CN110343671A - 一种表达vp2基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株 - Google Patents

一种表达vp2基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株 Download PDF

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Abstract

本发明构建了一株表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株并对其应用进行了探究。本发明利用同源重组技术，将包含传染性法氏囊病毒VP2基因和CMV启动子序列的基因片段CMV‑VP2及含flp识别位点的Kana基因插入到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗SC9‑1株的UL45/UL46基因之间，构建获得在UL45/UL46基因间插入CMV‑VP2表达框和Kana表达框的重组质粒，而后通过阿拉伯糖将Kana基因诱导掉，得到只含有CMV‑VP2表达框的重组质粒，由其拯救获得表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。研究表明，本发明获得的疫苗株具有与亲本毒SC9‑1疫苗株同等的体外复制能力以及良好的遗传稳定性，并且能够同时抵抗MDV超强毒株以及IBDV超强毒株的攻击。由此可见，本发明获得的表达IBDV‑VP2基因的重组MDV疫苗株可用于预防鸡传染性法氏囊病和马立克氏病。

Description

一种表达VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组马立克氏病毒株，该重组病毒免疫家禽可用于传染性法氏囊病及马立克氏病的预防。
技术背景
马立克氏病(Marek’s disease，MD)和鸡传染性法氏囊病(Infectious bursaldisease,IBD)是常见的两种影响家禽生产性能的免疫抑制病。其中，IBD是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的禽类急性、高度接触性免疫抑制性传染病，该病主要感染3周龄～12周龄青年鸡，可通过导致鸡法氏囊损伤、引起免疫抑制和雏鸡死亡等对家禽养殖造成巨大的经济损失。因此，几十年来，该病一直威胁着养禽业的发展。抗原变异、免疫抑制，特别是超强毒株(vvIBDV)的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽医局(OIE)认为IBD已经成为影响社会经济的重要疾病。
研究表明IBDV基因组由两个双股RNA节段组成，分别为A节段和B节段。A节段编码的VP2蛋白构成病毒的外衣壳，是IBDV的主要结构蛋白。VP2可以诱导机体产生中和抗体，是IBDV主要的宿主保护性抗原。IBD的免疫预防已成为目前防控该病的主要措施，而商品化的传染性法氏囊病活疫苗分为弱毒、中等毒力和强毒三类。弱毒活疫苗对有母源抗体鸡群的免疫保护效果不理想。与弱毒疫苗相比，中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然高很多，但由于其具有一定的致病性，对法氏囊有一定的损伤。同时，由于受母源抗体干扰及IBDV的特点，导致传统疫苗在实际应用中形成不可避免的免疫空白期。因此，针对传染性法氏囊病新型疫苗的研究成为目前的热点之一。IBDV的VP2蛋白是主要的免疫保护性抗原，针对VP2蛋白的中和抗体可抵御IBDV强毒株的攻击，因此构建表达IBDV-VP2基因的重组活载体疫苗具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组马立克氏病毒株，该重组病毒免疫家禽可用于传染性法氏囊病及马立克氏病的预防。该病毒株可用于家禽中诱导针对IBDV的保护性免疫应答，并可预防马立克氏病，从而弥补现有疫苗市场的不足。
本发明所提供的表达IBDV-VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，是将VP2基因表达框插入到Ⅰ型马立克氏病毒的UL45区和UL46区之间。
更具体的，所述的插入位点位于Ⅰ型马立克氏病毒基因组UL45区和UL46区之间的103909nt-103910nt之间；
所述的VP2基因，其编码序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
本发明提供的重组马立克氏病毒，其插入的VP2基因表达框中IBDV-VP2基因的调控元件由CMV启动子负责VP2基因的起始转录，BGH ployA终止子为VP2基因mRNA转录提供终止信号，同时为mRNA 3’端添加polyA尾巴；
所述的VP2基因表达框，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
本发明所提供的表达IBDV-VP2基因的重组马立克氏病毒，其一种具体的病毒株为马立克氏病毒YBSC9-1 vVP2株，已于2019年04月28日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201923。
本发明的YBSC9-1 vVP2株可用于表达IBDV-VP2蛋白。
本发明的YBSC9-1 vVP2株的另一方面的用途是用于制备疫苗。
本发明在Ⅰ型MDV株UL45区及UL46区之间插入IBDV-VP2基因构建的重组疫苗株不仅克服了现有IBD弱毒疫苗的不足，而且安全性高，可以同时有效预防IBD和MD两种重要的禽类传染病，能够为动保行业产生社会经济效益，因此，希望该疫苗能够规模化生产应用于家禽市场。
