CN104004835A - 一种兔皮肤真菌复合pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于,包括以下步骤：(1)疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的病料用热裂解法提取DNA；(2)合成Pa，Pb；Pc，Pd；Pe，Pf三对特异引物；(3)以病料DNA为模板，Pa-Pf3对引物混合为引物进行PCR扩增；(4)电泳检测PCR产物。本发明的有益之处在于：提供了一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，经过一次PCR就能鉴别3种皮肤真菌。较传统直接显微观察和病原分离培养等方法特异性强、敏感性高、省时；与其他分子生物学方法比，减少了PCR次数，也不需序列测定，具有简单、快速、经济等特点，且非常适合大规模样品检测。

Description

一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种兔皮肤真菌感染的检测方法，具体涉及一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
皮肤真菌(Dermatophyte)是皮肤真菌病的病原菌。兔皮肤真菌病(Dermatomycosis)是一类传染性极强的人畜共患病，不仅危害养兔业，造成重大经济损失，还传染人，影响人体健康。皮肤真菌病的病原涉及三个属，分别为毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)和表皮癣菌属(Epidermophyton)。兔皮肤真菌流行病学调查显示须癣毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌是最常见皮肤真菌。不同的皮肤真菌侵染部位不同，引起的病变有差异，用药和采取防控措施也各不相同，因此，对皮肤病真菌种类鉴定显得非常重要。
目前，常见皮肤真菌检测方法包括：病料直接显微观察、病原分离培养和分子生物学方法。病料直接显微观察简单、快速，但无法鉴别真菌的种类，有5％-15％假阴性；病原分离培养虽然通过菌落、菌丝和孢子的形态，结合生化试验，可以明确真菌种类，但由于皮肤真菌生长缓慢，一般为3-4周，耗时长，且有40％假阴性；分子生物学方法包括染色体DNA G+C的含量、总DNA同源性、线粒体DNA限制酶断片长度多态分析、随机引物PCR、随机扩增DNA多态性分析、PCR指纹等。最近发现，采用核糖体DNA(rDNA)区及rRNA小亚基序列分析，特别是ITS(analysis of internal transcribed spacer)区分析比对编码rRNA小亚基(18SrRNA)基因更适应对皮肤真菌检测，目前，把rDNA的ITS区序列分析称为皮肤癣菌鉴定的金标准。虽然该方法特异、敏感，但需要基因序列的测定及分析，这限制了此方法的应用，且一次反应仅能鉴定一种真菌，不适合大规模样品检测。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有特异性强、敏感性高，成本低，且适合大规模样品检测的兔皮肤真菌复合PCR检测方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)病料DNA提取：疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的病料采用热裂解的方法提取DNA；
(2)引物的合成：
须癣毛癣菌特异引物：Pa5'GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3'
                    Pb5'GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3'
犬小孢子菌特异引物：Pc5'GACCGCCCGTCGCT ACTAT3'
                    Pd5'TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3'
絮状表皮癣菌特异引物：Pe5'GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3'
                      Pf5'CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3'；
(3)复合PCR：以病料DNA为模板，Pa-Pf3对引物混合为引物进行PCR扩增；
(4)PCR产物检测：采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,凝胶成像分析仪观察结果。
前述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR的反应体系为：Mixtures10μL，三对引物Pa-Pf最终浓度0.2mM，模板DNA4μL，加ddH2O至总体积20μL。
前述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR循环参数为：94℃初始变性5min,94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃终延伸10min。
前述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，前述须癣毛癣菌特异引物、犬小孢子菌特异引物和絮状表皮癣菌特异引物的浓度配比为1：1：1。
本发明的有益之处在于：采用复合PCR方法，所用样品量少，经过一次PCR就能鉴别3种皮肤真菌。较传统直接显微观察和病原分离培养等方法特异性强、敏感性高、省时；与其他分子生物学方法比，减少了PCR次数，也不需序列测定，具有简单、快速、经济等特点，且非常适合大规模样品检测。
附图说明
图1是本发明所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法的一个具体实施例中获得的电泳图。
图中，M为DNA分子质量标准；F1，F2，F3为疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的3组病料；F4为阳性对照；F5，F6为阴性对照。
具体实施方式
1.DNA提取
(1)菌株DNA提取：将须癣毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的菌株接种在沙堡弱SDA培养液，27℃，震荡培养8天，收获；取真菌团块放入500μL裂解液(400mM Tris-HCl(pH8.0)，60mMEDTA(pH8.0)，150mM NaCl，1％十二烷基硫酸钠)；室温放置10min，加150μL乙酸钾(pH4.8)，漩涡震荡，离心12000g，1min；上清液放入新试管，加入等体积异丙醇；DNA团块用70％乙醇洗，干燥后，溶解在50μL的TE(10mM Tris，1mM EDTA)中，2μLDNA用于后续PCR。菌株DNA模板作为阳性对照组。
(2)病料DNA提取：将疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的三组病料F1，F2，F3分别进行下述操作：将病料加入100μL提取液(60mM NaHCO3，250mM KCI，50mM Tris，pH9.5)95℃，10min；加100μL2％牛血清蛋白，漩涡震荡，即可用于后续PCR。病料DNA模板作为实验样品组。
(3)阴性对照：取没有感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的两组DNA样品F5，F6为阴性对照组。
2.引物的合成
须癣毛癣菌特异引物：Pa5'GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3'
                    Pb5'GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3'
犬小孢子菌特异引物：Pc5'GACCGCCCGTCGCT ACTAT3'
                    Pd5'TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3'
絮状表皮癣菌特异引物：Pe5'GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3'
                      Pf5'CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3'；
引物合成在北京生工生物技术有限公司，预期扩增出目的片段大小须癣毛癣菌为：288bp，犬小孢子菌为：500bp，絮状表皮癣菌为：366bp。
3.复合PCR
(1)PCR反应体系：Mixtures10μL，三对引物Pa-Pf最终浓度0.2mM，三对引物的浓度配比为1：1：1，须癣毛癣菌特异引物、犬小孢子菌特异引物和絮状表皮癣菌特异引物的量分别为：1μL，模板DNA4μL，加ddH2O至总体积20μL。
(2)PCR循环参数：94℃初始变性5min,94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃终延伸10min。获得须癣毛癣菌DNA核酸序列SEQ.ID.No：1，犬小孢子菌DNA核酸序列SEQ.ID.No：2，絮状表皮癣菌DNA核酸序列SEQ.ID.No：3。
4.PCR产物检测：取5μL反应产物于1％含溴乙锭的琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像分析仪观察，见图1：F1组出现500bp条带，表明F1组病料感染了犬小孢子菌；F2组出现366bp条带，表明F2组病料感染了絮状表皮癣菌；F3组出现288p条带，表明F3组病料感染了须癣毛癣菌。
由此可见，本发明的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，所用样品量少，经过一次PCR就能鉴别3种皮肤真菌，较传统直接显微观察和病原分离培养等方法特异性强、敏感性高、省时；与其他分子生物学方法比，减少了PCR次数，也不需序列测定，具有简单、快速、经济等特点，且非常适合大规模样品检测。

