CN117625671A

CN117625671A - 基因MsFtsH11在植物抵抗非生物胁迫方面的应用

Info

Publication number: CN117625671A
Application number: CN202311562202.0A
Authority: CN
Inventors: 李明娜; 朱晓溪; 曾祥翠; 李如月; 龙瑞才; 康俊梅; 杨青川
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2023-11-22
Filing date: 2023-11-22
Publication date: 2024-03-01
Anticipated expiration: 2043-11-22
Also published as: CN117625671B

Abstract

本发明公开了基因MsFtsH11在植物抵抗非生物胁迫方面的应用。通过将MsFtsH11基因转化入植物获得过表达的植株，从而提高植物抵抗非生物胁迫的能力，进一步促进植物生长，提高植物的品质和产量，为MsFtsH11在植物育种创新与利用中提供新的思路和技术基础。

Description

基因MsFtsH11在植物抵抗非生物胁迫方面的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和作物遗传育种技术领域，具体涉及基因MsFtsH11在植物抵抗非生物胁迫方面的应用。

背景技术

植物在生长过程中要应对各种环境胁迫，这些环境胁迫包括非生物胁迫，如干旱、涝害、极端温度、土壤盐渍、过度光照和有毒金属过量等。非生物胁迫中的干旱、土壤盐渍和极端温度是限制植物地理分布和影响农业植物生产的主要环境因素，最终可能会造成严重的经济损失和粮食危机。

金属蛋白酶FtsH是一种锚定在生物膜上的ATP和Zn²⁺依赖型金属蛋白酶，属于AAA蛋白酶家族，是有机物必需蛋白。FtsH蛋白在植物对抗非生物胁迫过程中有着重要作用，在拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、芸苔(Brassica)、大豆(Glycine max)等物种中已有许多研究，但FtsH蛋白在紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中的研究鲜有报道。

紫花苜蓿作为最优质的饲草，产量高，富含蛋白、维生素、矿质元素等营养物质，适口性好，有着“牧草之王”的称号。紫花苜蓿适应能力强，再生能力好，能够有效的保持水土和培肥土壤，有利于生态环境的保护和农业的可持续发展。

随着社会的发展，人们越发关注非生物胁迫给植物的品质和产量造成的严重损害，如何提高植物对非生物胁迫的耐受性成为作物遗传育种领域的热点。因此，紫花苜蓿抗逆基因的研究与应用具有重要意义。

发明内容

为了提高植物(例如紫花苜蓿、拟南芥)抵抗非生物胁迫的能力，促进植物生长，提高植物的产量和品质，本发明提供以下技术方案。

第一方面，本发明提供基因MsFtsH11在植物抵抗非生物胁迫方面的应用。

优选地，所述植物抵抗非生物胁迫是通过提高植物对于非生物胁迫的耐受力实现的。

优选地，所述非生物胁迫包括干旱胁迫、高温胁迫、渗透胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和光胁迫。

优选地，所述MsFtsH11在所述植物中过表达，从而提高MsFtsH11蛋白的表达量。

优选地，所述MsFtsH11的序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述植物选自烟草、拟南芥、蒺藜苜蓿或紫花苜蓿中的任意一种，优选为紫花苜蓿。

第二方面，本发明提供一种质粒在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，所述质粒携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在植物中过表达。

优选地，所述质粒为pTOPO-TA。

第三方面，本发明提供一种重组载体在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，所述重组载体携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

优选地，所述载体为pCAMBIA3301或pCAMBIA1302，优选为pCAMBIA3301。

优选地，所述植物选自烟草、拟南芥、蒺藜苜蓿或紫花苜蓿中的任意一种或多种，优选为紫花苜蓿。

第四方面，本发明提供一种细胞在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，所述细胞携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

所述细胞包括植物细胞、大肠杆菌感受态细胞(DH5α)和根癌农杆菌(GV3101/EHA105)。

第五方面，本发明提供一种愈伤组织在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，所述愈伤组织携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

优选地，所述愈伤组织的原植物体选自烟草、拟南芥、蒺藜苜蓿或紫花苜蓿中的任意一种或多种，优选为紫花苜蓿。

第六方面，本发明提供基因MsFtsH11在植物分子育种方面的应用，所述分子育种用于提高植物对非生物胁迫的耐受力。

第七方面，本发明提供MsFtsH11基因过表达植株的构建方法，其包括以下步骤：

(1)植物组织内RNA的提取和转录成cDNA.

