CN102277368B - 鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统，其特征在于所述系统包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组，其中至少一个所述粘粒的复制非必须区中插入有外源基因。本发明还涉及鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统的构建方法和应用。

Description

鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及病毒疫苗株感染性克隆领域，具体地，涉及鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆领域，更具体地涉及鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性重组克隆系统，及其构建方法和应用。

背景技术

鸭病毒性肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭瘟病毒。能引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。但对DEV的研究相对于其它疱疹病毒而言相对比较少。故第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒^[1]，而未能进一步将其进行分类。直到最近，其全序列才被全部测通^[2](GeneBank EU082088)。

自上世纪80年代开始用痘病毒作为活疫苗载体研究以来，用痘病毒、腺病毒和疱疹病毒等作为活疫苗载体的研究已有大量报道。疱疹病毒基因组巨大，非必须基因多，可容纳较大片段的外源基因的插入。但鸭病毒性肠炎病毒复制非必须区的研究到目前仍是空白。

发明内容

将疱疹病毒的基因组分段克隆到粘粒或质粒中，并用这些含有相互重叠区的基因组DNA片段转染相应细胞拯救出病毒是研究疱疹病毒的几种途径之一，且已有大量报道。本研究成功在DEV疫苗株基因组中筛选出3个复制非必须区。

具体内容如下：

1.构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，所述方法包括：

1)切断所述鸭病毒性肠炎病毒的DNA，

2)将切断后的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段连接到粘粒上，

3)选择多个粘粒组成所述鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统，其中每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组，和

4)将外源基因插入至少一个所述粘粒中的复制非必须区。

2.以上1所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，其特征在于所述粘粒是Fosmid，优选为pCC1 Fos。

3.以上1或2所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统的方法，其特征在于在所述鸭病毒性肠炎病毒是鸭病毒性肠炎病毒CVCCAV1222(GeneBank EU082088)。

4.以上1-3中任一项所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，其特征在于所述多个粘粒是5个粘粒，优选地，所述5个粘粒分别为pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4和pFOS5，其中克隆的鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段的序列分别为鸭病毒性肠炎病毒CVCCAV1222(GeneBank EU082088)的1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位。

5.以上1-4中任一项所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，其特征在于所述复制非必须区位于pFOS1中的UL45和UL46基因之间，pFOS1中的UL41基因内，或pFOS5中的US7和US8基因之间。

6.根据以上1-5中任一项所述方法构建的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒。

7.一种鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒，其特征在于所述系统或试剂盒包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组，其中至少一个所述粘粒的复制非必须区中插入有外源基因。

8.以上6或7的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒用于构建重组鸭病毒性肠炎病毒的应用。

9.利用以上1-5中任一项的方法或利用以上6或7的系统或试剂盒获得的重组鸭病毒性肠炎病毒株，例如rDEVul4546，其保藏号为CCTCCV201012；rDEVus78，其保藏号为CCTCC V201010；和rDEVul41，其保藏号为CCTCC V201011。

10.以上9的重组鸭病毒性肠炎病毒株在制备用于预防所述鸭病毒性肠炎病毒感染所引起的疾病的药物中的应用。

在以上1中所述的方法中，步骤2)中的切断后的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段可以通过在两端连接所述鸭病毒性肠炎病毒中所不含或只含有少数几个酶切位点的内切酶序列，诸如Fse I-Sbf I-Pme I接头而连接到粘粒上。

在以上7中所述的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒中，所述鸭病毒性肠炎病毒基因片段两端可以连接有所述鸭病毒性肠炎病毒中所不含或只含有少数几个酶切位点的内切酶序列，诸如Fse I-SbfI-Pme I接头；所述粘粒可以是Fosmid，优选为pCC1 Fos；所述鸭病毒性肠炎病毒可以是鸭病毒性肠炎病毒CVCC AV1222(GeneBank EU082088)；所述多个粘粒可以是5个粘粒，优选地，所述5个粘粒中克隆的鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段的序列分别为鸭病毒性肠炎病毒CVCCAV1222(GeneBank EU082088)的1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位；所述外源基因可以是eGFP-Kan表达框架。

