CN105256052B - 一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法。本发明提供的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，包括军团菌属特异引物、嗜肺军团菌特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物、长滩军团菌特异引物、麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物。本发明提供的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，不仅能够检测军团菌属细菌，还可将检出的军团菌分型为六个种和1个血清型的军团菌，具有特异性好和准确性高的优点，极大的提高了检测效率。

Description

一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法。
背景技术
军团菌（Legionella）是一种兼性细胞内寄生菌，广泛存在于自然界、人工水体和土壤环境中。目前已经确认的军团菌属有58种，包括有70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离出来。现代研究发现，约有一半的军团菌种与人类疾病有关，其中约90%军团菌感染是由嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）引起，其中以血清型1型的嗜肺军团菌（Legionella pneumophila serogroup1）感染居多，占所有军团菌感染病例的85%左右。除此之外，约10%的军团菌感染由非嗜肺军团菌导致。在非嗜肺军团菌感染中，60%的感染病例由麦氏军团菌（Legionella micdadei）引起，其次为杜氏军团菌（Legionella domoffii），博兹曼军团菌（Legionella bozemanae），长滩军团菌(Legionella longbeachae)和菲氏军团菌(Legionella feeleii)等引起。
尽管在全球范围内的非嗜肺军团菌感染病例中，大部分由麦氏军团菌感染引起，但是长滩军团菌感染在一定的区域内占据主导，如澳大利亚，新西兰，泰国，日本等地军团菌感染病例中长滩军团菌感染占所有军团菌感染病例的30-50%。军团菌通过空气以气溶胶的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种能检测军团菌并能将检出的军团菌分型为常见致病性军团菌的方法具有重要的临床意义。
目前军团菌感染及军团菌的检测方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作提供了较简便和准确的方法。多重PCR 方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军团菌中的特异基因，以达到快速检测军团菌的目的。
中国专利CN102140514B公开了一种检测嗜肺军团菌多种血清型致病菌特异性引物及试剂盒，所述试剂盒可同时检测5种血清型嗜肺军团菌，而且该检测方法周期短、速度快、可操作性强，其检测结果与经提取得到的DNA作为模板扩增所得的结果一致，是一种理想的嗜肺军团菌多种血清型致病菌的检测方法。但是，该检测方法的检测对象只针对嗜肺军团菌，不利于对非嗜肺军团菌的检测。
中国专利申请201410607389.6公开了一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法，所述检测方法主要是针对军团菌种属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团菌I型的16SrRNA、danI和ORF9三个基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR方法，该检测方法可以对分离培养到的军团菌菌株进行快速有效的判定。但是，该检测方法只对特定军团菌菌株进行分型，检测范围较狭窄，而且特异性不强，不利于该检测方法的推广和应用。
发明内容
为了解决现有技术中军团菌的检测方法存在检测范围窄、特异性不强的缺陷，本发明提供了一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法，以解决上述问题。
本发明提供了一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液，所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有包括军团菌属特异引物、嗜肺军团菌特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物、长滩军团菌特异引物、麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物；所述军团菌属特异引物为：
GL-388F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’ (SEQ ID NO.1)，
GL-388R：5’-CCAACAGCTAGTTGACATCGT-3’ (SEQ ID NO.2)；
所述嗜肺军团菌特异引物为：
LP-229F：5’-TCCGATGGTCAAGTGCGT-3’ (SEQ ID NO.3)，
LP-229R ：5’- TGAAGGGACTTGATGTGGCA-3’ (SEQ ID NO.4)；
所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物为：
LPsg1-wzt-93F：5’-GCCACTGCCTTCATCCATT-3’ (SEQ ID NO.5),
LPsg1-wzt-93R: 5’-CGCAAAGCCCAGAAATGAT-3’ (SEQ ID NO.6)；
所述长滩军团菌特异引物：
llo0050-567F：5’-GCGCGCTGGTAATCCTAATA-3’ (SEQ ID NO.7)，
llo0050-567R：5’-TTGCTGCACGTACTGTCTT-3’ (SEQ ID NO.8)；
所述麦氏军团菌特异引物为：
LmgyrB-785F：5’-TGCATTTAACCATTCGTCGTAAC-3’ (SEQ ID NO.9)，
