CN102168131A - 扩增常见致病型军团菌gyrB基因特异区引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分别扩增米克戴德军团菌(Legionella micdadei)；博兹曼军团菌(Legionella bozemanii)；长滩军团菌(Legionella longbeachae)中gyrB基因(DNAgyrase B subunit gene，以下简称gyrB)特异区的引物，还提供了一种包括扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌gyrB基因特异区的引物的PCR试剂盒，利用该PCR试剂盒对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于水体和临床样品的监督和检测、饮用水中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及对米克戴德军团菌(Legionella micdadei)；博兹曼军团菌(Legionellabozemanii)；长滩军团菌(Legionella longbeachae)中gyrB基因(DNA gyrase B subunitgene，以下简称gyrB)的特异的核苷酸，特别是涉及对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌中的gyrB特异的寡核苷酸及其应用。
背景技术
军团菌属于革兰阴性杆菌，是广泛存在于自然界的土壤和水环境中的一种条件致病菌。军团菌可以引发军团菌病，它是一种以呼吸道感染症状为主，伴全身中毒症状的细菌感染性疾病。自1976年首次在美国发现军团病以来，该病已呈现出世界性分布及病死率高的两大特点。军团菌有42个种，64个血清型，其中至少有22个种与人类疾病有关，与人类关系最密切的是嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。在军团菌病例中，由嗜肺军团菌引发的病例占致病性军团菌引发病例的95％以上，其次为米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌。军团菌的生长与繁殖与环境因素密切相关，集中空调的冷却塔冷却水、冷凝水以及温泉水是军团菌在外界适宜的生存环境。当环境水中的军团菌繁殖到一定浓度，则会形成气溶胶进而感染人。宿主感染主要受其易感性和细菌毒力的影响，任何年龄均可发生，但中老年、基础免疫较差者、长途旅行者、吸烟者为高危人群，并以医院、宾馆、大型建筑工地等公共场所好发。
目前，细菌学培养法对疾病的诊断具有良好的敏感性和特异性，可以作为临床确诊和鉴定的标准。但是由于军团菌不易分离培养，而且种类又繁多。利用细菌学培养法对其进行鉴定需要价格昂贵的特殊培养基，而且细菌生长比较缓慢，要3～7d以上才能出结果，不利于临床的快速诊断，同时要求实验人员要有比较高的技术，费时费力。
近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括特定基因序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。
DNA链或染色体高级结构的变化是需要拓扑异构酶(Topoisomerase)参与的，包括I型和II型。DNA解螺旋酶gyrase是一种II型拓扑异构酶，最早是在E.coli中发现的，它由A、B两个亚基形式组成，gyrB就是编码B亚基的基因。和16S rRNA一样，gyrB和ISR均广泛存在于各种细菌细胞中，是细胞生命过程所必须的基因，但gyrB的进化速率却是16S rRNA的3～6倍，ISR的进化速率也比16S rRNA更快，可以作为细菌分子进化和系统分析的模式分子，近年来，人们已经开始使用它来区分、鉴定和检测许多用16S rRNA无能为力区分的细菌，相关报道及文献也越来越多。
聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
发明内容
本发明的一个目的是提供扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌中gyrB基因特异区的引物；
本发明的另一个目的是提供一种包括扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌gyrB基因特异区的引物的PCR试剂盒，并利用该PCR试剂盒检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的存在。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
扩增常见致病型军团菌gyrB基因特异区引物包括：米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌其中：
(1)对米克戴德军团菌的gyrB的特异核苷酸，所述核苷酸包含：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；
b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
所述的SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长为625个碱基；其中SEQ ID NO：1(5’- GGGCGTGGAATACCTGTAGACATTCATAAAGAAGAAGGCCGATCTGCTGCAGAAGTCATCATGACCATTTTGCACGCAGGAGGAAAATTTGATGATAA C T CCTACAAAGTATCAGGTGGTTTGCACGGTGTGGGTGTATCTGTTGTTAATGCGCTTTCTGAAGAGTTGCATTTAACCATTCGTCGTAACGGAAAAG TA CA CGAACAACACTATCGCAACGGTGTTCCAGATGCACCATTGGCGATGACAGGTGAGGCAAATACGACTGGAACTCAAGTTTGGTTTAAACCCAGC GCA AAT ACCTTTAGCAACATTGAGTTTCATTATGACATCCTTGCTAAACGCCTACGTGAACTTTCATTCCTGAATTCAGGCGTTCGCATCCATTTATA TGAT GAGC GTACCCAGAAGCAAGACACATTTTGCTACGAAGGCGGCATTAAAGCGTTTGTGGAACATTTAAACCGCAATAAAACGCCCATTATGCCCG TTGTT TTTTC GCTTAGCGGCGAAAGAGACAATATCAGTGTGGAATTATCCATGCAATGGAATGATTCATTTCAAGAAACCATATTTTGTTTCACGAAT