通过对三株重组病毒在体内和体外生长特性的检测来看，在DEV基因组中的这三个位点插入外源基因对其影响有些不同。用其对鸭进行一次免疫后均能提供与原疫苗株DEV相当的免疫效果。

rDEVul4546，即在DEV基因组的UL45和UL46之间插入eGFP-Kan表达框架构建成功的重组病毒。此重组病毒在体外的生长滴度相对于原DEV有些降低，但其最高生长滴度Log _TCID50/ml仍能达到7。完全能满足以10⁵免疫鸭的效果，且用其免疫的SPF(无特定病原动物)鸭保护率达到90％。所以在DEV中的这一位点是将来构建重组病毒，制备以DEV为载体的弱毒活疫苗的理想位点之一。

rDEVus78，即在DEV基因组的US7和US8之间插入eGFP-Kan表达框架构建成功的重组病毒。DEV的US区由IRS-US-TRS构成，与其他α疱疹病毒的US区的构成有一些不同。至今为止，未见有在疱疹病毒US7和US8中插入外源基因构建重组病毒的报道。本研究中构建的rDEVus78，一次免疫后，能给SPF鸭提供100％的免疫保护。且其在次代鸡胚成纤维细胞(CEF)中的生长滴度Log _TCID50/ml能达到7.05，所以，US7和US8基因之间是DEV构建表达外源基因重组病毒的理想位点之一。

rDEVul41，即在DEV基因组的UL41中插入eGFP-Kan表达框架构建成功的重组病毒。UL41编码宿主关闭蛋白(virion host shutoff(vhs))。此蛋白有核酸酶活性，可特异性的降解宿主细胞的mRNA。rDEVul41在CEF上的复制滴度比原DEV高3.16倍，其Log _TCID50/ml达到7.8。用其免疫SPF鸭，其免疫效率与DEV疫苗株相当，均为100％。所以，UL41是DEV构建表达外源基因重组病毒的理想位点之一。

本研究用DEV感染性克隆的方法成功构建三株重组病毒，在DEV疫苗株基因组中筛选出三个复制非必须区，三个位点均可作为DEV插入外源抗原的位点。在国内外尚属首次。

附图说明

图1：DEV DNA片段电泳图谱，其中M1：λ-Hind III消化分子标记(digest Marker)，M2：DNA MWM XV分子标记，1和2：38-48Kb DNA，左图：普通电泳；右图：脉冲电泳；

图2：pCC1Fos1图谱；

图3：DEV感染性克隆及突变粘粒示意图。A，DEV基因组结构及突变区域相应基因结构示意图；B，感染性克隆粘粒在基因组中相应位置示意图；C、D、E，eGFP-Kan表达框架在相应粘粒中插入位置示意图；

图4：拯救毒dDEV与原DEV疫苗株病毒基因组分别用BamH I、EcoRI、BbvC I酶切后的脉冲电泳图谱，其中DEV：原DEV疫苗株，dDEV：拯救出的三株病毒，M1：低范围PFG分子标记(Low Range PFG Marker)；M2：DL15000分子标记；M3：λ-Hind III消化分子标记(λ-Hind III digestMarker)；

图5：质粒图谱，其中A，pSI-eGFP；B，pMOD-6；和C，pMeGFP；

图6：重组病毒荧光图片及第十代重组病毒与原DEV比较PCR检测电泳图，其中DNA Marker为DL15000；

图7：rDEVul4546，rDEVul41和rDEVus78与原DEV生长曲线结果图；

图8：rDEVul4546，rDEVul41和rDEVus78与原DEV对30日龄SPF鸭免疫保护结果图。

生物保藏

鸭病毒性肠炎病毒株(Anatid herpesvirus 1)rDEVus78、rDEVul41和rDEVul4546于2010年5月19日保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC V201010、CCTCC V201011和CCTCC V201012。

