CN102140519A - 基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测试剂盒及方法，特别涉及基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，含有以下特异性引物：其具有上游外引物F3如SEQIDNO.1所示，下游外引物B3如SEQIDNO.2所示，上游内引物FIP如SEQIDNO.3所示，下游内引物BIP如SEQIDNO.4所示，上游环引物LF如SEQIDNO.5所示，下游环引物LB如SEQIDNO.6所示；本试剂盒是基于环介导等温扩增技术而制备的，特异性强，灵敏性高，在无需昂贵的仪器即可简单快速的检测沙门氏菌，特别适合于基层医疗单位。

Description

基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测试剂盒及方法，特别涉及基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

沙门氏菌( Salmonella) 是肠杆菌科中常见的人兽共患病原菌,不仅能导致鸡白痢、仔猪副伤寒、流产等动物疾病,还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例位列前位。目前沙门氏菌的快速检测方法主要有免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验、聚合酶链反应和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验( ELISA) 等方法 ,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想。

环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification ,LAMP) 是一种新型的核酸检测方法,其特点是针对靶基因的6 个区域设计2 对特异引物,利用链置换DNA 聚合酶在恒温条件下作用40～60 min ,即可完成检测,结果判断直观,通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度即可判断是否发生反应。LAMP 方法具有操作简便、检测快速、灵敏度高、成本低廉且易推广等优点,在疾病诊断、病原检测等领域得到了广泛应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，其灵敏度高，特异性好，操作简单快速，准确可靠，检测成本低。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，含有以下特异性引物：

上游外引物F3：5’-cgaagaaagctttgcctgtg-3’;

下游外引物B3: 5’- cagtacgcgaagccttgtt-3’；

上游内引物FIP:5’-gcacgtcagcaaagcgtacctt-gggaaggttaaggagggtga-3’;

下游内引物BIP:5’-agaggcgccttgcgctaaag-ccaaacctcgcttatcggaa-3’;

进一步，所述的基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，还包括

上游环引物LF:5’- cgtgtagtttaccggcttaaacaa-3’；

下游环引物LB: 5’-caatcatcaaccagtcagtacggc-3’；

进一步，所述的基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒有24μL反应体系的试剂，所述24μL反应体系的试剂包括：浓度各为0.2 μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3,浓度各为0.8μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP, 浓度各为0.4μmol/L的上游环引物LF和下游环引物LB，浓度为1.0 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液, 浓度为1mol/L的甜菜碱, PH值为8.8、浓度为25mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 , 浓度为10 mmol/L 氯化钾, 浓度为10 mmol/L 硫酸铵, 浓度为5 mmol/L 硫酸镁, 质量百分数为0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚, 8 单位Bst DNA 聚合片段酶, 余量为无RNA酶超纯水。

本发明的另目的在于提供一种沙门氏菌检测方法，该方法操作简单，适用于大规模应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

4、1～3任一项所述基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒的检测方法，具体由以下步骤组成：

A、提取待测样品的DNA作为模板DNA，控制模版DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μl范围内；

B、在24μL反应体系的试剂中加入1μl待测模版DNA水溶液，并在      60～65°C条件下保温60分钟，80°C保温5分钟终止反应液；

C、反应终止后，加入质量分数为10%的荧光染料赛博绿Ⅰ水溶液1μl,用肉眼观察颜色变化，如果颜色为橘黄色，说明待检样品不含沙门氏菌；如果颜色变为绿色，则说明样品中含有沙门氏菌。

本发明的有益效果在于：本发明建立了沙门氏菌的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据沙门氏菌属特异性基因fimY基因的保守序列设计了一组各两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为沙门氏菌所特有，以保证从属的水平上检测沙门氏菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与FQ-PCR有相同的高灵敏性，但不需要昂贵的仪器，只需要普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳来检测结果，使用荧光染料来观察即可，简单快速。可用于沙门氏菌的快速检测，特别适合于基层医疗单位。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒及其制备方法

一、按下列配方制作检测沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒：

（1）配制LAMP反应液：

24μl反应体系中包括：浓度各为0.2 μmol/L上游外引物F3和下游外引物B3,浓度各为0.8μmol/L上游内引物FIP和下游内引物BIP,浓度各为0.4μmol/L的上游环引物LF和下游环引物LB，浓度为1.0 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液, 浓度为1mol/L的甜菜碱, PH值为8.8、浓度为25mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 , 浓度为10 mmol/L 氯化钾, 浓度为10 mmol/L 硫酸铵, 浓度为5 mmol/L 硫酸镁, 质量百分数为0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚, 8 单位Bst DNA 聚合片段酶, 余量为无RNA酶超纯水。

其中，基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，含有以下特异性引物：

上游外引物F3：5’-cgaagaaagctttgcctgtg-3’;

下游外引物B3: 5’- cagtacgcgaagccttgtt-3’；

上游内引物FIP:5’-gcacgtcagcaaagcgtacctt-gggaaggttaaggagggtga-3’;

