CN105749265A - 一种二价炭疽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基因工程二价(rPA+rLF)炭疽疫苗。其活性成分包括炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA和致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF。本发明所提供的疫苗选用保护性抗原PA和致死因子LF显性生物失活突变体蛋白制备，其优点不仅使二者相互不能结合，丧失天然组合物产生炭疽毒素的能力和致死毒性作用，而且显性失活突变体蛋白rPA免疫原性和保护性优于野生保护性抗原PA，显性失活突变体蛋白rLF能够刺激机体增加免疫保护效果。因此，二价基因工程疫苗大大增强突变体蛋白rPA的保护功效，能够抵抗5倍以上致死毒素的致死剂量，同时生物失活的rPA和rLF还可以竞争结合受体，抑制野生毒素的活性，达到中和炭疽毒素的目的，可望对吸入性感染炭疽有良好的保护效果。

Description

一种二价炭疽疫苗
技术领域
本发明涉及免疫医学领域，具体的，涉及一种二价(rPA+rLF)炭疽疫苗。
背景技术
炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞杆菌感染引起的一种人畜共患传染病，草食动物(羊、牛、马等)最容易感染，人因接触这些病畜及其产品或食用病死畜的肉类而被感染，因感染途径不同分为皮肤炭疽、肠炭疽和肺炭疽。临床上主要表现为皮肤坏死、溃疡、焦痂和周围组织广泛水肿、毒血症和脑膜炎型的急性败血症等症状，一旦继发感染或吸入感染成肺炭疽，其死亡率高达90％以上。更重要的是，由于炭疽芽孢杆菌具有耐受性高、易生产、易保存和易施放等特点，是一种首选的细菌战菌剂。炭疽芽孢杆菌造成的大面积污染极难清除，遗留问题严重。仅仅几千克的炭疽芽孢杆菌，就能对一个国家的经济和人民生命安全造成巨大的打击，其损失是不可挽回的，甚至是永久性的危害。因此，为有效预防和控制生物武器威胁可能对国家安全带来的隐患，必须加强对炭疽芽孢杆菌的疫苗和治疗药物的研发。
在世界各地所使用的炭疽现有疫苗中除中国和俄罗斯仍然使用炭疽活芽孢疫苗外，英国和美国的炭疽保护性抗原PA组分疫苗是被批准生产的。1958年，我国杨叔雅等从炭疽病死驴尸体中分离出的A16菌株，经紫外线照射诱变，选育获得无荚膜水肿型弱毒株A16R，于1962年正式批准为生产人用炭疽A16R活芽孢苗，用于人体皮肤划痕接种。目前我国仍然由中国生物技术集团公司下属的兰州生物制品研究所独家生产炭疽A16R活芽孢人用疫苗。该疫苗接种不慎将对人体造成毒副作用，特别对弱势群体，给免疫预防接种造成极大的风险，从而使得我国目前在炭疽流行地区发生爆发疫情后，针对疫区危险人群采取的主要措施是进行预防性投药，接受免疫接种者颇为甚少。
由于炭疽杆菌的致病因子主要是荚膜和炭疽毒素，分别由两个大质粒编码。毒素的基因位于pXOl质粒(184.5kbp)上，合成荚膜相关的基因位于pXO2质粒(95.3kbp)上。强毒株需要两个质粒参与调控，缺少pXOl则不产生毒素，即为弱毒菌；缺少pXO2则不形成荚膜，其毒力比野生型菌株低105倍，也就失去了致病能力。炭疽杆菌所分泌的致死毒素和水肿毒素是导致机体发病甚至引起死亡的主要原因，而目前还没有研发成功中和这类毒素的有效办法和抗体。目前已经清楚在炭疽杆菌中能够引起机体对其产生免疫保护应答的主要成分是形成毒素的保护性抗原(PA)，另外炭疽杆菌的芽胞成分、水肿因子(EF)及致死因子(LF)均有增强免疫保护的作用。所以炭疽保护性抗原(PA)是所有抗炭疽疫苗研发首选的主要成份，如果在此基础中加入少量致死因子(LF)或水肿因子(EF)则可大大增加保护性抗原(PA)的保护功效。所以理想的炭疽疫苗应同时含有PA、LF或EF，但这种天然组合物有致死毒性作用的潜在危险。
因此深入研究炭疽疫苗的有效组合成分，从而制备出更加安全，高效的炭疽新疫苗，新疫苗要求能抵抗呼吸道感染，使用方法简单，免疫力产生快速，效果持久，以适应遭受生物战袭击进行免疫接种的需要，这将是本研究领域亟待攻破和解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于开发一种新的具有优良免疫保护效果和低毒性作用的二价炭疽基因工程蛋白疫苗。