具体实施方式

实施例1.DEV疫苗株基因组Fosmid文库的构建

按EPICENTRE公司“CopyControl Fosmid Library Production Kit”试剂盒说明书构建DEV基因组的Fosmid文库。方法如下，将DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222)(GeneBank EU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，目录编号AV1222；购自中国兽医药品监察所)DNA用物理方法即用25号针头(购自上海治宇医疗器械有限公司)抽吸多次进行切断处理，用T4DNA聚合酶(T4DNA Polymerase)(购自New England Biolabs及碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)(购自New England Biolabs)对DNA片段进行末端平滑化及去磷酸化处理，脉冲电泳(用Bio-Rad公司CHEFXA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为：电泳缓冲液位0.5xTBE，胶浓度为1％，程序为2K-80K。)，回收38kbp-48kbp之间的DNA片段(图1)。将回收后的DEV DNA片断两端加上Fse I-SbfI-Pme I接头，精制后连接到pCC1 Fos(购自EPICENTRE，图谱见图2)载体上，4℃过夜连接。对混和液进行包装，转染大肠杆菌EPI300(购自EPICENTRE)。对文库滴度进行确认，其试验过程如下：将包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10^-2，10^-4，10^-5，10^-6四个稀释度的稀释液10μl感染100μl EPI300菌株，将此菌涂于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板，37℃过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为3.8x10⁵cfu/lib。即成功构建DEV的fosmid文库。

实施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的选择

文库构建成功后，挑取286个克隆提取粘粒，用碱裂解法^[5]提取粘粒，送大连宝生物公司对插入pCC1 Fos中的DEV DNA片段末端进行测序，测序引物序列如下：

Primer 1：TAATACGACTCACTATAGGG

Primer 2：GCCAAGCTATTTAGGTGAGA

经过末端测序的分析，共得到插入片段两端都连接有完整Fse I-SbfI-Pme I接头的克隆250个。从这250个克隆中选取多组5粘粒组合。其中每组中克隆的DEV DNA片段两端都含有Fse I-Sbf I-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组。

实施例3.病毒拯救

用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse I、Sbf I或Pme I内切酶(均购自New England Biolabs)对所选择的粘粒进行线性化处理，反应条件如下：Sbf I内切酶20U(也可以使用Fse I或Pme I内切酶)，粘粒10μg，37℃作用1小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制备转染用DEV DNA。

参照Reddy SM(2002)的磷酸钙方法将5段DEV DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF)^[3]，经多次重复，其中有3组5粘粒组合转染4-6天后可见CEF出现DEV病毒典型病变，选取重复性较好的一组5粘粒组合进行后续实验。该粘粒组合相对于DEV基因组的位置如图3B所示。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为dDEV，用此dDEV与原DEV病毒分别接种次代CEF。CEF的制备方法如下：取9-10日龄SPF鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25％的胰酶(4mL/胚)在37℃水浴中消化4-5min，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗(青霉素100u/mL，链霉素100mg/mL)的M199营养液(购自HyClone)，吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成10⁶-10⁷细胞/毫升的细胞悬液，最后分装于培养转瓶中37℃培养。于转瓶中培养；待细胞病变达到100％时，收集培养液；4℃6000g离心10min，去除细胞碎片；取上清50000g离心2h富集病毒；然后经20％和60％蔗糖密度梯度离心，50000g离心2h，回收20％和60％中间层；之后经50000g离心2h超速离心脱糖处理获得纯化好的病毒。提取病毒全基因组DNA ^[4]，分别用BamH I、EcoR I和BbvC I(均购自New England Biolabs)对原疫苗株DEV和dDEV进行酶切。反应条件如下：分别取BamH I、EcoR I和BbvC I各20U，分别与DEV基因组DNA8μg混和，于50μl体系中37℃作用1h。用Bio-Rad公司CHEF

XAPulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为：电泳缓冲液位0.5xTBE，胶浓度为1％，程序为2K-70K。拯获的病毒酶切图谱和原病毒相同，如图4所示。说明所选择的5粘粒组成功拯救DEV病毒。

实施例4.突变粘粒的构建

在本研究室已建立的5粘粒感染性克隆的平台上，分别在pFOS1中UL45、UL46基因间及UL41中，pFOS5中US7、US8基因间插入eGFP-Kan表达框架，构建3个突变粘粒，pFOS1ul4546gfp，pFOS 1ul41gfp和pFOS5us78gfp。过程简述如下：

用引物Pegfp1(5’-CGA TCT AGA GGG CGG AGC CTA TGG AAA A-3’)和Pegfp2(5’-CGA TCT AGA CAG CCC GGA TCC TTA TCG A-3’)从pSI-eGFP(如图5A所示)(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)中扩增eGFP表达框架，用加在引物两端的Xba I位点将其克隆入pMOD-6(如图5B所示)(购自Epicentre公司)中，获得pMeGFP质粒(如图5C所示)。然后用带有相应同源臂的引物扩增eGFP-Kan表达框架，引物如下：

Pul4546m1(5’-AAT TGG TAA TAA TTG ATT TAG TTT TAA ATA ATA AAC AAT AAA CAA TCT GGC GTT TCG GTG ATG ACG GTG AA-3’)，

Pul4546m2(5’-ACT TGT TAT TTG TAT GCG TGT TTC TAC CCA TCT TAA TAA AAT TAC TAC AAG CGA GTC AGT GAG CGA GGA A-3’)，

Pus78m1(5’-CAT CCA AAT ATA TTT GTA CAT GAG GTA ATA GGC TAT GGG TGG AGC GCG TTT CGG TGA TGA CGG TGAA-3’)，

Pus78m2(5’-CGC ATA ATA CAG TTA ACC AGG CTG CAC ACT TAA ATTAGT ACA GAT CAG CGA GTC AGT GAG CGA GGAA-3’)，

Pul41m1(5’-CTA GAC GAT GAG GAT GAA GCA TTA GAA ACT GCA TGT AAA GAT GAA GGA GCG TTT CGG TGA TGA CGG TGA A-3’)，

Pul41m2(5’-TAT AAT ACT CAT GCA TAT TCC GTG GTT TAA TTT GGG CAT GTC AGG TCT AGC GAG TCA GTG AGC GAG GAA-3’)。

下划线部分为同源臂。并用Gene Bridges公司的Counter-Selection BACModification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入相应粘粒的相应位置，如图3所示。

实施例5.重组病毒的拯救

用Qiagen公司的中量提试剂盒提取上述获得粘粒的DNA。用Fse I或SbfI内切酶(分别购自New England Biolabs)将所用粘粒线性化处理，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制备转染用DEV DNA。参照Reddy SM(2002)的方法分别用pFOS1ul4546gfp，pFOS1ul41gfp和pFOS5us78gfp三个突变的粘粒之一与5粘粒组中的另外四个粘粒共转染次代CEF^[3]，(CEF制备方法如实施例3中所述。)转染4-7天后可观察到GFP的表达，之后可见CEF出现DEV病毒病变。分别拯救出rDEVul4546，rDEVul41和rDEVus78表达绿色荧光的三株重组DEV(图3)^[3]。将以上三株重组病毒连续传代，直至第十代未见绿色荧光表达异常。提取第十代重组病毒DNA，用如下鉴定引物，以PCR方法进行鉴定，未见有缺失发生(图6)。引物如下：

Pul4546D1(5’-GAT GGT TTG GCG TTT GGT-3’)，

Pul4546D2(5’-CAC TTG GCT CTG TGG CTG-3’)，

Pus78D1(5’-ACG CAAATTATG TCG TTG TT-3’)，

Pus78D2(5’-TTG AGG TTC CGTAGT CTG G-3’)

