CN107099505A - 抗FtsH2蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗FtsH2蛋白单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗FtsH2蛋白单克隆抗体及其应用，所述抗体由小鼠杂交瘤细胞系30749‑22分泌产生；该抗体可用于制备筛选抗逆性状植物材料的试剂盒。本发明的抗FtsH2蛋白单克隆抗体，可特异性地结合识别重组的和小麦叶片中表达的天然FtsH2蛋白；该抗体是一种IgG1类抗体，与FtsH2蛋白的结合有极强特异性和敏感性；并且单克隆抗体可通过免疫印迹(Western blotting)的方法对植物叶片中的FtsH2蛋白进行定性与半定量分析，用于遗传改良植物的鉴定，从而筛选抗逆胁迫性高的植物材料。

Description

抗FtsH2蛋白单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种抗FtsH2蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
FtsH(filamentation temperature-sensitive H)属于AAA蛋白酶家族，它是由FtsH基因编码的一种ATP和Zn2+依赖型兼职蛋白，兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性，此基因在生物基因组中广泛分布。
在真核生物中，已知的FtsH均定位于叶绿体膜或线粒体膜上。FtsH负责细菌原生质膜、线粒体膜、叶绿体膜上的未装配蛋白的降解，通过及时降解非复合体形式的自由亚基，避免其可能的有害积累。FtsH不仅参与生物体内正常的代谢调节过程，而且与多种逆境胁迫响应密切相关，在抵抗热激和高渗、盐害和冷胁迫中起作用。FtsH蛋白除了作为蛋白酶发挥功能外，还作为分子伴侣参与蛋白的装配和折叠，这种分子伴侣功能与蛋白酶功能独立存在。发现新的FtsH基因用于作物的遗传改良也具有明确的目标和意义，申请号为201210104976.4的发明专利“一种ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH”，提供了一种来自嗜热菌Alicyclobacillus hesperidium的ATP-依赖的金属蛋白酶FtsH编码基因，该蛋白具有蛋白水解活性和分子伴侣活性，可应用于农作物的基因改造。
来自于生物体的FtsH蛋白种类较多，功能也不完全相同。在叶绿体中，主要有FtsH1(又称FTSH蛋白酶1)、FtsH2、FtsH5、FtsH6(又称FtsH蛋白酶6)、FtsH7、FtsH8和FtsH9，在线粒体中则主要存在FtsH3(又称FtsH蛋白酶3)、FtsH4、FtsH10以及FtsH11亚型。
目前，已经在枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌等原核生物；人、酵母、拟南芥、烟草、苜蓿等多种真核生物中都发现了它的存在。经研究表明，FtsH是通过寡聚化形成一个六聚环形结构，将蛋白水解活性位点埋在六聚复合孔穴的中央，结构分析表明，原核生物和真核生物的FtsH蛋白都具有共同的保守模块，包括N端跨膜域、AAA结构域、锌离子结合模块等。
在高等植物中，FtsH参与蛋白质量的平衡控制，还与热激、高渗、光胁迫、低温、病害等胁迫响应答等多种植物应激生理反应过程。近来多个研究报道该蛋白家族成员在不同的植物，如拟南芥、水稻、玉米和大豆中与环境胁迫的耐受有关，这些胁迫包括盐胁迫、干旱胁迫和高温胁迫；但是目前还无抗FtsH蛋白单克隆抗体的相关报道，研发出相关抗体，将其用于筛选抗逆性高的植物材料成为一种发展趋势。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种抗FtsH2蛋白单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体可特异性地结合识别重组的和小麦叶片中表达的天然FtsH2蛋白，并且可用于筛选抗逆胁迫性高的植物材料。
除非特别指明，本发明中的“抗体”是指“包括通常意义上的抗体、构成它的重链、轻链，及其片段”。
除非特别指明，本发明中的“30749-22杂交瘤细胞株”、“30749-22杂交瘤细胞株”均指“小鼠细胞系30749-22杂交瘤”。
一方面，本发明提供一种小鼠细胞系30749-22杂交瘤。
另一方面，本发明提供一种抗FtsH2蛋白单克隆抗体，所述抗体由小鼠杂交瘤细胞系30749-22分泌产生。
优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述抗体的重链可变区的基因序列为SEQ ID NO:3所示，所述抗体的轻链可变区的基因序列为SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述抗体与FtsH2蛋白特异性结合，所述FtsH2蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:5所示。
优选地，所述FtsH2蛋白为小麦FtsH2蛋白。
还一方面，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包括所述抗体的重链可变区的基因序列和轻链可变区的基因序列。
再一方面，本发明还提供一种重组有机体，所述重组有机体包括上述的载体和宿主有机体，所述宿主有机体为大肠杆菌。
又一方面，本发明还提供上述抗体在用于制备筛选抗逆性状植物材料的试剂盒中的应用。
还一方面，本发明还提供一种筛选抗逆性状植物材料的试剂盒，包括上述的抗体。
本发明的抗FtsH2蛋白单克隆抗体，可特异性地结合识别重组的和小麦叶片中表达的天然FtsH2蛋白；该抗体是一种IgG1类抗体，与FtsH2蛋白的结合有极强特异性和敏感性；并且单克隆抗体可通过免疫印迹(Western blotting)的方法、酶联吸附测定法、免疫组织化学法检测对植物叶片中的FtsH2蛋白进行定性与半定量分析，用于遗传改良植物的鉴定，从而筛选抗逆胁迫性高的植物材料。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为在小麦叶片mRNA经逆转录-PCR扩增获得ftsh2基因的电泳分析结果；其中，Marker为核酸电泳的分子量标记DL2000；
图2为纯化的FtsH2重组抗原蛋白；其中，1，2为两个平行样品，即表达产物300mM咪唑洗脱的结果，M为分子量蛋白；
图3为抗体对重组FtsH2蛋白的识别特性和半定量分析结果，其中，1-5分别为900g/ml、300ng/ml、100ng/ml、33g/ml和11ng/ml标准品的显色结果，S1和S2分别为小麦品种冀麦418对照和经胁迫处理后样本杂交显色结果，M为分子量标记；