为达到以上目的，发明人对炭疽杆菌中能够引起机体对其产生免疫保护应答的成分进行了深入研究，尝试选用炭疽保护性抗原(PA)和致死因子(LF)的显性生物失活突变体制备了一种炭疽疫苗。本发明提供了一种二价基因工程炭疽疫苗所述炭疽疫苗的活性成分包括炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA和致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF。
其中，R178A/K197A代表同时存在两个位点的突变，R178A为第178位的精氨酸突变为丙氨酸，K197A为第197位的赖氨酸突变为丙氨酸。
其中，R491A/L514A代表同时存在两个位点的突变，R491A为第491位的精氨酸突变为丙氨酸，L514A为第514位的亮氨酸突变为丙氨酸。
优选的，所述炭疽保护性抗原PA的R178A/K197A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或者，将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。SEQIDNO.1所示序列命名为rPA。
优选的，所述致死因子LF的R491A/L514A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者，将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。SEQIDNO.2所示序列命名为rLF。
特别优选的，所述炭疽保护性抗原PA的R178A/K197A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，并且，所述致死因子LF的R491A/L514A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明的发明人在大量研究过程中发现，当将野生型炭疽保护性抗原PA进行R178A/K197A突变时，可以使蛋白的构象发生变化，导致蛋白失活，不能够结合相应配体，但仍保留较高的免疫原性。当将野生型致死因子LF进行R491A/L514A突变时，可以使蛋白的构象发生变化，导致蛋白失活，不能够结合相应配体，但仍保留较高的免疫原性。
在所述炭疽疫苗中，保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA和致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF的摩尔比为0.95-1.05：1；优选的摩尔比为1：1。
优选的，为了更好的发挥疫苗引起免疫反应的作用，本发明所提供的炭疽疫苗还包括佐剂，所述佐剂的种类包括但不限于氢氧化铝佐剂。
当所述佐剂为氧化铝佐剂时，所述氢氧化铝佐剂的浓度为0.8mg/ml。
所述的疫苗在抗炭疽杆菌中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了所述无毒炭疽疫苗在制备预防和/或治疗炭疽的产品中的应用，所述产品可以为口服型饲料或药剂。
本发明还提供了所述炭疽疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)获得无质粒炭疽杆菌ΔPasteurII受体株，它是在原始PasteurII疫苗株基础上通过在实验室人工诱变获得的删除了pXO2质粒和pXO1质粒的菌株。PasteurII疫苗菌株由中国医学细菌保藏管理中心炭疽芽孢杆菌专业实验室所保藏提供，该原始疫苗株1934年由杨守绅教授从法国巴斯德研究所引进，是法国科学家巴斯德1881年通过高温传代获得并在全世界兽用炭疽疫苗生产中应用至今，是本领域技术人员所公知的，已应用于炭疽疫苗生产研究多年且能够通过合法途径获取得到的菌株。
(2)利用所述受体株分别构建分泌性表达炭疽杆菌野生保护性抗原蛋白的分泌菌株BPL，和分泌性表达炭疽杆菌野生致死因子蛋白的分泌菌株BFL；
(3)在所述分泌菌株BPL中引入保护性抗原PA的R178A/K197A双位点突变，获得表达炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA的分泌菌株BPXL；在所述分泌菌株BFL中引入致死因子LF的R491A/L514A双位点突变，获得表达致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF的分泌菌株BFXL；
(4)表达和纯化获得保护性抗原突变体R178A/K197A蛋白；表达和纯化获得致死因子突变体R491A/L514A蛋白。
