JP2022545950A - 転写または発現を可能にするように変異を編集するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する遺伝子が転写可能となって機能性遺伝子産物を生成するように、プログラマブル核酸塩基エディターを用いてこの遺伝子を編集する（例えば、スプライス部位を与えるおよび／またはナンセンス変異を変更する）ための、組成物および方法を特徴として備える。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照によりその全体をここに組み込まれる、２０１９年８月２９日出願の米国仮特許出願第６２／８９３，６３８号の優先権および利益を主張する国際ＰＣＴ出願である。
シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）は、外分泌性膵不全、造血障害、および白血病素因という特徴を有する稀少性の常染色体劣性多系統疾患である。ＳＤＳに罹患している患者は、骨髄不全を呈する。他の臨床像としては、骨格障害、免疫障害、肝臓障害、および心臓障害が挙げられる。ＳＤＳの臨床像を伴う患者の約９０％が、７番染色体上に位置する進化的に保存されたシュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群（ＳＢＤＳ）遺伝子に、二対立遺伝子性の変異を有する。ＳＤＢＳタンパク質は、その精確な分子機能が依然として不明であるものの、リボソームの新生および有糸分裂時紡錘体の安定化に役割を担う。現在、ＳＤＳの治療法はなく、この障害を有する患者は、典型的には、合併症のために入院を繰り返し、平均的には約３５歳までしか生存しない。したがって、ＳＤＳを治療するための方法および治療薬の改善が差し迫って求められている。
下記に記載されるように、本発明は、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する遺伝子がスプライシングされて機能性遺伝子産物を生成するように、プログラマブル核酸塩基エディターを用いてこの遺伝子を編集するための製品、組成物、および方法を特徴として備える。
一態様では、転写を可能にするようにポリヌクレオチドを編集する方法が提供され、本方法は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中の塩基エディターにポリヌクレオチドを接触させることを含み、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを標的に向けて、転写を可能にする変異を導入する変更をもたらす。一実施形態では、転写を可能にする変異とは、終止コドンを変更する変異、スプライスアクセプターもしくはスプライスドナー部位を導入する変異、またはスプライスアクセプターもしくはスプライスドナー部位を修正する変異である。
一態様では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異を含むＳＢＤＳポリヌクレオチドを編集する方法が提供され、本方法は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中の塩基エディターにＳＢＤＳポリヌクレオチドを接触させることを含み、前記塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを標的に向けて、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異の変更をもたらす。本方法またはその実施形態のうち一実施形態では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異は、遺伝子変換に起因する。本方法またはその実施形態のうち一実施形態では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異は、その遺伝子の終止コドンを誘発するか、またはスプライシングを変更する。本方法またはその実施形態のうち一実施形態では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異は、切詰を有するＳＢＤＳポリペプチドをコードする。
任意の上述の方法およびその実施形態のうち一実施形態では、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。一実施形態では、デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである。複数の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書で表７Ａまたは表７Ｂなどに挙げられたＡＢＥ８またはＡＢＥ８バリアントから選択される。上述の方法およびその実施形態のうち別の実施形態では、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。一実施形態では、シトシンデアミナーゼは、ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち、１つまたは複数から選択される。一実施形態では、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントは、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む。上述の方法およびその実施形態のうちの複数の実施形態では、２つ以上のガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを標的に向けて、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する２つ以上の変異の変更をもたらす。
別の態様では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異を含むＳＢＤＳポリヌクレオチドを編集する方法が提供され、本方法は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中のアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）にＳＢＤＳポリヌクレオチドを接触させることを含み、前記塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを標的に向けて、１８３～１８４ＴＡ＞ＣＴ Ｒｓ１１３９９３９９１のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更をもたらし、ミスセンス変異を生成する。一実施形態では、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、以下の配列のうち１つを標的とする：ＴＧＴＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＴＣまたはＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴ。一実施形態では、１つまたは複数のｓｇＲＮＡは、以下の配列のうち１つを含む：ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣまたはＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ。一実施形態では、ＡＢＥは、５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＧ－３’のＰＡＭ特異性を有する。
別の態様では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異を含むＳＢＤＳポリヌクレオチドを編集する方法であって、本方法は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中のシチジン塩基エディターにＳＢＤＳポリヌクレオチドを接触させることを含み、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）は、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとシチジンデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを標的に向けて、ｒｓ１１３９９３９９３ ２５８＋２Ｔ＞ＣのＣ・ＧからＴ・Ａへの変更をもたらす。一実施形態では、ＣＢＥは、５’－ＮＧＣ－３’ＰＡＭへの特異性または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭに対する特異性を有する。一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣ、ＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣ、ＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣ、ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴ、ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、またはＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣから選択されるポリヌクレオチド標的配列を標的とする。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、以下の配列のうち１つを含む：ＧＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣ；ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ；ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡ；ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、またはＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ。
任意の上述の方法とその実施形態の他の実施形態では、上記接触は細胞内にあり、細胞は真核細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞である。一実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏである。任意の上述の方法およびその実施形態のうち一実施形態では、塩基エディターは、ミスセンス変異を導入し、新しいスプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を挿入し、および／または変異を含むスプライスアクセプター部位もしくはスプライスドナー部位を修正する。任意の上述の方法およびその実施形態のうち一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ストレプトコッカス・カニスＣａｓ９（ＳｃＣａｓ９）、またはそれらのバリアントから選択されるＣａｓ９である。一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、野生型もしくは改変型のストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそのバリアントである。一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントである。一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントを含む。一実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、ＰＡＭ核酸配列の５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＧ－３’に対する特異性を有する。一実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、ＰＡＭ核酸配列５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントである。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントは、表１に挙げられたアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントは、図３Ａ～図３Ｃ、または図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含む。一実施形態では、改変されたＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントは、以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含む：
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣＲｄ２ＳｐＣａｓ９）。
任意の上述の方法およびその実施形態の他の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活性のまたはニッカーゼのバリアントである。一実施形態では、ニッカーゼバリアントは、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む。一実施形態では、デアミナーゼドメインは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデノシンまたはシトシンを脱アミノ化することができる。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼは、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡデアミナーゼである。一実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。一実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、以下の変更のうち１つまたは複数を含む：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。
一実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙからなる群から選択される変更の組合せを含む。
任意の上述の方法およびその実施形態の別の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、ｃｒＲＮＡは、ＳＤＳに関連する変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む。任意の上述の方法およびその実施形態の別の実施形態では、塩基エディターは、ＳＤＳに関連する変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある。
別の態様では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター、上記塩基エディターをコードするポリヌクレオチド、細胞に；および塩基エディターを標的に向けて異常なスプライシングに関連する変更をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを、細胞内またはその前駆体内に導入することによって産生される細胞が提供される。一実施形態では、細胞またはその前駆体は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞である。一実施形態では、細胞はＳＢＤＳタンパク質を発現する。一実施形態では、細胞は、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に罹っている対象に由来する。一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞またはヒト細胞である。細胞の一実施形態では、変異または変更は、異常なスプライシングにより生じる終止コドンおよび／または変異を含む遺伝子変換に起因する。一実施形態では、細胞は、ＳＤＳに関連する遺伝子変換について選択される。一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、野生型もしくは改変型のストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそのバリアントである。一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された野生型ＳｐＣａｓ９または改変型ＳｐＣａｓ９バリアントを含む。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、核酸配列５’－ＮＧＣ－３’またはまたは５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、表１に挙げられるＣａｓ９バリアントである。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである。上記細胞の一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、図３Ａ～図３Ｃまたは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントである。上記細胞の一実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下から選択されるアミノ酸配列／置換の組合せを含む：
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。上記細胞の実施形態では、プログラマブルポリヌクレオチド結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活性のバリアントまたはニッカーゼバリアントである。一実施形態では、ニッカーゼバリアントは、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む。上記細胞の一実施形態では、デアミナーゼドメインは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）内のシチジンを脱アミノ化することができるシチジンデアミナーゼドメインであるか、またはＤＮＡ内のアデノシンを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインである。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼは、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。上記細胞の別の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡデアミナーゼである。一実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。一実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、以下の変更のうち１つまたは複数を含む：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。一実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓからなる群から選択される変更の組合せを含む。上記細胞の別の実施形態では、シトシンデアミナーゼは、ＢＥ４；ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち、１つまたは複数から選択される。一実施形態では、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントは、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む。上記細胞の別の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、ｃｒＲＮＡは、ＳＤＳに関連する変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む。上記細胞の一実施形態では、塩基エディターおよび１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、細胞内で複合体を形成する。一実施形態では、塩基エディターは、ＳＤＳに関連付けられた遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある。
別の態様では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）または異常なスプライシングに関連する疾患を、それを必要とする対象において治療する方法が提供され、本方法は、上述の態様およびその記述された実施形態による細胞を対象に投与することを含む。本方法の一実施形態では、細胞は、自己由来であるか、対象と同種異系または異種である。
別の態様では、上述の態様およびその記述された実施形態による細胞から増殖または拡大された、単離された細胞または細胞集団が提供される。
別の態様では、対象におけるシュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）の治療方法が提供され、本方法は、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；および塩基エディターを標的に向けてＳＤＳに関連する変異の変更をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む。
別の態様では、対象における異常なスプライシングに関連する遺伝子疾患の治療方法を提供し、本方法は、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター、または塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；および塩基エディターを標的に向けてスプライシングを変更する病原性変異の変更をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む。
対象においてシュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）を治療する上述の方法、または対象において異常なスプライシングに関連する遺伝子疾患を治療する上述の方法の一実施形態では、対象は哺乳動物またはヒトである。一実施形態では、上述の方法は、塩基エディターまたは塩基エディターをコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとを、対象の細胞に送達することを含む。一実施形態では、細胞は、切詰型ポリペプチドを発現する。上述の方法の一実施形態では、変更は、ＳＢＤＳポリヌクレオチド中、ＴＡＡ終止をＴＧＧに変換する。本方法の別の実施形態では、変更は、ＳＤＳに関連するＳＢＤＳポリペプチドにおいてＫ６２Ｘを変える。本方法の別の実施形態では、ＳＤＳに関連する遺伝子変換は、切詰されたＳＢＤＳポリペプチドの発現を結果として生じる。本方法の別の実施形態では、塩基エディターの修正は、アミノ酸６２位でリジン（Ｋ）をトリプトファン（Ｗ）に置き換える。本方法の別の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、改変型ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはそのバリアントを含む。本方法の別の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された改変型ＳｐＣａｓ９を含む。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、ＰＡＭ核酸配列５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、表１に挙げられるＣａｓ９バリアントである。一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである。これらの方法の別の実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、図３Ａ～図３Ｃまたは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントである。一実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含む：
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。上記方法およびその実施形態の他の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活性のバリアントである。上述の方法の一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ニッカーゼバリアントである。一実施形態では、ニッカーゼバリアントは、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む。上記方法の一実施形態では、デアミナーゼドメインは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデノシンまたはシチジンを脱アミノ化することができる。一実施形態では、デアミナーゼドメインは、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡデアミナーゼである。一実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。一実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、１つまたは複数の以下の変更：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒを含むか；または、ＴａｄＡ＊７．１０は、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙからなる群から選択される変更の組合せを含む。上述の方法およびその実施形態の別の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち１つまたは複数から選択されるシチジンデアミナーゼである。一実施形態では、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントは、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む。上述の方法およびその実施形態の実施形態では、塩基エディターは、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列中のＳＮＰのｒｓ１１３９９３９９３ ２５８＋２Ｔ＞Ｃを標的として、正しいスプライシングを回復させる。上記方法の一実施形態では、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、ｃｒＲＮＡは、遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む。一実施形態では、塩基エディターは、ＳＤＳに関連付けられた遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある。
別の態様では、細胞またはその前駆体を産生する方法が提供され、本方法は：
（ａ）シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する遺伝子変換を含む誘導多能性幹細胞内に、
ポリヌクレオチド－プログラマブルヌクレオチド－結合ドメインとシチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインとを含む塩基エディターまたは塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；および
塩基エディターを標的に向けてＳＤＳに関連する変異に変更をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド
を導入すること；ならびに
（ｂ）誘導多能性幹細胞または前駆体を所望の細胞型に分化させること
を含む。本方法の一実施形態では、変異はＳＤＳに関連する遺伝子変換である。一実施形態では、細胞または前駆体は、ＳＤＳに罹っている対象から得られる。一実施形態では、細胞または前駆体は、哺乳類細胞またはヒト細胞である。本方法の別の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、改変型ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそれらのバリアントを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された改変型ＳｐＣａｓ９を含む。本方法の一実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、核酸配列５’－ＮＧＧ－３’に対する特異性を有し、改変型ＳｐＣａｓ９は、核酸配列５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する。本方法の一実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、表１に挙げられたＣａｓ９バリアントであるか、または改変型ＳｐＣａｓ９はｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである。本方法の別の実施形態では、改変型ＳｐＣａｓ９は、図３Ａ～図３Ｃまたは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントである。本方法の一実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含む：
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。本方法の一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活性のまたはニッカーゼのバリアントである。一実施形態では、ニッカーゼバリアントは、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む。本方法の一実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）内のアデノシンを脱アミノ化することができ、シチジンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）内のシトシンを脱アミノ化することができる。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼである。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４から選択されるＴａｄＡデアミナーゼである。本方法の別の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち、１つまたは複数から選択されるシチジンデアミナーゼである。一実施形態では、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントは、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む。本方法の一実施形態では、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、ｃｒＲＮＡは、ＳＤＳに関連する遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む。本方法の一実施形態では、塩基エディターおよび１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、細胞内で複合体を形成する。本方法の一実施形態では、塩基エディターは、ＳＤＳに関連する遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある。
別の態様では、以下のうち１つまたは複数から選択される５’から３’の核酸配列、またはその１、２、３、４、もしくは５ヌクレオチドの５’切詰断片を含む、ガイドＲＮＡが提供される：ＧＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣ；ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ；ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡＵ；ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣ；ＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ、ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、およびＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ。
別の態様では、ＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を編集するための塩基エディターシステムが提供され、塩基エディターシステムは：
（ａ）（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）ＳＢＤＳ遺伝子変換に存在するポリヌクレオチドまたはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
を含む塩基エディター；および
（ｂ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと連係するガイドポリヌクレオチドであって、少なくとも一部がＳＢＤＳ遺伝子、ＳＢＤＳ偽遺伝子、またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチド
を含み；
ポリヌクレオチドまたはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することにより、ＳＢＤＳ遺伝子の転写が可能となる。
別の態様では、異常なスプライシングを結果として生じる遺伝子内の変異を編集するための塩基エディターシステムが提供され、塩基エディターシステムは：
（ａ）（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）異常なスプライシングを結果として生じる変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメイン；および
（ｂ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと連係するガイドポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記遺伝子、またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチド
を含み；
変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することにより、転写が可能となる。
別の態様では、異常なスプライシングを結果として生じる遺伝子内の病原性変異を編集するための方法が提供され、本方法は：
少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を、
（ｉ）少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチドと連係する、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）異常なスプライシングを結果として生じる病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
を含む塩基エディターに接触させること；ならびに
標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けた際に病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、病原性変異を編集すること
を含み、
病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することにより、結果として、スプライシングを可能にする配列への病原性変異の変換が生じ、それによって病原性変異が修正される。
別の態様では、ＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を編集する方法が提供され、本方法は：
少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を、
（ｉ）少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチドと連係する、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
を含む塩基エディターに接触させること；ならびに
標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けると病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、病原性変異を編集すること
を含み、
病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することは、スプライシングを可能とし、それによってＳＢＤＳ遺伝子の病原性変異を編集する。病原性変異を編集する上述の方法の一実施形態では、ＳＢＤＳ内の病原性変異は、結果として遺伝子変換を生じる。一実施形態では、病原性変異は、上記遺伝子の終止コドンを導入するかまたはスプライシングを変更する。一実施形態では、病原性変異は、切詰を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、塩基エディターは、ミスセンス変異を導入するか、新しいスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を挿入するか、または変異を含むスプライスアクセプター部位もしくはスプライスドナー部位を修正する。一実施形態では、塩基エディターは、ＳＢＤＳ遺伝子内のｒｓ１１３９９３９９３ Ｃ→Ｔの変異を含むスプライスドナーＳＮＰ部位を修正する。
別の態様では、ＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を編集することによって対象においてＳＤＳを治療する方法が提供され、本方法は：
塩基エディターまたは塩基エディターをコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することであって、塩基エディターは：
（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
（ｉｉ）病原性変異またはその相補的な核酸塩基内の核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
を含む、投与すること；ならびに
ガイドポリヌクレオチドを対象に投与することであって、ガイドポリヌクレオチドが、少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向ける、投与すること；ならびに
標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けた際にＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、上記病原性変異を編集すること
を含み、
病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することにより、転写が可能となるか、または病原性変異が修正される。
別の態様では、細胞、組織、または器官のＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を修正することによって、それを必要とする対象においてＳＤＳを治療するための細胞、組織、または器官を産生する方法が提供され、本方法は：
細胞、組織、または器官を、
（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、
（ｉｉ）病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
を含む塩基エディターに接触させること；ならびに
細胞、組織、または器官をガイドポリヌクレオチドに接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドが、少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向ける、接触させること；ならびに
標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けると病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、上記変異を編集すること
を含み、
病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、スプライシングが可能となり、それによってＳＤＳを治療するための細胞、組織、または器官が産生される。一実施形態では、変異は遺伝子変換に起因する。別の実施形態では、シュワックマン・ダイアモンド症候群に関連する変異は、その遺伝子の終止コドンを誘発するか、またはスプライシングを変更する。別の実施形態では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異は、切詰を有するＳＢＤＳポリペプチドをコードする。別の実施形態では、塩基エディターは、ミスセンス変異を導入するか、新しいスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を挿入するか、または変異を含むスプライスアクセプター部位もしくはスプライスドナー部位を修正する。別の実施形態では、本方法は、細胞、組織、または器官を対象に投与することを含む。本方法の一実施形態では、細胞、組織、または器官は、自己由来であるか、対象と同種異系または異種である。本方法の別の実施形態では、デアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインである。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼドメインは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンを脱アミノ化することができ、シチジンデアミナーゼは、ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化することができる。
上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列、またはそれらの組合せを含み、ｃｒＲＮＡは、ＳＤＳに関連する変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、塩基エディターシステムまたは方法は、第２のガイドポリヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、第２のガイドポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。別の実施形態では、第２のガイドポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列、またはそれらの組合せを含む。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性がないかまたはニッカーゼである。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９ドメインを含む。一実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性のＣａｓ９を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼを含む。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、工学的に作製されるか改変されたポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、編集することにより、結果として２０％未満のインデル形成、１５％未満のインデル形成、１０％未満のインデル形成、５％未満のインデル形成、４％未満のインデル形成、３％未満のインデル形成、２％未満のインデル形成、１％未満のインデル形成、０．５％未満のインデル形成、または０．１％未満のインデル形成を生じる。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、編集することにより結果として転位を生じない。上述の塩基エディターシステム、または編集する方法、または治療する方法、およびその実施形態のいずれかの一実施形態では、塩基エディターは、ＳＢＤＳ遺伝子内のｒｓ１１３９９３９９３ Ｃ→Ｔの変異を含むスプライスドナーＳＮＰ部位を修正する。
別の態様では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）を、それを必要とする対象において治療する方法が提供され、本方法は、上述の態様およびその記述された実施形態の細胞を対象に投与することを含む。
上述の方法およびその実施形態、上述の細胞およびその実施形態、または上述の塩基エディターシステムおよびその実施形態、または編集、治療、細胞や組織などを産生する上述の方法およびその実施形態のうちいずれかの一実施形態では、塩基エディターならびに／またはその構成成分は、ｍＲＮＡによってコードされる。上述の方法およびその実施形態、上述の細胞およびその実施形態、または上述の塩基エディターシステムおよびその実施形態、または編集、治療、細胞や組織などを産生する上述の方法およびその実施形態のうちいずれかの別の実施形態では、請求項１２６～１５７のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法であって、塩基エディターは、ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な少なくとも１０個の隣接したヌクレオチドを含む核酸配列を含む。別の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接したヌクレオチドを含む核酸配列を含む。別の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な１８、１９、または２０個の隣接したヌクレオチドを含む核酸配列を含む。
別の態様では、ガイドＲＮＡに結合している塩基エディターを含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連するＳＢＤＳ遺伝子に相補的な核酸配列を含む。一実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼを含む。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデノシンを脱アミノ化することができる。一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４のうち１つまたは複数から選択されるＴａｄＡデアミナーゼである。一実施形態では、シチジンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のシチジンを脱アミノ化することができる。別の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ、Ａ３Ｆ、またはその誘導体である。組成物の一実施形態では、塩基エディターは、
（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼを含み；
（ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９を含み；
（ｉｉｉ）図３Ａ～３Ｃもしくは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントを含み；
（ｉｖ）以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントを含み：
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。
（ｖ）ＵＧＩドメインを含まず；ならびに／または
（ｖｉ）ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、もしくはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントから選択される、シチジンデアミナーゼを含む。組成物の一実施形態では、（ｖｉ）では、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントは、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む。一実施形態では、組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含む。
別の態様では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）の治療のための医薬組成物が提供され、医薬組成物は、上述の態様および実施形態の組成物を含み、医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体を含む。医薬組成物の一実施形態では、ｇＲＮＡおよび塩基エディターは、共にまたは別々に製剤化される。医薬組成物の一実施形態では、ｇＲＮＡは、以下のうち１つまたは複数から選択される５’から３’までの核酸配列またはその１、２、３、４、もしくは５個のヌクレオチドの５’切詰断片を含む：
ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡＵ；ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣ；ＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ、ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、およびＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ。一実施形態では、医薬組成物は、哺乳類細胞での発現に適したベクターをさらに含み、ベクターは、塩基エディターをコードするポリヌクレオチドを含む。医薬組成物の一実施形態では、塩基エディターをコードするポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。医薬組成物の一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。一実施形態では、医薬組成物は、哺乳類細胞での発現に適したリボ核粒子をさらに含む。
一態様では、（ｉ）塩基エディターをコードする核酸と；（ｉｉ）上述の態様のガイドＲＮＡであって、例えば以下のうち１つまたは複数から選択される５’から３’までの核酸配列またはその１、２、３、４、もしくは５個のヌクレオチドの５’切詰断片を含むガイドＲＮＡなどとを含む、医薬組成物が提供される：ＧＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣ；ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ；ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡＵ；ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣ；ＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ、ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、およびＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ。上述の態様またはその実施形態のいずれかの医薬組成物の一実施形態では、医薬組成物は脂質をさらに含む。
一態様では、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）を治療する方法が提供され、本方法は、上述の態様およびその実施形態のいずれかの医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
一態様では、対象でのシュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）の治療における上述の態様およびその実施形態のいずれかの医薬組成物の使用が提供される。使用の一実施形態では、対象はヒトである。
定義
以下の定義は当技術分野のそれを補うものであり、本願に向けられており、任意の関連または無関連の案件、例えば、任意の共同所有の特許または出願に帰属されるものではない。本明細書に記載されるものに類似のまたは等しい任意の方法および材料を、本開示を試すために実践に用いることができるが、好適な材料および方法が本明細書に記載される。したがって、本明細書に用いられる用語は、具体的な実施形態を記載することのみを目的としており、限定することを意図されていない。
別段に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本明細書の属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。以下の参照文献は、本発明に用いられる数多くの用語の一般的な定義を当業者に与える：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書に用いられるように、以下の用語は、別段に指定のない限り下記に帰する意味を有する。
本願では、別段に具体的な記述のない限り、単数形の使用は複数形を含む。なお、本明細書に用いられる際に、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段にコンテクストが明確に記述しない限り、複数形の言及を含む。本願では、「または」の使用は、別段に記述のない限り「および／または」を意味する。さらに、用語「含むこと（including）」ならびに他の形式、例えば「含む（include）」、「含む（includes）」、および「含まれる（included）」の使用は限定的ではない。
本明細書および特許請求の範囲に用いられる際に、文言「含むこと（comprising）」（および含むことの任意の形、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」など）、「有すること（having）」（および有することの任意の形、例えば「有する（have）」および「有する（has）」など）、「含むこと（including）」（および含むことの任意の形、例えば「含む（includes）」および「含む（include）」など、または「含有すること（containing）」（および含有することの任意の形、例えば「含有する（contains）」および「含有する（contain）」など）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の記載されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書に論じられた任意の実施形態が本開示の任意の方法または組成物に関して実行され得、その逆もまたあり得ることが考えられる。さらに、本開示の組成物を用いて、本開示の方法を実現することができる。
用語「約」または「およそ」とは、当業者によって決定される場合の特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味し、その範囲は、その値がどのように測定または決定されたか、すなわち測定システムの限界に、部分的に依存するものとなる。例えば、「約」とは、当技術分野の実践あたり１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、具体的には生物学的なシステムまたはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、例えば５倍以内、２倍以内を意味し得る。具体的な値が本願または特許請求の範囲に記載される場合、別段に記述のない限り、用語「約」とは、その具体的な値について許容可能な誤差範囲内を意味するものと考えられるべきである。
本明細書における「一部の実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、その実施形態と関連して記載されるある具体的な特色、構造、または特徴が本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが必ずしも全ての実施形態を含む訳ではないことを意味する。
「アデノシンデアミナーゼ」とは、アデニンまたはアデノシンの加水分解性脱アミノ化を触媒することができるポリペプチドまたはその断片を意味する。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンからイノシンまたはデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの加水分解性脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンまたはアデノシンの加水分解性脱アミノ化を触媒する。本明細書に示されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、工学的に改変されたアデノシンデアミナーゼ、進化型アデノシンデアミナーゼ）は、細菌などのどの生物に由来していてもよい。
一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物由来の天然のデアミナーゼのバリアントである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に発生しない。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然のデアミナーゼに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィムリウム、シェワネラ・プトレファシエンス、ヘモフィルス・インフルエンザ、またはカウロバクター・クレセンタスなどの細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡデアミナーゼである。一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、大腸菌ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）デアミナーゼまたはその断片である。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下の配列内の変更を含む：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
（ＴａｄＡ＊７．１０とも称する）。
一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、アミノ酸８２または１６６での変更を含む。具体的な実施形態では、上記の参照配列のバリアントは、下記の変更のうち１つまたは複数を含む：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、およびＱ１５４Ｒ。変更Ｙ１２３Ｈとは、Ｙ１２３Ｈ ＴａｄＡ（野生型）に戻ったＴａｄＡ＊７．１０内の変更Ｈ１２３Ｙを指す。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０配列のバリアントは、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙからなる群から選択される変更の組合せを含む。
他の実施形態では、本発明は、欠失を含むアデノシンデアミナーゼバリアント、例えば、残基１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、または１５７で始まるＣ末端の欠失を含むＴａｄＡ＊８を提供する。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、以下の変更のうち1つまたは複数を含むＴａｄＡ単量体（例えばＴａｄＡ＊８）である：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、以下の変更を含む単量体である：Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ。さらに他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、２つのアデノシンデアミナーゼドメインを含むホモ二量体であって、各ドメインは、１つまたは複数の以下の変更を有する：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、野生型アデノシンデアミナーゼドメインまたはＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、１つまたは複数の以下の変更を含むＴａｄＡ＊７．１０のアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、以下の変更を含むＴａｄＡ＊７．１０のアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である：Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ。
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むかまたはそれから実質的になるＴａｄＡ＊８である：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD。
一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は切詰型である。一部の実施形態では、切詰型ＴａｄＡ＊８は、完全長ＴａｄＡ＊８に比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠いている。一部の実施形態では、切詰型ＴａｄＡ＊８は、完全長ＴａｄＡ＊８に比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠いている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは完全長ＴａｄＡ＊８である。
具体的な実施形態では、アデノシンデアミナーゼヘテロ二量体は、ＴａｄＡ＊８ドメインと以下のうち１つから選択されるアデノシンデアミナーゼドメインとを含む：
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．アウレウス）ＴａｄＡ：
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAH AEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCSGS LMNLLQQSNFNHRAIVDKGVLKEACSTLLTTFFKNLRANKKSTN
バチルス・サブチルス（Ｂ．サブチルス）ＴａｄＡ：
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEML VIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKGGCSGTLMN LLQEERFNHQAEVVSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLSE
サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ティフィムリウム）ＴａｄＡ：
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEG WNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIG RVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIK ALKKADRAEGAGPAV
シェワネラ・プトレファシエンス（Ｓ．プトレファシエンス）ＴａｄＡ：
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAHAEI LCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGT VVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE
ヘモフィルス・インフルエンザＦ３０３１（Ｈ．インフルエンザ）ＴａｄＡ：
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTΑΗ AEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFGASDYK TGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK
カウロバクター・クレセンタス（Ｃ．クレセンタス）ＴａｄＡ：
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAH DPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADD PKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI
ジオバクター・スルフレデュセンス（Ｇ．スルフレデュセンス）ＴａｄＡ：
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSN DPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDP KGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP
ＴａｄＡ＊７．１０
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD.
