CN116716256A - 杂交瘤细胞株、抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体及应用 - Google Patents
杂交瘤细胞株、抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了杂交瘤细胞株、抗芋螺毒素α‑GI单克隆抗体及应用，杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202339；一种抗芋螺毒素α‑GI单克隆抗体，所述的单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到，能特异结合芋螺毒素α‑GI。基于上述已克隆到的抗芋螺毒素α‑GI单抗Anti‑GI‑444‑No.7轻、重链可变区基因，经鉴定该抗体的分子亚型为鼠IgG1Kappa,其对应胚系基因分别来自于Musmus IGHV1S22*01F和Musmus IGKV1‑117*01F。体外功能研究显示，重组的抗芋螺毒素α‑GI单抗能特异性结合芋螺毒素α‑GI，ELISA实验显示结合活性明确。小鼠体内研究显示，不同浓度抗体Anti‑GI‑444‑No.7可分别显著提升LD50或1.6×LD50剂量α‑GI染毒导致的动物死亡率，可用于α‑GI毒素的中毒急救和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体Anti-GI-444-No.7重链和轻链可变区基因、所述基因编码的多肽，以及制备基因和多肽在芋螺毒素α-GI染毒诊断和治疗中的应用。
背景技术
芋螺是世界上最古老的生活在热带海洋中的肉食性软体生物物种之一，最早出现在5500万年前，属于腹足纲芋螺科(Conidae)，与锥螺科(Turridae)、笋螺科(Terebridae)同属于芋螺首科(Conoidea)，并且同以具有毒液装置为其特征，但以芋螺科生物毒性最大，种类最多。芋螺毒液中可能含50-200个相对分子质量小的生物活性多肽，是发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽，能够相对特异性的阻断高等生物体内各种不同类型的离子通道和受体及其亚型,具有巨大的药物开发和利用价值。不同种属芋螺所分泌生物活性肽各不相同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差别，理论上估计有5万多种不同活性肽存在于芋螺毒液中。
芋螺毒素(Conotoxin,Conopeptide,CTx)是一大类由海洋芋螺的毒液管和毒囊内壁毒腺所分泌的一系列富含二硫键的生物活性肽，多数由10-40个氨基酸残基组成，其能够特异性地靶向细胞膜上的不同离子通道受体，因而具有重要的药用潜力。不同化学结构的芋螺毒素，并不是随机性的化学产物，而是不断进化、优化而生成的高生物活性肽，且在毒理作用上具有密切的协同作用，如芋螺通过芋螺毒液中各种毒素的组合作用来实现对其他生物的捕食。例如，地纹芋螺毒液中既含有高强度的nAChR拮抗剂ω-芋螺毒素，又含有Na+通道阻断剂μ-芋螺毒素；前者作用类似于α-银环蛇毒素，后者作用类似于河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)，在这两类芋螺毒素的共同作用下，导致神经肌肉传导完全阻断。
芋螺毒素家族成员有不同的分类方法。根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、M、O、T、P、I等20多个超家族。根据其药理学靶点的不同，芋螺毒素又可分为a、μ、w、κ、δ、σ、ρ、加压素、惊厥剂、睡眠肽等药理家族。其中，α、αA、κA属于A-超家族，ω、δ、κ、μO属于O-超家族，μ、ψ、KM属于M-超家族。此外，根据芋螺毒素作用于生物体内的不同靶位可分为3类：(1)作用于电压门控离子通道(或称电压敏感性通道)的CTx，常以通透的离子Na+，K+，Ca2+等命名；(2)作用于配体门控离子通道(又称化学门控或递质依赖性通道)的CTx，包括烟碱受体、5-HT3受体、NMDA受体，按相应的受体命名；(3)作用于G-蛋白受体靶标的CTx，如：芋螺加压素和芋螺惰性素，以及2种磷脂(conodipineM和PLA2)，它们基本上不含有二硫键；按其作用的受体靶点可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。
芋螺毒素家族成员中，研究较多的是A-超家族芋螺毒素，包括α-、αA-和κA-芋螺毒素，其通常由10-30个氨基酸组成，富含两对或三对二硫键，且含有两对二硫键的α-芋螺毒素均按照1-3、2-4配对方式形成loop框架。A-超家族α-芋螺毒素(α-CTx)是发现最早、分布最广、丰度最高的一类CTx,通常含两个二硫键，是一些12-30个氨基酸的小肽。有20种α-CTx的一级结构得到了确证，分别来自不同的芋螺种属。一种芋螺同时可能含有6种以上的α-CTx，其靶点均为烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic Acetylcholine Receptors，nAChRs)。nAChRs主要与人体中枢神经系统功能紊乱密切相关，如药物成瘾、疼痛、肿瘤发生等多种病理过程，也是临床上肌肉松弛药的主要药物靶点，因而α-CTx是肌肉或神经型nAChRs的选择性阻断剂。此外，不同生物物种或同一种物种体内均存在多种nAChR受体亚型，某些生物体nAChR受体亚型可达16种之多。为了适应此种生态环境，α-CTx的分子结构不断进化，其二硫键间的LOOPs环框架与氨基酸组成发生变异。单个氨基酸取代即可提高α-CTx对某一nAChR受体亚型的选择性100倍以上。