LmgyrB-785R：5’-AGTCATTTCTCTTGCTTTGCGA-3’ (SEQ ID NO.10)；
所述博兹曼军团菌特异引物为：
LbgyrB-692F：5’-AATGCCTTATCCGAGGAAT-3’ (SEQ ID NO.11)，
LbgyrB-692R：5’-TCAGCAACACTGGACTCAA-3’ (SEQ ID NO.12)；
所述杜氏军团菌特异引物为：
LdgyrB-471F：5’-TTCGGGTGTATGCATTCAC-3’ (SEQ ID NO.13)，
LdgyrB-471FR:5’-TCAGCAACGCTGGATTCAA-3’ (SEQ ID NO.14)；
所述菲氏军团菌特异引物为：
LfgyrB-293F：5’-CAGAAGAGTTACATCTATCGATTCA-3’ (SEQ ID NO.15)，
LfgyrB-293R：5’-AAAGGCCTGAATTCCTCCC-3’ (SEQ ID NO.16)。
进一步地，所述军团菌属特异引物的靶基因为16s rRNA基因；所述嗜肺军团菌特异引物的靶基因为lpp0267基因；所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物的靶基因为wzt基因；所述长滩军团菌特异引物的靶基因为llo0050基因；所述麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物的靶基因均为gyrB基因。
进一步地，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex 100 resin 5%；Tris-HCl10 mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠 0.1 mM；叠氮钠 0.1 %；蛋白酶K 200μg/ml。
进一步地，所述PCR反应液为2×PCR反应液，所述2×PCR反应液的组分及其组分浓度为：0.1 U/µl EasyTaq DNA聚合酶；500 µM dNTP ；20 mM Tris-HCl，pH8.3；100 mM KCl；3 mM MgCl2。
进一步地，所述16条引物同时存在于同一反应体系中的浓度分别为：GL-388F、GL-388R、LP-229F和LP-229R的浓度为150-300nM；LPsg1-wzt-93F、LPsg1-wzt-93R、llo0050-567F、llo0050-567R、LmgyrB-785F、LmgyrB-785R、LbgyrB-692F、LbgyrB-692R、LfgyrB-293F、LfgyrB-293R和LdgyrB-471F的浓度为200-350nM；LdgyrB-471R的浓度为400-600nM。
更进一步地，所述16条引物同时存在于同一反应体系中的浓度分别为：GL-388F、GL-388R、LP-229F和LP-229R的浓度为200nM；LPsg1-wzt-93F、LPsg1-wzt-93R、llo0050-567F、llo0050-567R、LmgyrB-785F、LmgyrB-785R、LbgyrB-692F、LbgyrB-692R、LfgyrB-293F、LfgyrB-293R和LdgyrB-471F的浓度为250nM；LdgyrB-471R的浓度为500nM。
进一步地，所述阳性对照液还包括嗜肺军团菌血清型1型基因组DNA、长滩军团菌基因组DNA、麦氏军团菌基因组DNA、博兹曼军团菌基因组DNA、杜氏军团菌基因组DNA和菲氏军团菌基因组DNA。
另外，本发明还提供了一种用于军团菌快速检测与分型的检测方法，包括如下步骤：
S1应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA；
S2以细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物、嗜肺军团菌特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物、长滩军团菌特异引物、麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物进行多重PCR扩增；
S3将阳性对照液和阴性对照液同时进行多重PCR扩增；
S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
进一步地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：94℃ 3min；阶段2：94℃ 25s；阶段3：55℃ 25s；阶段4：72℃ 40s；35个循环；阶段5：72℃ 5min；在4℃贮存。
进一步地，所述步骤S2中军团菌属特异引物扩增的序列为388bp，所述嗜肺军团菌特异引物扩增的序列为229bp，所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物扩增的序列为93bp，所述长滩军团菌特异引物扩增的序列为567bp，所述麦氏军团菌特异引物扩增的序列为785bp，所述博兹曼军团菌特异引物扩增的序列为692bp，所述杜氏军团菌特异引物扩增的序列为471bp，所述菲氏军团菌特异引物扩增的序列为293bp。
其中，所述军团菌属特异引物（GL-388F）-（GL-388R）扩增的序列为388bp，该序列为军团菌属16S rDNA基因一段保守序列，具体序列如下：
GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAGGGTTAATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGG；
所述嗜肺军团菌特异性引物（LP-229F）-（LP-229R）引物对扩增的序列为229bp，该序列为嗜肺军团菌lpp0267基因内一段保守序列，具体序列为：
TCCGATGGTCAAGTGCGTAGGTATTGTGCCTGATTATCCACAGCATAAAGGAACAGAGTATCTTACAGCCTCACCTTTATATAACCATTACTTTAAGGCGATAGAGGAGTTTGATAAAGAGTTTGCTGAGGTTCATGAAAAAATTTGGCAGGAGTACCTTACGTATTTCCGTATGACTTATATGCCCGTTTGTATGCGTGATCATTGCCTGCCACATCAAGTCCCTTCA；