附图说明
图1：重组病毒YBSC9-1 vVP2基因组中外源基因VP2插入位点示意图；
图2：重组病毒YBSC9-1 vVP2基因组构建模式图；
图3：VP2表达框及Kana表达框PCR电泳图；其中，VP2：VP2表达框；Kana：Kana表达框；VP2+Kana：VP2和Kana串联表达框。
图4：VP2表达框及Kana表达框转移模式图；
图5：中间质粒PUC19-VP2-Kana VP2基因表达的荧光图；其中，PUC19-VP2-Ka:PUC19-VP2-Ka质粒转染的CEF细胞荧光图；PUC19:PUC19载体对照。
图6：拯救的重组病毒蚀斑图；其中，UL45/46：重组病毒YBSC9-1 vVP2UL45/46蚀斑图；UL41：重组病毒YBSC9-1 vVP2 UL41蚀斑图；US2：重组病毒YBSC9-1 vVP2 US2蚀斑图。
图7：重组病毒基因组DNAPCR鉴定图；其中，SC9-1：SC9-1基因组PCR鉴定条带；UL45/46P10(P20)：YBSC9-1 vVP2 UL45/46第10(20)代基因组PCR鉴定条带；UL41 P10(P20)：YBSC9-1 vVP2 UL41第10(20)代基因组PCR鉴定条带；US2 P10(P20)：YBSC9-1 vVP2US2第10(20)代基因组PCR鉴定条带。
图8：IFA鉴定重组病毒外源基因VP2表达的荧光图；其中，UL45/46：YBSC9-1 vVP2UL45/46荧光图；UL41：YBSC9-1 vVP2 UL41荧光图；US2：YBSC9-1 vVP2 US2荧光图；SC9-1：SC9-1对照荧光图。一抗为兔源抗传染性法氏囊病毒的血清。
图9：Western-Blot鉴定重组病毒外源基因VP2表达图片；其中，UL45/46：YBSC9-1vVP2 UL45/46感染CEF制备的蛋白样；UL41：YBSC9-1 vVP2 UL41感染CEF制备的蛋白样；US2：YBSC9-1 vVP2 US2感染CEF制备的蛋白样。SC9-1：SC9-1对照。一抗为兔源抗传染性法氏囊病毒的血清。
图10：重组病毒在CEF上的生长曲线图；其中，UL45/46 P20：第20代YBSC9-1 vVP2UL45/46在CEF细胞上的生长曲线；UL41 P20：第20代YBSC9-1vVP2 UL41在CEF细胞上的生长曲线；SC9-1 P20：第20代亲本毒SC9-1在CEF细胞上的生长曲线。
具体实施方式
本发明以Ⅰ型马立克氏病毒为载体，分别以其复制非必需区UL45和UL46区间，UL41区，US2区为插入位点，首先利用同源重组原理在该位点插入CMV-VP2表达框和筛选基因Kana表达框，构建表达VP2基因和Kana抗性基因的重组病毒YBSC9-1 vVP2-Kana，而后将抗性基因Kana表达框诱导掉，得到只含有CMV-VP2表达框的重组MDV。
本发明选择IBDV易邦分离株YB-IBDV201802株的完整VP2基因，将其插入pcDNA3.1(-)载体中，构建基因表达框，并通过PCR方法将该基因表达框从质粒pcDNA3.1-VP2中扩增出来，同时从PKD13质粒中扩增Kana表达框，将两表达框串联后插入到PUC19载体中，得到PUC19-VP2-Kana中间质粒。用含有不同位点同源臂的引物扩增CMV-VP2表达框和Kana表达框的串联表达框，同源重组到SC9-1基因组中，得到含有表达VP2基因和Kana抗性基因的重组MDV基因组YBSC9-1 vVP2-Kana UL45/46,YBSC9-1 vVP2-Kana UL41,YBSC9-1 vVP2-KanaUS2。
再次利用同源重组原理，用阿拉伯糖将重组基因组中的Kana抗性基因诱导掉，得到只含有VP2基因的重组MDV基因组，提取质粒拯救重组病毒，命名为YBSC9-1 vVP2 UL45/46,YBSC9-1 vVP2 UL41,YBSC9-1 vVP2 US2，模式图如图2所示。
本发明的YBSC9-1 vVP2疫苗株免疫鸡群后，针对IBDV强毒株SNJ93的攻击，可以提供100％攻毒保护。针对MDV超强毒的攻击，也可提供100％免疫保护。
对于本发明中所涉及的实验材料及方法，本领域的普通技术人员可以选用其它来源的材料或本领域的其它通用方法来实现本发明的技术方案。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1
1、实验材料
1.1毒株、菌株和质粒
IBDV强毒株YB-IBDV201802由本公司分离并保存。
含MDV SC9-1疫苗株基因组的EL250工程菌由山东农业大学家禽肿瘤病重点实验室提供。
质粒pcDNA3.1(-)，质粒PKD13购自长沙赢润生物技术有限公司；PUC19载体，感受态细胞DH5a购自宝日生物技术(北京)有限公司；鸡胚成纤维细胞(CEF)由9-10日龄SPF鸡胚制备。
2、实验方法
2.1pCMV-VP2质粒的构建
以VP2(ORF)-F和VP2(ORF)-R为引物，RT-PCR扩增的VP2基因为模板，得到VP2 ORF，通过EcoR I及Hind III将其克隆至pcDNA3.1(-)中，得到pCMV-VP2真核表达质粒。以VP2(C)-F和VP2(C)-R为引物，pCMV-VP2为模板得到含有CMV启动子及BGH poly(A)尾巴的VP2表达框(SEQ ID NO:3)。
2.2含CMV-VP2表达框及Kana表达框重组质粒的构建
