA Polymerase和引物制备成不同浓度的组合，用去离子水补充至25μL。Mg²⁺、dNTP、Taq DNA Polymerase和引物的浓度范围依次为：Mg²⁺浓度范围为1.0mmol/L-8mmol/L，以0.5mmol/L递增；dNTP浓度范围为0.1 mmol/L-0.8mmol/L，以0.05mmol/L递增；Taq DNA Polymerase浓度范围为0.5U-3.5U，以0.5U单位递增；引物浓度范围为0.1μmol/L-0.6μmol/L，以0.1μmol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，以确定最佳反应体系组成。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，如图1所示。确定的沙门氏菌DPO-PCR检测方法的反应体系为：

10×PCR Buffer (Mg²⁺ free)	2.5μL
		dNTP	0.2mmol/L
Mg²⁺	2.5mmol/L
		上游引物SA-DPOF	0.2μmol/L
下游引物SA-DPOR	0.2μmol/L
		TaqDNA Polymerase	1.5U
DNA模板	1μL
		无菌去离子水	补充至25μL

确定沙门氏菌DPO-PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、45℃～65℃ 20s、72℃ 30s，进行35个循环；72℃延伸10min。DPO-PCR对退火温度不敏感，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。

实施例5 DPO-PCR检测沙门氏菌特异性试验

利用建立的沙门氏菌DPO-PCR精准检测方法对猪霍乱沙门氏菌ATCC10708、肠炎沙门氏菌ATCC14028、嗜水气单胞菌ATCC7966、空肠弯曲菌ATCC33560、单核细胞增生李斯特菌ATCC19111、产气肠杆菌 ATCC13048、变形杆菌 ATCC49027、肠出血性大肠杆菌 O157:H7 ATCC35150、阪崎肠杆菌ATCC51329、志贺氏菌ATCC12022、金黄色葡萄球菌ATCC29213、溶血性链球菌CMCC32121、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC9610、霍乱弧菌ATCC14035、副溶血性弧菌ATCC27519、溶藻性弧菌ATCC33839、创伤弧菌ATCC33149进行检测，以验证该方法检测的特异性。结果显示，本发明方法能够对沙门氏菌进行特异性的检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性，结果如图3所示。

实施例6 DPO-PCR检测沙门氏菌灵敏度试验

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌体浓度约为1.17×10⁸CFU/mL沙门氏菌的基因组DNA，进行10倍梯度稀释，从每级稀释液中各取1μL作为模板利用建立的DPO-PCR方法进行检测，以确定该方法的检测灵敏性。结果显示，本发明方法具有高度的检测灵敏性，结果如图4所示。

实施例7 DPO-PCR检测沙门氏菌重复性试验

利用建立的沙门氏菌DPO-PCR检测方法重复30次检测同一阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，每次检测结果均相同。

利用建立的沙门氏菌DPO-PCR检测方法间隔60天检测同一批次制备的阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，两次检测结果均相同。

实施例8 DPO-PCR检测沙门氏菌实践验证试验

将建立的沙门氏菌DPO-PCR检测方法应用于检验检疫实践工作中，对采集的175份鸡肉、53份鸭肉、62份猪肉、49份奶类制品、20份牛肉和36份鹅肉样本进行检测，其结果与沙门氏菌国标法（GB/T 4789.4-2008 食品卫生微生物学检验-沙门氏菌检验）进行比较，考察该方法检测的可靠性与实用性。结果显示，共检出21份沙门氏菌阳性样本，检测结果与国标法检测结果符合率为100%，结果如表1所示。

表1 实践应用结果

Figure 2013101655805100002DEST_PATH_IMAGE002

<110>黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>利用DPO-PCR方法检测沙门氏菌的DPO引物序列及其检测试剂盒

<160>5

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221> modified_base

<222>(24,25,26,27,28)

<223>I

<400>1

TATTTTCCGG AAAACGTACC GCAIIIIIGC ATTCCGC

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221> modified_base

<222>(24,25,26,27,28)

<223>I

<400>2

AGCCATACGG ATAAACTGTG TTATIIIIIA GCGGAGGT

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TATTTTCCGG AAAACGTACC GCAGCATTCC GC

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

AGCCATACGG ATAAACTGTG TTATAGCGGA GGT

<210>5

<211>2919

<212>DNA

<213>pMD-T-FimY

<400>5

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat 420

cttccagaga ttattttccg gaaaacgtac cgcagcattc cgctcattag atgacatttc 480

tttgtggatt gaaaaggggt cgctcagaca actgattgta gatatggagg cgctacctgt 540

ctcctgtatt gaggcgctta accagctacg cgcgctcagt tggcaacaaa gcgatatcca 600

gatttacctg ctggtatcag ataaaacctc cgctataaca cagtttatcc gtatggctat 660

cgtcgaacgg caggcgtgca aacttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 720

attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 780

ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 840

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 900

gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 960

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1020

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 1080

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 1140

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1200

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 1260

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 1320

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 1380

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 1440

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 1500

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 1560

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 1620

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 1680

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 1740

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 1800

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 1860

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 1920

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 1980

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 2040

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 2100

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 2160

ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 2220

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 2280

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 2340

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 2400

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 2460

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 2520

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 2580

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 2640

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 2700

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 2760

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa atgggggttc 2820

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 2880

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 2919

Claims

1. 一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于，

上游引物SA-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物SA-DPOR：如序列表Seq No.2所示。

2. 一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物对，其特征在于，

上游引物SA-CGF：如序列表Seq No.3所示，

下游引物SA-CGR：如序列表Seq No.4所示。

3. 一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-FimY，其特征在于，如序列表Seq No.5所示。

4. 根据权利要求3所述的一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-FimY的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：沙门氏菌基因组DNA的提取和纯化

（2）、选择沙门氏菌FimY基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上游引物SA-CGF ，如序列表Seq No.3所示和下游引物SA-CGR，如序列表Seq No.4所示，并进行靶基因的PCR扩增；

（3）、阳性对照品pMD-T-FimY的制备；

步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：

PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、57.6℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸10min，

5. 根据权利要求1所述的一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于：

检测沙门氏菌的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer (Mg²⁺ free) 2.5μL dNTP 0.2mmol/L Mg²⁺ 2.5mmol/L 上游引物SA-DPOF 0.2μmol/L 下游引物SA-DPOR 0.2μmol/L Taq DNA Polymerase 1.5U DNA模板 1μL 无菌去离子水补充至25μL

6. 根据权利要求1所述的一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于：所述的引物对退火温度不敏感，有效温度范围为45℃～65℃。

7. 一种基于DPO引物检测沙门氏菌的PCR方法检测用试剂盒，其特征在于：

包括引物对：上游引物SA-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物SA-DPOR：如序列表Seq No.2所示、

阳性对照品（pMD-T-FimY）：如序列表Seq No.5所示、

阴性对照品(ddH₂O)和

PCR反应液：10×PCR Buffer(Mg²⁺ free)；dNTP，Mg²⁺，上游引物SA-DPOF，下游引物SA-DPOR和Taq DNA Polymerase。