图4为抗体对小麦叶片中FtsH2的半定量结果，其中，横坐标为标准蛋白的浓度值，纵坐标为杂交结果的扫描结果灰度值，曲线为依据灰度值和浓度制作的标准曲线。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。
实施例1小麦ftsh2基因的克隆和重组FtsH2抗原蛋白制备
1)采取植物样本
盆栽冀麦418(河北省农林科学院粮油作物研究所)至抽穗-开花期进行盐胁迫处理，取处理后三天的旗叶叶片约0.1g，液氮研磨至粉末状，加入0.5mL植物总RNA提取试剂(天根生化科技(北京)有限公司)，振荡至彻底混匀。室温放置5min，4℃，12000rpm离心2min，上清转入新的无RNase离心管。加入0.1mL 5M NaCl(用DEPC配制)，温和混匀，再加入0.3mL氯仿，颠倒混匀。4℃，12000rpm离心10min，取上层水相转入新的无RNase的离心管，加与所得水相等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置10min。随后4℃，12000rpm离心10min。弃上清，加1mL75％乙醇。4℃，12000rpm离心3min，倒出液体，保留沉淀，室温晾干2-3min，加50μLDEPC水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA，冷冻保存，得RNA。
2)逆转录
将1)中制得的RNA在冰上解冻；5×Buffer、DTT、dNTP、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。在1.5mL RNase-free离心管中依次加入2.5μg/μLoligo(dT)18(TaKaRa)逆转录用引物2μL，制备的总RNA 1μL，混匀后68℃5-10min，立即置于冰上5min，再加入1μL的RNase OUT(Promega)，4μL的0.1M DTT，8μL的5×RT buffer，3μL的5mM dNTP(TaKaRa)，补充RNase-Free ddH2O至总体积为38μL，混匀后42℃孵育2min，加入反转录酶2μL(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，混匀后42℃保温1h，然后70℃孵育15min，得到逆转录产物cDNA，在-80℃保存。
3)PCR扩增和基因克隆
根据不同物种的ftsh基因序列比对，设计用于扩增小麦ftsh基因的引物，其正向引物ftsh-F：5’-ATGGCGCCATCCATGAGTCTTG-3’(SEQ ID NO:6)，反向引物为ftsh-R:5’-CTAGACCGGGACGGCGGC-3’(SEQ ID NO:7)。在20μL的PCR扩增体系中加入：1μL的2)中制得的逆转录产物cDNA作为模板，2μL的dNTPs(2.5mM stock，TaKaRa)，5μL的10×Taq DNA聚合酶缓冲液，正向和反向引物各0.2μL，0.2μL的Taq DNA聚合酶(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，补ddH2O至203μL。扩增反应程序为，95℃预变性5分钟，循环过程94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸90秒，扩增30个循环，然后72℃最后延伸10分钟，将PCR产物经凝胶电泳分离后，结果见图1，ftsh2为从小麦叶片cDNA中扩增的ftsh基因片段，包括500bps和约2000bps两个PCR产物，经克隆和序列分析，长度约为2.kbps的产物为小麦的ftsh基因，序列比对结果表明该基因为ftsh2。以柱离心式DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收大小在2.0kb附近的PCR产物条带，连接pMD18-T载体(TaKaRa)后测序验证序列正确性，测序后的克隆表明，表达变化最为明显的基因为ftsh2，该基因属ATP-依赖的金属蛋白酶ATP依赖的金属蛋白酶2(FtsH2)，本序列已提交至Genbank，其编号为KX037456.1，其相应蛋白的Genbank ID为ANJ20927.1(SEQ ID NO:5)。本克隆的基因该序列将该序列连入表达载体pET-30a(Novagen)，构建为表达载体pET30a-ftsh2进行原核表达。
4)FtsH2蛋白的表达和纯化。
按1:100的比例将含有pET30a-ftsh2质粒的Bl21(DE3)大肠杆菌单菌落培养的过夜培养物转接至100ml LB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8。加入0.1mM的IPTG，25℃震荡培养8h，6000rpm离心10分钟，弃去培养基上清，加入pH7.4磷酸缓冲液重悬菌体，后再次离心10分钟，弃上清，再次加入pH7.4磷酸缓冲液超声破碎。该重组蛋白为FtsH2蛋白和组氨酸标签的融合蛋白，用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测，图2为重组FtsH2蛋白表达和纯化结果，重组FtsH2蛋白的分子量约为70kDa，蛋白纯度在90％以上，经Bradford法测定浓度为0.82mg/mL。
实施例2杂交瘤细胞系的建立和克隆筛选
1)动物免疫
将实施例1中表达纯化的重组蛋白用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以腹腔注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只，得到免疫达标的小鼠。
2)细胞融合
无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(WISENT公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％羧甲基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。
3)单克隆挑取和筛选
融合后7天，在解剖镜下吸取合适的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。经3天后，细胞量大约占底面积2/3，克隆完全换液。再经2天，取100μL上清用重组FtsH2蛋白和带有组氨酸标签的无关蛋白分别进行ELISA筛选，阳性克隆转入含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基的24孔板培养。3天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基6孔板培养扩大培养并冻存。在经过ELISA鉴定后确认克隆号为30749-22的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的结合特性，效价符合要求，加入细胞冻存液液氮保存。
