RU2662994C2 - Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека - Google Patents
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662994C2 RU2662994C2 RU2016140593A RU2016140593A RU2662994C2 RU 2662994 C2 RU2662994 C2 RU 2662994C2 RU 2016140593 A RU2016140593 A RU 2016140593A RU 2016140593 A RU2016140593 A RU 2016140593A RU 2662994 C2 RU2662994 C2 RU 2662994C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nuclease
- mitochondria
- gene
- ascpf1
- mitochondrial
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и терапии наследственных заболеваний. Предложена генетическая конструкция pMitoAsCpfl, обеспечивающая экспрессию нуклеазы AsCpfl, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека. Указанная конструкция содержит промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, нуклеазу AsCpfl с SEQ ID NO:1, Т2А, ген TurboGFP, 3’-UTR гена SOD2, ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину. Изобретение может быть использовано для элиминирования митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями. 1 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может, в комплексе с направляющей РНК, быть использовано для элиминирования патогенных мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК), ассоциированных с различными наследственными митохондриальными патологиями.
Известен «Способ лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии» (патент РФ №2375019, A61F 9/007, A61K 35/28, А61Р 27/02, 2003 г.), обеспечивающий улучшение или стойкую стабилизацию зрительных функций на небольшом временном промежутке, поскольку не направлен на коррекцию наследственного материала митохондрий.
Известно изобретение «Митохондриальные таргетные антиоксиданты» (Mitochondrially targeted antioxidants) (патент США № US 6331532, C07F 9/54, C07F 9/572, C07F 9/655, A61K 31/665, A61K 31/66, 1998 г.), которое является технологией импорта функциональных молекул в митохондрии, с использованием липофильных агентов с иммобилизованными молекулами антиоксидантов, но не дает возможности осуществлять редактирование патогенных мутаций в митохондриальной ДНК.
Известно изобретение «Система доставки нуклеиновых кислот в митохондрии» (Mitochondrial nucleic acid delivery systems) (патент Канады № CA 2678572 2008 г. A61K48/00D2, C12N15/864A, C12N15/90B4). Недостатками данной технологии является то, что она не подразумевает доставку в митохондрии белков, поэтому не может быть использована для импорта нуклеазы AsCpf1 в митохондрии, следовательно, не подходит для работы с системой CRISPR/Cpf1.
Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известно использование генетических конструкций на базе системы редактирования генома CRISPR/Cpf1 для элиминирования патогенных мутаций мтДНК путем доставки нуклеазы AsCpf1 в митохондрии; генетические конструкции отличаются модификацией последовательности кодирующей AsCpf1, обеспечивающей доставку данной нуклеазы в митохондрии.
Отличительным признаком изобретения является модификация нуклеазы AsCpf1, обеспечивающая ее доставку в митохондрии для обеспечения универсального механизма для специфической элиминации дефектной мтДНК, несущей ту или иную мутацию. Новизну представляют нуклеотидные последовательности конструкции, которая кодирует модифицированный белок AsCpf1.
Задачей заявляемого изобретения является элиминирование митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями.
Поставленная задача решается тем, что генетическая конструкция заявляемого изобретения, после попадания в цитоплазму клеток, обеспечивает экспрессию кодируемых ею молекул нуклеазы AsCpf1, которые, используя собственный аппарат клетки, транспортируются в митохондрии, где обеспечивают элиминирование мутантных молекул мтДНК путем распознавания специфического участка последовательности посредством взаимодействия со специфической направляющей РНК и последующей рестрикцией обеих цепей мтДНК. Поскольку в митохондриях отсутствуют системы репарации двухцепочечных разрывов, такие «разрезанные» мтДНК элиминируются экзонуклеазами. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет мтДНК, не имеющих мутации.
Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации мутантной мтДНК и способа ее доставки в органеллы.
Принцип функционирования предлагаемых веществ базируется на особенностях работы системы CRISPR/Cpf1. Нуклеаза AsCpf1 взаимодействует с особыми направляющими молекулами РНК, образуя комплекс, который специфически взаимодействует с участком двухцепочечной ДНК комплементарным участку направляющей РНК. В результате такого взаимодействия функциональный домен AsCpf1 вносит разрывы в обе цепи ДНК.
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека, представляет собой плазмидные векторы, разработанные на базе векторов pUC19 и pTurboGFP-mito. Плазмидный вектор обеспечивает возможность трансформации компетентных клеток E.coli с последующей наработкой большого количества копий. Позволяют отбирать трансформированные колонии на селективной среде, содержащей антибиотик. Обеспечивают экспрессию нуклеазы AsCpf1 в клетках млекопитающих и человека, а также доставку продуктов трансляции в митохондрии. Проникая в митохондрии, нуклеаза AsCpf1 может быть использована для специфической элиминации мтДНК, содержащей любую из описанных мутаций благодаря взаимодействию с определенной направляющей РНК.