「投与すること」とは、本明細書では、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物を患者または対象に与えることと呼ばれる。例としておよび限定はないが、組成物の投与、例えば注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射により実施することができる。１つまたは複数のそのような経路を採用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射によって、または経時的な漸次灌流によって行うことができる。あるいは、または同時に、投与を経口により行うことができる。
「剤」とは、任意の低分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
「変更」とは、本明細書に記載されるものなど標準的な技術の公知の方法によって検出される際の遺伝子またはポリペプチドの配列、発現レベル、または活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書に用いられるように、変更は、１０％の発現レベルの変化、２５％の変化、４０％の変化、および５０％以上の発現レベルの変化を含む。
「寛解する」とは、疾患の発達または進行を減少、抑制、減弱、漸減、抑止、または安定化することを意味する。
「類似体」とは、同一でないが類似の機能的または構造的な特性を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然のポリペプチドの生物活性を保持するとともに、天然のポリペプチドに比べてその類似体の機能を増強するある特定の生化学的な修飾を有する。そのような生化学的な修飾は、類似体のプロテアーゼ抵抗性、膜透過性、または半減期を、例えばリガンド結合を変えることなく増加し得る。類似体は非天然アミノ酸を含むことがある。
「塩基エディター（ＢＥ）」または「核酸塩基エディター（ＮＢＥ）」とは、ポリヌクレオチドに結合して核酸塩基修飾活性を有する剤を意味する。様々な実施形態では、塩基エディターは、核酸塩基修飾ポリペプチド（例えばデアミナーゼ）と、ガイドポリヌクレオチド（例えばガイドＲＮＡ）と連係するポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとを含む。様々な実施形態では、上記剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、すなわち、核酸分子（例えばＤＮＡ）内で塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を修飾することができるドメインを含む、生体分子複合体である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結されている。一実施形態では、上記剤は、塩基編集活性を有する１つまたは複数のドメインを含む融合タンパク質である。別の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインは、ガイドＲＮＡに（例えば、ガイドＲＮＡ上のＲＮＡ結合モチーフおよびデアミナーゼに融合されたＲＮＡ結合ドメインを介して）連結される。一部の実施形態では、塩基編集活性を有するドメインは、核酸分子内の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ分子内の１つまたは複数の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）またはアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ内のシトシン（Ｃ）およびアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターはシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）およびシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、循環置換体Ｃａｓ９（例えば、ｓｐＣａｓ９またはｓａＣａｓ９）である。循環置換体Ｃａｓ９は、当技術分野に公知であり、例えばOakes et al., Cell 176, 254-267, 2019に記載されている。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害物質、例えば、ＵＧＩドメインまたはｄＩＳＮドメインに融合されている。一部の実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼに融合されたＣａｓ９ニッカーゼと、ＵＧＩまたはｄＩＳＮドメインなどの塩基除去修復の阻害物質とを含む。他の実施形態では、塩基エディターは、脱塩基性塩基エディターである。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡからの進化型である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連（例えばＣａｓまたはＣｐｆ１）酵素である。一部の実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合された触媒として活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、デアミナーゼドメインに融合されたＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復（ＢＥＲ）の阻害物質に融合されている。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害物質は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）である。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害物質は、イノシン塩基除去修復の阻害物質である。塩基エディターの詳細は、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、そのどちらも本明細書に参照によりその全体が組み込まれている。また、全ての内容が参照によりここに組み込まれるKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)、およびRees, H.A., et al., “Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.” Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1も参照されたい。
一部の実施形態では、塩基エディター（例えばＡＢＥ８）は、循環置換体Ｃａｓ９（例えばｓｐＣＡＳ９）と二分核定位配列とを含むスキャフォールド内にアデノシンデアミナーゼバリアント（例えばＴａｄＡ＊８）をクローニングすることによって生成される。循環置換体Ｃａｓ９ｓは、当技術分野に公知であり、例えばOakes et al., Cell 176, 254-267, 2019に記載されている。例示的な循環置換体配列は下記に記載されるが、ボールド体の配列がＣａｓ９由来の配列を標示し、イタリック体の配列がリンカー配列を示し、下線部の配列が二分核定位配列を示す。
ＣＰ５（ＭＳＰ「ＮＧＣ＝変異を含むＰａｍバリアント 通常のＣａｓ９はＮＧＧを選好」ＰＩＤ＝タンパク質相互作用ドメインおよび「Ｄ１０Ａ」ニッカーゼ）：
Figure 2022545950000002
一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、下記の表７由来の塩基エディターから選択される。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡからの進化型であるアデノシンデアミナーゼを含有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８のアデノシンデアミナーゼバリアントは、下記の表７に記載されるようなＴａｄＡ＊８バリアントである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒからなる群から選択される変更の１つまたは複数を含むＴａｄＡ＊７．１０である。様々な実施形態では、ＡＢＥ８は、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙからなる群から選択される変更を有するＴａｄＡ＊７．１０を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は単量体構築物である。
一部の実施形態では、ＡＢＥ８はヘテロ二量体構築物である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８塩基エディターは以下の配列を含む：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
例として、本明細書に記載される塩基編集組成物、システム、および方法に用いられるアデニン塩基エディターＡＢＥは、下記に記載されるように核酸配列（８８７７塩基対）を有する（Addgene, Watertown, MA.; Gaudelli NM, et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471. doi: 10.1038/nature24644；Koblan LW, et al., Nat Biotechnol. 2018 Oct;36(9):843-846. doi: 10.1038/nbt.4172）。ＡＢＥ核酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列も包含される。
ATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACAT
GACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG
TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTG
ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCC
ATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGT
CAGATCCGCTAGAGATCCGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCGCCACCATGAAACGGACA
GCCGACGGAAGCGAGTTCGAGTCACCAAAGAAGAAGCGGAAAGTCTCTGAAGTCGAGTTTAGCCACGAGT
ATTGGATGAGGCACGCACTGACCCTGGCAAAGCGAGCATGGGATGAAAGAGAAGTCCCCGTGGGCGCCGT
GCTGGTGCACAACAATAGAGTGATCGGAGAGGGATGGAACAGGCCAATCGGCCGCCACGACCCTACCGCA
CACGCAGAGATCATGGCACTGAGGCAGGGAGGCCTGGTCATGCAGAATTACCGCCTGATCGATGCCACCC
TGTATGTGACACTGGAGCCATGCGTGATGTGCGCAGGAGCAATGATCCACAGCAGGATCGGAAGAGTGGT
GTTCGGAGCACGGGACGCCAAGACCGGCGCAGCAGGCTCCCTGATGGATGTGCTGCACCACCCCGGCATG
AACCACCGGGTGGAGATCACAGAGGGAATCCTGGCAGACGAGTGCGCCGCCCTGCTGAGCGATTTCTTTA
GAATGCGGAGACAGGAGATCAAGGCCCAGAAGAAGGCACAGAGCTCCACCGACTCTGGAGGATCTAGCGG
AGGATCCTCTGGAAGCGAGACACCAGGCACAAGCGAGTCCGCCACACCAGAGAGCTCCGGCGGCTCCTCC
GGAGGATCCTCTGAGGTGGAGTTTTCCCACGAGTACTGGATGAGACATGCCCTGACCCTGGCCAAGAGGG
CACGCGATGAGAGGGAGGTGCCTGTGGGAGCCGTGCTGGTGCTGAACAATAGAGTGATCGGCGAGGGCTG
GAACAGAGCCATCGGCCTGCACGACCCAACAGCCCATGCCGAAATTATGGCCCTGAGACAGGGCGGCCTG
GTCATGCAGAACTACAGACTGATTGACGCCACCCTGTACGTGACATTCGAGCCTTGCGTGATGTGCGCCG
GCGCCATGATCCACTCTAGGATCGGCCGCGTGGTGTTTGGCGTGAGGAACGCAAAAACCGGCGCCGCAGG
CTCCCTGATGGACGTGCTGCACTACCCCGGCATGAATCACCGCGTCGAAATTACCGAGGGAATCCTGGCA
GATGAATGTGCCGCCCTGCTGTGCTATTTCTTTCGGATGCCTAGACAGGTGTTCAATGCTCAGAAGAAGG
CCCAGAGCTCCACCGACTCCGGAGGATCTAGCGGAGGCTCCTCTGGCTCTGAGACACCTGGCACAAGCGA
GAGCGCAACACCTGAAAGCAGCGGGGGCAGCAGCGGGGGGTCAGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCC
ATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGG
TGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGA
AACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGC
TATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGT
CCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGC
CTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGAC
CTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACC
TGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGA
GGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGA
CGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCC
TGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAG
CAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTT
CTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCA
AGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGC
TCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCC
GGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGG
ACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAA
CGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTAC
CCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCC
CTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAA
CTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAG
AACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGC
TGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGC
CATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAG
AAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACAT
ACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGA
AGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCC
CACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCC
GGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGG
CTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAA
GCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTA
AGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGA
GAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGA
ATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACA
CCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGA
ACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGAC
TCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAG
AGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTT
CGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAG
CTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACG
ACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCG
GAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAAC
GCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACA
AGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTT
CTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGG
CCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGC
GGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAA
AGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAG
TACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGT
CCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAA
TCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAG
TACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAA
ACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGG
CTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATC
GAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCT
ACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAA
TCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAA
GAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTC
AGCTGGGAGGTGACTCTGGCGGCTCAAAAAGAACCGCCGACGGCAGCGAATTCGAGCCCAAGAAGAAGAG
GAAAGTCTAACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTT
CTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCAC
TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGT
GGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCT
CTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTA
ATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGA
AGCATAAAGTGTAAAGCCTAGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGC
CCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG
TTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA
GCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACA
TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCT
CCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAA
AGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGAT
ACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTC
GGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTA
TCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTA
ACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTA
CACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGC
TCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA
GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACACTCAGTGGAACGAAAACTC
ACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGA
AGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGG
CACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTAC
GATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCA
GATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCT
CCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGT
TGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCC
CAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGA
TCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTAC
TGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGT
ATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAA
AAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAG
TTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGA
GCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAC
TCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATG
TATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGA
TCGGGAGATCGATCTCCCGATCCCCTAGGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAA
GCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAAC
AAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGAT
GTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCAT
TAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC
CAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCAT
TGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATC
例として、本明細書に記載される塩基編集組成物、システム、および方法に用いられるシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）は、下記に記載されるように以下の核酸配列（８８７７塩基対）を有する（Addgene, Watertown, MA.; Komor AC, et al., 2017, Sci Adv., 30;3(8):eaao4774. doi: 10.1126/sciadv.aao4774）。ＢＥ４核酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列も包含される。
1 ATATGCCAAG TACGCCCCCT ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCATTATG
61 CCCAGTACAT GACCTTATGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTAGTCATCG
121 CTATTACCAT GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACATCAATGG GCGTGGATAG CGGTTTGACT
181 CACGGGGATT TCCAAGTCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT TGGCACCAAA
241 ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAACA ACTCCGCCCC ATTGACGCAA ATGGGCGGTA
301 GGCGTGTACG GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTGGTTT AGTGAACCGT CAGATCCGCT
361 AGAGATCCGC GGCCGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG CCGCCACCAT GAGCTCAGAG
421 ACTGGCCCAG TGGCTGTGGA CCCCACATTG AGACGGCGGA TCGAGCCCCA TGAGTTTGAG
481 GTATTCTTCG ATCCGAGAGA GCTCCGCAAG GAGACCTGCC TGCTTTACGA AATTAATTGG
541 GGGGGCCGGC ACTCCATTTG GCGACATACA TCACAGAACA CTAACAAGCA CGTCGAAGTC
601 AACTTCATCG AGAAGTTCAC GACAGAAAGA TATTTCTGTC CGAACACAAG GTGCAGCATT
661 ACCTGGTTTC TCAGCTGGAG CCCATGCGGC GAATGTAGTA GGGCCATCAC TGAATTCCTG
721 TCAAGGTATC CCCACGTCAC TCTGTTTATT TACATCGCAA GGCTGTACCA CCACGCTGAC
781 CCCCGCAATC GACAAGGCCT GCGGGATTTG ATCTCTTCAG GTGTGACTAT CCAAATTATG
841 ACTGAGCAGG AGTCAGGATA CTGCTGGAGA AACTTTGTGA ATTATAGCCC GAGTAATGAA
901 GCCCACTGGC CTAGGTATCC CCATCTGTGG GTACGACTGT ACGTTCTTGA ACTGTACTGC
961 ATCATACTGG GCCTGCCTCC TTGTCTCAAC ATTCTGAGAA GGAAGCAGCC ACAGCTGACA
1021 TTCTTTACCA TCGCTCTTCA GTCTTGTCAT TACCAGCGAC TGCCCCCACA CATTCTCTGG
1081 GCCACCGGGT TGAAATCTGG TGGTTCTTCT GGTGGTTCTA GCGGCAGCGA GACTCCCGGG
1141 ACCTCAGAGT CCGCCACACC CGAAAGTTCT GGTGGTTCTT CTGGTGGTTC TGATAAAAAG
1201 TATTCTATTG GTTTAGCCAT CGGCACTAAT TCCGTTGGAT GGGCTGTCAT AACCGATGAA
1261 TACAAAGTAC CTTCAAAGAA ATTTAAGGTG TTGGGGAACA CAGACCGTCA TTCGATTAAA
1321 AAGAATCTTA TCGGTGCCCT CCTATTCGAT AGTGGCGAAA CGGCAGAGGC GACTCGCCTG
1381 AAACGAACCG CTCGGAGAAG GTATACACGT CGCAAGAACC GAATATGTTA CTTACAAGAA
1441 ATTTTTAGCA ATGAGATGGC CAAAGTTGAC GATTCTTTCT TTCACCGTTT GGAAGAGTCC
1501 TTCCTTGTCG AAGAGGACAA GAAACATGAA CGGCACCCCA TCTTTGGAAA CATAGTAGAT
1561 GAGGTGGCAT ATCATGAAAA GTACCCAACG ATTTATCACC TCAGAAAAAA GCTAGTTGAC
1621 TCAACTGATA AAGCGGACCT GAGGTTAATC TACTTGGCTC TTGCCCATAT GATAAAGTTC
1681 CGTGGGCACT TTCTCATTGA GGGTGATCTA AATCCGGACA ACTCGGATGT CGACAAACTG
1741 TTCATCCAGT TAGTACAAAC CTATAATCAG TTGTTTGAAG AGAACCCTAT AAATGCAAGT
1801 GGCGTGGATG CGAAGGCTAT TCTTAGCGCC CGCCTCTCTA AATCCCGACG GCTAGAAAAC
1861 CTGATCGCAC AATTACCCGG AGAGAAGAAA AATGGGTTGT TCGGTAACCT TATAGCGCTC
1921 TCACTAGGCC TGACACCAAA TTTTAAGTCG AACTTCGACT TAGCTGAAGA TGCCAAATTG
1981 CAGCTTAGTA AGGACACGTA CGATGACGAT CTCGACAATC TACTGGCACA AATTGGAGAT
2041 CAGTATGCGG ACTTATTTTT GGCTGCCAAA AACCTTAGCG ATGCAATCCT CCTATCTGAC
2101 ATACTGAGAG TTAATACTGA GATTACCAAG GCGCCGTTAT CCGCTTCAAT GATCAAAAGG
2161 TACGATGAAC ATCACCAAGA CTTGACACTT CTCAAGGCCC TAGTCCGTCA GCAACTGCCT
2221 GAGAAATATA AGGAAATATT CTTTGATCAG TCGAAAAACG GGTACGCAGG TTATATTGAC
2281 GGCGGAGCGA GTCAAGAGGA ATTCTACAAG TTTATCAAAC CCATATTAGA GAAGATGGAT
2341 GGGACGGAAG AGTTGCTTGT AAAACTCAAT CGCGAAGATC TACTGCGAAA GCAGCGGACT
2401 TTCGACAACG GTAGCATTCC ACATCAAATC CACTTAGGCG AATTGCATGC TATACTTAGA
2461 AGGCAGGAGG ATTTTTATCC GTTCCTCAAA GACAATCGTG AAAAGATTGA GAAAATCCTA
2521 ACCTTTCGCA TACCTTACTA TGTGGGACCC CTGGCCCGAG GGAACTCTCG GTTCGCATGG
2581 ATGACAAGAA AGTCCGAAGA AACGATTACT CCATGGAATT TTGAGGAAGT TGTCGATAAA
2641 GGTGCGTCAG CTCAATCGTT CATCGAGAGG ATGACCAACT TTGACAAGAA TTTACCGAAC
2701 GAAAAAGTAT TGCCTAAGCA CAGTTTACTT TACGAGTATT TCACAGTGTA CAATGAACTC
2761 ACGAAAGTTA AGTATGTCAC TGAGGGCATG CGTAAACCCG CCTTTCTAAG CGGAGAACAG
2821 AAGAAAGCAA TAGTAGATCT GTTATTCAAG ACCAACCGCA AAGTGACAGT TAAGCAATTG
2881 AAAGAGGACT ACTTTAAGAA AATTGAATGC TTCGATTCTG TCGAGATCTC CGGGGTAGAA
2941 GATCGATTTA ATGCGTCACT TGGTACGTAT CATGACCTCC TAAAGATAAT TAAAGATAAG
3001 GACTTCCTGG ATAACGAAGA GAATGAAGAT ATCTTAGAAG ATATAGTGTT GACTCTTACC
3061 CTCTTTGAAG ATCGGGAAAT GATTGAGGAA AGACTAAAAA CATACGCTCA CCTGTTCGAC
3121 GATAAGGTTA TGAAACAGTT AAAGAGGCGT CGCTATACGG GCTGGGGACG ATTGTCGCGG
3181 AAACTTATCA ACGGGATAAG AGACAAGCAA AGTGGTAAAA CTATTCTCGA TTTTCTAAAG
3241 AGCGACGGCT TCGCCAATAG GAACTTTATG CAGCTGATCC ATGATGACTC TTTAACCTTC
3301 AAAGAGGATA TACAAAAGGC ACAGGTTTCC GGACAAGGGG ACTCATTGCA CGAACATATT
3361 GCGAATCTTG CTGGTTCGCC AGCCATCAAA AAGGGCATAC TCCAGACAGT CAAAGTAGTG
3421 GATGAGCTAG TTAAGGTCAT GGGACGTCAC AAACCGGAAA ACATTGTAAT CGAGATGGCA
3481 CGCGAAAATC AAACGACTCA GAAGGGGCAA AAAAACAGTC GAGAGCGGAT GAAGAGAATA
3541 GAAGAGGGTA TTAAAGAACT GGGCAGCCAG ATCTTAAAGG AGCATCCTGT GGAAAATACC
3601 CAATTGCAGA ACGAGAAACT TTACCTCTAT TACCTACAAA ATGGAAGGGA CATGTATGTT
3661 GATCAGGAAC TGGACATAAA CCGTTTATCT GATTACGACG TCGATCACAT TGTACCCCAA
3721 TCCTTTTTGA AGGACGATTC AATCGACAAT AAAGTGCTTA CACGCTCGGA TAAGAACCGA
3781 GGGAAAAGTG ACAATGTTCC AAGCGAGGAA GTCGTAAAGA AAATGAAGAA CTATTGGCGG
3841 CAGCTCCTAA ATGCGAAACT GATAACGCAA AGAAAGTTCG ATAACTTAAC TAAAGCTGAG
3901 AGGGGTGGCT TGTCTGAACT TGACAAGGCC GGATTTATTA AACGTCAGCT CGTGGAAACC
3961 CGCCAAATCA CAAAGCATGT TGCACAGATA CTAGATTCCC GAATGAATAC GAAATACGAC
4021 GAGAACGATA AGCTGATTCG GGAAGTCAAA GTAATCACTT TAAAGTCAAA ATTGGTGTCG
4081 GACTTCAGAA AGGATTTTCA ATTCTATAAA GTTAGGGAGA TAAATAACTA CCACCATGCG
4141 CACGACGCTT ATCTTAATGC CGTCGTAGGG ACCGCACTCA TTAAGAAATA CCCGAAGCTA
4201 GAAAGTGAGT TTGTGTATGG TGATTACAAA GTTTATGACG TCCGTAAGAT GATCGCGAAA
4261 AGCGAACAGG AGATAGGCAA GGCTACAGCC AAATACTTCT TTTATTCTAA CATTATGAAT
4321 TTCTTTAAGA CGGAAATCAC TCTGGCAAAC GGAGAGATAC GCAAACGACC TTTAATTGAA
4381 ACCAATGGGG AGACAGGTGA AATCGTATGG GATAAGGGCC GGGACTTCGC GACGGTGAGA
4441 AAAGTTTTGT CCATGCCCCA AGTCAACATA GTAAAGAAAA CTGAGGTGCA GACCGGAGGG
4501 TTTTCAAAGG AATCGATTCT TCCAAAAAGG AATAGTGATA AGCTCATCGC TCGTAAAAAG
4561 GACTGGGACC CGAAAAAGTA CGGTGGCTTC GATAGCCCTA CAGTTGCCTA TTCTGTCCTA
4621 GTAGTGGCAA AAGTTGAGAA GGGAAAATCC AAGAAACTGA AGTCAGTCAA AGAATTATTG
4681 GGGATAACGA TTATGGAGCG CTCGTCTTTT GAAAAGAACC CCATCGACTT CCTTGAGGCG
4741 AAAGGTTACA AGGAAGTAAA AAAGGATCTC ATAATTAAAC TACCAAAGTA TAGTCTGTTT
4801 GAGTTAGAAA ATGGCCGAAA ACGGATGTTG GCTAGCGCCG GAGAGCTTCA AAAGGGGAAC
4861 GAACTCGCAC TACCGTCTAA ATACGTGAAT TTCCTGTATT TAGCGTCCCA TTACGAGAAG
4921 TTGAAAGGTT CACCTGAAGA TAACGAACAG AAGCAACTTT TTGTTGAGCA GCACAAACAT
4981 TATCTCGACG AAATCATAGA GCAAATTTCG GAATTCAGTA AGAGAGTCAT CCTAGCTGAT
5041 GCCAATCTGG ACAAAGTATT AAGCGCATAC AACAAGCACA GGGATAAACC CATACGTGAG
5101 CAGGCGGAAA ATATTATCCA TTTGTTTACT CTTACCAACC TCGGCGCTCC AGCCGCATTC
5161 AAGTATTTTG ACACAACGAT AGATCGCAAA CGATACACTT CTACCAAGGA GGTGCTAGAC
5221 GCGACACTGA TTCACCAATC CATCACGGGA TTATATGAAA CTCGGATAGA TTTGTCACAG
5281 CTTGGGGGTG ACTCTGGTGG TTCTGGAGGA TCTGGTGGTT CTACTAATCT GTCAGATATT
5341 ATTGAAAAGG AGACCGGTAA GCAACTGGTT ATCCAGGAAT CCATCCTCAT GCTCCCAGAG
5401 GAGGTGGAAG AAGTCATTGG GAACAAGCCG GAAAGCGATA TACTCGTGCA CACCGCCTAC
5461 GACGAGAGCA CCGACGAGAA TGTCATGCTT CTGACTAGCG ACGCCCCTGA ATACAAGCCT
5521 TGGGCTCTGG TCATACAGGA TAGCAACGGT GAGAACAAGA TTAAGATGCT CTCTGGTGGT
5581 TCTGGAGGAT CTGGTGGTTC TACTAATCTG TCAGATATTA TTGAAAAGGA GACCGGTAAG
5641 CAACTGGTTA TCCAGGAATC CATCCTCATG CTCCCAGAGG AGGTGGAAGA AGTCATTGGG
5701 AACAAGCCGG AAAGCGATAT ACTCGTGCAC ACCGCCTACG ACGAGAGCAC CGACGAGAAT
5761 GTCATGCTTC TGACTAGCGA CGCCCCTGAA TACAAGCCTT GGGCTCTGGT CATACAGGAT
5821 AGCAACGGTG AGAACAAGAT TAAGATGCTC TCTGGTGGTT CTCCCAAGAA GAAGAGGAAA
5881 GTCTAACCGG TCATCATCAC CATCACCATT GAGTTTAAAC CCGCTGATCA GCCTCGACTG
5941 TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG
6001 AAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA
6061 GTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG
6121 AAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA
6181 CCAGCTGGGG CTCGATACCG TCGACCTCTA GCTAGAGCTT GGCGTAATCA TGGTCATAGC
6241 TGTTTCCTGT GTGAAATTGT TATCCGCTCA CAATTCCACA CAACATACGA GCCGGAAGCA
6301 TAAAGTGTAA AGCCTAGGGT GCCTAATGAG TGAGCTAACT CACATTAATT GCGTTGCGCT
6361 CACTGCCCGC TTTCCAGTCG GGAAACCTGT CGTGCCAGCT GCATTAATGA ATCGGCCAAC
6421 GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC
6481 TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT
6541 TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG
6601 CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG
6661 AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT
6721 ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA
6781 CCGGATACCT GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT
6841 GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG CACGAACCCC
6901 CCGTTCAGCC CGACCGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA
6961 GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG
7021 TAGGCGGTGC TACAGAGTTC TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGAACAG
7081 TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT
7141 GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA
7201 CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC
7261 AGTGGAACGA AAACTCACGT TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA
7321 CCTAGATCCT TTTAAATTAA AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA
7381 CTTGGTCTGA CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT
7441 TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT
7501 TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT
7561 TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT
7621 CCGCCTCCAT CCAGTCTATT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA
7681 ATAGTTTGCG CAACGTTGTT GCCATTGCTA CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG
7741 GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT
7801 TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG
7861 CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG
7921 TAAGATGCTT TTCTGTGACT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC
7981 GGCGACCGAG TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA TACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA
8041 CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC
8101 CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT
8161 TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG
8221 GAATAAGGGC GACACGGAAA TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA
8281 GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA
8341 AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC GACGGATCGG
8401 GAGATCGATC TCCCGATCCC CTAGGGTCGA CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT
8461 AGTTAAGCCA GTATCTGCTC CCTGCTTGTG TGTTGGAGGT CGCTGAGTAG TGCGCGAGCA
8521 AAATTTAAGC TACAACAAGG CAAGGCTTGA CCGACAATTG CATGAAGAAT CTGCTTAGGG
8581 TTAGGCGTTT TGCGCTGCTT CGCGATGTAC GGGCCAGATA TACGCGTTGA CATTGATTAT
8641 TGACTAGTTA TTAATAGTAA TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT
8701 TCCGCGTTAC ATAACTTACG GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC
8761 CATTGACGTC AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC
8821 GTCAATGGGT GGAGTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATC
一部の実施形態では、シチジン塩基エディターは、以下のうち１つから選択される核酸配列を有するＢＥ４である：
本来のＢＥ４核酸配列：