(2)以cDNA为模版，经过PCR反应，获得MsFtsH11的CDS序列。

(3)构建MsFtsH11克隆载体。

(4)构建MsFtsH11基因表达载体。

(5)农杆菌的转化和鉴定。

(6)MsFtsH11基因转化入植物细胞，培养获得所述MsFtsH11基因过表达植株。

优选地，步骤(2)中的PCR引物为：

MsFtsH11F：TATGGCAACACTTCAAGCTTC(SEQ ID NO：2)

MsFtsH11R：ATTACGCCAATACAAGATCCC(SEQ ID NO：3)

优选地，步骤(3)中的PCR引物为M13F和M13R。

优选地，步骤(4)中的PCR引物为：

Ms3301F11-F1：

GAACACGGGGGACTCTTGACCATGGCAACACTTCAAGCTTC(SEQ ID NO：8)

Ms3301F11-RI：

AGAAATTTACCCTCAGATCTACCATTTACGCCAATACAAGATCCC(SEQ ID NO：9)

优选地，步骤(4)中的载体为pCAMBIA3301或者pCAMBIA1302，进一步优选为pCAMBIA3301。

优选地，步骤(5)中的农杆菌为GV3101或EHA105，进一步优选为EHA105。

本发明的有益效果：

本发明公开了MsFtsH11基因在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，为改善和提高植物的品质和产量提供了技术基础，为植物分子育种提供了新的方向。

附图说明

图1所示为MsFtsH11基因序列电泳检测图；

图2所示为非生物胁迫条件下MsFtsH11基因表达水平，其中A为干旱胁迫，B为渗透胁迫，C为盐胁迫，D为氧化胁迫；

图3所示为表达载体pCAMBIA3301-MsFtsH11阳性鉴定结果；

图4所示为MsFtsH11基因转化紫花苜蓿的结果，其中A表示共培养，B表示诱导愈伤组织，C表示诱导胚体，D表示芽生成，E表示生根发芽，F表示移至土中培养；

图5所示为MsFtsH11过表达紫花苜蓿植株阳性鉴定结果，其中M表示DNA maker，OE1～OE10表示不同的转基因紫花苜蓿，0表示空白对照；

图6所示为MsFtsH11过表达紫花苜蓿植株中MsFtsH11的表达量，其中OE1～OE10表示不同的转基因紫花苜蓿，(WT)表示野生型，-表示阴性对照，+表示阳性对照；

图7所示为紫花苜蓿干旱胁迫下叶片表型；

图8所示为紫花苜蓿干旱胁迫下叶片的DAB和NBT染色结果；

图9所示为紫花苜蓿干旱胁迫下叶片相对含水量；

图10所示为紫花苜蓿干旱胁迫下整体植株的表型；

图11所示为紫花苜蓿干旱胁迫下植株上叶片表型；

图12所示为紫花苜蓿过表达株系的叶片H₂O₂含量；

图13所示为紫花苜蓿过表达株系的叶片中丙二醛含量；

图14所示为紫花苜蓿过表达株系在干旱胁迫下的幼叶和成熟叶片的叶绿体结构分析。

图15所示为MsFtsH11基因过表达拟南芥纯合植株筛选、成长及种子收获结果；

图16所示为MsFtsH11过表达拟南芥植株阳性鉴定结果，其中M表示DNA maker，OE1～OE9表示不同的转基因拟南芥，0表示空白对照，-表示阴性对照，+表示阳性对照；

图17所示为MsFtsH11过表达拟南芥植株中MsFtsH11的表达量，其中At-OE1～At-OE9表示不同的转基因拟南芥；

图18所示为MsFtsH11过表达拟南芥干旱胁迫下的发芽率；

图19所示为MsFtsH11过表达拟南芥干旱胁迫下垂直板培养结果；

图20所示为MsFtsH11过表达拟南芥干旱胁迫下的根长。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。

