CN1694722A - 无毒炭疽疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
作为炭疽杆菌(B.anthracis)主要毒性因子的炭疽毒素，包括保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。保护性抗原PA是所有抗炭疽疫苗的主要成分。如果在疫苗中加入少量LF或EF则可大大增加PA的保护功效。理想的抗炭疽疫苗应同时含有PA、LF和EF；但这种组合物是有毒的。因此，可以使用PA、LF和EF的生物失活突变体制品以进行更好的免疫保护。本发明描述了制造抗炭疽的重组疫苗的方法，所述疫苗由无毒的突变炭疽毒素蛋白构成。所述方法包括毒素蛋白天然基因的定点诱变，以及纯化突变蛋白和最后定性这些蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及重组DNA的构建物和无毒性炭疽疫苗的制备方法。
发明背景
炭疽是一种由革兰氏阳性的成孢子细菌—炭疽杆菌(Bacillusanthracis)引起的动物传染性疾病。通过动物来源的食物、动物制品和炭疽杆菌对环境的污染(Brachman P.S.，1970，Annals.N.Y.Acad.Sci.174，577-582)，人类是其偶然宿主。炭疽是已知最古老的细菌性疾病之一，发生在包括印度在内的世界大部分地区。炭疽杆菌的主要致病因子包括聚-D-谷氨酸荚膜和三部分组成的炭疽毒素复合体。炭疽毒素(Leppla S.H.，1991，摘自“细菌蛋白毒素手册”(Source Bookof Bacterial protein toxins)，第277-302页)是炭疽杆菌主要的毒性因子，包括保护性抗原PA(83kDa)、致死因子(LF-(90kDa)和水肿因子(EF-(89kDa)。LF/EF是该复合体中具有催化作用的部分，需要PA进入细胞质。PA和LF(称为致死毒素)的结合导致实验动物死亡(Smith H.and Keppie J.，1954，Nature，173，869-870)。PA和EF(称为水肿毒素)的结合导致实验动物皮肤内水肿(Stanley J.L.和Smith H.，1961，J.Gen Microbiol.，26，49-66)。PA是受体-结合部分，使催化部分LF和EF容易易位进入靶细胞。在易位进入细胞后，LF这种金属蛋白酶引起一种有丝分裂原活性蛋白激酶激活酶(MAPKKs)裂解，导致信号转导路径失活(Duesbery N.S.等，1998，Science，280.734-737)。另一方面，EF一进入细胞，就通过钙调蛋白得到活性，导致细胞内cAMP水平大大提高(Leppla S.H.，1982，Proc.Acad.Sci.USA.，79，3162-3166)。
中毒过程的第一阶段是PA与细胞表面受体的结合(Bradley K.A.等，2001，Nature，414，225-229)。在结合到细胞表面上的受体后，PA受细胞表面蛋白酶的切割而产生一个63-kDa的片段(Klimpel R.K.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，89，10277-10281)，后者解聚并结合到LF/EF(Milne J.C.等，1994，J.Biol.Chem.，269，20607-20612)。和LF/EF的结合是竞争性的。然后整个复合体发生受体介导的胞吞作用。内体的酸化(Friedlander A.M.，1986，J.Biol.Chem.，261，7123-7126)导致PA寡聚体插入内体膜而形成小孔(Milne J.C.和Collier R.J.，1993，Mol.Microbiol.，10，647-653)，LF/EF通过其易位进入细胞质。
PA有四个结构域，首先组成反平行-β片层，它仅有不超过四圈的少数短螺旋(Petosa C.等，1997，Nature，385，833-838)。结构域1负责在炭疽中毒过程中结合至LF/EF。结构域2形成β桶状结构并在膜的插入和易位中发挥作用。结构域3是其中最小的结构域，对PA的解聚有重要作用，并且也可能在PA与LF/EF的结合中有重要作用。结构域4是受体-结合区域。
最近测定出LF具水晶样构造，显示LF具有4个结构域(Pannifer A.D.等，2001，Nature，414，229-233)。结构域1负责与PA结合。该结构域与EF的N端1-250个残基具有显著的同源性。事实上，该结构域的大多数残基是完全相同的。
在所有三种毒性蛋白质中，PA具有最强的免疫原性并且是抗炭疽疫苗的必需成分(Gladstone G.P.，1946，Br.J.Exp.Pathol，27，349-418)。已经观察到，若在疫苗中引入少量LF或EF，PA的保护效果会极大地提高(Pezard等，1995，Infect.Immun.，63，1369-1372)。然而，这也恰是疫苗产生毒性和产生反应原性的主要原因。炭疽毒素(Leppla S.H.，1991，摘自“细菌蛋白毒素手册”(Source Book ofBacterial protein toxins)，第277-302页)，包含保护性抗原(PA)，致死因子(LF)和水肿因子(EF)，是炭疽杆菌的主要致病因子。