ATGagctcagagactggcccagtggctgtggaccccacattgagacggcggatcgagccccatgagtttgaggtattcttcgatccgagagagctccgcaaggagacctgcctgctttacgaaattaattgggggggccggcactccatttggcgacatacatcacagaacactaacaagcacgtcgaagtcaacttcatcgagaagttcacgacagaaagatatttctgtccgaacacaaggtgcagcattacctggtttctcagctggagccgcgaatgtagtagggccatcactgaattcctgtcaaggtatccccacgtcactctgtttatttacatcgcaaggctgtaccaccacgctgacccccgcaatcgacaaggcctgcgggatttgatctcttcaggtgtgactatccaaattatgactgagcaggagtcaggatactgctggagaaactttgtgaattatagcccgagtaatgaagcccactggcctaggtatccccatctgtgggtacgactgtacgttcttgaactgtactgcatcatactgggcctgcctccttgtctcaacattctgagaaggaagcagccacagctgacattctttaccatcgctcttcagtcttgtcattaccagcgactgcccccacacattctctgggccaccgggttgaaatctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttctggtggttcttctggtggttctgataaaaagtattctattggtttagccatcggcactaattccgttggatgggctgtcataaccgatgaatacaaagtaccttcaaagaaatttaaggtgttggggaacacagaccgtcattcgattaaaaagaatcttatcggtgccctcctattcgatagtggcgaaacggcagaggcgactcgcctgaaacgaaccgctcggagaaggtatacacgtcgcaagaaccgaatatgttacttacaagaaatttttagcaatgagatggccaaagttgacgattctttctttcaccgtttggaagagtccttccttgtcgaagaggacaagaaacatgaacggcaccccatctttggaaacatagtagatgaggtggcatatcatgaaaagtacccaacgatttatcacctcagaaaaaagctagttgactcaactgataaagcggacctgaggttaatctacttggctcttgcccatatgataaagttccgtgggcactttctcattgagggtgatctaaatccggacaactcggatgtcgacaaactgttcatccagttagtacaaacctataatcagttgtttgaagagaaccctataaatgcaagtggcgtggatgcgaaggctattcttagcgcccgcctctctaaatcccgacggctagaaaacctgatcgcacaattacccggagagaagaaaaatgggttgttcggtaaccttatagcgctctcactaggcctgacaccaaattttaagtcgaacttcgacttagctgaagatgccaaattgcagcttagtaaggacacgtacgatgacgatctcgacaatctactggcacaaattggagatcagtatgcggacttatttttggctgccaaaaaccttagcgatgcaatcctcctatctgacatactgagagttaatactgagattaccaaggcgccgttatccgcttcaatgatcaaaaggtacgatgaacatcaccaagacttgacacttctcaaggccctagtccgtcagcaactgcctgagaaatataaggaaatattctttgatcagtcgaaaaacgggtacgcaggttatattgacggcggagcgagtcaagaggaattctacaagtttatcaaacccatattagagaagatggatgggacggaagagttgcttgtaaaactcaatcgcgaagatctactgcgaaagcagcggactttcgacaacggtagcattccacatcaaatccacttaggcgaattgcatgctatacttagaaggcaggaggatttttatccgttcctcaaagacaatcgtgaaaagattgagaaaatcctaacctttcgcataccttactatgtgggacccctggcccgagggaactctcggttcgcatggatgacaagaaagtccgaagaaacgattactccatggaattttgaggaagttgtcgataaaggtgcgtcagctcaatcgttcatcgagaggatgaccaactttgacaagaatttaccgaacgaaaaagtattgcctaagcacagtttactttacgagtatttcacagtgtacaatgaactcacgaaagttaagtatgtcactgagggcatgcgtaaacccgcctttctaagcggagaacagaagaaagcaatagtagatctgttattcaagaccaaccgcaaagtgacagttaagcaattgaaagaggactactttaagaaaattgaatgcttcgattctgtcgagatctccggggtagaagatcgatttaatgcgtcacttggtacgtatcatgacctcctaaagataattaaagataaggacttcctggataacgaagagaatgaagatatcttagaagatatagtgttgactcttaccctctttgaagatcgggaaatgattgaggaaagactaaaaacatacgctcacctgttcgacgataaggttatgaaacagttaaagaggcgtcgctatacgggctggggacgattgtcgcggaaacttatcaacgggataagagacaagcaaagtggtaaaactattctcgattttctaaagagcgacggcttcgccaataggaactttatgcagctgatccatgatgactctttaaccttcaaagaggatatacaaaaggcacaggtttccggacaaggggactcattgcacgaacatattgcgaatcttgctggttcgccagccatcaaaaagggcatactccagacagtcaaagtagtggatgagctagttaaggtcatgggacgtcacaaaccggaaaacattgtaatcgagatggcacgcgaaaatcaaacgactcagaaggggcaaaaaaacagtcgagagcggatgaagagaatagaagagggtattaaagaactgggcagccagatcttaaaggagcatcctgtggaaaatacccaattgcagaacgagaaactttacctctattacctacaaaatggaagggacatgtatgttgatcaggaactggacataaaccgtttatctgattacgacgtcgatcacattgtaccccaatcctttttgaaggacgattcaatcgacaataaagtgcttacacgctcggataagaaccgagggaaaagtgacaatgttccaagcgaggaagtcgtaaagaaaatgaagaactattggcggcagctcctaaatgcgaaactgataacgcaaagaaagttcgataacttaactaaagctgagaggggtggcttgtctgaacttgacaaggccggatttattaaacgtcagctcgtggaaacccgccaaatcacaaagcatgttgcacagatactagattcccgaatgaatacgaaatacgacgagaacgataagctgattcgggaagtcaaagtaatcactttaaagtcaaaattggtgtcggacttcagaaaggattttcaattctataaagttagggagataaataactaccaccatgcgcacgacgcttatcttaatgccgtcgtagggaccgcactcattaagaaatacccgaagctagaaagtgagtttgtgtatggtgattacaaagtttatgacgtccgtaagatgatcgcgaaaagcgaacaggagataggcaaggctacagccaaatacttcttttattctaacattatgaatttctttaagacggaaatcactctggcaaacggagagatacgcaaacgacctttaattgaaaccaatggggagacaggtgaaatcgtatgggataagggccgggacttcgcgacggtgagaaaagttttgtccatgccccaagtcaacatagtaaagaaaactgaggtgcagaccggagggttttcaaaggaatcgattcttccaaaaaggaatagtgataagctcatcgctcgtaaaaaggactgggacccgaaaaagtacggtggcttcgatagccctacagttgcctattctgtcctagtagtggcaaaagttgagaagggaaaatccaagaaactgaagtcagtcaaagaattattggggataacgattatggagcgctcgtcttttgaaaagaaccccatcgacttccttgaggcgaaaggttacaaggaagtaaaaaaggatctcataattaaactaccaaagtatagtctgtttgagttagaaaatggccgaaaacggatgttggctagcgccggagagcttcaaaaggggaacgaactcgcactaccgtctaaatacgtgaatttcctgtatttagcgtcccattacgagaagttgaaaggttcacctgaagataacgaacagaagcaactttttgttgagcagcacaaacattatctcgacgaaatcatagagcaaatttcggaattcagtaagagagtcatcctagctgatgccaatctggacaaagtattaagcgcatacaacaagcacagggataaacccatacgtgagcaggcggaaaatattatccatttgtttactcttaccaacctcggcgctccagccgcattcaagtattttgacacaacgatagatcgcaaacgatacacttctaccaaggaggtgctagacgcgacactgattcaccaatccatcacgggattatatgaaactcggatagatttgtcacagcttgggggtgactctggtggttctggaggatctggtggttctactaatctgtcagatattattgaaaaggagaccggtaagcaactggttatccaggaatccatcctcatgctcccagaggaggtggaagaagtcattgggaacaagccggaaagcgatatactcgtgcacaccgcctacgacgagagcaccgacgagaatgtcatgcttctgactagcgacgcccctgaatacaagccttgggctctggtcatacaggatagcaacggtgagaacaagattaagatgctctctggtggttctggaggatctggtggttctactaatctgtcagatattattgaaaaggagaccggtaagcaactggttatccaggaatccatcctcatgctcccagaggaggtggaagaagtcattgggaacaagccggaaagcgatatactcgtgcacaccgcctacgacgagagcaccgacgagaatgtcatgcttctgactagcgacgcccctgaatacaagccttgggctctggtcatacaggatagcaacggtgagaacaagattaagatgctctctggtggttctAAAAGGACGGCGGACGGATCAGAGTTCGAGAGTCCGAAAAAAAAACGAAAGGTCGAAtaa
ＢＥ４コドン最適化１核酸配列：
ATGTCATCCGAAACCGGGCCAGTGGCCGTAGACCCAACACTCAGGAGGCGGATAGAACCCCATGAGTTTGAAGTGTTCTTCGACCCCAGAGAGCTGCGCAAAGAGACTTGCCTCCTGTATGAAATAAATTGGGGGGGTCGCCATTCAATTTGGAGGCACACTAGCCAGAATACTAACAAACACGTGGAGGTAAATTTTATCGAGAAGTTTACCACCGAAAGATACTTTTGCCCCAATACACGGTGTTCAATTACCTGGTTTCTGTCATGGAGTCCATGTGGAGAATGTAGTAGAGCGATAACTGAGTTCCTGTCTCGATATCCTCACGTCACGTTGTTTATATACATCGCTCGGCTTTATCACCATGCGGACCCGCGGAACAGGCAAGGTCTTCGGGACCTCATATCCTCTGGGGTGACCATCCAGATAATGACGGAGCAAGAGAGCGGATACTGCTGGCGAAACTTTGTTAACTACAGCCCAAGCAATGAGGCACACTGGCCTAGATATCCGCATCTCTGGGTTCGACTGTATGTCCTTGAACTGTACTGCATAATTCTGGGACTTCCGCCATGCTTGAACATTCTGCGGCGGAAACAACCACAGCTGACCTTTTTCACGATTGCTCTCCAAAGTTGTCACTACCAGCGATTGCCACCCCACATCTTGTGGGCTACTGGACTCAAGTCTGGAGGAAGTTCAGGCGGAAGCAGCGGGTCTGAAACGCCCGGAACCTCAGAGAGCGCAACGCCCGAAAGCTCTGGAGGGTCAAGTGGTGGTAGTGATAAGAAATACTCCATCGGCCTCGCCATCGGTACGAATTCTGTCGGTTGGGCCGTTATCACCGATGAGTACAAGGTCCCTTCTAAGAAATTCAAGGTTTTGGGCAATACAGACCGCCATTCTATAAAAAAAAACCTGATCGGCGCCCTTTTGTTTGACAGTGGTGAGACTGCTGAAGCGACTCGCCTGAAGCGAACTGCCAGGAGGCGGTATACGAGGCGAAAAAACCGAATTTGTTACCTCCAGGAGATTTTCTCAAATGAAATGGCCAAGGTAGATGATAGTTTTTTTCACCGCTTGGAAGAAAGTTTTCTCGTTGAGGAGGACAAAAAGCACGAGAGGCACCCAATCTTTGGCAACATAGTCGATGAGGTCGCATACCATGAGAAATATCCTACGATCTATCATCTCCGCAAGAAGCTGGTCGATAGCACGGATAAAGCTGACCTCCGGCTGATCTACCTTGCTCTTGCTCACATGATTAAATTCAGGGGCCATTTCCTGATAGAAGGAGACCTCAATCCCGACAATTCTGATGTCGACAAACTGTTTATTCAGCTCGTTCAGACCTATAATCAACTCTTTGAGGAGAACCCCATCAATGCTTCAGGGGTGGACGCAAAGGCCATTTTGTCCGCGCGCTTGAGTAAATCACGACGCCTCGAGAATTTGATAGCTCAACTGCCGGGTGAGAAGAAAAACGGGTTGTTTGGGAATCTCATAGCGTTGAGTTTGGGACTTACGCCAAACTTTAAGTCTAACTTTGATTTGGCCGAAGATGCCAAATTGCAGCTGTCCAAAGATACCTATGATGACGACTTGGATAACCTTCTTGCGCAGATTGGTGACCAATACGCGGATCTGTTTCTTGCCGCAAAAAATCTGTCCGACGCCATACTCTTGTCCGATATACTGCGCGTCAATACTGAGATAACTAAGGCTCCCCTCAGCGCGTCCATGATTAAAAGATACGATGAGCACCACCAAGATCTCACTCTGTTGAAAGCCCTGGTTCGCCAGCAGCTTCCAGAGAAGTATAAGGAGATATTTTTCGACCAATCTAAAAACGGCTATGCGGGTTACATTGACGGTGGCGCCTCTCAAGAAGAATTCTACAAGTTTATAAAGCCGATACTTGAGAAAATGGACGGTACAGAGGAATTGTTGGTTAAGCTCAATCGCGAGGACTTGTTGAGAAAGCAGCGCACATTTGACAATGGTAGTATTCCACACCAGATTCATCTGGGCGAGTTGCATGCCATTCTTAGAAGACAAGAAGATTTTTATCCGTTTCTGAAAGATAACAGAGAAAAGATTGAAAAGATACTTACCTTTCGCATACCGTATTATGTAGGTCCCCTGGCTAGAGGGAACAGTCGCTTCGCTTGGATGACTCGAAAATCAGAAGAAACAATAACCCCCTGGAATTTTGAAGAAGTGGTAGATAAAGGTGCGAGTGCCCAATCTTTTATTGAGCGGATGACAAATTTTGACAAGAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCCAAGCATTCCCTTTTGTATGAATACTTTACAGTATATAATGAACTGACTAAAGTGAAGTACGTTACCGAGGGGATGCGAAAGCCAGCTTTTCTCAGTGGCGAGCAGAAAAAAGCAATAGTTGACCTGCTGTTCAAGACGAATAGGAAGGTTACCGTCAAACAGCTCAAAGAAGATTACTTTAAAAAGATCGAATGTTTTGATTCAGTTGAGATAAGCGGAGTAGAGGATAGATTTAACGCAAGTCTTGGAACTTATCATGACCTTTTGAAGATCATCAAGGATAAAGATTTTTTGGACAACGAGGAGAATGAAGATATCCTGGAAGATATAGTACTTACCTTGACGCTTTTTGAAGATCGAGAGATGATCGAGGAGCGACTTAAGACGTACGCACATCTCTTTGACGATAAGGTTATGAAACAATTGAAACGCCGGCGGTATACTGGCTGGGGCAGGCTTTCTCGAAAGCTGATTAATGGTATCCGCGATAAGCAGTCTGGAAAGACAATCCTTGACTTTCTGAAAAGTGATGGATTTGCAAATAGAAACTTTATGCAGCTTATACATGATGACTCTTTGACGTTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTATCCGGCCAAGGGGATAGCCTCCATGAACACATAGCCAACCTGGCCGGCTCACCAGCTATTAAAAAGGGAATATTGCAAACCGTTAAGGTTGTTGACGAACTCGTTAAGGTTATGGGCCGACACAAACCAGAGAATATCGTGATTGAGATGGCTAGGGAGAATCAGACCACTCAAAAAGGTCAGAAAAATTCTCGCGAAAGGATGAAGCGAATTGAAGAGGGAATCAAAGAACTTGGCTCTCAAATTTTGAAAGAGCACCCGGTAGAAAACACTCAGCTGCAGAATGAAAAGCTGTATCTGTATTATCTGCAGAATGGTCGAGATATGTACGTTGATCAGGAGCTGGATATCAATAGGCTCAGTGACTACGATGTCGACCACATCGTTCCTCAATCTTTCCTGAAAGATGACTCTATCGACAACAAAGTGTTGACGCGATCAGATAAGAACCGGGGAAAATCCGACAATGTACCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAGATGAAAAACTATTGGAGACAATTGCTGAACGCCAAGCTCATAACACAACGCAAGTTCGATAACTTGACGAAAGCCGAAAGAGGTGGGTTGTCAGAATTGGACAAAGCTGGCTTTATTAAGCGCCAATTGGTGGAGACCCGGCAGATTACGAAACACGTAGCACAAATTTTGGATTCACGAATGAATACCAAATACGACGAAAACGACAAATTGATACGCGAGGTGAAAGTGATTACGCTTAAGAGTAAGTTGGTTTCCGATTTCAGGAAGGATTTTCAGTTTTACAAAGTAAGAGAAATAAACAACTACCACCACGCCCATGATGCTTACCTCAACGCGGTAGTTGGCACAGCTCTTATCAAAAAATATCCAAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTTTACGGTGACTATAAAGTATACGACGTTCGGAAGATGATAGCCAAATCAGAGCAGGAAATTGGGAAGGCAACCGCAAAATACTTCTTCTATTCAAACATCATGAACTTCTTTAAGACGGAGATTACGCTCGCGAACGGCGAAATACGCAAGAGGCCCCTCATAGAGACTAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTATGGGACAAAGGACGGGACTTTGCGACCGTTAGAAAAGTACTTTCAATGCCACAAGTGAATATTGTTAAAAAGACAGAAGTACAAACAGGGGGGTTCAGTAAGGAATCCATTTTGCCCAAGCGGAACAGTGATAAATTGATAGCAAGGAAAAAAGATTGGGACCCTAAGAAGTACGGTGGTTTCGACTCTCCTACCGTTGCATATTCAGTCCTTGTAGTTGCGAAAGTGGAAAAGGGGAAAAGTAAGAAGCTTAAGAGTGTTAAAGAGCTTCTGGGCATAACCATAATGGAACGGTCTAGCTTCGAGAAAAATCCAATTGACTTTCTCGAGGCTAAAGGTTACAAGGAGGTAAAAAAGGACCTGATAATTAAACTCCCAAAGTACAGTCTCTTCGAGTTGGAGAATGGGAGGAAGAGAATGTTGGCATCTGCAGGGGAGCTCCAAAAGGGGAACGAGCTGGCTCTGCCTTCAAAATACGTGAACTTTCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAACTCAAGGGTTCTCCTGAGGATAACGAGCAGAAACAGCTGTTTGTAGAGCAGCACAAGCATTACCTGGACGAGATAATTGAGCAAATTAGTGAGTTCTCAAAAAGAGTAATCCTTGCAGACGCGAATCTGGATAAAGTTCTTTCCGCCTATAATAAGCACCGGGACAAGCCTATACGAGAACAAGCCGAGAACATCATTCACCTCTTTACCCTTACTAATCTGGGCGCGCCGGCCGCCTTCAAATACTTCGACACCACGATAGACAGGAAAAGGTATACGAGTACCAAAGAAGTACTTGACGCCACTCTCATCCACCAGTCTATAACAGGGTTGTACGAAACGAGGATAGATTTGTCCCAGCTCGGCGGCGACTCAGGAGGGTCAGGCGGCTCCGGTGGATCAACGAATCTTTCCGACATAATCGAGAAAGAAACCGGCAAACAGTTGGTGATCCAAGAATCAATCCTGATGCTGCCTGAAGAAGTAGAAGAGGTGATTGGCAACAAACCTGAGTCTGACATTCTTGTCCACACCGCGTATGACGAGAGCACGGACGAGAACGTTATGCTTCTCACTAGCGACGCCCCTGAGTATAAACCATGGGCGCTGGTCATCCAAGATTCCAATGGGGAAAACAAGATTAAGATGCTTAGTGGTGGGTCTGGAGGGAGCGGTGGGTCCACGAACCTCAGCGACATTATTGAAAAAGAGACTGGTAAACAACTTGTAATACAAGAGTCTATTCTGATGTTGCCTGAAGAGGTGGAGGAGGTGATTGGGAACAAACCGGAGTCTGATATACTTGTTCATACCGCCTATGACGAATCTACTGATGAGAATGTGATGCTTTTaACGTCAGACGCTCCCGAGTACAAACCCTGGGCTCTGGTGATTCAGGACAGCAATGGTGAGAATAAGATTAAAATGTTGAGTGGGGGCTCAAAGCGCACGGCTGACGGTAGCGAATTTGAGAGCCCCAAAAAAAAACGAAAGGTCGAAtaa
ＢＥ４コドン最適化２核酸配列：
ATGAGCAGCGAGACAGGCCCTGTGGCTGTGGATCCTACACTGCGGAGAAGAATCGAGCCCCACGAGTTCGAGGTGTTCTTCGACCCCAGAGAGCTGCGGAAAGAGACATGCCTGCTGTACGAGATCAACTGGGGCGGCAGACACTCTATCTGGCGGCACACAAGCCAGAACACCAACAAGCACGTGGAAGTGAACTTTATCGAGAAGTTTACGACCGAGCGGTACTTCTGCCCCAACACCAGATGCAGCATCACCTGGTTTCTGAGCTGGTCCCCTTGCGGCGAGTGCAGCAGAGCCATCACCGAGTTTCTGTCCAGATATCCCCACGTGACCCTGTTCATCTATATCGCCCGGCTGTACCACCACGCCGATCCTAGAAATAGACAGGGACTGCGCGACCTGATCAGCAGCGGAGTGACCATCCAGATCATGACCGAGCAAGAGAGCGGCTACTGCTGGCGGAACTTCGTGAACTACAGCCCCAGCAACGAAGCCCACTGGCCTAGATATCCTCACCTGTGGGTCCGACTGTACGTGCTGGAACTGTACTGCATCATCCTGGGCCTGCCTCCATGCCTGAACATCCTGAGAAGAAAGCAGCCTCAGCTGACCTTCTTCACAATCGCCCTGCAGAGCTGCCACTACCAGAGACTGCCTCCACACATCCTGTGGGCCACCGGACTTAAGAGCGGAGGATCTAGCGGCGGCTCTAGCGGATCTGAGACACCTGGCACAAGCGAGTCTGCCACACCTGAGAGTAGCGGCGGATCTTCTGGCGGCTCCGACAAGAAGTACTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAATCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAAGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGGCGGAGATACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGATGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCTCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTTCTGATCGAGGGCGATCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCTCTGGCGTGGACGCCAAGGCTATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGGCTGGAAAACCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGACTGACCCCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGATATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACAAAGGCCCCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGATCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAATGGCTCTATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACACCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTATGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATTGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAAATCAGCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGACCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATTCTCGAGGACATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGAGGCGGTACACAGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAAGGCGATTCTCTGCACGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGATCTCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGATAACAAGGTCCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGATAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGATAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTTGATAAGGCCGGCTTCATTAAGCGGCAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACCAAACACGTGGCACAGATTCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCTAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGGGAAATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAGAAGTATCCCAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAACAAGAGATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTTTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAAAGACCCCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCAGAGATTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGATAGCCCTACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAAAAGCTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTTGAGAAGAACCCGATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTCAAGAAGGACCTCATCATCAAGCTCCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAAAATGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCAGCAGGCGAACTGCAGAAAGGCAATGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATACGTCAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAACCTGGATAAGGTGCTGTCTGCCTATAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACACTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAAACCCGGATCGACCTGTCTCAGCTCGGCGGCGATTCTGGTGGTTCTGGCGGAAGTGGCGGATCCACCAATCTGAGCGACATCATCGAAAAAGAGACAGGCAAGCAGCTCGTGATCCAAGAATCCATCCTGATGCTGCCTGAAGAGGTTGAGGAAGTGATCGGCAACAAGCCTGAGTCCGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGATGAGAGCACCGATGAGAACGTCATGCTGCTGACAAGCGACGCCCCTGAGTACAAGCCTTGGGCTCTCGTGATTCAGGACAGCAATGGGGAGAACAAGATCAAGATGCTGAGCGGAGGTAGCGGAGGCAGTGGCGGAAGCACAAACCTGTCTGATATCATTGAAAAAGAAACCGGGAAGCAACTGGTCATTCAAGAGTCCATTCTCATGCTCCCGGAAGAAGTCGAGGAAGTCATTGGAAACAAACCCGAGAGCGATATTCTGGTCCACACAGCCTATGACGAGTCTACAGACGAAAACGTGATGCTCCTGACCTCTGACGCTCCCGAGTATAAGCCCTGGGCACTTGTTATCCAGGACTCTAACGGGGAAAACAAAATCAAAATGTTGTCCGGCGGCAGCAAGCGGACAGCCGATGGATCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAGAAACGGAAGGTgGAGtaa
「塩基編集活性」とは、ポリヌクレオチド内で塩基を化学的に変更するよう作用することを意味する。一実施形態では、第１の塩基が第２の塩基に変換される。一実施形態では、塩基編集活性とは、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換するシチジンデアミナーゼ活性である。別の実施形態では、塩基編集活性とは、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換するアデノシンまたはアデニンデアミナーゼ活性である。別の実施形態では、塩基編集活性とは、例えば、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換するシチジンデアミナーゼ活性であり、例えば、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換するアデノシンまたはアデニンデアミナーゼ活性である。
用語「塩基エディターシステム」とは、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集するためのシステムを指す。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）システムは、（１）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン、標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を脱アミノ化するためのデアミナーゼドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインと；（２）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに連係する１つまたは複数ガイドポリヌクレオチド（例えばガイドＲＮＡ）とを含む。様々な実施形態では、塩基エディター（ＢＥ）システムは、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼから選択される核酸塩基エディタードメインと、核酸配列特異的な結合活性を有するドメインとを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、（１）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、標的ヌクレオチド配列中の１つまたは複数の核酸塩基を脱アミノ化するためのデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター（ＢＥ）；および（２）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインに連係する１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターはシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターはアデニンまたはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデニンもしくはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）またはシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）である。
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ドメイン」とは、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性の、不活性の、または部分的に活性のＤＮＡ切断ドメインを含むタンパク質、および／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）を含むＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ｃａｓｎｌヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成する規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）関連ヌクレアーゼと呼ばれることもある。例示的なＣａｓ９は、ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）であり、そのアミノ酸配列は下記に示される：
Figure 2022545950000003
（単下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
用語「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」とは、１アミノ酸を、共通の特性を有する別のアミノ酸に置換することを指す。個々のアミノ酸間の共通の特性を規定する機能的な方法は、相同性のある生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化頻度を分析することである（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)）。そのような分析に従って、アミノ酸群を規定することができるが、その場合、群内のアミノ酸は互いに選好的に交換し、それゆえにタンパク質構造全体にそれらが及ぼす影響という点では互いに最もよく似ている（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.、前掲）。保存的変異の非限定的な例としては、アミノ酸のアミノ酸置換、例えば、正電荷を維持できるようにアルギニンをリジンに、およびその逆に；負電荷を維持できるようにアスパラギン酸をグルタミン酸に、およびその逆に；フリーの－ＯＨを維持できるようにスレオニンをセリンに；ならびにフリーのＮＨ２を維持できるようにアスパラギンをグルタミンにすることが挙げられる。
本明細書に互換的に用いられる際の用語「コード配列」または「タンパク質コード配列」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。この領域または配列は、開始コドンにより５’端近くで、および終止コドンにより３’３’端近くで仕切られている。本明細書に記載の塩基エディターに有益な終止コドンとしては、以下が挙げられる：
グルタミン ＣＡＧ→ＴＡＧ 終止コドン
ＣＡＡ→ＴＡＡ
アルギニン ＣＧＡ→ＴＧＡ
トリプトファン ＴＧＧ→ＴＧＡ
ＴＧＧ→ＴＡＧ
ＴＧＧ→ＴＡＡ
コード配列は、オープンリーディングフレームとも呼ぶことができる。
「シチジンデアミナーゼ」とは、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒することのできる、ポリペプチドまたはその断片を意味する。一実施形態では、シチジンデアミナーゼは、シトシンからウラシルにまたは５－メチルシトシンからチミンに変換する。ウミヤツメ（Petromyzon marinus）由来のＰｍＣＤＡ１（ウミヤツメシトシンデアミナーゼ１、「ＰｍＣＤＡ１」）、哺乳動物、または異なる種の哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サルなど）、および非哺乳動物、例えばアリゲーターに由来するＡＩＤ（活性化誘発性シチジンデアミナーゼ；ＡＩＣＤＡ）、ならびにＡＰＯＢＥＣが、例示的なシチジンデアミナーゼである。
本明細書に用いられる用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は、脱アミノ化反応を触媒するタンパク質または酵素を指す。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シチジンまたはデオキシシチジンからそれぞれウリジンまたはデオキシウリジンへの加水分解性脱アミノ化を触媒するシチジンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シトシンからウラシルへの加水分解性脱アミノ化を触媒するシトシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アデニンからヒポキサンチンへの加水分解性脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アデノシンまたはアデニン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への加水分解性脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンまたはデオキシアデノシンからそれぞれイノシンまたはデオキシイノシンへの加水分解性脱アミノ化を触媒するアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデノシンの加水分解性脱アミノ化を触媒する。本明細書に示されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、工学的に改変されたアデノシンデアミナーゼ、進化型アデノシンデアミナーゼ）は、細菌などの任意の生物に由来し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィリウム、シェワネラ・プトレファシエンス、ヘモフィルス・インフルエンザ、またはカウロバクター・クレセンタスなどの細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの生物由来の天然のデアミナーゼのバリアントである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に発生しない。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然のデアミナーゼと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一である。
「直接的」とは、存在、不在、または検出される分析物の量を特定することを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド中の配列変更が検出される。別の実施形態では、インデルの存在が検出される。
「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結された際に分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段を介して後者を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、放射性同位元素、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、（例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に一般に用いられるような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を意味する。具体的な実施形態では、本発明の組成物を用いる治療に適用可能な疾患は、異常なスプライシングに関連する。具体的な一実施形態では、疾患とはシュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）である。
「異常なスプライシングに関連する疾患」とは、スプライシングに影響を及ぼす遺伝子配列中の変更、例えばスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位内の変更などに起因する転写の中断に関連する、任意の状態または障害を意味する。
「有効量」とは、無治療の患者または疾患のない個体、すなわち健康な個体に比べて疾患の症状を寛解させるのに必要な剤または活性化合物、例えば、本明細書に記載されるような塩基エディターの量を意味するか、または所望の生物学的応答を惹起するのに十分な剤または活性化合物の量である。疾患の治療的処置のために本発明を実践するのに用いられる活性化合物の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、および全身の健康状態に応じて様々である。最終的には、担当する医師または獣医師が適正な量および投与レジメンを決定するものとなる。そのような量が「有効な」量と呼ばれる。一実施形態では、有効量とは、細胞（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞）内の目的の遺伝子に変更を導入するのに十分な本発明の塩基エディターの量である。一実施形態では、有効量とは、治療効果を達成するのに必要な塩基エディターの量である。そのような治療効果は、対象、組織、器官の全ての細胞において病原性遺伝子を変更するのに十分である必要はないが、対象、組織、または器官内に存在する細胞の約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％以上の病原性遺伝子を変更すればよい。一実施形態では、有効量は、疾患の１つまたは複数の症状を寛解させるのに十分である。
一部の実施形態では、本明細書に示される融合タンパク質の形態であり得るｎＣａｓ９ドメインとデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ）とを含む核酸塩基エディター、またはｎＣａｓ９ドメインとデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ）とを含む核酸塩基エディターを含む剤もしくは組成物の有効量とは、本明細書に記載の核酸塩基エディターにより特異的に結合され編集される標的部位の編集を誘導するのに十分な量を指す。当業者によって理解されるように、剤、例えば、融合タンパク質の有効量は、様々な要因に応じて、例えば、所望の生物学的反応に応じて、例えば、編集される特異的な対立遺伝子、ゲノム、もしくは標的部位に応じて、標的となっている細胞もしくは組織に応じて、および／または用いられている剤に応じて、変わり得る。
一部の実施形態では、融合タンパク質の形態であり得る剤、例えば、ｎＣａｓ９ドメインとデアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質の有効量とは、融合タンパク質によって特異的に結合され編集される標的部位の編集を誘導するのに十分な剤、例えば、融合タンパク質の量を指し得る。当業者によって理解されるように、剤、例えば融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質の複合体（またはタンパク質二量体）、およびポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの有効量は、様々な要因に応じて、例えば、所望の生物学的反応に応じて、例えば、編集される特異的な対立遺伝子、ゲノム、もしくは標的部位に応じて、標的となっている細胞もしくは組織に応じて、および／または用いられている剤に応じて、変わり得る。
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この一部分は、参照の核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とは、標的配列に特異的であって、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）との複合体を形成することのできるポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドとは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体として、または単一ＲＮＡ分子として存在することができる。単一ＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれることがあるが、尤も、「ｇＲＮＡ」は、単一分子としてまたは２つ以上の分子の複合体として存在するガイドＲＮＡを指すために互換的に用いられる。典型的には、単一ＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、２つのドメイン：（１）標的核酸との相同性（および例えばＣａｓ９複合体の標的との直接的な結合）を共有するドメインと；（２）Ｃａｓ９タンパク質に結合するドメインとを含む。一部の実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の配列に対応し、ステムループ構造を有する。例えば、一部の実施形態では、ドメイン（２）は、その全体の内容が本明細書に参照により組み込まれるJinek et al., Science 337:816-821(2012)に記載されるようなｔｒａｃｒＲＮＡに一致するかまたは相同である。ｇＲＮＡの他の例（例えばドメイン２を含むもの）は、「Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof」と題された米国特許出願公開第２０１６０２０８２８８号、および「Delivery System For Functional Nucleases」と題された米国特許第９，７３７，６０４号に見出すことができ、それぞれの全体の内容は、ここに参照によりその全体を組み込まれる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２つ以上のドメイン（１）および（２）を含み、「延長型ｇＲＮＡ」とも呼ばれることがある。延長型ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるように、２つ以上のＣａｓ９タンパク質を結合し、２つ以上の異なる領域で標的核酸を結合するものとなる。ｇＲＮＡは、標的部位を相補するヌクレオチド配列を含み、この配列は、ヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の標的部位との結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性をもたらす。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な核酸塩基間の水素結合を意味し、この結合は、ワトソン・クリック水素結合、フーグスティーン水素結合、または逆フーグスティーン水素結合であり得る。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成を通じて対を成す相補的な核酸塩基である。