可选的，所述炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或者，将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。
可选的，在所述制备方法中，所述致死因子的R491A/L514A突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者，将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。
本发明中对于实现突变的手段没有特别的限制，可以利用本领域常规的引入突变的方式进行。
可选的，在所述制备方法中，所述方法还包括将突变体rPA蛋白和突变体rLF蛋白按照摩尔比0.95-1.05：1均匀混合，优选按照摩尔比1:1均匀混合获得二价炭疽疫苗。
本发明所提供的二价炭疽疫苗可以适用于哺乳动物的免疫接种，除特别适合施用于人类预防接种以外，还可以广泛应用于牲畜的免疫接种，均具有优异的免疫原性和安全性。
本发明所提供的二价基因工程疫苗选用保护性抗原PA和致死因子LF的显性生物失活突变体制备，其优点是不仅使PA和LF相互不能结合，丧失天然组合物产生炭疽毒素的能力和致死毒性作用，而且显性失活突变体蛋白rPA免疫原性和保护性优于野生保护性抗原，显性失活突变体蛋白rLF能够刺激机体增加免疫保护效果。因此，二价基因工程炭疽疫苗大大增强了突变体蛋白rPA的保护功效，能够抵抗5倍以上致死毒素的致死剂量，同时生物失活的rPA和rLF还可以竞争结合受体，抑制野生毒素的活性，达到中和炭疽毒素的目的，有望发展为对吸入性感染炭疽有较好的免疫效果。
附图说明
图1为无质粒ΔPasteurII受体菌株(tox-，cap-)的构建。
图2为构建“分泌性”野生PA克隆BPL株和表达纯化PA蛋白。
图3为构建“分泌性”野生LF克隆BFL株和表达纯化LF蛋白。
图4为“分泌性”保护性抗原突变体BPXL株的构建。
图5为“分泌性”致死因子突变体BFXL株的构建。
图6为保护性抗原双位点突变R178A/K197A测序核实比对。
图7为致死因子双位点突变R491A/L514A测序核实比对。
图8为表达纯化突变体rPA和rLF蛋白质。
图9为保护性抗原突变体R178A/K197A蛋白生物活性测定。
图10为保护性抗原突变体R178A/K197A竞争抑制PA活性测定。
图11为致死因子突变体R491A/L514A蛋白活性测定。
图12为致死因子突变体R491A/L514A竞争抑制LF活性测定。
图13为突变体蛋白对大鼠F344毒力实验测定。
图14为第1，2，3次免疫野生PA和突变体rPA蛋白血清效价检测。
图15为第1，2，3次免疫不同剂量突变体rPA蛋白血清效价检测。
图16为第1，2，3次免疫二价疫苗(rPA+rLF)蛋白血清效价检测。
图17为不同剂量突变致死因子rLF血清效价比较。
图18为二价疫苗免疫F344大鼠后用毒素攻击保护效果观察。
图19为二价疫苗免疫F344大鼠后的血清采集进行被动保护效果观察。
图20为二价疫苗末次免疫F344大鼠三个月后血清效价检测。
图21为二价疫苗末次免疫F344大鼠六个月后血清效价检测。
图22为二价疫苗末次免疫九个月后血清效价检测结果。
图23为二价疫苗免疫BALB/C小鼠后用炭疽杆菌攻击保护效果观察。
具体实施方式
下面将通过具体实施条例对本发明进行详细说明，但实施条例的给出并不用来限制本发明的范围。
实施例1
1.获得无质粒ΔPasteurII受体株(tox-，cap-)
将炭疽杆菌PasteurII株(tox+/cap+)疫苗株在含新生霉素(1μg/μl)的培养基中37℃振荡传代培养，删除pXO2质粒。然后在含0.05％SDS培养基中42℃振荡连续传代培养，删除pXO1质粒，获得一株完全消除质粒pXO1和pXO2的炭疽杆菌，命名为ΔPasteurII株(tox-/cap-)。动物毒力测定试验结果如图1A所示，证实ΔPasteurII株丧失其致病毒力；荚膜染色如图1B所示，显示ΔPasteurII株丧失荚膜；pXO1上PagA基因和pXO2上capA基因PCR反应如图1C所示，证明ΔPasteurII株删除(pXO1-，pXO2-)质粒；Western-blotting保护性抗原抗体杂交结果如图1D所示，表明ΔPasteurII株保护性抗原PA不表达。图1C和1D中1为标准分子量，2为PasteurII株(tox+/cap+)，3为ΔPasteurII株(tox-/cap-)。
2.构建“分泌性”表达炭疽杆菌野生PA和LF蛋白的菌株
