CN105797148B - 一种无毒炭疽活疫苗及无毒炭疽菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种无毒炭疽活疫苗，其活性成分包括表达炭疽保护性抗原突变体蛋白(rPA)的无毒炭疽菌株。所述无毒炭疽菌株是通过在原始Sterne疫苗株pXO1质粒上进行位点突变获得的，所述点突变为保护性抗原的R178A和K197A双位点突变体。本发明所提供的活疫苗选用含有保护性抗原PA显性失活突变体的菌株制备，其优点不仅使其丧失结合致死因子和水肿因子的能力，导致不能产生毒素，经证实其免疫原原无任何改变，同时生物失活的rPA还可以竞争结合细胞受体，能够达到中和炭疽毒素的目的。该突变株完全丧失形成芽孢的功能，符合不危害操作者和不造成环境污染的疫苗规范要求，给药途径可选用皮下注射和口服，克服了Sterne疫苗株因残留毒力大而不宜某些家畜适用的缺点。

Description

一种无毒炭疽活疫苗及无毒炭疽菌株
技术领域
本发明涉及免疫医学领域，具体的，涉及一种无毒炭疽活疫苗及无毒炭疽菌株。
背景技术
炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞杆菌感染引起的一种人畜共患传染病。炭疽最初是一种草食动物性疾病，一方面由于1937年Sterne成功的研制出高效的家畜疫苗，另一方面由于抗生素的应用，使这种疾病在全世界范围内的发病率明显下降，然而炭疽仍然有其重要的地位，在世界各地，炭疽在牲畜中散发流行，不仅影响畜牧业的发展和动物皮、毛、骨粉等的外贸出口，目前炭疽对动物地方病流行地区的易感动物种群仍然是一种潜在的威胁，同时Sterne疫苗株对山羊，马等易感动物因为副反应严重，甚至引起死亡而不宜适用接种。近几年，我国不少老、少、边、穷地区仍然不同程度地存在高度散发性畜间炭疽，且不时引起人间炭疽暴发，甚至流行，因此，开发更为安全有效的兽用炭疽疫苗显得尤为重要且意义深远。
现已清楚，炭疽杆菌pXO1质粒编码的毒素由三种成分组成：保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)，它们都是炭疽杆菌分泌的蛋白单体。属于经典的AB型细菌毒素类型，其中PA相当于B亚单位，是介导蛋白；LF和EF相当于A亚单位，是具有酶活性的部分。PA结合细胞表面受体形成七聚体，然后结合LF或EF，将它们运送入宿主细胞内。PA与EF结合形成水肿毒素(EeTx)，可引起宿主细胞水肿反应；PA与LF结合形成致死毒素(LeTx)，可引起宿主细胞凋亡，已经确认致死毒素是造成炭疽疾病死亡的重要因素。
目前炭疽兽用疫苗生产用的PasteurII苗或Sterne菌株都是人工选择诱导后丢失了毒素质粒(pXO1)或荚膜质粒(pXO2)的减毒株。但在发明人前期的研究中发现PasteurII苗仍然带有毒素质粒(pXO1)，这也明确揭示了PasteurII苗比Sterne苗毒性强的真正原因，以致后来Sterne苗逐渐代替了风靡一时的PasteurII苗，成为第二代疫苗的首选而被生产和应用半个多世纪，它的出色效果使炭疽兽用疫苗再没有新疫苗发展的动力。然而，Sterne菌株虽然缺失了荚膜，但仍能产生毒素，因此Sterne菌株虽然能产生保护性抗原，有较好的免疫保护效果，但所产生的水肿因子和致死因子还是能够引起严重的接种反应，特别对某些易感动物(山羊，马等)种属仍保留残余毒力，仅能提供有限的持续性保护，并且必须通过注射免疫而使用，这些特点使之在某些情况下应用效果不够理想。例如在发展中国家，注射工具短缺的现状成为将这种使用方式应用在野生动物的免疫预防的障碍。因此进入八十年代，兽医领域产生了研发新的炭疽疫苗的需求，研究工作者尝试把Sterne苗制成生物弹通过射击的方式进行大规模的野生动物远距群体免疫获得成功，但据估计进行远距离群体免疫时需要直升机、乘务员、观察者和射击手，一天仅能免疫大约1000头动物，所以成本非常昂贵，不适合推广；有人用Sterne苗进行口服实验观察，虽然通过动物血清学监测能够产生免疫应答，但担心随粪便排出的Sterne芽孢苗对环境的危害无法清除，所以对畜用疫苗株的改造仍然在进行，目的是增强活疫苗的安全性，减轻反应性，保证免疫效果和避免造成环境污染，使之变得更加安全有效。