「増加する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の正の変更を意味する。
用語「塩基修復の阻害物質」、「塩基修復阻害物質」、「ＩＢＲ」、またはそれらの文法的に等価な語は、核酸修復酵素、例えば塩基除去修復酵素の活性を阻害することのできるタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＩＢＲは、イノシン塩基除去修復の阻害物質である。塩基修復の例示的な阻害物質としては、ＡＰＥ１、ＥｎｄｏＩＩＩ、ＥｎｄｏＩＶ、ＥｎｄｏＶ、ＥｎｄｏＶＩＩＩ、Ｆｐｇ、ｈＯＧＧｌ、ｈＮＥＩＬｌ、Ｔ７Ｅｎｄｏｌ、Ｔ４ＰＤＧ、ＵＤＧ、ｈＳＭＵＧｌ、およびｈＡＡＧの阻害物質が挙げられる。一部の実施形態では、塩基修復阻害物質は、ＥｎｄｏＶまたはｈＡＡＧの阻害物質である。一部の実施形態では、ＩＢＲは、ＥｎｄｏＶまたはｈＡＡＧの阻害物質である。一部の実施形態では、ＩＢＲは、触媒として不活性のＥｎｄｏＶまたは触媒として不活性のｈＡＡＧである。一部の実施形態では、塩基修復阻害物質は、触媒として不活性のＥｎｄｏＶまたは触媒として不活性のｈＡＡＧである。一部の実施形態では、塩基修復阻害物質はウラシルグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）である。ＵＧＩとは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することのできるタンパク質を指す。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、野生型ＵＧＩまたは野生型ＵＧＩの断片を含む。一部の実施形態では、本明細書に示されるＵＧＩタンパク質には、ＵＧＩの断片と、ＵＧＩまたはＵＧＩ断片に相同なタンパク質とが含まれる。一部の実施形態では、塩基修復阻害物質は、イノシン塩基除去修復の阻害物質である。一部の実施形態では、塩基修復阻害物質は、「触媒として不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼ」または「活性のないイノシン特異的ヌクレアーゼ」である。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、触媒として不活性のイノシングリコシラーゼ（例えば、アルキルアデニングリコシラーゼ（ＡＡＧ））は、イノシンに結合することができるが、脱塩基部位を作り出すこともイノシンを除去することもできず、それによって、新しく形成されたイノシン部分をＤＮＡ損傷／修復機構から立体的に遮断する。一部の実施形態では、触媒として不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼは、核酸内でイノシンの結合を可能とすることができるが、核酸を切断しない。非制限的で例示的な触媒として不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼとしては、触媒として不活性のアルキルアデノシングリコシラーゼ（ＡＡＧヌクレアーゼ）であって例えばヒト由来のもの、および触媒として不活性のエンドヌクレアーゼＶ（ＥｎｄｏＶヌクレアーゼ）であって例えば大腸菌由来のものが挙げられる。一部の実施形態では、触媒として不活性のＡＡＧヌクレアーゼは、Ｅ１２５Ｑ変異または別のＡＡＧヌクレアーゼ中の対応する変異を含む。
「インテイン」とは、タンパク質スプライシングとして知られる過程において、それ自体を切除して残りの断片（エクステイン）をペプチド結合に接合することのできるタンパク質の断片である。インテインはまた、「タンパク質イントロン」とも呼ばれる。「それ自体を切除しそのタンパク質の残りの部分を接合するインテインの過程」は、本明細書では「タンパク質スプライシング」または「インテイン媒介性タンパク質スプライシング」と称される。一部の実施形態では、前駆体タンパク質のインテイン（インテイン媒介性タンパク質スプライシングの前のインテイン含有タンパク質）は、２つの遺伝子に由来する。そのようなインテインは、本明細書ではスプリットインテイン（例えば、スプリットインテイン－Ｎおよびスプリットインテイン－Ｃ）と称される。例えば、シアノバクテリアでは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの触媒サブユニットであるＤｎａＥは、２つの別々の遺伝子ｄｎａＥ－ｎおよびｄｎａＥ－ｃによりコードされる。ｄｎａＥ－ｎ遺伝子によりコードされるインテインは、本明細書では「インテイン－Ｎ」と称されることがある。ｄｎａＥ－ｃ遺伝子によりコードされるインテインは、本明細書では「インテイン－Ｃ」と称されることがある。
他のインテインシステムも用いられてもよい。例えば、ｄｎａＥインテインをベースとした合成インテイン、Ｃｆａ－Ｎ（例えばスプリットインテイン－Ｎ）およびＣｆａ－Ｃ（例えばスプリットインテイン－Ｃ）のインテイン対が記載されている（例えば、本明細書に参照により組み込まれるStevens et al., J Am Chem Soc. 2016 Feb. 24; 138(7):2162-5）。本開示にしたがって用いられ得るインテイン対の非限定的な例としては、Ｃｆａ ＤｎａＥインテイン、Ｓｓｐ ＧｙｒＢインテイン、Ｓｓｐ ＤｎａＸインテイン、Ｔｅｒ ＤｎａＥ３インテイン、Ｔｅｒ ＴｈｙＸインテイン、Ｒｍａ ＤｎａＢインテイン、およびＣｎｅ Ｐｒｐ８インテイン（本明細書に参照により組み込まれる米国特許第８，３９４，６０４号に記載されるようなものが挙げられる。
インテインの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列が示される。
ＤｎａＥインテイン－Ｎ ＤＮＡ：TGCCTGTCATACGAAACCGAGATACTGACAGTAGAATATGGCCTTCTGCCAATCGGGAAGATTGTGGAGAAACGGATAGAATGCACAGTTTACTCTGTCGATAACAATGGTAACATTTATACTCAGCCAGTTGCCCAGTGGCACGACCGGGGAGAGCAGGAAGTATTCGAATACTGTCTGGAGGATGGAAGTCTCATTAGGGCCACTAAGGACCACAAATTTATGACAGTCGATGGCCAGATGCTGCCTATAGACGAAATCTTTGAGCGAGAGTTGGACCTCATGCGAGTTGACAACCTTCCTAAT
ＤｎａＥインテイン－Ｎ タンパク質： CLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDR GEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNL PN
ＤｎａＥ インテイン－Ｃ ＤＮＡ：ATGATCAAGATAGCTACAAGGAAGTATCTTGGCAAACAAAACGTTTATGA TATTGGAGTCGAAAGAGATCACAACTTTGCTCTGAAGAACGGATTCATAG CTTCTAAT
インテイン－Ｃ： MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN
Ｃｆａ－Ｎ ＤＮＡ：TGCCTGTCTTATGATACCGAGATACTTACCGTTGAATATGGCTTCTTGCCTATTGGAAAGATTGTCGAAGAGAGAATTGAATGCACAGTATATACTGTAGACAAGAATGGTTTCGTTTACACACAGCCCATTGCTCAATGGCACAATCGCGGCGAACAAGAAGTATTTGAGTACTGTCTCGAGGATGGAAGCATCATACGAGCAACTAAAGATCATAAATTCATGACCACTGACGGGCAGATGTTGCCAATAGATGAGATATTCGAGCGGGGCTTGGATCTCAAACAAGTGGATGGATTGCCA
Ｃｆａ－Ｎ タンパク質：
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
Ｃｆａ－Ｃ ＤＮＡ：ATGAAGAGGACTGCCGATGGATCAGAGTTTGAATCTCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTAAAGATAATATCTCGAAAAAGTCTTGGTACCCAAAATGTCTATGATATTGGAGTGGAGAAAGATCACAACTTCCTTCTCAAGAACGGTCTCGTAGCCAGCAAC
Ｃｆａ－Ｃ タンパク質：MKRTADGSEFESPKKKRKVKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASN
インテイン－Ｎおよびインテイン－Ｃは、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分およびスプリットＣａｓ９のＣ末端部分の接合のために、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分およびスプリットＣａｓ９のＣ末端部分にそれぞれ融合されていてもよい。例えば、一部の実施形態では、インテイン－Ｎは、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分のＣ末端に融合され、すなわち、Ｎ－［スプリットＣａｓ９のＮ末端部分］－［インテイン－Ｎ］－Ｃの構造を形成する。一部の実施形態では、インテイン－Ｃは、スプリットＣａｓ９のＣ末端部分のＮ末端に融合され、すなわち、Ｎ－［インテイン－Ｃ］－［スプリットＣａｓ９のＣ末端部分］－Ｃの構造を形成する。インテインの融合されるタンパク質（例えば、スプリットＣａｓ９）を接合するためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、当技術分野に公知であり、例えば、本明細書に参照により組み込まれるShah et al., Chem Sci. 2014; 5(1):446-461に記載される。インテインを設計し使用するための方法は、当技術分野に公知であり、例えば、ＷＯ２０１４００４３３６、ＷＯ２０１７１３２５８０、米国特許出願公開第２０１５０３４４５４９号、および米国特許出願公開第２０１８０１２７７８０号に記載され、これらはいずれも本明細書に参照によりその全体を組み込まれる。
用語「単離される」、「精製される」、または「生物学的に純粋な」とは、物質がその本来の状態に見出される際に通常付随する構成成分を様々な程度で含まないことを指す。「単離する」とは、元来の供給源または環境からの分離の程度を指す。「精製する」とは、単離よりも高度な分離の程度を指す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物もタンパク質の生物学的特性に物質的に影響を及ぼさないかまたは他の有害な結果を生じない程度に、他の物質を含まない。換言すれば、本発明の核酸またはペプチドは、細胞由来物質、ウイルス由来物質、または組換えＤＮＡ手法により生産された際の培養培地、または化学合成された際の化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合に、精製されている。純度および均一性は、典型的には分析化学手法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを用いて決定される。用語「精製される」とは、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを指し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質については、異なる修飾により異なる単離タンパク質が生じることがあり、それらは別々に精製することができる。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子の由来する生物の天然のゲノムにおいて、その遺伝子の側面に位置する遺伝子を含まない核酸（例えばＤＮＡ）を意味する。そのためこの用語は、例えば、ベクター内、自律的に複製するプラスミドまたはウイルス内、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれるか、または他の配列とは独立して別々の分子（例えば、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化により生じるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。さらに、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、ならびに追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
「単離されたポリペプチド」とは、天然に付随する構成成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、天然に付随するタンパク質および天然有機分子を重量で少なくとも６０％含まない場合に、単離されている。好ましくは、調製物は、重量で少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％の本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質の化学合成によって、取得されてもよい。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはＨＰＬＣ分析によって、測定することができる。
用語「リンカー」とは、本明細書に用いられる際には、２つの分子もしくは部分、例えば、タンパク質複合体もしくはリボ核複合体の２つの構成成分、または融合タンパク質の２つのドメイン、例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン（例えばｄＣａｓ９）およびデアミナーゼドメイン（（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、もしくはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を連結している共有結合性リンカー（例えば共有結合）、非共有結合性リンカー、化学基、または分子を指し得る。リンカーは、塩基エディターシステムの異なる構成成分または構成成分の異なる部分を接合することができる。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのガイドポリヌクレオチド結合ドメインとデアミナーゼの触媒ドメインとを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ＣＲＩＳＰＲポリペプチドとデアミナーゼとを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃａｓ９とデアミナーゼとを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ｄＣａｓ９とデアミナーゼとを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ｎＣａｓ９とデアミナーゼとを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ガイドポリヌクレオチドとデアミナーゼとを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化構成成分とポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合構成成分とを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化構成成分のＲＮＡ結合部分とポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合構成成分とを接合することができる。一部の実施形態では、リンカーは、塩基エディターシステムの脱アミノ化構成成分のＲＮＡ結合部分とポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合構成成分のＲＮＡ結合部分とを接合することができる。リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するかまたはそれらを側面に配し、共有結合または非共有結合を介してそれぞれ接続され、ゆえに上記２つを接続することができる。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分とすることができる。一部の実施形態では、リンカーはポリヌクレオチドとすることができる。一部の実施形態では、リンカーはＤＮＡリンカーとすることができる。一部の実施形態では、リンカーはＲＮＡリンカーとすることができる。一部の実施形態では、リンカーは、リガンドへの結合が可能なアプタマーを含むことができる。一部の実施形態では、リガンドは、炭水化物、ペプチド、タンパク質、または核酸であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、リボスイッチに由来し得るアプタマーを含んでいてもよい。アプタマーの由来するリボスイッチは、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）リボスイッチ、アデノシンコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）リボスイッチ、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）リボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、ＧｌｍＳリボスイッチ、またはプレクオシン１（ＰｒｅＱ１）リボスイッチから選択され得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン、例えばポリペプチドリガンドなどに結合されたアプタマーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、Ｋホモロジー（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕ Ｃｏｍコートタンパク質ドメイン、滅菌アルファモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドリガンドは、塩基エディターシステム構成成分の一部分としてもよい。例えば、核酸塩基編集構成成分は、デアミナーゼドメインとＲＮＡ認識モチーフとを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）とすることができる。一部の実施形態では、リンカーは、約５～１００アミノ酸の長さ、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００アミノ酸の長さとすることができる。一部の実施形態では、リンカーは、約１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、または４５０～５００アミノ酸の長さとすることができる。さらに長いかまたは短いリンカーも想定される。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含めたＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインと、核酸編集タンパク質の触媒ドメイン（例えば、シチジンまたはアデノシンデアミナーゼ）とを接合する。一部の実施形態では、リンカーは、ｄＣａｓ９と核酸編集タンパク質とを接合する。例えば、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に配置されるかまたはそれらの側面に配され、共有結合を介してそれぞれ接続され、ゆえに上記２つを接続する。一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、５～２００アミノ酸の長さであり、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３５、４５、５０、５５、６０、６０、６５、７０、７０、７５、８０、８５、９０、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、１８０、１９０、または２００アミノ酸の長さである。
一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ、またはＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている。一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、ＸＴＥＮリンカーと呼ばれることがあるアミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含むリンカーを介して融合されている。一部の実施形態では、リンカーは２４アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは４０アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは６４アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは９２アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳを含む。
「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変更を含む任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
用語「変異」とは、本明細書に用いられる際には、配列内、例えば、核酸配列もしくはアミノ酸配列内の残基の置換、別の残基への残基の置換、または配列内の１つまたは複数残基の欠失もしくは挿入を指す。一部の実施形態では、挿入とは、野生型配列の全部または一部を置き換える遺伝子変換である。変異は、典型的には、本来の残基、続いて配列内のその残基の位置、および新たに置換される残基のアイデンティティを特定することによって、本明細書に記載される。本明細書に示されるアミノ酸置換（変異）を作製するための様々な方法が、当技術分野に周知されており、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))により示されている。
一部の実施形態では、ここに開示される塩基エディターは、かなりの数の目的外の変異、例えば目的外の点変異などを生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）内の「目的の変異」、例えば点変異などを効率的に生成することができる。一部の実施形態では、目的の変異とは、目的の変異を生成するように特異的に設計されたガイドポリヌクレオチド（例えばｇＲＮＡ）に結合されている特異的塩基エディター（例えば、シチジン塩基エディターまたはアデノシン塩基エディター）によって生成される変異である。
概して、配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列）中に作製または特定された変異は、参照（または野生型）配列、すなわち、その変異を含有しない配列に関連して付番される。当業者は、参照配列に比較してアミノ酸配列および核酸配列変異の位置をどのように決定するのかを容易に理解するものとなる。
用語「非保存的な変異」とは、異なる群の間、例えば、トリプトファンからリジンへ、またはセリンからフェニルアラニンへなどのアミノ酸置換を含む。この場合、非保存的なアミノ酸置換が、機能性バリアントの生物活性に干渉しないかまたはそれを阻害しないことが好ましい。非保存的なアミノ酸置換は、機能性バリアントの生物活性が野生型タンパク質に比べて増加するように、機能性バリアントの生物活性を増強することができる。
用語「核局在化配列」、「核局在化シグナル」、または「ＮＬＳ」とは、細胞核内へのタンパク質の移入を促進するアミノ酸配列を指す。核局在化配列は、当技術分野に公知であり、例えば、Plankら、２０００年１１月２３日出願の国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０、２００１年５月３１日公開のＷＯ／２００１／０３８５４７に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み込まれている。他の実施形態では、ＮＬＳとは、最適化されたＮＬＳであり、例えば、Koblan et al., Nature Biotech. 2018 doi:10.1038/nbt.4172.に記載されている。本発明の方法に有用な最適化された配列は、図８Ａ～図８Ｅ（Koblan et al., 前掲）に示されている。一部の実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫ、ＰＫＫＫＲＫＶ、またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣを含む。
本明細書に互換的に用いられる用語「核酸塩基」、「含窒塩基」、または「塩基」とは、ヌクレオシド、さらにはヌクレオチドの構成成分を形成する、窒素を含有する生体化合物を指す。核酸塩基が塩基対を形成し、１つを別の１つに積み重ねる能力によって、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの長鎖の螺旋構造が直接的に生じる。５つの核酸塩基、すなわちアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）は、主要または規準的と呼ばれる。アデニンおよびグアニンはプリンに由来し、シトシン、ウラシル、およびチミンはピリミジンに由来する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、修飾された他の（主要ではない）塩基も含有することができる。非制限的で例示的な修飾された核酸塩基としては、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、および５－ヒドロメチルシトシンを挙げることができる。ヒポキサンチンおよびキサンチンは、変異原の存在を通じて、どちらも脱アミノ化（アミン基からカルボニル基への置換）を通じて、作り出すことができる。ヒポキサンチンはアデニンから修飾することができる。キサンチンはグアニンから修飾することができる。ウラシルは、シトシンの脱アミノ化の結果として生じ得る。「ヌクレオシド」は、核酸塩基と５炭糖（リボースまたはデオキシリボースのどちらか）とから成る。ヌクレオシドの例としては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、およびデオキシシチジンが挙げられる。修飾された核酸塩基を含むヌクレオシドの例としては、イノシン（Ｉ）、キサントシン（Ｘ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、およびシュードウリジン（Ψ）が挙げられる。「ヌクレオチド」は、核酸塩基、５炭糖（リボースまたはデオキシリボのどちらか）、および少なくとも１つのリン酸基から成る。
用語「核酸」および「核酸分子」とは、本明細書に用いられる際には、核酸塩基と酸性部分を含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを指す。典型的には、ポリマー核酸、例えば、３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は、直鎖状の分子であり、その中では、隣接するヌクレオチドが、ホスホジエステル結合を介して互いに連結されている。一部の実施形態では、「核酸」とは、個別の核酸残基（例えばヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」とは、３つ以上の個別のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書に用いられる際には、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、一続きの少なくとも３つのヌクレオチド）を指すために互換的に用いることができる。一部の実施形態では、「核酸」とは、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡを包含する。核酸は、例えば、ゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然の核酸分子という状況において天然に発生したものとしてよい。一方、核酸分子は、非天然の分子、例えば、組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、工学的に改変されたゲノム、またはそれらの断片、または合成のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよいし、非天然のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含んでいてもよい。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸類似体、例えば、ホスホジエステル骨格以外のものを有する類似体を含む。核酸は、天然の供給源から精製する、組換え発現システムを用いて生産し任意選択的に精製する、化学合成するなどできる。適切であれば、例えば、化学的に合成される分子の場合、核酸は、ヌクレオシド類似体、例えば化学的に修飾された塩基または糖を有する類似体などと、骨格の修飾とを含むことができる。核酸配列は、別段に標示のない限り、５’から３’の方向で存在する。一部の実施形態では、核酸は、天然のヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物学的に修飾された塩基（例えばメチル化塩基）；インターカレーション塩基；修飾糖（２’－例えば、フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；ならびに／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるかまたはそれを含む。
用語「核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質」または「ｎａｐＤＮＡｂｐ」は、ｎａｐＤＮＡｂｐを特異的な核酸配列にガイドする核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）、例えばガイド核酸またはガイドポリヌクレオチド（例えばｇＲＮＡ）などに付随するタンパク質を指すために、「ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン」と互換的に用いられることがある。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、Ｃａｓ９タンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡに相補的な特異的なＤＮＡ配列にＣａｓ９タンパク質をガイドするガイドＲＮＡに付随し得る。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐとはＣａｓ９ドメインであり、例えばヌクレアーゼ活性のＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、ならびにＣａｓ１２ｉが挙げられる。Ｃａｓ酵素の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらの相同体、またはそれらの改変型もしくは工学的に改変されたバージョンが挙げられる。他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質も、本開示に具体的に挙げられていないことがあるとはいえ本開示の範囲内にある。例えば、それぞれの内容の全てが参照によりここに組み込まれているMakarova et al. “Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?” CRISPR J. 2018 Oct;1:325-336. doi: 10.1089/crispr.2018.0033; Yan et al., “Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems” Science. 2019 Jan 4;363(6422):88-91. doi: 10.1126/science.aav7271を参照されたい。
用語「核酸塩基編集ドメイン」または「核酸塩基編集タンパク質」とは、本明細書に用いられる際には、ＲＮＡまたはＤＮＡ中の核酸塩基の修飾、例えばシトシン（もしくはシチジン）からウラシル（もしくはウリジン）またはチミン（もしくはチミジン）への、およびアデニン（またはアデノシン）からヒポキサンチン（またはイノシン）への脱アミノ化、ならびに非鋳型ヌクレオチドの付加および挿入などを触媒することのできるタンパク質または酵素を指す。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメイン（例えば、アデニンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ；またはシチジンデアミナーゼもしくはシトシンデアミナーゼ）である。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは１つ以上のデアミナーゼドメイン（例えば、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ、およびシチジンまたはシトシンデアミナーゼ）である。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインを天然の核酸塩基編集ドメインとすることができる。一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、天然の核酸塩基編集ドメインから工学的に改変されているかまたは進化型の核酸塩基編集ドメインである。核酸塩基編集ドメインは、任意の生物、例えば細菌、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスを由来とすることができる。
本明細書に用いられる際に、「剤を得ること」にあるような「得ること」とは、剤を合成すること、単離すること、取り出すこと、購入すること、またはその他獲得することを含む。
本明細書に用いられる際の「患者」または「対象」とは、疾患または障害であるものと診断されたか、その発症のリスクがあるか、またはその発症の疑いのある哺乳類の対象または個体を指す。一部の実施形態では、ＳＤＳＰをコードする遺伝子内に変異を有する対象は、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に罹っているかまたはその発症のリスクがあるものと識別される。一部の実施形態では、用語「患者」とは、疾患または障害の発症の可能性が平均よりも高い哺乳類の対象を指す。例示的な患者は、本明細書に開示される療法の恩恵を得ることのできるヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ラクダ、ラマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類（例えば、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、またはモルモット）、および他の哺乳動物である。例示的なヒト患者は男性および／または女性とすることができる。
「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」とは、本明細書では、疾患または障害、例えばＳＤＳであるものと診断されたか、その罹患のリスクがあるか、その罹患が予め定められているか、または罹患の疑いのある患者として参照される。
用語「病原性変異」、「病原性のバリアント」、「疾患を引き起こす変異」、「疾患を引き起こすバリアント」、「有害な変異」、または「素因となる変異」とは、ある特定の疾患または障害に対する個体の感受性または素因を増加させる遺伝子上の変更または変異を指す。一部の実施形態では、病原性変異は、ＳＢＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位内の変更を含む。一部の実施形態では、病原性変異は、ＳＢＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドのスプライシングを変更し、結果として、例えば、タンパク質の切詰またはその他ＳＢＤＳタンパク質の発現または活性への負の影響を生じる。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、およびそれらの文法的な等価物は、本明細書に互換的に用いられ、ペプチド（アミド）結合により合わせて連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３アミノ酸の長さとなる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質のコレクションを指すことができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸は、コンジュゲーション、官能化、または他の修飾のための化学実体、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなどによって、修飾することができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、単一の分子とすることもできるし、多分子の複合体とすることもできる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然のタンパク質またはペプチドの断片のみとすることができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然、組換え、もしくは合成、またはそれらの任意の組合せとすることができる。本明細書に用いられる際の用語「融合タンパク質」とは、少なくとも２つの異なるタンパク質由来のタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。１つのタンパクが、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に位置し、それゆえに、アミノ末端融合タンパク質またはカルボキシ末端融合タンパク質をそれぞれ形成することができる。タンパク質は、異なるドメイン、例えば、核酸編集タンパク質の核酸結合ドメイン（例えば、タンパク質と標的部位との結合を方向付けるＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）と、核酸切断ドメインまたは触媒ドメインとを含むことができる。一部の実施形態では、タンパク質は、タンパク質性部分、例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば、核酸切断剤として働くことのできる化合物とを含む。一部の実施形態では、タンパク質は、核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡと複合体を形成しているかまたは会合している。本明細書に示される任意のタンパク質は、当技術分野に公知の任意の方法によって生産することができる。例えば、本明細書に示されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適した組換えタンパク質の発現および精製を介して生産することができる。組換えタンパク質の発現および精製のための方法は周知されており、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))により記載されたものが挙げられ、その全体の内容は本明細書に参照により組み込まれる。
本明細書に開示されたポリペプチドおよびタンパク質（機能性部分とその機能性バリアントを含む）は、１つまたは複数の天然のアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。そのような合成アミノ酸は、当技術分野に公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。ポリペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチド構築物の１つまたは複数のアミノ酸の翻訳後修飾を付随し得る。翻訳後修飾の非限定的な例としては、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ－結合型およびＯ－結合型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピエーション、リポイル化、およびヨウ素化が挙げられる。
タンパク質または核酸のコンテクストで本明細書に用いられる際の用語「組換え」とは、自然に発生しないが人間工学の産物であるタンパク質または核酸を指す。例えば、一部の実施形態では、組換えタンパク質または核酸分子は、任意の天然の配列に比べて、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの変異を含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含む。
「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変更を意味する。
「参照」とは、標準的なまたは対照の状態を意味する。一実施形態では、参照は、野生型のまたは健康な細胞である。例えば、野生型のまたは健康な細胞は、健康であるおよび／または疾患のない対象に由来することもあるしまたはそれから得られることもある。具体的な実施形態では、野生型のまたは健康な細胞は、野生型ＳＢＤＳタンパク質（すなわち、野生型スプライシングを呈する野生型ＳＢＤＳ遺伝子の産物であるＳＢＤＳタンパク質）を発現する細胞である。他の実施形態では、かつ限定はないが、参照は、試験条件に供されないか、またはプラセボもしくは通常の生理食塩水、培地、緩衝液、および／または目的のポリヌクレオチドを持たない対照ベクターに供される、無処理の細胞である。
「参照配列」とは、配列比較のための基準として用いられる規定された配列である。参照配列は、指定された配列のサブセットまたは全体としてもよく、例えば、完全長のｃＤＮＡもしくは遺伝子の配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子の配列である。ポリペプチドについて、参照ポリペプチド配列の長さは、概して少なくとも約１６アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸となる。核酸について、参照核酸配列の長さは、概して、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、もしくは約３００ヌクレオチド、またはその前後もしくはその間の任意の整数である。一部の実施形態では、参照配列は、目的のタンパク質の野生型配列である。他の実施形態では、参照配列は、野生型タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。
用語「ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ」、および「ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ」は、切断のための標的ではない１つまたは複数のＲＮＡと共に用いられる（例えば、そのようなＲＮＡに結合または会合する）。一部の実施形態では、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体中では、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と呼ばれることがある。典型的には、結合されるＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる。一部の実施形態では、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼは、（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、例えば、ストレプトコッカス・ピロゲネス由来のＣａｓ９（Ｃｓｎｌ）である（例えば "Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)を参照されたい。
「シュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群（ＳＢＤＳ）タンパク質」とは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０５７１２２．２と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、ＳＢＤＳの生物活性を有する、ポリペプチドまたはその断片を意味する。様々な実施形態では、ＳＢＤＳの生物活性は、ＲＮＡプロセッシング、リボソームの生成、またはＳＢＤＳタンパク質に特異的に結合する抗体との結合において役割を果たすことを指す。
ＳＢＤＳタンパク質のアミノ酸配列の一例を下記に示す：
MSIFTPTNQI RLTNVAVVRM KRAGKRFEIA CYKNKVVGWR SGVEKDLDEV LQTHSVFVNV SKGQVAKKED LISAFGTDDQ TEICKQILTK GEVQVSDKER HTQLEQMFRD IATIVADKCV NPETKRPYTV ILIERAMKDI HYSVKTNKST KQQALEVIKQ LKEKMKIERA HMRLRFILPV NEGKKLKEKL KPLIKVIESE DYGQQLEIVC LIDPGCFREI DELIKKETKG KGSLEVLNLK DVEEGDEKFE.
具体的な実施形態では、ＳＢＤＳタンパク質はタンパク質切詰を含む。
「シュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群（ＳＢＤＳ）ポリヌクレオチド」とは、ＳＢＤＳタンパク質をコードする核酸配列を意味する。ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列の一例は、下記に複写されているＮＭ＿０１６０３８．２に示されている。ＳＢＤＳポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ヌクレオチド１８５から９３７に延びている（下線部に示す）。
GTAAGTAAGC CTGCCAGACA CACTGTGACG GCTGCCTGAA GCTAGTGAGT CGCGGCGCCG CGCACTGGTG GTTGGGTCAG TGCCGCGCGC CGATCGGTCG TTACCGCGAG GCGCTGGTGG CCTTCAGGCT GGACGGCGCG GGTCAGCCCT GGTTCGCCGG CTTCTGGGTC TTTGAACAGC CGCGATGTCG ATCTTCACCC CCACCAACCA GATCCGCCTA ACCAATGTGG CCGTGGTACG GATGAAGCGT GCCGGGAAGC GCTTCGAAAT CGCCTGCTAC AAAAACAAGG TCGTCGGCTG GCGGAGCGGC GTGGAAAAAG ACCTCGATGA AGTTCTGCAG ACCCACTCAG TGTTTGTAAA TGTTTCTAAA GGTCAGGTTG CCAAAAAGGA AGATCTCATC AGTGCGTTTG GAACAGATGA CCAAACTGAA ATCTGTAAGC AGATTTTGAC TAAAGGAGAA GTTCAAGTAT CAGATAAAGA AAGACACACA CAACTGGAGC AGATGTTTAG GGACATTGCA ACTATTGTGG CAGACAAATG TGTGAATCCT GAAACAAAGA GACCATACAC CGTGATCCTT ATTGAGAGAG CCATGAAGGA CATCCACTAT TCGGTGAAAA CCAACAAGAG TACAAAACAG CAGGCTTTGG AAGTGATAAA GCAGTTAAAA GAGAAAATGA AGATAGAACG TGCTCACATG AGGCTTCGGT TCATCCTTCC AGTCAATGAA GGCAAGAAGC TGAAAGAAAA GCTCAAGCCA CTGATCAAGG TCATAGAAAG TGAAGATTAT GGCCAACAGT TAGAAATCGT ATGTCTGATT GACCCGGGCT GCTTCCGAGA AATTGATGAG CTAATAAAAA AGGAAACTAA AGGCAAAGGT TCTTTGGAAG TACTCAATCT GAAAGATGTA GAAGAAGGAG ATGAGAAATT TGAATGACAC CCATCAATCT CTTCACCTCT AAAACACTAA AGTGTTTCCG TTTCCGACGG CACTGTTTCA TGTCTGTGGT CTGCCAAATA CTTGCTTAAA CTATTTGACA TTTTCTATCT TTGTGTTAAC AGTGGACACA GCAAGGCTTT CCTACATAAG TATAATAATG TGGGAATGAT TTGGTTTTAA TTATAAACTG GGGTCTAAAT CCTAAAGCAA AATTGAAACT CCAAGATGCA AAGTCCAGAG TGGCATTTTG CTACTCTGTC TCATGCCTTG ATAGCTTTCC AAAATGAAAG TTACTTGAGG CAGCTCTTGT GGGTGAAAAG TTATTTGTAC AGTAGAGTAA GATTATTAGG GGTATGTCTA TACAACAAAA GGGGGGGTCT TTCCTAAAAA AGAAAACATA TGATGCTTCA TTTCTACTTA ATGGAACTTG TGTTCTGAGG GTCATTATGG TATCGTAATG TAAAGCTTGG ATGATGTTCC TGATTATCTG AGAAACAGAT ATAGAAAAAT TGTGCCGGAC TTACCTTTCA TTGAACATGC TGCCATAACT TAGATTATTC TTGGTTAAAA AATAAAAGTC ACTTATTTCT AATTCTTAAA GTTTATAATA TATATTAATA TAGCTAAAAT TGTATGTAAT CAATAAAACC ACTCTTATGT
TTATT
一部の実施形態では、シュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群（ＳＢＤＳ）ポリヌクレオチドは、ＳＢＤＳ偽遺伝子に由来するポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＳＢＤＳポリヌクレオチドは、ＳＤＳに関連する遺伝子変換に起因する変異（例えば、２５８＋２Ｔ＞Ｃおよび／または１８３～１８４ＴＡ＞ＣＴ変異）を、単独でまたはＳＢＤＳ偽遺伝子中の他の変更との組合せで含む。
「シュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群（ＳＢＤＳ）偽遺伝子」とは、ＳＢＤＳポリヌクレオチドに少なくとも約８５％の核酸配列同一性を有する核酸配列を意味する。一実施形態では、例示的な偽遺伝子は、以下のその断片を含む。
＞ＮＲ＿０２４１０９．１ ヒト（Homo sapiens）ＳＢＤＳ偽遺伝子１（ＳＢＤＳＰ１）、転写物バリアント４、非コードＲＮＡ