α-芋螺毒素GI(ECCNPACGRHYSC-NH2)来自地纹芋螺(C.geographus)，属于α-芋螺毒素，仅含13个氨基酸、2对二硫键。其作用靶标为nAChRs，是目前发现的毒性最强芋螺毒素，能导致中毒对象肌肉麻痹及呼吸抑制，小鼠腹腔注射的半数致死量(LD50)仅为8～12μg/kg。目前，尚无有效药物及抗体用于GI毒素中毒的急救和治疗策略。
α-芋螺毒素GI的化学结构一般式如下式所示：
芋螺毒素制备的方法主要有三种。第一种是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法获取量非常少，且由于海洋生态环境的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，且随着近年来海洋生态的破坏使野生芋螺数量急剧降低，该法会进一步加剧芋螺资源恶化，靠分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产并不现实。但提取到的少量天然毒液可通过一系列仪器分析手段得到单个毒素肽的氨基酸序列，再根据所得序列人工合成这些肽，可进一步用于活性测试和结构分析。第二种是基因工程方法，即将芋螺毒素的基因转化到微生物基因组中使其表达，后期再进行分离纯化。由于部分芋螺毒素的N端为Cys，酰胺化C端，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决酰胺化C端问题；同时芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象，使得分离纯化较为困难。但随着基因工程技术的日新月异，用芋螺毒素成熟肽基因，拼接原核或真核生物的信号肽，或同时转入酰胺化酶基因，可望生产出大量廉价的重组芋螺毒素。第三种方法采用人工化学合成的方法获取芋螺毒素，即通过分离天然芋螺毒素获取其氨基酸序列，目前使用较多的方法是多肽固相合成法。与传统的液相合成法相比，该方法具有很多优势，例如易清洗过滤容易将产物分离；可以将流程自动化；反应更彻底且过程损失小等。
作为识别抗原独特位点的特异性免疫球蛋白，抗体药物曾经是最重要的生物安全药物之一，同时也可作为新型毒素的治疗剂。肉毒毒素、产气荚膜杆菌ε毒素、葡萄球菌肠毒素等目前有效的治疗手段仍是免疫球蛋白注射剂。单克隆抗体与常规血清抗体不同，后者是针对一个抗原的不同抗原决定簇由许多不同的B淋巴细胞产生的多克隆混合体，而单克隆抗体是针对抗原某一个决定簇的，由一个B淋巴细胞产生的抗体，因而是一种均质的高特异性的抗体。虽然致敏的B淋巴细胞能分泌特异性抗体，且每个B淋巴细胞只针对单一的抗原决定簇产生抗体；但这些分泌抗体的细胞寿命短，不能在体外培养的条件下长时间存活与生长。自1975年和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来,各种单克隆抗体相继出现,它们在疾病诊治的基础研究和临床应用方面发挥了积极作用。随着基因工程抗体技术的发展，噬菌体抗体库、B细胞分选技术等尽管取得了长足的发展，但是目前基于细胞融合的杂交瘤依然是治疗性单抗，特别是抗毒素抗体制备的最可行策略之一。
抗毒素抗体不仅可对毒素的生物学功能发挥拮抗和中和作用，同时也能作为有效的毒素的解毒剂。目前，抗病毒治疗的唯一特效药物是免疫球蛋白类中和抗体(分为多克隆抗体和单克隆抗体)。如，上市的抗毒素/病毒抗体主要有肉毒毒素抗毒素、破伤风抗毒素、各类蛇毒抗毒素、炭疽抗毒素、狂犬病毒免疫球蛋白、人源乙肝免疫球蛋白、人源带状疱疹免疫球蛋白和人源牛痘免疫球蛋白等。但上述多抗多为动物源性，存在动物病毒污染、血清病等问题，并不是理想的中和抗体可进行直接应用。
发明内容
本发明的目的在于提供杂交瘤细胞株、抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体及应用。该抗体的重链和轻链可变区基因从能够分泌较高活性的鼠源性杂交瘤细胞株GI-444-No.7中克隆和制备，杂交瘤细胞株GI-444-No.7于中国典型培养物保藏中心保藏，拉丁文学名Hybridoma cell line，保藏时间：2023年3月8日，保藏编号：CCTCC NO:C202339，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号；邮编：430072；电话：(027)-6875 2319。
具体包括：
杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202339。
一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，所述的单克隆抗体由本发明所述的杂交瘤细胞株分泌得到，能特异结合芋螺毒素α-GI。
一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的重链可变区基因编码的多肽产物，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的轻链可变区基因编码的多肽产物，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包含特定的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，序列分别为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；轻链可变区的氨基酸序列包含特定的抗原互补决定区的CDR1、CDR2和CDR3，序列分别为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
可选的，所述的单克隆抗体对应的靶抗原多肽α-GI具有氨基酸序列组成为ECCNPACGRHYSC-NH2，对应分子量为1437.64Da。
