CN107419020B - 嗜肺军团菌多位点序列分型用pcr引物、分型方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物、分型方法和应用。该PCR引物共包括5对引物对，分别针对cca部分片段、trpA以及lssD、lspE和icmK的部分基因片段，该5个基因位点cca、trpA、lssD、lspE和icmK在嗜肺军团菌上存在较多的单核苷酸多态性位点，其核苷酸相对变异性较大，因此进行测序后，对嗜肺军团菌进行序列分型时可以获取较大的分辨率，有利于分子流行病学调查和研究。利用本发明的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法在对嗜肺军团菌进行多位点序列分型时所需检测基因数目少、序列分型方法分辨率高，操作简便，可以提高多位点序列分型方法效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物分子流行病学领域，尤其是涉及一种嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物、分型方法和应用。
背景技术
军团菌是一种胞内寄生的革兰氏阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。目前军团菌属有59种，包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半的军团菌与人类疾病有关，其中又约有90％军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。嗜肺军团菌的生活史包括两个部分：自然水环境中(包括江、河、湖泊和池塘等)的阿米巴原虫是其主要的寄生场所和储存库，之后其从自然水环境迁移到人工水环境(包括人工喷泉、空调冷凝塔等)，经由人工水环境制造的气溶胶感染人类，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，对自然水环境、人工水环境中和临床分离到的嗜肺军团菌进行分子流行病学研究有利于加深对嗜肺军团菌毒力的理解，以及对嗜肺军团菌感染、爆发流行的防控。
目前对嗜肺军团菌进行分子流行病学调查和研究的主要方法包括扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgel electrophoresis，PFGE)，但是上述方法均存在着在不同实验室之间结果不一致、实验操作的标准化比较困难的问题。七位点序列分型(sequence-based typing，SBT)是欧洲军团菌感染工作小组(European Working Group for Legionella Infections，EWGLI，现在的名称是ESCMID军团菌感染研究小组，ESGLI)在2007年形成的一种基于7个基因位点(包括flaA、pilE、asd、mip、mompS、proA和neuA)的嗜肺军团菌多位点序列分型方法，并且被用于全球嗜肺军团菌流行病学调查和研究。其实验操作的标准化，有利于各个不同的实验室结果之间进行比较。尽管SBT是目前应用最广的嗜肺军团菌序列分型方法，但是其本身具有一定局限性，主要问题即是对嗜肺军团菌的序列分型分辨率不够，例如嗜肺军团菌ST1型菌株是全球流行最广的菌株，在某些地区为临床分离到的最多的致病株，但是并非所有ST1型菌株均具有致病性，因此需要对ST1菌株进行进一步分型。
目前一些新的方法被研究作为嗜肺军团菌序列分型方法。2016年，David,S等人报告了基于核糖体基因的多位点序列分型(ribosomal-gene MLST)和核心基因组基因的多位点序列分型(core-gene MLST)方法，通过对79个嗜肺军团菌株的研究表明，这两种方法对这些菌株的分辨率指数(Index of discriminatory，IOD)分别为0.972和0.991，而SBT方法为0.940。但是这两种方法所需检测的基因位点数目较多，分别为53个和100个，操作复杂，耗时耗力，经济成本也较高。因此新的嗜肺军团菌多位点序列分型方法的研究很有必要。
发明内容
基于此，有必要提供一种嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物、分型方法和应用。
本发明解决技术问题的技术方案如下。
一种嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对，其中，所述第一引物对用于扩增嗜肺军团菌tRNA核苷酸转移酶的部分基因片段，所述第二引物对用于扩增色氨酸合成酶alpha亚基基团的部分基因片段，所述第三引物对、所述第四引物对和所述第五引物对分别用于扩增嗜肺军团菌蛋白分泌系统构成基因lssD、lspE和icmK的部分基因片段。
在其中一个实施例中，所述第一引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述第三引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述第四引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，所述第五引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
在其中一个实施例中，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对、所述第四引物对及所述第五引物对的使用浓度是200nM。
上述任一实施例所述的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物在制备嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂中的应用。
一种嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂盒，包括上述任一实施例所述的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物。
在其中一个实施例中，所述嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂盒还包括细菌DNA提取试剂、PCR扩增试剂、和/或PCR产物纯化回收试剂。
一种嗜肺军团菌多位点序列分型方法，包括如下步骤：
提取待测嗜肺军团菌的基因组DNA；
以提取的基因组DNA为模板，以上述任一实施例所述的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物进行PCR扩增；
对PCR扩增的产物进行纯化回收处理；
对纯化回收的产物进行测序；
将各引物对的PCR扩增产物的测序结果与已知分型的序列进行比对。
在其中一个实施例中，对于所述第一引物对和所述第二引物对，其PCR扩增的条件是：94℃、3min—94℃、25s，60℃、25s，72℃、70s，共35个循环—72℃延伸5min；
对于所述第三引物对、所述第四引物对和所述第五引物对，其PCR扩增的条件是：94℃、3min—94℃、25s，60℃、25s，72℃、40s，共35个循环—72℃延伸5min。