Pul41D1(5’-CGG CTT GGT AGA TTT GAG G-3’)，

Pul41D2(5’-TTC GCT AGAAAC GTA GCA TAG TC-3’)

实施例6.重组病毒生长曲线滴定

将DEV和三株拯救的重组病毒以MOI 0.01接种次代CEF，每24小时收集上清和细胞。-80℃冻存。待收集完全后冻融一次，4℃，1000g离心10分钟。取上清于96孔板中滴定其TCID50。

其生长曲线如图7所示。从结果可见，重组毒rDEVul4546、rDEVul41、rDEVus78和原DEV的生长趋势均相似，在感染后72小时达到最高滴度。在最高滴度时，DEV、rDEVul4546、rDEVul41和rDEVus78的生长滴度Log _TCID50/ml分别是7.3、7、7.8、7.05，可见rDEVul4546和rDEVus78的生长滴度有4倍和17倍的降低。但这是整个生长曲线测定过程中最大的差别。而rDEVul41生长滴度比原DEV高3倍左右，这是研究者们之间未能预料到的。

实施例7.动物实验

将原DEV病毒与3株重组病毒分别以10⁵PFU免疫4周龄SPF鸭，每组10只。2周后用100DLD50的DEV强毒攻击，观察重组病毒对DEV强毒的保护效果。

其结果如图8所示。DEV疫苗株、rDEVul41和rDEVus78能提供100％保护。rDEVul4546对DEV强毒的保护率为90％。

参考文献

1.Fauquet CM，Mayo MA，Maniloff J，et al.Virus Taxonomy：EighthReport of the International Committee on Taxonomy of Viruses(ElsevierAcademic Press，California，2005)，p.208

2.Li Y.，Huang B.b，Ma X.，Wu J.，et al.Molecular characterization of thegenome of duck enteritis virus.Virology，2009，391(2)：151-161.

3.Reddy SM.，Lupiani B.，Gimeno IM.，et al.Rescue of a patho genicMarek’s disease virus with overlapping cosmid DNAs：use of a pp38 mutant tovalidate the technology for the study of gene function.Proc.Natl.Acad.Sci.，2002，99：7054-7059.

4.Morgan RB，John L.Cantello；Caroline H.McDermott.1990.Transfection of Chicken Embryo Fibroblasts with Marek′s Disease Virus DNA.Avian Diseases，Vol.34，No.2.(Apr.-Jun.，1990)，pp.345-351.

5.Sambrook J，Russel DW.Plasmids and their usefulness in molecularcloning.Molecular cloning(3rd ed).Cold Spring Harbor Laboratory Press.2002，pp：26-32

Claims (6)

1.一种鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统，其特征在于所述系统包括5个pCC1Fos粘粒pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4和pFOS5，所述粘粒中分别克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CVCC AV1222的基因片段1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组，其中至少一个所述粘粒的复制非必须区中插入有外源基因，所述复制非必须区位于pFOS1中的UL45和UL46基因之间，pFOS1中的UL41基因内，或pFOS5中的US7和US8基因之间。

2.权利要求1的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统用于构建重组鸭病毒性肠炎病毒的应用。

3.利用权利要求1的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统获得的重组鸭病毒性肠炎病毒株，其为rDEVu14546，保藏号为CCTCC V201012。

4.利用权利要求1的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统获得的重组鸭病毒性肠炎病毒株，其为rDEVus78，其保藏号为CCTCC V201010.

5.利用权利要求1的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统获得的重组鸭病毒性肠炎病毒株，其为rDEVu141，其保藏号为CCTCC V201011。

6.权利要求3-5中任一项的重组鸭病毒性肠炎病毒株在制备用于预防所述鸭病毒性肠炎病毒感染所引起的疾病的药物中的应用。

Images