实施例3腹水诱生法制备抗FtsH2蛋白单克隆抗体和单抗性质鉴定
1)腹水制备
将30749-22杂交瘤细胞株培养至对数生长期，用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×105，1ml。悬浮的两种细胞分别腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，-20℃保存。用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。
2)亚类鉴定
用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H2O2的柠檬酸缓冲液(pH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明的抗FtsH2蛋白单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。
3)亲和常数测定
在ELISA板中包被重组FtsH2蛋白，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出的30749-22杂交瘤细胞株分泌的抗FtsH2蛋白单克隆抗体的亲和常数为4.1×109。
实施例4抗FtsH2蛋白单克隆抗体的可变区序列测定
培养新鲜的30749-22杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集106以上的杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA，加入2.5μL oligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μLdNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μL RT buffer(5X)，2.5μL DTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中MHV.B1直至MHV.B12的11条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合用于扩增重链可变区基因。
MHV.B1：5’-GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’(SEQ ID NO:8)
MHV.B2：5’-CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’(SEQ ID NO:9)
MHV.B3：5’-CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’(SEQ ID NO:10)
MHV.B4：5’-AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’(SEQ ID NO:11)
MHV.B5：5’-GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’(SEQ ID NO:12)
MHV.B6：5’-GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3’(SEQ ID NO:13)
MHV.B7：5’-CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’(SEQ ID NO:14)
MHV.B8：5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’(SEQ ID NO:15)
MHV.B9：5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’(SEQ ID NO:16)
MHV.B10：5’-GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’(SEQ ID NO:17)
MHV.B12：5’-GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3’(SEQ ID NO:18)
MHC.F：5’-GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’(SEQ ID NO:19)
用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV.B1直至MKV.B10的10条引物为上游引物，可分别与轻链下游引物MKC.F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。
MKV.B1：5’-GATGTTTTGATGACCCAAACT-3’(SEQ ID NO:20)
MKV.B2：5’-GATATTGTGATGACGCAGGCT-3’(SEQ ID NO:21)
MKV.B3：5’-GATATTGTGATAACCCAG-3’(SEQ ID NO:22)
MKV.B4：5’-GACATTGTGCTGACCCAATCT-3’(SEQ ID NO:23)
MKV.B5：5’-GACATTGTGATGACCCAGTCT-3’(SEQ ID NO:24)
MKV.B6：5’-GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’(SEQ ID NO:25)
MKV.B7：5’-GATATCCAGATGACACAGACT-3’(SEQ ID NO:26)
MKV.B8：5’-GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’(SEQ ID NO:27)
MKV.B9：5’-CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’(SEQ ID NO:28)
MKV.B10：5’-GACATTCTGATGACCCAGTCT-3’(SEQ ID NO:29)
MKC.F：5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’(SEQ ID NO:30)
其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，将所得重链可变区和轻链可变区分别克隆至pMD18T质粒载体(TaKaRa)测序。