需要说明的是，下述实施例中所用实验方法如无特别说明，均为本领域常规方法。

本发明实施例中采用的实验材料如下：

植物材料：紫花苜蓿中苜一号(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1)、拟南芥Col-0(WT)由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所饲草育种与栽培团队提供。

菌株：大肠杆菌感受态细胞(DH5α)、农杆菌GV3101、农杆菌EHA105。

载体：pTOPO-TA(北京赛音图科技有限公司)，植物表达载体pCAMBIA3301。

实验试剂如下：

Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞生物)；Eastep Super总RNA提取试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)；UnionScript First-strand cDNASynthesis Mix for qPCR(北京金沙生物科技有限公司)；Easy Pure Quick Ge1Extraction Kit(北京全式金生物技术有限公司)；过氧化氢(H₂O₂)测试盒(南京建成生物工程研究所)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所)。

实验仪器如下：

电泳仪(DYC)，pH计(CyberScan pH/Ion 510)，微量分光光度计(ImplenNP80Touch)，PCR仪(BIO-RAD C1000Touch)，RXZ智能型人工气候培养箱(RXZ)，移液枪(Gilson)，超净工作台(AIRTECH SW-CJ-2FD)，立式压力蒸汽灭菌锅(Clave SS-320)，ABI7300荧光定量PCR仪(7300)。

实验培养基如下：

SH3a培养基：BAP(1mg/mL)0.25mL/L；Sucrose 20g/L；2-4D(1mg/L)5mL/L；SHmedial 3.2g/L：SH vitamin(1000×)1mL/L；Myo-inositol 100mL/L；pH＝5.8。SH3a固体培养基在此基础上加入3g/L的植物凝胶，灭菌方法同上。

MSBK培养基：MS培养基4.44g/L；Sucrose 30g/L；Kinetin 1mg/L；BAP(1mg/mL)0.25mL/L；Phytagel 3g/L；PH＝5.8。121℃灭菌15min。

SH9a培养基：SH medial 13.2g/L；SH vitamin(1000×)1mL/L；Myoinositol100mL/L；Sucrose 10g/L；Agar 6～7g/L；pH＝5.8。121℃灭菌15min。

实施例1MsFtsH11基因的克隆

1.1紫花苜蓿中苜一号种子的萌发和水培苗的培养。将紫花苜蓿中苜一号种子用75％酒精消毒5min，蒸馏水冲洗5次，铺在装有湿润滤纸的玻璃皿中，放入4℃冰箱中春化2d，取出后移至人工气候培养箱中，在光照16h/黑暗8h、温度26℃/22℃、相对湿度60％、光照80％条件下萌发。种子萌发且长出两片子叶后，将幼苗移至1/2Hoagland营养液中，营养液每隔4d更换一次，共培养30d。收集成熟叶片后保存于-80℃超低温冰箱中。

1.2紫花苜蓿RNA的提取并逆转录成cDNA。

1.2.1提取RNA，具体步骤如下：

(1)将实验1.1中保存的紫花苜蓿叶片样品用组织研磨破壁机充分研磨，加入500μL RNA裂解液和500μL RNA稀释液，用移液枪混匀，室温放置5min后，13000×g离心5min。

(2)吸取上清700μL至新的离心管中，加入350μL无水乙醇，用移液枪吹打混匀。

(3)将上述液体移至离心柱中，13000×g离心1min。

(4)弃废液，加入600μL RNA洗液，13000×g离心1min。

(5)弃废液，加入50μL DNA酶I孵育液(按照试剂盒说明书配制)到吸附膜中央，室温放置15min。

(6)加入600μL RNA洗液，13000×g离心1min。

(7)弃废液，加入600μL RNA洗液，13000×g离心1min。

(8)弃废液，直接离心，13000×g离心2min。

(9)将离心柱转移至洗脱管上，在离心柱膜中央加入50μL无核酸酶水，室温放置2min，13000×g离心1min，测量RNA浓度(ng/μL)。

1.2.2cDNA的获取，具体步骤如下：

(1)基因组DNA去除。以实验1.2.1提取的RNA为模版，按照表1配制的反应体系去除紫花苜蓿的基因组DNA。

表1紫花苜蓿DNA去除反应体系

具体反应条件为：37℃ 5min，65℃2min。

(2)第一链cDNA合成。以(1)中的反应产物为模版，按照表2配制的反应体系进行cDNA的合成。

表2cDNA合成反应体系

反应条件为：25℃10min，50℃ 15min，85℃5min。

1.3MsFtsH11基因的克隆。

以实验1.2.2获得的紫花苜蓿cDNA为模板，MsFtsH11F和MsFtsH11R为引物(见表3)，按照表4配制的PCR反应体系，采用ExTaqDNA聚合酶进行PCR扩增，以获得MsFtsH11的CDS序列。

