RU2287581C2 - Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины - Google Patents
Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2287581C2 RU2287581C2 RU2004120293/13A RU2004120293A RU2287581C2 RU 2287581 C2 RU2287581 C2 RU 2287581C2 RU 2004120293/13 A RU2004120293/13 A RU 2004120293/13A RU 2004120293 A RU2004120293 A RU 2004120293A RU 2287581 C2 RU2287581 C2 RU 2287581C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- alanine
- dna fragment
- amino acid
- acid sequence
- gene encoding
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 title description 14
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 title description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 63
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims abstract description 53
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 45
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 16
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 16
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 13
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 78
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 64
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 52
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 claims description 43
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 claims description 20
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 claims description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 28
- 101000585552 Bacillus anthracis Protective antigen Proteins 0.000 claims 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 26
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 12
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 8
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 4
- 241000272168 Laridae Species 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 102220590510 Alpha-1,6-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase_W346A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102220545419 Exportin-1_F554A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220478383 Interleukin enhancer-binding factor 3_F552A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002497 edematous effect Effects 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 2
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 102220337144 rs375830111 Human genes 0.000 description 2
- 102200124078 rs72667032 Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102220530017 Brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2_F427A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102220516988 Double homeobox protein 1_K153A_mutation Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102220585628 Glutamate receptor ionotropic, delta-2_M350A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220552418 Guanylate-binding protein 1_L188A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220474977 Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic_Y149A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220468753 Homeobox protein Meis2_I151A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220467367 Hypoxia-inducible lipid droplet-associated protein_Y138A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220509941 Isoamyl acetate-hydrolyzing esterase 1 homolog_Y137F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220503000 Laminin subunit gamma-3_F202A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710180643 Leishmanolysin Proteins 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 102220539777 Lymphocyte antigen 6 complex locus protein G5b_I140A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102220633146 Mu-type opioid receptor_W226C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102220510481 Protein odd-skipped-related 2_F190A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102220493086 Type-2 angiotensin II receptor_Y148A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102220531618 Zinc finger protein ZFPM2_L352A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960002235 anthrax antigen Drugs 0.000 description 1
- 229960005447 anthrax vaccines Drugs 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102220006542 rs113994164 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности производству вакцин. Описанная сибиреязвенная вакцина включает мутантный белок токсин Bacillus anthracis, выбранный из мутантного РА, или мутантного LF, или мутантного EF, или их комбинации, при этом токсины мутированы таким образом, чтобы при снижении уровня их токсичности сохранить иммуногенность. Для создания вакцины со сниженной реактогенностью предложена рекомбинантная ДНК-конструкция для экспрессии указанных белков-токсинов. ДНК-конструкция включает экспрессирующий вектор и ДНК-фрагмент, включающий в свою очередь гены, кодирующие соответствующий токсин-белок (PA, LF или EF). Описан способ получения мутантных белков с использованием трансформированного прокариотического хозяина. Полученный мутантный белок-токсин, обладающий иммуногенными свойствами и нетоксичностью, - используют для приготовления противосибирязвенной вакцины, включающей один или более мутантных белков-токсинов, а также в комбинации с белком-токсином PA, LF или EF дикого типа. Использование изобретения позволит создать безопасную и эффективную вакцину против сибирской язвы. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.
Description
Изобретение относится к рекомбинантной ДНК-конструкции и к способу получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины.
ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Сибирская язва, зоонозное заболевание, вызывается грам-положительными спорулирующими микроорганизмами Bacillus anthracis. Люди становятся случайными хозяевами через пищу животного происхождения, продукты животноводства и заражаются через окружающую среду, содержащую микроорганизмы Bacillus anthracis (Brachman P.S., 1970, Annals. N.Y. Acad. Sci. 174, 577-582). Сибирская язва представляет собой одно из наиболее древних известных бактериальных заболеваний и встречается в большинстве районов мира, включая Индию. Основные вирулентные факторы B. anthracis включают капсулы поли-D-глутаминовой кислоты и трехкомпонентный токсиновый комплекс сибирской язвы. Сибиреязвенный токсин (Leppla S.H., 1991, In Source Book of Bacterial protein toxins, pp.277-302), включающий защищающий антиген РА(83 кДа), летальный фактор (LF-(90 кДа) и фактор отечности (EF-(89кДа), является основным вирулентным фактором B. anthracis. Каталитические составляющие этого комплекса, LF/EF, нуждаются в РА для проникновения в цитозоль клетки. РА в сочетании с LF (названный летальным токсином) является причиной смерти у экспериментальных животных (Smith H. and Keppie J., 1954, Nature, 173, 869-870). РА в сочетании с EF (названный отечным токсином) у экспериментальных животных вызывает отек на коже (Stanley J.L. and Smith H., 1961, J. Gen. Microbiol., 26, 49-66). РА представляет собой рецептор-связывающую составляющую, которая обеспечивает перемещение каталитических составляющих, LF и EF, в клетки-мишени. После перемещения в клетку LF, которая является металлопротеиназой, расщепляет некоторые митоген-активируемые протеинкиназные киназы (MAPKK), приводя к инактивации путей передачи сигнала (Duesbery N.S., и соавт., 1998, Science, 280, 734-737). С другой стороны, EF, при проникновении в клетки, активируется кальмодулином, что вызывает увеличение внутриклеточного уровня цАМФ (Leppla S.H., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3162-3166).
На первой стадии процесса интоксикации происходит связывание РА с поверхностными рецепторами клетки (Bradley K.A., и соавт., 2001, Nature, 414, 225-229). После связывания с рецепторами на клеточной поверхности РА расщепляется протеазами клеточной поверхности с образованием фрагмента размером 63-кДа (Klimpel R.K., и соавт., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10277-10281), который олигомеризуется и связывается с LF/EF (Milne J.C., и соавт., 1994, J. Biol. Chem., 269, 20607-20612). Связывание LF/EF является конкурентным. Затем весь комплекс подвергается рецептор-опосредованному эндоцитозу. Подкисление эндосомы (Friedlander A.M., 1986, J. Biol. Chem., 261, 7123-7126) приводит к встраиванию РА-олигомера в мембрану эндосомы с образованием пор (Milne J.C. and Collier R.J., 1993, Mol. Microbiol., 10, 647-653), через которые LF/EF перемещается в цитозоль клетки.