发明内容
本发明的目的在于开发一种新的具有优良免疫保护效果，低毒性作用和使用简单方便适合于兽用注射和口服的无毒炭疽活疫苗。
为达到以上目的，发明人对炭疽杆菌中能够引起机体对其产生免疫保护应答的主要成分进行了深入研究，尝试选用改造现有疫苗株在pXO1质粒上保护性抗原(PA)的生物活性突变体制备炭疽活疫苗。
基于研究的结果，本发明提供了一种无毒炭疽活疫苗，所述炭疽活疫苗的活性成分包括表达炭疽保护性抗原PA突变体蛋白的无毒炭疽菌株，其中，所述炭疽活疫苗的活性成分包括表达炭疽保护性抗原PA突变体蛋白的无毒炭疽菌株，其中，所述无毒炭疽疫苗菌株是通过在原始Sterne疫苗株的pXO1质粒上通过进行点突变改造获得的，所述点突变为炭疽保护性抗原PA的R178A和K197A双位点突变。
其中，R178A/K197A代表同时存在两个位点的突变，R178A为第178位的精氨酸突变为丙氨酸，K197A为第197位的赖氨酸突变为丙氨酸。
所述原始Sterne疫苗株由中国医学细菌保藏管理中心炭疽芽孢杆菌专业实验室所保藏提供。该原始菌株我国于1948年自印度引进后一直使用制造兽用炭疽活芽孢疫苗,它是英国科学家斯特恩1937年采用脱纤维马血清培养基，在二氧化碳条件下成功选育的减毒菌株，是本领域技术人员所公知的，已应用于炭疽疫苗生产研究且能够通过合法途径获取得到的菌株。
所述PA突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有相同功能的蛋白。
所述PA突变体蛋白不结合炭疽致死因子(LF)和水肿因子(EF)，不能将它们运送入宿主细胞内，不会产生致死毒素和水肿毒素，且具备较高的免疫原性。同时还意外的发现PA突变体蛋白能够完全抑制炭疽杆菌芽孢的形成。
特别优选的，所述表达炭疽保护性抗原PA突变体蛋白的无毒炭疽疫苗株为炭疽芽孢杆菌SterneXL，分类命名为Bacillus anthracis，保藏号为CGMCC No.12058。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年1月19日。
可选的，所述炭疽活疫苗还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂的组成成分包括蔗糖、明胶、维生素C和谷胺酸钠等。优选的，为了获得最佳的稳定保存效果，所述活疫苗制备成冻干疫苗时含有一定百分含量的冻干剂，其中包含5％的蔗糖和1.5％的明胶。
所述活疫苗经冷冻干燥后，性状为乳白色或微带黄色的疏松固体，加入氯化钠注射液后，应于1分钟内快速溶解成均匀的混悬液。
优选的，所述活疫苗为兽用疫苗，可以适用于所有动物的免疫接种，例如特别适用于山羊，马等家畜的免疫接种，对易感动物没有残余毒力，能够提供持续性保护，并且由于该活疫苗中的无毒炭疽菌株不能够形成荚膜，因此对环境的安全性高。
优选的，所述无毒炭疽活疫苗的剂型为注射剂或口服剂。当所述无毒炭疽活疫苗为口服剂时，可以含有本领域制备口服疫苗时的常规添加剂。
本发明还提供了一种无毒炭疽菌株，所述无毒炭疽菌株表达炭疽保护性抗原PA突变体蛋白，其中，所述PA突变体蛋白具有R178A和K197A双位点突变。
优选的，所述无毒炭疽疫苗菌株为炭疽芽孢杆菌SterneXL，分类命名为Bacillusanthracis，保藏号为CGMCC No.12058。
本发明还提供了所述无毒炭疽疫苗菌株的构建方法，包括在原始Sterne疫苗菌株的pXO1质粒上进行点突变，其中，所述点突变为炭疽保护性抗原PA的R178A和K197A双位点突变体蛋白,以下简称突变体(rPA)蛋白。
本发明所述的无毒炭疽疫苗菌株在制备预防和/或治疗炭疽的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的疫苗菌株是在世界范围内广泛使用的炭疽第二代Sterne疫苗的基础上通过基因工程改造获得的全新的第三代炭疽疫苗SterneXL，选用保护性抗原(PA)显性生物失活突变体的减毒菌株制备，其优点是不仅使PA与LF或EF相互不能结合，丧失天然组合物产生炭疽毒素的能力和致死毒性作用，改善了其亲本株对山羊，马等动物因副作用大不宜适用的缺点。而且显性失活突变体蛋白rPA免疫原性和保护性优于野生保护性抗原，同时生物失活的PA还可以竞争结合细胞受体，抑制野生毒素的活性，达到中和炭疽毒素的目的。更为惊奇的是由于对保护性抗原进行的双突变位点，完全负调节抑制了芽孢形成基因的功能，使其发生显性失活，导致该突变株不能形成芽孢，以繁殖体形式存活的疫苗株在自然界比芽孢形式存活脆弱的多，将在短时间内死亡,不危害操作者和不造成环境污染，成为非常理想的疫苗选育株。