表3引物序列

表4PCR反应体系

具体PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，50.5℃30s，72℃ 2min，24cycles；72℃5min；4℃ 2h。

1.4PCR产物切胶回收。

将实验1.3得到的PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1)，对目的条带进行切胶回收，具体步骤如下：

(1)切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带放入干净离心管，称重。

(2)加入凝胶重量3倍的溶液GSB(试剂盒中药品)，于55℃水浴溶胶10min，确保胶完全融化。

(3)待(2)获得的溶液降至室温后，胶溶液加入离心柱，室温静置1min，10000×g离心1min，弃废液。

(4)加入650μL WB溶液(试剂盒提供)，10000×g离心1min，弃废液。继续10000×g离心2min，弃废液。

(5)将离心柱置于新的离心管中，开盖静置1min，使乙醇挥发干净，在离心柱中央加入65℃的30μL去离子水，室温静置1min。10000×g离心1min，测DNA浓度，-20℃保存。

1.5克隆载体pTOPO-TA-MsFtsH11的连接与转化。

具体实验步骤如下：

(1)克隆载体的连接。以1.4制备的MsFtsH11的CDS序列为样品，按照表5配制的连接体系，在37℃，15min条件下进行连接反应，构建克隆载体pTOPO-TA-MsFtsH11。

表5连接反应体系

(2)吸取5μL连接产物，加入装有500μL刚融化的大肠杆菌感受态的离心管中，轻轻混匀，冰上孵育5min，42℃热水浴60s，迅速转移至冰上，冰浴2min。

(3)向离心管中加入500μL不含抗生素的LB培养液，37℃ 200rmp振荡培养20min。

(4)吸取200μL的菌液涂在含有50mg/L Kan抗性的LB固体培养基上。倒放在37℃恒温培养箱中，过夜培养。

(5)用移液枪头随机挑取生长较好的单菌落于1ml含有50mg/L Kan抗性的LB液体培养基中，37℃ 200rmp振荡培养4h。

(6)以培养的菌液为模板，按照表6的PCR反应体系，使用载体上的通用引物M13F和M13R进行菌落PCR，鉴定阳性菌落。

表6PCR反应体系

具体PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃ 2min，34cycles；72℃5min；4℃ 2h。

(7)菌液PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，挑取阳性单克隆菌液送至北京天一辉远生物科技有限公司进行测序，并将测序正确的菌液中加入等体积的50％甘油，放置-80℃冰箱中保存。

测序结果显示，MsFtsH11基因(SEQ ID NO：1)序列长度为2367bp，与图1的检测结果一致。

实施例2非生物胁迫对MsFtsH11基因表达的影响

2.1紫花苜蓿中苜一号种子的萌发和水培苗的培养

具体步骤同实施例1中的实验1.1

2.2紫花苜蓿中苜一号的非生物胁迫处理及植物材料的获取

对30d的紫花苜蓿水培苗进行干旱胁迫(15％PEG 6000)、盐胁迫(200mM NaCl)、氧化胁迫(0.3％H₂O₂)。分别选择处理后0、2、4、6、8、12、24h的紫花苜蓿成熟叶片，速冻后放置于-80℃冰箱内保存。

2.3MsFtsH11基因表达量的测定

具体实验步骤如下：

2.3.1以实验2.2中保存的叶片为样品，按照实验1.2中的方法，提取不同干旱胁迫处理、不同时间点的叶片的RNA，并反转录为cDNA。

2.3.2设计MsFtsH11基因和紫花苜蓿内参基因(MsActin2)的qPCR引物，具体引物序列见表7。

表7引物序列

按照表8配置的qPCR反应体系，通过qRT-PCR技术测量MsFtsH11基因表达量。将2.3.1最终所得的cDNA稀释10倍，每个样品设计3次技术重复，进行qRT-PCR反应。