РА имеет четыре домена, которые изначально образуют антипараллельные бета-тяжи с несколькими короткими спиралями, состоящими менее чем из четырех витков (Petosa C., и соавт., 1997, Nature, 385, 833-838). Домен 1 отвечает за связывание с LF/EF во время интоксикации сибирской язвой. Домен 2 преимущественно представляет собой beta barrel (бета-бочка) и предназначен для встраивания в мембрану и перемещение. Домен 3 является самым маленьким доменом и важен для олигомеризации РА и, по-видимому, также для связывания РА с LF/EF. Домен 4 представляет собой рецептор-связывающий домен.
Установленная недавно кристаллическая структура LF свидетельствует, что LF имеет 4 домена (Pannifer A.D., и соавт., 2001, Nature, 414, 229-233). Домен 1 участвует в связывании с РА. Этот домен обладает существенной гомологией с N-концевыми 1-250 остатками EF. Фактически большинство остатков в этой области совершенно консервативны.
Из всех трех белков-токсинов РА является наиболее иммуногенным и представляет собой существенный компонент вакцины против сибирской язвы (Gladstone G.P., 1946, Br. J. Exp. Pathol., 27, 349-418). Отмечено, что защитная эффективность РА сильно увеличивается, если в эту вакцину включить небольшие количества LF или EF (Pezard и соавт., 1995, Infect. Immun., 63, 1369-1372). Вместе с тем это также является главной причиной токсикогенности и реактогенности таких вакцин. Токсин сибирской язвы (Leppla S.H., 1991, In Source Book of Bacterial protein toxins, pp.277-302), включающий защищающий антиген (РА), летальный фактор (LF) и фактор отечности (EF), является у B. anthracis основным вирулентным фактором.
Используемую в настоящее время противосибиреязвенную вакцину производят из некапсулированного авирулентного штамма микроорганизма, известного как штамм Штерна (Sterne M., 1939, J. Vet. Sci. Anim. Ind, 13, 307-312). В России и в Китае используют живую споровую вакцину, основанную на штамме Штерна. В Великобритании эта вакцина представляет собой фильтрат культуры штамма Штерна, осажденный квасцами, а в США вакцина состоит из адсорбированного на алгидрогеле фильтрата бесклеточной культуры некапсулированного, полученного без протеолиза, штамма V770, выделенного из пораженного сибирской язвой крупного рогатого скота (Turnbull P.C.B., 1991, Vaccine, 9, 533-539). Все эти используемые в настоящее время вакцины против сибирской язвы, не говоря уже о неочищенных вакцинах, обладают неопределенным составом. Они реактогенны и не обеспечивают защиты от всех природных штаммов B. anthracis.
В патенте США №2017606 описано получение сибиреязвенного антигена путем выращивания микроорганизмов в соответствующей культуральной среде и отделения выращенных микроорганизмов от этой культуральной среды.
В патенте США №2151364 описан способ получения противосибиреязвенной вакцины, который включает получение суспензии спор сибирской язвы и ее добавление к суспензионному стерильному раствору, содержащему квасцы.
В патенте России №2115433 описан способ получения противосибиреязвенной вакцины, которая включает живые споры некапсулированного штамма B. anthracis и защищающего антигена из B. anthracis.
В патенте WO №0002522 описан способ получения противосибиреязвенной вакцины с использованием нетоксичного защищающего антигена из B. anthracis, применяемого для индукции иммунного ответа, который защищает от сибирской язвы.
Недостатком всех вышеуказанных патентов является то, что все они используют культуры/споры Bacillus anthracis. Bacillus anthracis является инфекционным микроорганизмом и с ним нельзя работать, не соблюдая мер предосторожности. Получаемая вакцина содержит примеси других токсичных и нетоксичных белков Bacillus anthracis, что приводит к ряду побочных эффектов и к реактогенности.
Эти вакцины обладают также некоторой остаточной вирулентностью в отношении некоторых видов домашних и лабораторных животных. Штамм Штерна токсигенен и в высоких дозах является патогенным. Поэтому он считается небезопасным и не подходящим для использования человеком. Такая вакцина может вызывать нежелательные побочные эффекты, в том числе некроз на участке вакцинации.
По этой причине существует необходимость в создании противосибиреязвенной вакцины второго поколения, которая не вызывает побочных эффектов и обладает четко определенным составом.
Цель настоящего изобретения заключается в придании сибиреязвенному токсину нетоксичности без воздействия на его иммуногенность, для того чтобы создать безопасную и эффективную противосибиреязвенную вакцину.
Для достижения указанной цели в настоящем изобретении создана конструкция рекомбинантной ДНК, включающая экспрессионный вектор и фрагмент ДНК, включающий гены защищающего антигена (РА) дикого типа, летального фактора (LF) дикого типа, и фактора отечности (EF) дикого типа.
В настоящем изобретении создана также конструкция рекомбинантной ДНК, включающая:
экспрессионный вектор и фрагмент ДНК, включающий гены мутантного защищающего антигена (РА), мутантного летального фактора (LF) или мутантного отечного фактора (EF).
Указанный вектор представляет собой прокариотический вектор такой, например, как вектор PQE 30, причем указанный экспрессионный вектор содержит промотор Т5 и 6Х гистидиновую метку.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена c замещением аланином по остатку Phe202.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Leu203.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Pro205.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Ile207.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остаткам Pro205, Trp226 и Phe236.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe552.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe552 и Phe554.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Ile562 и Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Leu566 и Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe552 и Phe554, Ile562, Leu566 и Ile574.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Phe427.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с делецией по остатку Asp 425.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с делецией по остатку Phe 427.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Trp346.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Leu352.
Фрагмент ДНК представляет собой ген защищающего антигена с замещением аланином по остатку Trp346, Met350 и Leu352.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Tyr148.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Tyr149.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Ile151.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Lys153.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Asp187.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Phe190.
Фрагмент ДНК представляет собой ген летального фактора с замещением аланином по остатку Asp187, Leu188, Leu189 и Phe190.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Tyr137.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Tyr138.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Ile140.
Фрагмент ДНК представляет собой ген фактора отечности с замещением аланином по остатку Lys142.
Белок, кодируемый указанным фрагментом ДНК, экспрессируется в прокариотическом хозяине. Указанный прокариотический хозяин представляет собой штамм E. coli.
Белок, экспрессируемый генным ДНК-фрагментом, представляет собой РА дикого типа, LF дикого типа, EF дикого типа и их мутантные варианты.