参考炭疽杆菌(AmesAncestor)菌株GenBank:AE017336.2完成的pXO1质粒测序报道，编码保护性抗原的基因pagA在143779-146073区间，编码致死因子的基因lef在149357-151786区间。设计引物，PA-NdeFattccatatggaagttaaacaggagaaccg；PA-Rtacaaacaatctcaaaggatta；LF-NdeFattccatatggcgggcggtcatggtgatgt；LF-BamHRcgcggatccttatgagttaataatgaacttaa。以炭疽杆菌A16R人用疫苗株DNA染色体为模板，采用高保真PyrobestTaq酶，PCR扩增保护性抗原pagA和致死因子lef基因，扩增条件为95℃5分钟预变性，然后95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟进行30个循环。PagA基因PCR扩增后，产物经NdeI酶切后，再进行末端削平处理，与同样酶切处理过的载体连接，lef基因PCR扩增后，PCR产物经NdeI和BamHI后，与经同样双酶切处理过的载体连接，将其克隆到表达载体pYH4上，并对pYH4启动子和携带的抗性基因进行改造，更换成保护性抗原PA自身启动子和抗卡拉抗生素基因的抗性，构建通过自身启动子表达目的蛋白的载体，然后将质粒载体转化进入大肠杆菌DH5α，PCR及双酶切鉴定挑选阳性克隆，提取阳性克隆质粒经SCS110转化后，将构建的质粒电击转化进入炭疽杆菌ΔPasteurII中，阳性菌株通过PCR反应扩增目的基因进一步测序鉴定，保证克隆蛋白基因没有发生突变，确认获得构建成功并表达野生型保护性抗原PA、野生型致死因子LF的菌株，命名为BPL和BFL。结果如图2-3所示。图2A为构建野生型保护性抗原(PA)的载体示意图。图2B中保护性抗原(PA)的表达大约占菌体的20-30％，表达量为4.5mg/ml。图2B中，1为标准蛋白分子量，2为纯化前PA蛋白，3为标准蛋白分子量，4为纯化后PA蛋白。图3A为构建野生型致死因子(LF)的载体示意图。图3B中致死因子(LF)的表达大约占菌体的20-30％，表达量为4mg/ml。图3B中，1为标准蛋白分子量，2为纯化前LF蛋白，3为标准蛋白分子量，4为纯化后LF蛋白。
3.定点突变构建表达保护性抗原和致死因子突变体蛋白的菌株：在构建“分泌性”表达野生保护性抗原(PA)和致死因子(LF)蛋白菌株的基础上，选择同样构建表达野生蛋白的载体和技术路线，为在炭疽杆菌保护性抗原(PA)和致死因子(LF)蛋白质中引入设想的突变位点，使用互补的致突变引物来扩增炭疽杆菌pagA和lef基因，所用突变引物见表1。
表1保护性抗原和致死因子突变位点所用的引物表
引物名称 序列(5'-3')
R178for: ggacctacggttccagacgcagacaatgatggaatc
R178rew: gattccatcattgtctgcgtctggaaccgtaggtcc
K197for: ggatatacggttgatgtcgcaaataaaagaacttttc
K197rew: gaaaagttcttttatttgcgacatcaaccgtatatcc
L514for: aggatatgcagaaaatggaaagcttatattaca
L514rew: cattttctgcatatcctgctcgagtatctgg
R491for: aaatgaagcacctgcattagataatgagcgt
R491rew: atgcaggtgcttcatttatatcaacaatcatatag
以炭疽杆菌A16R人用疫苗株DNA染色体为模板，使用高保真的PfuDNA聚合酶进行PCR反应。两股质粒DNA的全长在数十次的热循环过程中呈线型扩增，产生相对两股上有交错缺口的突变质粒。通过对PCR产物的琼脂凝胶电泳检验扩增产物。扩增产物经DpnI酶处理，特异性地完全剪切甲基化的Gmc6ATC序列。酶切消化反应在50微升反应容器中进行，含有100纳克扩增产物、5微升10XDpnI反应缓冲物和1U的DpnI酶。经过DpnI消化后，设想的突变物中富含的抗DpnI分子通过DNA的转化作用得到恢复，电击转化大肠杆菌宿主DH5α，挑选阳性克隆提取质粒。经测序证实突变成功后，将提取的阳性克隆质粒经SCS110活化后，电击转化ΔPasteurII菌株，确认获得构建并表达单突变保护性抗原K197A和R178A株，单突变致死因子R491A和L514A的菌株。随后分别提取突变保护性抗原R178A株和突变致死因子R491A株的质粒为模板，使用与分别对应的单突变保护性抗原K197A和单突变致死因子L514A的引物进行PCR扩增，按上述获得突变操作的技术方法进行二次突变，确认获得构建并表达双突变保护性抗原R178A/K197A株、双突变致死因子R491A/L514A的菌株。分别命名为BPXL和BFXL，如图4-7所示。PA定点突变R178A/K197A位点示意图4，LF定点突变R491A/L514A位点示意图5，PA定点突变R178A/K197A位点测序核实比对如图6所示，LF定点突变R491A/L514A位点测序核实比对如图7所示。