表8qRT-PCR反应体系

具体反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃ 31s，95℃15s，40cycles；60℃ 1min；95℃15s。反应结束后，数据采用2^-ΔΔcT法计算基因的相对表达量，利用ANOVA单因素方差进行显著性分析。结果见图2。

由图2可以看出，在所有这些胁迫下，MsFtsH11基因表达量都增加，干旱胁迫和盐胁迫时，在6h表达量达到最高峰，渗透胁迫和氧化胁迫时，分别在24h和12h时达到最高峰。这些结果表明MsFtsH11基因参与了植物的非生物胁迫响应。

实施例3MsFtsH11基因对紫花苜蓿抵抗干旱胁迫的影响

3.1MsFtsH11基因过表达载体的构建。

具体实验步骤如下：

(1)设计一对具有Nco I酶切位点的引物，将MsFtsH11基因按照正确的方向分别连接到植物表达载体pCAMBIA3301上。

(2)以实验1.5构建的含有正确MsFtsH11序列的pTOPO-TA-MsFtsH11质粒作为模板，以Ms3301F11-F1和Ms3301F11-R1为引物，扩增出含有Nco I酶切位点的MsFtsH11基因片段，回收纯化PCR产物。引物序列见表9。

表9引物序列

(3)按照表10中的载体酶切反应体系，将pCAMBIA3301载体进行酶切，然后将目的片段连接到酶切后的载体上，连接体系见表11。

表10载体酶切反应体系

具体酶切反应条件：37℃，2h。

表11连接反应体系

具体连接反应条件为：50℃，30min。

(4)按照实验1.5的转化方法，将上述连接反应产物转化入大肠杆菌DH5α感受态中，涂抹在含有卡那霉素抗性的LB板上培养过夜，挑选单克隆菌落摇菌并同时进行菌落PCR，阳性菌液送天一辉远公司进行菌液测序，序列完全正确的菌液保存甘油菌，并提取质粒，获得重组子，命名为：pCAMBIA3301-MsFtsH11。

3.2农杆菌GV3101和EHA105的转化和鉴定

使用高纯度质粒小量快速提取试剂盒提取pCAMBIA3301和pCAMBIA3301-MsFtsH11质粒，进行农杆菌转化。

具体过程如下：

(1)取农杆菌GV3101和EHA105感受态置于冰上融化。

(2)将pCAMBIA3301-MsFtsH11质粒分别加入融化的GV3101和EHA105感受态中，轻轻混匀，冰浴10min，液氮5min，37℃水浴5min，最后冰浴5min。

(3)加入700μL无抗生素的YEB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养4h。

(4)吸取50μL菌液涂抹至含有相应抗生素的YEB培养基上(Rif50mg/L和Kan 50mg/L)，避光倒置于28℃培养箱中培养2d。

(5)挑选单菌落，摇菌并同时进行菌落PCR鉴定，保存阳性菌液，PCR鉴定结果见图3。

3.3紫花苜蓿的遗传转化

(1)按照实验1.1的方法培养紫花苜蓿中苜一号的水培苗。

(2)将实验3.2中含有pCAMBIA3301-MsFtsH11的阳性农杆菌EHA105取出，于含有相应抗生素的YEB液体培养基中活化两次，200rpm，28℃。