本发明所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体用于制备抗芋螺毒素α-GI药物的应用。
本发明所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体用于制备诊断芋螺毒素α-GI试剂盒的应用。
一种抗芋螺毒素α-GI的药物，所述的药物含有本发明任一所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体。
一种诊断芋螺毒素α-GI的试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明任一所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体。
本发明人应用一套设计的抗体扩增引物成功地从培养的抗α-GI毒素特异性单抗Anti-GI-444-No.7杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区VL、VH基因。序列分析表明,抗体重链可变区基因VH的胚系基因来源为Musmus IGHV3-2*02F；而抗体轻链可变区基因VL的胚系基因来源为Musmus IGKV6-15*01F，它们的V(D)J的连接氨基酸分别为CSSYGSNYWFFDVW和CFQGSHVPWTF。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述已克隆的抗毒素多肽α-GI单抗Anti-GI-444-No.7轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便达到芋螺毒素α-GI染毒诊断和治疗中的应用目的。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1为10％ SDS-PAGE鉴定芋螺毒素α-GI多肽与BSA的偶联情况；图中从左至右，泳道1：蛋白Marker；泳道2：第一批多肽-BSA蛋白偶联产物；泳道3：未偶联多肽的BSA蛋白；泳道4：第二批多肽-BSA蛋白偶联产物；泳道5：未偶联多肽的BSA蛋白；
图2为芋螺毒素GI-KLH的体内快速免疫效果的ELISA分析；
图3抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7重、轻链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳分析；注：图中M表示DNAMarker；条带1表示Anti-GI-444-No.7的重链；条带2表示Anti-GI-444-No.7的轻链；
图4为抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7轻链可变区基因的测序图谱；
图5为抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7重链可变区基因的测序图谱；
图6为重组抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7的ELISA活性鉴定；注：其中444-No.7to GI-BSA为单抗Anti-GI-444-No.7结合包被的GI-BSA；而444-No.7to BSA为单抗Anti-GI-444-No.7结合包被的未偶联多肽的BSA。Ig ctrl为实验中的对照单抗样品。
具体实施方式
本研究针对来自地纹芋螺(C.geographus)的毒性最强α-芋螺毒素GI(ECCNPACGRHYSC-NH2)，采用偶联BSA/KLH后进行α-芋螺毒素GI的抗毒素抗体制备，用于芋螺毒素α-GI中毒的诊断及其结合和拮抗治疗，为α-GI毒素中毒的急救和治疗提供新策略探索。
本发明人应用杂交瘤技术获得了特异性抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7。该单抗的体外功能研究显示，无论是亲本或重组的抗芋螺毒素α-GI单抗均能结合芋螺毒素α-GI，结合活性明确；小鼠体内研究显示，不同浓度抗体Anti-GI-444-No.7可分别显著降低和提升LD50或1.6×LD50剂量α-GI染毒导致的动物死亡率和存活时间，可用于α-GI毒素中毒的急救和治疗。所制备单抗已递送中国典型培养物保藏中心保藏(杂交瘤细胞株GI-444-No.7，Hybridoma cell line，保藏编号：CCTCC NO:C202339)；细胞活性>95％，同时所制样品符合《人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点》的要求。该单抗的制备为探索芋螺毒素α-GI的临床诊断和急救治疗提供了重要研究和技术基础。
本发明所获得的靶向芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7不仅可作为拮抗毒素的有效策略，为探索靶向芋螺毒素治疗提供重要基础；此外，对该抗体进行改构和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，达到用于芋螺毒素α-GI染毒诊断和治疗应用。
本发明提供抗芋螺毒素α-GI的单克隆抗体Anti-GI-444-No.7及其重链和轻链可变区基因序列。该抗体的重链和轻链可变区基因从能够分泌较高活性的鼠源性杂交瘤细胞株GI-444-No.7中克隆和制备，杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202339。