目前使用的炭疽疫苗出自一种无荚膜的非致病性菌株，称为Sterne株(Sterne M.，1939，J.Vet.Sci.Anim.Ind，13，307-312)。在俄罗斯和中国使用基于Sterne株的活孢子。在英国使用的疫苗是Sterne株的培养物经明矾沉淀后的过滤液，而美国使用的疫苗含有一种无荚膜、无蛋白水解活性的，从牛炭疽分离的菌株V770(Turnbull P.C.B，1991，Vaccine，9，533-539)，经含铝水凝胶吸附(alhydrogel-adsorbed)的细胞单独培养物的滤液。所有这些目前使用的从原液分离的炭疽疫苗没有明确的组成。它们有反应性并且不能对所有炭疽杆菌的自然株提供保护。
美国专利2,017,606描述了炭疽抗原的制备，用合适的培养基培养细菌，从培养基中分离细菌。
美国专利2,151,364描述了一种生产炭疽疫苗的方法，包括制备炭疽孢子的悬浮液，在悬浮液中加入含明矾的无菌溶液。
俄罗斯专利2,115,433描述了炭疽疫苗的方法，包括炭疽杆菌的无荚膜菌株的活孢子和炭疽杆菌的保护性抗原。
国际专利0002522描述了一种生产炭疽疫苗的方法，该方法使用来自炭疽杆菌的无毒保护性抗原来诱导针对炭疽有保护作用的免疫应答。
上述专利的缺点是，它们都使用炭疽杆菌的培养物/孢子。炭疽杆菌是一种具有感染性的生物，没有防泄漏设施则无法控制。制成的疫苗会被来自炭疽杆菌的其它毒素和无毒性蛋白质污染而导致许多副作用和反应原性。
对于某些种类的驯养和实验动物，这些疫苗也具有一定程度的残余致病性。Sterne株有产毒性并且在高剂量下有致病性。因此被认为用于人类不安全、不适合。这种疫苗会导致有害副作用，包括接种部位的坏死。
因此有必要开发出第二代炭疽疫苗，这种疫苗无副作用且有明确的组成。
本发明的目标是为了开发一种安全有效的炭疽疫苗，对炭疽毒素给予无毒性处理而不影响其免疫原性。
为实现所述目标，本发明提供一种重组DNA构建物，包括一种表达载体和一种含有野生型保护性抗原(PA)或野生型致死因子(LF)或野生型水肿因子(EF)基因的DNA片段。
本发明还提供一种重组DNA构建物，所述构建物包括：
一种表达载体和一种含有突变型保护性抗原(PA)或突变型致死因子(LF)或突变型水肿因子(EF)基因的DNA片段
所述载体是一种诸如PQE 30的原核载体，并且所述表达载体包含T5启动子和6X组氨酸标记。
该DNA片段是在残基Phe202上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Leu203上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Pro205上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Ile207上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Pro205，Trp226和Phe236上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Phe552上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Phe552和Phe554上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Ile562和Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原所含所含的基因。
该DNA片段是在残基Leu566和Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Phe552和Phe554，Ile562，Leu566和Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Phe427上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是去除残基Asp425的保护性抗原基因。
该DNA片段是去除残基Phe427的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Trp346上发生丙氨酸取代的保护性抗原的基因。
该DNA片段是在残基Leu352上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Trp346，Met350和Leu352上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