Кроме того, в настоящем изобретении описан способ получения мутантного белка-токсина сибирской язвы, включающий:
- получение мутированных генов РА, LF и EF с использованием различных полученных с помощью мутагенных праймеров, таких, которые указаны здесь для ПЦР-реакции;
- обработку указанного мутантного ПЦР-продукта вместе с нативной матрицей с помощью фермента для расщепления этой нативной матрицы указанного ПЦР-продукта;
- трансформацию указанного мутантного продукта в штамме E. coli;
- выделение рекомбинантной конструкции из трансформируемого штамма E. coli и подтверждение требуемой мутации;
- трансформацию подтвержденной мутантной конструкции в соответствующем экспрессионном штамме E. coli для экспрессии мутантного белка и
- выделение очисткой указанного экспрессированного мутантного белка.
Эту очистку осуществляют с использованием Ni-NTA-хроматографии и/или других методов хроматографии.
Указанные гены клонируют в экспрессионном векторе PQE, содержащем промотор Т5 и 6Х гистидиновую метку.
Мутации затрагивают первый домен РА по остаткам 202, 203, 205. Мутации затрагивают третий домен РА по остаткам 552, 574, 552+554, 562+574, 566+574, 552+554+562+566+574, приводя к мутантным белкам, которые дефектны по олигомеризации. Мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 425 и 427 в петле 4 домена 2. Эти мутации нарушают способность РА к перемещению. Эти мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 346, 352 и 346+350+352 в петле 3 домена 2 так, что РА становится биологически неактивным. Эти мутации затрагивают 1-й домен LF по остаткам 148, 149, 151, 153, 187, 190 и 187+188+189+190, нарушая связывание LF с РА. Эти мутации затрагивают первые 250 остатков EF.
Противосибиреязвенная вакцина включает белок-токсин сибирской язвы, выбранный из РА дикого типа, или LF дикого типа, или EF дикого типа.
Противосибиреязвенная вакцина включает белок-токсин сибирской язвы, выбранный из мутантного РА или мутантного LF, или мутантного EF, или их сочетания.
Противосибиреязвенная вакцина включает белок-токсин сибирской язвы, выбранный из сочетания любого выбранного из РА дикого типа, LF дикого типа, или EF дикого типа с любым одним или несколькими факторами, выбранными из мутантного РА, мутантного LF, или мутантного EF.
Фармацевтическая композиция включает эффективное количество белка-токсина сибирской язвы, как заявлено в настоящем изобретении.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Идеальная вакцина против сибирской язвы должна содержать одновременно РА, LF, EF, но, вместе с тем, она должна быть нетоксичной и безопасной. Выделенные очисткой рекомбинантные белки определенного состава могут использоваться в вакцине для минимизации реактогенности вакцины. Кроме того, эти белки-токсины сибирской язвы могут оказаться нетоксичными при введении мутаций, которые влияют на биологическую активность указанных белков без воздействия на их структуру или иммуногенность. Эти нетоксичные мутантные белки-токсины сибирской язвы можно использовать совместно для создания безопасной, нереактогенной и эффективной рекомбинантной вакцины против сибирской язвы. Таким образом, первая цель настоящего изобретения заключается в создании способа получения безопасной и эффективной вакцины второго поколения против сибирской язвы, включающей нетоксичные белки-токсины сибирской язвы, которые получают с помощью сайт-направленного мутагенеза в разных функционально существенных доменах этих белков-токсинов.
Авторы настоящего изобретения подвергали ПЦР-амплификации гены РА, LF, EF. Они клонировали эти гены в экспрессионном векторе pQE30 (Gupta P., и соавт., 1998, Infect. Immun., 66, 862-865; Gupta P., и соавт., 1999, Protein Expr. Purif. 16, 369-376; Kumar P., и соавт., 2001, Infect. Immun., 69, 6532-6536). Этот вектор содержит промотор Т5 и 6х-гистидиновую метку, что позволяет легко очистить указанные рекомбинантные белки (Фиг.1).
Условия сверхэкспрессирования указанных генов с использованием вышеуказанных рекомбинантных плазмид из штаммов E. coli, были оптимизированы авторами настоящего изобретения (Chauhan V., и соавт., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283, 308-315).
Используя вышеуказанную рекомбинантную плазмиду, авторы настоящего способа вводили мутации в указанные гены для создания экспрессируемых рекомбинантных белков, дефектных по их биологической функции, делая их тем самым нетоксичными. Настоящее изобретение включает экспрессию и выделение очисткой указанных мутантных белков из штаммов E. coli. Кроме того, оно включает полную характеристику выделенных очисткой мутантных белков с точечным дефектом, который придает им нетоксичность.
МУТАЦИИ, ВВОДИМЫЕ В ЗАЩИЩАЮЩИЙ АНТИГЕН КАК ЧАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Мутации, которые делают РА дефектным для связывания с LF/EF. Авторы настоящего изобретения вводили ряд мутаций в 1-й домен РА. Среди введенных мутаций мутации по остаткам 202, 203, 205, 207 и 205+226+236 оказались дефектными для связывания с LF.
2. Мутации, которые делают РА дефектным для олигомеризации. Авторы настоящего изобретения вводили мутации в 3-й домен РА. Мутации по остаткам 552, 574, 552+554, 562+574, 566+574, 552+554+562+566+574 дают мутантные белки, которые оказались дефектными в олигомеризации.
3. Мутации, которые делают РА дефектным для перемещения. Авторы настоящего изобретения вводили мутации по остаткам 425 и 427 в петле 4 домена 2. Эти мутации нарушают способность РА к перемещению.
4. Мутации, которые делают РА дефектным для встраивания/транслокации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при введении мутаций по остаткам 346, 352 и 346+350+352 в петле 3 домена 2 РА становится биологически неактивным. Эти мутантные белки способны связываться с рецепторами клеточной поверхности, становясь протеолитически активными с образованием олигомеров и связываясь с LF. Биологическая инактивация этих мутантных белков может быть обусловлена дефектом по встраиванию/транслокации.
МУТАЦИИ, ВВОДИМЫЕ В ЛЕТАЛЬНЫЙ ФАКТОР, КАК ЧАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Мутации, которые делают LF дефектным для связывания с РА. Авторы способа вводили мутации в 1-й домен LF. Они обнаружили, что мутация по остаткам 148, 149, 151, 153, 187, 190 и 187+188+189+190 нарушает связывание LF с РА.
МУТАЦИИ, ВВОДИМЫЕ В ФАКТОР ОТЕЧНОСТИ, КАК ЧАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Мутации, которые делают EF дефектным для связывания с РА. Авторы способа вводили ряд мутаций в первые 250 остатков EF. Установлено, что мутация по остаткам 137, 138, 140 и 142 радикально нарушает связывание EF с РА.