所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物对（LPsg1-wzt-93F）-（LPsg1-wzt-93R）扩增的序列为93bp，该序列为嗜肺军团菌血清型1型wzt基因一段保守序列，具体序列如下：
GCCACTGCCTTCATCCATTGCACAAGAAGGTAGAACTGTAGTCGATGCAAGTCAAATTAGCCCGGAATATCCCAATCATTTCTGGGCTTTGCG；
所述长滩军团菌特异引物对（llo0050-567F）-（llo0050-567R）扩增的序列为567bp，该序列为长滩军团菌llo0050基因上一段保守序列，具体序列如下：
GCGCGCGCTGGTAATCCTAATATAAAAATTTTAATTTCACTGGGATGGGGAAAAAAAGATTGGACCTACATTAATAATGACTATGTGAATCGAGCCAATATCTTCGTACCCAGCGTGATTCAATTTATTCGCAGCAATCATCTGGATGGGCTTGATATTGATGATGAAAGCATAGGTGACTCCAGTGGTTCTATTCCCCAGGCCAATTTCGATGGGGTAGTTGCCAATTTAAGGAATGCGTTAAATTATGCAGCACTGCAAGACGGAAAACCTTATTACCTTACCATTACCCCTGCTGGAAATAATGATGAACCAGGTGGCATTGTCGCAACACAGGTAAACATGTTAAATGCCAACAGTTTTGATTTAATTAATATTCAAAGTTATTTTGGTGATGGCGGTTGGGGGGATGATTTCTTTGATGCACTTGTTGCAATAGGCTATCCTAAACAGCAAATTGCAAATGGAATTGATACTCAGGAAACAAATTGTGATCCTGAATATCCGCCCTACATCGGTTTAGCAGGAATATTTAACTGGAATATGACTAAAGACAGTACGTGCAGCAA；
所述麦氏军团菌特异引物对（LmgyrB-785F）-（LmgyrB-785R）扩增的序列为785bp，该序列为麦氏军团菌gryB基因上一段保守序列，具体序列如下：
TGCATTTAACCATTCGTCGTAACGGAAAAGTACACGAACAACACTATCGCAACGGTGTTCCAGATGCACCATTGGCGATGACAGGTGAGGCAAATACGACTGGAACTCAAGTTTGGTTTAAACCCAGCGCAAATACCTTTAGCAACATTGAGTTTCATTATGACATCCTTGCTAAACGCCTACGTGAACTTTCATTCCTGAATTCAGGCGTTCGCATCCATTTATATGATGAGCGTACCCAGAAGCAAGACACATTTTGCTACGAAGGCGGCATTAAAGCGTTTGTGGAACATTTAAACCGCAATAAAACGCCCATTATGCCCGTTGTTTTTTCGCTTAGCGGCGAAAGAGACAATATCAGTGTGGAATTATCCATGCAATGGAATGATTCATTTCAAGAAACCATATTTTGTTTCACGAATAACATTCCCCAACGCGATGGAGGAACCCATTTAGCTGGTTTTAGGGCGGCATTAACGCGCACTCTTAATTCTTATATTGAAAACGAAGGGTATGCGAAAAAAGCAAAAATCACGACAACAGGTGATGATGCAAGGGAGGGATTAACCGCAGTATTATCAGTAAAAGTTCCGGATCCAAAATTCTCATCACAAACAAAAGATAAACTTGTCTCTTCAGAAGTGAAAGCAGTCGTCGAGTCTCTGGTTTCAGAAAAATTGAATGATTTCTTATTAGAAAACCCTACCGTTGCAAAATCGATTGTGGGGAAAATTATCGATGCTGCACGCGCGAGGGAAGCGGCTCGCAAAGCAAGAGAAATGACT；
所述博兹曼军团菌特异引物对（LbgyrB-692F）-（LbgyrB-692R）扩增的序列为692bp，该序列为博兹曼军团菌gyrB基因上一段特异保守序列，具体序列如下：
AATGCCTTATCCGAGGAATTACATTTAACCGTACGTCGTCATGGTAAAATCCATGAGCAACATTACCGTAATGGAGTTCCAGATGCGCCAATGGCAGAAACAGGAGATGCATCGACAACCGGAACTCAAATTTGGTTTAAACCAAGTGCCGAAACGTTTTCTAATATTGAGTTTCACTATGATATTTTAGCAAAACGGCTAAGAGAATTATCTTATTTAAATTCAGGTGTTTGCATCCATTTATTCGATGAGCGATCCCAAAGGCAAGACACTTTTCATTATGAAGGTGGAATCACGGCATTTGTGGAGCATCTCAATAAAAATAAAAATACTATTATGCCCACTGTTTTTTCTATGACCGCTGAAAAAGATAACATTGTTGTTGAACTGTCTATGCAGTGGAATGATTCTTATCAAGAAACACTTTATTGCTTTACAAATAATATCCCTCAGCGTGACGGTGGAACACATATGGCTGGGTTCAGAGCTGCATTAACAAGAACTTTAAATAACTACATCGAAAGTGAAGGTTATGCTAAAAAAGCTAAAGTATCTCCAACAGGTGATGATGCTCGAGAAGGATTAACCGCAGTACTTTCTGTTAAAGTACCTGATCCCAAGTTCTCTTCACAAACAAAGGATAAGTTAGTTTCTTCGGAAGTAAAATCAGTTGTTGAGTCCAGTGTTGCTGA；
所述杜氏军团菌特异引物对（LdgyrB-471F）-（LdgyrB-471R）扩增的序列为471bp，该序列为杜氏军团菌gyrB基因上一段特异保守序列，具体序列如下：