结果显示，本发明的30749-22杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的重链和轻链可变区的DNA序列如序列表中序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，其对应的可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
实施例5利用免疫印迹法半定量检测小麦叶片FtsH2蛋白含量
将重组的FtsH2蛋白进行等比稀释，制备浓度分别为900g/ml、300ng/ml、100ng/ml、33g/ml和11ng/ml的标准品。取经盐胁迫处理和未经处理的抽穗-开花期小麦品种冀麦867叶片，取1g叶片在液氮中研磨，加入植物蛋白提取液提取蛋白，将标准品和抽提的叶片蛋白进行电泳和免疫印迹检测。免疫印迹实验过程如下：每孔上样20μL，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T(10mmol/L，Tris含0.9％NaCl，用1NHC1调pH至7.4，加入终浓度为0.05％的吐温20)封闭液中4℃过夜。加入30749-22杂交瘤分泌的抗FtsH2蛋白单克隆抗体(1：1000稀释)，4℃孵育过夜。用TBS-T缓冲液洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集，如图3所示，从图中可以看只有一条条带，没有其他条带，说明本发明的抗FtsH2蛋白单克隆抗体具有很高的特异性。
在取得的免疫印迹结果图3中，按照各条带的灰度值制作外部对照的浓度-灰度值标准曲线(如图4所示)，按线性回归计算得到标准曲线的回归方程为，y＝70.848x+1640.9(R2＝0.9903)。处理小麦叶片和对照叶片的检测灰度值分别为3928和11593，经计算，其FtsH2的含量分别为32.3ng/mL和140.5ng/mL。
上述结果表明，本发明的抗FtsH2蛋白单克隆抗体特异性高，检测灵敏度高，通过检测植物中的FtsH2蛋白含量，用于抗逆性高的植物材料筛选。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明的保护范围，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明核心技术的前提下，所能做出的改进或等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所
<120> 抗FtsH2蛋白单克隆抗体及其应用
<130> 1
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> SEQ ID NO:1
<400> 1
gaggtgcagc tgcaggagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggtgcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctacacga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcagtggtag aagcaagtac 180
aatgacaatt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacactgtac 240
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc accgaactgg 300
agcggttttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> SEQ ID NO:2
<220>
<221> misc_feature
<222> (294)..(294)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 2
gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcca gagagtcagt acatctggct atagttatat gcactggtat 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtctccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tttgggacag acttcaccct caacatccat 240
agagtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgttctc aaattaggga tccntacacg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 330
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> SEQ ID NO:3
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Ser Lys Tyr Asn Asp Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Asn Trp Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 110
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> SEQ ID NO:4
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Arg Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ile Arg
85 90 95
Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 680
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<220>
<223> SEQ ID NO:5
<400> 5
Met Ala Pro Ser Met Ser Leu Ala Ala Lys Gly Leu Leu Pro Phe Gly
1 5 10 15
Ala Leu Pro Ser Ser Gly Ala Ala Gln Arg Pro Val Ser Val Thr Ala
20 25 30