以VP2(Ka)-F和VP2(Ka)-R为引物，pCMV-VP2为模板，得到含有CMV启动子、BGHpoly(A)尾巴及Kana表达框上游20bp的VP2表达框的PCR产物。以Kana(V)-F和Kana(V)-R为引物，PKD13质粒为模板，扩增两端带有FRT位点的Kana表达框和VP2表达框下游20bp的PCR产物。通过引物VP2(PUC19)-F和VP2(PUC19)-R，以两PCR产物为模板，将其串联，得到两端含PUC19质粒15bp同源臂的串联表达框的PCR产物，如图3所示。将其连接至经Hind III,Sal I双酶切的PUC19线性质粒中，得到含VP2表达框及Kana表达框的重组质粒PUC19-VP2-Ka，如图4所示；其中Kana表达框的序列如SEQ ID NO:4所示。
VP2(ORF)-F:ATTGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCA(EcoRI)
VP2(ORF)-R:ATTAAGCTTTTACCTCCTTATAGCCCGGA(HindIII)
VP2(C)-F：GACATTGATTATTGACTAGT
VP2(C)-R：CCATAGAGCCCACCGCATCC
VP2(Ka)-F：GACATTGATTATTGACTAGT
VP2(Ka)-R:GAAGCAGCTCCAGCCTACACCCATAGAGCCCACCGCATCC
Kana(V)-F:GGATGCGGTGGGCTCTATGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
Kana(V)-R:ATTCCGGGGATCCGTCGACCT
VP2(PUC19)-F:TGATTACGCC AAGCT GACATTGATTATTGACTAGT
VP2(PUC19)-R:ATCCTCTAGA GTCGA ATTCCGGGGATCCGTCGACCT
2.3重组质粒PUC19-VP2-Ka中VP2基因表达的鉴定
将构建的重组质粒PUC19-VP2-Ka瞬时转染到长至80％-90％的CEF细胞培养皿中，置37℃5％CO2培养箱中培养，24h后间接免疫荧光试验(IFA)鉴定其VP2基因表达。其中一抗为兔源抗传染性法氏囊病毒的血清，二抗选用FITC标记羊抗兔IgG，置倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光(图5)，表明VP2基因在重组质粒PUC19-VP2-Ka中能够很好的表达。
2.4含VP2基因重组质粒的构建
分别以CMV(UL45)-F和CMV(UL45)-R，CMV(UL41)-F和CMV(UL41)-R，CMV(US2)-F和CMV(US2)-R为引物，重组质粒PUC19-VP2-Ka为模板，扩增得到含SC9-1不同位点两端各50bp同源臂的PCR产物，将其电转进含SC9-1基因组的EL250感受态细胞中，得到重组有串联表达盒的重组MDV基因组，而后通过阿拉伯糖诱导EL250工程菌表达FLP重组酶，识别Kana两端的FRT位点，将Kana诱导掉，得到在目的区只保留VP2表达盒及34bp FRT位点残基的重组目的基因组，如图2所示。
CMV(UL45)-F:attactacgaagtttacagttccattctctcgaacgcaattatgaaataa
gacattgattattgactagt
CMV(UL45)-R：attattaaagaaataaagaaccgctttaagaatagtgtttatttttgtgt
attccggggatccgtcgacct
CMV(UL41)-F:gttttccccagtccgccgatcttgctcttcgtatagaggtctgatacacc
gacattgattattgactagt
CMV(UL41)-R：cattgctactagaggaggttctgggcgactacatgcacgattgtttgatg
attccggggatccgtcgacct
CMV(US2)-F:cgattatgggcacacccacatcatcctgtatttgttccatacattgcttt
gacattgattattgactagt
CMV(US2)-R:ctagatgaatgcgatcgattgccaggaagatctagagatgctgcatctac
attccggggatccgtcgacct
2.5重组病毒的拯救
转染前制备次代CEF细胞，生长于加入M199培养基(含5％胎牛血清)的60mm培养皿中，待细胞长至铺满单层时，配制转染体系，进行转染。采用磷酸钙共沉淀法拯救重组病毒，配制体系如下：
配置上述体系时，需要从管底缓慢加入2M CaCl2 37μL；缓慢加入2×HBS溶液(10mg/mL Herpes；0.74mg/mL KCl；16mg/mL NaCl；0.25mg/mL Na2HPO4；2mg/mL葡萄糖，pH值调至6.96)300μL，轻轻颠倒混匀，室温静置30min；向制备的次代CEF培养皿中加入上述混合物，37℃，5％CO2条件下继续培养。转染细胞培养4h后，配制甘油休克液，对细胞进行休克。配制2.5mL体系如下：
取出细胞培养皿，弃掉培养基，用M199培养基洗涤细胞2～3次；加甘油休克液静置1min；再次用M199培养基清洗细胞2～3次；加适量5％M199培养基(含5％胎牛血清)；37℃，5％CO2条件下培养5～7d，荧光显微镜下观察病毒蚀斑，若观察不到典型蚀斑则盲传2代，将拯救的重组病毒命名为YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1 vVP2 UL41，YBSC9-1 vVP2 US2，如图6所示。
2.6重组病毒的传代及鉴定
2.6.1PCR鉴定