TTCGGGTGTATGCATTCACTTATTTGATGAGCGCTCACAAAGACAAGACACCTTTCATTACGAAGGTGGAATAAAGGCATTCGTGGAACATCTCAATAAAAATAAAAATGTCATTATACCGACAGTTTTTTCTATGTCTGCTGAAAAGGATAATATTGTTGTTGAGTTATCAATGCAGTGGAATGATTCGTACCAGGAAACCCTTTATTGTTTTACAAACAATATCCCCCAACGCGACGGTGGAACTCATATGGCCGGCTTCAGAGCGGCATTAACCCGTACTCTGAATAACTACATTGAAAACGAAGGTTATGCCAAAAAAGCTAAAGTATCCCCTACGGGAGATGATGCCCGCGAAGGATTAACTGCAGTTCTGTCGGTTAAAGTACCTGATCCTAAATTTTCTTCACAAACTAAAGATAAACTTGTTTCCTCCGAAGTAAAATCAGTGGTTGAATCCAGCGTTGCTGA；
所述菲氏军团菌特异引物对（LfgyrB-293F）-（LfgyrB-293R）扩增序列为293bp，该序列为菲氏军团菌gyrB基因上一段特异保守序列，具体序列如下：
CAGAAGAGTTACATCTATCGATTCACCGAAATGGAAAGCTGCACGAACAGCACTACCGTAATGGTGTTCCCGACGCACCCCTTGCAGTGACAGGGGATGCAACTGCAACAGGGACACAAGTTTGGTTTAAACCAAGTGCCAACACCTTTAACAATATTGAATTCCATTACGATATACTTGCCAAGCGTTTAAGAGAACTCTCTTTCCTTAACTCCGGCGTTTGCATTTATCTTTACGACGAACGGTCTCAAAAGCAGGATACTTTCCGCTATGAGGGAGGAATTCAGGCCTTT。
本发明提供的用于军团菌快速检测与分型的方法是利用多重PCR原理，利用不同类型的军团菌菌株含有不同的特异基因，或相同的基因，而这些相同的基因其片段在不同菌种间的变异性，设计出针对不同类型菌株的8对特异性引物。将这8对特异性引物放在同一体系中采用多重PCR的方式进行扩增，如果扩增出某种类型菌株含有的某个基因的特异片段，则说明存在该类型菌株。
发明人是经过生物信息学方法的研究发现16s rDNA基因388bp序列是所有军团菌属细菌中高度保守的基因序列，而lpp0267基因为嗜肺军团菌所独有，wzt基因为嗜肺军团菌血清型1型菌株所独有，llo0050基因为长滩军团菌所独有，gyrB基因在麦氏军团菌、博兹曼军团菌、杜氏军团菌和菲氏军团菌种均存在，但其在不同菌种间的变异性很大，因此利用其在不同菌种间的变异性，设计针对上述四种不同菌种特异的引物扩增gyrB基因里不同大小片段。此外，发明人经过生物信息学方法的分析，也发现这16条引物，除了上述的8对引物对的配对方法能够扩增出不同长度的特异片段外，其他方式的两两组合方式，共计112种引物两两配对方式，均无非特异性片段出现，保证了反应的特异性。
本发明提供的用于军团菌快速检测与分型检测方法的结果判定方法是：对PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果进行分析，若出现388bp条带，则说明检测标本中含有军团菌属细菌，反之，则说明检测标本中不含军团菌属细菌；若除了出现388bp条带外还出现了229bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌；若除了388bp和229bp条带，还出现了93bp条带，则说明检测到的嗜肺军团菌军团菌为嗜肺军团菌血清型1型菌株，如未出现93bp条带，出现其他条带，则为嗜肺军团菌除1型外的其他血清型菌株；若除了出现388bp条带还出现567bp条带，则说明检出的军团菌为长滩军团菌；如除了出现388bp条带还出现785bp条带，则说明检出的军团菌为麦氏军团菌；如除了388bp条带还出现692bp条带，则说明检出的军团菌为博兹曼军团菌；如除了388bp条带还出现471bp条带，则说明检出的军团菌为杜氏军团菌；如除了388bp条带还出现293bp条带，则说明检出了菲氏军团菌；如仅出现388bp条带，无上述其他条带，则检出的军团菌为除上述5种非嗜肺军团菌外的其他非嗜肺军团菌种菌株。
除此之外，若除了388bp条带还出现了其他的一些条带组合，如229bp条带和567bp条带，则说明检出了嗜肺军团菌非血清型1型菌株和长滩军团菌，其余组合状况可如此类推。
本发明提供用于军团菌快速检测与分型的试剂盒不仅能在临床中应用，还可以应用于环境水标本中，为环境水源风险性控制及军团菌感染流行病学调查提供依据和工具，有利于该检测方法的推广和应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，不仅能够检测军团菌属细菌，还可将检出的军团菌分型为六个种和1个血清型的军团菌，具有特异性好和准确性高的优点，提高了检测效率。此外，本发明还提供用于军团菌快速检测与分型的检测方法，通过使用本发明提供的特异性的引物，可以快速、简便的检测出军团菌，还可将检出的军团菌分型为六个种和1个血清型的常见致病性军团菌，该检测方法无需进行多次凝胶电泳分析，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的方法。
附图说明
图1为PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700、800、900、1000、1200和1500bp，1-12分别为各个不同菌种的鉴定结果，PC为阳性对照，NC为阴性对照。
具体实施方式
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。其中，Chelex 100 resin购买自bio-rad公司（货号:1432832）。
实施例1、引物
本发明提供一种用于军团菌快速检测与分型的引物。
表1 本发明提供的引物
实施例2、引物的配对及其扩增片段大小
本发明提供的军团菌属特异引物对扩增片段为388bp，嗜肺军团菌种特异引物扩增片段为229bp，嗜肺军团菌血清型1型特异引物扩增片段为93bp，长滩军团菌特异引物扩增片段为567bp，麦氏军团菌特异引物扩增片段为785bp，博兹曼军团菌特异引物扩增片段为692bp，杜氏军团菌特异引物扩增片段为471bp和菲氏军团菌特异引物扩增片段为293bp。
表2 引物的配对及其扩增片段大小
其中：
（1）GL-388F 与GL388-R 引物扩增的核苷酸序列为：
GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAGGGTTAATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGG；