4.生产表达和纯化野生和突变体蛋白质
将筛选出的含有编码蛋白序列的阳性克隆株BPL，BFL，BPXL和BFXL培养在LBS培养基(3％蛋白胨，0.5％酵母侵膏粉，0.5％氯化钠，0.6％磷酸氢二钠，0.1％磷酸二氢钾)中，含有10mg/ml卡拉霉素，37℃振荡过夜培养18小时。离心收集上清液，采用Millipore超滤离心管进行浓缩上清液，然后选用阴离子交换柱进行蛋白纯化，最后利用凝胶过滤层析，进一步纯化获得纯度为99％以上的目的蛋白。利用Biorad蛋白定量试剂盒，对纯化蛋白进行精确定量，提纯的蛋白质经SDS-PAGE和western印迹分析并使用Bradford方法评估。提纯后的蛋白质经50mMHEPES的渗析，并在-80℃分成数份保存。蛋白质经SDS-PAGE电泳如图8所示。图8A为，纯化的突变体rPA蛋白质；其中，第1和第3泳道为标准蛋白分子量，第2泳道为纯化前的蛋白，第4泳道为纯化后的蛋白。图8B为纯化的突变体rLF蛋白质，其中，第1和第3泳道为标准蛋白分子量，第2泳道为纯化前的蛋白，第4泳道为纯化后的蛋白。
5.评估突变蛋白质的细胞生物学活性
5.1突变和野生蛋白诱导细胞死亡的比较
利用AQassay检测技术检测克隆表达蛋白的活性，具体方法是将被试J774A.1巨噬细胞培养在含有10％小牛血清(FBS)和1％抗生素(P/S)的RPMI-1640培养基中，在37℃和5％二氧化碳条件下培养。待细胞培养良好后接种在96孔细胞培养板上，当细胞在96微孔细胞培养板上生长达70％时，无菌条件下按不同稀释剂量加入制备好的致死毒素(10μg/mlLF+0.1μg/mlPA)，继续培养3小时，然后加CellTiter96aqueousnonradioactivecellProliferationassay(PromegaMI)检查LDH，计算分析细胞存活百分数。如图9-10所示。
5.2突变和野生蛋白竞争结合受体导致毒素诱导细胞死亡下降的比较
按照上述AQassay检测技术所述的方法，准备96微孔细胞培养板，无菌条件下加入制备好的致死毒素(1μg/mlLF+1μg/mlrLF+0.1μg/mlPA)或(1μg/mlLF+1μg/mlrPA+0.1μg/mlPA)，继续培养3小时，然后加CellTiter96aqueousnonradioactivecellProliferationassay(PromegaMI)检查LDH，计算分析细胞存活百分数。如图11-12所示。
6.动物实验毒力测定
选择适合的实验动物，计算致死毒素最小致死剂量。结果显示，wistar大鼠、Balb/c小鼠和裸鼠对炭疽毒素不敏感；当实验动物选用F344大鼠时，该鼠对炭疽毒素具有较好的敏感性。
毒力测定实验选用体重150g、雌性F344大鼠，炭疽毒素和突变蛋白质经尾静脉注射，浓度为LT60μg(致死剂量)，即PA30μg+LF30μg，F344大鼠90分钟左右全部死亡(0/6)。突变蛋白质剂量加大3倍R178A/K197A90μg+LF90μg，R491A/L514A90μg+PA90μg，F344大鼠无症状和无死亡(6/6)。如图13所示，图13中A为保护性抗原突变体R178A/K197A致死活性测定，13B为致死因子突变体R491A/L514A致死活性测定。
7.ELISA分析蛋白免疫学特性
用炭疽毒素野生蛋白PA和LF、突变PA蛋白R178A、K197A和R178A/K197A以及突变LF蛋白R491A、L514A和R491A/L514A免疫Balb/c小鼠，二周后追加免疫一次，一月后采集免疫小鼠血清，用ELISA检测各种蛋白的血清效价滴度。将炭疽保护性抗原(PA)和致死因子(LF)分别以0.5μg/ml的浓度包板，被检测血清倍比稀释，用HRP标记兔抗鼠二抗1:5000检测，通过ELISA对上述蛋白组分的免疫抗体测定。结果显示，双突变蛋白R178A/K197A和R491A/L514A产生血清抗体滴度明显高于单突变蛋白，抗体滴度分别是R178A/K197A为128000，R491A/L514A为102400，R178A为64000，K197A为64000，R491A为6400，L514A为6400。
8.用毒素攻毒动物免疫实验观察疫苗保护性效果