该DNA片段是在残基Tyr148上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Tyr149上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Ile151上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Lys153上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Asp187上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Phe190上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Asp187，Leu188，Leu189和Phe190上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Tyr137上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Tyr138上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Ile140上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
该DNA片段是在残基Lys142上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
基因DNA片段表达的蛋白质是野生型PA、野生型LF、野生型EF、及其突变变体。
本发明进一步揭示了一种生产突变的炭疽毒素蛋白质的方法，所述方法包括：
-使用这里定义的不同的致突变引物进行PCR反应，使PA、LF和EF基因产生突变；
-用一种酶一同处理所述突变PCR产物及天然模板，使所述PCR产物的天然模板裂解；
-将所述突变产品转化入大肠杆菌菌株；
-从转化的大肠杆菌菌株分离重组构建物，并确认所需的突变；
-转化经确认的突变构建物进入适当的大肠杆菌表达株以表达突变的蛋白质，以及
-提纯所述表达的突变蛋白质。
使用Ni-NTA层析法和/或其它层析技术进行提纯。
该基因在包含T5启动子和6X组氨酸标记的PQE表达载体中进行复制。
突变型在PA的第一结构域残基202，203，205处受到影响。突变型在PA的第三结构域残基552，574，552+554，562+574，566+574，552+554+562+566+574处受到影响，导致突变蛋白质在寡聚反应中有缺陷。突变型在PA的第二结构域，结构域2的环4残基425和427处受到影响。这些突变削弱了PA的易位能力。突变型在PA的第二结构域，结构域2的环3残基346，352和346+350+352处受到影响，致使PA失去生物学活性。突变型在LF的1st结构域残基148，149，151，153，187，190和187+188+189+190处受到影响，削弱了LF与PA的结合。突变型在EF的1st250残基处受到影响。
一种炭疽疫苗，所述疫苗包含选自野生型PA或野生型LF或野生型EF的炭疽毒素蛋白质。
一种炭疽疫苗，所述疫苗包含选自突变型PA或突变型LF或突变型EF或其组合的炭疽毒素蛋白质。
一种炭疽疫苗，所述疫苗包含选自野生型PA或野生型LF或野生型EF中任一及选自突变型PA或突变型LF或突变型EF中一种或多种的组合的炭疽毒素蛋白质。
一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如本发明权利要求所述的炭疽毒素蛋白质。
发明的详细描述
理想的抗炭疽疫苗应包括PA，LF，EF三者，但同时应该无毒性和安全。在疫苗中可使用具有明确组成的提纯的重组蛋白质，以减小疫苗的反应原性。并且，可通过引入影响蛋白质生物学活性但不影响其结构或免疫原性的突变，使这些炭疽毒素蛋白质变为无毒性。这些无毒的突变的炭疽毒素蛋白质可一起使用以形成一种安全的、无反应原性的、有效的抗炭疽的重组疫苗。因此，本发明的首要目标是建立一种制造安全和有效的，第二代的抗炭疽疫苗的方法，包含通过对毒素蛋白质的不同重要功能区域定点诱变而产生的无毒性炭疽毒素蛋白质。
该申请的发明者们已使用PCR技术扩增PA，LF和EF的基因。他们已经在pQE30表达载体(Gupta P.等，1998，Infect.Immun.，66，862-865；Gupta P.等，1999Protein Expr.Purif.16，369-376；Kumar P.等，2001，Infet.Immun.，69，6532-6536)中复制这些基因。所述载体包括T5启动子和6X组氨酸标记，这将便于对重组蛋白质的提纯(图1)。
使用上述重组质粒时大肠杆菌对所述基因过度表达的情况已由发明者们加以完善。(Chauhan V.等，2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.，283，308-315)。
本方法的发明者们使用上述重组质粒，在所述基因中引入突变，使表达的重组蛋白质在生物学功能上有缺陷，从而赋予其无毒性。本发明涉及从大肠杆菌菌株中对所述突变蛋白质的表达和提纯。尤其涉及对提纯的突变蛋白质完整的特性描述，以指出赋予其无毒性的缺陷。
本发明中引入保护性抗原的突变
1.
使PA结合LF/EF产生缺陷的突变。发明者们在PA的1st结构域引入一系列突变。在引入的突变中，发现残基202，203，205，207和205+226+236处的突变有连接到LF的缺陷。
2.
使PA的寡聚反应产生缺陷的突变。本发明的作者们在PA的3rd结构域引入突变。在残基552，574，552+554，562+574，566+574，552+554+562+566+574处的突变导致突变蛋白质的寡聚反应存在缺陷。
3.