Ser Leu Glu His Lys Pro Asn Asp Ser Lys Arg Lys Leu Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Val Gly Leu Pro Ala Leu Leu Ser Ala Asn Lys Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Asp Gln Gly Val Ser Ser Ser Arg Met Ser Tyr Ser Arg
65 70 75 80
Phe Leu Glu Tyr Leu Asp Lys Asp Arg Val Lys Lys Val Asp Leu Phe
85 90 95
Glu Asn Gly Thr Ile Ala Ile Val Glu Ala Ile Ser Pro Glu Leu Gly
100 105 110
Asn Arg Val Gln Arg Val Arg Val Gln Leu Pro Gly Leu Ser Gln Glu
115 120 125
Leu Leu Gln Lys Leu Arg Glu Lys Asn Ile Asp Phe Ala Ala His Ser
130 135 140
Gln Gln Glu Asp Ser Gly Asn Leu Leu Phe Asn Leu Ile Gly Asn Leu
145 150 155 160
Ala Phe Pro Leu Ile Leu Ile Gly Gly Leu Phe Leu Leu Ser Arg Arg
165 170 175
Gly Gly Ser Gly Gly Met Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Phe Pro Leu
180 185 190
Gly Phe Gly Gln Ser Lys Ala Lys Phe Gln Met Glu Pro Asn Thr Gly
195 200 205
Val Thr Phe Asp Asp Val Ala Gly Val Asp Glu Thr Lys Gln Asp Phe
210 215 220
Met Glu Val Val Glu Phe Leu Lys Lys Pro Glu Arg Phe Thr Ala Val
225 230 235 240
Gly Ala Arg Ile Pro Lys Gly Val Leu Leu Val Gly Pro Pro Gly Thr
245 250 255
Gly Lys Thr Leu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Gly Glu Ala Gly Val Pro
260 265 270
Phe Phe Ser Ile Ser Gly Ser Glu Phe Val Glu Met Phe Val Gly Val
275 280 285
Gly Ala Ser Arg Val Arg Asp Leu Phe Lys Lys Ala Lys Glu Asn Ala
290 295 300
Pro Cys Ile Val Phe Val Asp Glu Ile Asp Ala Val Gly Arg Gln Arg
305 310 315 320
Gly Thr Gly Ile Gly Gly Gly Asn Asp Glu Arg Glu Gln Thr Leu Asn
325 330 335
Gln Leu Leu Thr Glu Met Asp Gly Phe Glu Gly Asn Thr Gly Ile Ile
340 345 350
Val Val Ala Ala Thr Asn Arg Ala Asp Ile Leu Asp Ser Ala Leu Leu
355 360 365
Arg Pro Gly Arg Ser Asp Arg Gln Val Ser Val Asp Val Pro Asp Val
370 375 380
Arg Gly Arg Thr Glu Ile Leu Lys Val His Gly Ser Asn Lys Lys Phe
385 390 395 400
Asp Ala Asp Val Ser Leu Glu Val Ile Ala Met Arg Thr Pro Gly Phe
405 410 415
Ser Gly Ala Asp Leu Ala Asn Leu Leu Asn Glu Ala Ala Ile Leu Ala
420 425 430
Gly Arg Arg Gly Arg Thr Gly Ile Ser Ser Lys Glu Ile Asp Asp Ser
435 440 445
Ile Asp Arg Ile Val Ala Gly Met Glu Gly Thr Val Met Thr Asp Gly
450 455 460
Lys Ser Lys Ser Leu Val Ala Tyr His Glu Val Gly His Ala Val Cys
465 470 475 480
Gly Thr Leu Thr Pro Gly His Asp Pro Val Gln Lys Val Thr Leu Val
485 490 495
Pro Arg Gly Gln Ala Arg Gly Leu Thr Trp Phe Ile Pro Met Asp Asp
500 505 510
Pro Thr Leu Ile Ser Arg Gln Gln Leu Phe Ala Arg Ile Val Gly Gly
515 520 525
Leu Gly Gly Arg Ala Ala Glu Glu Ile Ile Phe Gly Asp Ser Glu Val
530 535 540
Thr Thr Gly Ala Ala Gly Asp Leu Gln Gln Ile Thr Gly Leu Ala Lys
545 550 555 560
Gln Met Val Val Thr Phe Gly Met Ser Asp Ile Gly Pro Trp Ser Leu
565 570 575
Met Asp Ala Ala Gln Ser Gly Asp Val Ile Met Arg Met Met Ala Arg
580 585 590
Asn Ser Met Ser Glu Lys Leu Ala Leu Asp Ile Asp Ser Ala Val Lys
595 600 605
Gln Leu Ser Asp Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Leu Gln Gln Val Arg Asp
610 615 620
Asn Arg Val Ala Met Asp Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Glu Lys Glu
625 630 635 640
Thr Leu Ser Gly Asp Glu Phe Arg Ala Ile Leu Ser Glu Phe Thr Glu