本发明涉及抗芋螺毒素α-GI的单克隆抗体Anti-GI-444-No.7重链和轻链可变区基因。其中单克隆抗体即Anti-GI-444-No.7重链可变区基因全长为414bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，对应138个氨基酸。轻链可变区基因全长为393bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，对应131个氨基酸。
抗体在制备用于诊断和治疗芋螺毒素α-GI相关的临床诊断和急救治疗，如在未知情况下染毒预防或紧急状况下的染毒治疗中的开发和应用。本研究首先采用天然和纯化的芋螺毒素α-GI通过体外化学偶联的方法获得免疫用偶联多肽；经过质量控制和检测，将偶联多肽免疫小鼠，通过杂交瘤的技术和交叉筛选鉴定等，获得可特定结合芋螺毒素α-GI的单克隆抗体Anti-GI-444-No.7及其细胞株GI-444-No.7。之后，采用基因工程的技术，包括对抗体的可变区进行基因克隆、重组表达等方法，考虑到不同亚类的人抗体恒定区与补体和Fc受体的相互作用能力以及触发细胞溶解的功能不尽相同，发明人选择了人IgG4恒定区进行重组和人源化抗体制备，结果显示所制备的抗体Anti-GI-444-No.7能特异结合芋螺毒素α-GI，具有较好的毒素中和活性。
单克隆抗体对应的靶抗原多肽α-GI具有氨基酸序列组成为ECCNPACGRHYSC-NH2(Disulfide bridges:C2-C7,C3-C13)，对应分子量为1437.64Da。所述的单克隆抗体Anti-GI-444-No.7在结合和拮抗芋螺毒素α-GI中的应用。
本发明人应用一套设计的抗体扩增引物成功地从培养的抗α-GI毒素特异性单抗Anti-GI-444-No.7杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区VL、VH基因。序列分析表明,抗体重链可变区基因VH的胚系基因来源为Musmus IGHV3-2*02F；而抗体轻链可变区基因VL的胚系基因来源为Musmus IGKV6-15*01F，它们的V(D)J的连接氨基酸分别为CSSYGSNYWFFDVW和CFQGSHVPWTF。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述已克隆的抗毒素多肽α-GI单抗Anti-GI-444-No.7轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便达到芋螺毒素α-GI染毒诊断和治疗中的应用目的。
实施例1：芋螺毒素α-GI多肽的半抗原体外偶联和鉴定
按照上海生工偶联试剂盒C006068说明书进行。首先，通过选择3kDa超滤柱除盐浓缩α-芋螺毒素GI(13aa，2对S-S，HPLC纯度≥85％)；其次，使用化学异双功能交联剂EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐)，将α-GI多肽偶联到载体蛋白KLH/BSA的伯胺基。具体操作步骤为：首先将2mg纯化的芋螺毒素α-GI重悬于500μl1×Optimizer BufferTMIV；然后，将活化的肽溶液转移到Tube-O-DialyzerTM管中。将2mg BSA/KLH载体蛋白溶于200μl1×Optimizer BufferTMIII中；之后，将10mg EDC(干粉剂)加入到含有BSA/KLH载体蛋白溶液的Tube-O-DialyzerTM中，立即混匀；将含有偶联剂EDC的BSA/KLH溶液，加入最先制备的Optimizer BufferTMIV中，转移至Tube-O-DialyzerTM倒置，放置到透析杯中，在室温下孵育2小时，偶尔翻转混合。反应2小时后，加入PBS缓冲液，期间更换2-3次透析缓冲液，去除未偶联肽和EDC。透析后，从浮子上移除Tube-O-DialyzerTM，500g离心5-6秒。将透析帽更换为常规帽，收集载体蛋白-肽缀合物，之后将载体蛋白-肽结合物可储存在-20℃。最后，选用偶联的α-芋螺毒素GI-KLH/BSA缀合物进行10％ SDS-PAGE鉴定交联效果。
结果显示，采用10％ SDS-PAGE凝胶电泳对偶联之后的α-芋螺毒素GI-KLH/BSA缀合物交联效果分析(见附图1)，图像分析系统表明与对照为偶联的BSA相比，前后两次偶联的芋螺毒素α-GI的相对分子质量(M)均增大了5OO0 Da左右，说明毒素和半抗原的交联成功，即每个BSA分子平均交联了约3个芋螺毒素GI分子(α-Gi的分子量约1450Da)。
实施例2：芋螺毒素α-GI多肽-半抗原偶联物小鼠体内免疫效价测定及其单克隆抗体制备
发明人选用实施例1中芋螺毒素α-GI多肽与半抗原偶联产物，选用实施例制备的α-芋螺毒素GI-KLH/BSA缀合物，进行小鼠体内免疫及其单克隆抗体制备。首先，发明人将实施例1中偶联的α-芋螺毒素α-GI-KLH作为免疫原用于小鼠免疫，偶联的α-芋螺毒素α-GI-BSA用于后续的抗体制备与交叉筛选；其次，选择合适的免疫宿主为BALB/c小鼠品系。
小鼠体内免疫：考虑到选用毒素多肽的半数致死剂量LD50大约是10μg/kg体重的级别，我们设置两种初次免疫方式：1)常规免疫剂量：0.1μg/只、0.2μg/只、1μg/只、5μg/只；2)快速免疫剂量：0.1μg/只、0.2μg/只、1μg/只、10μg/只(实验过程见下表)。α-GI-KLH免疫原的体积均调整为0.2ml，与等体积的Freund's完全佐剂(CFA)混合后，在背部皮下进行注射。
在第一次免疫后14天，用等体积的Freund's不完全佐剂(IFA)混合免疫原，按0.1ml/只的剂量，在尾根处皮下注射加强免疫。之后，在加强免疫后14天，分别用等体积的PBS混合免疫原，按0.1ml/只的剂量，在尾根处皮下注射再次加强免疫。最后，在腹腔加强免疫后第3天，从眼眶采集血液样本，并用ELISA法检测血清中特异性抗体水平。根据实际结果，当抗体达到预期水平(抗原交叉滴度>10,000)，则进行融合细胞实验；如不达标，则继续加强免疫或更换小鼠。第三次加强后再次用免疫多肽包被Elisa检测效价。