（2）LP-229F 和LP-229R引物扩增的核苷酸序列为：
TCCGATGGTCAAGTGCGTAGGTATTGTGCCTGATTATCCACAGCATAAAGGAACAGAGTATCTTACAGCCTCACCTTTATATAACCATTACTTTAAGGCGATAGAGGAGTTTGATAAAGAGTTTGCTGAGGTTCATGAAAAAATTTGGCAGGAGTACCTTACGTATTTCCGTATGACTTATATGCCCGTTTGTATGCGTGATCATTGCCTGCCACATCAAGTCCCTTCA；
（3）LPsg1-wzt-93F和LPsg1-wzt-93R扩增的核苷酸序列为：
GCCACTGCCTTCATCCATTGCACAAGAAGGTAGAACTGTAGTCGATGCAAGTCAAATTAGCCCGGAATATCCCAATCATTTCTGGGCTTTGCG；
(4) llo0050-567F和llo0050-567R扩增的核苷酸序列为：GCGCGCGCTGGTAATCCTAATATAAAAATTTTAATTTCACTGGGATGGGGAAAAAAAGATTGGACCTACATTAATAATGACTATGTGAATCGAGCCAATATCTTCGTACCCAGCGTGATTCAATTTATTCGCAGCAATCATCTGGATGGGCTTGATATTGATGATGAAAGCATAGGTGACTCCAGTGGTTCTATTCCCCAGGCCAATTTCGATGGGGTAGTTGCCAATTTAAGGAATGCGTTAAATTATGCAGCACTGCAAGACGGAAAACCTTATTACCTTACCATTACCCCTGCTGGAAATAATGATGAACCAGGTGGCATTGTCGCAACACAGGTAAACATGTTAAATGCCAACAGTTTTGATTTAATTAATATTCAAAGTTATTTTGGTGATGGCGGTTGGGGGGATGATTTCTTTGATGCACTTGTTGCAATAGGCTATCCTAAACAGCAAATTGCAAATGGAATTGATACTCAGGAAACAAATTGTGATCCTGAATATCCGCCCTACATCGGTTTAGCAGGAATATTTAACTGGAATATGACTAAAGACAGTACGTGCAGCAA；
（5）LmgyrB-785F和LmgyrB-785R扩增的核苷酸序列为：
TGCATTTAACCATTCGTCGTAACGGAAAAGTACACGAACAACACTATCGCAACGGTGTTCCAGATGCACCATTGGCGATGACAGGTGAGGCAAATACGACTGGAACTCAAGTTTGGTTTAAACCCAGCGCAAATACCTTTAGCAACATTGAGTTTCATTATGACATCCTTGCTAAACGCCTACGTGAACTTTCATTCCTGAATTCAGGCGTTCGCATCCATTTATATGATGAGCGTACCCAGAAGCAAGACACATTTTGCTACGAAGGCGGCATTAAAGCGTTTGTGGAACATTTAAACCGCAATAAAACGCCCATTATGCCCGTTGTTTTTTCGCTTAGCGGCGAAAGAGACAATATCAGTGTGGAATTATCCATGCAATGGAATGATTCATTTCAAGAAACCATATTTTGTTTCACGAATAACATTCCCCAACGCGATGGAGGAACCCATTTAGCTGGTTTTAGGGCGGCATTAACGCGCACTCTTAATTCTTATATTGAAAACGAAGGGTATGCGAAAAAAGCAAAAATCACGACAACAGGTGATGATGCAAGGGAGGGATTAACCGCAGTATTATCAGTAAAAGTTCCGGATCCAAAATTCTCATCACAAACAAAAGATAAACTTGTCTCTTCAGAAGTGAAAGCAGTCGTCGAGTCTCTGGTTTCAGAAAAATTGAATGATTTCTTATTAGAAAACCCTACCGTTGCAAAATCGATTGTGGGGAAAATTATCGATGCTGCACGCGCGAGGGAAGCGGCTCGCAAAGCAAGAGAAATGACT；
（6）LbgyrB-692F和LbgyrB-692R扩增的核苷酸序列为：
AATGCCTTATCCGAGGAATTACATTTAACCGTACGTCGTCATGGTAAAATCCATGAGCAACATTACCGTAATGGAGTTCCAGATGCGCCAATGGCAGAAACAGGAGATGCATCGACAACCGGAACTCAAATTTGGTTTAAACCAAGTGCCGAAACGTTTTCTAATATTGAGTTTCACTATGATATTTTAGCAAAACGGCTAAGAGAATTATCTTATTTAAATTCAGGTGTTTGCATCCATTTATTCGATGAGCGATCCCAAAGGCAAGACACTTTTCATTATGAAGGTGGAATCACGGCATTTGTGGAGCATCTCAATAAAAATAAAAATACTATTATGCCCACTGTTTTTTCTATGACCGCTGAAAAAGATAACATTGTTGTTGAACTGTCTATGCAGTGGAATGATTCTTATCAAGAAACACTTTATTGCTTTACAAATAATATCCCTCAGCGTGACGGTGGAACACATATGGCTGGGTTCAGAGCTGCATTAACAAGAACTTTAAATAACTACATCGAAAGTGAAGGTTATGCTAAAAAAGCTAAAGTATCTCCAACAGGTGATGATGCTCGAGAAGGATTAACCGCAGTACTTTCTGTTAAAGTACCTGATCCCAAGTTCTCTTCACAAACAAAGGATAAGTTAGTTTCTTCGGAAGTAAAATCAGTTGTTGAGTCCAGTGTTGCTGA；
（7）LdgyrB-471F和LdgyrB-471R扩增的核苷酸序列为：