8.1实验动物：F344大鼠。
8.2实验安排
实验1组6只，注射50μg野生保护性抗原(PA)；
实验2组6只，注射50μg突变保护性抗原rPA；
实验3组6只，各注射50μg突变PA和突变LF(1：1)rPA+rLF；
实验4组6只，注射50μg突变PA和200μg突变LF(1：4)rPA+rLF；
实验5组6只，注射25μg突变保护性抗原rPA；
实验6组6只，各注射25μg突变PA和突变LF(1：1)rPA+rLF；
试验7组6只，对照；
疫苗佐剂：氢氧化铝。
免疫途径：下肢肌内。
攻毒方式：采用尾静脉注射60μg炭疽致死毒素(LF30μg+PA30μg)。
免疫时间见表2。
表2免疫和攻毒动物免疫实验时间表
时间 0周 3周 5周 7周 8周
工作 1免疫 2免疫 3免疫 1攻毒 2攻毒
8.3攻毒方式：采用尾静脉注射60μg炭疽致死毒素(LF30μg+PA30μg)。
8.4结果分析
8.4.1血清效价测定
8.4.1.1野生保护性抗原PA和突变保护性抗原rPA血清效价比较
从第2次免疫开始，连续采集第1，第2和第3次免疫后的血清用ELISA检测每次的血清效价，每组采集3只大鼠的血清。用PA83和LF(0.5μg/ml)包被板子，血清从1:1000稀释到1:128000。如图14所示。
8.4.1.2不同剂量保护性抗原突变体rPA血清效价比较如图15所示。
8.4.1.3保护性抗原突变体rPA和二价疫苗(rPA+rLF)血清效价比较如图16所示。
8.4.1.4不同剂量致死因子突变体rLF血清效价比较如图17所示。
共两组，每组3只用LF(0.5μg/ml)包被板子，血清从1:1000稀释到1:128000
8.5.1.二价疫苗免疫后用毒素攻击F344大鼠保护效果实验观察结果见表3。
表3毒素攻击免疫后的F344大鼠存活情况
实验分组 最小致死剂量攻毒 5倍致死剂量攻毒
对照组 0/6(约2小时死亡)
免疫一组PA50μg 6/6 6/6
免疫二组rPA50μg 6/6 6/6
免疫三组rPA50μg+rLF50μg 6/6 6/6
免疫四组rPA50μg+rLF200μg 6/6 6/6
免疫五组rPA25μg 6/6 3/6(约5小时死亡)
免疫六组rPA25μg+rLF25μg 6/6 4/6(约20小时死亡)
用毒素最小致死剂量攻毒F344大鼠，所有免疫组动物6/6；对照组动物0/6。将毒素剂量增加到5倍最小致死剂量进行攻毒，结果低剂量保护性抗原突变体(rPA)组死亡3只，死亡时间推迟5小时后发生，低剂量保护性抗原突变体(rPA)加致死因子突变体(rLF)组死亡2只，但死亡时间推迟20小时后发生。如图18所示。图18A为所有实验组用最小致死剂量和5倍致死剂量攻毒后F344大鼠存活情况；18B为保护性抗原突变体rPA蛋白和二价疫苗(rPA+rLF)免疫效果比较；18C为所有实验组用5倍致死剂量攻毒后F344大鼠存活情况。
9.二价疫苗免疫后采集F344大鼠血清的被动保护力实验观察
采集存活F344大鼠的血清，挑选健康F344大鼠，分组重新尾静脉注射免疫F344大鼠血清50μl，然后实验各组尾静脉注射最小致死剂量毒素进行攻毒实验，结果表明野生保护性抗原(PA)血清注射组，大鼠约2h死亡，保护性抗原突变体(rPA)蛋白组血清注射和低剂量二价疫苗免疫组血清注射组大鼠全部存活且无伴随症状。如图19所示。
10.二价疫苗末次免疫三个月后血清效价检测
采集末次免疫三个月后存活F344大鼠的血清，用ELISA进行血清效价检测，观测三个月后二价疫苗成分中保护性抗原突变体rPA和致死因子突变体rLF免疫水平下降程度。如图20所示，20A为野生保护性抗原PA和保护性抗原突变体rPA蛋白血清滴度比较，20B为保护性抗原突变体rPA蛋白和二价疫苗血清滴度比较。
11.二价疫苗末次免疫六个月后血清效价检测
采集末次免疫六个月后存活大鼠的血清，用ELISA进行血清效价检测，观测六个月后二价疫苗成分中保护性抗原突变体rPA和致死因子突变体rLF免疫水平下降程度。如图21所示，21A为为野生保护性抗原PA和保护性抗原突变体rPA蛋白血清滴度比较，21B为为保护性抗原突变体rPA蛋白和二价疫苗血清滴度比较。
12.二价疫苗末次免疫九个月后血清效价检测
采集末次免疫九个月后存活大鼠的血清，用ELISA进行血清效价检测，观测六个月后二价疫苗成分中保护性抗原突变体rPA和致死因子突变体rLF免疫水平下降程度。如图22所示，22A为野生保护性抗原PA和保护性抗原突变体rPA蛋白血清滴度比较，22B为保护性抗原突变体rPA蛋白和二价疫苗血清滴度比较。