将重组病毒YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1 vVP2 UL41，YBSC9-1vVP2 US2，分别在CEF连续传至20代，提取第10代，20代重组病毒的基因组，以提取的各基因组为模板，以设计于UL45区的上游引物UL45(YZ)-F(tttagactacgggacagtag)和设计在UL46区的下游引物UL46(YZ)-R(tacagttgccgtcgaatcgg)，UL41区的UL41(YZ)-F(gcgctctgggattatagtag)和UL41(YZ)-R(gatatgacacctattgccgt)及US2区的US2(YZ)-F(aaaacggaataggtctgcag)和US2(YZ)-R(cgtcgtatccgtaccattga)进行PCR扩增含VP2表达框及SC9-1基因组的嵌合区，对于YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1 vVP2 UL41均可扩增出3000bp左右的目的条带，而YBSC9-1 vVP2 US2第20代基因组中没有扩增出目的条带，如图7所示，表明VP2表达框成功插入到SC9-1基因组的各位点中，但是对于US2位点，在传代过程中出现基因丢失现象。
2.6.2间接免疫荧光试验(IFA)鉴定
将重组病毒YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1 vVP2 UL41及YBSC9-1vVP2 US2接种于长满单层CEF的24孔细胞培养板中，37℃，5％CO2条件下培养，待细胞出现典型蚀斑后，将培养液弃掉，用冷的固定液(丙酮：乙醇＝3:2)固定10min，PBS洗3次，每个孔中加入100μL阳性兔血清，37℃恒温培养箱中孵育1h，用PBS洗3次，每孔加100μL FITC标记羊抗兔IgG，放置37℃恒温培养箱中孵育1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，各重组病毒感染孔出现特异性绿色荧光，而SC9-1感染孔无荧光(图8)，表明YBSC9-1 vVP2UL45/46，YBSC9-1 vVP2UL41及YBSC9-1 vVP2 US2重组病毒株中VP2基因能够很好的表达。
2.6.3Western-Blot试验鉴定
将重组病毒YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1 vVP2 UL41及YBSC9-1vVP2 US2接种次代CEF细胞，3～4d后收集病变细胞制备蛋白样品。Western-Blot检测蛋白表达情况，试验中阳性兔血清作为一抗，FITC标记的羊抗兔IgG作为二抗。试验中设置阴性对照(用亲本毒SC9-1感染的细胞制备的蛋白样品)。结果表明，由接种YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1vVP2 UL41及YBSC9-1 vVP2 US2的CEF制备的蛋白样品可以扩增出预期的特异性条带，而阴性对照样品未有特异性条带出现，如图9所示。
2.7重组病毒的体外复制曲线
将传至20代的重组病毒YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1 vVP2 UL41和亲本毒SC9-1各100PFU剂量接种于6孔板中的次代CEF细胞，感染后每隔24h收集病毒(每个时间点每种病毒均做3个重复孔，取均值)，直到感染后144h。测定各个时间点所收集病毒的滴度，绘制生长曲线，结果显示重组病毒YBSC9-1vVP2 UL45/46，YBSC9-1 vVP2 UL41在CEF上的复制能力与亲本毒无显著差异，复制能力基本一致，说明重组病毒的复制能力并未受到外源基因插入的影响，如图10所示。
2.8重组病毒对IBDV超强毒的免疫保护评价
将60只1日龄SPF鸡随机分成三组，分别为YBSC9-1 vVP2 UL45/46组，YBSC9-1vVP2 UL41组、攻毒对照组；其中YBSC9-1 vVP2 UL45/46，YBSC9-1vVP2 UL41组于1日龄时颈部皮下接种3000PFU重组疫苗，攻毒对照组接种等量无菌稀释液。各组鸡于28日龄时，用IBDV超强毒SNJ93株经滴鼻、点眼途径进行攻毒，攻毒剂量为100LD50，攻毒后连续7天每天观察并统计各组鸡的发病和死亡情况，从表中可以看到YBSC9-1 vVP2 UL45/46组鸡的攻毒保护率可达100％，而YBSC9-1 vVP2 UL41组鸡的攻毒保护率为80％，攻毒对照组的死亡率为100％(表1)。
表1重组病毒对IBDV超强毒的免疫保护评价结果
组别 攻毒用毒株 发病率 死亡率 攻毒保护率
YBSC9-1vVP2 UL45/46组 SNJ93 0/20 0/20 100％
YBSC9-1vVP2 UL41组 SNJ93 4/20 0/20 80％
攻毒对照组 SNJ93 20/20 18/20 -
每组随机挑选10羽SPF鸡，从8日龄开始，每隔7天采血，分离血清用Synbiotics公司的传染性法氏囊病抗体检测ELISA试剂盒，检测抗体效价；检测主要步骤为：①血清样品做100倍稀释，②酶标仪所用波长为405-410nm，③效价计算公式为log10Titer＝1.172(log10S/P)+3.614；④S/P值＞0.299；Titer值大于998.8，判定阳性。通过抗体效价的监测来揭示鸡群免疫重组疫苗后外源基因在体内的表达水平，抗体检测结果如表2所示。
表2重组病毒诱导鸡体产生IBD抗体水平结果
免疫评价结果表明，鸡群免疫表达IBDV-VP2基因的YBSC9-1 vVP2 UL45/46后，可以对IBDV强毒株的攻击提供良好的免疫保护，而免疫YBSC9-1 vVP2UL41的组，只能提供80％的保护。由此可见YBSC9-1 vVP2 UL45/46提供的对IBDV超强毒的保护优于YBSC9-1vVP2 UL41。
2.9重组病毒对MDV超强毒的免疫保护评价