TTCGGGTGTATGCATTCACTTATTTGATGAGCGCTCACAAAGACAAGACACCTTTCATTACGAAGGTGGAATAAAGGCATTCGTGGAACATCTCAATAAAAATAAAAATGTCATTATACCGACAGTTTTTTCTATGTCTGCTGAAAAGGATAATATTGTTGTTGAGTTATCAATGCAGTGGAATGATTCGTACCAGGAAACCCTTTATTGTTTTACAAACAATATCCCCCAACGCGACGGTGGAACTCATATGGCCGGCTTCAGAGCGGCATTAACCCGTACTCTGAATAACTACATTGAAAACGAAGGTTATGCCAAAAAAGCTAAAGTATCCCCTACGGGAGATGATGCCCGCGAAGGATTAACTGCAGTTCTGTCGGTTAAAGTACCTGATCCTAAATTTTCTTCACAAACTAAAGATAAACTTGTTTCCTCCGAAGTAAAATCAGTGGTTGAATCCAGCGTTGCTGA；
（8）LfgyrB-293F和LfgyrB-293R扩增的核苷酸序列为：
CAGAAGAGTTACATCTATCGATTCACCGAAATGGAAAGCTGCACGAACAGCACTACCGTAATGGTGTTCCCGACGCACCCCTTGCAGTGACAGGGGATGCAACTGCAACAGGGACACAAGTTTGGTTTAAACCAAGTGCCAACACCTTTAACAATATTGAATTCCATTACGATATACTTGCCAAGCGTTTAAGAGAACTCTCTTTCCTTAACTCCGGCGTTTGCATTTATCTTTACGACGAACGGTCTCAAAAGCAGGATACTTTCCGCTATGAGGGAGGAATTCAGGCCTTT。
实施例3、一种用于军团菌快速检测与分型的检测方法
1）应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA：选取标本进行预处理，再使用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA，其中，所述DNA提取液的成分如下：
DNA提取液组成 浓度
Chelex 100 resin 5 %质量浓度
Tris-HCl,pH 8.3 10 mM
EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠） 0.1 mM
NaN3（叠氮钠） 0.1 %质量浓度
Protease-K（蛋白酶K） 200 μg/ml
2）以细菌基因组DNA为模板，采用实施例1所述的军团菌属特异引物、嗜肺军团菌种特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物、长滩军团菌特异引物、麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物进行多重PCR扩增；所述的PCR反应混合液由以下组分组成：2×PCR反应混合液（2×EasyTaq PCR SuperMix，含0.1 U Taq Polymerase/µl，500 µM dNTP ，20 mM Tris-HCl (pH8.3)，100 mM KCl，3 mMMgCl2）12.5μL，ddH2O 5.5μL。
3）将阳性对照液和阴性对照液同时进行多重PCR扩增；
4）将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
凝胶成像结果：
（1）阳性对照应该有对照的八条条带分别为785bp、692bp、567bp、471bp、388bp、293bp、229bp和93bp，而阴性对照则无上述条带出现。若凝胶成像后，阴性对照出现388条带，或/和阳性对照未出现785bp、692bp、567bp、471bp、388bp、293bp、229bp和93bp电泳条带，则试验结果不可信，可能存在污染或操作有误。
（2）试验管的产物经过电泳若出现388bp条带，则说明标本中检出了军团菌，若无388bp条带出现，则标本中未检出军团菌，即标本中不存在军团菌；若除了出现388bp条带外还出现了229bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌；若除了388bp和229bp条带，还出现了93bp条带，则说明检测到的嗜肺军团菌军团菌为嗜肺军团菌血清型1型菌株；如未出现93bp条带，出现其他条带，则为嗜肺军团菌除1型外的其他血清型菌株；如除了出现388bp条带还出现567bp条带，则说明检出的军团菌为长滩军团菌；如除了出现388bp条带还出现785bp条带，则说明检出的军团菌为麦氏军团菌；如除了388bp条带还出现692bp条带，则说明检出的军团菌为博兹曼军团菌；如除了388bp条带还出现471bp条带，则说明检出的军团菌为杜氏军团菌；如除了388bp条带还出现293bp条带，则说明检出了菲氏军团菌；如仅出现388bp条带，无上述其他条带，则检出的军团菌为除上述5种非嗜肺军团菌外的其他非嗜肺军团菌种菌株。
（3）若除了388bp条带还出现了其他的一些条带组合，如229bp条带和567bp条带，则说明检出了嗜肺军团菌非血清型1型菌株和长滩军团菌，其余组合状况可如此类推。
实施例4、痰标本的军团菌检测
1.含有嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌的痰标本处理：
1）在1.5 ml离心管中加入0.5 ml军团菌专用的痰消化液；痰消化液为自制，其具体组成为：
二硫苏糖醇（DTT）0.2 g，乙二胺四乙酸0.894 g，氯化钾0.04 g，磷酸氢二钾0.36g和磷酸二氢钾0.04 g, 加双蒸水混匀后定容为10 ml。
2）用枪头或灭菌牙签从痰标本中吸取或挑取约0.5 ml痰标本，置于上述痰消化液中；
3）充分混匀后，37℃水浴10-15 min；
4）在13000 rpm 的离心机中离心5分钟后，弃上清，用0.5 ml无菌水洗涤2次后离心留沉淀。
2.标本中细菌基因组DNA的提取：在上述留取沉淀的离心管中加入细菌基因组DNA提取液100 μl，在56℃水浴30 min，接着在100℃水浴10 min，离心沉淀，在5000 rpm下离心5 min，上清液即为提取到的基因组DNA，供作DNA模版。
3.PCR反应
1）每个标本准备3个PCR管，每管中分别加入PCR反应液11μl和八种引物混合液8.1μl，标记好管的编号。阳性对照及阴性对照亦各为一管，加入19.1μl阳性对照液或阴性对照液编号为PC或NC，直接加入0.9μl双蒸水进行反应；阳性对照液与阴性对照液的组成参见表3。
表3 阳性对照液和阴性对照液的组成配方
阳性对照液组成 体积 阴性对照液组成 体积
2× EasyTaq PCR Supermix 11μl 2× EasyTaq PCR Supermix 11μl