(2)对博兹曼军团菌的gyrB的特异核苷酸，所述核苷酸包含：
a)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；
b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
所述的SEQ ID NO：2所示的分离的核苷酸，全长为625个碱基；其中SEQ ID NO：2(5’-GGACGAGGGATACCCGTCGATATTCATAAAGAAGAAGGACGATCCGCTGCTGAAGTGATTATGACAGTGCTTCACGCCGGTGGTAAATTTGATGATAATTCTTATAAAGTATCGGGTGGTTTGCATGGAGTGGGTGTTTCTGTAGTTAATGCCTTATCCGAGGAATTACATTTAACCGTACGTCGTCATGGTAAAATCCATGAGCAACATTACCGTAATGGAGTTCCAGATGCGCCAATGGCAGAAACAGGAGATGCATCGACAACCGGAACTCAAATTTGGTTTAAACCAAGTGCCGAAACGTTTTCTAATATTGAGTTTCACTATGATATTTTAGCAAAACGGCTAAGAGAATTATCTTATTTAAATTCAGGTGTTTGCATCCATTTATTCGATGAGCGATCCCAAAGGCAAGACACTTTTCATTATGAAGGTGGAATCACGGCATTTGTGGAGCATCTCAATAAAAATAAAAATACTATTATGCCCACTGTTTTTTCTATGACCGCTGAAAAAGATAACATTGTTGTTGAACTGTCTATGCAGTGGAATGATTCTTATCAAGAAACACTTTATTGCTTTACAAATAATATCCCTCAGCGTGACGGTGGAACACATATGGCTG-3’)
(3)对长滩军团菌的gyrB的特异核苷酸，所述核苷酸包含：
a)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；
b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
所述的SEQ ID NO：3所示的分离的核苷酸，全长为625个碱基；其中SEQ ID NO：3(5’-GGACGTGGCATACCCGTTGATATTCATAAGGAACAAGGACGTTCTGCTGCTGAAGTGATTATGACAGTCTTGCATGCAGGAGGTAAGTTTGATGATAATTCCTATAAAGTATCTGGTGGACTACATGGCGTCGGTGTGTCAGTAGTTAATGCTTTATCCGAAGAGTTGCATTTGACTGTGCGGCGTCATGGTAAAATCCATGAGCAACGTTATAGAAATGGAGTTCCCGATGCGCCAATGGCTGAAACGGGAGATGCAACAACAACAGGAACACAAATATGGTTTAAGCCAAGCGCTGATACCTTTTCAAATATAGAGTTCCACTATGATATTCTCGCGAAACGCCTTAGGGAACTGTCTTATCTAAATTCGGGTGTTTGTATCCATTTATTTGATGAGCGCTCGCAAAGGCAGGATACTTTTCACTATGAAGGTGGTATAAAAGCTTTTGTTGAGCATCTCAATAAGAATAAAAATGTGATTATGCCCATCGTATTCTCCATGACAGCTGAAAAAGAGAATATTGTTGTTGAGCTTTCAATGCAGTGGAATGATTCATATCAAGAAACGCTCTATTGTTTTACTAACAATATACCTCAGCGTGATGGCGGAACGCATATGGCAG-3’)
上述的分别扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的gyrB基因特异区的引物的制备方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)通过PCR扩增这三种军团菌中的gyrB基因；3)gyrB基因的测序；4)核苷酸序列的拼接及分析；5)特异引物的筛选。
上述的核苷酸的应用，可用所述核苷酸设计引物用于PCR试剂盒、设计探针用于杂交反应与荧光检测，或者用于制造基因芯片或微阵列以检测细菌。
上述的PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，
其中PCR引物包括
SEQ ID NO：4(5’-ATTTAACCATTCGTCGTAAC-3’)米克戴德军团菌上游引物
SEQ ID NO：5(5’-TTGGGGAATGTTATTCGTG-3’)米克戴德军团菌下游引物
SEQ ID NO：6(5’-TGGTAAAATCCATGAGCA-3’)博兹曼军团菌上游引物
SEQ ID NO：7(5’-AACAGTGGGCATAATAGTA-3’)博兹曼军团菌下游引物
SEQ ID NO：8(5’-TGGTGGACTACATGGCGTC-3’)长滩军团菌上游引物
SEQ ID NO：9(5’-ATACGATGGGCATAATCACAT-3’)长滩军团菌下游引物