Claims (4)

1.一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)病料DNA提取：疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的病料采用热裂解的方法提取DNA；
(2)引物的合成：
须癣毛癣菌特异引物：Pa5'GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3'
                    Pb5'GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3'
犬小孢子菌特异引物：Pc5'GACCGCCCGTCGCT ACTAT3'
                    Pd5'TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3'
絮状表皮癣菌特异引物：Pe5'GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3'
                      Pf5'CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3'；
(3)复合PCR：以病料DNA为模板，Pa-Pf3对引物混合为引物进行PCR扩增；
(4)PCR产物检测：采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,凝胶成像分析仪观察结果。
2.根据权利要求1所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR的反应体系为：Mixtures10μL，三对引物Pa-Pf最终浓度0.2mM，模板DNA4μL，加ddH2O至总体积20μL。
3.根据权利要求2所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR循环参数为：94℃初始变性5min,94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃终延伸10min。
4.根据权利要求1、2或3所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，所述须癣毛癣菌特异引物、犬小孢子菌特异引物和絮状表皮癣菌特异引物的浓度配比为1：1：1。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104195263A (zh) * 2014-09-24 2014-12-10 河北工程大学 一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法
CN104878118A (zh) * 2015-06-25 2015-09-02 河北工程大学 一种双重定量pcr检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法
CN106635828A (zh) * 2016-11-15 2017-05-10 河北工程大学 兔须癣毛癣菌角质蛋白培养基及其制作方法
CN111961745A (zh) * 2020-09-02 2020-11-20 上海捷诺生物科技有限公司 用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006133701A2 (en) * 2005-06-14 2006-12-21 Statens Serum Institut Pcr diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006133701A2 (en) * 2005-06-14 2006-12-21 Statens Serum Institut Pcr diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TOSHIO KANBE等: "Species-identification of dermatophytes Trichophyton, Microsporum and Epidermophyton by PCR and PCR-RFLP targeting of the DNA topoisomerase II genes", 《JOURNAL OF DERMATOLOGICAL SCIENCE》, vol. 33, no. 1, 31 December 2003 (2003-12-31), pages 41 - 54 *
Y.GRASER等: "Identification of common dermatophytes (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton) using polymerase chain reactions", 《BRITISH JOURNAL OF DERMATOLOGY》, vol. 138, no. 4, 30 April 1998 (1998-04-30), pages 576 - 582 *
崔丽娜等: "家兔皮肤真菌病的研究进展", 《家畜生态学报》, vol. 32, no. 1, 31 January 2011 (2011-01-31), pages 102 - 106 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104195263A (zh) * 2014-09-24 2014-12-10 河北工程大学 一种SYBR Green I荧光定量PCR检测兔须癣毛癣菌的方法
CN104878118A (zh) * 2015-06-25 2015-09-02 河北工程大学 一种双重定量pcr检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法
CN106635828A (zh) * 2016-11-15 2017-05-10 河北工程大学 兔须癣毛癣菌角质蛋白培养基及其制作方法
CN111961745A (zh) * 2020-09-02 2020-11-20 上海捷诺生物科技有限公司 用于一次性检测多种皮肤真菌的方法和试剂盒

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