CN102277367B

CN102277367B - 鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆系统及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN102277367B
Application number: CN 201010207207
Authority: CN
Inventors: 陈化兰; 柳金雄; 步志高; 姜永萍
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2010-06-13
Filing date: 2010-06-13
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2030-06-13
Also published as: HK1162598A1; CN102277367A

Abstract

本发明涉及一种鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统，其特征在于所述系统包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组。本发明还涉及该种鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统的构建方法和应用。

Description

鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆系统及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及病毒疫苗株感染性克隆领域，具体地，涉及鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆领域，更具体地涉及鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆系统及其构建方法和应用。

背景技术

鸭瘟又名鸭病毒性肠炎，由鸭瘟病毒，又称鸭病毒性肠炎病毒(Duckenteritis virus，DEV)引起，是鸭、鹅及其它雁形目禽类一种急性、接触性、败血性传染病，以血管损伤、消化道出血坏死、淋巴器官受损和实质性器官退形性变化为主要特征。临床上除急性病例外，DEV还可在三叉神经和淋巴组织形成潜伏感染^[1]。在自然条件下，本病主要发生于鸭，不同年龄、性别和品种的鸭均有易感性。1959年，我国首次报道发现该病，之后广泛流行于我国华南、华中、华东等养鸭业较发达地区，造成了重大的经济损失。DEV是线性双股DNA病毒。第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒。因相对于其它疱疹病毒，DEV的研究相对滞后，其具体分类地位仍未确定。直到最近几年，DEV疫苗株的基因组序列才被陆续报道。Li等报道了DEV疫苗株全基因组的测序和分析结果。其基因组大小约为158Kb，约编码78个蛋白(GeneBank EU082088)。通过对DEV疫苗株基因组基因构成及结构分析，DEV被认为是α疱疹病亚科中的中间型病毒，与水痘病毒属成员更为相近^[2]。而同为禽类疱疹病毒的MDV(马立克病毒)和HTV(火鸡疱疹病毒)属于马立克病毒属，ILTV(传染性喉气管炎病毒)和PsHV(鸽疱疹病毒)为传染性喉气管炎病毒属。将疱疹病毒的基因组分段克隆到粘粒或质粒中，并用这些含有相互重叠区的基因组DNA片段转染相应细胞拯救出病毒是研究疱疹病毒的几种途径之一，且已有大量报道^[3-10]。

粘粒是一种能容纳约30Kb-45Kb大小外源DNA的载体，常用作构建复杂基因组的基因文库。其中传统Cosmid的复制子与普通质粒复制子相同，即比含有如colE1复制子的质粒多出1-2个COS位点。而Fosmid是最近数年来才广泛用于基因文库构建的一种新型粘粒，它是以BAC(细菌染色体)为骨架。用其构建的文库保真性和稳定性较之Cosmid好。

相对于其它疱疹病毒，DEV的研究比较滞后，其主要原因之一是缺少行之有效的构建DEV重组病毒的技术平台。常用于构建疱疹病毒重组病毒的方法有三种。一种是同源重组；第二种是将病毒基因组插入BAC中，然后在BAC上构建突变，用其转染相应细胞拯救出重组病毒；第三种是将含有相互重叠区的疱疹病毒基因片段分别插入粘粒中，并在其相应区段上构建突变，再用其共转染相应细胞拯救出重组病毒。然而对于DEV这种基础研究缺乏，分类不清楚，非必需基因未知的病毒而言，用第一或第二种方法构建重组病毒工作量大，且效率低。而第三种方法的难点在于多粘粒感染性克隆的建立，如果这个平台构建成功，将能快速有效的构建重组病毒。可见此研究为DEV的相关基础研究奠定了坚实的基础。

发明内容

本研究中将DEV疫苗株基因组用物理方法打碎，并在基因片段两端连接上DEV中所不含或只含有少数几个酶切位点的内切酶序列，用Fosmid为载体，首次成功构建了DEV疫苗株基因Fosmid文库。用Fosmid构建疱疹病毒基因组文库，及构建DEV疫苗株粘粒文库在国内外均属首次。在对该文库进行全基因组测序的同时，从中挑选出合适的克隆组合，即5个克隆有DEV疫苗株基因片段，且相互含有重叠区域，并拼接覆盖DEV疫苗株全基因组的粘粒。用这5个片段共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF)成功拯救出完整的DEV。通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒，并提取全基因组DNA，用多种限制性内切酶进行酶切，脉冲电泳分析，其图谱与原DEV疫苗株完全相同。证明DEV疫苗株多粘粒感染性克隆平台构建成功。用这种途径构建DEV的感染性克隆，在国内外尚属首次。