军团菌属特异引物 两条引物各为0.4μl，终浓度为0.2μM 军团菌属特异引物 两条引物各为1μl,终浓度为0.5μM
嗜肺军团菌特异引物 两条引物各为0.4μl，终浓度为0.2 μM 嗜肺军团菌特异引物 两条引物各为0.4μl，终浓度为0.2 μM
嗜肺军团菌血清型1型特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25 μM 嗜肺军团菌血清型1型特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25 μM
长滩军团菌特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25μM 长滩军团菌特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25μM
麦氏军团菌特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25 μM 麦氏军团菌特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25 μM
博兹曼军团菌特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25 μM 博兹曼军团菌特异引物 两条引物各为0.5μl，终浓度为0.25 μM
杜氏军团菌特异引物 上游引物为0.5μl，终浓度为0.25 μM；下游引物为1.0μl，终浓度为0.5μM 杜氏军团菌特异引物 上游引物为0.5μl，终浓度为0.25 μM；下游引物为1.0μl，终浓度为0.5μM
菲氏军团菌特异引物 两条引物各为0.4μl，终浓度为0.25 μM 菲氏军团菌特异引物 两条引物各为0.4μl，终浓度为0.25 μM
嗜肺军团菌血清型1型、长滩军团菌特异引物、麦氏军团菌、博兹曼军团菌、杜氏军团菌、菲氏军团菌 双蒸水 0.9μl
总体积 20μl 总体积 20μl
PCR反应条件为：94℃ 3 min, 94℃ 25 s, 55℃ 25 s, 72℃ 40 s，35个循环，72℃ 5 min, 4℃ 贮存。
4.琼脂糖凝胶电泳
反应完成后，将产物琼脂糖凝胶电泳，取5μl PCR产物和5μlDNA Marker ，加入1.5%琼脂糖凝胶中电泳40 min，DNA Marker的条带从小到大分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700、800、900、1000、1200和1500。
5.试验结果：
试验结果如图1所示，其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700、800、900、1000、1200和1500，1-12分别为各个不同的菌种鉴定结果，PC为阳性对照， NC为阴性对照。1-11道均出现了388bp条带，说明均检出了军团菌属细菌；1道出现了388bp、229bp和93bp条带，说明检出了嗜肺军团菌血清型1型菌株；2-4道仅出现388bp条带和229bp条带，说明检出了嗜肺军团菌非血清型1型菌株，5道出现388bp和567bp条带，说明检出的为长滩军团菌；6道出现了388bp和692bp条带，说明检出了博兹曼军团菌；7道出现388bp和785bp条带，说明检出了麦氏军团菌；8道出现了388bp和471bp条带，说明检出了杜氏军团菌；9道出现了388bp和293bp条带，说明检出了菲氏军团菌；10-11道仅出现388bp条带，说明检出了军团菌属其他种的细菌，这些种不属于非嗜肺军团菌、长滩军团菌种、博兹曼军团菌种、麦氏军团菌种，杜氏军团菌种和菲氏军团菌种；12道未出现388bp条带，说明未检出军团菌。本发明提供的用于军团菌快速检测与分型的方法的检测结果与实际的结果一致，证明本发明提供的用于军团菌快速检测与分型的方法具有良好的实用性。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域检测科技股份有限公司
<120> 一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒及其检测方法
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagggttga taggttaaga gc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaacagcta gttgacatcg t 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgatggtc aagtgcgt 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaagggact tgatgtggca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccactgcct tcatccatt 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgcaaagccc agaaatgat 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgcgctggt aatcctaata 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgctgcacg tactgtctt 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgcatttaac cattcgtcgt aac 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agtcatttct cttgctttgc ga 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aatgccttat ccgaggaat 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcagcaacac tggactcaa 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttcgggtgta tgcattcac 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcagcaacgc tggattcaa 19