单抗的融合筛选：在融合细胞前一天制备饲养细胞。收集处于对数生长期的SP2/0细胞100～200ml(5×104～105/ml)于50ml离心管中，1000转/min离心10分钟，用DMEM培养液洗2次，将细胞悬浮于40ml DMEM完全培养液中即为单个骨髓瘤细胞悬液。将产生高水平特异性抗体的小鼠用脱臼法处死，并取出脾脏，在无菌条件下制备单个脾细胞悬液。
将上述两种细胞悬液(脾细胞108个，骨髓瘤细胞2×107个)共同加入50ml离心管中混匀，1000转/min离心10分钟，倒尽上清液，用手弹击管底，使两种细胞混匀成糊状，然后用聚乙二醇(PEG)溶液进行融合。具体操作的步骤为：用吸管吸取0.7ml预温的50％ PEG溶液后，将吸管尖端插入离心管底部，一边轻轻搅动细胞沉淀，一边滴加PEG溶液，一分钟内加完，放入烧杯温水中，静置90秒钟。
将融合产物稀释并分装到含有HAT培养基和羊血清的96孔板中，并在37℃、5％CO2条件下培养10-14天。观察并记录每个孔中杂交瘤细胞(Hybridoma cell)生长情况，并用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。将阳性杂交瘤细胞亚克隆化并扩增培养，直到得到稳定分泌特异性单抗的单克隆杂交瘤细胞株。取生长旺盛、形态良好的杂交瘤细胞株按照常规的细胞冻存方法进行冻存，或放入液态氮中长期保存。
α-GI-KLH的对雌性BALB/c小鼠免疫效果分析显示，常规免疫的交叉滴度为6400-12800之间，之后迅速下降至阴性附近。而加入佐剂的快速免疫1.0μg/只芋螺毒素多肽偶联KLH(实验室命名2021-413)免疫小鼠却能引起较好的免疫反应(结果见附图2)，小鼠的抗体滴度>10000，同时小鼠未有死亡的情形发生。这也提示交联半抗原的毒素体内具有一定的抗原性，抗体滴度符合预期。选择滴度较高的小鼠进行腹腔抗原冲击后，开展杂交瘤细胞融合、阳性单克隆细胞株筛选。通过毒素单抗的杂交瘤细胞筛选，第一批共得到9株阳性杂交瘤细胞株，进行亚类鉴定，共获得9株IgM类的阳性杂交瘤细胞株(实验室命名2022-444)。之后，选用天然纯化的毒素，进行第二轮芋螺毒素α-GI多肽-KLH/BSA偶联物的体内免疫及其抗体制备。通过天然纯化芋螺毒素多肽2022-444-KLH免疫小鼠，得到多株能够分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株，将筛选得到的阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到1株IgG类的阳性杂交瘤细胞：GI-444-No.7(抗体亚型为小鼠IgG2b)。
实施例3：抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7轻、重链可变区基因克隆
取处于对数生长期的GI-444-No.7杂交瘤细胞(5×106)，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，取少量总RNA进行紫外分光光度计定量及甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测；随后以Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链。接着，利用设计的一套通用引物进行抗毒素多肽α-GI单抗Anti-GI-444-No.7的轻、重链可变区基因(VH，VL)扩增。扩增产物VH(约410bp)和VL(约400bp)经低溶点琼脂糖凝胶(1.5％)电泳后，切胶分离靶片段；通过凝胶纯化试剂盒(Promega公司)回收纯化，进行总RNA凝胶电泳(1.5％)鉴定(结果见附图3)。之后将目的片段克隆至T载体，测序分析(见附图4,5)。
Oligo(dT)15为随机引物的反转录方案如下：20μL反应体系中依次加入1μg总RNA(2μL)，0.5μg随机引物Oligo(dT)15(1μL),4μL MgCl2(25mM)，2μL 5×dNTPs,2μL 10×缓冲液,0.5μL RNase抑制剂，反转录酶AMV 15U(0.75μL)，用水补至20μL，混匀，42℃水浴1h，煮沸3min，反应产物置于-20℃备用。
PCR扩增反应按常规方法进行：以上述反转录PCR产物为模板，分别用3对重链引物和5对轻链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。设计的Anti-GI-444-No.7单抗可变区基因PCR扩增引物序列如下：
小鼠重链V区5'端引物
(1)5'-GGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT-3'
(2)5'-GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT-3'
(3)5'-GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3'
小鼠重链V区3'端引物
5’GAC(ACT)CATGGGG(CG)TGT(TC)GTGCTAGCTG(AC)(AG)GAGAC(AGT)GTGA-3’
小鼠轻链V区5'端引物
(1)5'-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'
(2)5'-GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3'
(3)5'-GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA-3'