发明的具体内容包括：

1.一种鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒，其特征在于所述系统或试剂盒包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组。

2.以上1所述的鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒，其中所述鸭病毒性肠炎病毒基因片段两端连接有所述鸭病毒性肠炎病毒中所不含或只含有少数几个酶切位点的内切酶序列，诸如Fse I-Sbf I-Pme I接头。

3.以上1所述的鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒，其中所述粘粒是Fosmid，优选为pCC1 Fos。

4.以上1所述的鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒，其中所述鸭病毒性肠炎病毒是鸭病毒性肠炎病毒CVCC AV1222。

5.以上1所述的鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒，其中所述多个粘粒是5个粘粒，优选地，所述5个粘粒中克隆的鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段的序列分别为鸭病毒性肠炎病毒CVCCAV1222(GeneBank EU082088)的1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位。

6.一种构建以上1-5中任一项所述的鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)切断所述鸭病毒性肠炎病毒的DNA，

2)将切断后的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段连接到粘粒上，

3)选择多个粘粒组成所述鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒，其中每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组。

7.粘粒在构建疱疹病毒感染性克隆中的应用，其中所述粘粒优选是Fosmid，更优选是pCC1 Fos。

8.以上1-5的系统或试剂盒或以上6的方法在拯救鸭病毒性肠炎病毒中的应用。

9.利用以上1-5的系统或试剂盒或以上6的方法拯救获得的重组鸭病毒性肠炎病毒株。

10.以上9的重组鸭病毒性肠炎病毒株在制备用于预防所述鸭病毒性肠炎病毒感染所引起的疾病的药物中的应用。

其中，在以上6所述的方法中，步骤2)中的切断后的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段可以通过在两端连接所述鸭病毒性肠炎病毒中所不含或只含有少数几个酶切位点的内切酶序列，诸如Fse I-Sbf I-Pme I接头而连接到粘粒上；所述粘粒可以是Fosmid，优选为pCC1 Fos；所述鸭病毒性肠炎病毒可以是CVCC AV1222(GeneBank EU082088)；所述多个粘粒可以是5个粘粒；所述5个粘粒中克隆的鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段的序列可以分别为鸭病毒性肠炎病毒CVCC AV1222(GeneBank EU082088)的1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位。。

本发明还涉及利用以上6所述的方法制备的鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒，及该鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒在拯救鸭病毒性肠炎病毒中的应用；使用该鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统或试剂盒拯救获得的重组鸭病毒性肠炎病毒株；以及该重组鸭病毒性肠炎病毒株在制备用于预防所述鸭病毒性肠炎病毒感染所引起的疾病的药物中的应用。

附图说明

图1：DEV DNA片段电泳图谱，其中M1：λ-Hind III消化分子标记(digest Marker)，M2：DNA MWM XV分子标记，1和2：38-48Kb DNA，左图：普通电泳；右图：脉冲电泳；

图2：pCC1 Fos1图谱；

图3：DEV疫苗株基因组的结构及感染性克隆示意图，其中A：DEV疫苗株基因组含有一个UL区和一个两端分别有一个末端和中间重复序列的US区。B：感染性克隆5粘粒的相应位置示意图；

图4：拯救毒dDEV与原DEV疫苗株病毒基因组分别用BamH I、EcoRI、BbvC I酶切后的脉冲电泳图谱，其中DEV：原DEV疫苗株，dDEV：拯救出的三株病毒，M1：低范围PFG分子标记(Low Range PFG Marker)；M2：DL15000分子标记；M3：λ-Hind III消化分子标记(λ-Hind III digestMarker)；

图5：拯救毒dDEV与原DEV疫苗株病毒生长曲线；和

图6：拯救毒dDEV与原DEV疫苗株病毒在次代CEF上产生的病变。

具体实施方式

实施例1.DEV疫苗株基因组Fosmid文库的构建

按EPICENTRE公司“CopyControl Fosmid Library Production Kit”试剂盒说明书构建DEV基因组的Fosmid文库。方法如下，将DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，目录编号AV1222；购自中国兽医药品监察所)DNA用物理方法即用25号针头(购自上海治宇医疗器械有限公司)抽吸多次进行切断处理，用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase)(购自New England Biolabs)及碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)(购自New England Biolabs)对DNA片段进行末端平滑化及去磷酸化处理，脉冲电泳(用Bio-Rad公司CHEF MapperXAPulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为：电泳缓冲液位0.5*TBE，胶浓度为1％，程序为2K-80K。)，回收38kbp-48kbp之间的DNA片段(图1)。将回收后的DEV DNA片断两端加上Fse I-Sbf I-Pme I接头，精制后连接到pCC1 Fos(购自EPICENTRE，图谱见图2)载体上，4℃过夜连接。对混和液进行包装，转染大肠杆菌EPI300(购自EPICENTRE)。对文库滴度进行确认，其试验过程如下：将包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10^-2，10^-4，10^-5，10^-6四个稀释度的稀释液10μl感染100μl EPI300菌株，将此菌涂于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板，37℃过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为3.8x10⁵cfu/lib。即成功构建DEV的fosmid文库。