使PA产生易位缺陷的突变。发明者们已在结构域2环4的残基425和427处引入突变。这些突变削弱了PA的易位能力。
使PA在插入/易位方面产生缺陷的突变。作者们已发现当在结构域2环3的残基346，352和346+350+352处引入突变时，PA变得生物学失活。突变蛋白质能够结合到细胞表面的受体，获得蛋白水解活性而形成低聚体并结合到LF。这些突变蛋白质的生物学失活可能与插入/易位的缺陷有关。
本发明中引入致死因子的突变
使LF结合PA产生缺陷的突变。本方法的发明者们已在LF的1st结构域引入突变。他们发现残基148，149，151，153，187，190和187+188+189+190处的突变会削弱LF与PA的结合。
本发明中引入水肿因子的突变
使EF结合PA产生缺陷的突变。本方法的发明者们已在EF的1st结构域250残基引入一系列突变。发现残基137，138，140和142处的突变会严重削弱LF与PA的结合。
在突变蛋白质的表达和提纯后，对这些蛋白质的生物学活性进行评估。
发明者们已发现，当上述PA的突变被单独加入野生型LF时，对J774A.1细胞是无毒性的。同样地，当LF的突变被单独加入野生型PA对J774A.1细胞是无毒性的。相似地，当EF的突变被单独加入野生型PA，是不能在CHO细胞中产生Camp-毒性的(表2)。
提纯的突变蛋白质通过以下测试分析其生物学活性：
-PA结合至细胞表面受体的能力，
-PA结合至LF或EF的能力，
-PA寡聚的能力，
-PA寡聚体插入膜的能力，
-PA使LF或EF易位进入细胞质的能力，
-致死因子杀死RAW264.7和J774A.1等巨噬细胞系的能力，
-水肿因子使CHO细胞伸长的能力。
免疫学研究
保护性抗原，顾名思义是一种高度免疫原性的蛋白质。事实上它是炭疽疫苗的必需成分。野生型重组PA的免疫作用产生高抗-PA效价，并在豚鼠体内提供对抗炭疽致死攻击的保护。还观察到突变型PA与野生型PA有相同的免疫原性，并能轻易地在疫苗中代替野生型PA(Singh等，1998，Infect.Immun.66，3447-3448)。免疫学研究也显示了LF/EF对免疫保护作用的显著作用。基于这些结论，发明者们已开发一种对抗炭疽的重组疫苗，包含所有三种炭疽毒素成分的突变型。
发明者们开发的这种基于炭疽毒素的重组疫苗具有以下优点：
1.这里所述方法不涉及培养炭疽杆菌的手段(在任何阶段)。因此本方法是安全、费用低廉的，并且无需严密的防泄漏设施。
2.发明者们开发的这种疫苗具有非常明确的组成，因此每批产品间将不会有任何差别。
3.这里描述的发明利用了提纯的突变炭疽毒素蛋白质。因此，这种第二代的炭疽疫苗将不会有反应原性，并且不同于目前的疫苗，将不会导致任何副作用。
4.另外，本发明包含无毒性突变蛋白质，当其施用后(单独使用或者联合使用)不会导致任何与目前使用的疫苗有关的毒性或致病性。
5.因此这里描述的本发明是安全的并适用于动物/人类。
实验程序的详述
炭疽毒素蛋白质的定点诱变
为在炭疽毒素蛋白质中引入设想的突变，使用互补的致突变引物(参考表1)来扩增野生型炭疽毒素基因(对于PA或LF或EF)。使用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR反应。两股质粒DNA的全长在数个轮次的热循环过程中呈线型扩增，产生相对两股上有交错缺口的突变质粒(图2)。通过对PCR产物的琼脂凝胶电泳检验扩增作用。扩增产物经DpnI处理，后者特异性地完全剪切甲基化的Gmc6 ATC序列。消化反应在20微升反应容积中含有100纳克扩增产物、2微升10X DpnI反应缓冲物、和0.1U的DpnI的条件下进行。经过DpnI消化后，设想的突变物中富含的抗DpnI分子通过DNA的转化作用得到恢复，进入合适的大肠杆菌菌株。该突变经使用Perkin Elmer循环DNA测序工具对上述构建物的测序得到证实。
突变炭疽毒素蛋白质的表达和提纯
经证实的构建物被转化入大肠杆菌表达菌株，表达T5 RNA聚合酶。转化后的细胞在含有100微克/毫升氨卡青霉素和25微克/毫升卡那霉素的Luria肉汤培养基(LB)中，在37℃下进行生长，直至0.8的OD600。然后用0.5mMIPTG进行诱导，在37℃下培养3到4小时。然后通过10分钟6000rpm的离心获取细胞。然后溶解细胞。通过SDS-PAGE和western印迹分析蛋白质的形态。使用Ni-NTA金属-螯合亲和层析法和其它层析技术提纯突变的PA蛋白质(Kumar P.等，2001，Infect.Immun.，69，6532-6536；Gupta P.等，1998，Infect.Immun.，66，862-865；Gupta P.等，1999，Protein Expr.Purif.16，369-376)。提纯的突变蛋白质经SDS-PAGE和western印迹分析并使用Bradford方法评估。保存方面提纯后的蛋白质经50mM HEPES的渗析，并在-70℃分成数份保存。
细胞培养
巨噬细胞例如细胞系J774A.1被置于含有10％加热灭活的FCS、25Mm HEPES、100U/毫升青霉素和200微克/毫升链霉素的RPMI I640培养基中，培养基置于加湿的、含5％CO2、37℃的环境中。
CHO细胞被置于含有10％加热灭活的FCS、25Mm HEPES、100U/毫升青霉素和200微克/毫升链霉素的EMEM培养基中，培养基置于加湿的、含5％CO2、37℃的环境中。
为了研究野生型PA及其突变蛋白质的生物学活性，不同浓度的该蛋白质被分别与LF(1微克/毫升)一起加入置于96孔培养皿的J774A.1细胞中。在37℃进行3小时的培养，然后使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑溴(MTT)染料(Bhatnagar R.等，1999，Cell Signa.，11，111-116)测定细胞的生存力(Bhatnagar等，1989，Infect.Immun.，57，2107-2114)。溶解在RPMI中的MTT被加至每个孔中，最终达到0.5毫克/毫升的浓度，并在37℃另外培养45分钟，以使染料可被存活细胞摄取和氧化。用1.5％(w/v)十二烷硫酸钠(SDS)，含25mM盐酸的90％异丙基乙醇和培养皿的涡旋去除培养基。使用微型平板阅读器(BIORAD)在540纳米处读取吸收度。
类似地，为了研究野生型LF及其突变蛋白质的生物学活性，不同浓度的该蛋白质被分别与PA(1微克/毫升)一起加入置于96孔培养皿的J774A.1细胞中。在37℃培养3小时，然后如上文所述用MTT染色测量细胞的生存力。