为确定外源基因插入后是否会影响弱毒疫苗株对MDV本身的免疫保护效力，将80只1日龄SPF鸡随机分为四组，前三组分别用重组病毒YBSC9-1 vVP2UL45/46，YBSC9-1 vVP2UL41及亲本病毒SC9-1颈部皮下免疫，3000PFU/只，第四组免疫同等剂量稀释液作为攻毒对照组。免疫后6天用超强毒株Md5进行攻毒，攻毒后连续观察实验组与对照组试验鸡发病和死亡情况至攻毒后12周。结果显示，非免疫对照组试验鸡攻击MDV超强毒后出现典型的MD临床症状，死亡率达85％(17/20)，发病后至实验结束仍存活的3只对照组试验鸡经病理学检查可以观察到特征性肿瘤病理变化(表3)。而两组重组病毒免疫组和SC9-1亲本病毒免疫组试验鸡攻毒后未出现任何临床症状和显微病变，保护指数均达到100％，说明各重组病毒对MDV的免疫保护效力未受到影响。
表3重组病毒对MDV超强毒的免疫保护评价结果
由此可见，重组病毒YBSC9-1 vVP2 UL45/46和YBSC9-1 vVP2 UL41免疫SPF鸡后可以产生显著的IBDV特异性中和抗体。免疫鸡攻IBDV超强毒后，YBSC9-1 vVP2 UL45/46组试验鸡完全存活且未见任何IBD临床症状，法氏囊未见萎缩，且无明显病理变化，能够对IBDV超强毒的攻击提供完全保护。而YBSC9-1 vVP2 UL41组试验鸡出现发病现象，保护效果低于YBSC9-1 vVP2UL45/46组，然而，YBSC9-1 vVP2 UL45/46和YBSC9-1 vVP2 UL41均能够提供良好的对超强毒MDV的免疫保护。综上，YBSC9-1 vVP2UL45/46不仅能够提供对超强毒IBDV的良好保护，也能够提供对MDV超强毒的良好保护，我们将位于UL45/46位点的重组病毒重新命名为YBSC9-1 vVP2。
序列表
<110> 青岛易邦生物工程有限公司
<120> 一种表达VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60
ccaacaaccg gaccggcatc catcccggac gacaccctgg agaaacacac tctcaggtca 120
gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180
cctggcttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcga tgggaactac 240
aaattcgatc agatgctcct gacggcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300
ctagtgagtc ggagtctcac agtaaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcgcta 360
aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa gggagcctga gtgaactgac agatgttagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgata aaattgggaa cgtcctggta 480
ggggaagggg taaccgttct cagcttgccc acatcatatg atctcgggta tgtgaggctt 540
ggtgacccca tacctgccat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600
gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgacaatt accaattctc atcacagtac 660
aagacaggtg gggtgacaat cacactgttc tcagccaaca tcgatgccat cactagtctc 720
agcattgggg gggagcttgt gttcaaaaca agcatccaaa accttgtact gggcgccacc 780
atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtagc tgcaaacaat 840
gggctgacgg ccggcatcga caatctcatg ccattcaacc ttgtgatccc gaccagcgag 900
ataacccagc caatcacatc catcaaattg gagatagtga cttccaaaag tgatggccag 960
gcaggggaac agatgtcgtg gtcggcaagt gggagtctag cagtgacgat ccatggtggc 1020
aactacccag gagctctccg tcccgtcacg ctagtggcct acgaaagagt ggcaaaagga 1080
tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140
aagaacctgg ttacagaata cggccgattc gacccaggag ctatgaacta cacaaaactg 1200
atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260
gactttcgcg agtacttcat gaaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320
gcatttggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggagg 1359