在其中一个实施例中，所述对PCR扩增的产物进行纯化回收处理是使用琼脂糖凝胶电泳后切胶回收的方式进行纯化回收。
在其中一个实施例中，所述将各引物对的PCR扩增产物的测序结果与已知分型的序列进行比对是：对各测序出的序列截去5’端和3’端的部分碱基后，按照cca-trpA-lssD-lspE-icmK的顺序拼接为一个长度为2876bp的片段，再与已知分型的序列进行比对，其中，cca为所述第一引物对扩增出的片段，trpA为所述第二引物扩增出的片段，lssD、lspE和icmK分别为所述第三引物对、所述第四引物对及所述第五引物对扩增出的片段。
在其中一个实施例中，所述截去5’端和3’端的部分碱基分别是：cca：截去5’端51bp的碱基和3’端64bp的碱基；trpA：截去5’端29bp的碱基和3’端20bp的碱基；lssD：截去5’端24bp的碱基和3’端29bp的碱基；lspE：截去5’端23bp的碱基和3’端26bp的碱基；icmK：截去5’端23bp的碱基和3’端28bp的碱基。
本发明经过大量创造性的实验研究，提出一种嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物及分型方法，该PCR引物共包括5对引物对，分别针对嗜肺军团菌的tRNA核苷酸转移酶(cca)部分片段、色氨酸合成酶alpha亚基基团(trpA)以及嗜肺军团菌蛋白分泌系统构成基因lssD、lspE和icmK的部分基因片段，该5个基因位点cca、trpA、lssD、lspE和icmK在嗜肺军团菌上存在较多的单核苷酸多态性位点，其核苷酸相对变异性较大，因此进行测序后，对嗜肺军团菌进行序列分型时可以获取较大的分辨率，有利于分子流行病学调查和研究。利用本发明的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法在对嗜肺军团菌进行多位点序列分型时所需检测基因数目少、序列分型方法分辨率高，操作简便，可以提高多位点序列分型方法效率。
附图说明
图1为嗜肺军团菌多位点序列分型方法流程示意图。
图2为本发明的嗜肺军团菌多位点序列分型法对110个环境分离株分出的不同nST和ST型之间进化关系示意图。
图3为传统SBT分型法对110个环境分离株分出的不同nST和ST型之间进化关系示意图。
图4为本发明的嗜肺军团菌多位点序列分型对22个ST1型菌株进行进一步区分以及它们之间进化关系示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对，其中，第一引物对的两条引物的序列分别如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第二引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示，第三引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，第四引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，第五引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。具体的，该嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物可参见下表1所示。
表1
其中，cca-F与cca-R引物扩增的典型核苷酸序列为：atgaaagtctacttggtaggcggtgcagttcgtgatcgattattaggaattcctgtccaggaacaggattgggtagtcgtcggagcaacgccggaagaattattaaaaagaaaatataggcaagttgggcgggatttccccgtttttttgcatcctgaaacgaaagaggaatatgcattagcaagaacagagcgtaaatcagctccaggatattatggattcatttgtgattttagtgaatcagtgacgttggaagaggatttggcacgacgagatttaacgattaatgccatggctatggatgaacagggaaatttaattgatccatatcagggacagcgagatctcgaagagaaattattacgtcatgtgtcctccgcttttgtagaagatcctgttcgggttttacgtgttgcccgttttgccagtcggtttcatcatcttggatttagaatagccaatgagactcgtttattaatgtattccatggttaaacaaggtgaattagctcatttgatccccgagcgtgtttggcaggaatggcaaaaaagtcttgaagaaaaaaatcctgaacaattcattctttctttacgttcctgtgatgcattaagagtgattttgccagaaattaactcattatttggtgtgcctaatccacatcaataccatcaagaaatagatacgggcattcattcattaatgacattacgggcatcatctgagcttagcgaagaaccattagtacgatttgctgctttggttcatgatttaggcaaagcctcgacaccaattcaggcatggcctaaacaccatgggcatgaggaggagggtaccaagctgattcgagcattatgtgctcgcttgcgcattcctaatgattatcgcgacttggccgttacagtggcgcgagctcatttgaatattcataggctatgcgaattgcgtcctaacacaatcgtcaagcttttggagcaggtagatgcctttagacgacctcaattatttcataaaatattgattgcttgtcaagcagatgccgagagttgtggcaaaacagtggtctatcgccaaactcaattatggaatgaaatattatctgaatgtgttaaagtgacgccacaaacttttatcgtacaaggttatgaaggtaaagcgattaaggaggccatgcatcaaagtcgtgtggcttgtgtagag(SEQ ID NO:11)。
trpA-F和trpA-R引物扩增的典型核苷酸序列为：atgaaccgtattgataagactctggaaaaattaaaagccaatagaaaaaaaatgttaagtccttatattactgcaggcgatccatatcctgagttaacagtaagtttaatgcatcaattggttaaatcaggggcagatgtattggagctgggaatacccttttctgaccctatggcagaaggtcctgttatccaaagagcaatggaacgagctttggcgcattcaattcattgtgatgacgtattgaatatggttaggcaatttcgcaaaacggataccgaaacgcctgtgattcttatgggatatttaaatcctatagaacaatatggctatgatctttttgcccagcaggcagtggaggctggggttgatggaacaatattagttgatttgcctcctgaggaagctgatggagtatcgcgagtttggcaaaaacatggtttgtacagtatttatttatgttcgccaaccacctcagctgaaagaatgaactatataaatcagcatgccaatggttatctgtattatgtttcattgaagggagtgacaggttctgacgcgcttaagttgccagaattaaaagctcaatatctacaacgaaaggcacaatcaaaattaccgcttatggttgggtttggaataaaaactccggaaatggctgcacaagttgctgaatttgctgatggggtcattgttggggcggcactgataaatgaaatcattgaagcctatgaggccaagaaagatccgctgcaagcaagcggggctctattgagttccatgaggcaagctatcga(SEQ ID NO:12)。