为了研究野生型EF及其突变蛋白质的生物学活性，不同浓度的该蛋白质被分别与PA(1微克/毫升)一起加入置于96孔培养皿的CHO细胞中。在37℃培养3小时，然后在显微镜下测定细胞的伸长度。在毒素处理后细胞内cAMP水平的升高使用Amersham制药公司的cAMP EIA工具测定。
然后进行进一步的实验以了解突变体是如何影响炭疽毒素突变蛋白质的生物学活性的。
PA与细胞表面受体的结合
让J774.1细胞生长至铺满24孔培养皿，然后和1微克/毫升野生型PA或其突变蛋白质在4℃一起培养2小时。然后用冷却的RPMI洗涤细胞，溶解在SDS细胞溶解缓冲液中，再进行SDS-PAGE得到电印迹。用抗-PA抗体显影该印迹，以研究野生型PA或其突变蛋白质与细胞表面受体的结合。
在溶液中PA和突变蛋白质的蛋白水解分裂
测试野生型PA及其突变蛋白质被胰岛素裂解的敏感性。在室温下、25mM HEPES、1mM CaCl2、0.5mM EDTA、pH7.5中，将蛋白质(1.0毫克/毫升)与1微克/毫升的胰岛素一起培养30分钟。通过加入PMSF直至浓度1mM使消化反应停止。为进行SDS-PAGE，将样品在SDS样品缓冲液中沸腾5分钟并分解到12％的SDS-PAGE中。
PA与LF在细胞表面的结合
将J774A.1细胞用RPMI洗涤两次，然后和1微克/毫升的野生型PA或其突变蛋白质在4℃一起培养3小时。然后用冷却的RPMI洗涤细胞以除去未结合的蛋白质。将细胞再次和LF(1.0微克/毫升)一起培养3小时，然后用冷却的RPMI洗涤以除去未结合的LF。将细胞溶解在SDS细胞溶解缓冲液中，并进行SDS-PAGE以得到电印迹。用抗-LF抗体显影该印迹，以研究野生型PA或其突变蛋白质与LF的结合。
溶液中PA的寡聚反应
PA通过细胞水解分裂解聚成为七聚物。为研究野生型PA及其突变蛋白质形成低聚体的能力，用胰岛素在25℃消化蛋白质(1毫克/毫升)30分钟。通过加入1M、pH5.0的Tris，使最终浓度达到100mM，以调整样品至pH5.0，并且在加载到倾斜度3-12％的凝胶前，在SDS样品缓冲液(0.0625M Tris-Cl，1.25％SDS，2.5％β-巯基乙醇和5％甘油，pH6.8)中沸腾5分钟。进行银染色法以探测低聚体的形成。
结合至细胞表面的PA与LF/EF结合
将J774A.1细胞用冷却的RPMI洗涤，然后和1微克/毫升的野生型PA在4℃一起培养3小时。然后再次用冷却的RPMI洗涤细胞以除去未结合的蛋白质。然后加入野生型LF/EF或其突变蛋白质(1.0微克/毫升)，继续培养3小时。然后用冷却的RPMI洗涤细胞以除去未结合的LF/EF。随后，将细胞溶解在SDS细胞溶解缓冲液中，并进行SDS-PAGE以得到电印迹。用抗-LF/EF抗体显影该印迹，以研究LF/EF与细胞表面结合键的结合。
| 残基 | 变化 | 引物 | 结构域 | 效果 |
| PA突变体 | ||||
| Phe202 | 变为丙氨酸 | 5’CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGCTGAAAG | I | 结合致死因子缺陷 |
| Leu203 | 变为丙氨酸 | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAGCAAAAGT | I | 结合致死因子缺陷 |
| Pro205 | 变为丙氨酸 | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAAGAGCAGTTCT | I | 结合致死因子缺陷 |
| Ile207 | 变为丙氨酸 | TTTGGTTAACCCTTTCTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAAGAAAAGTTCTTTTATTTTTGACATCAACCGTATATCCTTCTACCTCTAATGAATCAGCGATTCC | I | 结合致死因子缺陷 |
| Pro205+Trp226+Phe236 | 变为丙氨酸 | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAAGAGCAGTTCT和GGATTTCTAATATTCATGAAAAGAAAGGATTAACCAAATATAAATCATCTCCTGAAAAAGCGAGCACGGCTTCTGATCCGTACAGTGATGCCGAAAAGGTT | I | 结合致死因子缺陷 |
| Phe552 | 变为丙氨酸 | CAAGGGAAAGATATCACCGAATTTGATGCTAATTTCGATC | III | 寡聚反应缺陷 |
| Ile574 | 变为丙氨酸 | GAATTAAACGCGTCTAACGCATATACTG | III | 寡聚反应缺陷 |
| Phe552+Phe554 | 变为丙氨酸 | ATTTTGAGATGTTTGTTGATCGGCATTAGCATCAAATTC | III | 寡聚反应缺陷 |
| Ile562+Ile574 | 变为丙氨酸 | CAGTATATGCGTTAGACGCGTTTAATTCCGCTTAACTGATTCTTGGCATTTTGAGATG | III | 寡聚反应缺陷 |
| Leu566+Ile574 | 变为丙氨酸 | ATCAGGCAGCGGAATTAAACGCGTCTAACGCATATACTG | III | 寡聚反应缺陷 |
| Phe552+Phe554+Ile562+Leu566+ | 变为丙氨酸 | CAGTATATGCGTTAGACGCGTTTAATTCCGCTGCCTGATTCTTGGCATTTTGAGATG和ATTTTGAGATGTTTGTTGATCGGCATTAGCATCAAATT | III | 寡聚反应缺陷 |
| Ile574 | ||||
| Phe427 | 变为丙氨酸 | GTAATTGGAGTAGAACTGGCATCGTCTTGTGC | II | 易位缺陷 |
| Asp425 | 残基缺失 | GTAATTGGAGTAGAACTGAAATCTTGTTCATTTAATGCG | II | 易位缺陷 |
| Phe427 | 残基缺失 | GCACAAGACGATAGTTCTACTCCAATTAC | II | 易位缺陷 |