菌种保藏信息：炭疽芽孢杆菌SterneXL，分类命名为Bacillus anthracis，保藏号为CGMCC No.12058。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期为2016年1月19日。
附图说明
图1为SDS-PAGE凝胶电泳检测突变体(rPA)蛋白表达纯化图。
图2为AQassay检测突变体(rPA)蛋白丧失生物活性图。
图3为用突变体(rPA)蛋白攻击F344大鼠后观察死亡曲线图。
图4为野生PA和突变体(rPA)蛋白免疫F344大鼠后血清效价比较。
图5为不同剂量突变体(rPA)蛋白免疫F344大鼠后血清效价比较。
图6为免疫F344大鼠后用毒素攻击观察保护效果曲线图。
图7为免疫F344大鼠血清被动保护性实验观察保护效果曲线图。
图8为新构建疫苗株携带pXO1质粒突变示意图。
图9为Western bloting检测亲本株和新疫苗株PA蛋白的表达。
图10为PFGE检测亲本株和新疫苗株不同酶切差异性比较。
图11为亲本株和新疫苗株不同时间的生长曲线图。
图12为亲本株和新疫苗株形成芽孢功能性比较。
图13为亲本株和新疫苗株感染小白鼠水肿反应观察。
图14为亲本株和新疫苗株感染山羊副作用观察。
图15为新疫苗株免疫山羊一个月后血清效价测定。
图16为新疫苗株免疫山羊四个月后血清效价测定。
图17为新疫苗株免疫小白鼠后被攻毒观察保护性效果。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明，但实施例的给出并不用来限制本发明的范围。
实施例1
1、在炭疽保护性抗原蛋白质中引入R178A和K197A双位点突变
使用互补的致突变引物来扩增野生型炭疽保护性抗原基因见表1：
表1 保护性抗原突变位点所用的引物表
引物名称 序列(5'-3')
R178for: ggacctacggttccagacgcagacaatgatggaatc；
R178rew: gattccatcattgtctgcgtctggaaccgtaggtcc.
K197for: ggatatacggttgatgtcgcaaataaaagaacttttc
K197rew: gaaaagttcttttatttgcgacatcaaccgtatatcc
参考炭疽杆菌(Ames Ancestor)菌株GenBank:AE017336.2完成的pXO1质粒测序报道，编码保护性抗原的基因pagA在143779-146073区间。设计引物见上表，以炭疽杆菌A16R人用疫苗株DNA染色体为模板，使用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR反应。两股质粒DNA的全长在数十次的热循环过程中呈线型扩增，产生相对两股上有交错缺口的突变质粒。通过对PCR产物的琼脂凝胶电泳检验扩增产物。扩增产物经DpnI处理，特异性地完全剪切甲基化的Gmc6ATC序列。酶切消化反应在50微升反应容积中进行，含有100纳克扩增产物、5微升10XDpnI反应缓冲物和1U的DpnI。经过DpnI消化后，设想的突变物中富含的抗DpnI分子通过DNA的转化作用得到恢复，电击转化大肠杆菌宿主DH5α，挑选阳性克隆提取质粒。确认获得构建并表达单突变保护性抗原K197A和R178A的菌株，随后分别提取突变保护性抗原R178A株的质粒为模板，使用与分别对应的单突变保护性抗原K197A的引物，按上述获得突变操作的技术方法进行二次突变，确认获得构建并表达双突变保护性抗原R178A/K197A株，经测序证实突变成功后，将提取的阳性克隆质粒经SCS110转化后，电击入ΔPasteurII株(tox-/cap-)中，阳性菌株进一步通过测序鉴定，保证克隆蛋白基因无突变。