上述上游引物SEQ ID NO：4是根据米克戴德军团菌gyrB基因种内保守但种间特异的区段设计合成的，下游引物SEQ ID NO：5亦是根据米克戴德军团菌gyrB基因种内保守但种间特异的区段设计合成的寡核苷酸，位于gyrB序列上的581-600碱基位置。该引物可在PCR管中由DNA聚合酶选择性的复制合成介于两引物之间的DNA区段(针对米克戴德军团菌为431bp靶DNA片段)，因而可以将极其微量的(1ng DNA)目的基因在较短的时间内(2小时)扩增到电泳检测显而易见的水平。
上述上游引物SEQ ID NO：6是根据博兹曼军团菌gyrB基因种内保守但种间特异的区段设计合成的，下游引物SEQ ID NO：7亦是根据博兹曼军团菌gyrB基因种内保守但种间特异的区段设计合成的寡核苷酸，位于gyrB序列上的478-495碱基位置。该引物可在PCR管中由DNA聚合酶选择性的复制合成介于两引物之间的DNA区段(针对博兹曼军团菌为307bp靶DNA片段)，因而可以将极其微量的(1ng DNA)目的基因在较短的时间内(2小时)扩增到电泳检测显而易见的水平。
上述上游引物SEQ ID NO：8是根据长滩军团菌gyrB基因种内保守但种间特异的区段设计合成的，下游引物SEQ ID NO：9亦是根据长滩军团菌gyrB基因种内保守但种间特异的区段设计合成的寡核苷酸，位于gyrB序列上的476-496碱基位置。该引物可在PCR管中由DNA聚合酶选择性的复制合成介于两引物之间的DNA区段(针对长滩军团菌为383bp靶DNA片段)，因而可以将极其微量的(1ng DNA)目的基因在较短的时间内(2小时)扩增到电泳检测显而易见的水平。
上述PCR检测试剂盒包括如下试剂：10mM dNTP 5μl；10×酶特异性反应缓冲液30μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；上下游引物各20μl；阳性对照品各15μl，阴性对照品15μl；ddH2O 3ml。
本发明还涉及上述的PCR试剂盒在检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌中的应用。
上述针对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的PCR检测试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理-扩增-电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
使用上述的PCR试剂盒检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的PCR检测方法包括以下步骤：
1)提取待测临床样品的DNA模板；
2)在PCR管中加入dNTP、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品DNA模板和ddH2O，混匀；
3)将步骤2)中混匀的PCR管在PCR仪上扩增；
4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；
5)分析并进行结果判断。
上述步骤1)中的临床样品模板为临床样品中的自来水取样、矿泉水取样、空调冷却水取样等的培养物的粗提液，或是米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的纯培养物的粗体液，或是纯DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品。
上述步骤1)中的临床样品DNA模板的提取方法为：
(1)1.5ml 50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取培养物，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液；
(2)取500μl的ddH2O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，控干；
(3)取100μl ddH2O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；
(4)再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；
(5)取3μl中层上清作为PCR反应的模板。
上述步骤3)中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：
80℃，10分钟
94℃，5分钟
72℃，5分钟
上述步骤4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：
(1)取5～10μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5∶1的体积比混合；
(2)将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；
(3)将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约10分钟，用50bp Marker进行对照；
(4)观察并记录结果。
本发明通过配制一种可检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测、试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌所使用的试验设备简单，检测成本低。
使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。若含有米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照品相同位置的条带；若不含有米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌，则与阴性对照品一样不具有这一条带。
本发明一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量为：上下游引物各1.5μL，10mMdNTP 0.3μL，10×酶特异性反应缓冲液2.5μL，5U/μL耐热DNA聚合酶0.4μL，余下的体积在除去3uL待测样品的量后用ddH2O补足至25μL。