CCTTTTTGGGCGTGGAAAGATGGCGGTAAAAGCCACAATGCGCAGGCGTCATCGCTCACTTCTCCCCTCC CGGCTTCTGCTCCACCTGACGCCTGCGCAGTAAGTAAGCCTGCCAGACACGCTGTGGCGGCTGCCTGAAG CTAGTGAGTCGCGGCGCCGCGCACTTGTGGTTGGGTCAGTGCCGCGCGCCGCTCGGTCGTTACCGCGAGG CGCTGGTGGCCTTCAGGCTGGACGGCGCGGGTCAGCCCTGGTTTGCCGGCTTCTGGGTCTTTGAACAGCC GCGATGTCGATCTTCACCCCCACCAACCAGATCCGCCTAACCAATGTGGCCGTGGTACGGATGAAGCGCG CCAGGAAGCGCTTCGAAATCGCCTGCTACAGAAACAAGGTCGTCGGCTGGCGGAGCGGCTTATTTTGACT AAAGGAGAAGTTCAAGTATCAGATAAAGACACACACAACTGGAGCAGATGTTTAGGGACATTGCAATTAT TGTGGCAGACAAATGTGTGACTCCTGAAACAAAGAGACCATACACCGTGATCCTTATTGAGAGAGCCATG AAGGACATCCACTATTTGGTGAAAACCAACAGGAGTACAAAACAGCAGGCTTTGGAAGTGATAAAGCAGT TAAAAGAGAAAATGAAGATAGAACGTGCTCACATGAGGCTTCAGTTCATCCTTCCAGTGAATGAAGGCAA GAAGCTGAAAGAAAAGCTCAAGCCACTGATCAAGGTCATAGAAAGTAAAGATTATGGCCAACAGTTAGAA ATCGTAAGAGTCAAATATTTTCTTTGCTTCATGTTACCTAAATATTGTATTCTCTAGTAATAAATTTGTA GCAAACATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
＞ＮＲ＿０２４１１０．１ ヒトＳＢＤＳ偽遺伝子１（ＳＢＤＳＰ１）、転写物バリアント１、非コードＲＮＡ
CCTTTTTGGGCGTGGAAAGATGGCGGTAAAAGCCACAATGCGCAGGCGTCATCGCTCACTTCTCCCCTCC CGGCTTCTGCTCCACCTGACGCCTGCGCAGTAAGTAAGCCTGCCAGACACGCTGTGGCGGCTGCCTGAAG CTAGTGAGTCGCGGCGCCGCGCACTTGTGGTTGGGTCAGTGCCGCGCGCCGCTCGGTCGTTACCGCGAGG CGCTGGTGGCCTTCAGGCTGGACGGCGCGGGTCAGCCCTGGTTTGCCGGCTTCTGGGTCTTTGAACAGCC GCGATGTCGATCTTCACCCCCACCAACCAGATCCGCCTAACCAATGTGGCCGTGGTACGGATGAAGCGCG CCAGGAAGCGCTTCGAAATCGCCTGCTACAGAAACAAGGTCGTCGGCTGGCGGAGCGGCTTGGAAAAAGA CCTTGATGAAGTTCTGCAGACCCACTCAGTGTTTGTAAATGTTTCCTAAGGTCAGGTTGCCAAGAAGGAA GATCTCATCAGTGCGTTTGGAACAGATGACCAAACTGAAATCTATTTTGACTAAAGGAGAAGTTCAAGTA TCAGATAAAGACACACACAACTGGAGCAGATGTTTAGGGACATTGCAATTATTGTGGCAGACAAATGTGT GACTCCTGAAACAAAGAGACCATACACCGTGATCCTTATTGAGAGAGCCATGAAGGACATCCACTATTTG GTGAAAACCAACAGGAGTACAAAACAGCAGGCTTTGGAAGTGATAAAGCAGTTAAAAGAGAAAATGAAGA TAGAACGTGCTCACATGAGGCTTCAGTTCATCCTTCCAGTGAATGAAGGCAAGAAGCTGAAAGAAAAGCT CAAGCCACTGATCAAGGTCATAGAAAGTAAAGATTATGGCCAACAGTTAGAAATCGTATGTCTGATTGAC CTGGGCTGCTTCCGAGAAATTGATGAGCTAATAAAAAAGGAAACCAAAGGCAAAGGTTCTTTGGAAGTAC TCAATCTGAAAGATTTGAAGAAGGAGATGAGAAATTTGAATGACACCCATCAGTCTCTTCACCTCTAAAA CACTAAAGTGTTTTCGTTTCCAACAGCACTGTTTCATGTCTGTGGTCTGCCAAATACTTGCTCAAACTAT TTGACATTTTCTATCTTTGTGTTAACAGTGGACACAGCAAGGCTTTCCTACATAAGTATAATAATGTGGG AATGATTTGGTTTTAATTATAAACTGGGGTCTAAATCCTAAAGCAAAATTGAAACTCCAGGATGCAAAAT CCAGAGTGGCATTTTGCTACTCTGTCTCATGCCTTGATAGCTTTCCAAAATGAAAGTTACTTGAGGCAGC TCTTGTGGGTGAAAAGTTTTTTGTACAGTAGAGTAAGATTATTAGGGGTATGTCTATACGACAAAAGGGG GGTCTTTCCTAAAAAAGAAAACATGATGCTTCATTTCTACTTAATGGAACTTGTGTTCTGAGGGTCATTA TGGTATCGTAATATAAAGCTTGGATGATGTTCCTGATTATCTGAGAAACAGATATAGAAAAATTGTGTCG GACTTAAATAATTTTCGTTGAACATGCTGCCATAACTTAGATTATTCTTGGTTAAAAAATAAAAGTCACT TATTTCTAATTCTTAAAGTTTATAATATATATTAATATAGCTAAAATTGTATGTAATCAATAAAACCACT CTTATGTTTATTAAACTATGGCTTGTGTTTCTAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAA
＞ＮＲ＿０２４１１１．１ ヒトＳＢＤＳ偽遺伝子１（ＳＢＤＳＰ１）、転写物バリアント２、非コードＲＮＡ
CCTTTTTGGGCGTGGAAAGATGGCGGTAAAAGCCACAATGCGCAGGCGTCATCGCTCACTTCTCCCCTCC CGGCTTCTGCTCCACCTGACGCCTGCGCAGTAAGTAAGCCTGCCAGACACGCTGTGGCGGCTGCCTGAAG CTAGTGAGTCGCGGCGCCGCGCACTTGTGGTTGGGTCAGTGCCGCGCGCCGCTCGGTCGTTACCGCGAGG CGCTGGTGGCCTTCAGGCTGGACGGCGCGGGTCAGCCCTGGTTTGCCGGCTTCTGGGTCTTTGAACAGCC GCGATGTCGATCTTCACCCCCACCAACCAGATCCGCCTAACCAATGTGGCCGTGGTACGGATGAAGCGCG CCAGGAAGCGCTTCGAAATCGCCTGCTACAGAAACAAGGTCGTCGGCTGGCGGAGCGGCTTATTTTGACT AAAGGAGAAGTTCAAGTATCAGATAAAGACACACACAACTGGAGCAGATGTTTAGGGACATTGCAATTAT TGTGGCAGACAAATGTGTGACTCCTGAAACAAAGAGACCATACACCGTGATCCTTATTGAGAGAGCCATG AAGGACATCCACTATTTGGTGAAAACCAACAGGAGTACAAAACAGCAGGCTTTGGAAGTGATAAAGCAGT TAAAAGAGAAAATGAAGATAGAACGTGCTCACATGAGGCTTCAGTTCATCCTTCCAGTGAATGAAGGCAA GAAGCTGAAAGAAAAGCTCAAGCCACTGATCAAGGTCATAGAAAGTAAAGATTATGGCCAACAGTTAGAA ATCGTATGTCTGATTGACCTGGGCTGCTTCCGAGAAATTGATGAGCTAATAAAAAAGGAAACCAAAGGCA AAGGTTCTTTGGAAGTACTCAATCTGAAAGATTTGAAGAAGGAGATGAGAAATTTGAATGACACCCATCA GTCTCTTCACCTCTAAAACACTAAAGTGTTTTCGTTTCCAACAGCACTGTTTCATGTCTGTGGTCTGCCA AATACTTGCTCAAACTATTTGACATTTTCTATCTTTGTGTTAACAGTGGACACAGCAAGGCTTTCCTACA TAAGTATAATAATGTGGGAATGATTTGGTTTTAATTATAAACTGGGGTCTAAATCCTAAAGCAAAATTGA AACTCCAGGATGCAAAATCCAGAGTGGCATTTTGCTACTCTGTCTCATGCCTTGATAGCTTTCCAAAATG AAAGTTACTTGAGGCAGCTCTTGTGGGTGAAAAGTTTTTTGTACAGTAGAGTAAGATTATTAGGGGTATG TCTATACGACAAAAGGGGGGTCTTTCCTAAAAAAGAAAACATGATGCTTCATTTCTACTTAATGGAACTT GTGTTCTGAGGGTCATTATGGTATCGTAATATAAAGCTTGGATGATGTTCCTGATTATCTGAGAAACAGA TATAGAAAAATTGTGTCGGACTTAAATAATTTTCGTTGAACATGCTGCCATAACTTAGATTATTCTTGGT TAAAAAATAAAAGTCACTTATTTCTAATTCTTAAAGTTTATAATATATATTAATATAGCTAAAATTGTAT GTAATCAATAAAACCACTCTTATGTTTATTAAACTATGGCTTGTGTTTCTAGACAAAAAAAAAAAAAAAA AA
＞ＮＲ＿００１５８８．２ ヒトＳＢＤＳ偽遺伝子１（ＳＢＤＳＰ１）、転写物バリアント３、非コードＲＮＡ
CCTTTTTGGGCGTGGAAAGATGGCGGTAAAAGCCACAATGCGCAGGCGTCATCGCTCACTTCTCCCCTCC CGGCTTCTGCTCCACCTGACGCCTGCGCAGTAAGTAAGCCTGCCAGACACGCTGTGGCGGCTGCCTGAAG CTAGTGAGTCGCGGCGCCGCGCACTTGTGGTTGGGTCAGTGCCGCGCGCCGCTCGGTCGTTACCGCGAGG CGCTGGTGGCCTTCAGGCTGGACGGCGCGGGTCAGCCCTGGTTTGCCGGCTTCTGGGTCTTTGAACAGCC GCGATGTCGATCTTCACCCCCACCAACCAGATCCGCCTAACCAATGTGGCCGTGGTACGGATGAAGCGCG CCAGGAAGCGCTTCGAAATCGCCTGCTACAGAAACAAGGTCGTCGGCTGGCGGAGCGGCTTGGAAAAAGA CCTTGATGAAGTTCTGCAGACCCACTCAGTGTTTGTAAATGTTTCCTAAGGTCAGGTTGCCAAGAAGGAA GATCTCATCAGTGCGTTTGGAACAGATGACCAAACTGAAATCTATTTTGACTAAAGGAGAAGTTCAAGTA TCAGATAAAGACACACACAACTGGAGCAGATGTTTAGGGACATTGCAATTATTGTGGCAGACAAATGTGT GACTCCTGAAACAAAGAGACCATACACCGTGATCCTTATTGAGAGAGCCATGAAGGACATCCACTATTTG GTGAAAACCAACAGGAGTACAAAACAGCAGGCTTTGGAAGTGATAAAGCAGTTAAAAGAGAAAATGAAGA TAGAACGTGCTCACATGAGGCTTCAGTTCATCCTTCCAGTGAATGAAGGCAAGAAGCTGAAAGAAAAGCT CAAGCCACTGATCAAGGTCATAGAAAGTAAAGATTATGGCCAACAGTTAGAAATCGTAAGAGTCAAATAT TTTCTTTGCTTCATGTTACCTAAATATTGTATTCTCTAGTAATAAATTTGTAGCAAACATTCAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
用語「一塩基多型（ＳＮＰ）」とは、ゲノム内の特異的な位置で起こる単一ヌクレオチドのバリエーションであり、各バリエーションは、いくらかそれと分かる程度に集団内に存在する（例えば、＞１％）。例えば、ヒトゲノム内の特異的な塩基位置では、Ｃヌクレオチドは大部分の個体に現れる可能性があるが、少数の個体ではこの位置をＡが占める。このことは、ＳＮＰがこの特異的な位置にあることを意味し、このあり得る２つのヌクレオチドのバリエーションＣまたはＡは、この位置について対立遺伝子であると言う。ＳＮＰは、疾患に対する感受性の差の根底を成す。また、病気の重症度と、我々の身体が治療に応答する道筋も、遺伝子バリエーションの現れである。ＳＮＰは、遺伝子のコード領域内、遺伝子の非コード領域内、または遺伝子間領域（遺伝子間の領域）中の範囲にあり得る。一部の実施形態では、コード配列内のＳＮＰは、遺伝子コードの縮重ゆえに、産生されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変えない。コード領域中のＳＮＰは、２つのタイプ、すなわち同義ＳＮＰと非同義ＳＮＰとがある。同義ＳＮＰはタンパク質配列に影響を及ぼさないのに対し、非同義ＳＮＰはタンパク質のアミノ酸配列を変える。非同義ＳＮＰには２つのタイプ、すなわちミスセンスとナンセンスとがある。タンパク質コード領域中にないＳＮＰもやはり、遺伝子のスプライシング、転写因子の結合、メッセンジャーＲＮＡの分解、または非コードＲＮＡの配列に影響を及ぼし得る。このタイプのＳＮＰにより影響を受ける遺伝子発現は、ｅＳＮＰ（発現ＳＮＰ）と呼ばれ、遺伝子から上流または下流であり得る。一塩基バリアント（ＳＮＶ）は、何ら頻度の限定のない単一ヌクレオチドのバリエーションであり、体細胞に起こり得る。体細胞の一塩基バリエーションもまた、単一ヌクレオチドの変更であり得る。
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子を認識し結合するが、試料中、例えば生体試料中の他の分子を実質的に認識し結合しない、核酸分子、ポリペプチド、またはそれらの複合体（例えば、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質およびガイド核酸）、化合物、または分子を意味する。
本発明の方法において有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を呈するものとなる。内因性の配列に「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子のうち少なくとも一本鎖にハイブリダイズすることができる。本発明の方法で有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を呈するものとなる。内因性の配列に「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子のうち少なくとも一本鎖にハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシーの条件下で相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）またはその一部分の間を対合させて二本鎖分子を形成することを指す （例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ ＮａＣｌおよび７５ｍＭ クエン酸三ナトリウムを超えず、好ましくは約５００ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウムを超えず、さたに好ましくは約２５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウムを超えないものとなる。ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの不在下で得ることができるのに対して、ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミド、さらに好ましくは少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、さらに好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むものとなる。様々な追加的なパラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの含有もしくは除外などは、当技術分野に周知されている。様々なレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。好適な実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳ中、３０℃で起こるものとなる。さらに好適な実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で起こるものとなる。最も好適な実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、および２００μｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡ中、４２℃で起こるものとなる。これらの条件に関する有用なバリエーションは、当業者に容易に明らかになるものとなる。
大部分の適用では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップも、ストリンジェンシーの点で異なるものとなる。洗浄のストリンジェンシーの条件は、塩濃度によって、および温度によって、規定され得る。上記のように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることによって、または温度を増加させることによって、増加させることができる。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウムを超えず、最も好ましくは約１５ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムを超えないものとなる。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、さらに好ましくは少なくとも約４２℃、いっそうさらに好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むものとなる。一実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、２５℃で起こるものとなる。別の実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、４２℃で起こるものとなる。さらに好適な実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、６８℃で起こるものとなる。これらの条件に関する追加のバリエーションは、当業者に容易に明らかになるものとなる。ハイブリダイゼーション手法は、当業者に周知されており、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977)；Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)；Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
「スプリット」とは、２つ以上の断片に分けることを意味する。
「スプリットＣａｓ９タンパク質」または「スプリットＣａｓ９」とは、２つの別々のヌクレオチド配列によりコードされるＮ末端断片およびＣ末端断片として与えられるＣａｓ９タンパク質を指す。Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分に対応するポリペプチドは、分けられて、「再構成された」Ｃａｓ９タンパク質を形成してもよい。具体的な実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれるNishimasu et al., Cell, Volume 156, Issue 5, pp. 935-949, 2014に記載されるかまたはJiang et al. (2016) Science 351: 867-871. PDB file: 5F9Rに記載されるように、タンパク質の障害領域内で２つの断片に分けられる。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳｐＣａｓ９の領域内の任意のＣ、Ｔ、Ａ、またはＳで、おおよそアミノ酸Ａ２９２～Ｇ３６４、Ｆ４４５～Ｋ４８３、もしくはＥ５６５～Ｔ６３７の間で、または任意の他のＣａｓ９、Ｃａｓ９バリアント（例えば、ｎＣａｓ９、ｄＣａｓ９）、もしくは他のｎａｐＤＮＡｂｐの対応する位置で、２つの断片に分けられる。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳｐＣａｓ９Ｔ３１０、Ｔ３１３、Ａ４５６、Ｓ４６９、またはＣ５７４で２つの断片に分けられる。一部の実施形態では、このタンパク質を２つの断片に分ける過程は、タンパク質をスプリットすると呼ばれる。
他の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分は、Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９野生型（ＳｐＣａｓ９）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２７３７．２、Ｕｎｉｐｒｏｔ参照配列：Ｑ９９ＺＷ２）のアミノ酸１～５７３または１～６３７を含み、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端部分は、ＳｐＣａｓ９野生型のアミノ酸５７４～１３６８または６３８～１３６８の部分を含む。
スプリットＣａｓ９のＣ末端部分は、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分に接合して、完全なＣａｓ９タンパク質を形成することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質のＣ末端部分は、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分の終わるところから開始する。このように、一部の実施形態では、スプリットＣａｓ９のＣ末端部分は、ｓｐＣａｓ９のアミノ酸（５５１～６５１）～１３６８の部分を含む。「（５５１～６５１）～１３６８」とは、アミノ酸５５１～６５１（全て含む）の間のアミノ酸で開始し、アミノ酸１３６８で終わることを意味する。例えば、スプリットＣａｓ９のＣ末端部分は、ｓｐＣａｓ９のアミノ酸５５１～１３６８、５５２～１３６８、５５３～１３６８、５５４～１３６８、５５５～１３６８、５５６～１３６８、５５７～１３６８、５５８～１３６８、５５９～１３６８、５６０～１３６８、５６１～１３６８、５６２～１３６８、５６３～１３６８、５６４～１３６８、５６５～１３６８、５６６～１３６８、５６７～１３６８、５６８～１３６８、５６９～１３６８、５７０～１３６８、５７１～１３６８、５７２～１３６８、５７３～１３６８、５７４～１３６８、５７５～１３６８、５７６～１３６８、５７７～１３６８、５７８～１３６８、５７９～１３６８、５８０～１３６８、５８１～１３６８、５８２～１３６８、５８３～１３６８、５８４～１３６８、５８５～１３６８、５８６～１３６８、５８７～１３６８、５８８～１３６８、５８９～１３６８、５９０～１３６８、５９１～１３６８、５９２～１３６８、５９３～１３６８、５９４～１３６８、５９５～１３６８、５９６～１３６８、５９７～１３６８、５９８～１３６８、５９９～１３６８、６００～１３６８、６０１～１３６８、６０２～１３６８、６０３～１３６８、６０４～１３６８、６０５～１３６８、６０６～１３６８、６０７～１３６８、６０８～１３６８、６０９～１３６８、６１０～１３６８、６１１～１３６８、６１２～１３６８、６１３～１３６８、６１４～１３６８、６１５～１３６８、６１６～１３６８、６１７～１３６８、６１８～１３６８、６１９～１３６８、６２０～１３６８、６２１～１３６８、６２２～１３６８、６２３～１３６８、６２４～１３６８、６２５～１３６８、６２６～１３６８、６２７～１３６８、６２８～１３６８、６２９～１３６８、６３０～１３６８、６３１～１３６８、６３２～１３６８、６３３～１３６８、６３４～１３６８、６３５～１３６８、６３６～１３６８、６３７～１３６８、６３８～１３６８、６３９～１３６８、６４０～１３６８、６４１～１３６８、６４２～１３６８、６４３～１３６８、６４４～１３６８、６４５～１３６８、６４６～１３６８、６４７～１３６８、６４８～１３６８、６４９～１３６８、６５０～１３６８、または６５１～１３６８のうちいずれか１つの一部を含み得る。一部の実施形態では、スプリットＣａｓ９タンパク質のＣ末端部分は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸５７４～１３６８または６３８～１３６８の一部を含む。
「対象」とは、哺乳動物を意味し、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類（サル）、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の対象は、ＳＤＳを有するかまたはＳＤＳを発症する傾向を有するものとして対象を識別する、ＳＢＤＳタンパク質をコードするＳＤＳポリヌクレオチド配列内の病原性変異を含む。
「実質的に同一である」とは、ポリペプチドまたは核酸分子が、参照のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すことを意味する。一実施形態では、そのような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、比較に用いられる配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％もしくは８５％、９０％、９５％、または９９％さえ同一である。
配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア（例えば、ジェネティクス・コンピュータ・グループの配列解析ソフトウェアパッケージ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０ユニバーシティ・アベニュー、マディソン、ウィスコンシン州５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の修飾との相同性の程度を対応付けることによって、同一または類似の配列を照合する。保存的な置換は、典型的には、以下：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの群内の置換を含む。同一性の程度を決定する例示的な一アプローチでは、密接に関連する配列であることを標示するｅ－３とｅ－１００との間の確率スコアを伴うＢＬＡＳＴプログラムを用いてもよい。
ＣＯＢＡＬＴを、例えば、以下のパラメーターを用いて使用する：
ａ）アラインメントパラメーター：Ｇａｐペナルティー－１１、－１およびＥｎｄ－Ｇａｐペナルティー－５、－１、
ｂ）ＣＤＤパラメーター：ＲＰＳ ＢＬＡＳＴを使用；Ｂｌａｓｔ Ｅ－ｖａｌｕｅ ０．００３；保存されたカラムを見つけて再演算、ならびに
c）クエリクラスタリングパラメーター: クエリクラスターを使用；ワードサイズ４；最大クラスター距離０．８；アルファベット レギュラー。
ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを例えば、以下のパラメーターを用いて使用する：
ａ）マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；
ｂ）ＧＡＰ ＯＰＥＮ：１０；
ｃ）ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：０．５；
ｄ）ＯＵＴＰＵＴ ＦＯＲＭＡＴ：ｐａｉｒ；
ｅ）ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ：ｆａｌｓｅ；
ｆ）ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ：１０；および
ｇ）ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：０．５。
用語「標的部位」とは、デアミナーゼまたはデアミナーゼを含む融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９－アデノシンデアミナーゼ融合タンパク質または本明細書に開示の塩基エディター）によって脱アミノ化される核酸分子内の配列を指す。
ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いてＤＮＡ切断部位を標的とするため、これらのタンパク質は、原理上は、ガイドＲＮＡにより指定された任意の配列を標的とすることが可能である。Ｃａｓ９などのＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼを部位特異的切断のために（例えば、ゲノムを改変するために）用いる方法は、当技術分野に公知である（例えば、それぞれの全体の内容を本明細書に参照により組み込まれるCong, L. et ah, Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)；Mali, P. et ah, RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)；Hwang, W.Y. et ah, Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)；Jinek, M. et ah, RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)；Dicarlo, J.E. et ah, Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)；Jiang, W. et ah RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照）。
本明細書に用いられる際に、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、疾患もしくは障害および／またはそれに伴う症状を低減すること、減少させること、減じること、漸減すること、軽減すること、または寛解させること、または所望の薬学的および／または生理学的な効果を得ることを指す。除外するものではないが、障害または状態を治療することは、障害、状態、またはそれに伴う症状を完全に排除することを必要とはしないことが理解されよう。一部の実施形態では、この効果は治療的であり、すなわち、限定はないがこの効果は、部分的または完全に、疾患および／またはその疾患に起因する有害な症状の強度を低減するか、漸減するか、阻止するか、減じるか、寛解させるか、減少させるか、または治癒させる。一部の実施形態では、この効果は予防的であり、すなわち、この効果は、疾患または状態の発生および再発を防御または予防する。この目的に向けて、ここに開示された方法は、本明細書に記載されるように治療有効量の組成物を投与することを含む。一実施形態では、本発明はＳＤＳの治療を提供する。
「ウラシルグリコシラーゼ阻害物質」または「ＵＧＩ」とは、ウラシル除去修復システムを阻害する剤を意味する。一実施形態では、この剤は、宿主のウラシルＤＮＡグリコシラーゼに結合してＤＮＡからのウラシル残基の除去を防止するタンパク質またはその断片である。一実施形態では、ＵＧＩは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することのできるタンパク質またはその断片またはドメインである。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、野生型ＵＧＩまたはその改変型バージョンを含む。一部の実施形態では、ＵＧＩドメインは、下記に規定される例示的なアミノ酸配列の断片を含む。一部の実施形態では、ＵＧＩ断片は、下記に示される例示的なＵＧＩ配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＵＧＩは、下記に規定されるような例示的なＵＧＩアミノ酸配列またはその断片に相同なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＵＧＩまたはその一部は、野生型ＵＧＩまたは下記に規定されるようなＵＧＩ配列もしくはその一部と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％同一である。例示的なＵＧＩは、以下のようなアミノ酸配列を含む。
＞ｓｐｌＰ１４７３９ＩＵＮＧＩ＿ＢＰＰＢ２ ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害物質
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLT S D APE YKPW ALVIQDS NGENKIKML.
本明細書に示される範囲は、範囲内の全ての値についての簡略表現であるものと理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群に由来する任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むものと理解される。
本明細書中の変動要素の任意の定義における化学基の列挙の記載は、その変動要素の定義を、挙げられた基のうち任意の単一の基または組合せとして含む。本明細書中の変動要素または態様についての一実施形態の記載は、その実施形態を、任意の単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せとして含む。
本明細書に示される任意の組成物または方法は、本明細書に示される他の組成物および方法のうちいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。
本明細書の記載および実施例は、本開示の実施形態を詳細に説明する。本開示は本明細書に記載の具体的な実施形態に限定されず、それゆえに変わり得ることが理解されよう。当業者は、その範囲内に包含され得る本開示の数多くのバリエーションおよび修飾があることを認識するものとなる。
全ての用語は、当業者によって理解されるものとして理解されることが意図されている。別段に定義のない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書に開示される一部の実施形態の実践では、別段に指示のない限り、当技術分野の技能の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えDNAの従来の手法が採用される。例えば、Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012)；the series Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.)；the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))を参照されたい。
本開示の様々な特徴は、単一の実施形態のコンテクストで記載することができるが、この特徴は別々に、または任意の適した組合せで示すこともできる。逆に、本開示は、明確にするために、別々の実施形態のコンテクストで本明細書に記載することができるが、本開示は、単一の実施形態に実装することもできる。本明細書に用いられる項目見出しは、構成の目的があるに過ぎず、記載された主題を限定するものと解釈されることはない。
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に規定される。ここでの特徴および利点のより良い理解は、本明細書で下記に記載されるような添付の図面の観点で、本開示の原理の利用される例証となる実施形態を規定する以下の詳細な記載を参照することによって得られるものとなる。
図１Ａおよび図１Ｂは、ＳＤＳを引き起こすＳＢＤＳ内の変異を示す。図１Ａは、ＳＢＤＳ（明るい陰影内のコード領域、暗い陰影内の非コード領域）のマップおよびＳＢＤＳのエクソン２領域とＳＢＤＳタンパク質との配列アラインメントを示す図であり、遺伝子特異的（灰色；上部）配列と偽遺伝子特異的（灰色；下部）配列とを標示している。ＳＢＤＳに比べると、変換事象の結果生じるＳＢＤＳＰのエクソン２は、タンパク質の切詰（下線部）を生じるものと予想される配列変化を含有する。これらは、１８４位にインフレーム終止コドンを、および２５０＋１０にＴ→Ｃ変化（ＳＢＤＳ中の２５８＋２にあるドナースプライス部位の不変のＴに対応する）を含み、後者の変化は、代替ドナースプライス部位の使用を２５０＋１（不変のスプライス部位の位置がボックスで囲まれている）に生じる。 図１Ｂは、ＳＢＤＳのエクソン２領域に由来するクローニングされたセグメントについての配列リードを示す図であり、ここでは、ＳＢＤＳとその偽遺伝子との間の遺伝子変換事象から得られたＳＤＳに罹っている個体における配列変化を標示しており、３つの変換された対立遺伝子が示されている。これらには、１８３～１８４ＴＡ→ＣＴ、２５８＋２Ｔ→Ｃ、および拡張変換変異である１８３～１８４ＴＡ→ＣＴ＋２０１Ａ→Ｇ＋２５８＋２Ｔ→Ｃが含まれる。それぞれの場合に、情報を与える側面位置は、１４１と２５８＋１２４とを含めて、変換されていなかった（緑色）。 同上。 図２Ａ～図２Ｄは、１つまたは複数の病原性変異を含むＳＢＤＳ遺伝子において転写を回復させるためのストラテジーを説明する概略図である。図２Ａは、終止コドンを排除し、代替のアミノ酸（例えば、Ｔｒｐ（Ｗ））をアミノ酸６２位（例えば、（Ｋ６２Ｘ））に含むＳＢＤＳタンパク質の発現をもたらす、変異を導入するためのストラテジーを説明する図である。図２Ｂおよび図２Ｄは、ヌクレオチド２５８位（標的ＳＮＰ ｒｓ１１３９９３９９３ Ｃ→Ｔ）でスプライス部位を修正するためのストラテジーを説明する図である。図２Ｃは、スプライスドナー位置を説明する図であり、この位置では、規準的なスプライスドナーが回復してＳＮＰ変異を修正する。 同上。 同上。 同上。 図３Ａ～図３Ｃは、変更型ＰＡＭ５’－ＮＧＣ－３’またはＰＡＭを含有する５’－ＮＧＣ－３’に対する特異性を有するＣａｓ９バリアントを産生するＣａｓ９タンパク質中、例えば、改変型ＳｐＣａｓ９などの改変型Ｃａｓ９中で置換の発生するアミノ酸位置と、ＳｐＣａｓ９バリアント配列をコードするプラスミド構築物とを示す表を提示している。記載されるような少なくとも１つのシチジンデアミナーゼと少なくとも１つのＣａｓ９バリアントとを含むシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）は、実施例３に記載されるようなＳＤＳに関連するＳＢＤＳ遺伝子内の変異を修正するのに用いられる。図３Ａは、ＮＧＣ ＰＡＭに結合可能であったＣａｓ９バリアント（左カラムの番号により称される）を生産するためにＣａｓ９タンパク質中の野生型から変えられた、アミノ酸位置を提示する。これらのＣａｓ９バリアントは、本明細書に記載の塩基編集試験で評価されるＣＢＥの構成成分である。図３Ｂは、試験でバイスタンダー効果が限定的であった特に良好かつ高いオンターゲット編集をもたらす、Ｃａｓ９バリアントのサブセットを提示する。図３Ｂにまた示されるのは、Ｃａｓ９タンパク質ドメインの模式図とＣａｓ９タンパク質配列内のそれらの位置である。図３Ｃは、本明細書に記載されるような変更型ＰＡＭ ５’－ＮＧＣ－３’に対し特異性を有する、ＳｐＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドベクター構成成分とその中の配列変異とを図説する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図４は、横座標に示す異なるシチジンデアミナーゼを含むＣＢＥによって達成される塩基編集の相対変異速度を比較したグラフを図示する。 図５は、本明細書に記載の試験で評価されたＣＢＥと共に用いたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を示す表である。実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、実施例に記載の塩基編集試験で用いられたプラスミド構築物の構成成分とした。 図６Ａ～図６Ｃは、本明細書に記載されるようなＮＧＣ ＣＢＥバリアントと１９ｍｅｒおよび２０ｍｅｒのｇＲＮＡ、例えばＧ８８およびＧ４４によって達成される、編集（例えばオンターゲット編集）パーセントとバイスタンダー編集のパーセントとの対比を示す。図６Ａの右手のグラフならびに図６Ｂでは、「ＰＶ２２６」および「ＰＶ２３０」は、試験に用いられたプラスミドを指す。ＰＶ２２６プラスミドは、Ｃａｓ９バリアント＃２２６をコードするポリヌクレオチドを含有し、その配列は図３Ａ～図３Ｃに示されており、ＰＶ２３０プラスミドは、Ｃａｓ９バリアント＃２３０をコードするポリヌクレオチドを含有し、その配列は図３Ａ～図３Ｃに示されている。配列を図３Ａ～図３Ｃに記載された異なるＣａｓ９バリアントを含有する他のＮＧＣ ＣＢＥと、２０ｍｅｒのｇＲＮＡであるＧ４４とによって発揮される編集のパーセントは、図６Ｃに示されている。 同上。 同上。 図７Ａおよび図７Ｂは、本明細書の実施例４に記載される１９ｍｅｒのｇＲＮＡ（Ｇ８８）および２０ｍｅｒのｇＲＮＡ（Ｇ４４）に連係されて用いられる表１３に示すシチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアントとを含むＮＧＣ ＣＢＥによる編集のパーセントのグラフを示す。 同上。 図８Ａ～８Ｊは、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列内のスプライス部位のＳＮＰを修正する細胞ベース（ＨＥＫ２９３）のアッセイで評価した際に、１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのどちらかのｇＲＮＡと併せて、異なるシチジンデアミナーゼと、図３Ａ～図３Ｃまたは表１３に提示されるようなＣａｓ９アミノ酸配列内に変異の特異的な組合せを有するＣａｓ９（例えば、ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドとを含むＮＧＣ ＣＢＥによって達成される、塩基編集（オンターゲット編集およびバイスタンダー編集）のパーセントのグラフを示す。図８Ａは、１９ｍｅｒ（ガイド８８）ｇＲＮＡと共に用いて、Ｃａｓ９バリアント２２５とＰｐＡＰＯＢＥＣ１とを含有するＮＧＣ ＣＢＥによって、およびＰｐＡＰＯＢＥＣ１とＣａｓ９バリアント２２６および２４４（図３Ａ～３Ｃ）とをそれぞれ含有するＮＧＣ ＣＢＥ４５４および４５９（表１３）によって発揮される、オンターゲット編集とバイスタンダー編集との対比を示す。図８Ｂは、２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のｇＲＮＡと共に用いて、Ｃａｓ９バリアント２２５とＰｐＡＰＯＢＥＣ１とを含有するＮＧＣ ＣＢＥによって、およびＰｐＡＰＯＢＥＣ１とＣａｓ９バリアント２２６および２４４とをそれぞれ含有するＮＧＣ ＣＢＥｓ４５４および４５９（表１３）によって発揮される、オンターゲット編集とバイスタンダー編集との対比のパーセントを示す。図８Ｃおよび図８Ｄは、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡを共に用いた、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、２２６、および２４４（図３Ａ～図３Ｃ）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲット塩基編集およびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ｅおよび図８Ｆは、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡを共に用いた、ＰｍＣＤＡ１シチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、４５３、および４５８（表１３）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲット塩基編集およびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ｇおよび図８Ｈは、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡと共に用いた、ＲＲＡ３ＦシチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、４５５、および４６０（表１３）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲット塩基編集およびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ｉおよび図８Ｊは、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡを共に用いたＳｓＡＰＯＢＥＣ２シチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、４５６、および４６１（表１３）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲット塩基編集およびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ａ～図８Ｊでは、Ｃａｓ９バリアント２２５（またはＰＶ２２５）は、代替的に「ビームシャッフル」と呼ばれる。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図９Ａ～図９Ｄは、１９ｍｅｒのｇＲＮＡ（図９Ａ）または２０ｍｅｒのｇＲＮＡ（図９Ｂ）を共に用いた、実施例４に記載されるような様々な変異、例えば、Ｈ１２２Ａ変異のみ、ならびにアミノ酸変異Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、およびＹ１２０Ｆとの組合せなどを含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼポリペプチド配列を含むＮＧＣ ＣＢＥによる編集のパーセントのグラフおよびドットプロットを示す。オンターゲット編集とバイスタンダー編集との対比のパーセンテージは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースのアッセイで評価された。図９Ｃおよび図９Ｄは、それぞれ図９Ａおよび図９Ｂのデータをドットプロットの形式で提示している。 同上。 同上。 同上。 図１０は、示されるような変異の組合せを有するＳｐＣａｓ９バリアントを作り出すためにＳｐＣａｓ９タンパク質内に作製された、変異および変異の組合せを図示する表を提示しており、このような変異としては、その内容が参照により本明細書にその全体を組み込まれるS. Miller et al., April, 2020, “Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs,” Nature Biotechnology, 38(4):471-481（２０２０年２月１０日にオンラインにて公開 doi: 10.1038/s41587-020-0412-8）に記載されるような「ＮＲＣＨ」変異が挙げられる。ＮＲＣＨ変異（アミノ酸置換）の組合せをいくつかの異なるＳｐＣａｓ９バリアントに含めて、ＳＤＳに関連するＳＢＤＳ遺伝子中のスプライス部位のＳＮＰを高いオンターゲット塩基編集とバイスタンダー塩基編集との対比で修正する際に使用するためのＮＧＣ ＣＢＥのＳｐＣａｓ９バリアント構成成分を産生するものを決定した（実施例６）。図１０では、暗い方の陰影のアミノ酸は、野生型の無変異のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質の配列と比べた際のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）アミノ酸配列中のアミノ酸置換を反映する。明るい方の陰影のアミノ酸は、野生型の無変異のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質のアミノ酸残基を反映する。 同上。 図１１Ａおよび図１１Ｂは、細胞ベースアッセイにおいて、１９ｍｅｒのｇＲＮＡまたは２０ｍｅｒのｇＲＮＡのどちらかと連係されて用いられた、シチジンデアミナーゼを含むＮＧＣ ＣＢＥ（例えば、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１）と、図１０および実施例５に規定される１つまたは複数のＮＲＣＨ変異を含むＳｐＣａｓ９バリアントとによる、編集のパーセントを説明するグラフを示し、アッセイは、これらのＣＢＥがＳＤＳに関連するＳＢＤＳ遺伝子中のスプライス部位のＳＮＰを修正するためのオンターゲット編集効率およびバイスタンダー編集効率を評価する。ＮＧＣ ＣＢＥ ４６８および４６９（図１０）は、１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのどちらかのｇＲＮＡと連係されて用いられた際に、高いレベルのオンターゲット対オフターゲット塩基編集を示した。 同上。 図１２Ａ～図１２Ｃは、異なる長さ（１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、または２１ｍｅｒ）のｇＲＮＡと併せた実施例６に記載のｍＲＮＡによってコードされるＮＧＣ ＣＢＥの塩基編集効率、およびオンターゲット編集のパーセンテージとバイスタンダー編集のパーセンテージとの対比を評価するために実行される、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースのアッセイの結果を説明するグラフを示す。観察されるように、１８ｍｅｒおよび２０ｍｅｒのｇＲＮＡを有するｍＲＮＡ３４２は、ｍＲＮＡ３４０またはｍＲＮＡ３４１に比べて、ＣからＡまたはＣからＧへの遷移が最も少ない。 同上。 同上。
本発明は、プログラマブル核酸塩基エディターを用いて、遺伝子内で異常なスプライシングを引き起こす病原性遺伝子変異を編集し、転写を可能にして治療効果を達成する、組成物および方法の特徴を述べる。一部の実施形態では、編集することは、終止コドンから転写を可能にするコドンに変換することを含む。一部の実施形態では、編集することは、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を提供し修正すること、または代替のスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を提供することを含む。一部の実施形態では、異常なスプライシングに起因する１つ以上の変異が修正される。
本発明は、少なくとも部分的には、アデノシン塩基エディターまたはシチジン塩基エディター（ＡＢＥ、ＣＢＥ）を用いて、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する遺伝子内の病原性変異（例えば、遺伝子変換に起因する変異）を編集するストラテジーに基づく。したがって、本発明は、ＳＤＳの治療または予防に有用なＡＢＥまたはＣＢＥを含む塩基エディターシステムを提供する。
シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）
シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）は、常染色体劣性障害である。ＳＤＳの臨床的な診断基準を満たす患者のおよそ９０％が、シュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群（ＳＢＤＳ）遺伝子に変異を有する。この変異の保因者の頻度は、おおよそ１１０人に１人と推定されている。この高度に保存された遺伝子は５つのエクソンを有し、それらは７．９ｋｂを包含し、７番染色体の７ｑ１１セントロメア領域にマッピングされる。ＳＤＢＳ遺伝子は、既知のタンパク質機能性ドメインとの相同性に欠いた新規の２５０アミノ酸タンパク質をコードする。隣接する偽遺伝子であるＳＢＤＳＰは、ＳＢＤＳと９７％の相同性を共有するが、機能性タンパク質の生成を妨げる欠失およびヌクレオチド変化を有する。ＳＤＳの患者のほぼ７５％が、この偽遺伝子を伴う遺伝子変換事象に起因する変異を有する。遺伝子変換は、異なるゲノム遺伝子座に存在する相同配列（パラロガス配列）間で組換えが発生した際に生じる。ＳＢＤＳ偽（ＳＢＤＳＰとも呼ばれる）遺伝子の存在は、過去の遺伝子重複に起因する可能性がある。ＳＢＤＳのｍＲＮＡおよびタンパク質は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルで、ヒト組織の至る所に広く発現している。早期に切詰の生じたＳＢＤＳ変異１８３ＴＡ＞ＣＴは、ＳＤＳの患者間に共通するが、この変異がホモ接合性である患者は同定されておらず、このことは、ＳＢＤＳ発現の完全な欠落がヒト患者では致死的である可能性があることを示唆している。
ＳＤＳに関連する共通の配列変化としては、１８３～１８４位のＴＡ→ＣＴジヌクレオチド変化またはエクソン２終端の８ｂｐの欠失が挙げられる。ＳＢＤＳのゲノム配列の解析により、欠失転写物を発現するＳＤＳに罹っている個人に、１８３～１８４ＴＡ→ＣＴ変化の存在が確認され、２５８＋２Ｔ→Ｃ変化が特定された。変異２５８＋２Ｔ→Ｃは、イントロン２のドナースプライス部位を中断させるものと予測されており、８ｂｐの欠失は、２５１～２５２位にある上流の潜在的なスプライスドナー部位の使用に整合する。ジヌクレオチド変更１８３～１８４ＴＡ→ＣＴは、インフレームの終止コドン（Ｋ６２Ｘ）を導入し、２５８＋２Ｔ→Ｃおよび結果として生じる８ｂｐの欠失は、フレームシフトにより、コードされたタンパク質の未熟な切詰を引き起こす（８４Ｃｆｓ３）。
本発明は、異常なスプライシングを結果として生じる１つまたは複数の変更（例えば遺伝子変換）を有するポリヌクレオチドの転写を可能として、それによって機能性ＳＢＤＳタンパク質（例えば、ＳＢＤＳ遺伝子変換の影響を軽減させるのに十分な活性を有するタンパク質）の発現をもたらす、組成物および方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、１８３～１８４ＴＡ→ＣＴを含むＳＢＤＳ遺伝子内に、ＴＡＡ終止からＴｒｐをコードするＴＧＧに変換して転写を可能にする変更を導入することをもたらす。他の実施形態では、本発明は、生物活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドのスプライシングを可能にするスプライスドナー部位またはエフェクター部位を導入する、ポリヌクレオチド配列の変更を導入する。一部の実施形態では、本発明は、ＳＢＤＳ遺伝子のエクソン２内の部位を、（例えば、図２Ｂに示されるようにヌクレオチド位置１４９５のシトシンを編集することによって）修正する。
核酸塩基エディター
本明細書に開示されるのは、ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、改変、または変更するための塩基エディターまたは核酸塩基エディターである。本明細書に記載されるのは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと核酸塩基編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ）とを含む核酸塩基エディターまたは塩基エディターである。ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、結合ガイドポリヌクレオチド（例えばｇＲＮＡ）に連結されている際に、標的ポリヌクレオチド配列に特異的に（すなわち、結合されたガイド核酸の塩基と標的ポリヌクレオチド配列の塩基との間の相補的な塩基対形成を介して）結合し、それによって、編集の目標とする核酸配列を標的とするように塩基エディターを局在化させることができる。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列はＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む。
ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン
ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ＲＮＡを結合する核酸プログラマブルタンパク質も含み得ることを理解するべきである。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインをＲＮＡにガイドする核酸を付随し得る。他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質もまた、本開示に具体的に挙げられないとはいえ、本開示の範囲内にある。
塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、それ自体で１つまたは複数のドメインを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを含み得る。本明細書では、用語「エキソヌクレアーゼ」とは、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）をフリーな末端から消化することのできるタンパク質またはポリペプチドを指し、用語「エンドヌクレアーゼ」とは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の内部領域を触媒する（例えば、切断する）ことのできるタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸のうち一本鎖を切断することができる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の両鎖を切断することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインをデオキシリボヌクレアーゼとし得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインをリボヌクレアーゼとし得る。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインのヌクレアーゼドメインは、標的ポリヌクレオチドの０本、１本、または２本の鎖を切断し得る。一部の場合では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ニッカーゼドメインを含み得る。本明細書では、用語「ニッカーゼ」とは、二重鎖核酸分子（例えばＤＮＡ）中の二本鎖のうち一本鎖のみを切断することができるヌクレアーゼドメインを含む、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを指す。一部の実施形態では、ニッカーゼは、１つまたは複数の変異を活性のポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに導入することによって、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの完全に触媒として活性の（例えば天然の）形態から得ることができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインが、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメインを含む場合に、このＣａｓ９由来ニッカーゼドメインは、Ｄ１０Ａ変異と８４０位のヒスチジンとを含み得る。そのような場合、残基Ｈ８４０は、触媒活性を保持し、それによって核酸二重鎖のうち一本鎖を切断し得る。別の例では、Ｃａｓ９由来ニッカーゼドメインは、Ｈ８４０Ａ変異を含むことができるのに対し、１０位のアミノ酸残基はＤのままである。一部の実施形態では、ニッカーゼは、ニッカーゼ活性に必要ではないヌクレアーゼドメインの全部または一部を除去することによって、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの完全に触媒として活性の（例えば天然の）形態から得ることができる。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインが、Ｃａｓ９由来のニッカーゼドメインを含む場合に、このＣａｓ９由来ニッカーゼドメインは、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインの全部または一部の欠失を含み得る。
例示的な触媒として活性のＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD。
ゆえに、ニッカーゼドメインを含むポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、特異的なポリヌクレオチド標的配列（例えば、結合されたガイド核酸の相補的な配列によって決定される）に一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができる。一部の実施形態では、ニッカーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ニッカーゼドメイン）を含む塩基エディターによって切断される核酸二重鎖標的ポリヌクレオチド配列の鎖は、塩基エディターによって編集されない鎖である（すなわち、塩基エディターによって切断される鎖が、編集される塩基を含む鎖とは逆である）。他の実施形態では、ニッカーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ニッカーゼドメイン）を含む塩基エディターは、編集のために標的となっているＤＮＡ分子の鎖を切断し得る。そのような場合に、標的とされていない鎖は切断されない。
また本明細書に提供されるのは、触媒として活性のない（すなわち、標的ポリヌクレオチド配列を切断できない）ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターである。本明細書では、用語「触媒として活性のない」および「ヌクレアーゼ活性のない」は、結果として核酸の鎖を切断不能とする１つまたは複数の変異および／または欠失を有するポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを指すために、互換的に用いられる。一部の実施形態では、触媒として活性のないポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン塩基エディターは、１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン内の特異的な点変異の結果として、ヌクレアーゼ活性を欠いていることがある。例えば、Ｃａｓ９ドメインを含む塩基エディターの場合に、Ｃａｓ９は、Ｄ１０Ａ変異とＨ８４０Ａ変異との療法を含み得る。そのような変異は、両方のヌクレアーゼドメインを不活化し、それによってヌクレアーゼ活性の欠損を生じる。他の実施形態では、触媒として活性のないポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、触媒ドメイン（例えば、ＲｕｖＣ１および／またはＨＮＨドメイン）の全部または一部の１つまたは複数の欠失を含み得る。さらに別の実施形態では、触媒として活性のないポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、点変異（例えば、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ）ならびにヌクレアーゼドメインの全部または一部の欠失を含む。
また本明細書に想定されるのは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの従来は機能的なバージョンから、触媒として活性のないポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを生成することのできる変異である。例えば、触媒として活性のないＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）の場合に、ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ９を生じるＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するバリアントが提供される。そのような変異には、例えば、Ｄ１０およびＨ８４０での他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメイン内の置換）が含まれる。追加の適したヌクレアーゼ不活性のｄＣａｓ９ドメインは、本開示と当技術分野の知識に基づき、当業者に明らかとなり得、本開示の範囲内にある。そのような追加の例示的な適したヌクレアーゼ－不活性のＣａｓ９ドメインとしては、以下に限定されないが、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ変異体ドメイン、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ変異体ドメイン、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメインが挙げられる（例えば、その全体の内容を参照により本明細書に組み込まれるPrashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照）。
塩基エディターに組み込まれ得るポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメイン、制限ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる。一部の場合では、塩基エディターは、核酸のＣＲＩＳＰＲ（すなわち、クラスターを形成する規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）媒介性改変の間に、結合されたガイド核酸を介して核酸配列に結合することができる、天然または改変型のタンパク質またはその一部を含むポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む。そのようなタンパク質は、本明細書では「ＣＲＩＳＰＲタンパク質」と呼ばれる。したがって、本明細書に開示されるのは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部を含むポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディター（すなわち、塩基エディターの「ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメイン」とも呼ばれる、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部のドメインを含む塩基エディター）である。塩基エディターに組み込まれたＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の野生型または天然のバージョンと比べて改変することができる。例えば、下記に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の野生型または天然のバージョンに比べて、１つまたは複数の変異、挿入、欠失、再配列、および／または組換えを含み得る。
ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子、および接合性プラスミド）に対する保護を与える適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、前例の可動因子に相補的な配列、および標的進入核酸を含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセッシングされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ｃｒＲＮＡ前駆体の正しいプロセッシングは、トランスにコードされた低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、内因性のリボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）と、Ｃａｓ９タンパク質とを必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ前駆体のリボヌクレアーゼ３支援型プロセッシングのためのガイドとして役割を果たす。続いて、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な線状または環状のｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的ではない標的鎖は、まず、エンドヌクレアーゼ的に切断され、次いで、３’－５’エキソヌクレアーゼ的に刈り込まれる。本来は、ＤＮＡの結合および切断は、典型的には、タンパク質と両ＲＮＡとを必要とする。しかし、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方の態様を単一ＲＮＡ種に取り込むように、単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単純に「ｇＮＲＡ」）を工学的に改変することができる。例えば、その全体の内容を参照によりここに組み込まれるJinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照されたい。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列内の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己とを区別する一助となる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、工学的に改変されたＣａｓタンパク質を利用することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ結合に必要なスキャフォールド配列と、改変されるゲノム標的を画定するユーザにより規定される約２０ヌクレオチドのスペーサーとから構成される、短い合成ＲＮＡである。そのため、当業者は、ｇＲＮＡに存在する標的配列を変えることによって、Ｃａｓタンパク質のゲノムまたはポリヌクレオチドの標的を変えることができる。ゲノムポリヌクレオチド標的配列に対しｇＲＮＡ標的化配列がゲノムの残り部分に比べてどれほど特異的であるかによって、Ｃａｓタンパク質の特異性は部分的に決定される。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールド配列は以下の通りである：GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU。
一実施形態では、ＲＮＡスキャフォールドはステムループを含む。一実施形態では、ＲＮＡスキャフォールドは以下の核酸配列を含む：GUUUUUGUACUCUCAAGAUUUAAGUAACUGUACAACGAAACUUACACAGUUACUUAAAUCUUGCAGAAGCUACAAAGAUAAGGCUUCAUGCCGAAAUCAACACCCUGUCAUUUUAUGGCAGGGUG。
一実施形態では、ＲＮＡスキャフォールドは以下の核酸配列を含む：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU。
一実施形態では、Ｓ．ピロゲネスのｓｇＲＮＡスキャフォールドポリヌクレオチド配列は以下の通りである：
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC。
一実施形態では、Ｓ．アウレウスのｓｇＲＮＡスキャフォールドポリヌクレオチド配列は以下の通りである：
GUUUUAGUACUCUGUAAUGAAAAUUACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGA。
一実施形態では、ＢｈＣａｓ１２ｂのｓｇＲＮＡスキャフォールドは、以下のポリヌクレオチド配列を有する：
GUUCUGTCUUUUGGUCAGGACAACCGUCUAGCUAUAAGUGCUGCAGGGUGUGAGAAACUCCUAUUGCUGGACGAUGUCUCUUACGAGGCAUUAGCAC。
一実施形態では、ＢｖＣａｓ１２ｂのｓｇＲＮＡスキャフォールドは、以下のポリヌクレオチド配列を有する：GACCUAUAGGGUCAAUGAAUCUGUGCGUGUGCCAUAAGUAAUUAAAAAUUACCCACCACAGGAGCACCUGAAAACAGGUGCUUGGCAC。
一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸に連係されている際に標的ポリヌクレオチドに結合することの可能なエンドヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ）である。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸に連係されている際に標的ポリヌクレオチドに結合することの可能なニッカーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、結合ガイド核酸に連係されている際に標的ポリヌクレオチドに結合することの可能な、触媒として活性のないドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインによって結合される標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインによって結合される標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。
本明細書に用いることのできるＣａｓタンパク質には、クラス１およびクラス２のＣａｓタンパク質が含まれる。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、およびＣａｓ１２ｉ、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。未改変のＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有し得るが、例えばＣａｓ９があり、２つの機能性エンドヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の一方または両方の切断を、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補部内などに導くことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、一方または両方の切断を、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれを超える数の塩基対内に導くことができる。
標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を変異型ＣＲＩＳＰＲ酵素が失うように対応の野生型酵素について変異を入れた、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを用いることができる。Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ピロゲネス由来のＣａｓ９）に対し少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％または少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の配列同一性および／または配列相同性を備えるポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ピロゲネス由来）に対し最大５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％または最大約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の配列同一性および／または配列相同性を備えるポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、アミノ酸変化、例えば欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組合せなどを含み得る、Ｃａｓ９タンパク質の野生体または改変体を指し得る。
一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、コリネバクテリウム・ウルセランス（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）；コリネバクテリウム・ジフテリア（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１６７８２。１、ＮＣ＿０１６７８６。１）；スピロプラズマ・シルフィディコーラ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１２８４。１）；プレボテラ・インターメディア（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１７８６１。１）；スピロプラズマ・タイワネンス（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１８４６。１）；ストレプトコッカス・イニエ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１３１４。１）；ベリエラ・バルティカ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１８０１０．１）；サイクロフレクサス・トルキス（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１８７２１。１）；ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿８２０８３２。１）；リステリア・イノキュア（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿４７２０７３。１）；カンピロバクター・ジェジュニ（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００２３４４９００．１）；ナイセリア・メニンギティディス（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００２３４２１００．１）、ストレプトコッカス・ピロゲネス、またはスタフィロコッカス・アウレウスに由来するＣａｓ９の全部または一部を含み得る。
核酸塩基エディターのＣａｓ９ドメイン
Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者に周知されている（例えば、そのそれぞれの全体の内容を参照により本明細書に組み込まれる“Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；および “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.” Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照）。Ｃａｓ９オルソログは、様々な種に記載されており、そのようなものとしては、以下に限定されないが、Ｓ．ピロゲネスおよびＳ．サーモフィルスが挙げられる。追加の適したＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者に明らかになるものとなり、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列としては、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれるChylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示される、生物由来のＣａｓ９配列および遺伝子座が挙げられる。
一部の態様では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）はＣａｓ９ドメインである。非制限的かつ例示的なＣａｓ９ドメインは本明細書に示されている。Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性のＣａｓ９ドメイン、ヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９ドメイン、またはＣａｓ９ニッカーゼとしてよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインはヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Ｃａｓ９ドメインは、二重鎖核酸（例えば、二重鎖ＤＮＡ分子の両鎖）の両鎖を切断するＣａｓ９ドメインとしてよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に規定されるようなアミノ酸配列のうち任意の１つを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に規定されたアミノ酸配列のうちいずれか１つに少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に規定されたアミノ酸配列のうちいずれか１つに比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれを超える個数の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に規定されたアミノ酸配列のうちいずれか１つに比べて少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個同一の隣接したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９の断片を含むタンパク質が提供される。例えば、一部の実施形態では、タンパク質は、以下の２つのＣａｓ９ドメインのうち１つを含む：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン；または（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメイン。一部の実施形態では、Ｃａｓ９またはその断片を含むタンパク質は、「Ｃａｓ９バリアント」と呼ばれる。Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９またはその断片と相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％相同であるか、少なくとも約８０％相同であるか、少なくとも約９０％相同であるか、少なくとも約９５％相同であるか、少なくとも約９６％相同であるか、少なくとも約９７％相同であるか、少なくとも約９８％相同であるか、少なくとも約９９％相同であるか、少なくとも約９９．５％相同であるか、または少なくとも約９９．９％相同である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９に比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれを超える数のアミノ酸変化を有することがある。一部の実施形態では、Ｃａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）が、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％相同であるか、少なくとも約８０％相同であるか、少なくとも約９０％相同であるか、少なくとも約９５％相同であるか、少なくとも約９６％相同であるか、少なくとも約９７％相同であるか、少なくとも約９８％相同であるか、少なくとも約９９％相同であるか、少なくとも約９９．５％相同であるか、または少なくとも約９９．９％相同であるように、この断片を有する。一部の実施形態では、断片は、対応する野生型Ｃａｓ９の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一の、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％のアミノ酸長である。一部の実施形態では、この断片は少なくとも１００アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、この断片は、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または少なくとも１３００個のアミノ酸の長さである。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるようなＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の完全長アミノ酸配列、例えば、本明細書に提供されるＣａｓ９配列の１つを含む。しかし、他の実施形態では、本明細書に提供されるような融合タンパク質は、完全長Ｃａｓ９配列を含まないが、それらの１つまたは複数の断片のみを含む。適したＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９断片の例示的なアミノ酸配列は、本明細書に示されており、Ｃａｓ９ドメインおよび断片の追加の適した配列は、当業者に明らかになるものとなる。
Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡに相補性を有する特異的なＤＮＡ配列にＣａｓ９タンパク質をガイドするガイドＲＮＡに付随することがある。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとはＣａｓ９ドメインであり、例えばヌクレアーゼ活性のＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質の例としては、限定はないが、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２Ｃ１、ならびにＣａｓ１２ｃ／Ｃ２Ｃ３が挙げられる。
一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピロゲネス（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１７０５３．１、下記の通りのヌクレオチドおよびアミノ酸配列）由来のＣａｓ９に対応する。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA

Figure 2022545950000004
（単下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、以下のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列に対応するかまたはそれを含む：
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGACATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA

Figure 2022545950000005
（単下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピロゲネス（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２７３７．２（下記の通りのヌクレオチド配列）；およびＵｎｉｐｒｏｔ参照配列：Ｑ９９ＺＷ２（下記の通りのアミノ酸配列）由来のＣａｓ９に対応する：
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA

Figure 2022545950000006
（単下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、コリネバクテリウム・ウルセランス（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）；コリネバクテリウム・ジフテリア（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）；スピロプラズマ・シルフィディコーラ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１２８４．１）；プレボテラ・インターメディア（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１７８６１．１）；スピロプラズマ・タイワネンス（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１８４６．１）；トレプトコッカス・イニエ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０２１３１４．１）；ベリエラ・バルティカ（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１８０１０．１）；サイクロフレクサス・トルキス（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＣ＿０１８７２１．１）；ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿８２０８３２．１）、リステリア・イノキュア（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿４７２０７３．１）、カンピロバクター・ジェジュニ（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００２３４４９００．１）、またはナイセリア・メニンギティディス（ＮＣＢＩ参照番号：ＹＰ＿００２３４２１００．１）に由来するＣａｓ９を指すか、または任意の他の生物に由来するＣａｓ９を指す。
追加のＣａｓ９タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９）は、それらのバリアントおよびホモログを含めて、本開示の範囲内にあることを認識すべきである。例示的なＣａｓ９タンパク質としては、下記に示されるものが挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質はヌクレアーゼ活性のＣａｓ９である。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインはヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）である。例えば、ｄＣａｓ９ドメインは、二重鎖の核酸分子のどちらも切断することなく、二重鎖の核酸分子に（例えば、ｇＲＮＡ分子を介して）結合し得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性のｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に規定されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ変異およびＨ８４０Ｘ変異、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含み、表記中、Ｘは任意のアミノ酸変化である。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性のｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に規定されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一例として、ヌクレアーゼ－不活性のＣａｓ９ドメインは、規定されるアミノ酸配列をクローニングベクターｐＰｌａｔＴＥＴ－ｇＲＮＡ２（受入番号ＢＡＶ５４１２４）に含む。
例示的な触媒として不活性のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）のアミノ酸配列は以下の通りである：MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
（例えば、その全体の内容が本明細書に参照により組み込まれるQi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.” Cell. 2013; 152(5):1173-83を参照）。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性の（例えば、不活化された）ＤＮＡ切断ドメインを有する、すなわち、Ｃａｓ９はニッカーゼであり、「ｎＣａｓ９」タンパク質（「ニッカーゼ」Ｃａｓ９）とも呼ばれる。ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ９タンパク質は、互換的に「ｄＣａｓ９」タンパク質（ヌクレアーゼ「活性のない」Ｃａｓ９）または触媒として不活性のＣａｓ９とも呼ばれることがある。不活性のＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはその断片）を生成する方法は公知である（例えば、そのそれぞれの全体の内容が参照により本明細書に組み込まれるJinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., “Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression” (2013) Cell. 28;152(5):1173-83を参照）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、すなわちＨＮＨヌクレアーゼサブドメインとＲｕｖＣ１サブドメインとを含むことが知られる。ＨＮＨサブドメインがｇＲＮＡに相補的な鎖を切断するのに対し、ＲｕｖＣ１サブドメインは非相補的な鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を封じることができる。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28;152(5):1173-83 (2013)）。
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に示されるｄＣａｓ９ドメインのうちいずれか１つに少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に規定されたアミノ酸配列のうちいずれか１つに比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれを超えるまたはそれを超える個数の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に規定されたアミノ酸配列のうちいずれか１つに比べて少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個同一の隣接したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、部分的または全体的に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活化する１つまたは複数の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に対応するか、またはそれを含む。例えば、一部の実施形態では、ｄＣａｓ９ドメインは、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異、または別のＣａｓ９中の対応する変異を含む。
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、ｄＣａｓ９（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）のアミノ酸配列を含む：
Figure 2022545950000007
（単下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインはＤ１０Ａ変異を含むとともに、８４０位の残基は、上記に示されるアミノ酸配列において、または本明細書に示されるアミノ酸配列のうちいずれかの対応する位置で、ヒスチジンのままである。
他の実施形態では、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するｄＣａｓ９バリアントが提供され、それらは例えば、ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を結果として生じる。そのような変異には、例えば、Ｄ１０およびＨ８４０での他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメイン内の置換）が含まれる。一部の実施形態では、少なくとも約７０％同一の、少なくとも約８０％同一の、少なくとも約９０％同一の、少なくとも約９５％同一の、少なくとも約９８％同一の、少なくとも約９９％同一の、少なくとも約９９．５％同一の、または少なくとも約９９．９％同一のｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログが提供される。一部の実施形態では、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはそれを超えて短いかまたは長いアミノ酸配列を有する、ｄＣａｓ９のバリアントが提供される。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインはＣａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖の核酸分子（例えば、二重鎖のＤＮＡ分子）のうち一本鎖のみを切断することのできるＣａｓ９タンパク質とし得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖の核酸分子の標的鎖を切断し、このことは、Ｃａｓ９に結合するｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）と塩基対を形成する（と相補的な）鎖を、Ｃａｓ９ニッカーゼが切断することを意味する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ変異を含み、ヒスチジンを８４０位に有する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二重鎖の核酸分子のうち標的ではなく塩基編集されない鎖を切断し、このことは、Ｃａｓ９に結合するｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）と塩基対を形成しない鎖を、Ｃａｓ９ニッカーゼが切断することを意味する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｈ８４０Ａ変異を含み、アスパラギン酸残基を１０位に有するか、または対応する変異を有する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書に提供されるいずれか１つのＣａｓ９ニッカーゼに少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。追加の適したＣａｓ９ニッカーゼは、本開示および当技術分野の知識に基づき当業者に明らかになるものとなり、本開示の範囲内にある。
例示的な触媒としてのＣａｓ９（ｎＣａｓ９）のアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
一部の実施形態では、Ｃａｓ９とは、単細胞の原核微生物のドメインと界を構成する古細菌（例えば、ナノ古細菌）由来のＣａｓ９を指す。一部の実施形態では、プログラマブルヌクレオチド結合タンパク質は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質としてもよく、これは例えば、その全体の内容がここに参照により組み込まれるBurstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes." Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21に記載されている。ゲノム解読メタゲノミクスを用いて複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが特定されたが、そのようなものとしては、古細菌１の生命ドメインで最初に報告されたＣａｓ９が挙げられる。この多様なＣａｓ９タンパク質は、殆ど研究されていないナノ古細菌に活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの一環として見出された。細菌では、以前には未知であった２つのシステムＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸおよびＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＹが発見されたが、これらはこれまで発見された最もコンパクトなシステムである。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムにおいて、Ｃａｓ９は、ＣａｓＸまたはＣａｓＸのバリアントによって置き換えられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターシステムにおいて、Ｃａｓ９はＣａｓＹまたはＣａｓＹのバリアントによって置き換えられる。他のＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合タンパク質が核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）として用いられることがあり、本開示の範囲内にあることを理解するべきである。
一部の実施形態では、本明細書に提供される任意の融合タンパク質の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質としてもよい。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓＸタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓＹタンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然のＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または楽に９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、プログラマブルヌクレオチド結合タンパク質は、天然のＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質である。一部の実施形態では、プログラマブルヌクレオチド結合タンパク質は、本明細書に記載される任意のＣａｓＸまたはＣａｓＹタンパク質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または楽に９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣａｓＸおよびＣａｓＹも本開示に従って用いられることを認識するべきである。