<210> 2
<211> 2341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag 600
aacccactgc ttactggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag acccaagctg 660
gctagcgttt aaacgggccc tctagactcg agcggccgcc actgtgctgg atatctgcag 720
aattcatgac aaacctgcaa gatcaaaccc aacagattgt tccgttcata cggagccttc 780
tgatgccaac aaccggaccg gcatccatcc cggacgacac cctggagaaa cacactctca 840
ggtcagagac ctcgacctac aatttgactg tgggggacac agggtcaggg ctaattgtct 900
ttttccctgg cttccctggc tcaattgtgg gtgctcacta cacactgcag agcgatggga 960
actacaaatt cgatcagatg ctcctgacgg cccagaacct accggccagc tacaactact 1020
gcaggctagt gagtcggagt ctcacagtaa ggtcaagcac actccctggt ggcgtttatg 1080
cgctaaacgg caccataaac gccgtgacct tccaagggag cctgagtgaa ctgacagatg 1140
ttagctacaa tgggttgatg tctgcaacag ccaacatcaa cgataaaatt gggaacgtcc 1200
tggtagggga aggggtaacc gttctcagct tgcccacatc atatgatctc gggtatgtga 1260
ggcttggtga ccccatacct gccatagggc tcgacccaaa aatggtagca acatgtgaca 1320
gcagtgacag gcccagagtc tacaccataa ctgcagccga caattaccaa ttctcatcac 1380
agtacaagac aggtggggtg acaatcacac tgttctcagc caacatcgat gccatcacta 1440
gtctcagcat tgggggggag cttgtgttca aaacaagcat ccaaaacctt gtactgggcg 1500
ccaccatcta ccttataggc tttgatggga ctgcggtaat caccagagct gtagctgcaa 1560
acaatgggct gacggccggc atcgacaatc tcatgccatt caaccttgtg atcccgacca 1620
gcgagataac ccagccaatc acatccatca aattggagat agtgacttcc aaaagtgatg 1680
gccaggcagg ggaacagatg tcgtggtcgg caagtgggag tctagcagtg acgatccatg 1740
gtggcaacta cccaggagct ctccgtcccg tcacgctagt ggcctacgaa agagtggcaa 1800
aaggatctgt cgttacggtc gccggggtga gcaacttcga gctgatccca aatcctgaac 1860
tagcaaagaa cctggttaca gaatacggcc gattcgaccc aggagctatg aactacacaa 1920
aactgatact gagtgagagg gaccgtcttg gcatcaagac cgtctggcca acaagggagt 1980
acactgactt tcgcgagtac ttcatgaagg tggccgacct caactctccc ctgaagattg 2040
caggagcatt tggcttcaaa gacataatcc gggccataag gaggaagctt aagtttaaac 2100
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 2160
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2220
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 2280
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 2340
g 2341
<210> 3
<211> 2475
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgatgtcgc ctacacccga ggacgatcgc gatttagtgg tagtacgtgg acgtctccga 60
atgatggata acggtgccga acatgatcga gaacggcgat catacaccgc atggccccat 120
ttgtgttgtg gatgtaccat cggaattatc ttaactatgt tcgtcatcgc gacaacgtta 180
ttattagcat cattgtttgc attctcgtac atgtctctag agtcgggaac atgccctaag 240