lssD-F和lssD-R扩增的典型核苷酸序列为：tcacggatgagagagttgaatcaactgaaaaaatccctagagttggcgcaaaaagaattggatttaactcgcccattattaaagggtggatccgtttcagaagtagaggttattcgtctggaaagatcagtaagtgaaattaaaggaaacatcgagaagttcaaatcagaagaactggataaattgaataaagccagaacagagttgtttgcgctggttgaggcgaataaagcggataaagatcgtttaacaaggaccacagttcgttctccagtttatggtattgtaaaacaaattaagacgacaacgattggtggtgtagttcaaccaggtagtgatttacttgagatagtcccgcttgatgatactttattaattgaagc(SEQ ID NO:13)。
lspE-F和lspE-R扩增的典型核苷酸序列为：gccaaaagcaatggaattgttgtgggagaaatacaagaaaatctggctattgtctatcatttacctaacacaccactgcaggctttcgctgagataaaaagattattgcaatgcgaacttgatctaaaacaagtcgatgaatccacttttcagcaacatttagccaatatttaccaatctaaatcttcaatactggatgccgcagaaggcatggaagaagatatggatttatccatgttggccagtcaacttccagtcagtgaagacttattggaaaaccaagacgatgccccaattatccgcttactaaacgctctgtttacccaagcgattaaacaaaaagcatctgatatacacattgaaacttatgaagacagagt(SEQID NO:14)。
icmK-F和icmK-R扩增的典型核苷酸序列为：gctgatcaatcagatgatgctcagcaagcgttgcagcaactgcgaatgctacaacaaaaattatcacaaaacccttcccctgatgcacagtcaggagccggtgatggcggtgataatgcagcttctgattcaacacaacaacctaatcaatccggtcaggccaatgctccggctgcaaatcaaacagcaactgcgggcggtgatgggcagataattagtcaagatgatgccgaagttattgataagaaagcatttaaggatatgacacgcaacttatatcccttaaatcctgagcaagtagtcaaattaaaacaaatctatgaaacttctgagtatgccaaagctgcaacgccaggcactccacctaagcctacagcgacatcacaatttgttaatttgtctccaggatcaacaccaccagtaataagattatcac(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，优选的，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对及第五引物对的使用浓度是200nM。
本实施方式的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物可广泛应用在制备嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂中，如一种嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂盒，其包括上述任一实施例的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物。
在一个实施例中，该嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂盒还包括细菌DNA提取试剂、PCR扩增试剂、和/或PCR产物纯化回收试剂。
本实施方式还提供了一种嗜肺军团菌多位点序列分型方法，包括如下步骤：
提取待测嗜肺军团菌的基因组DNA；
以提取的基因组DNA为模板，以上述任一实施例的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物进行PCR扩增；
对PCR扩增的产物进行纯化回收处理；
对纯化回收的产物进行测序；
将各引物对的PCR扩增产物的测序结果与已知分型的序列进行比对。
在一个实施例中，对于第一引物对和第二引物对，其PCR扩增的条件是：94℃、3min—94℃、25s，60℃、25s，72℃、70s，共35个循环—72℃延伸5min；对于第三引物对、第四引物对和第五引物对，其PCR扩增的条件是：94℃、3min—94℃、25s，60℃、25s，72℃、40s，共35个循环—72℃延伸5min。
在一个实施例中，对PCR扩增的产物进行纯化回收处理是使用琼脂糖凝胶电泳后切胶回收的方式进行纯化回收。
在一个实施例中，将各引物对的PCR扩增产物的测序结果与已知分型的序列进行比对是：对各测序出的序列截去5’端和3’端的部分碱基后将剩下的部分与已知分型的序列进行比对。
在一个实施例中，所述截去5’端和3’端的部分碱基是：cca：截去5’端51bp的碱基和3’端64bp的碱基；trpA：截去5’端29bp的碱基和3’端20bp的碱基；lssD：截去5’端24bp的碱基和3’端29bp的碱基；lspE：截去5’端23bp的碱基和3’端26bp的碱基；icmK：截去5’端23bp的碱基和3’端28bp的碱基。所截取的5个基因片段的长度及在各个基因上序列位置分别为：cca：1082bp，52bp-1133bp；trpA：748bp，30bp-777bp；lssD：330bp，439bp-768bp；lspE：331bp，66bp-396bp；icmK：385bp，105bp-489bp。
更进一步，在一个实施例中，还包括将各引物对对应的剩下的部分(即测序出的序列截去前、后部分碱基后将剩下的部分)进行拼接，基因片段的拼接顺序可以但不限于cca-trpA-lssD-lspE-icmK的顺序，形成一个长度为2876bp的序列片段的步骤，将该序列片段录入数据库，每对一个嗜肺军团菌株进行这5个基因测序和拼接后产生的不同序列，则命名为一个新的序列型。