例示的なＣａｓＸ（(uniprot.org/uniprot/F0NN87; uniprot.org/uniprot/F0NH53) tr|F0NN87|F0NN87_SULIH ＣＲＩＳＰＲ関連ＣａｓＸタンパク質 OS = スルフォロブス・ イスランディカス (ＨＶＥ１０／４ 株) GN = SiH_0402 PE=4 SV=1)のアミノ酸配列は以下の通りである：
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYEFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIIAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVRIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRYLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG。
例示的なＣａｓＸ（>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＣａｓＸ OS = スルフォロブス・ イスランディカス（ＲＥＹ１５Ａ株）GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1)のアミノ酸配列は以下の通りである：
MEVPLYNIFGDNYIIQVATEAENSTIYNNKVEIDDEELRNVLNLAYKIAKNNEDAAAERRGKAKKKKGEEGETTTSNIILPLSGNDKNPWTETLKCYNFPTTVALSEVFKNFSQVKECEEVSAPSFVKPEFYKFGRSPGMVERTRRVKLEVEPHYLIMAAAGWVLTRLGKAKVSEGDYVGVNVFTPTRGILYSLIQNVNGIVPGIKPETAFGLWIARKVVSSVTNPNVSVVSIYTISDAVGQNPTTINGGFSIDLTKLLEKRDLLSERLEAIARNALSISSNMRERYIVLANYIYEYLTGSKRLEDLLYFANRDLIMNLNSDDGKVRDLKLISAYVNGELIRGEG。
デルタプロテオバクテリアＣａｓＸ
MEKRINKIRKKLSADNATKPVSRSGPMKTLLVRVMTDDLKKRLEKRRKKPEVMPQVISNNAANNLRMLLDDYTKMKEAILQVYWQEFKDDHVGLMCKFAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPVKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDfAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPVVERRENEVDWWNTINEVKKLIDAKRDMGRVFWSGVTAEKRNTILEGYNYLPNENDHKKREGSLENPKKPAKRQFGDLLLYLEKKYAGDWGKVFDEAWERIDKKIAGLTSHIEREEARNAEDAQSKAVLTDWLRAKASFVLERLKEMDEKEFYACEIQLQKWYGDLRGNPFAVEAENRVVDISGFSIGSDGHSIQYRNLLAWKYLENGKREFYLLMNYGKKGRIRFTDGTDIKKSGKWQGLLYGGGKAKVIDLTFDPDDEQLIILPLAFGTRQGREFIWNDLLSLETGLIKLANGRVIEKTIYNKKIGRDEPALFVALTFERREVVDPSNIKPVNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLPEFKDSSGGPTDILRIGEGYKEKQRAIQAAKEVEQRRAGGYSRKFASKSRNLADDMVRNSARDLFYHAVTHDAVLVFANLSRGFGRQGKRTFMTERQYTKMEDWLTAKLAYEGLTSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITYADMDVMLVRLKKTSDGWATTLNNKELKAEYQITYYNRYKRQTVEKELSAELDRLSEESGNNDISKWTKGRRDEALFLLKKRFSHRPVQEQFVCLDCGHEVHAAEQAALNIARSWLFLNSNSTEFKSYKSGKQPFVGAWQAFYKRRLKEVWKPNA
例示的なＣａｓＹ（(ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1) >APG80656.1 ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ＣａｓＹ［未培養のパークバクテリア群細菌］）のアミノ酸配列は以下の通りである：
MSKRHPRISGVKGYRLHAQRLEYTGKSGAMRTIKYPLYSSPSGGRTVPREIVSAINDDYVGLYGLSNFDDLYNAEKRNEEKVYSVLDFWYDCVQYGAVFSYTAPGLLKNVAEVRGGSYELTKTLKGSHLYDELQIDKVIKFLNKKEISRANGSLDKLKKDIIDCFKAEYRERHKDQCNKLADDIKNAKKDAGASLGERQKKLFRDFFGISEQSENDKPSFTNPLNLTCCLLPFDTVNNNRNRGEVLFNKLKEYAQKLDKNEGSLEMWEYIGIGNSGTAFSNFLGEGFLGRLRENKITELKKAMMDITDAWRGQEQEEELEKRLRILAALTIKLREPKFDNHWGGYRSDINGKLSSWLQNYINQTVKIKEDLKGHKKDLKKAKEMINRFGESDTKEEAVVSSLLESIEKIVPDDSADDEKPDIPAIAIYRRFLSDGRLTLNRFVQREDVQEALIKERLEAEKKKKPKKRKKKSDAEDEKETIDFKELFPHLAKPLKLVPNFYGDSKRELYKKYKNAAIYTDALWKAVEKIYKSAFSSSLKNSFFDTDFDKDFFIKRLQKIFSVYRRFNTDKWKPIVKNSFAPYCDIVSLAENEVLYKPKQSRSRKSAAIDKNRVRLPSTENIAKAGIALARELSVAGFDWKDLLKKEEHEEYIDLIELHKTALALLLAVTETQLDISALDFVENGTVKDFMKTRDGNLVLEGRFLEMFSQSIVFSELRGLAGLMSRKEFITRSAIQTMNGKQAELLYIPHEFQSAKITTPKEMSRAFLDLAPAEFATSLEPESLSEKSLLKLKQMRYYPHYFGYELTRTGQGIDGGVAENALRLEKSPVKKREIKCKQYKTLGRGQNKIVLYVRSSYYQTQFLEWFLHRPKNVQTDVAVSGSFLIDEKKVKTRWNYDALTVALEPVSGSERVFVSQPFTIFPEKSAEEEGQRYLGIDIGEYGIAYTALEITGDSAKILDQNFISDPQLKTLREEVKGLKLDQRRGTFAMPSTKIARIRESLVHSLRNRIHHLALKHKAKIVYELEVSRFEEGKQKIKKVYATLKKADVYSEIDADKNLQTTVWGKLAVASEISASYTSQFCGACKKLWRAEMQVDETITTQELIGTVRVIKGGTLIDAIKDFMRPPIFDENDTPFPKYRDFCDKHHISKKMRGNSCLFICPFCRANADADIQASQTIALLRYVKEEKKVEDYFERFRKLKNIKVLGQMKKI。
一部の実施形態では、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの単一エフェクターである。微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの単一エフェクターとしては、限定はないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３が挙げられる。典型的には、微生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス１とクラス２とのシステムに分けられる。クラス１システムは、マルチサブユニットのエフェクター複合体を有するのに対し、クラス２システムは、単一タンパク質のエフェクターを有する。例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１は、クラス２エフェクターである。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１に加えて、３つの別個のクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３）が、Shmakov et al., “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems”, Mol. Cell, 2015 Nov. 5; 60(3): 385-397によって記載されており、その全体の内容はここに参照により組み込まれる。２つのシステムのエフェクターであるＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１およびＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３は、Ｃｐｆ１に関連するＲｕｖＣ－ｌｉｋｅエンドヌクレアーゼドメインを含有する。第３のシステムは、２つの推定ＨＥＰＮ ＲＮａｓｅドメインを有するエフェクターを含有する。成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの産生は、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１によるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとは異なり、ｔｒａｃｒＲＮＡ依存的である。Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断にはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方に依存する。
アリシクロバチルス・アシドテレストリスＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）の結晶構造が、キメラ一本鎖分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体において報告されている。例えば、その全体の内容がここに参照により組み込まれるLiu et al., “C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”, Mol. Cell, 2017 Jan. 19; 65(2):310-322を参照されたい。この結晶構造は、標的ＤＮＡに三次複合体として結合されたアリシクロバチルス・アシドテレストリスＣ２ｃ１において報告されている。例えば、その全体の内容がここに参照により組み込まれるYang et al., “PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease”, Cell, 2016 Dec. 15; 167(7):1814-1828を参照されたい。標的および非標的の両方のＤＮＡ鎖とのＡａｃＣ２ｃ１の触媒能を有する立体配座が、単一のＲｕｖＣ触媒ポケット内に独立して配置されて捕捉されており、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１媒介性切断の結果として標的ＤＮＡの７ヌクレオチドの互い違いの切断が生じる。Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１三次複合体と過去に特定されたＣａｓ９およびＣｐｆ１のカウンターパートとの構造比較では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにより用いられる機構の多様性が実証されている。
一部の実施形態では、本明細書に提供される任意の融合タンパク質の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質としてもよい。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然のＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または楽に９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然のＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３タンパク質である。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に示されるいずれか１つのｎａｐＤＮＡｂｐ配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または楽に９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１またはＣａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３も本開示に従って用いられることを認識するべきである。
Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１（（ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｔ０Ｄ７Ａ２＃２）ｓｐ｜Ｔ０Ｄ７Ａ２｜Ｃ２Ｃ１＿ＡＬＩＡＧ ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣ２ｃ１ ＯＳ＝アリシクロバチルス・アシドテレストリス（ＡＴＣＣ４９０２５／ＤＳＭ３９２２／ＣＩＰ１０６１３２／ＮＣＩＭＢ１３１３７／ＧＤ３Ｂ株） ＧＮ＝ｃ２ｃ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１）のアミノ酸配列は以下の通りである：
MAVKSIKVKLRLDDMPEIRAGLWKLHKEVNAGVRYYTEWLSLLRQENLYRRSPNGDGEQECDKTAEECKAELLERLRARQVENGHRGPAGSDDELLQLARQLYELLVPQAIGAKGDAQQIARKFLSPLADKDAVGGLGIAKAGNKPRWVRMREAGEPGWEEEKEKAETRKSADRTADVLRALADFGLKPLMRVYTDSEMSSVEWKPLRKGQAVRTWDRDMFQQAIERMMSWESWNQRVGQEYAKLVEQKNRFEQKNFVGQEHLVHLVNQLQQDMKEASPGLESKEQTAHYVTGRALRGSDKVFEKWGKLAPDAPFDLYDAEIKNVQRRNTRRFGSHDLFAKLAEPEYQALWREDASFLTRYAVYNSILRKLNHAKMFATFTLPDATAHPIWTRFDKLGGNLHQYTFLFNEFGERRHAIRFHKLLKVENGVAREVDDVTVPISMSEQLDNLLPRDPNEPIALYFRDYGAEQHFTGEFGGAKIQCRRDQLAHMHRRRGARDVYLNVSVRVQSQSEARGERRPPYAAVFRLVGDNHRAFVHFDKLSDYLAEHPDDGKLGSEGLLSGLRVMSVDLGLRTSASISVFRVARKDELKPNSKGRVPFFFPIKGNDNLVAVHERSQLLKLPGETESKDLRAIREERQRTLRQLRTQLAYLRLLVRCGSEDVGRRERSWAKLIEQPVDAANHMTPDWREAFENELQKLKSLHGICSDKEWMDAVYESVRRVWRHMGKQVRDWRKDVRSGERPKIRGYAKDVVGGNSIEQIEYLERQYKFLKSWSFFGKVSGQVIRAEKGSRFAITLREHIDHAKEDRLKKLADRIIMEALGYVYALDERGKGKWVAKYPPCQLILLEELSEYQFNNDRPPSENNQLMQWSHRGVFQELINQAQVHDLLVGTMYAAFSSRFDARTGAPGIRCRRVPARCTQEHNPEPFPWWLNKFVVEHTLDACPLRADDLIPTGEGEIFVSPFSAEEGDFHQIHADLNAAQNLQQRLWSDFDISQIRLRCDWGEVDGELVLIPRLTGKRTADSYSNKVFYTNTGVTYYERERGKKRRKVFAQEKLSEEEAELLVEADEAREKSVVLMRDPSGIINRGNWTRQKEFWSMV NQRIEGYLVKQIRSRVPLQDSACENTGDI。
ＢｈＣａｓ１２ｂ（バチルス・ヒサシイ）ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０９５１４２５１５
MAPKKKRKVGIHGVPAAATRSFILKIEPNEEVKKGLWKTHEVLNHGIAYYMNILKLIRQEAIYEHHEQDPKNPKKVSKAEIQAELWDFVLKMQKCNSFTHEVDKDEVFNILRELYEELVPSSVEKKGEANQLSNKFLYPLVDPNSQSGKGTASSGRKPRWYNLKIAGDPSWEEEKKKWEEDKKKDPLAKILGKLAEYGLIPLFIPYTDSNEPIVKEIKWMEKSRNQSVRRLDKDMFIQALERFLSWESWNLKVKEEYEKVEKEYKTLEERIKEDIQALKALEQYEKERQEQLLRDTLNTNEYRLSKRGLRGWREIIQKWLKMDENEPSEKYLEVFKDYQRKHPREAGDYSVYEFLSKKENHFIWRNHPEYPYLYATFCEIDKKKKDAKQQATFTLADPINHPLWVRFEERSGSNLNKYRILTEQLHTEKLKKKLTVQLDRLIYPTESGGWEEKGKVDIVLLPSRQFYNQIFLDIEEKGKHAFTYKDESIKFPLKGTLGGARVQFDRDHLRRYPHKVESGNVGRIYFNMTVNIEPTESPVSKSLKIHRDDFPKVVNFKPKELTEWIKDSKGKKLKSGIESLEIGLRVMSIDLGQRQAAAASIFEVVDQKPDIEGKLFFPIKGTELYAVHRASFNIKLPGETLVKSREVLRKAREDNLKLMNQKLNFLRNVLHFQQFEDITEREKRVTKWISRQENSDVPLVYQDELIQIRELMYKPYKDWVAFLKQLHKRLEVEIGKEVKHWRKSLSDGRKGLYGISLKNIDEIDRTRKFLLRWSLRPTEPGEVRRLEPGQRFAIDQLNHLNALKEDRLKKMANTIIMHALGYCYDVRKKKWQAKNPACQIILFEDLSNYNPYEERSRFENSKLMKWSRREIPRQVALQGEIYGLQVGEVGAQFSSRFHAKTGSPGIRCSVVTKEKLQDNRFFKNLQREGRLTLDKIAVLKEGDLYPDKGGEKFISLSKDRKCVTTHADINAAQNLQKRFWTRTHGFYKVYCKAYQVDGQTVYIPESKDQKQKIIEEFGEGYFILKDGVYEWVNAGKLKIKKGSSKQSSSELVDSDILKDSFDLASELKGEKLMLYRDPSGNVFPSDKWMAAGVFFGKLERILISKLTNQYSISTIEDDSSKQSMKRPAATKKAGQAKKKK
一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂはＢｖＣａｓ１２Ｂであり、ＢｖＣａｓ１２ＢはＢｈＣａｓ１２ｂのバリアントであり、ＢｈＣａｓ１２Ｂに関して以下の変化を含む：Ｓ８９３Ｒ、Ｋ８４６Ｒ、およびＥ８３７Ｇ。
ＢｖＣａｓ１２ｂ（バチルス属Ｖ３－１３）ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿１０１６６１４５１．１
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Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能性エンドヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、標的が結合すると立体変化を生じ、この立体変化は、標的ＤＮＡの反対の鎖を切断するようにヌクレアーゼドメインを配置する。Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断の最終的な結果は、標的ＤＮＡ（ＰＡＭ配列の約３～４ヌクレオチド上流）内の二本鎖切断（ＤＳＢ）である。この結果として生じるＤＳＢは、次いで、２つの一般的な修復経路：（１）効率は良いが誤りが生じやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、または（２）効率は低いが忠実度が高い相同性指向型修復（ＨＤＲ）経路のうちの１つにより修復される。
非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）および／または相同性指向型修復（ＨＤＲ）の「効率」は、任意の簡便な方法によって計算することができる。例えば、一部の場合では、効率は、成功したＨＤＲのパーセンテージの観点から表現することができる。例えば、サーベイヤーヌクレアーゼアッセイを用いて切断産物を生成することができ、基質に対する産物の比率を用いてパーセンテージを計算することができる。例えば、サーベイヤーヌクレアーゼ酵素を用いることができるが、この酵素は、ＨＤＲの成功した結果として新たに組み込まれた制限配列を含有するＤＮＡを直接的に切断する。切断された基質の多さは、ＨＤＲのパーセントが大きいこと（ＨＤＲ効率が大きいこと）を標示する。説明となる例として、ＨＤＲの割合（パーセンテージ）は、以下の式：［（切断産物）／（基質＋切断産物）］を用いて計算することができる（例えば、（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）であって、式中、「ａ」はＤＮＡ基質のバンド強度であり、「ｂ」および「ｃ」は切断産物である）。
一部の場合では、効率は、成功したＮＨＥＪのパーセンテージの観点から表現することができる。例えば、Ｔ７ヌクレアーゼアッセイＩを用いて切断産物を生成することができ、基質に対する産物の比率を用いてパーセンテージＮＨＥＪを計算することができる。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、野生型ＤＮＡ鎖と変異体ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションから起こるミスマッチヘテロ二重鎖ＤＮＡを切断する（ＮＨＥＪは、小さなランダムな挿入または欠失（インデル）を元の切断の部位に生成する）。切断の多さは、ＮＨＥＪのパーセントが大きいこと（ＮＨＥＪ効率が大きいこと）を標示する。説明となる例として、ＮＨＥＪの割合（パーセンテージ）は、以下の式：（１－（１－（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））１／２）×１００を用いて計算することができ、式中、「ａ」はＤＮＡ基質のバンド強度であり、「ｂ」および「ｃ」は切断産物である（Ran et. al., Cell. 2013 Sep. 12; 154(6):1380-9; and Ran et al., Nat Protoc. 2013 Nov.; 8(11): 2281-2308）。
ＮＨＥＪ修復経路は、最も活性のある修復機構であり、頻繁に小さなヌクレオチド挿入または欠失（インデル）をＤＳＢ部位に引き起こす。ＮＨＥＪ媒介性ＤＳＢ修復のランダム性は、重大な実用上の意味があるが、なぜなら、Ｃａｓ９とｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドとを発現している細胞集団が、一連の様々な変異を結果として生じかねないためである。殆どの場合に、ＮＨＥＪは、標的ＤＮＡに小さなインデルを生じ、その結果、アミノ酸欠失、挿入、または標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の未熟な終止コドンをもたらすフレームシフト変異を生じる。理想的な最終的な結果は、標的遺伝子内の機能欠損変異である。
ＮＨＥＪ媒介性ＤＳＢ修復が、多くの場合に遺伝子のオープンリーディングフレームを中断させるのに対し、相同性指向型修復（ＨＤＲ）は、単一のヌクレオチドの変化から蛍光体またはタグの追加のような大きな挿入まで、特異的なヌクレオチド変化を生成するために用いることができる。遺伝子編集にＨＤＲを利用するために、所望の配列を含有するＤＮＡ修復の鋳型を、ｇＲＮＡとＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼとにより、目的の細胞型の中に送達することができる。修復の鋳型は、所望の編集の配列ならびに追加の相同な配列を、標的のすぐ上流および下流に含有することができる（左側＆右側相同性アームとも呼ばれる）。各相同性アームの長さは、導入されている変化のサイズに依存し得るが、挿入が大きいほど長い相同性アームを要する。修復の鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡプラスミドとすることができる。ＨＤＲの効率は一般的に低く（改変された対立遺伝子で＜１０％）、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および外因性の修復の鋳型を発現する細胞であっても低い。ＨＤＲは細胞周期Ｓ期およびＧ２期に起こることから、ＨＤＲの効率は、同調させた細胞によって高めることができる。ＮＨＥＪに関与する遺伝子を化学的または遺伝子的に阻害することによっても、ＨＤＲの効率を増加させることができる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は改変型Ｃａｓ９である。所与のｇＲＮＡ標的配列は、部分的な相同性の存在する追加の部位を、ゲノム全体にわたって有し得る。これらの部位は、オフターゲットと呼ばれ、ｇＲＮＡを設計する際に考慮される必要がある。ｇＲＮＡの設計を最適化することに加えて、ＣＲＩＳＰＲの特異性もＣａｓ９への改変を介して増加させることができる。Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメインＲｕｖＣおよびＨＮＨの活性の組合せを介して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。ＳｐＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であるＣａｓ９ニッカーゼは、ヌクレアーゼドメインを１つ保持し、ＤＳＢではなくＤＮＡニックを生成する。このニッカーゼシステムは、特異的な遺伝子編集のためのＨＤＲ媒介性遺伝子編集と組み合わせることもできる。
一部の場合では、Ｃａｓ９はバリアントＣａｓ９タンパク質である。バリアントＣａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列と比べた場合に１アミノ酸異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）アミノ酸配列を有する。一部の例では、バリアントＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドのヌクレアーゼ活性を低減するアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を有する。例えば、一部の場合では、バリアントＣａｓ９ポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、実質的なヌクレアーゼ活性を持たない。対象のＣａｓ９タンパク質が、実質的なヌクレアーゼ活性を持たないバリアントＣａｓ９タンパク質である場合には、「ｄＣａｓ９」と呼ばれることがある。
一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を低減している。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質、例えば野生型Ｃａｓ９タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満を呈する。
一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低減されている。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインの機能を低減する変異（アミノ酸置換）を有する。非制限的な一例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ（アミノ酸１０位のアスパラギン酸からアラニン）を有し、それゆえに二本鎖ガイド標的配列の相補鎖を切断することができるが、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断する能力が低減されている（その結果、バリアントＣａｓ９タンパク質が二本鎖標的核酸を切断する際に、二本鎖切断（ＤＳＢ）の代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じる）（例えば、Jinek et al., Science. 2012 Aug. 17; 337(6096):816-21を参照）。
一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、二本鎖ガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低減されている。例えば、バリアントＣａｓ９タンパク質は、ＨＮＨドメイン（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／ＲｕｖＣドメインモチーフ）の機能を低減する変異（アミノ酸置換）を有し得る。非制限的な一例として、一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位のヒスチジンからアラニン）変異を有し、それゆえにガイド標的配列の非相補鎖を切断することができるが、ガイド標的配列の相補鎖を切断する能力が低減されている（その結果、バリアントＣａｓ９タンパク質が二本鎖ガイド標的配列を切断する際に、ＤＳＢの代わりにＳＳＢを生じる）。そのようなＣａｓ９タンパク質は、ガイド標的配列（例えば、一本鎖ガイド標的配列）を切断する能力が低減されているが、ガイド標的配列（例えば、一本鎖ガイド標的配列）に結合する能力を保持する。
一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低減されている。非制限的な一例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａの両方の変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。
別の非制限的な例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｗ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。
別の非制限的な例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。
別の非制限的な例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。別の非制限的な例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。一部の実施形態では、バリアントＣａｓ９は、Ｃａｓ９ ＨＮＨドメインの８４０位に触媒活性のＨｉｓ残基が戻されている（Ａ８４０Ｈ）。
別の非制限的な例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。別の非制限的な例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質がＷ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ変異を担持する場合、またはバリアントＣａｓ９タンパク質がＰ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ変異を担持する場合は、バリアントＣａｓ９タンパク質は、効率良くＰＡＭ配列に結合しない。そのため、一部のこのような場合では、そのようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法で用いられる際に、その方法は、ＰＡＭ配列を必要としない。言い換えれば、一部の場合では、そのようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法で用いられる際に、その方法はガイドＲＮＡを含み得るが、方法は、ＰＡＭ配列の不在下で実施することができる（そしてそれゆえに、結合の特異性は、ガイドＲＮＡの標的化セグメントによってもたらされる）。他の残基を変異させて、上記の効果を達成する（すなわち、一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活化する）ことができる。非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７を変更（すなわち置換）することができる。アラニン置換以外の変異も適している。
一部の実施形態では、触媒活性が低減されたバリアントＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有する場合）、このバリアントＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用する能力を保持する限り、部位特異的な様式でやはり標的ＤＮＡに結合することができる（なぜなら、やはりそれがガイドＲＮＡによって標的ＤＮＡ配列にガイドされるためである）。
一部の実施形態では、バリアントＣａｓタンパク質は、ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ、ｘＣａｓ９（ｓｐ）、ｓａＣａｓ９、ｓａＣａｓ９－ＫＫＨ、ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲ、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、ｓｐＣａｓ９－ＬＲＫＩＱＫ、またはｓｐＣａｓ９－ＬＲＶＳＱＬとすることができる。
具体的な一実施形態では、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（ＳｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲ）を含みかつ変更されたＰＡＭ５’－ＮＧＣ－３’への特異性を有する、改変型ＳｐＣａｓ９が用いられる。
Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９の代替としては、哺乳類細胞で切断活性を呈示するＣｐｆ１ファミリー由来のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを挙げることができる。プレボテラおよびフランシセラ１由来ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに類似したＤＮＡ編集技術である。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構は、プレボテラ細菌およびフランシセラ細菌に見出された。Ｃｐｆ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に関連付いており、この遺伝子座は、ガイドＲＮＡを用いてウイルスＤＮＡを見つけ出して切断するエンドヌクレアーゼをコードする。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小さくかつ単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの制約の一部を克服する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１媒介性ＤＮＡ切断の結果は、短い３’突出部を有する二本鎖切断である。Ｃｐｆ１の互い違いの切断パターンは、旧来の制限酵素クローニングに類似した指向型の遺伝子移送の可能性を拓き得るものであり、それにより遺伝子編集の効率が増加し得る。上記のＣａｓ９バリアントおよびオルソログのように、Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲにより標的とし得る部位の数を、ＳｐＣａｓ９により選好されるＮＧＧ ＰＡＭ部位に乏しいＡＴリッチな領域またはＡＴリッチなゲノムにまで拡張することもできる。Ｃｐｆ１遺伝子座は、アルファ／ベータドメインの混合と、ＲｕｖＣ－Ｉおよびそれに続くヘリックス領域と、ＲｕｖＣ－ＩＩと、ジンクフィンガー様ドメインとを含有する。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Ｃｐｆ１は、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを持たず、Ｃｐｆ１のＮ末端は、Ｃａｓ９のアルファ－ヘリックス認識ローブを持たない。Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓドメインの構造は、Ｃｐｆ１が機能的にユニークであり、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムに分類されることを示している。Ｃｐｆ１遺伝子座は、ＩＩ型システムよりもＩ型およびＩＩＩ型に類似したＣａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣａｓ４タンパク質をコードする。機能性のＣｐｆ１は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とせず、それゆえにＣＲＩＳＰＲ（ｃｒＲＮＡ）のみが必要とされる。このことはゲノム編集に恩恵をもたらすものであり、それはなぜなら、Ｃｐｆ１がＣａｓ９よりも小さいだけでなく、より小さなｓｇＲＮＡ分子（Ｃａｓ９のほぼ半分のヌクレオチド数）を有するためである。Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９により標的とされるＧリッチなＰＡＭと対照的にプロトスペーサー隣接モチーフ５’－ＹＴＮ－３’を識別することによって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する。ＰＡＭを識別した後、Ｃｐｆ１は、４ヌクレオチドまたは５ヌクレオチドの突出部の付着末端様のＤＮＡ二本鎖切断を導入する。
本開示の一部の態様は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメインとデアミナーゼドメインとを提供する。本開示の一部の態様は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質として役割を果たすドメインを含む融合タンパク質を提供し、このドメインは、塩基エディターなどのタンパク質を特異的な核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列にガイドするのに用いられ得る。具体的な実施形態では、融合タンパク質は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメインとデアミナーゼドメインとを含む。ＤＮＡ結合タンパク質としては、限定はないが、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、およびＣａｓ１２ｉが挙げられる。Ｃａｓ９とは異なるＰＡＭ特異性を有するプログラマブルポリヌクレオチド結合タンパク質の一例は、プレボテラおよびフランシセラ１由来のクラスターを形成する規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（Ｃｐｆ１）である。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１もまたクラス２のＣＲＩＳＰＲエフェクターである。Ｃｐｆ１はＣａｓ９とは異なる特徴により堅牢なＤＮＡ干渉を媒介することが示されている。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠いた単一ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＴＮ、ＴＴＴＮ、またはＹＴＮ）を利用する。さらに、Ｃｐｆ１は、互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。１６個のＣｐｆ１ファミリータンパク質以外に、アシドアミノコッカスおよびラクノスピラ科由来の２つの酵素が、ヒト細胞で効率の良いゲノム編集活性を有することが示されている。Ｃｐｆ１タンパク質は、当技術分野に公知であり、以前に記載されており、例えば、その全体の内容をここに参照により組み込まれるYamano et al., “Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.” Cell (165) 2016, p. 949-962である。
またここでの組成物および方法で有用なのは、ガイドヌクレオチド配列プログラマブルポリヌクレオチド結合タンパク質ドメインとして用いられ得るヌクレアーゼ不活性のＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）バリアントである。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに類似したＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Ｃｐｆ１のＮ末端は、Ｃａｓ９のアルファ－ヘリックス認識ローブを有さない。Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015（本明細書に参照により組み込まれる）では、Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ様ドメインが、両方のＤＮＡ鎖の切断を担うこと、ならびにＲｕｖＣ様ドメインの不活化がＣｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活化することが示された。例えば、フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１中のＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する変異は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ活性を不活化する。一部の実施形態では、本開示のｄＣｐｆ１は、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインを不活化する任意の変異、例えば、置換変異、欠失、または挿入が本開示に従って用いられてもよいことが理解されよう。
一部の実施形態では、本明細書に示される任意の融合タンパク質の核酸プログラマブルヌクレオチド結合タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質とし得る。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質はＣｐｆ１ニッカーゼ（ｎＣｐｆ１）である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性のＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１、ｎＣｐｆ１、またはｄＣｐｆ１は、本明細書に開示されるＣｐｆ１配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｄＣｐｆ１は、本明細書に開示されるＣｐｆ１配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または楽に９９．５％同一のアミノ酸配列を含み、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ内に対応する変異を含む。他の細菌種由来のＣｐｆ１も本開示に従って用いられることを認識するべきである。
野生型フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１のアミノ酸配列は以下である。Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５にはボールド体および下線を付した。
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フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１ Ｄ９１７Ａのアミノ酸配列は以下である。（Ａ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５にはボールド体および下線を付した。）
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フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１ Ｅ１００６Ａのアミノ酸配列は以下である。（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＤ１２５５にはボールド体および下線を付した。）
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フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１ Ｄ１２５５Ａのアミノ酸配列は以下である。（Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＡ１２５５の変異位置にはボールド体および下線を付した。）
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フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１ Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａのアミノ酸配列は以下である。（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＤ１２５５にはボールド体および下線を付した。）
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フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１ Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａのアミノ酸配列は以下である。（Ａ９１７、Ｅ１００６、およびＡ１２５５にはボールド体および下線を付した。）
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フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１ Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａのアミノ酸配列は以下である。（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５にはボールド体および下線を付した。）
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フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１ Ｄ９１７／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａのアミノ酸配列は以下である。（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５にはボールド体および下線を付した。）
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一部の実施形態では、融合タンパク質に存在するＣａｓ９ドメインの１つは、ＰＡＭ配列の必要のないガイドヌクレオチド配列プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメインに置き換えられてもよい。
一部の実施形態では、Ｃａｓドメインは、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＣａｓ９ドメイン（ＳａＣａｓ９）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性のＳａＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性のＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９ｄ）、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｎ５７９Ａ変異、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列の対応する変異を含む。
一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非規準のＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｘ、Ｎ９６７Ｘ、Ｒ１０１４Ｘ変異、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列の対応する変異のうちの１つまたは複数を含み、上式で、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、およびＲ１０１４Ｈ変異、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列中の１つもしくは複数の対応する変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、Ｅ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、もしくはＲ１０１４Ｈ変異、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。
例示的なＳａＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の通りである。
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG.この配列では、下線およびボールド体で示した残基Ｎ５７９が（例えば、Ａ５７９に）変異されて、ＳａＣａｓ９ニッカーゼを産生してもよい。
例示的なＳａＣａｓ９ｎのアミノ酸配列は以下の通りである。
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG.