2、生产表达和纯化野生和突变体蛋白质
将筛选出的含有编码蛋白序列的阳性克隆培养在LBS培养基(3％蛋白胨，0.5％酵母侵膏粉，0.5％氯化钠，0.6％磷酸氢二钠，0.1％磷酸二氢钾)中，含有10mg/ml卡拉霉素，37℃振荡过夜培养18小时。离心收集上清液，采用Millipore超滤离心管进行浓缩上清液，然后选用阴离子交换柱进行蛋白纯化，最后利用凝胶过滤层析，进一步纯化获得纯度为99％以上的目的蛋白。利用Biorad蛋白定量试剂盒，对纯化蛋白进行精确定量，提纯的蛋白质经SDS-PAGE和western印迹分析并使用Bradford方法评估。提纯后的蛋白质经50mMHEPES的渗析，并在-80℃分成数份保存。蛋白质经SDS-PAGE电泳如图1所示。图1中，第1和第3泳道为蛋白分子量，2为纯化前蛋白，4为R178A/K197A纯化后蛋白，以下简称rPA蛋白。
3、实验室评估突变蛋白质的生物学活性
利用AQassay检测技术检测克隆表达蛋白的活性，将被试J774A.1巨噬细胞培养在含有10％小牛血清(FBS)和1％抗生素(P/S)的DMEM(Dμlbecco Modified Eagle Medium)培养基中，37℃5％二氧化碳条件下培养。待细胞培养良好后接种在96孔细胞培养板上，当细胞在96微孔细胞培养板上生长达70％时，无菌条件下按不同稀释剂量加入制备好的致死毒素(10μg/ml LF+0.1μg/ml PA)，继续培养3小时，然后加Cell Titer 96aqueousnonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)检查LDH，计算分析细胞死亡百分数如图2所示，图2中，PA为野生型保护性抗原，R178A/K197A为突变体蛋白，LF为野生型致死因子。
4、动物实验毒力测定
毒力测定实验选用体重150g、雌性F344大鼠，炭疽毒素和突变蛋白质经尾静脉注射，浓度为LT60μg(致死剂量)，即PA30μg+LF30μg，F344大鼠90分钟左右全部死亡(6/6)。突变蛋白质剂量加大3倍K197/R178 90μg+LF90μg，F344大鼠无症状和无死亡(6/0)。如图3所示，图3中，PA为野生型保护性抗原，R178A/K197A为突变蛋白，LF为野生型致死因子。
5、实验室免疫学特性分析
用炭疽野生保护性抗原蛋白PA和突变体R178A、K197A和R178A/K197A蛋白免疫Balb/c小鼠，二周后追加免疫一次，一月后采集血清检测各种蛋白的免疫原性。将野生保护性抗原蛋白PA以2μg/ml的浓度包板，将待检测血清倍比稀释，用HRP标记兔抗鼠二抗1:5000检测，通过ELISA对上述各种蛋白组分的免疫血清抗体进行测定。结果显示，突变蛋白R178A/K197A产生高滴度效价的抗体，抗体滴度为128000，而其它蛋白的抗体滴度效价相对较低，分别是野生保护性抗原蛋白PA为64000，R178A为64000，K197A为64000。
6、动物保护性实验观察
6.1实验动物：F344大鼠
6.2实验安排
实验1组6只，注射50μg野生保护性抗原(PA)；
实验2组6只，注射50μg突变保护性抗原rPA；
试验3组6只，对照。
6.3疫苗佐剂：氢氧化铝。
6.4免疫途径：下肢肌内。
6.5免疫和攻毒时间见表2。
表2免疫和攻毒时间的安排
时间 0周 3周 5周 7周 8周
工作 第1次免疫 第2次免疫 第3次免疫 第1次攻毒 第2次攻毒
6.6攻毒方式
采用尾静脉注射60μg炭疽致死毒素(LF30μg+PA30μg)。
6.7结果分析如图4-5所示，图4为野生PA和突变体(rPA)蛋白免疫F344大鼠后血清效价比较。图5为不同剂量突变体(rPA)蛋白免疫F344大鼠后血清效价比较。
图4-5中，第一次免疫血清从1:100稀释至1:3200，第二次免疫血清从1:400稀释至1:52600，第三次免疫血清从1:1000稀释至1:128000。
6.7.1血清效价测定
6.7.1.1野生保护性抗原PA和突变保护性抗原rPA血清效价比较
每组取了3只大鼠。用野生保护性抗原PA83(2μg/ml)包被，血清从1:1000稀释到1:128000。