Белок AsCpf1 обладает нуклеазной активностью и имеет два активных центра, каждый их которых участвует в расщеплении одной из цепей двухцепочечной ДНК. Нуклеаза AsCpf1 связывается с направляющей РНК, образуя комплекс. Данный комплекс сканирует молекулу ДНК и в случае обнаружения гомологичной последовательности формирует дуплекс с участком направляющей РНК. После образования дуплекса нуклеаза AsCpf1 вносит разрывы в обе цепи ДНК в определенной структуре дуплекса, названной РАМ (protospacer adjacent motif). Ближайший аналог нуклеазы семейства Cpf1 является нуклеаза Cas9. Последняя, однако, обладает большим размером, в силу чего хуже импортируется в митохондрии.
Генетическая конструкция pMitoAsCpf1 содержит ориджин репликации, ген устойчивости к ампициллину, промотор цитомегаловируса митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3×FLAG, последовательность, кодирующую модифицированную нуклеазу AsCpf1, Т2А, ген TurboGFP, 3' UTR гена SOD2.
Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.
Карта генетической конструкции pMitoAsCpf1 была построена при помощи программного обеспечения SnapGene. Для сборки использовали фрагменты плазмид pTurboGFP-mito (# FP517, Evrogen), pUC19 и pY010 AsCpf1, а также синтезированные по заказу двухцепочечные фрагменты ДНК - gBloks (IDT, США). Амплификацию фрагментов ДНК проводили при помощи полимеразы PfuTurbo Сх (Agilent Technologies, США) на амплификаторе С1000 Touch (Bio-Rad, США). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью фосфорамидитного метода на AMS-2000 («Биоссет», Россия), очищали методом обращено-фазовой хроматографии на OPS-1000 («Биоссет») с применением реагентов компании «Glen Research» (США). Сборку плазмид осуществляли с использованием ферментативной системы USER (NEB, США), а также классических методов молекулярного клонирования. «Бесшовное» соединение фрагментов ДНК проводили путем сборки по Гибсону (NEB, США) согласно инструкции фирмы производителя.
На фиг. 1 представлена карта генетической конструкции pMitoAsCpf1, кодирующего нуклеазу AsCpf1, импортируемую в митохондрию.
Оценки эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась на культуре клеток.
Клетки выращивали на покровных стеклах 15×15 мм в 12-луночных планшетах. Через 48 ч после трансфекции генетической конструкцией митохондрии окрашивали 150 нМ красителем MitoTracker® Red CMXRos (Life Technologies, США) в течение 30 мин. при 37°C согласно инструкции фирмы-производителя. Далее клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали в течение 15 мин при комнатной температуре в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на PBS, промывали 2 раза по 5 мин раствором PBS, обрабатывали клетки 0,2% Triton Х-100 на PBS в течение 10 мин и промывали клетки 2 раза по 5 мин PBS. Для блокирования неспецифического связывания антител клетки инкубировали в течение 30 мин с 10% раствором бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США) в фосфатно-солевом буфере при 37°C. Инкубирование с первичными антителами против эпитопа 3×FLAG (Sigma, США) в разведении 1:500 в 3% BSA проводили при 37°C в течение 2 ч. После трехкратной промывки раствором PBS в течение 5 мин добавляли вторичные антитела (Life Technologies, США), конъюгированные с Alexa Fluor® 488 в разведении 1:500 в 3% BSA на PBS, и инкубировали при 37°C в течение 45 мин. Клетки промывали 3 раза по 5 мин буфером PBS, ядра окрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS в течение 5 мин, промывали два раза по 5 мин в PBS и под покровное стекло наносили по 10 мкл раствора антифейда (90% глицерин, 0,1 М Tris-HCl и 23,3 мг/мл DABCO (1,4диазабисцикло(2,2,2)октан). Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Германия).
Использование заявляемых генетических конструкций позволяет осуществлять терапию наследственных митохондриальных патологий.