(4)5'-GGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT-3'
(5)5'-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3'
小鼠轻链V区3'端引物
5'-GGATACAGTTGGTGGTGCAGTCGACTTACGTTT(GT)GTTTCA(AG)CTT-3'；
其中：划线处为限制性酶切位点
反应体系为：模板cDNA2.5μL，dNTP(各0.4mM)2μL,10×Buffer 5μL,Ex Taq DNA聚合酶1.25U即1.5μL,5'端和3'端引物各5μL(约30pmol)，加水至50μL,混匀，瞬时离心后，加入1-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件:94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。
目的片段T载体克隆测序方案如下：将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体1μL，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3μL，去离子水1μL，连接缓冲液5μL，混匀后4℃过夜。将反应混合物转化大肠杆菌JM109，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序分析。
经过抗体的亚型鉴定，得知该抗体所对应的分子亚型为鼠IgG2b,对应胚系基因分别来自于Musmus IGHV1S22*01F和Musmus IGKV1-117*01F，重链可变区基因具有序列表SEQID NO:1的序列，具体为：
atg gga tgg agc tct atc atc ctc ttc tgg gta gca aca gcc tca ggt 48
gtc cac tcc cag gtc cta ctg cag caa cct ggg tct gaa ctg gtg agg 96
cct gga gct tca gtg agg ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttc 114
acc agc tac tgg atg cac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt 192
gag tgg att gga aat att tat cct ggt agt ggt tta act aac cac gat 240
gag aag ttc aag agc aag gcc aca ctg act gta gac aca tcc tcc agc 288
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tat tac tgt tca agc tac ggt agt aat tac tgg ttc ttc gat gtc tgg 384
ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 414；
编码的多肽产物具有序列表SEQ ID NO:3的序列；具体为：
Ser Ser；
137 138；
而轻链可变区基因具有序列表SEQ ID NO:2的序列，具体为：
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48
tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
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gaa atc aaa 393；
该轻链可变区基因编码的多肽产物，具有序列表SEQ ID NO:4的序列，具体为：
同时抗体的两条链均具有抗体的特征序列和CDR区，其中重链可变区的氨基酸序列所包含特定的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列分别为SEQ ID NO：5(SYWMH)、SEQID NO：6(NIYPGSGLTNHDEKFKS)和SEQ ID NO：7(YGSNYWFFDV)；
轻链可变区的氨基酸序列所包含的特定的抗原互补决定区的CDR1、CDR2和CDR3序列分别为SEQ ID NO：8(RSSQSIVHSNGNTYLE)、SEQ ID NO：9(KVSNRFS)和SEQ ID NO：10(FQGSHVPWT)，具体如下：
其中，单抗Anti-GI-444-No.7重链可变区为：
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单抗Anti-GI-444-No.7轻链可变区为：
实施例4：抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7轻、重链可变区基因重组表达制备及ELISA活性鉴定
根据上述实施例4中获得的单抗Anti-GI-444-No.7轻、重链可变区基因，即重链可变区基因具有序列表SEQ ID NO：1的序列和轻链可变区基因具有序列表SEQ ID NO：2的序列，体外进行全基因的合成，同时进行表达密码子的优化；将合成的序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2分别克隆入含人hIgG4/-Kappa恒定区的酶切表达载体pCI-vector；连接产物经DNA纯化试剂盒进行纯化后转化到TOP10大肠杆菌，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上；获得的阳性克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，进行质粒提取和测序，获得分别含有人源化抗体VH基因全长真核表达载体克隆B22102403H(Anti-A-444KLH 7#Heavy Chain)和含有人源化抗体VL基因的全长真核表达载体克隆B22102403L(Anti-A-444KLH 7#Light Chain)；经过序列测定，所获克隆含有重链可变区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:1；轻链可变区对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2。