После экспрессии и выделения очисткой мутантные белки оценивают по их биологической активности.
Авторы настоящего изобретения установили, что вышеуказанные мутанты РА при совместном добавлении с LF дикого типа оказываются нетоксичными для J774А.1-клеток. Также и мутанты LF, при совместном добавлении с РА дикого типа, оказываются нетоксичными для J774А.1-клеток. Аналогично при совместном добавлении с РА дикого типа мутанты EF неспособны производить цАМФ-токсичность в клетках СНО (Таблица 2).
Выделенный очисткой мутантный белок анализируют на предмет его биологической активности путем тестирования:
- Способности РА связываться с рецепторами клеточной поверхности,
- Способности РА связываться с LF или с EF,
- Способности РА к олигомеризации,
- Способности РА-олигомера встраиваться в мембрану,
- Способности РА перемещать LF или EF в цитозоль,
- Способности летального токсина уничтожать клеточные линии макрофагов, таких как RAW264.7 и J774A.1,
- Способности токсина отечности удлинять СНО-клетки.
ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ИММУНИЗАЦИИ
Защищающий антиген в соответствии со своим наименованием представляет собой высокоиммуногенный белок. Фактически он является необходимым компонентом вакцины против сибирской язвы. Иммунизация с помощью рекомбинантного РА дикого типа дает высокие титры антител к РА и обеспечивает защиту против летального заражения морских свинок сибирской язвой. Отмечено также, что мутантный РА оказывается столь же иммуногенным, как и РА дикого типа, и мог бы без труда заменить в вакцине РА дикого типа (Singh и соавт., 1998, Infect. Immun. 66, 3447-3448). Исследования по иммунизации свидетельствуют также о существенном вкладе LF/EF в иммунную защиту. На основании этих результатов авторы настоящего изобретения создали рекомбинантную вакцину против сибирской язвы, которая включает мутанты всех трех сибиреязвенных токсинов.
Рекомбинантная вакцина на основе сибиреязвенного токсина, созданная авторами настоящего изобретения, обладает следующими преимуществами:
1. Описанный здесь способ не предполагает использования культур B. anthracis (на любой стадии). Поэтому данный способ безопасен, рентабелен и не нуждается в использовании сложной аппаратуры.
2. Созданная авторами настоящего изобретения вакцина имеет четко определенный состав и поэтому не обладает какой-либо изменчивостью от партии к партии.
3. В описанном здесь изобретении используется выделенный очисткой сибиреязвенный белок-токсин. Вследствие этого сибиреязвенная вакцина второго поколения не является реактогенной и не может вызвать какой-либо побочный эффект в отличие от прежней вакцины.
4. Кроме того, настоящее изобретение включает нетоксичные мутантные белки, которые при введении (в отдельности или в сочетании) не вызывают какой-либо токсикогенности или патогенности, которые обусловлены использованием существующей вакцины.
5. Поэтому описанное здесь изобретение является безопасным и пригодным для использования на животном/человеке.
ПОДРОБНОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ
Сайт-направленный мутагенез белков-токсинов сибирской язвы
Для введения требуемых мутаций в белки-токсины сибирской язвы используют комплементарные мутагенные праймеры (ссылка на Таблицу 1) для амплификации генов дикого типа токсинов сибирской язвы (РА или LF, или EF). В ПЦР-реакции используют высокоточную ДНК-полимеразу Pfu. В течение нескольких циклов на амплификаторе амплифицируют обе полноразмерные цепи плазмидной ДНК, получая мутантную плазмиду со ступенчатыми разрывами на противоположных цепях (Фиг.2). Результаты амплификации контролируют с помощью агарозного гель электрофореза полученных ПЦР-продуктов. Продукт амплификации обрабатывают с помощью DpnI, которая специфически расщепляет полностью метилированные Gme6 АТС-последовательности. Эту реакцию расщепления осуществляют в 20 мкл реакционном объеме со 100 нг амплифицированного продукта, 2 мкл 10Х DnpI-реакционного буфера и 0,1 Ед. DpnI. После DpnI-обработки DpnI-резистентные молекулы, которые богаты требуемыми мутантами, собирают путем трансформации ДНК в соответствующий штамм E. coli. Мутации подтверждают секвенированием вышеуказанных конструкций с использованием набора для циклического секвенирования ДНК (Perkin Elmer).
Экспрессия и выделение очисткой мутантных белков-токсинов сибирской язвы
Подтвержденные конструкции трансформируют в экспрессионные штаммы E. coli, экспрессирующие Т5-РНК-полимеразу. Трансформированные клетки выращивают на среде Луриа (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, при 37°С, до ОП600 0,8. Затем осуществляют индукцию с помощью 0,5 мМ IPTG и продолжают инкубацию при 37°С в течение 3-4 часов. Клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут. Затем центрифугированные клетки лизируют. Белковый профиль анализируют с помощью SDS-электрофореза в ПААГ и вестерн-блоттинга. Мутантные РА белки выделяют очисткой с использованием металл-хелатной Ni-NTA-хроматографии по сродству и других хроматографических методов (Kumar P., и соавт., 2001, Infect. Immun., 69, 6532-6536; Gupta P., и соавт., 1998, Infect. Immun., 66, 862-865; Gupta P., и соавт., 1999, Protein Expr. Purif. 16, 369-376). Выделенные очисткой мутантные белки анализируют с помощью SDS-электрофореза в ПААГ и вестерн-блоттинга и оценивают с использованием метода Бредфорда. Для хранения выделенные очисткой белки диализуют против 50 мМ HEPES и хранят в виде аликвотов при -70°С.
Культура клеток
Макрофагоподобную клеточную линию J774A.1 поддерживают в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной нагреванием FCS, 25 мМ HEPES, 100 Ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина во влажной среде с 5% СО2 при 37°С.
СНО-клетки поддерживают в среде EMEM, содержащей 10% инактивированной нагреванием FCS, 25 мМ HEPES, 100 Ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина во влажной среде с 5% СО2 при 37°С.
Для изучения биологической активности РА дикого типа или его мутантных белков различные концентрации этих белков добавляют вместе с LF (1мкг/мл) к клеткам J774A.1, помещенным в 96-луночные планшеты. Инкубируют в течение 3-х часов при 37°С, после чего определяют жизнеспособные клетки (Bhatnagar и соавт., 1989, Infect. Immun., 57, 2107-2114) с использованием красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтеразолийбромида (MTT) (Bhatnagar R., и соавт., 1999, Cell Signal., 11, 111-116). MTT, растворенный в RPMI, приливают в каждую лунку до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубируют в течение последующих 45 мин при 37°С для поглощения и окисления красителя жизнеспособными клетками. Эту среду меняют на 0,5% (масс./об.) натрийдодецилсульфат (SDS), 25 мМ HCl в 90% изопропиловом спирте и планшет встряхивают на приборе для встряхивания и перемешивания. Считывают поглощение при 540 нм с использованием спектрофотометра для микроплашек (BIORAD).