13.炭疽杆菌攻毒动物保护性实验观察
本试验参照上述毒素攻毒动物保护性实验的操作流程和方法，对BALB/C小鼠进行分组免疫，小鼠接受免疫两次后使用炭疽杆菌PasteurII(tox+/cap+)疫苗株进行攻毒试验观察。24只BALB/C小鼠随机分成四组，实验1组6只，注射5μg野生保护性抗原(PA)蛋白；实验2组6只，注射5μg保护性抗原突变体rPA蛋白；实验3组6只，各注射5μg二价疫苗成分rPA+rLF(1：1)；实验4组6只，对照。免疫两次，第二次免疫两周后用104个/毫升炭疽杆菌PasteurII株菌悬液0.2ml进行攻毒，结果显示二价疫苗rPA+rLF(1：1)免疫组对炭疽杆菌PasteurII株免疫保护率为100％，如图23所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种二价炭疽疫苗，其特征在于，所述炭疽疫苗的活性成分包括炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA和致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF。
2.根据权利要求1所述的炭疽疫苗，其特征在于，所述炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或者，将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。
3.根据权利要求1所述的炭疽疫苗，其特征在于，所述致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者，将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的炭疽疫苗，其特征在于，在所述炭疽疫苗中，保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA和致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF的摩尔比为0.95-1.05：1。
5.根据权利要求4所述的炭疽疫苗，其特征在于，所述疫苗中还包括氢氧化铝佐剂，所述氢氧化铝佐剂的浓度为0.8mg/ml。
6.权利要求1-5中任意一项所述的无毒炭疽疫苗在制备预防和/或治疗炭疽的产品中的应用。
7.权利要求1-5中任意一项所述的炭疽疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得无质粒炭疽杆菌受体株；
(2)利用所述受体株分别构建分泌性表达炭疽杆菌野生保护性抗原蛋白的分泌菌株BPL，和分泌性表达炭疽杆菌野生致死因子蛋白的分泌菌株BFL；
(3)在所述分泌菌株BPL中引入保护性抗原PA的R178A/K197A双位点突变，获得表达炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA的分泌菌株BPXL；在所述分泌菌株BFL中引入致死因子LF的R491A/L514A双位点突变，获得表达致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF的分泌菌株BFXL；
(4)表达和纯化获得保护性抗原突变体R178A/K197A蛋白；表达和纯化获得致死因子突变体R491A/L514A蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述炭疽保护性抗原的R178A/K197A突变体蛋白rPA的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，或者，将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述致死因子的R491A/L514A突变体蛋白rLF的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，或者，将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加所获得的具有同等功能的蛋白。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将突变体蛋白rPA和突变体蛋白rLF按照摩尔比0.95-1.05：1均匀混合，获得二价基因工程炭疽疫苗。
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