用Invitrogen公司的Freestyle Max Reagent转染试剂分别将上述载体B22102403H和B22102403L配对进行共转染入CHO细胞(1.0×106个/ml)，将转染后的细胞置于37℃，5％CO2浓度的培养箱中震荡培养，培养摇床转速为120转。转染7天后离心收取转染细胞的上清液，采用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化目的全长人源化IgG4kappa抗体，对表达纯化的抗体进行蛋白浓度测定并用于进一步的纯化抗体ELISA活性鉴定。
重组表达制备的抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7的ELISA活性鉴定：将按照实施例2中制备的200ng芋螺毒素α-GI多肽-BSA偶联物或未负载多肽毒素的BSA蛋白包被到96孔酶标板中，4℃静置过夜；用1XPBS/2％BSA室温封闭1小时。将实施例5及后续制备的杂交瘤上清纯化抗体产物从1μg/ml起始用封闭液1:5梯度稀释，每孔分别加入100μl，室温静置1小时。加入100μl 1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人二抗Goat anti-humanIgG Fc HRP(Bethyl Cat#A80-304P)，室温静置1小时。最后，加入TMB显色，并用2M H2SO4终止反应；用光学酶标仪在OD450nm下观察读数并记录。
结果显示，构建的嵌合人IgG4kappa抗体载体转染人CHO细胞24h后细胞的活力大于95％；200mL培养体积小试悬浮瞬时表达7天后，离心收取上清共纯化获得抗体12.9mg(3.3mg*4支分装)。ELISA结果可看出，相对于未负载多肽毒素的BSA蛋白，表达纯化的Anti-GI-444-No.7抗体可以结合芋螺毒素α-GI多肽-BSA偶联物，OD450值最高可达到3.0(结果见附图6)。由于对照的BSA未有非特异的结合，说明制备的抗体可特异性的与芋螺毒素α-GI结合，且结合活性明确，表明所制备的抗体能特异的结合到该多肽靶分子。综上，发明人选择了人IgG4恒定区进行重组和抗体制备，所制备的抗体Anti-GI-444-No.7能特异结合芋螺毒素α-GI，具有较好毒素结合活性。
实施例5：抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7的小鼠体内的毒素对抗保护实验
为了进一步明确所制备单抗对芋螺毒素α-GI的中和功能活性，发明人进一步进行了小鼠体内的毒素对抗保护实验。具体实施过程为：首先选用ThermoScientificTMPierceTM定量肽检测试剂与标准品对实施例1中所制备的芋螺毒素α-GI再次准确定量，考虑到文献报道的芋螺毒素α-GI小鼠腹腔LD50为8～12μg/kg或15～30μg/kg，我们首先测试了测试1/5/10/100/150μg/kg暴露后动物死亡率，每只小鼠腹腔/静脉注射体积0.5mL，采用GraphPad Prism 8.0软件对死亡百分率-GI剂量进行拟合，获得GI对小鼠的LD50数据。之后，观察不同浓度抗体对LD50或1.6×LD50剂量GI染毒导致动物死亡率和存活时间的影响，即给予1.6×LD50剂量GI腹腔染毒，染毒后立即不同滴度GI抗体静脉给药(100μL)，观察72h的存活时间和存活率。其中分组设置为：随机分为4组，即①1.6×LD50剂量GI染毒组、②低剂量抗体+1.6×LD50剂量GI染毒组、③中剂量抗体+1.6×LD50剂量GI染毒组、④高剂量抗体+1.6×LD50剂量GI染毒组。对应的抗芋螺毒素α-GI单抗Anti-GI-444-No.7分别选用低、中、高剂量抗体：0.2mg/kg、2mg/kg、10mg/kg，共尾静脉注射1次，实验记录并观察。
小鼠体内结果显示，通过单抗Anti-GI-444-No.7的小鼠体内的毒素对抗保护实验，不同浓度抗体Anti-GI-444-No.7对LD50或1.6×LD50剂量GI染毒导致动物死亡率和存活时间均有保护和提升，具有较好毒素中和活性，可用于GI毒素的中毒急救和治疗。
血清ELISA检测结果显示，与对照组相比，注射抗芋螺毒素α-GI单抗后能显著缓解芋螺毒素α-GI诱导的急性促炎因子表达。在单抗注射后8和12h，与存活的未注射单抗的小鼠相比，促炎细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ的水平相对较高。芋螺毒素α-GI mAb处理可显着降低芋螺毒素α-GI注射小鼠中这四种细胞因子的血清浓度。
综上所述，芋螺毒素α-GI(ECCNPACGRHYSC-NH2)是目前发现的毒性最强的芋螺毒素，能导致中毒对象肌肉麻痹及呼吸抑制，小鼠的半数致死量(LD50)约为15μg/kg(尾静脉注射)。目前，芋螺毒素α-GI侦检尚比较困难，临床上也无有效药物及抗体用于α-GI毒素中毒的急救和治疗。以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可直接用于抗芋螺毒素α-GI的体内中和治疗，或者通过其特定结合特征用于芋螺毒素α-GI的检测和诊断。另外，以本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽及其衍生物作为载体，交联上蛋白酶和生物反应调节剂等作为导向药物，可用于芋螺毒素α-GI引起相关疾病的侦查、检测、预防和治疗中的作用。