实施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的选择

文库构建成功后，挑取286个克隆提取粘粒，用碱裂解法^[12]提取粘粒，送大连宝生物公司对插入pCC1 Fos中的DEV DNA片段末端进行测序，

测序引物序列如下：

Primer 1：TAATACGACTCACTATAGGG

Primer 2：GCCAAGCTATTTAGGTGAGA

经过末端测序的分析，共得到插入片段两端都连接有完整Fse I-SbfI-Pme I接头的克隆250个。从这250个克隆中选取多组5粘粒组合。其中每组中克隆的DEV DNA片段两端都含有Fse I-Sbf I-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组。

实施例3.病毒拯救

用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse I、Sbf I或Pme I内切酶(均购自New England Biolabs)对所选择的粘粒进行线性化处理，反应条件如下：Sbf I内切酶20U(也可以使用Fse I或Pme I内切酶)，粘粒10μg，37℃作用1小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制备转染用DEV DNA。

参照Reddy SM(2002)的磷酸钙方法将5段DEV DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF)^[9]，经多次重复，其中有3组5粘粒组合转染4-6天后可见CEF出现DEV病毒典型病变，选取重复性较好的一组5粘粒组合进行后续实验。该粘粒组合相对于DEV基因组的位置如图3所示。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为dDEV，用此dDEV与原DEV病毒分别接种次代CEF。CEF的制备方法如下：取9-10日龄SPF(无特定病原动物)鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25％的胰酶(4mL/胚)在37℃水浴中消化4-5min，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗(青霉素100u/mL，链霉素100mg/mL)的M199营养液(购自HyClone)，吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成10⁶-10⁷细胞/毫升的细胞悬液，最后分装于培养转瓶中37℃培养。于转瓶中培养；待细胞病变达到100％时，收集培养液；4℃6000g离心10min，去除细胞碎片；取上清50000g离心2h富集病毒；然后经20％和60％蔗糖密度梯度离心，50000g离心2h，回收20％和60％中间层；之后经50000g离心2h超速离心脱糖处理获得纯化好的病毒。提取病毒全基因组DNA^[11]，分别用BamH I、EcoRI和BbvC I(均购自New England Biolabs)对原疫苗株DEV和dDEV进行酶切。反应条件如下：取BamH I、EcoR I和BbvC I各20U，分别与DEV基因组DNA 8μg混和，于50μl体系中37℃作用1h。用Bio-Rad公司CHEFMapper

XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为：电泳缓冲液位0.5x TBE，胶浓度为1％，程序为2K-70K。拯获的病毒酶切图谱和原病毒相同，如图4所示。

实施例4.比较拯救毒dDEV与原DEV疫苗株病毒的生长曲线

将DEV和其中一个拯救毒dDEV以感染复数(MOI)为0.01接种次代CEF，每12小时收集上清和细胞。-80度冻存。待收集完全后冻融一次，4℃，1000g离心10分钟。取上清于96孔板中滴定其半数感染量(TCID50)^[9]。

用此5粘粒感染性克隆拯救出的病毒dDEV与原DEV生长曲线没有明显区别，说明用此感染性克隆方法拯救出的病毒与原DEV在CEF上的生长特性相同(图5)。

实施例5.比较拯救毒dDEV与原DEV疫苗株病毒在次代CEF上产生的病变。

用DEV与dDEV分别以MOI为0.01感染次代CEF，待其细胞病变达到50％时进行观察，并拍照(图6)。dDEV在CFE上的病变与DEV相同。

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Claims

1.一种鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统，其特征在于所述系统包括多个Fosmid粘粒，每个Fosmid粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组，其中所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株是鸭病毒性肠炎病毒CVCC AV1222；所述Fosmid粘粒是pCC1Fos；所述多个Fosmid粘粒是5个Fosmid粘粒；且所述5个Fosmid粘粒中克隆的鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段的序列分别为鸭病毒性肠炎病毒CVCC AV1222的基因组序列的1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位，所述鸭病毒性肠炎病毒CVCC AV1222的基因组序列如GeneBank EU082088所示。

2.权利要求1所述的鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统，其中所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段两端连接有所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株中所不含的内切酶序列。

3.权利要求1或2的系统在拯救鸭病毒性肠炎病毒中的应用。