gaatggattg gattagggta cagttgcatg cgcgtggctg gaaacaatgc tacagaactc 300
gaggcattag atatgtgtgc ccagcataac agtaaactca tagattttac taacgcaaaa 360
acattggttg aagcaattgt cccattcggc tccacgaatg cttcctttgg aaatatattt 420
agactacggg acagtagatc aacctgtata ctacccacca ttggaggtcc tatatcggtc 480
gattgtccaa ggacatgcag cgttgtatgc caacgccccc gaccattaag taccacggct 540
tctataatca gagatgctcg tatctatctt cgtttagaac gacgcgatta ctacgaagtt 600
tacagttcca ttctctcgaa cgcaattatg aaataaacac aaaaataaac actattctta 660
aagcggttct ttatttcttt aataatcgag catgaaaggt gaaagggtat acatgtttgg 720
gacaaatcgt tacgctaaag ataaaaacat atatgtttga acatagtatc aatcggtagc 780
caccctcaac ctacgcaata ttcgttccac tttggatgat ggagatttgt ttcgtgcggt 840
ttctctgcat acatataccg attcgacggc aactgtaaca ggcggtgtct cagctactgt 900
agttgatgat tcaacttcgg ttggatcgag ggacgcatcg gtcactctcg ttggagaacc 960
gtctgaagct gtcccattat ttgtttgact ggaatttgga gtgatcgagt cagctggctg 1020
tggggctgga cataaaactc cacctttcat ttccacgtaa tcgttttgga gttcgtccgc 1080
tgaccacaaa gcggtagcga ttgaagatag ttgtcccgaa gaacactcag gaacaatcgc 1140
ttgttgatta ttctgtaatg tactgtgtat atgtcccgaa gaagacggca tgctggtaga 1200
tcgtgtaaac ctcgtatcat gcctttctcc aatttgagta tgccttggtt tacataaagg 1260
ttcaaggaca ttattgctca caatggactt tttgagtaaa gagccgtgaa ttaccattga 1320
cttggctaat gcaagttcaa accatgctct gatgctaaat tcaagttctc cccatgccgt 1380
ggggcgaatg gatgggaaaa gtcctcccaa ataatgttca aaccgttttt gttgtcgaat 1440
tgccgatctt aacataggat tacccaaacc cccctccaac catcttgcat atccattaaa 1500
agtaatattg ataatatatt gacagtgatg gtgcaagaga gaaaccaacg cgacaatgct 1560
aactatagga cgcaacattt ctccatgttt ggtttcgcgc cattgacaac atgtccacag 1620
agaactaata tggataagtg aagacaaaag gtgttctatg gagcgacaga gcaatgcagt 1680
gctcatccac ttatctgacg ataacgaacc cataacctca gtaagatttg aaaatatatt 1740
atcaatgctg ataggtacgc gggtgccgaa tttgttagaa acaattcgcg tatctagcaa 1800
gtccattaac cacattgccc acatgtacag tgtcttcaca taaccaaata acaactccag 1860
tcgagcggaa gtatcgagac taggtgttgt tatttcgtca ggtctcatat aatacacata 1920
cttctgaata aaatttaacg catcccatat ttccgcccag catttgacga acattttgtt 1980
atctttttga agccgaaatg gtttttgtgt taagggattt cgttgtatag ctggataaaa 2040
tagcaacgca acggtggatc tggcaggttc acgagttccc gggagatcaa cacaaggtat 2100
acgccgccgc ttacagacat agcgctgata cgagtctgtg tagtagtctt ttaccaccgc 2160
aggtgtcaac gccgcccgtt tcaatctgcg tttcacattt gcgctgtata gggatatata 2220
ctctcctcta acatctccca acgcaagatg aacaataaca gattctggaa ccttattgga 2280
aagagtttca cacaataccg attcccttat acccaatgtc aacccggatg gcaacttctc 2340