从本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽出发，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式：(1)嵌合抗体。是用鼠MAb的V区与人Ig的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应，故在人体的后续应用中显示出良好的效果。(2)人源化抗体。针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基镶饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价微型抗体。主要有双链抗体、(scFv)2、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab')2、F(ab')3、(scFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透肿瘤组织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(5)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的蛋白酶和生物反应调节剂等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。(7)重组免疫毒素。将编码抗体和毒素的基因重组而产生，特点是高效，非特异毒性低，体内稳定性好，易穿透肿瘤及体内使用较安全。(8)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因Ⅲ或基因Ⅷ连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或scFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出所需的特异性抗体。(9)免疫脂质体。将MAb偶联到脂质体的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一体，再包埋上有关药物，则可进一步提高抗体药物靶向性和疗效，从而用于芋螺毒素α-GI染毒诊断和治疗应用。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C202339。
2.一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到，能特异结合芋螺毒素α-GI。
3.一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，其特征在于，所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，其特征在于，所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的重链可变区基因编码的多肽产物，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的轻链可变区基因编码的多肽产物，具有如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
5.一种抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，其特征在于，所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包含特定的抗原互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，序列分别为SEQID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
轻链可变区的氨基酸序列包含特定的抗原互补决定区的CDR1、CDR2和CDR3，序列分别为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
6.根据权利要求1-5任一所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体对应的靶抗原多肽α-GI具有氨基酸序列组成为ECCNPACGRHYSC-NH2，对应分子量为1437.64Da。
7.权利要求1-5任一所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体用于制备抗芋螺毒素α-GI药物的应用。
8.权利要求1-5任一所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体用于制备诊断芋螺毒素α-GI试剂盒的应用。
9.一种抗芋螺毒素α-GI的药物，其特征在于，所述的药物含有权利要求1-5任一所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体。
10.一种诊断芋螺毒素α-GI的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求1-5任一所述的抗芋螺毒素α-GI单克隆抗体。
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