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq聚合酶。
上述的阳性对照品为已确定是米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的样品，阴性对照品则为经实验室确定不是嗜肺军团菌的样品，如大肠杆菌。
本PCR试剂盒若用米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了人力物力。
采用本发明所提供的PCR检测方法进行扩增的米克戴德军团菌应在431bp有一条带、博兹曼军团菌应在307bp有一条带、长滩军团菌应在383bp有一条带。
根据引物设计的结果，扩增出的米克戴德军团菌应在431bp有一条带、博兹曼军团菌应在307bp有一条带、长滩军团菌应在383bp有一条带，因此若扩增结果431bp左右具有和米克戴德军团菌阳性对照相同位置的条带，则可判断此待测样品带有米克戴德军团菌；若扩增结果307bp左右具有和博兹曼军团菌阳性对照相同位置的条带，则可判断此待测样品带有博兹曼军团菌；若扩增结果383bp左右具有和长滩军团菌阳性对照相同位置的条带，则可判断此待测样品带有长滩军团菌。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)实用性强：本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低，市场应用前景广。
(2)准确性高：本发明通过对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的gyrB克隆、测序，将得到序列与GeneBank中的gyrB比较，找到米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌gyrB的种内保守种间特异的区段，设计出引物。继而利用引物组合成多重PCR检测体系，能够直接将米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌和其近源菌种分开。本发明者对各1株米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的标准菌株，各1株米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的临床菌株，11株军团菌属内其他菌株以及5株近缘株进行了扩增，结果发现，本发明的检测方法的准确率高达100％。
(3)灵敏度高：本发明提供的米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌检测试剂盒及其检测方法具有相当高的敏感性，检测精度高，可以检测到1ng/μl的DNA模板。
附图说明
图1为本发明检测标准菌株电泳结果图，其中：1，米克戴得军团菌标准菌株G2823；2，博兹曼军团菌标准菌株G2828；3，长滩军团菌标准菌株G2825；M，50bp DNA marker；
图2为本发明检测临床菌株部分电泳结果图，其中1，米克戴得军团菌临床菌株G3415；2，博兹曼军团菌临床菌株G3417；3，长滩军团菌临床菌株G3416；M，50bp DNAmarker；
图3为本发明检测军团菌属内近缘菌株电泳结果图，其中1，米克戴得军团菌标准菌株G2823；2，博兹曼军团菌标准菌株G2828；3，长滩军团菌标准菌株G2825；4，菲氏军团菌(Legionella feeleii)G3419；5，斯太格尔沃特军团菌(Legionella steigerwaltii)G2830，6，茴香军团菌(Legionella anisa)G2826；7，杜莫夫军团菌(Legionella dumoffii)G3418；8，戈曼军团菌(Legionella gormanii)G2827；9，沃氏军团菌(Legionellawaltersii)G2821；10，嗜肺军团菌G2818；11，嗜肺军团菌G2824；12，嗜肺军团菌G2772；13，嗜肺军团菌G2819；14，嗜肺军团菌G2756；M为50bp DNA marker；
图4为本发明检测军团菌属见近缘菌株电泳结果图，其中1，米克戴得军团菌标准菌株G2823；2，博兹曼军团菌标准菌株G2828；3，长滩军团菌标准菌株G2825；4，粪肠球菌G2276；5，小肠结肠炎耶尔森氏菌G3853；6，志贺氏菌G1032；7，金黄色葡萄球菌G2303；8，铜绿色假单胞G2116；M，50bp DNA marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件。特别说明：米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的标准菌株来源见表1。为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
实施例1：基因组的提取
在BCYE平板培养基中37℃、5％CO2过夜分别培养米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌，50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，离心收集菌体。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2：通过PCR扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌中的gyrB基因