Подобным образом для исследования биологической активности LF дикого типа или его мутантных белков различные концентрации этих белков добавляют вместе с РА (1 мкг/мл) к клеткам J774A.1, помещенным в 96-луночные планшеты. Инкубируют в течение 3-х часов при 37°С, после чего определяют жизнеспособные клетки с использованием красителя MTT, как подробно описано выше.
Для исследования биологической активности EF дикого типа или его мутантных белков различные концентрации этих белков добавляют вместе с РА (1 мкг/мл) к СНО-клеткам, помещенным в 96-луночные планшеты. Инкубируют в течение 3-х часов при 37°С, после чего при помощи микроскопа определяют удлинение клетки. Определяют нарастание уровня цАМФ в клетках при обработке токсином (Kumar P., и соавт., 2001, Infect. Immun., 69, 6532-6536) с помощью cAMP-EIA-набора от Amersham Pharmacia.
В последующих экспериментах выясняют, каким образом мутации влияют на биологическую активность мутантных белков-токсинов сибирской язвы.
Связывание РА с рецепторами клеточной поверхности
Клетки J774A.1 выращивают в 24-луночных планшетах до слияния перед инкубацией с 1 мкг/мл РА дикого типа или его мутантным белком при 4°С в течение 2-х часов. Затем выращенные клетки промывают охлажденной средой RPMI, растворяют в SDS-лизирующем буфере и подвергают SDS-электроблоттированию в ПААГ. Полученный блот проявляют с помощью антител к РА для анализа связывания РА дикого типа или его мутантного белка с рецепторами клеточной поверхности.
Протеолитическое расщепление РА и мутантных белков в растворе
РА дикого типа и его мутантные белки тестируют на чувствительность к расщеплению трипсином. Белки (1,0 мг/мл) инкубируют с 1 мкг/мл трипсином в течение 30 минут при комнатной температуре в 25 мМ HERES, 1 мМ CaCl2, 0,5 мМ ЭДТА рН 7,5. Реакцию расщепления останавливают добавлением PMSF в концентрации 1 мМ. Для SDS-электрофореза в ПААГ полученные образцы кипятят в течение 5 минут в SDS-буфере для образцов и разделяют SDS-электрофорезом в 12%-м ПААГ.
Связывание РА с LF на поверхности клеток
Клетки J774A.1 дважды промывают RPMI и затем инкубируют с 1 мкг/мл РА дикого типа или его мутантного белка при 4°С в течение 3-х часов. После чего эти клетки промывают холодным RPMI для удаления несвязавшегося белка. Далее промытые клетки инкубируют с LF (1,0 мкг/мл) в течение 3-х часов и затем промывают холодным RPMI для удаления несвязавшегося LF. Эти клетки растворяют в SDS-лизирующем буфере и подвергают SDS-электрофорезу в ПААГ для электроблоттирования. Полученный блот проявляют с помощью антител к LF для анализа связывания РА дикого типа или его мутантного белка с LF.
Олигомеризация РА в растворе
При протеолитическом расщеплении РА олигомеризуется с образованием гептамеров. Для изучения способности РА дикого типа и его мутантных белков образовывать олигомеры указанные белки (1 мг/мл) расщепляют с помощью трипсина в течение 30 минут при 25°С. Расщепленные образцы переносят в рН 5,0 после добавления 1 М Трис рН 5,0 до конечной концентрации 100 мМ и кипятят в течение 5 минут в SDS-буфере для образцов (0,0625 М Трис-Cl, 1,25% SDS, 2,5% β-меркаптоэтанола и 5% глицерина, рН 6,8) перед загрузкой в 3-12%-й градиентный гель. Осуществляют окрашивание серебром для детекции образования олигомеров.
Связывание LF/EF с РА, связанным с клеточной поверхностью
Клетки J774A.1 промывают холодным RPMI после чего инкубируют с 1 мкг/мл РА дикого типа при 4°С в течение 3-х часов. Эти клетки вновь промывают холодным RPMI для удаления несвязавшегося белка. Затем добавляют LF/EF дикого типа или их мутантные белки (1,0 мкг/мл) и продолжают инкубацию в течение 3-х часов. Затем инкубированные клетки промывают холодным RPMI для удаления несвязавшихся LF/EF. Позже эти клетки растворяют в SDS-лизирующем буфере и подвергают SDS-электрофорезу в ПААГ для электроблоттирования. Полученный блот проявляют с помощью антител к LF/EF для исследования связывания LF/EF с РА, связавшегося с клеточной поверхностью.