本发明提供的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法，利用上述五个基因cca、trpA、lssD、lspE、icmK在嗜肺军团菌上存在较多的单核苷酸多态性位点的特点，其核苷酸相对变异性较大，因此进行测序拼接后，适用于对嗜肺军团菌进行序列分型并获得获取较大的分辨率，有利于分子流行病学调查和研究。
本发明提供的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法，可以将从嗜肺军团菌株的五个基因片段进行拼接，形成一个2876bp片段，每一个不同的拼接序列代表一个序列分型，并录入数据库，每对一个嗜肺军团菌分离株进行这五个基因测序和拼接后产生的不同序列，则可以命名为一个新的序列型。
本发明提供的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法不仅能在临床分离菌株应用，还可以应用于环境水标本中分离的嗜肺军团菌，为环境水源风险性控制及军团菌感染流行病学调查提供依据和工具，有利于该多位点序列分型方法的推广和应用。
与现有技术相比，本发明提供的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法具有所测序基因数量少、测序片段拼接长度短，对嗜肺军团菌分辨率指数(index ofdiscriminatory)高的优点，可以提高多位点序列分型方法效率，并且能够将SBT方法分型的高致病性ST1型流行株进行进一步分型，因此是一种更为实用的嗜肺军团菌序列分型的方法。
以下为具体实施例部分
1.材料
本实施例中用到的细菌基因组DNA提取试剂来源于北京天根生化科技有限公司(货号：DP302)，DNA纯化试剂盒来源于北京全式金生物技术有限公司(货号：EG101-02)，基因测序使用广州艾基生物技术有限公司服务。
2.PCR引物
见下表2。
表2
上述引物对分别扩增的目的片段长度分别为：cca：1197bp；trpA：797bp；lssD：383bp；lspE：380bp；icmK：436bp。
3.嗜肺军团菌多位点序列分型方法
1)使用生长于BCYE平板上的纯的嗜肺军团菌分离株菌落，应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测标本，进行基因组DNA提取操作。
2)以提取的细菌基因组DNA为模板，采用上述PCR引物对分别进行PCR扩增。
PCR反应混合液由以下组分组成：2×PCR反应混合液(2×EasyTaq PCR SuperMix，含：0.1U Taq Polymerase/μl，500μM dNTP，20mM Tris-HCl(pH8.3)，100mM KCl，3mMMgCl2)12.5μl，ddH2O 5.5μl。
PCR反应条件：阶段1：94℃3min；阶段2：94℃、25s，60℃、25s，72℃、40s(lssD，lspE和icmK基因片段的扩增采用此方法)或72℃、70s(cca和trpA基因片段的扩增采用此方法)，共35个循环；阶段3：72℃、5min；在4℃贮存，在扩增过程中需要使用空白对照和阳性对照。空白对照为不含有DNA的扩增体系，阳性对照为含有已知序列的基因组DNA的扩增体系。
3)对五管PCR产物分别使用切胶回收的方式进行纯化。
4)纯化后的PCR产物分别用对应的引物对进行测序。
测序方法可以使用但不限于如Sanger测序法。
5)对测序结果进行分析，可采用Chromas软件进行测序质量检查。
6)由于测序结果前20个碱基和后20个碱基一般不可信，因此截取测序结果所示序列中的一部分，截取的片段长度和它们各个基因上序列位置分别为：cca：1082bp，52bp-1133bp；trpA：748bp，30bp-777bp；lssD：330bp，439bp-768bp；lspE：331bp，66bp-396bp；icmK：385bp，105bp-489bp。
7)将测序分析后的五个基因片段序列按照cca-trpA-lssD-lspE-icmK的顺序进行拼接，形成一段2876bp片段。
8)将该2876bp片段与数据库中已知序列分型的片段进行对比分析，如与数据库中某个序列分型的序列一致，则该嗜肺军团菌序列分型为数据库中已有的那个序列分型，如不一致，则为新的序列分析。
本实施例研究了某个嗜肺军团菌株(该菌株分离自广东新会一水塔，其五位点序列分型被定义为nST1型，nST即new Sequence Type，新序列分型，用以区别于SBT方法的Sequence Type，ST)五个基因应用上述PCR引物进行扩增，纯化后测序，经分析后，其拼接序列为：cctgtccaggaacaggattgggtagtcgtcggagcaacgccggaagaattattaaaaagaaaatataggcaagttgggcgggatttccccgtttttttgcatcctgaaacgaaagaggaatatgcattagcaagaacagagcgtaaatcagctccaggatattatggattcatttgtgattttagtgaatcagtgacgttggaagaggatttggcacgacgagatttaacgattaatgccatggctatggatgaacagggaaatttaattgatccatatcagggacagcgagatctcgaagagaaattattacgtcatgtgtcctccgcttttgtagaagatcctgttcgggttttacgtgttgcccgttttgccagtcggtttcatcatcttggatttagaatagccaatgagactcgtttattaatgtattccatggttaaacaaggtgaattagctcatttgatccccgagcgtgtttggcaggaatggcaaaaaagtcttgaagaaaaaaatcctgaacaattcattctttctttacgttcctgtgatgcattaagagtgattttgccagaaattaactcattatttggtgtgcctaatccacatcaataccatcaagaaatagatacgggcattcattcattaatgacattacgggcatcatctgagcttagcgaagaaccattagtacgatttgctgctttggttcatgatttaggcaaagcctcgacaccaattcaggcatggcctaaacaccatgggcatgaggaggagggtaccaagctgattcgagcattatgtgctcgcttgcgcattcctaatgattatcgcgacttggccgttacagtggcgcgagctcatttgaatattcataggctatgcgaattgcgtcctaacacaatcgtcaagcttttggagcaggtagatgcctttagacgacctcaattatttcataaaatattgattgcttgtcaagcagatgccgagagttgtggcaaaacagtggtctatcgccaaactcaattatggaatgaaatattatctgaatgtgttaaagtgacgccacaaacttttatcgtattaaaagccaatagaaaaaaaatgttaagtccttatattactgcaggcgatccatatcctgagttaacagtaagtttaatgcatcaattggttaaatcaggggcagatgtattggagctgggaatacccttttctgaccctatggcagaaggtcctgttatccaaagagcaatggaacgagctttggcgcattcaattcattgtgatgacgtattgaatatggttaggcaatttcgcaaaacggataccgaaacgcctgtgattcttatgggatatttaaatcctatagaacaatatggctatgatctttttgcccagcaggcagtggaggctggggttgatggaacaatattagttgatttgcctcctgaggaagctgatggagtatcgcgagtttggcaaaaacatggtttgtacagtatttatttatgttcgccaaccacctcagctgaaagaatgaactatataaatcagcatgccaatggttatctgtattatgtttcattgaagggagtgacaggttctgacgcgcttaagttgccagaattaaaagctcaatatctacaacgaaaggcacaatcaaaattaccgcttatggttgggtttggaataaaaactccggaaatggctgcacaagttgctgaatttgctgatggggtcattgttggggcggcactgataaatgaaatcattgaagcctatgaggccaagaaagatccgctgcaagcaagcggggctctattgagtctgaaaaaatccctagagttggcgcaaaaagaattggatttaactcgtccattattaaagggtggatccgtttcagaagtagaggttattcgtctggaaagatcagtaagtgaaattaaaggaaacattgagaagttcaaatcagaagaactggataaattgaataaagccagaacagagttgtttgcgctgattgaggccaataaagcggataaagatcgtttaacaaggaccacagttcgttctccagtttatggtattgtaaaacaaattaagacgacaacgattggtggtgtagttcaaccaggtagtgatttacttgagatagtcgggagaaatacaagaaaatctggctattgtctatcatttacctaacacaccactgcaggctttcgctgagataaaaagattattgcaatgcgaacttgatctaaaacaagtcgatgaatccacttttcagcaacatttagccaatatttaccaatctaaatcttcaatactggatgccgcagaaggcatggaagaagatatggatttatccatgttggccagtcaacttccagtcagtgaagacttattggaaaaccaagacgatgccccaattatccgcttactaaacgctctgtttacccaagcgattaaacaaaaagcatctgatatagcaagaggggcagcaactgcgaatgctacaacaaaaattatcacaaaacccttcccctgatgcacagtcaggagccggtgatggcggtgataatgcagcttctgattcaacacaacaacctaatcaatccggtcaggccaatgctccggctgcaaatcaaacagcaactgcgggcggtgatgggcagataattagtcaagatgatgccgaagttattgataagaaagcatttaaggatatgacacacaacttatatcccttaaatcctgagcaagtagtcaaattaaaacaaatctatgaaacttctgagtatgccaaagctgcaacgccaggcactccacctaagcctacagcgacatcacaatttgttaatttgtctccaggc(SEQ ID NO:16)。该序列可被定义为此多位点序列分型方法的nST1型，通过上述方法测序拼接其他嗜肺军团菌菌株的相应序列，与nST1型的序列进行比对，若相同，则为同一nST型，若不同，则可以认为是一新的nST型。
通过本实施例的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法，对110个来源于自然水样和人工水样的嗜肺军团菌株进行分析，结果显示这110菌株可分为91个序列型，该方法分辨率指数为0.985，而SBT仅可分为33个序列型，分辨率指数为0.920。如图2-3所示为这110个菌株所分型的91个nST型的进化关系以及33个ST型间的进化关系。
进一步，通过本发明的嗜肺军团菌多位点序列分型用的PCR引物和分型方法对22个SBT分型法显示为ST1型的嗜肺军团菌株可以进一步分型为19个不同的序列型，如图4所示为这19个nST型间的进化关系。而传统的SBT方法对这些菌株进行的多位点序列分型，均分型为ST1菌株。由此，本发明的PCR引物及分型方法对嗜肺军团菌ST1型高致病性流行株具有进一步分型能力，从而更有利于嗜肺军团菌感染的流行病学调查研究和爆发的监控。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京金域医学检验所有限公司
<120> 嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物、分型方法和应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaagtct acttggtagg c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctctacacaa gccacacg 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaccgta ttgataagac tctgg 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcgatagctt gcctcatgga 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcacggatga gagagttgaa tc 22
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcttcaatta ataaagtatc atcaagcg 28
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
actctgtctt cataagtttc aatgtg 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gccaaaagca atggaattgt tg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctgatcaat cagatgatgc tc 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtgataatct tattactggt ggtg 24