6.7.1.2不同剂量突变保护性抗原rPA血清效价比较
6.8.1.保护力实验如图6所示
对照组用30μgPA+30μg LF稀释于180μl无菌PBS中使注射体积为300μl，尾静脉注射大鼠，大鼠均在90min左右死亡。实验各组尾静脉注射等剂量毒素，实验组1和2均存活，rPA免疫组用5倍剂量的最小致死剂量(150μg PA+150μg LF)尾静脉注射，观察大鼠仍然存活，无任何症状发生。
6.8.2.血清被动保护力实验结果如图7所示
采集仍然存活大鼠的血清，分组重新尾静脉注射大鼠，然后实验各组尾静脉注射等剂量毒素，实验野生保护性抗原蛋白PA血清注射组，用炭疽毒素攻击大鼠后约2h死亡，实验突变体蛋白rPA血清注射组，用炭疽毒素攻击大鼠后存活且无伴随症状。
实施例2 无毒疫苗菌株的构建
通过上述实验证实突变保护性抗原(rPA)具有免疫原性，保护性效果优于野生性的保护性抗原(PA)，且不能产生致死毒素和水肿毒素。所以，通过同源重组技术把Sterne菌株中的pXO1质粒上的保护性抗原(PA)进行定点突变，也就是说把Sterne菌株中pXO1质粒的保护性抗原(PA)两位点R178A和K197A进行了双突变，从而使pXO1质粒中产生的突变体保护性抗原蛋白，其不能结合致死因子(LF)和水肿因子(EF)，构建成无毒的新疫苗株，命名为SterneXL，无毒疫苗株pXO1质粒突变示意如图8所示。
具体操作如下。
采用overlap方法进行pag基因上下同源臂序列的扩增，具体方法为：在pag基因上游设计合成引物：
142778F_Bam：
5’-GGAGGATCCCGAGATGAAAATGGTAATATAGCG-3’，
143802R_crossover：
5’-TTATCCTATCTCATATATTAACACTTTTCGTTTTTTCAT-3’
上游引物引入BamHI酶切位点，以突变质粒为模板，PCR扩增获得上游同源臂序列片段长约1000bp；在pag基因下游设计合成引物：146050F_crossover：
5’-ATGAAAAAACGAAAAAAAAAAGGCTATGAGATAGGATAA-3’，
146854R_Bgl：
5’-AGAAGATCTGTTTTTAAGAACTTTCGCACACTA-3’
下游引物引入BglII酶切位点，以构建表达突变保护性抗原的质粒为模板，PCR扩增获得下游同源序列片段长约800bp；由于143802R_crossover和146050F_crossover部分序列互补，将上、下游同源臂的PCR扩增产物混合后，直接利用引物142778F_Bam和146854R_Bgl进行扩增即获得长1.8kb的片段，将此片段经BamHI和BglII双酶切后克隆于同样双酶切的质粒pMAD中，获得重组质粒PA-pMAD。将重组质粒经SCS110活化后，电击转化Sterne菌株，于42℃获得整合有PA-pMAD的整合子，然后低温30℃传代，筛选无erm抗性菌株，最后利用PCR及序列测定确认获得基因突变株(如图9所示，亲本株和新疫苗株Western bloting检测PA蛋白的表达，1为标准分子量，2为纯化保护性抗原蛋白PA，3为Sterne菌株，4为SterneXL菌株)，命名为SterneXL，将成为本发明新疫苗株，新疫苗SterneXL株经过连续传60代培养经测序检验突变位点和实验室保藏一年以上没有发现返祖现象，证明疫苗株的稳定性和可靠性。
实施例3 生物学性状鉴定
在实验室进行了常规鉴定，包括培养菌落形态、革兰氏染色、生化反应、噬菌体AP631裂解试验、青霉素抑制试验、串珠试验、SDS-PAGE电泳和炭疽沉淀素血清凝胶扩散。
经鉴定与原始株除不形成芽孢外，没有其它生物学性状改变，如图10-12所示(图10中，1为标准分子量，2为Sterne菌株，3为SterneXL菌株，图11为亲本株和新疫苗株不同时间的生长曲线图；图12为亲本株和新疫苗株形成芽孢功能性比较。)，新疫苗株模拟环境下生存时间实验观察(见表3)。
表3
Figure BDA0000954107920000111
RT-PCR证实除调控芽孢的基因在转录水平有所变化，其它致病基因没有改变，(见表4)。