ТАБЛИЦА 1
| ОСТАТОК | ЗАМЕНА | ПРАЙМЕРЫ | ДОМЕН | ДЕФЕКТ |
| РА-мутанты: | ||||
| Phe202 | На аланин | 5'CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGCTGAAAG | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Leu203 | На аланин | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAGCAAAAGT | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Pro205 | На аланин | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAAGAGCAGTTCT | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Ile207 | На аланин | TTTGGTTAACCCTTTCTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGT GAAAGAAAAGTTCTTTTATTTTTGACATCAACCGTATATCCTT CTACCTCTAATGAATCAGCGATTCC | I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Pro205 +Trp226 +Phe236 |
На аланин | CTTTTCATGAATATTAGAAATCCATGGTGAAAGAGCAGTTCT и GGATTTCTAATATTCATGAAAAGAAAGGATTAACCAAATATA AATCATCTCCTGAAAAAGCGAGCACGGCTTCTGATCCGTACA GTGATGCCGAAAAGGTT |
I | Дефектное связывание с летальным фактором |
| Phe552 | На аланин | CAAGGGAAAGATATCACCGAATTTGATGCTAATTTCGATC | III | Дефектная олигомеризация |
| Ile574 | На аланин | GAATTAAACGCGTCTAACGCATATACTG | III | Дефектная олигомеризация |
| Phe552 +Phe554 |
На аланин | ATTTTGAGATGTTTGTTGATCGGCATTAGCATCAAATTC | III | Дефектная олигомеризация |
| Ile562 +Ile574 | На аланин | CAGTATATGCGTTAGACGCGTTTAATTCCGCTTAACTGATTCT TGGCATTTTGAGATG | III | Дефектная олигомеризация |
| Leu566+Ile574 | На аланин | ATCAGGCAGCGGAATTAAACGCGTCTAACGCATATACTG | III | Дефектная олигомеризация |
| Phe552 +Phe554 + Ile562+Leu566+ Ile574 | На аланин | CAGTATATGCGTTAGACGCGTTTAATTCCGCTGCCTGATTCTT GGCATTTTGAGATG и ATTTTGAGATGTTTGTTGATCGGCATTAGCATCAAATT | III | Дефектная олигомеризация |
| Phe427 | На аланин | GTAATTGGAGTAGAACTGGCATCGTCTTGTGC | II | Дефектная транслокация |
| Asp425 | Остаток делетирован | GTAATTGGAGTAGAACTGAAATCTTGTTCATTTAATGCG | II | Дефектная транслокация |
| Phe427 | Остаток делетирован | GCACAAGACGATAGTTCTACTCCAATTAC | II | Дефектная транслокация |
| Trp346 | На аланин | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAA С TGCGGCTGAAACAATG |
II | Мембранная вставка/ транслокация дефектна |
| Leu 352 | На аланин | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAA CTTGGGCTGAAACAATGGGTGCAAATACCGCTGAT | II | Мембранная вставка/ транслокация дефектна |
| Trp 346, Met 350 и Leu 352 | На аланин | CGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAA CTGCGGCTGAAACAGCGGGTGCAAATACCGCTGAT | II | Мембранная вставка/ транслокация дефектна |
| LF-мутанты: | ||||
| Туr148 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTGCTTAT | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Туr149 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGCTGAA | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Ile151 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGAAGCAGGT | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Lys153 | На аланин | GTAGAAGGTACCGAAAAGGCACTGAACGTTTATGAAATAGGT GCAATA | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Asp 187 | На аланин | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAAATAAAAGAGCTTGT | I | Дефектное |
| TCATCTGA | связывание с защищающим антигеном | |||
| Phel90 | На аланин | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAGCTAAAAGATCTTG | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| Asp187, Leu188, Leu189, Phe190 | На аланин | TGTGGGATGTTCCTTAAGCTGATTAGTAGCTGCAGCAGCTTGT TCATCTGA | I | Дефектное связывание с защищающим антигеном |
| EF-мутанты: | ||||
| Туr137 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC ТТТ СС ААТ ТТС AGC АТА ТАС ТТС ТТТ ACT TTG ТТС АС | Дефектное связывание с защищающим антигеном | |
| Туr138 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC ТТТ СС ААТ ТТС АТА A GCT АС ТТС ТТТ ACT TTG ТТС АС | Дефектное связывание с защищающим антигеном | |
| Ile140 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC ТТТ CCAGCTTC АТА AT AT AC ТТС ТТТ ACT TTG ТТС AC |
Дефектное связывание с защищающим антигеном | |
| Lysl42 | На аланин | CCTTACTTATGATATCAAGAGAAATCCCC GCT СС ААТ ТТС АТА АТАТАС ТТС ТТТ ACT TTG ТТС АС | Дефектное связывание с защищающим антигеном | |
ТАБЛИЦА 2: ХАРАКТЕРИСТИКИ МУТАНТОВ
| МУТАЦИЯ В PA | СВЯЗЫВАНИЕ С РЕЦЕПТОРОМ | РАСЩЕПЛЕНИЕ ТРИПСИНОМ | ОБРАЗОВАНИЕ ОЛИГОМЕРА | СВЯЗЫВАНИЕ LF/EF | ТОКСИЧНОСТЬ |
| Phe202Ala | + | + | + | - | - |
| Leu203Ala | + | + | + | - | - |
| Pro205Ala | + | + | + | - | - |
| Ile207Ala | + | + | + | - | - |
| Pro205Ala + Trp226Ala + Phe236Ala |
+ | + | + | - | - |
| Phe552Ala | + | + | - | - | - |
| Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe552Ala + Phe554Ala | + | + | - | - | - |
| Ilе562А1а + Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Leu566Ala + Ile574Ala | + | + | - | - | - |
| Phe552Ala + Phe554Ala+ Ilе562А1а + Leu566Ala + Ile574Ala |
+ | + | - | - | - |
| Phe427Ala | + | + | + | + | - |
| Asp425del | - | + | + | + | - |
| Phe427del | + | + | + | + | - |
| Trp346Ala | + | + | + | + | - |
| Leu352Ala | + | + | + | - | |
| Trp346Ala+ Met350Ala+ Leu352Ala |
+ | + | + | + | - |
| МУТАЦИЯ B LF | СВЯЗЫВАНИЕ С PA | ТОКСИЧНОСТЬ | |||
| Tyr148Ala | - | - | |||
| Tyr149Ala | - | - | |||
| Ile151Ala | - | - | |||
| Lys153Ala | - | - | |||
| Asp187Ala | - | - | |||
| Phe190Ala | - | - | |||
| Asp187Ala+Leu188Ala+ Phe190Leu189Ala | - | - | |||
| МУТАЦИЯ В EF | СВЯЗЫВАНИЕ С PA | ТОКСИЧНОСТЬ | |||
| Tyr137Ala | - | - | |||
| Tyr138Ala | - | - | |||
| Ile140Ala | - | - | |||
| Lys142Ala | - | - | |||
Claims (13)
1. Рекомбинантная ДНК-конструкция для экспрессии белка-токсина Bacillus anthracis, включающая:
a) экспрессирующий вектор,
b) ДНК-фрагмент, включающий гены, кодирующие мутантный защищающий антиген (РА) или мутантный летальный фактор (LF), или мутантный фактор отечности (EF), где
i) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe202 заменен на аланин,
ii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Leu203 заменен на аланин,
iii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Рго205 заменен на аланин,
iv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Ile207 заменен на аланин,
v) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Рrо205, Тrр226 и Phe236 заменены на аланин,
vi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe552 заменен на аланин,
vii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Ile574 заменен на аланин,
viii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe552 и Phe554 заменены на аланин,
ix) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Ile562 и Ile574 заменены на аланин,
х) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Leu566 и Ile574 заменены на аланин,
xi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe552 и Phe554, Ile562, Leu566 и Ile574 заменены на аланин,
xii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Phe427 заменен на аланин,
xiii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, с делецией по остатку Asp 425 в аминокислотной последовательности,
xiv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, с делецией по остатку Phe 427 в аминокислотной последовательности,
xv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Тrр346 заменен на аланин,
xvi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Leu352 заменен на аланин,
xvii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий РА, в аминокислотной последовательности которого Trp346, Met350 и Leu352 заменены на аланин,
xviii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Tyr148 заменен на аланин,
xix) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Tyr 149 заменен на аланин,
хх) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Ile 151 заменен на аланин,
xxi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Lys 153 заменен на аланин,
xxii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Asp 187 заменен на аланин,
xxiii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Phe 190 заменен на аланин,
xxiv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий LF, в аминокислотной последовательности которого Asp 187, Leu 188, Leu 189 и Phe 190 заменены на аланин,
xxv) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Tyr 137 заменен на аланин,
xxvi) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Tyr 138 заменен на аланин,
xxvii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Ile 140 заменен на аланин,
xxviii) указанный фрагмент ДНК представляет собой ген, кодирующий EF, в аминокислотной последовательности которого Lys 142 заменен на аланин.