<210> 11
<211> 1197
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgaaagtct acttggtagg cggtgcagtt cgtgatcgat tattaggaat tcctgtccag 60
gaacaggatt gggtagtcgt cggagcaacg ccggaagaat tattaaaaag aaaatatagg 120
caagttgggc gggatttccc cgtttttttg catcctgaaa cgaaagagga atatgcatta 180
gcaagaacag agcgtaaatc agctccagga tattatggat tcatttgtga ttttagtgaa 240
tcagtgacgt tggaagagga tttggcacga cgagatttaa cgattaatgc catggctatg 300
gatgaacagg gaaatttaat tgatccatat cagggacagc gagatctcga agagaaatta 360
ttacgtcatg tgtcctccgc ttttgtagaa gatcctgttc gggttttacg tgttgcccgt 420
tttgccagtc ggtttcatca tcttggattt agaatagcca atgagactcg tttattaatg 480
tattccatgg ttaaacaagg tgaattagct catttgatcc ccgagcgtgt ttggcaggaa 540
tggcaaaaaa gtcttgaaga aaaaaatcct gaacaattca ttctttcttt acgttcctgt 600
gatgcattaa gagtgatttt gccagaaatt aactcattat ttggtgtgcc taatccacat 660
caataccatc aagaaataga tacgggcatt cattcattaa tgacattacg ggcatcatct 720
gagcttagcg aagaaccatt agtacgattt gctgctttgg ttcatgattt aggcaaagcc 780
tcgacaccaa ttcaggcatg gcctaaacac catgggcatg aggaggaggg taccaagctg 840
attcgagcat tatgtgctcg cttgcgcatt cctaatgatt atcgcgactt ggccgttaca 900
gtggcgcgag ctcatttgaa tattcatagg ctatgcgaat tgcgtcctaa cacaatcgtc 960
aagcttttgg agcaggtaga tgcctttaga cgacctcaat tatttcataa aatattgatt 1020
gcttgtcaag cagatgccga gagttgtggc aaaacagtgg tctatcgcca aactcaatta 1080
tggaatgaaa tattatctga atgtgttaaa gtgacgccac aaacttttat cgtacaaggt 1140
tatgaaggta aagcgattaa ggaggccatg catcaaagtc gtgtggcttg tgtagag 1197
<210> 12
<211> 797
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgaaccgta ttgataagac tctggaaaaa ttaaaagcca atagaaaaaa aatgttaagt 60
ccttatatta ctgcaggcga tccatatcct gagttaacag taagtttaat gcatcaattg 120
gttaaatcag gggcagatgt attggagctg ggaataccct tttctgaccc tatggcagaa 180
ggtcctgtta tccaaagagc aatggaacga gctttggcgc attcaattca ttgtgatgac 240
gtattgaata tggttaggca atttcgcaaa acggataccg aaacgcctgt gattcttatg 300
ggatatttaa atcctataga acaatatggc tatgatcttt ttgcccagca ggcagtggag 360
gctggggttg atggaacaat attagttgat ttgcctcctg aggaagctga tggagtatcg 420
cgagtttggc aaaaacatgg tttgtacagt atttatttat gttcgccaac cacctcagct 480
gaaagaatga actatataaa tcagcatgcc aatggttatc tgtattatgt ttcattgaag 540
ggagtgacag gttctgacgc gcttaagttg ccagaattaa aagctcaata tctacaacga 600
aaggcacaat caaaattacc gcttatggtt gggtttggaa taaaaactcc ggaaatggct 660
gcacaagttg ctgaatttgc tgatggggtc attgttgggg cggcactgat aaatgaaatc 720
attgaagcct atgaggccaa gaaagatccg ctgcaagcaa gcggggctct attgagttcc 780
atgaggcaag ctatcga 797
<210> 13
<211> 383
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcacggatga gagagttgaa tcaactgaaa aaatccctag agttggcgca aaaagaattg 60
gatttaactc gcccattatt aaagggtgga tccgtttcag aagtagaggt tattcgtctg 120
gaaagatcag taagtgaaat taaaggaaac atcgagaagt tcaaatcaga agaactggat 180
aaattgaata aagccagaac agagttgttt gcgctggttg aggcgaataa agcggataaa 240
gatcgtttaa caaggaccac agttcgttct ccagtttatg gtattgtaaa acaaattaag 300
acgacaacga ttggtggtgt agttcaacca ggtagtgatt tacttgagat agtcccgctt 360
gatgatactt tattaattga agc 383
<210> 14
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gccaaaagca atggaattgt tgtgggagaa atacaagaaa atctggctat tgtctatcat 60