645 650 655
Ile Pro Val Glu Asn Arg Val Pro Pro Thr Pro Gln Ala Ala Val Pro
660 665 670
Val Glu His His His His His His
675 680
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:6
<400> 6
atggcgccat ccatgagtct tg 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:7
<400> 7
ctagaccggg acggcggc 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:8
<400> 8
gatgtgaagc ttcaggagtc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:9
<400> 9
caggtgcagc tgaaggagtc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:10
<400> 10
caggtgcagc tgaagcagtc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:11
<400> 11
aggttactct gaaagagtc 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:12
<400> 12
gaggtccagc tgcaacaatc t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:13
<400> 13
gaggtccagc tgcagcagtc 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:14
<400> 14
caggtccaac tgcagcagcc t 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:15
<400> 15
gaggtgaagc tggtggagtc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:16
<400> 16
gaggtgaagc tggtggaatc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:17
<400> 17
gatgtgaact tggaagtgtc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:18
<400> 18
gaggtgcagc tggaggagtc 20
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:19
<400> 19
ggccagtgga tagtcagatg ggggtgtcgt tttggc 36
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:20
<400> 20
gatgttttga tgacccaaac t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:21
<400> 21
gatattgtga tgacgcaggc t 21
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:22
<400> 22
gatattgtga taacccag 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:23
<400> 23
gacattgtgc tgacccaatc t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:24
<400> 24
gacattgtga tgacccagtc t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:25
<400> 25
gatattgtgc taactcagtc t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:26
<400> 26
gatatccaga tgacacagac t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:27
<400> 27
gacatccagc tgactcagtc t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:28
<400> 28
caaattgttc tcacccagtc t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:29
<400> 29
gacattctga tgacccagtc t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:30
<400> 30
ggatacagtt ggtgcagcat c 21

Claims (10)

1.一种小鼠细胞系30749-22杂交瘤。
2.一种抗FtsH2蛋白单克隆抗体，所述抗体由小鼠杂交瘤细胞系30749-22分泌产生。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2或3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的基因序列为SEQ ID NO:3所示，所述抗体的轻链可变区的基因序列为SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体与FtsH2蛋白特异性结合，所述FtsH2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述FtsH2蛋白为小麦FtsH2蛋白。
7.一种重组载体，所述重组载体包括所述抗体的重链可变区的基因序列和轻链可变区的基因序列。
8.一种重组有机体，所述重组有机体包括权利要求7中所述的载体和宿主有机体，所述宿主有机体为大肠杆菌。
9.根据权利要求2至6中任一项所述的抗体在用于制备筛选抗逆性状植物材料的试剂盒中的应用。
10.一种筛选抗逆性状植物材料的试剂盒，包括权利要求2至6中任一项的抗体。
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