2. Рекомбинантная ДНК-конструкция по п.1, в которой указанный экспрессионный вектор представляет собой прокариотический вектор.
3. Рекомбинантная ДНК-конструкция по п.2, в которой указанный прокариотический вектор представляет собой PQE 30.
4. Рекомбинантная ДНК-конструкция по п.3, в которой указанный экспрессионный вектор содержит Т5-промотор и 6Х гистидиновую метку.
5. Способ получения мутагенизированных белков PA, LF и EF токсина сибирской язвы, где указанный способ включает следующие стадии:
a) получение мутантных генов, кодирующих мутантные белки-токсины PA, LF и EF, с использованием разных комплементарных мутагенных праймеров для ПЦР,
b) обработка указанного мутантного ПЦР-продукта вместе с нативной матрицей, полученной на стадии (а), ферментом, который расщепляет эту нативную матрицу указанного ПЦР- продукта,
c) трансформация указанного мутантного продукта в прокариотическом хозяине,
d) выделение рекомбинантной ДНК-конструкции, охарактеризованной в пп.1-4, из трансформированного прокариотического хозяина и подтверждение наличия требуемой мутации,
e) трансформация подтвержденной мутантной конструкции в соответствующем прокариотическом хозяине для экспрессии мутантного белка, и
f) очистка указанного экспрессируемого мутантного белка.
6. Способ по п.5, в котором прокариотическим хозяином является штамм Е. coli.
7. Способ по п.5, в котором указанный фермент представляет собой DpnI- фермент, который специфически расщепляет полностью метилированные Gme6 АТС-последовательности.
8. Способ по п.5, в котором указанные гены клонируют в экспрессионном векторе PQE, содержащем Т5-промоторы и 6Х гистидиновую метку.
9. Способ по п.5, в котором указанную очистку осуществляют с использованием Ni-NTA хроматографии и/или других хроматографических технологий.
10. Способ по п.5, в котором
a) мутации затрагивают первый домен РА по остаткам 202, 203 и 205,
b) мутации затрагивают третий домен РА по остаткам 552, 574, 552+554,562+574,566+574 и 552+554+562+566+574,
c) мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 425 и 427 петли 4 домена 2,
d) мутации затрагивают второй домен РА по остаткам 346, 352 и 346+350+352 в петле 3 домена 2,
e) мутации затрагивают 1-й домен LF по остаткам 148, 149, 151, 153, 187,190 и 187+188+189+190,
f) мутации затрагивают 1-е 250 остатков EF.
11. Мутантный белок-токсин Bacillus anthracis, обладающий иммуногенными свойствами, экспрессируемый рекомбинантной ДНК-конструкцией по п.1 и полученный способом по п.5.
12. Противосибиреязвенная вакцина, включающая мутантный белок - токсин Bacillus anthracis, выбранный из мутантного РА, или мутантного LF, или мутантного EF, или их комбинации.
13. Противосибиреязвенная вакцина, включающая один или более мутантных белков-токсинов Bacillus anthracis, охарактеризованных в п.11, в комбинации с белком-токсином Bacillus anthracis PA, LF или EF дикого типа.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN1222/DEL/2001 | 2001-12-05 | ||
| IN1222DE2001 | 2001-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004120293A RU2004120293A (ru) | 2005-04-20 |
| RU2287581C2 true RU2287581C2 (ru) | 2006-11-20 |
Family
ID=11097141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004120293/13A RU2287581C2 (ru) | 2001-12-05 | 2002-03-20 | Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7888490B2 (ru) |
| EP (2) | EP1453534A1 (ru) |
| JP (1) | JP2005511059A (ru) |
| CN (1) | CN1694722A (ru) |
| AU (1) | AU2002242935A1 (ru) |
| BR (1) | BRPI0215039A2 (ru) |
| CA (1) | CA2469671A1 (ru) |
| IL (1) | IL162381A0 (ru) |
| MX (1) | MXPA04005538A (ru) |
| RU (1) | RU2287581C2 (ru) |
| WO (1) | WO2003048390A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200404444B (ru) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481043B2 (en) * | 2001-06-22 | 2013-07-09 | Cpex Pharmaceuticals, Inc. | Nasal immunization |
| US20060246079A1 (en) * | 2003-11-14 | 2006-11-02 | Morrow Phillip R | Neutralizing human antibodies to anthrax toxin |
| WO2005081749A2 (en) * | 2004-01-23 | 2005-09-09 | Avanir Pharmaceuticals, Inc. | Neutralizing human antibodies to anthraxtoxin |
| US8409590B2 (en) | 2004-02-11 | 2013-04-02 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Anthrax antigens and methods of use |
| CA2669290A1 (en) * | 2005-11-14 | 2008-04-24 | Leslie W. Baillie | Salmonella based oral vaccines for anthrax |
| CN100362094C (zh) * | 2006-02-14 | 2008-01-16 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一株无pX01和pX02质粒的炭疽杆菌菌株及其用途 |
| GB0607462D0 (en) * | 2006-04-13 | 2006-05-24 | Avecia Ltd | Assay |
| WO2007145760A2 (en) * | 2006-05-12 | 2007-12-21 | Oklahoma Medical Research Foundation | Anthrax compositions and methods of use and production |
| WO2008152655A1 (en) * | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Panacea Biotec Limited Limited | Anthrax fusion proteins, compositions and uses thereof |
| WO2008152654A1 (en) * | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Panacea Biotec Limited | Anthrax fusion proteins, compositions and uses thereof |
| WO2010038076A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Pharmathene Uk Limited | Anthrax vaccine formulation and uses thereof |
| CN101798565B (zh) * | 2010-02-26 | 2013-08-07 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 能在芽孢表面展示pa20蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用 |
| WO2012171329A1 (zh) * | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Du Quan | 一种核酸分离的方法及其应用 |
| CN102516394B (zh) * | 2011-12-14 | 2014-07-09 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用 |
| CN105749265B (zh) * | 2016-03-30 | 2020-03-27 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种二价炭疽疫苗 |