ttacctaaca caccactgca ggctttcgct gagataaaaa gattattgca atgcgaactt 120
gatctaaaac aagtcgatga atccactttt cagcaacatt tagccaatat ttaccaatct 180
aaatcttcaa tactggatgc cgcagaaggc atggaagaag atatggattt atccatgttg 240
gccagtcaac ttccagtcag tgaagactta ttggaaaacc aagacgatgc cccaattatc 300
cgcttactaa acgctctgtt tacccaagcg attaaacaaa aagcatctga tatacacatt 360
gaaacttatg aagacagagt 380
<210> 15
<211> 436
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gctgatcaat cagatgatgc tcagcaagcg ttgcagcaac tgcgaatgct acaacaaaaa 60
ttatcacaaa acccttcccc tgatgcacag tcaggagccg gtgatggcgg tgataatgca 120
gcttctgatt caacacaaca acctaatcaa tccggtcagg ccaatgctcc ggctgcaaat 180
caaacagcaa ctgcgggcgg tgatgggcag ataattagtc aagatgatgc cgaagttatt 240
gataagaaag catttaagga tatgacacgc aacttatatc ccttaaatcc tgagcaagta 300
gtcaaattaa aacaaatcta tgaaacttct gagtatgcca aagctgcaac gccaggcact 360
ccacctaagc ctacagcgac atcacaattt gttaatttgt ctccaggatc aacaccacca 420
gtaataagat tatcac 436
<210> 16
<211> 2876
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cctgtccagg aacaggattg ggtagtcgtc ggagcaacgc cggaagaatt attaaaaaga 60
aaatataggc aagttgggcg ggatttcccc gtttttttgc atcctgaaac gaaagaggaa 120
tatgcattag caagaacaga gcgtaaatca gctccaggat attatggatt catttgtgat 180
tttagtgaat cagtgacgtt ggaagaggat ttggcacgac gagatttaac gattaatgcc 240
atggctatgg atgaacaggg aaatttaatt gatccatatc agggacagcg agatctcgaa 300
gagaaattat tacgtcatgt gtcctccgct tttgtagaag atcctgttcg ggttttacgt 360
gttgcccgtt ttgccagtcg gtttcatcat cttggattta gaatagccaa tgagactcgt 420
ttattaatgt attccatggt taaacaaggt gaattagctc atttgatccc cgagcgtgtt 480
tggcaggaat ggcaaaaaag tcttgaagaa aaaaatcctg aacaattcat tctttcttta 540
cgttcctgtg atgcattaag agtgattttg ccagaaatta actcattatt tggtgtgcct 600
aatccacatc aataccatca agaaatagat acgggcattc attcattaat gacattacgg 660
gcatcatctg agcttagcga agaaccatta gtacgatttg ctgctttggt tcatgattta 720
ggcaaagcct cgacaccaat tcaggcatgg cctaaacacc atgggcatga ggaggagggt 780
accaagctga ttcgagcatt atgtgctcgc ttgcgcattc ctaatgatta tcgcgacttg 840
gccgttacag tggcgcgagc tcatttgaat attcataggc tatgcgaatt gcgtcctaac 900
acaatcgtca agcttttgga gcaggtagat gcctttagac gacctcaatt atttcataaa 960
atattgattg cttgtcaagc agatgccgag agttgtggca aaacagtggt ctatcgccaa 1020
actcaattat ggaatgaaat attatctgaa tgtgttaaag tgacgccaca aacttttatc 1080
gtattaaaag ccaatagaaa aaaaatgtta agtccttata ttactgcagg cgatccatat 1140
cctgagttaa cagtaagttt aatgcatcaa ttggttaaat caggggcaga tgtattggag 1200
ctgggaatac ccttttctga ccctatggca gaaggtcctg ttatccaaag agcaatggaa 1260
cgagctttgg cgcattcaat tcattgtgat gacgtattga atatggttag gcaatttcgc 1320
aaaacggata ccgaaacgcc tgtgattctt atgggatatt taaatcctat agaacaatat 1380
ggctatgatc tttttgccca gcaggcagtg gaggctgggg ttgatggaac aatattagtt 1440
gatttgcctc ctgaggaagc tgatggagta tcgcgagttt ggcaaaaaca tggtttgtac 1500
agtatttatt tatgttcgcc aaccacctca gctgaaagaa tgaactatat aaatcagcat 1560
gccaatggtt atctgtatta tgtttcattg aagggagtga caggttctga cgcgcttaag 1620
ttgccagaat taaaagctca atatctacaa cgaaaggcac aatcaaaatt accgcttatg 1680
gttgggtttg gaataaaaac tccggaaatg gctgcacaag ttgctgaatt tgctgatggg 1740
gtcattgttg gggcggcact gataaatgaa atcattgaag cctatgaggc caagaaagat 1800