tataaggctg tcctcaagag ctcttaatgc agacgcagat acagttaatt cgttgggtaa 2400
tatacatgaa tattcttgtg gcgaatctcg gtcaaacagt tccaacgact gttcagaaga 2460
gctgagccgc ttcat 2475
<210> 4
<211> 1304
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 60
ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 120
tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 180
agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 240
agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 300
caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 360
gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 420
agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 480
gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 540
ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 600
agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 660
gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 720
tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 780
gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 840
ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 900
tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 960
actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1020
gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1080
tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1140
ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1200
cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1260
agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaat 1304

Claims (8)

1.一种表达IBDV-VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的病毒株是将VP2基因表达框插入到Ⅰ型马立克氏病毒的UL45区和UL46区之间。
2.如权利要求1所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的VP2基因表达框的插入位点位于Ⅰ型马立克氏病毒基因组UL45区和UL46区之间的103909nt-103910nt之间。
3.如权利要求1或2所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的VP2基因，其编码序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
4.如权利要求1或2所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的VP2基因表达框中IBDV-VP2基因的调控元件由CMV启动子负责VP2基因的起始转录，BGH ployA终止子为VP2基因mRNA转录提供终止信号，同时为mRNA3′端添加polyA尾巴。
5.如权利要求4所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的VP2基因表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
6.如权利要求1-5任一项所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V201923。
7.权利要求1-6任一项所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株在制备VP2蛋白中的应用。
8.权利要求1-6任一项所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株在制备疫苗中的应用。
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