表4 RT-PCR检测亲本株和新疫苗株基因在转录水平的变化
实施例4 动物实验毒力测定
4.1小白鼠感染实验
Balb/c小白鼠随机分成二组，每组6只。Sterne和SterneXL菌株组分别注射108个/毫升菌悬液0.2ml。操作时，选择大腿内侧的皮肤，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，可缓慢地将细菌注入皮下。如图13所示，图13中，Sterne为亲本株，SterneXL为新疫苗株。
4.2山羊感染实验
Sterne芽孢苗对山羊和马比较敏感，常发生严重接种反应，注射芽胞苗后副作用大甚至发生死亡，选用新疫苗株SterneXL感染山羊，与亲本株进行比较，结果Sterne苗感染的山羊反应严重，死亡2只。新疫苗株SterneXL感染的山羊状况良好。用增加两倍剂量的SterneXL苗攻击山羊仍然没有发生任何不良反应，证明SterneXL苗对山羊是非常安全的，对免疫山羊1个月和四个月后采集血清进行效价测定，一个月达128000，四个月为32000，证明SterneXL疫苗株对山羊有高效的免疫应答，而且血清滴度下降缓慢，能够长时间在机体内持续存在，表明新疫苗具有较长的免疫原性和持续性，亲本株和新疫苗株感染山羊副作用观察如图14所示，图14A为山羊感染存活率，图14B为山羊感染后水肿反应发生率，新疫苗株免疫山羊一个月后血清效价测定如图15所示(A为PA抗体，B为LF抗体)，新疫苗株免疫山羊四个月后血清效价测定如图16所示(A为PA抗体，B为LF抗体)。
实施例5 动物实验免疫保护效果观察
本试验选用新疫苗株SterneXL进行感染免疫小白鼠BALB/C，免疫一个月后用炭疽杆菌攻毒，观察其保护性效果。12只BALB/C小鼠随机分为二组，一组为免疫组，一组为对照组，使用常规免疫方法后用104个/毫升炭疽杆菌PasteurII株菌悬液0.2ml攻毒，结果显示新疫苗株SterneXL免疫组对炭疽杆菌PasteurII株免疫保护力能够达到100％，如图17所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000954108030000011
Figure IDA0000954108030000021
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Claims (7)

1.一种无毒炭疽活疫苗，其特征在于，所述炭疽活疫苗的活性成分包括表达炭疽保护性抗原PA突变体蛋白的无毒炭疽菌株，其中，所述无毒炭疽菌株是通过在原始Sterne疫苗菌株的pXO1质粒上进行点突变改造获得的选育株，所述点突变为炭疽保护性抗原PA的R178A和K197A双位点突变；
所述PA突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的无毒炭疽活疫苗，其特征在于，所述表达炭疽保护性抗原PA突变体蛋白的无毒炭疽菌株为炭疽芽孢杆菌SterneXL，分类命名为Bacillus anthracis，保藏号为CGMCC No.12058。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的无毒炭疽活疫苗，其特征在于，所述活疫苗为兽用疫苗。
4.根据权利要求3所述的无毒炭疽活疫苗，其特征在于，所述活疫苗还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂的组成成分包括蔗糖、明胶、维生素C和谷胺酸钠。
5.根据权利要求1或2中任意一项所述的无毒炭疽活疫苗，其特征在于，所述无毒炭疽活疫苗为注射剂或口服剂。
6.一种无毒炭疽菌株，其特征在于，所述无毒炭疽菌株表达炭疽保护性抗原PA突变体蛋白，其中，所述PA突变体蛋白具有R178A和K197A双位点突变；所述无毒炭疽菌株为炭疽芽孢杆菌SterneXL，分类命名为Bacillus anthracis，保藏号为CGMCC No.12058。
7.权利要求6所述的无毒炭疽菌株在制备预防和/或治疗炭疽的药物中的应用。
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