ccgctgcaag caagcggggc tctattgagt ctgaaaaaat ccctagagtt ggcgcaaaaa 1860
gaattggatt taactcgtcc attattaaag ggtggatccg tttcagaagt agaggttatt 1920
cgtctggaaa gatcagtaag tgaaattaaa ggaaacattg agaagttcaa atcagaagaa 1980
ctggataaat tgaataaagc cagaacagag ttgtttgcgc tgattgaggc caataaagcg 2040
gataaagatc gtttaacaag gaccacagtt cgttctccag tttatggtat tgtaaaacaa 2100
attaagacga caacgattgg tggtgtagtt caaccaggta gtgatttact tgagatagtc 2160
gggagaaata caagaaaatc tggctattgt ctatcattta cctaacacac cactgcaggc 2220
tttcgctgag ataaaaagat tattgcaatg cgaacttgat ctaaaacaag tcgatgaatc 2280
cacttttcag caacatttag ccaatattta ccaatctaaa tcttcaatac tggatgccgc 2340
agaaggcatg gaagaagata tggatttatc catgttggcc agtcaacttc cagtcagtga 2400
agacttattg gaaaaccaag acgatgcccc aattatccgc ttactaaacg ctctgtttac 2460
ccaagcgatt aaacaaaaag catctgatat agcaagaggg gcagcaactg cgaatgctac 2520
aacaaaaatt atcacaaaac ccttcccctg atgcacagtc aggagccggt gatggcggtg 2580
ataatgcagc ttctgattca acacaacaac ctaatcaatc cggtcaggcc aatgctccgg 2640
ctgcaaatca aacagcaact gcgggcggtg atgggcagat aattagtcaa gatgatgccg 2700
aagttattga taagaaagca tttaaggata tgacacacaa cttatatccc ttaaatcctg 2760
agcaagtagt caaattaaaa caaatctatg aaacttctga gtatgccaaa gctgcaacgc 2820
caggcactcc acctaagcct acagcgacat cacaatttgt taatttgtct ccaggc 2876
Claims (8)
1.一种嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对，其中，所述第一引物对用于扩增嗜肺军团菌tRNA核苷酸转移酶的部分基因片段，所述第二引物对用于扩增色氨酸合成酶alpha亚基基团的部分基因片段，所述第三引物对、所述第四引物对和所述第五引物对分别用于扩增嗜肺军团菌蛋白分泌系统构成基因lssD、lspE和icmK的部分基因片段；
所述第一引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述第三引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述第四引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，所述第五引物对的两条引物的序列分别如SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10所示。
2.如权利要求1所述的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物，其特征在于，所述第一引物对、所述第二引物对、所述第三引物对、所述第四引物对及所述第五引物对的使用浓度是200nM。
3.如权利要求1或2所述的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物在制备嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂中的应用。
4.一种嗜肺军团菌多位点序列分型用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物。
5.一种非疾病诊断和治疗目的的嗜肺军团菌多位点序列分型方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测嗜肺军团菌的基因组DNA；
以提取的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述的嗜肺军团菌多位点序列分型用PCR引物进行PCR扩增；
对PCR扩增的产物进行纯化回收处理；
对纯化回收的产物进行测序；
将各引物对的PCR扩增产物的测序结果与已知分型的序列进行比对。
6.如权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的嗜肺军团菌多位点序列分型方法，其特征在于，对于所述第一引物对和所述第二引物对，其PCR扩增的条件是：94℃、3min—94℃、25s，60℃、25s，72℃、70s，共35个循环—72℃延伸5min；
对于所述第三引物对、所述第四引物对和所述第五引物对，其PCR扩增的条件是：94℃、3min—94℃、25s，60℃、25s，72℃、40s，共35个循环—72℃延伸5min。
7.如权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的嗜肺军团菌多位点序列分型方法，其特征在于，所述对PCR扩增的产物进行纯化回收处理是使用琼脂糖凝胶电泳后切胶回收的方式进行纯化回收。
8.如权利要求5所述的非疾病诊断和治疗目的的嗜肺军团菌多位点序列分型方法，其特征在于，所述将各引物对的PCR扩增产物的测序结果与已知分型的序列进行比对是：对各测序出的序列截去5’端和3’端的部分碱基后，按照cca-trpA-lssD-lspE-icmK的顺序拼接为一个长度为2876bp的片段，再与已知分型的序列进行比对，其中，cca为所述第一引物对扩增出的片段，trpA为所述第二引物扩增出的片段，lssD、lspE和icmK分别为所述第三引物对、所述第四引物对及所述第五引物对扩增出的片段；
所述截去5’端和3’端的部分碱基分别是：cca：截去5’端51bp的碱基和3’端64bp的碱基；trpA：截去5’端29bp的碱基和3’端20bp的碱基；lssD：截去5’端24bp的碱基和3’端29bp的碱基；lspE：截去5’端23bp的碱基和3’端26bp的碱基；icmK：截去5’端23bp的碱基和3’端28bp的碱基。
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