| Trp346 | 变为丙氨酸 | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAACTGCGGCTGAAACAATG | II | 膜插入/易位缺陷 |
| Leu352 | 变为丙氨酸 | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAACTTGGGCTGAAACAATGGGTGCAAATACCGCTGAT | II | 膜插入/易位缺陷 |
| Trp346，Met350和Leu352 | 变为丙氨酸 | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAACTGCGGCTGAAACAGCGGGTGCAAATACCGCTGAT | II | 膜插入/易位缺陷 |
| LF突变体 | ||||
| Tyr148 | 变为丙氨酸 | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTGCTTAT | I | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Tyr149 | 变为丙氨酸 | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGCTGAA | I | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Ile151 | 变为丙氨酸 | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGAAGCAGGT | I | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Lys153 | 变为丙氨酸 | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGAAATAGGTGCAATA | I | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Asp187 | 变为丙氨酸 | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAAATAAAAGAGCTGTTCATCTGA | I | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Phe190 | 变为丙氨酸 | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAGCTAAAAGATCTTC | I | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Asp187，Leu188，Leu189，Phe190 | 变为丙氨酸 | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAGCTGCAGCAGCTTGTTCATCTGA | I | 与保护性抗原结合缺陷 |
| EF突变体 | |||
| Tyr137 | 变为丙氨酸 | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCCTTTCCAATTTCAGCATATACTTCTTTACTTTGTTCAC | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Tyr138 | 变为丙氨酸 | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCCTTTCCAATTTCATAAGCTACTTCTTTACTTTGTTCAC | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Ile140 | 变为丙氨酸 | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCCTTTCCAGCTTCATAATATACTTCTTTACTTTGTTCAC | 与保护性抗原结合缺陷 |
| Lys142 | 变为丙氨酸 | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCCGCTCCAATTTCATAATATACTTCTTTACTTTGTTCAC | 与保护性抗原结合缺陷 |
表2：突变体的特征
| PA中的突变 | 受体结合 | 胰蛋白酶切割 | 寡聚体形成 | LF/EF结合 | 毒性 |
| Phe202Ala | + | + | + | - | - |
| Leu203Ala | + | + | + | - | - |
| Pro205Ala | + | + | + | - | - |
| Ile207Ala | + | + | + | - | - |
| Pro205Ala+Trp226Ala+Phe236Ala | + | + | + | - | - |
| Phe552Ala | + | + | - | - | - |
| Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe552Ala+Phe554Ala | + | + | - | - | - |
| Ile562Ala+Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Leu566Ala+Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe552Ala+Phe554Ala+Ile562Ala+Leu566ala+Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe427Ala | + | + | + | + | - |
| Asp425del | + | + | + | + | - |
| Phe427del | + | + | + | + | - |
| Trp346Ala | + | + | + | + | - |
| Leu352Ala | + | + | + | - | |
| Trp346Ala+Met350Ala+Leu352Ala | + | + | + | + | - |