| CN105797148B (zh) * | 2016-03-30 | 2020-01-14 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种无毒炭疽活疫苗及无毒炭疽菌株 |
| NL2027383B1 (en) | 2020-01-24 | 2022-04-06 | Aim Immunotech Inc | Methods, compositions, and vaccines for treating a virus infection |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2017606A (en) | 1932-12-24 | 1935-10-15 | Sharp & Dohme Inc | Anthrax antigen preparation and product |
| US2151364A (en) | 1937-06-02 | 1939-03-21 | Cutter Lab | Anthrax vaccine |
| RU2115433C1 (ru) | 1992-08-28 | 1998-07-20 | Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ | Вакцина сибиреязвенная комбинированная |
| ATE418612T1 (de) | 1998-07-10 | 2009-01-15 | U S Medical Res Inst Of Infect | Anthrax-impfstoff |
| FR2798291B1 (fr) * | 1999-09-10 | 2005-01-14 | Pasteur Institut | Compositions acellulaires immunogenes et compositions acellulaires vaccinales contre bacillus anthracis |
| WO2001045639A2 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | The Ohio State University Research Foundation | Methods for protecting against lethal infection with bacillus anthracis |
| KR20030019366A (ko) | 2000-05-04 | 2003-03-06 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 세균 감염의 치료 및 예방을 위한 화합물 및 방법 |
| GB2393122B (en) * | 2001-06-08 | 2005-12-28 | Avant Immunotherapeutics Inc | Improved vaccination against anthrax |
| GB0116798D0 (en) * | 2001-07-10 | 2001-08-29 | Secr Defence | Expression system |
| GB0126266D0 (en) * | 2001-11-01 | 2002-01-02 | Microbiological Res Authority | Anthrax antigenic compositions |
-
2002
- 2002-03-20 JP JP2003549567A patent/JP2005511059A/ja active Pending
- 2002-03-20 AU AU2002242935A patent/AU2002242935A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-20 RU RU2004120293/13A patent/RU2287581C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-03-20 EP EP02708609A patent/EP1453534A1/en not_active Withdrawn
- 2002-03-20 CA CA002469671A patent/CA2469671A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-20 US US10/497,673 patent/US7888490B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-20 EP EP08006580A patent/EP1958960A3/en not_active Withdrawn
- 2002-03-20 IL IL16238102A patent/IL162381A0/xx unknown
- 2002-03-20 WO PCT/IN2002/000048 patent/WO2003048390A1/en active Application Filing
- 2002-03-20 MX MXPA04005538A patent/MXPA04005538A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-03-20 BR BRPI0215039A patent/BRPI0215039A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-03-20 CN CNA028277724A patent/CN1694722A/zh active Pending
-
2004
- 2004-06-04 ZA ZA200404444A patent/ZA200404444B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA200404444B (en) | 2006-03-29 |
| BRPI0215039A2 (pt) | 2016-06-28 |
| AU2002242935A1 (en) | 2003-06-17 |
| CA2469671A1 (en) | 2003-06-12 |
| RU2004120293A (ru) | 2005-04-20 |
| EP1958960A3 (en) | 2009-01-07 |
| MXPA04005538A (es) | 2005-06-08 |
| WO2003048390A1 (en) | 2003-06-12 |
| EP1958960A2 (en) | 2008-08-20 |
| CN1694722A (zh) | 2005-11-09 |
| JP2005511059A (ja) | 2005-04-28 |
| US7888490B2 (en) | 2011-02-15 |
| AU2002242935A8 (en) | 2003-06-17 |
| IL162381A0 (en) | 2005-11-20 |
| EP1453534A1 (en) | 2004-09-08 |
| US20050063986A1 (en) | 2005-03-24 |
| WO2003048390A8 (en) | 2004-02-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2287581C2 (ru) | Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины | |
| Williamson et al. | A genetically engineered vaccine against the alpha-toxin of Clostridium perfringens protects mice against experimental gas gangrene | |
| Cohen et al. | Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax | |
| CA2413045C (en) | Expression system | |
| Brentjens et al. | Fine tangled pili expressed by Haemophilus ducreyi are a novel class of pili | |
| AU2005254774B2 (en) | Preparation of protective antigen from bacillus anthracis | |
| Montie et al. | Flagellar preparations from Pseudomonas aeruginosa: isolation and characterization | |
| AU2014234765B2 (en) | Vaccines against Chlamydia sp. | |
| Logan et al. | Isolation and characterization of Campylobacter flagellins | |
| CN1261896A (zh) | 诊断和预防莱姆病用的组合物的表面抗原和蛋白质 | |
| US8372405B2 (en) | Proteins with improved solubility and methods for producing and using same | |
| US20100055123A1 (en) | Vaccine against burkholderia infections | |
| WO2020102717A2 (en) | Clostridium difficile multi-component vaccine | |
| US7201912B2 (en) | Recombinant immunogenic compositions and methods for protecting against lethal infections from Bacillus anthracis | |
| WO2016115328A1 (en) | Vaccine compositions for use against enterotoxigenic escherichia coli | |
| Jiang et al. | FlgN plays important roles in the adhesion of Aeromonas hydrophila to host mucus | |
| EP2391640B1 (en) | A clostridium chauvoei polypeptide, dna encoding the polypeptide and a vaccine comprising the polypeptide | |
| Rajeev et al. | Bordetella bronchiseptica fimbrial protein-enhanced immunogenicity of a Mannheimia haemolytica leukotoxin fragment | |
| JP2002522055A (ja) | バクテリア性超抗原ワクチン | |
| Mao et al. | Expression and immunogenicity analysis of two iron-regulated outer membrane proteins of Vibrio parahaemolyticus | |
| WO2007058625A1 (en) | Toxin-antitoxin system and applications thereof | |
| EP2083016B1 (en) | Bacterial superantigen vaccines | |
| JP2005515759A (ja) | ＧｒｏＥＬキメラ蛋白質およびワクチン | |
| Poff | Expression of Bacillus Anthracis Protective Antigen in Vaccine Strain Brucella Abortus Rb51 | |
| Sastry et al. | Comparative evaluation of protective antigen produced from Bacillus anthracis & Escherichia coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080321 |