分别以米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的基因组为模板通过PCR扩增其gyrB。本发明中根据gyrB的保守区设计简并引物，扩增其gyrB简并引物的序列为：上游引物(5’-WCVGGTYTGCAYCAYATG’)，下游引物(5’-GTCTGBGAKGARAAYTTVGG’)；。PCR反应程序如下：在94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，这样进行30个循环；最后，在72℃继续延伸5分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并2管PCR产物，并用上海生工生物工程技术公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物中600bp左右的目的条带；其中gyrB的通用引物为简并引物，W代表A/T，V代表A/C/G，Y代表G/C，B代表C/G/T，K代表G/T，R代表A/G。
实施例3：对gyrB基因测序及拼接
切胶纯化后的片段用ABI377型DNA自动测序仪双向进行测序，应用Staden Package进行序列拼接，从而获得gyrB全基因的序列(SEQ ID NO：1-3)。
实施例4：特异引物的筛选
针对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的gyrB的特异区设计引物；分别设计一条上游引物和下游引物，用这三对引物(米克戴德军团菌上游引物是5’-ATTTAACCATTCGTCGTAAC-3’，见序列SEQ ID NO：4，下游引物是5’-TTGGGGAATGTTATTCGTG-3’，见序列SEQ ID NO：5；博兹曼军团菌上游引物是5’-TGGTAAAATCCATGAGCA-3’，见序列SEQ ID NO：6，下游引物是5’-AACAGTGGGCATAATAGTA-3’，见序列SEQ ID NO：7；长滩军团菌上游引物是5’-TGGTGGACTACATGGCGTC-3’，见序列SEQ ID NO：8，下游引物是5’-ATACGATGGGCATAATCACAT-3’，见序列SEQ ID NO：9)。
以各1株米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的标准菌株、各1株米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的临床菌株，11株军团菌属其他菌株以及5株近缘株的基因组为模板进行PCR，体系为10uM的上下游引物各0.5ul、10×酶特异性反应缓冲液2.5ul、10mM dNTP 0.3ul、5U/ul Taq聚合酶0.4ul及3ul的待测样品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH2O补足至25ul。所有引物都只在米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的标准菌株和临床菌株中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增出大小正确的条带，也就是说，在其他组中没有得到任何PCR产物带，所以该寡核苷酸对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌及其gyrB都是高度特异的。
实施例6：PCR检测试剂盒
检测实验所需材料及设备的准备
1.试剂盒组成：
1)dNTP(10mM) 5ul；
2)10×buffer(10×酶特异性反应缓冲液) 30ul；
3)Taq聚合酶(5U/ul) 4ul；
4)上游引物(10uM)(包含米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的上游引物)20ul；
5)下游引物(10uM)(包含米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的上游引物)20ul；
6)阳性对照品(包含米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的阳性对照品)各15ul；
7)阴性对照品15ul；
8)ddH2O 3ml。
每个试剂盒可用于检测10个样品。
其中10×缓冲液、dNTP、Taq聚合酶从上海生工购买；引物混合物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；
阳性对照品、阴性对照品和ddH2O由我们自行制备。三种阳性对照品是我们购买的标准菌株纯培养后，按照实施例1中的基因组提取方法分别提取米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的标准菌株基因组进行制备。
阴性对照品为无菌水，由超纯水灭菌后制备。ddH2O为灭菌水，由超纯水灭菌后制备。
检测所使用的米克戴德军团菌上游引物是5’-ATTTAACCATTCGTCGTAAC-3’(SEQ IDNO：4)，下游引物是5’-TTGGGGAATGTTATTCGTG-3’(SEQ ID NO：5)；博兹曼军团菌上游引物是5’-TGGTAAAATCCATGAGCA-3’(SEQ ID NO：6)，下游引物是5’-AACAGTGGGCATAATAGTA-3’(SEQ ID NO：7)；长滩军团菌上游引物是5’-TGGTGGACTACATGGCGTC-3’(SEQ ID NO：8)，下游引物是5’-ATACGATGGGCATAATCACAT-3’(SEQ ID NO：9)。
2.仪器设备
PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2ml PCR薄壁管。
3.待测样品的提供
我们收集了各1株米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的标准菌株、各1株米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌的临床菌株，11株军团菌属其他菌株以及5株近缘株验证引物的特异性，菌株编号和来源见下表1。
表1：供试的菌株
实施例7检测实施的具体操作
将上述22株菌株进行了同样条件下采用本发明所提供的PCR检测试剂盒进行PCR方法的检测。
1.待测样品DNA模板的提取
1)3uL接菌量无菌操作，接种于BCYE培养基中，37℃、5％CO2培养24-48h；