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagaagagtt acatctatcg attca 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aaaggcctga attcctccc 19

Claims (7)

1.一种用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，其特征在于，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液，所述PCR引物混合液包括军团菌属特异引物、嗜肺军团菌特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物、长滩军团菌特异引物、麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物；所述军团菌属特异引物为：
GL-388F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，
GL-388R：5’-CCAACAGCTAGTTGACATCGT-3’；
所述嗜肺军团菌特异引物为：
LP-229F：5’-TCCGATGGTCAAGTGCGT-3’，
LP-229R：5’-TGAAGGGACTTGATGTGGCA-3’；
所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物为：
LPsg1-wzt-93F：5’-GCCACTGCCTTCATCCATT-3’，
LPsg1-wzt-93R:5’-CGCAAAGCCCAGAAATGAT-3’；
所述长滩军团菌特异引物为：
llo0050-567F：5’-GCGCGCTGGTAATCCTAATA-3’，
llo0050-567R：5’-TTGCTGCACGTACTGTCTT-3’；
所述麦氏军团菌特异引物为：
LmgyrB-785F：5’-TGCATTTAACCATTCGTCGTAAC-3’，
LmgyrB-785R：5’-AGTCATTTCTCTTGCTTTGCGA-3’；
所述博兹曼军团菌特异引物为：
LbgyrB-692F：5’-AATGCCTTATCCGAGGAAT-3’，
LbgyrB-692R：5’-TCAGCAACACTGGACTCAA-3’；
所述杜氏军团菌特异引物为：
LdgyrB-471F：5’-TTCGGGTGTATGCATTCAC-3’，
LdgyrB-471FR：5’-TCAGCAACGCTGGATTCAA-3’；
所述菲氏军团菌特异引物为：
LfgyrB-293F：5’-CAGAAGAGTTACATCTATCGATTCA-3’，
LfgyrB-293R：5’-AAAGGCCTGAATTCCTCCC-3’。
2.如权利要求1所述的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，其特征在于，所述军团菌属特异引物的靶基因为16s rRNA基因；所述嗜肺军团菌特异引物的靶基因为lpp0267基因；所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物的靶基因为wzt基因；所述长滩军团菌特异引物的靶基因为llo0050基因；所述麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物的靶基因均为gyrB基因。
3.如权利要求1所述的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，其特征在于，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex 100resin 5％；Tris-HCl 10mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠0.1mM；叠氮钠0.1％；蛋白酶K 200μg/ml。
4.如权利要求1所述的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为2×PCR反应液，所述2×PCR反应液的组分及其组分浓度为：0.1U/μl EasyTaq DNA聚合酶；500μM dNTP；20mM Tris-HCl，pH8.3；100mM KCl；3mM MgCl2。
5.如权利要求1所述的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，其特征在于，所述引物在反应体系中的浓度分别为：GL-388F、GL-388R、LP-229F和LP-229R的浓度为150-300nM；LPsg1-wzt-93F、LPsg1-wzt-93R、llo0050-567F、llo0050-567R、LmgyrB-785F、LmgyrB-785R、LbgyrB-692F、LbgyrB-692R、LfgyrB-293F、LfgyrB-293R和LdgyrB-471F的浓度为200-350nM；LdgyrB-471R的浓度为400-600nM。
6.如权利要求5所述的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，其特征在于，所述引物在反应体系中的浓度分别为：GL-388F、GL-388R、LP-229F和LP-229R的浓度为200nM；LPsg1-wzt-93F、LPsg1-wzt-93R、llo0050-567F、llo0050-567R、LmgyrB-785F、LmgyrB-785R、LbgyrB-692F、LbgyrB-692R、LfgyrB-293F、LfgyrB-293R和LdgyrB-471F的浓度为250nM；LdgyrB-471R的浓度为500nM。
7.如权利要求1所述的用于军团菌快速检测与分型的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液还包括嗜肺军团菌血清型1型基因组DNA、长滩军团菌基因组DNA、麦氏军团菌基因组DNA、博兹曼军团菌基因组DNA、杜氏军团菌基因组DNA和菲氏军团菌基因组DNA。
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