(3)当上述菌液OD值在0.6～0.8之间时，室温离心5000r/min，10min，倒上清，收集菌斑。

(4)将离心的菌斑用SH3a液体培养基重悬至OD值在0.2～0.4之间。

(5)剪取紫花苜蓿中苜一号不嫩不老的叶片，置于10％次氯酸钠溶液中消毒8分种，倒出次氯酸钠溶液。

(6)用灭菌的双蒸水清洗叶片8次，每次1min。

(7)倒出双蒸水，加入SH3a液体培养基，淹没叶片，进行叶片超声处理，超声至叶片边缘出现深绿色即可。

(8)将SH3a液体培养基倒出，加入步骤5中的重悬菌液，淹没过叶片。

(9)进行抽真空，10min。

(10)28℃，转速70rpm摇晃15min。

(11)在超净台中将叶片取出，用灭菌后的滤纸将叶片正反面的水分吸干，将叶片正面朝上放置于SH3a固体培养基上，暗培养48h。

(12)将叶片转移至加入2mg/L头孢霉素和2mg/L草铵膦(PPT)的SH3a固体培养基，每2周转移至新配的培养板上。

(13)待2个月时间，出现愈伤组织后，将愈伤组织移至加入2mg/L头孢霉素和2mg/LPPT的MSBK固体培养基上，进行正常光照培养。

(14)待愈伤组织上长出绿色的芽点后，将愈伤组织移至加入2mg/L头孢霉素和2mg/L PPT的SH9a固体培养基上，等待生根长叶。

(15)将培养基中的幼苗转移至配制的营养土(营养土∶蛭石＝1∶1.5)中，套袋进行炼苗，约4天后打开套袋，进行阳性苗鉴定。

实验结果见图3，

3.4转基因紫花苜蓿的阳性鉴定

3.4.1转基因紫花苜蓿DNA水平的阳性鉴定

根据pCAMBIA3301载体序列以及MsFtsH11基因序列设计PCR引物35S和GUS；MsFtsH11F2和MsFtsH11R2两对引物，对转基因紫花苜蓿基因组进行DNA水平鉴定，结果见图4。

3.4.2转基因紫花苜蓿RNA水平的阳性鉴定

以紫花苜蓿内参基因(MsActin2)设计内参基因引物AtActinF/R、MtActinF/R和MsActinF/R，同时设计MsFtsH11基因的qPCR引物，qMsFtsH11F1和qMsFtsH11R1，通过qRT-PCR技术，对野生型以及阳性转基因紫花苜蓿植株进行MsFtsH11基因表达量测定，结果见图5。具体引物序列见表12。

表12紫花苜蓿阳性鉴定的引物序列

3.5转基因紫花苜蓿的干旱胁迫实验

植物材料：紫花苜蓿中苜一号野生型和实验3.4中的紫花苜蓿中苜一号过表达Ms-OE-1、Ms-OE-2、Ms-OE-4和Ms-OE-10。

实验试剂：甘露醇；PEG 6000；DAB染色剂；氯化硝基四氮唑兰(NBT染色剂)。

DAB染色液：0.05g DAB粉末溶于45mL蒸馏水，加入吐温水溶液20～25μL和2.5mL的200mM磷酸氢二钠(或者500μL的1M磷酸氢二钠)，用盐酸调制pH值为3.8(现配现用，避光)。

NBT染色液：0.1g NBT粉末溶于50mL pH＝7.5的磷酸缓冲液中(现配现用，避光)。

3.5.1将过表达紫花苜蓿进行扦插扩繁，待其长大后，剪去从顶端数第3或4位置的三复叶，将叶片一片一片放置在40mL的蒸馏水和40mL含有15％PEG 6000的蒸馏水中(每个处理3个重复，每个株系3个生物学重复)，处理4天后，进行DAB和NBT染色，结果见图7和图8。

具体染色方法为：将用蒸馏水清洗干净的样本浸泡在DAB和NBT染色液中，避光，室温下过夜染色。然后倒出染色液，将样本浸泡在无水乙醇中，并沸水浴30分钟，间歇摇晃。再将样本移至浸透了60％甘油的滤纸上，整理拍照。

由图7可以看出，对照组中，野生型和过表达株系没有明显的表型差异，而在干旱处理后，野生型从叶片中心开始出现泛黄表型，而过表达的三个株系叶片还是绿色。

DAB染色可以定位过氧化物酶活性部位。由图8可以看出，DAB染色叶片中，野生型的棕红色沉淀明显多于三个过表达株系，说明野生型受到严重的氧化损伤。

NBT染色可以定位超氧阴离子自由基O_2-产生的部位，由图8可以看出，NBT染色叶片中，野生型的蓝色沉淀也是明显多于三个过表达株系，说明野生型受到了严重的氧化损伤。

3.5.2测定过表达株系叶片中的相对含水量，结果见图9。

相对含水量计算方法如下：

取干旱处理后的叶片称量鲜重，记为W_f，将称重后的叶片放入装有9mL去离子水的离心管中，离心管缓慢摇晃48h，将叶片取出，用纸擦干表面水分，再次进行称量饱和鲜重，记为W_t，将称重后的叶片放入干净的信封袋里放入烘干箱，60℃烘干48h，测量烘干后的干重，记为W_d。按照以下公式计算叶片的相对含水量。