2)50mM Tris-HCl(pH8.0)刮取菌落，8000rpm离心5分钟，去上清。
3)500ul ddH2O重悬沉淀，8000rpm离心5分钟，去上清，尽量控干。
4)100ul ddH2O重悬沉淀，混匀，100℃沸水浴10分钟，
5)置冰上10分钟后，12000rpm离心2分钟。
6)取3ul中层上清作为PCR反应的模板。
2.用微量移液器分别吸取PCR试剂盒中的试剂和待测模板至薄壁PGR管中，用量见下表：
| 成分 | 浓度 | 加样量(μl) |
| ddH2O | 15.8 | |
| 10×酶特异性反应缓冲液 | 10× | 2.5 |
| 10mM dNTP | 10mM | 0.3 |
| 上游引物 | 10μM | 1.5 |
| 下游引物 | 10μM | 1.5 |
| Taq酶 | 5U/μL | 0.4 |
| 待测模板 | 3 | |
| 总体积 | 25 |
3.将混合物高速离心数秒后在PCR仪上依下列温度和时间进行扩增：
95℃5分钟
72℃5分钟
4.在电泳设备中电泳PCR扩增产物，记录结果。
1)取3ul扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液混合；
2)将混合液上样于2％的琼脂糖凝胶上；
3)将琼脂糖凝胶经120v电压稳压电泳约10分钟，用50bp Marker进行对照；
4)观察前沿溴酚蓝指示剂迁移至距加样孔至少3cm停止电泳，在凝胶成像仪上观察并记录试验结果。
5.依据如下条件进行结果判断出的米克戴德军团菌应在431bp有一条带、博兹曼军团菌应在307bp有一条带、长滩军团菌应在383bp有一条带。
阳性对照和阴性对照试验只要将待测样品模板换成米克戴德军团菌阳性模板、博兹曼军团菌阳性模板和长滩军团菌阳性模板以及阴性模板(灭菌水)即可，含有米克戴德军团菌应在431bp有一条带、博兹曼军团菌应在307bp有一条带、长滩军团菌应在383bp有一条带。不含米克戴得军团菌、博兹曼军团菌和长滩军团菌的样品模板无此片段。标准菌株部分电泳结果记录见图1所示：米克戴德军团菌标准菌株在431bp有一条带、博兹曼军团菌标准菌株在307bp有一条带、长滩军团菌标准菌株在383bp有一条带。临床菌株电泳结果记录见图2所示：米克戴德军团菌临床菌株在431bp有一条带、博兹曼军团菌临床菌株在307bp有一条带、长滩军团菌临床菌株菌株在383bp有一条带。试剂盒检测其他近缘菌株电泳结果记录见图3-图4：除米克戴德军团菌在431bp有一条带、博兹曼军团菌在307bp有一条带、长滩军团菌在383bp有一条带，其他菌株均无扩增产物。这说明采用PCR检测方法可排除假阳性反应，根据有无以上片段进行病原菌的检测盒鉴定，检测准确度提高了，避免了因检测失误而导致的不必要损失。
利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌和长滩军团菌。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.扩增常见致病型军团菌gyrB基因特异区引物包括：米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌其中：
(1)米克戴德军团菌的gyrB的特异核苷酸，所述核苷酸包含：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；
b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长为625个碱基。
(2)博兹曼军团菌的gyrB特异核苷酸，所述核苷酸包含：
a)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；
b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO：2所示的分离的核苷酸，全长为625个碱基。
(3)长滩军团菌的gyrB的特异核苷酸，所述核苷酸包含：
a)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；
b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO：3所示的分离的核苷酸，全长为625个碱基。
2.一种含有权利要求1所述特异区引物的PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒由PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶组成，其中PCR引物包括：SEQ ID NO：4-9；
其他试剂：10mM dNTP 5μl；10×酶特异性反应缓冲液30μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；上下游引物各20μl；阳性对照品各15μl，阴性对照品15μl；ddH2O 3ml；DNA聚合酶为Taq聚合酶。
3.权利要求2所述PCR试剂盒在检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌中的应用。
4.权利要求2所述PCR试剂盒的使用方法，其特征在于检测米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌，包括以下步骤：
1)提取待测临床样品的DNA模板；
2)在PCR管中加入dNTP、10×酶特异性反应缓冲液、Taq聚合酶、引物、待测样品DNA模板和ddH2O，混匀；其中上下游引物各1.5μL，10mM dNTP 0.3μL，10×酶特异性反应缓冲液2.5μL，5U/μL耐热DNA聚合酶0.4μL，余下的体积在除去3uL待测样品的量后用ddH2O补足至25μL。
3)将步骤2)中混匀的PCR管在PCR仪上扩增；
4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；
5)分析并进行结果判断。
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