| LF中的突变 | 与PA结合 | 毒性 |
| Tyr148Ala | - | - |
| Tyr149Ala | - | - |
| Ile151Ala | - | - |
| Lys153Ala | - | - |
| Asp187Ala | - | - |
| Phe190Ala | - | - |
| Asp187Ala+Leu188Ala+Phe190Leu189Ala | - | - |
| EF中的突变 | 与PA结合 | 毒性 |
| Tyr137Ala | - | - |
| Tyr138Ala | - | - |
| Ile140Ala | - | - |
| Lys142Ala | - | - |
Claims (50)
1.一种重组DNA构建物，其特征在于，所述构建物包括：
-一种表达载体，和
-一种DNA片段，所述片段包含野生型保护性抗原(PA)或野生型致死因子(LF)或野生型水肿因子(EF)的基因。
2.一种重组DNA构建物，其特征在于，所述构建物包括：
-一种表达载体，和
-一种DNA片段，所述片段包含突变型保护性抗原(PA)或突变型致死因子(LF)或突变型水肿因子(EF)的基因。
3.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述载体是原核载体。
4.权利要求3所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述原核载体是PQE 30。
5.权利要求4所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述表达载体包含T5启动子和6X组氨酸标记。
6.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Phe202上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
7.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Leu203上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
8.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Pro205上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
9.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Ile207上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
10.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Pro205，Trp226和Phe236上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
11.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Phe552上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
12.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
13.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Phe552和Phe554上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
14.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Ile562和Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
15.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Leu556和Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
16.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Phe552和Phe554，Ile562，Leu566和Ile574上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
17.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Phe427上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
18.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是去除残基Asp425的保护性抗原基因。
19.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是去除残基Phe427的保护性抗原基因。
20.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Trp346上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
21.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Leu352上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
22.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Trp346，Met350和Leu352上发生丙氨酸取代的保护性抗原基因。
23.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Tyr148上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