相对含水量(RCW)＝(W_f-W_d)/(W_t-W_d)*100％。

由图9可以看出，干旱处理后过表达株系叶片的相对含水量显著高于野生型，说明过表达株系比野生型更抗旱。

3.5.3观察过表达株系和野生型的叶片变化，结果见图10和图11。

由图10和图11可以看出，紫花苜蓿经过干旱处理后，野生型在处理后叶片出现卷曲萎蔫，从叶子外边缘开始颜色变浅，变萎蔫，而过表达株系叶片表型正常。

3.5.4测定过表达株系叶片中的H₂O₂含量，结果见图12。

参考过氧化氢(H₂O₂)测试盒说明书进行实验，具体实验步骤如下：

(1)准确称取3.5.1中的叶片样品重量，按照重量(g)∶体积(mL)＝1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水或PBS(pH7.0-7.4，0.1mol/L)，冰水浴条件下机械匀浆，于10000rpm条件下离心10min，取上清液的10％，匀浆后作为待测样本。

(2)按照表13配置样品溶液，混匀后于405nm处，1cm光径，双蒸水调零条件下，测定各样品管的吸光度值。根据以下公式计算叶片中的H₂O₂含量。

计算公式：叶片中H₂O₂含量(mmol/gprot)＝(A测定-A空白)/(A标准-A空白)*C标准/Cpr

表13过表达株系叶片中H₂O₂含量测定试剂配比

由图12可以看出，过表达株系叶片中H₂O₂含量显著低于野生型，说明过表达株系积累更少的活性氧，受到更少的氧化胁迫。

3.5.5测定过表达株系叶片中的丙二醛(MDA)含量，结果见图13。

参考丙二醛(MDA)测试盒说明书进行实验，具体实验步骤如下：

(1)取离心管，然后按照表14配置样品溶液，在离心管盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后于3500～4000rpm下离心10min，取上清，于532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定各离心管的吸光度值。按照以下公式计算叶片中的丙二醛(MDA)含量。

计算公式：组织中MDA含量(nmol/gprot)＝(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)*标准品浓度/待测样本蛋白浓度

表14过表达株系叶片中MDA含量测定试剂配比

由图13可以看出，紫花苜蓿过表达植株叶片中的丙二醛含量显著低于野生型，说明过表达株系积累更少的活性氧，受到更少的氧化胁迫。

3.5.6采集过表达株系和野生型的幼叶和成熟叶片，观察透射电镜下的叶绿体结构，结果见图14。

由图14可以看出，幼叶和成熟叶片进行透射电镜下的叶绿体结构观察显示，在幼叶中，处理后过表达株系的叶绿体结构完整，而且细胞形态正常，仅是基粒出现波浪状和叶绿体膜部分断裂，而野生型的叶绿体完全被破坏，细胞形态出现弯曲。成熟叶片中叶绿体的观察结果与幼叶中叶绿体的结果相似。但与幼叶相比，过表达株系成熟叶片的叶绿体被破坏的更严重，由此可见MsFtsH11基因在幼叶中发挥更重要的作用。

图7～图14说明，过表达MsFtsH11基因可以维持干旱胁迫后植株的叶绿体结构完整，减少植株受到的氧化损伤，从而比野生型更加抗旱。

实施例4MsFtsH11基因对紫花苜蓿抵抗干旱胁迫的影响

4.1MsFtsH11基因过表达载体的构建。

具体过程同实验3.1。

4.2农杆菌GV3101和EHA105的转化和鉴定

具体过程同实验3.2。

4.3拟南芥的遗传转化

(1)选取饱满的野生型Col-0(WT)的种子，消毒后种在1/2MS培养基上，培养7天后移至灭菌的营养土中，培养至抽苔，剪去主花轴，继续培养至长出更多的花序。

(2)将实验4.2中含有pCAMBIA3301-MsFtsH11阳性农杆菌GV3101取出，置于还有相应抗生素的YEB液体培养基中活化两次，200rpm，28℃。