下游内引物BIP:5’-agaggcgccttgcgctaaag-ccaaacctcgcttatcggaa-3’；

上游环引物LF:5’-cgtgtagtttaccggcttaaacaa-3’；

下游环引物LB:5’-caatcatcaaccagtcagtacggc-3’。

（2）显色液：1.0 μl显色剂为10%的荧光染料赛博绿Ⅰ。

二、待测样品模板DNA的制备：

⑴标准品模板DNA的制备

按照标准的微生物学方法，从疑似沙门氏菌污染的食品和动物组织上分离菌株并挑取单菌落接种于LB肉汤中，37℃过夜培养，之后取500μl菌液，4000r/min离心5分钟，弃上清，加入500μl STE 洗涤沉淀, 4000r/min离心5分钟，弃上清，再加入500μl TE使沉淀重新悬浮，煮沸10分钟，12000r/min,4℃,离心5分钟，上清即作为模板DNA。

⑵阳性对照组模板DNA的制备

标准菌株：亚利桑纳沙门氏菌(Salmonella arizona)，购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Centre Of Industrial Culture Collection, CICC)，编号No. 21506。

按照购回的菌株中附带的复苏指南对细菌进行复苏，用接种环勾取复苏后的菌液划线接种于SS培养基37℃过夜培养，待细菌长出后再勾取单菌落接种于LB肉汤，37℃过夜培养,之后取500μl菌液，4000r/min离心5分钟，弃上清，加入500μl STE 洗涤沉淀, 4000r/min离心5分钟，弃上清，再加入500μl TE使沉淀重新悬浮，煮沸10分钟，12000r/min,4℃,离心5分钟，上清即作为模板DNA。

⑶阴性对照组模板DNA的制备

标准菌株：产肠毒素大肠埃希氏菌O125:K71(Enterotoxigenic escherichia coil O125:K71)购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Centre Of Industrial Culture Collection, CICC)，编号No. 10415。

菌株复苏步骤及模板DNA制备与阳性对照组一致。

⑷空白对照组模板DNA的制备

空白对照组的模板采用无RNA酶超纯水，购置于大连宝生物公司（Takara.Co）。

三 进行沙门氏菌的环介导等温扩增反应：

A. 在装有24μlLAMP反应液的反应管中加入1μl待检模板DNA。

B. 于60-65°C的水浴锅中保温60分钟。

C.   80°C保温灭活5分钟。

四 显色检测：

反应结束后，加入质量分数为10%的荧光染料赛博绿Ⅰ水溶液1μl,用手甩动反应管，3分钟后用肉眼直接观察颜色变化，阳性对照组反应混合液的颜色由橙色变成绿色，阴性对照组及空白对照组反应混合液的颜色无变化均为橙色，而标准品反应混合液的颜色如果从橙色变成绿色，说明待检标准品为沙门氏菌，如果标准品反应混合液的颜色无变化均为橙色，则说明待检标准品不含沙门氏菌。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  四川农业大学

<120>基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒及其检测方法

<160>  6

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  上游外引物F3

<400>  1

cgaagaaagc tttgcctgtg        20

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  下游外引物B3

<400>  2

cagtacgcga agccttgtt         19

<210>  3

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  上游内引物FIP

<400>  3

gcacgtcagc aaagcgtacc ttgggaaggt taaggagggt ga   42

<210>  4

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  下游内引物BIP

<400>  4

agaggcgcct tgcgctaaag ccaaacctcg cttatcggaa    40

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  上游环引物LF

<400>  5

cgtgtagttt accggcttaa acaa     24

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  下游环引物LB

<400>  6

caatcatcaa ccagtcagta cggc     24

 

Claims (4)

1.基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，含有以下特异性引物：

上游外引物F3如SEQ ID NO.1所示，下游外引物B3如SEQ ID NO.2所示，上游内引物FIP如SEQ ID NO.3所示，下游内引物BIP如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于：还包括上游环引物LF如SEQ ID NO.5所示；下游环引物LB如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求2所述的基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有24μL反应体系的试剂，所述24μL反应体系的试剂包括：浓度各为0.2 μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3,浓度各为0.8μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP, 浓度各为0.4μmol/L的上游环引物LF和下游环引物LB，浓度为1.0 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液, 浓度为1mol/L的甜菜碱, PH值为8.8、浓度为25mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 , 浓度为10 mmol/L 氯化钾, 浓度为10 mmol/L 硫酸铵, 浓度为5 mmol/L 硫酸镁, 质量百分数为0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚, 8 单位Bst DNA 聚合片段酶, 余量为无RNA酶超纯水。

4.权利要求1～3任一项所述基于fimY基因的沙门氏菌检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体由以下步骤组成：

A、提取待测样品的DNA作为模板DNA，控制模版DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μl范围内；

B、在24μL反应体系的试剂中加入1μl待测模版DNA水溶液，并在60～65°C条件下保温60分钟，80°C保温5分钟终止反应液；

C、反应终止后，加入质量分数为10%的荧光染料赛博绿Ⅰ水溶液1μl,用肉眼观察颜色变化，如果颜色为橘黄色，说明待检样品不含沙门氏菌；如果颜色变为绿色，则说明样品中含有沙门氏菌。