Claims (1)
- Генетическая конструкция pMitoAsCpfl, обеспечивающая экспрессию нуклеазы AsCpfl, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека, представленная на фиг. 1 и содержащая промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, нуклеазу AsCpfl с SEQ ID NO:1, Т2А, ген TurboGFP, 3'-UTR гена SOD2, ориджин репликации, ген устойчивости к ампицилину.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016140593A RU2662994C2 (ru) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016140593A RU2662994C2 (ru) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016140593A RU2016140593A (ru) | 2018-04-16 |
RU2662994C2 true RU2662994C2 (ru) | 2018-07-31 |
Family
ID=61974582
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016140593A RU2662994C2 (ru) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2662994C2 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2709739C1 (ru) * | 2018-10-29 | 2019-12-19 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) | Генетические конструкции, кодирующие направляемые в митохондрии клеток человека нуклеазы Cas9-BE4-Gam и Cas9-ABE 7.10 |
RU2800362C1 (ru) * | 2022-12-01 | 2023-07-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) | Генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантных дезаминаз на основе АРОВЕС1 для направленной модификации цитозиновых оснований митохондриальной ДНК |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2678572C (en) * | 2007-02-16 | 2012-10-30 | University Of Florida Research Foundation Inc. | Mitochondrial targeting and import of a virus to deliver a nucleic acid |
-
2016
- 2016-10-14 RU RU2016140593A patent/RU2662994C2/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2678572C (en) * | 2007-02-16 | 2012-10-30 | University Of Florida Research Foundation Inc. | Mitochondrial targeting and import of a virus to deliver a nucleic acid |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JO A. ET AL. Efficient Mitochondrial Genome Editing by CRISPR/Cas9 // BioMed Research International, Volume 2015, Article ID 305716, 10 pages. * |
RAN F.A. ET AL. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // NATURE PROTOCOLS, 2013, vol.8, no.11, pp. 2281-2308. * |
RAN F.A. ET AL. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // NATURE PROTOCOLS, 2013, vol.8, no.11, pp. 2281-2308. JO A. ET AL. Efficient Mitochondrial Genome Editing by CRISPR/Cas9 // BioMed Research International, Volume 2015, Article ID 305716, 10 pages. SHMAKOV S. ET AL. Discovery and functional characterization of diverse Class 2 CRISPR-Cas systems // Mol Cell. 2015 November 5; 60(3): 385-397. * |
SHMAKOV S. ET AL. Discovery and functional characterization of diverse Class 2 CRISPR-Cas systems // Mol Cell. 2015 November 5; 60(3): 385-397. * |
ОРИЩЕНКО К.Е. и др. Импорт нуклеазы CAS9 в митохондрии // Гены и Клетки, 2016, том 11, номер 2, с. 100-105. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2709739C1 (ru) * | 2018-10-29 | 2019-12-19 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) | Генетические конструкции, кодирующие направляемые в митохондрии клеток человека нуклеазы Cas9-BE4-Gam и Cas9-ABE 7.10 |
RU2800362C1 (ru) * | 2022-12-01 | 2023-07-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) | Генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантных дезаминаз на основе АРОВЕС1 для направленной модификации цитозиновых оснований митохондриальной ДНК |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016140593A (ru) | 2018-04-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2634395C1 (ru) | Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека | |
US10781432B1 (en) | Engineered cascade components and cascade complexes | |
US10323073B2 (en) | CRISPR-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof | |
Zuris et al. | Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo | |
US11104897B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders | |
JP2019532644A (ja) | Rna誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法 | |
JP2020508685A (ja) | サプレッサーtRNA及びデアミナーゼによる変異のRNAターゲティング | |
WO2017107898A2 (en) | Compositions and methods for gene editing | |
Song et al. | AcrIIA5 inhibits a broad range of Cas9 orthologs by preventing DNA target cleavage | |
EP3262061B1 (en) | Peptides for facilitating secretion and uses thereof | |
EP2776560A2 (en) | Endonuclease for genome editing | |
Zuris et al. | Efficient delivery of genome-editing proteins in vitro and in vivo | |
US20200323902A1 (en) | ENHANCED hAT FAMILY TRANSPOSON-MEDIATED GENE TRANSFER AND ASSOCIATED COMPOSITIONS, SYSTEMS, AND METHODS | |
JP2022545950A (ja) | 転写または発現を可能にするように変異を編集するための組成物および方法 | |
KR20230003511A (ko) | 안면견갑상완 근이영양증에 대한 crispr-억제 | |
Maestro et al. | Modulation of pPS10 host range by plasmid-encoded RepA initiator protein | |
He et al. | First experimental evidence for the presence of a CRISPR toxin in Sulfolobus | |
Wang et al. | CRISPR-Cas9 HDR system enhances AQP1 gene expression | |
RU2662994C2 (ru) | Генетическая конструкция pMitoAsCpf1, кодирующая нуклеазу AsCpf1 с детерминантной импорта в митохондрии клеток человека | |
Takano et al. | A novel system of bacterial cell division arrest implicated in horizontal transmission of an integrative and conjugative element | |
CN114008205A (zh) | 前导序列 | |
Dara et al. | Dystrophin gene editing by CRISPR/Cas9 system in human skeletal muscle cell line (HSkMC) | |
JP2023517581A (ja) | CPR富化メタゲノム由来のCRISPR-Casヌクレアーゼ | |
Krela et al. | A novel method for cloning of coding sequences of highly toxic proteins | |
US20130023643A1 (en) | Nuclear localization signal peptides derived from vp2 protein of chicken anemia virus and uses of said peptides |