(4)将菌斑用含有200μL/L silwet-77的5％蔗糖溶液重悬至OD值在0.4～0.5之间。

(5)将拟南芥WT的花序完全浸入步骤(4)的菌液中约4min。

(6)将拟南芥黑暗培养24h，然后转至正常光照培养。

(7)一周后再次进行步骤(2)～(6)。

(8)收取成熟的拟南芥种子，消毒后种在含有4mg/LPPT的1/2MS培养基上，筛选得到阳性转基因拟南芥，再转至到营养土中培养，收取T₁代种子。

(9)将T₁代种子进行消毒，种在含有4mg/L PPT的1/2MS培养基上，筛选得到纯合的株系，结果见图15。

4.4转基因拟南芥的干旱胁迫实验

4.4.1转基因拟南芥DNA水平的阳性鉴定

具体过程同实验3.4.1，结果见图16。

4.4.2转基因紫花苜蓿RNA水平的阳性鉴定

具体过程同实验3.4.2，不同之处在于拟南芥内参基因是AtActin2。野生型和阳性转基因拟南芥MsFtsH11基因表达量的测定结果见图17。

4.5转基因拟南芥的干旱胁迫实验

4.5.1发芽率实验

将拟南芥野生型Col-0(WT)和拟南芥过表达At-OE-7、At-OE-8的纯合T2代种子进行消毒后，点在1/2MS、含有300mM甘露醇的1/2MS和含有350mM甘露醇1/2MS培养基上，每个处理3个重复。点好种子后的培养基4℃春化2d后，放置在光照培养箱中培养，每天中午统计发芽率，结果见图18。

由图18可以看出，在对照组内，野生型和过表达拟南芥发芽率无显著差异；在300mM甘露醇处理下，在第2d开始过表达株系的发芽率显著高于野生型，在第3d时发芽率的显著性差异达到最高，在5天开始野生型和过表达株系发芽率无显著性差异。在350mM甘露醇处理下，在第2d开始过表达株系的发芽率显著高于野生型，在第3d和4d时显著性差异达到最高，在5天开始，一个株系的过表达At-OE-8与野生型的发芽率无显著性差异，而At-OE-7的发芽率仍然显著高于野生型。说明在干旱胁迫下，MsFtsH11基因可以显著提高拟南芥的发芽率。

4.5.2垂直板实验

将拟南芥野生型Col-0(WT)和拟南芥过表达At-OE-6、At-OE-7、At-OE-8的纯合T2代种子进行消毒后，点在1/2MS和含有350mM甘露醇1/2MS培养基上，每个处理3个重复。点好种子后的培养基4℃春化2d后，竖直放置在光照培养箱中培养，观察拟南芥干旱处理后的根长变化，结果见图19和图20。

由图19可以看出，对照组中，过表达和野生型生长没有差异，而在干旱处理条件下，过表达株系的生长状况优于野生型株系。

由图20可以看出，对照组中无显著性差异，而在处理组中，过表达三个株系的根长都显著高于野生型，其中At-OE-7和At-OE-6的根长平均值达到了0.5cm左右，而野生型受胁迫影响严重，根长均值不到0.2cm。

图19和图20说明，在干旱胁迫下，MsFtsH11基因可以显著促进拟南芥的生长。

图18～图20说明MsFtsH11基因有利于提高拟南芥的耐旱性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims

1.基因MsFtsH11在植物抵抗非生物胁迫方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述非生物胁迫包括干旱胁迫、高温胁迫、渗透胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和光胁迫。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述MsFtsH11的序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述植物选自烟草、拟南芥、蒺藜苜蓿或紫花苜蓿中的任意一种，优选为紫花苜蓿。

6.一种质粒在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，其特征在于：所述质粒携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

7.一种重组载体在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，其特征在于：所述重组载体携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

8.一种细胞在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，其特征在于：所述细胞携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

9.一种愈伤组织在植物抵抗非生物胁迫方面的应用，其特征在于：所述愈伤组织携带基因MsFtsH11，所述MsFtsH11在所述植物中过表达。

10.基因MsFtsH11在植物分子育种方面的应用，其特征在于：所述分子育种用于提高植物对非生物胁迫的耐受力。