24.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Tyr149上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
25.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Ile151上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
26.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Lys153上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
27.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Asp187上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
28.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Phe190上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
29.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Asp187，Leu188，Leu189和Phe190上发生丙氨酸取代的致死因子所含的基因。
30.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Tyr137上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
31.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Tyr138上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
32.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Ile140上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
33.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段是在残基Lys142上发生丙氨酸取代的水肿因子所含的基因。
34.如权利要求1或2所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述DNA片段编码的蛋白质在原核宿主中表达。
35.如权利要求34所述的重组DNA构建物，其特征在于，所述原核宿主是一种大肠杆菌菌株。
36.一种由基因DNA片段表达的蛋白质，所述蛋白质是野生型PA、野生型LF、野生型EF和它们的突变变体。
37.一种生产突变的炭疽毒素蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：
- 使用不同的互补的致突变引物进行PCR反应以使PA、LF和EF基因突变，
- 用一种酶同时处理所述突变PCR产物及天然模板，以使所述PCR产物的天然模板裂解，
- 将所述突变产品转化入大肠杆菌菌株，
- 从转化的大肠杆菌菌株分离重组构建物，并确认所需的突变，
- 转化经确认的突变构建物进入适当的大肠杆菌表达株以表达突变的蛋白质，
- 提纯所述表达的突变蛋白质。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述提纯使用Ni-NTA层析法和/或其它层析技术进行。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述酶是特异性地完全剪切甲基化的Gmc6 ATC序列的DpnI酶。
40.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述基因在包含T5启动子和6X组氨酸标记的PQE表达载体中克隆。
41.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述突变型在PA的第一结构域在残基202，203，205处受到影响。
42.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述突变型在PA的第三结构域在残基552，574，552+554，562+574，566+574，552+554+562+566+574处受到影响，导致突变蛋白质在寡聚反应中有缺陷。
43.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述突变型在PA的第二结构域在结构域2的环4残基425和427处受到影响。这些突变削弱了PA的易位能力。
44.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述突变型在PA的第二结构域在结构域2的环3残基346，352和346+350+352处受到影响，而使PA失去生物学活性。
45.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述突变型在LF的第一结构域在残基148，149，151，153，187，190和187+188+189+190处受到影响，削弱了LF与PA的结合。
46.如权利要求37所述的方法，其特征在于，定点突变型在EF的1st 250残基处受到影响。
47.一种炭疽疫苗，其特征在于，所述疫苗包括一种选自野生型PA或野生型LF或野生型EF的炭疽毒素蛋白质。
48.一种炭疽疫苗，其特征在于，所述疫苗包括一种选自突变型PA或突变型LF或突变型EF或其组合的炭疽毒素蛋白质。
49.一种炭疽疫苗，其特征在于，所述疫苗包括一种经过挑选的炭疽毒素蛋白质，所述蛋白质是选自野生型PA或野生型LF或野生型EF中任一及选自突变型PA或突变型LF或突变型EF中任何一个或多个的组合。
50.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含有效量的权利要求46-49中任一项所述的炭疽毒素蛋白质。
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