この配列では、残基Ａ５７９は、Ｎ５７９から変異されてＳａＣａｓ９ニッカーゼを産生することができ、下線およびボールド体で示されている。
例示的なＳａＫＫＨ Ｃａｓ９のアミノ酸配列は以下の通りである。
Figure 2022545950000008
上記の残基Ａ５７９は、Ｎ５７９から変異されてＳａＣａｓ９ニッカーゼを産生することができ、下線およびボールド体で示されている。上記の残基Ｋ７８１、Ｋ９６７、およびＨ１０１４は、Ｅ７８１、Ｎ９６７、およびＲ１０１４から変異されてＳａＫＫＨ Ｃａｓ９を産生することができ、下線およびイタリックで示されている。
忠実度の高いＣａｓ９ドメイン
本開示の一部の実施形態は、忠実度の高いＣａｓ９ドメインを提供する。一部の実施形態では、忠実度の高いＣａｓ９ドメインは、対応する野生型Ｃａｓ９ドメインに比べてＣａｓ９ドメインとＤＮＡの糖リン酸骨格との間の静電相互作用を減少させる１つまたは複数の変異を含む、工学的に改変されたＣａｓ９ドメインである。ＤＮＡの糖リン酸骨格との静電相互作用を減少させる忠実度の高いＣａｓ９ドメインは、オフターゲット効果が少なくなり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、野生型Ｃａｓ９ドメイン）は、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖リン酸骨格との会合を減少させる１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖リン酸骨格との会合を少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％減少させる１つまたは複数の変異を含む。
一部の実施形態では、本明細書に示されるいずれかのＣａｓ９融合タンパク質は、Ｎ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘ、および／もしくはＱ９２６Ｘ変異のうち１つまたは複数、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、本明細書に示されるいずれかのＣａｓ９融合タンパク質は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、および／もしくはＱ９２６Ａ変異のうち１つまたは複数、または対応する変異本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ変異、または本明細書に示されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。忠実度の高いＣａｓ９ドメインは、当技術分野に公知であり、当業者に明らかになるものとなる。例えば、忠実度の高いＣａｓ９ドメインは、それぞれの全体の内容を本明細書に参照により組み込まれるKleinstiver, B.P., et al. “High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.” Nature 529, 490-495 (2016)；およびSlaymaker, I.M., et al. “Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.” Science 351, 84-88 (2015)に記載されている。
一部の実施形態では、改変型Ｃａｓ９は、忠実度の高いＣａｓ９酵素である。一部の実施形態では、忠実度の高いＣａｓ９酵素はＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、または超高精度Ｃａｓ９バリアント（ＨｙｐａＣａｓ９）である。改変型Ｃａｓ９ｅＳｐＣａｓ９（１．１）は、ＨＮＨ／ＲｕｖＣ溝と非標的ＤＮＡ鎖との間の相互作用を弱めるアラニン置換を含有し、オフターゲット部位における鎖の分離および切断を防止する。同様に、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は、Ｃａｓ９とＤＮＡリン酸骨格との相互作用を分断するアラニン置換により、オフターゲット編集を低下させる。ＨｙｐａＣａｓ９は、Ｃａｓ９の校正および標的識別を高める変異（ＳｐＣａｓ９ Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ）をＲＥＣ３ドメインに含有する。忠実度の高い３つ全ての酵素が、野生型Ｃａｓ９よりも少なくオフターゲット編集を生成する。
例示的な忠実度の高いＣａｓ９が以下に示される。
Ｃａｓ９に比べて忠実度の高いＣａｓ９ドメイン変異は、ボールド体および下線で示されている。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTAFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGALSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMALIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRAITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
ガイドポリヌクレオチド
一実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡである。ＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに「ガイドする」のを支援することができる。Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な線状または環状のｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。ｃｒＲＮＡに相補的ではない標的鎖は、まず、エンドヌクレアーゼ的に切断され、次いで、３’－５’エキソヌクレアーゼ的に刈り込まれる。本来は、ＤＮＡの結合および切断は、典型的には、タンパク質と両ＲＮＡとを必要とする。しかし、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両方の態様を単一ＲＮＡ種に取り込むように、単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単純に「ｇＮＲＡ」）を工学的に改変することができる。例えば、その全体の内容をここに参照により組み込まれるJinek M. et al., Science 337:816-821(2012)を参照されたい。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列内の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己と非自己とを区別する一助となる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は、当業者に周知されている（例えば、そのそれぞれの全体の内容を本明細書に参照により組み込まれる“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti, J.J. et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E. et al., Nature 471:602-607(2011)；および“Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.” Jinek M.et al, Science 337:816-821(2012)を参照されたい）。Ｃａｓ９オルソログは、様々な種に記載されており、そのようなものとしては、以下に限定されないが、Ｓ．ピロゲネスおよびＳ．サーモフィルスが挙げられる。追加の適したＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者に明らかになり得るが、そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列としては、その全体の内容を参照により本明細書に組み込まれるChylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示される、生物由来のＣａｓ９配列および遺伝子座が挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性の（例えば、不活化された）ＤＮＡ切断ドメインを有する、すなわち、Ｃａｓ９はニッカーゼである。
一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つの単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または「ｇＮＲＡ」）である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を標的ヌクレオチド配列にガイドするためにＰＡＭ配列を必要としない。
本明細書に開示される塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ由来ドメイン）は、ガイドポリヌクレオチドに会合することによって、標的ポリヌクレオチド配列を認識することができる。ガイドポリヌクレオチド（例えばｇＲＮＡ）は、典型的には一本鎖であり、部位特異的に（すなわち、相補的な塩基対形成を介して）ポリヌクレオチドの標的配列に結合して、それによって、ガイド核酸に連係されている塩基エディターを標的配列に向けるように、プログラムすることができる。ガイドポリヌクレオチドはＤＮＡとすることができる。ガイドポリヌクレオチドはＲＮＡとすることができる。一部の場合では、ガイドポリヌクレオチドは、天然のヌクレオチド（例えばアデノシン）を含む。一部の場合では、ガイドポリヌクレオチドは、天然でない（または非天然の）ヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸またはヌクレオチド類似体）を含む。一部の場合では、ガイド核酸配列の標的化領域は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さとすることができる。ガイド核酸の標的化領域は、１０～３０ヌクレオチドの間の長さ、または１５～２５ヌクレオチドの間の長さ、または１５～２０ヌクレオチドの間の長さとすることができる。
一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、２つ以上の個別のポリヌクレオチドを含み、それらは互いに、例えば、相補的な塩基対形成（例えば、二重ガイドポリヌクレオチド）を介して、相互作用し得る。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み得る。例えば、ガイドポリヌクレオチドは、１つまたは複数のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えばＣａｓ９）による核酸の標的化は、典型的には、標的配列を認識する配列を含む第１のＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲタンパク質複合体を安定化させるスキャフォールド領域を形成する反復配列を含む第２のＲＮＡ分子（ｔｒＲＮＡ）との間に、相補的な塩基対を形成することを必要とする。そのような二連ガイドＲＮＡシステムは、本明細書に開示の塩基エディターを標的ポリヌクレオチド配列に向けるガイドポリヌクレオチドとして採用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、単一ガイドポリヌクレオチド（例えばｇＲＮＡ）を利用する。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、二重ガイドポリヌクレオチド（例えば、二連ｇＲＮＡ）を利用する。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターは、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド（例えば、多連ｇＲＮＡ）を利用する。一部の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドは、本明細書に記載される異なる塩基エディターに利用される。例えば、単一ガイドポリヌクレオチドは、シチジン塩基エディターおよびアデノシン塩基エディターに利用され得る。
他の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、核酸のポリヌクレオチド標的化部分と核酸のスキャフォールド部分との両方を単一分子（すなわち、単一分子ガイド核酸）に含むことができる。例えば、単一分子ガイドポリヌクレオチドは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）とされ得る。本明細書では、ガイドポリヌクレオチド配列という用語は、標的ポリヌクレオチド配列と相互作用し、かつ標的ポリヌクレオチド配列に塩基エディターを方向付けることができる、任意の単一分子の、二連分子の、または多連分子の核酸を想定している。
典型的には、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｃｒＲＮＡ／ｔｒＲＮＡ複合体またはｇＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列を認識し結合することができる配列を含む「ポリヌクレオチド標的化セグメント」と、塩基エディターのポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン構成成分内でガイドポリヌクレオチドを安定化させる「タンパク質結合セグメント」とを含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的化セグメントは、ＤＮＡポリヌクレオチドを認識して結合し、それによってＤＮＡ内の塩基の編集を促進する。他の場合では、ガイドポリヌクレオチドのポリヌクレオチド標的化セグメントは、ＲＮＡポリヌクレオチドを認識して結合し、それによってＲＮＡ内の塩基の編集を促進する。本明細書では、「セグメント」とは、分子の区画または領域、例えば、ガイドポリヌクレオチド内のヌクレオチドの連続的な広がりを指す。また、セグメントは、複合体の領域／区画も指し、それゆえにセグメントは、１つを超える分子の領域を含み得る。例えば、ガイドポリヌクレオチドが複数の核酸分子を含む場合、タンパク質結合セグメントは、相補性領域に沿って例えばハイブリダイズされている複数の別々の分子の全部または一部を含み得る。一部の実施形態では、２つの別々の分子を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、（ｉ）長さ１００塩基対の第１のＲＮＡ分子の塩基対４０～７５個と、（ｉｉ）長さ５０塩基対の第２のＲＮＡ分子の塩基対１０～２５個とを含み得る。「セグメント」の定義は、具体的なコンテクストで別段に特定して定義のない限り、特定の数の総塩基対に限定されず、所与のＲＮＡ分子由来の任意の具体的な数の塩基対に限定されず、複合体内の具体的な数の別々の分子に限定されず、任意の全長を有し他の分子との相補性を有する領域を含み得るＲＮＡ分子の領域を含むことができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、２つ以上のＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み得る。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、時には、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの一部分（例えば、機能性部分）を融合することによって形成される一本鎖ＲＮＡ、または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドはまた、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを含む二連ＲＮＡとすることもできる。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡとハイブリダイズすることもできる。
上記に考察したように、ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、発現産物とすることができる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターとすることができる。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡおよびプロモーターをコードする配列を含む単離されたガイドＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡを用いて、細胞をトランスフェクトすることによって、細胞内に移送することができる。ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、ウイルス媒介性遺伝子送達などの他の方法で細胞内に移送することができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは単離することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形態で、細胞内または生体内にトランスフェクトすることができる。ガイドＲＮＡは、当技術分野に公知の任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写システムを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく単離されたＲＮＡの形態で、細胞にトランスフェクトすることができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、３つの領域：染色体配列内の標的部位に相補的とされ得る５’末端の第１の領域と、ステムループ構造を形成し得る第２の中間領域と、一本鎖とされ得る第３の３’領域とを含み得る。また、各ガイドＲＮＡの第１の領域は、各ガイドＲＮＡが融合タンパク質を特異的な標的部位にガイドするように、異なるものとすることもできる。さらに、各ガイドＲＮＡの第２および第３の領域は、全てのガイドＲＮＡで同一とすることができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの第１の領域は、ガイドＲＮＡの第１の領域が標的部位と塩基対を形成できるように、染色体配列内の標的部位における配列に相補的とすることができる。一部の場合では、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１０ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまでもしくは約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで（すなわち、１０ヌクレオチドからヌクレオチドまで；もしくは約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで；もしくは１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまで；もしくは約１０ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまで）またはそれを超えるものを含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列中の標的部位との間の塩基対形成の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、もしくは約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２２、約２３、約２４、約２５、またはそれを超えるヌクレオチド数の長さとすることができる。時として、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド、または約１９、約２０、もしくは約２１ヌクレオチドの長さとすることができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、二次構造を形成する第２の領域を含み得る。例えば、ガイドＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含み得る。ループおよびステムの長さは変わり得る。例えば、ループは、３から１０までまたは約３から１０までに及ぶヌクレオチド数の長さとすることができ、ステムは、６から２０までまたは約６から約２０までの塩基対数の長さとすることができる。ステムは、１から１０ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチドの１つまたは複数の膨らみを含み得る。第２の領域の全体の長さは、１６から６０ヌクレオチドまでまたは約１６から約６０ヌクレオチドに及ぶ長さとすることができる。例えば、ループは、４ヌクレオチドまたは約４ヌクレオチドの長さとすることができ、ステムは、１２塩基対または約１２塩基対とすることができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドはまた、本質的に一本鎖であり得る第３の領域を３’末端に含むこともできる。例えば、第３の領域は、目的の細胞内で任意の染色体配列に相補的ではない時もあれば、ガイドＲＮＡの残り部分に相補的でない時もある。さらに、第３の領域の長さは変わり得る。第３の領域は、４ヌクレオチドを超えるかまたは約４ヌクレオチドを超える長さとすることができる。例えば、第３の領域の長さは、５から６０または約５から６０のヌクレオチド数に及ぶ長さとすることができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、遺伝子標的の任意のエクソンまたはイントロンを標的とすることができる。一部の場合では、ガイドは、遺伝子のエクソン１または２を標的とすることができ、他の場合では、ガイドは、遺伝子のエクソン３または４を標的とすることができる。組成物は、同じエクソンを全てが標的とする複数のガイドＲＮＡを含み得るが、または一部の場合では、異なるエクソンを標的とし得る複数のガイドＲＮＡを含み得る。遺伝子のエクソンおよびイントロンが標的とされ得る。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、２０ヌクレオチドまたは約２０ヌクレオチドの核酸配列を標的とし得る。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満または約２０ヌクレオチド未満とされ得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、または少なくとも約５、約１０、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、または１～１００の間のいずれかのヌクレオチド数の長さとされ得る。標的核酸は、最大５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、または最大約５、約１０、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約４０、約５０、または１～１００の間のいずれかのヌクレオチド数の長さとし得る。標的核酸配列は、ＡＭの最初のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基または約２０塩基とされ得る。ガイドＲＮＡは、核酸配列を標的とし得る。標的核酸は、少なくとも１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、もしくは１～１００ヌクレオチド、または少なくとも約１～１０、約１～２０、約１～３０、約１～４０、約１～５０、約１～６０、約１～７０、約１～８０、約１～９０、もしくは約１～１００ヌクレオチドとされ得る。
ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡとは、別の核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズすることができる核酸を指し得る。ガイドポリヌクレオチドはＲＮＡとすることができる。ガイドポリヌクレオチドはＤＮＡとすることができる。ガイドポリヌクレオチドは、核酸の配列に部位特異的に結合するようプログラムまたは設計され得る。ガイドポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖を含むことがあり、単一ガイドポリヌクレオチドと呼ばれることがある。ガイドポリヌクレオチドは、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことがあり、二連ガイドポリヌクレオチドと呼ばれることがある。ガイドＲＮＡは、細胞内または胚内にＲＮＡ分子として導入することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することができるおよび／または化学合成することができる。ＲＮＡは、合成ＤＮＡ分子、例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片から転写することができる。次いで、ガイドＲＮＡは、細胞内または胚内にＲＮＡ分子として導入することができる。ガイドＲＮＡはまた、細胞内または胚内に非ＲＮＡ核酸分子、例えばＤＮＡ分子の形態で導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞または胚におけるガイドＲＮＡの発現のために、プロモーター制御配列に動作可能に連結することができる。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に、動作可能に連結することができる。ガイドＲＮＡを発現するために用いることのできるプラスミドベクターとしては、以下に限定されないが、ｐｘ３３０ベクターおよびｐｘ３３３ベクターが挙げられる。一部の場合では、プラスミドベクター（例えば、ｐｘ３３３ベクター）は、少なくとも２つのガイドＲＮＡコードＤＮＡ配列を含み得る。
ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡと標的配列とを選択、設計、および検証する方法は、本明細書に記載されており、当業者に公知である。例えば、核酸塩基エディターシステム内のデアミナーゼドメイン（例えば、ＡＩＤドメイン）の潜在的な基質の混乱の影響を最小限にするために、意図なく脱アミノ化の標的となり得る残基（例えば、標的核酸遺伝子座内のｓｓＤＮＡ上に潜在的に存在し得るオフターゲットＣ残基）の数は、最小限とされることがある。さらに、ソフトウェアツールを用いて、例えば、ゲノム全体の総オフターゲット活性を最小限にするように、標的核酸配列に対応するｇＲＮＡを最適化することができる。例えば、Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９を用いたあり得る標的化ドメインの選択のそれぞれについて、ある特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）までのミスマッチ塩基対を含有する全てのオフターゲット配列（選択されたＰＡＭ、例えば、ＮＡＧまたはＮＧＧに先行する）が、ゲノム中にわたって特定されてもよい。標的部位に相補的なｇＲＮＡの第１の領域が特定され得るが、全ての第１の領域（例えば、ｃｒＲＮＡ）は、その総予測オフターゲットスコアに従ってランク付けされ得る。すなわち、最上位にランク付けされた標的化ドメインは、最大のオンターゲット活性と最小のオフターゲット活性とを有する可能性のあるものを表す。標的化ｇＲＮＡの候補は、当技術分野に公知のおよび／または本明細書に規定の方法を用いることによって、機能面で評価することができる。
非限定的な例として、Ｃａｓ９と共に用いるためのガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ中の標的ＤＮＡハイブリダイズ配列は、ＤＮＡ配列探索アルゴリズムを用いて特定してもよい。ｇＲＮＡの設計は、Bae S., Park J., & Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014)に記載されるような公開ツールｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づき、カスタムｇＲＮＡ設計ソフトウェアを用いて行ってもよい。このソフトウェアは、ガイドに対し、そのゲノムワイドなオフターゲット傾向を計算した後、スコアリングする。典型的には、長さ１７から２４に及ぶガイドについて、完全マッチから７ミスマッチに及ぶマッチが考慮される。オフターゲット部位が演算により決定されると、各ガイドについて合計スコアが計算され、ウェブインターフェースを用いて表形式の出力にまとめられる。ＰＡＭ配列に隣接する潜在的な標的部位の特定に加えて、ソフトウェアは、選択された標的部位と１、２、３、または３以上のヌクレオチド数が異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も特定する。標的核酸配列、例えば標的遺伝子に用いるゲノムＤＮＡ配列が得られ、公的に利用可能なツール、例えば、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを用いて反復エレメントがスクリーニングされ得る。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復エレメントと複雑度の低い領域とに用いるインプットＤＮＡ配列を探索する。出力は、所与のクエリ配列に存在する反復の詳細なアノテーションである。
特定後、ガイドＲＮＡの第１の領域、例えばｃｒＲＮＡは、標的部位とのそれらの距離、それらの直交性、および関連のＰＡＭ配列と密接にマッチするための５’ヌクレオチドの存在（例えば、関連のＰＡＭ、例えばＳ．ピロゲネスのＮＧＧ ＰＡＭ、Ｓ．アウレウスのＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ ＰＡＭを含有する、ヒトゲノムにおける密接なマッチの特定に基づく５’Ｇ）に基づいて、階級をランク付けする。本明細書に用いられる際に、直交性とは、標的配列との最小限の数のミスマッチを含有する、ヒトゲノムにおける配列の数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」とは、例えば、ヒトゲノム内に目的の標的の他に同一配列を持たず、標的配列内に１つまたは２つのミスマッチを含有する配列も持たない、２０ｍｅｒの標的化ドメインを指し得る。良好な直交性を有する標的化ドメインは、オフターゲットＤＮＡ切断を最小限にするように選択され得る。
一部の実施形態では、レポーターシステムが、塩基編集活性を検出するために、およびガイドポリヌクレオチドの候補を試験するために、用いられることがある。一部の実施形態では、レポーターシステムは、レポーター遺伝子ベースアッセイを含み得るが、このアッセイでは、塩基編集活性がレポーター遺伝子の発現を生じる。例えば、レポーターシステムは、不活化された開始コドン、例えば、鋳型鎖上の３’－ＴＡＣ－５’から３’－ＣＡＣ－５’への変異を含む、レポーター遺伝子を含む。標的Ｃの脱アミノ化が成功すると、対応するｍＲＮＡは、５’－ＧＵＧ－３’の代わりに５’－ＡＵＧ－３’として転写され、レポーター遺伝子の翻訳が可能となる。適したレポーター遺伝子は、当業者に明らかになるものとなる。レポーター遺伝子の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする遺伝子、または発現が検出可能であり当業者に明らかな他の遺伝子が挙げられる。レポーターシステムを用いて、例えば、標的ＤＮＡ配列に関するどの残基をそれぞれのデアミナーゼが標的とするのかを判定するために、数多くの異なるｇＲＮＡを供試することができる、非鋳型鎖を標的とするｓｇＲＮＡもまた、特異的な塩基編集タンパク質、例えば、Ｃａｓ９デアミナーゼ融合タンパク質のオフターゲット効果を評価するために、供試することができる。一部の実施形態では、変異型開始コドンがｇＲＮＡと塩基対を形成しないように、そのようなｇＲＮＡを設計することができる。ガイドポリヌクレオチドは、標準的なリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド（例えば、シュードウリジン）、リボヌクレオチド異性体、および／またはリボヌクレオチド類似体を含み得る。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つの検出可能な標識を含み得る。検出可能な標識は、蛍光体（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｈａｌｏタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子とすることができる。
ガイドポリヌクレオチドは、化学的に合成することも、酵素により合成することも、またはそれらの組合せとすることもできる。例えば、ガイドＲＮＡは、標準的なホスホロアミダイトベースの固相合成法を用いて合成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、ファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター制御配列に動作可能に連結することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。適したファージプロモーター配列の例としては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらのバリエーションが挙げられる。ガイドＲＮＡが２つの別々の分子（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む実施形態では、ｃｒＲＮＡは化学的に合成することができ、ｔｒａｃｒＲＮＡは酵素により合成することができる。
一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、複数のガイドポリヌクレオチド、例えばｇＲＮＡを含んでいてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、塩基エディターシステムに含まれる１つまたは複数の標的遺伝子座を標的としてもよい（例えば、少なくとも１つのｇＲＮＡ、少なくとも２つのｇＲＮＡ、少なくとも５つのｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｇＲＮＡ）。複数のｇＲＮＡ配列は、直列に配置することができ、好ましくは直接的な反復によって分離される。
ガイドＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列は、ベクターの一部分とすることもできる。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば、ＧＦＰまたは抗生物質耐性遺伝子、例えばピューロマイシンなど）、複製起点などを含み得る。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ分子は、線状とすることもできる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ分子は、環状とすることもできる。
一部の実施形態では、塩基エディターシステムの１つまたは複数の構成成分は、ＤＮＡ配列によってコードされていてもよい。そのようなＤＮＡ配列は、発現システム内、例えば細胞内に、共にまたは別々に導入されてもよい。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとガイドＲＮＡとをコードするＤＮＡ配列は、細胞内に導入されてもよく、各ＤＮＡ配列は、別々の分子の一部分（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインコード配列を含有する１つのベクターと、ガイドＲＮＡコード配列を含有する第２のベクター）とすることもできるし、またはどちらも、同じ分子（例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインおよびガイドＲＮＡの両方のためのコード（および調節）配列を含有する１つのベクター）の一部分とすることもできる。
ガイドポリヌクレオチドは、核酸に新しいまたは増強された特徴を付与するために１つまたは複数の修飾を含み得る。ガイドポリヌクレオチドは、核酸親和性タグを含み得る。ガイドポリヌクレオチドは、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含み得る。
一部の場合では、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、改変を含み得る。改変は、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの任意の場所で作製することができる。１つ以上の改変を、単一ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドに作製することができる。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドは、改変後に品質管理を受けることができる。一部の場合では、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、またはそれらの組合せを含み得る。
ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの改変は、置換、挿入、欠失、化学修飾、物理的修飾、安定化、精製、またはそれらの任意の組合せとされ得る。
ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドはまた、５’アデニレート、５’グアノシン－三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’修飾、５’－５’修飾、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオ―ルリンカー、２’－デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’－デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ｗｏｂｂｌｅ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’－フルオロＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－三リン酸、５’－メチルシチジン－５’－三リン酸、またはそれらの任意の組合せによって修飾することができる。
一部の場合では、修飾は永続的である。他の場合では、修飾は一時的である。一部の場合では、複数の修飾がｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドに行われる。ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチドの物理化学的性質、例えばその立体配座、極性、疎水性、化学的反応性、塩基対形成相互作用、またはそれらの任意の組合せなどを変更し得る。
ＰＡＭ配列は、当技術分野に公知の任意のＰＡＭ配列とすることができる。適したＰＡＭ配列としては、以下に限定されないが、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＮＧＣ、ＮＧＮ、ＮＧＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＣＧ、ＮＧＴＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＴＴＴＶ、ＴＹＣＶ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡＷ、またはＮＡＡＡＡＣが挙げられる。Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意のヌクレオチド塩基であり、ＷはＡまたはＴである。
また、修飾は、ホスホロチオエート置換とすることができる。一部の場合では、天然のホスホジエステル結合を、細胞性ヌクレアーゼによる速やかな分解に対して感受性があるものとすることができ、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換を用いたヌクレオチド間結合修飾を、細胞性分解による加水分解に対してより安定なものとすることができる。修飾は、ｇＲＮＡまたはガイドポリヌクレオチドにおける安定性を増加させることができる。また、修飾は、生物活性を増強することができる。一部の場合では、ホスホロチオエート増強型ＲＮＡ ｇＲＮＡは、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＴ１、ウシ血清ヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組合せを阻害することができる。これらの性質は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでヌクレアーゼに曝露される可能性が高い場合の適用に用いられるＰＳ－ＲＮＡ ｇＲＮＡの使用を可能にする。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、ｇＲＮＡの５’－または’’－末端の最後の３～５ヌクレオチド間に導入することができ、エキソヌクレアーゼ分解を阻害することができる。一部の場合では、ホスホロチオエート結合は、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減するためにｇＲＮＡ全体にわたって追加することができる。
プロトスペーサー隣接モチーフ
用語「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）」またはＰＡＭ様モチーフとは、ＣＲＩＳＰＲ細菌適応免疫システムにおいてＣａｓ９ヌクレアーゼにより標的とされるＤＮＡ配列にすぐ続く２～６塩基対のＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＰＡＭを５’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）とすることができる。他の実施形態では、ＰＡＭを３’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）とすることができる。
ＰＡＭ配列は標的結合に不可欠であるが、正確な配列はＣａｓタンパク質のタイプに依存する。
本明細書に提供される塩基エディターは、規準または非規準のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有するヌクレオチド配列を結合することができるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインを含み得る。ＰＡＭ部位は、標的ポリヌクレオチド配列に近接したヌクレオチド配列である。本開示の一部の態様は、異なるＰＡＭ特異性を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質の全部または一部を含む塩基エディターを提供する。例えば、典型的には、Ｓ．ピロゲネス由来のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）などのＣａｓ９タンパク質は、特定の核酸領域に結合する規準のＮＧＧ ＰＡＭ配列を必要とするが、この配列では、「ＮＧＧ」の「Ｎ」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇはグアニンである。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質特異的となり得、異なるＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインを含む異なる塩基エディター間で異なるものとなり得る。ＰＡＭは、標的配列の５’または３’とされ得る。ＰＡＭは、標的配列の上流または下流とされ得る。ＰＡＭは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるヌクレオチド数の長さとされ得る。多くの場合、ＰＡＭは、２～６の間のヌクレオチド数の長さである。複数のＰＡＭバリアントが下記の表１に記載されている。
Figure 2022545950000009
一部の実施形態では、ＰＡＭはＮＧＣである。一部の実施形態では、ＮＧＣ ＰＡＭは、Ｃａｓ９バリアントによって認識される。一部の実施形態では、ＮＧＣ ＰＡＭバリアントは、Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（まとめて「ＭＱＫＦＲＡＥＲ」と呼ばれる）から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、ＰＡＭはＮＧＴである。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭはバリアントである。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭバリアントは、１つまたは複数の残基１３３５、１３３７、１１３５、１１３６、１２１８、および／または１２１９での標的変異を介して作製される。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭバリアントは、１つまたは複数の残基１２１９、１３３５、１３３７、１２１８での標的変異を介して作製される。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭバリアントは、１つまたは複数の残基１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、および１３３５で標的とされた変異を介して作製される。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭバリアントは、下記の表２および表３に示された一連の標的変異から選択される。
Figure 2022545950000010
Figure 2022545950000011
一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭバリアントは、表２および表３のバリアント５、７、２８、３１、または３６から選択される。一部の実施形態では、バリアントは、ＮＧＴ ＰＡＭ認識が高められている。
一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭバリアントは、残基１２１９、１３３５、１３３７、および／または１２１８に変異を有する。一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭバリアントは、下記の表４に示されるバリアントから、認識を高めるための変異を有して選択される。
Figure 2022545950000012
一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭは、下記の表５に示されるバリアントから選択される。
Figure 2022545950000013
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、ストレプトコッカス・ピロゲネス由来のＣａｓ９ドメイン（ＳｐＣａｓ９）である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性のＳｐＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性のＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ｄ）、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、Ｄ９Ｘ変異、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含み、式中、ＸはＤを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、Ｄ９Ａ変異、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、非規準のＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＧＧ、ＮＧＡ、またはＮＧＣＧ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。
一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異のうち１つまたは複数、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異のうち１つまたは複数、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異のうち１つまたは複数、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異のうち１つまたは複数、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｘ、Ｇ１２１７Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異のうち１つまたは複数、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１７Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異のうち１つまたは複数、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１７Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、または本明細書に提供されるいずれかのアミノ酸配列中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、図３Ａ～図３Ｃおよび図１０のアミノ酸置換のうち１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供されるいずれかの融合タンパク質のＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載のＣａｓ９ポリペプチドと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるいずれかの融合タンパク質のＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるいずれかのＣａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるいずれかの融合タンパク質のＣａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるいずれかのＣａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列からなる。
一部の例では、本明細書に開示される塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインによって認識されかつ細胞に対するＰＡＭは、塩基エディターをコードするインサート（例えば、ＡＡＶインサート）への別々のオリゴヌクレオチド上に付与され得る。そのような実施形態では、ＰＡＭを別々のオリゴヌクレオチド上に付与することによって、そうしなければ切断できない標的配列の切断を可能にし得るが、なぜなら、隣接ＰＡＭが、同じポリヌクレオチド上に標的配列として存在しないためである。
一実施形態では、Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を、ゲノム工学のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして用いることができる。しかし、他のものを用いることができる。一部の実施形態では、異なるエンドヌクレアーゼを用いて、ある特定のゲノム標的を標的とすることができる。一部の実施形態では、非ＮＧＧ ＰＡＭ配列を有する合成ＳｐＣａｓ９由来バリアントを用いることができる。さらに、様々な種由来の他のＣａｓ９オルソログが同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、本開示にやはり有用となり得る種々のＰＡＭ配列を結合することができる。例えば、比較的大きなサイズのＳｐＣａｓ９（およそ４ｋｂのコード配列）は、細胞で効率的に発現できないＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡを含むプラスミドをもたらすことがある。逆に、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列は、ＳｐＣａｓ９よりもおよそ１キロベース短く、細胞で効率的に発現することを可能にする可能性がある。ＳｐＣａｓ９と同様に、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは哺乳類細胞で、ｉｎ ｖｉｖｏではマウスで、標的遺伝子を改変することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、異なるＰＡＭ配列を標的とすることができる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、Ｃａｓ９ ＰＡＭである５’－ＮＧＧに隣接し得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、Ｃａｓ９ ＰＡＭである５’－ＮＧＣまたは５’－ＮＧＣを含むＣａｓ９ ＰＡＭに隣接し得る。他の実施形態では、他のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭの要求性を有する。例えば、Ｓ．サーモフィルス（ＣＲＩＳＰＲ１のための５’－ＮＮＡＧＡＡおよびＣＲＩＳＰＲ３のための５’－ＮＧＧＮＧ）およびナイセリア・メニンギティディス（５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ）のものなどの他のＰＡＭも、標的遺伝子に隣接して見出され得る。
一部の実施形態では、Ｓ．ピロゲネスシステムについて、標的遺伝子配列は、５’－ＮＧＧＰＡＭに先行する（すなわち、その５’側にある）ことがあり、２０ｎｔのガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭに隣接したＣａｓ９切断を媒介するための反対の鎖を有する塩基対であることがある。一部の実施形態では、隣接の切断は、ＰＡＭの上流の３塩基対または約３塩基対であり得る。一部の実施形態では、隣接の切断は、ＰＡＭの上流の１０塩基対または約１０塩基対であり得る。一部の実施形態では、隣接の切断は、ＰＡＭの上流の０～２０塩基対または約０～２０塩基対であり得る。例えば、隣接の切断は、ＰＡＭの上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対隣りであり得る。また、隣接の切断は、ＰＡＭの下流１から３０塩基対であり得る。ＰＡＭ配列を結合することができる例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質の配列は以下の通りである。
例示的なＰＡＭ結合ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD。
例示的なＰＡＭ結合ＳｐＣａｓ９ｎアミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD。
例示的なＰＡＭ結合ＳｐＥＱＲ Ｃａｓ９アミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFESPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.この配列では、残基Ｅ１１３５、Ｑ１３３５、およびＲ１３３７は、Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、およびＴ１３３７から変異されてＳｐＥＱＲ Ｃａｓ９を産生することができ、下線およびボールド体で示されている。
例示的なＰＡＭ結合ＳｐＶＱＲ Ｃａｓ９アミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKQYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.この配列では、残基Ｖ１１３５、Ｑ１３３５、およびＲ１３３６は、Ｄ１１３５、Ｒ１３３５、およびＴ１３３６から変異されてＳｐＶＱＲＣａｓ９を産生することができ、下線およびボールド体で示されている。
例示的なＰＡＭ結合ＳｐＶＲＥＲ Ｃａｓ９アミノ酸配列は以下の通りである：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFVSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASARELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKEYRSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD.
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは組換えＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、組換えＣａｓ９ドメインは、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性のＳｐｙＭａｃＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性のＳｐｙＭａｃＣａｓ９（ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ｄ）、またはＳｐｙＭａｃＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非規準のＰＡＭを有する核酸配列に結合することができる。一部の実施形態では、ＳｐｙＭａｃＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＡＡ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合することができる。
例示的なＳｐｙＭａｃＣａｓ９
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFGSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLADSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQIYNQLFEENPINASRVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKRNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNSEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGAYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRGMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGHSLHEQIANLAGSPAIKKGILQTVKIVDELVKVMGHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFIKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEIQTVGQNGGLFDDNPKSPLEVTPSKLVPLKKELNPKKYGGYQKPTTAYPVLLITDTKQLIPISVMNKKQFEQNPVKFLRDRGYQQVGKNDFIKLPKYTLVDIGDGIKRLWASSKEIHKGNQLVVSKKSQILLYHAHHLDSDLSNDYLQNHNQQFDVLFNEIISFSKKCKLGKEHIQKIENVYSNKKNSASIEELAESFIKLLGFTQLGATSPFNFLGVKLNQKQYKGKKDYILPCTEGTLIRQSITGLYETRVDLSKIGED.
一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。別の非制限的な例として、一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ変異を担持し、それゆえにポリペプチドは、標的ＤＮＡを切断する能力が低減されている。そのようなＣａｓ９タンパク質は、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）を切断する能力が低減されているが、標的ＤＮＡ（例えば、一本鎖標的ＤＮＡ）に結合する能力を保持する。一部の場合では、バリアントＣａｓ９タンパク質がＷ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ変異を担持する場合、またはバリアントＣａｓ９タンパク質がＰ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１２１８Ａ変異を担持する場合は、バリアントＣａｓ９タンパク質は、効率良くＰＡＭ配列に結合しない。そのため、一部のこのような場合では、そのようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法で用いられる際に、その方法は、ＰＡＭ配列を必要としない。言い換えれば、一部の場合では、そのようなバリアントＣａｓ９タンパク質が結合方法で用いられる際に、その方法はガイドＲＮＡを含み得るが、方法は、ＰＡＭ配列の不在下で実施され得る（そしてそれゆえに、結合の特異性は、ガイドＲＮＡの標的化セグメントによってもたらされる）。上記の効果を達成する（すなわち、一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活化する）ために、他の残基が変異され得る。非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７を変更（すなわち置換）することができる。アラニン置換以外の変異も適している。
一部の実施形態では、塩基エディターのＣＲＩＳＰＲタンパク質由来ドメインは、規準のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を有するＣａｓ９タンパク質の全部または一部を含み得る。他の実施形態では、塩基エディターのＣａｓ９由来ドメインは、非規準のＰＡＭ配列を採用し得る。そのような配列は、当技術分野に記載されており、当業者に明らかになるものとなる。例えば、非規準のＰＡＭ配列を結合するＣａｓ９ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記載されており、それぞれの全体の内容はここに参照により組み込まれる。
Ｃａｓ９ドメインとシチジンデアミナーゼおよび／またはアデノシンデアミナーゼとを含む融合タンパク質
本開示の一部の態様は、Ｃａｓ９ドメインまたは他の核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質と１つまたは複数のアデノシンデアミナーゼドメイン、シチジンデアミナーゼドメイン、および／またはＤＮＡグリコシラーゼドメインとを含む融合タンパク質を提供する。Ｃａｓ９ドメインは本明細書に提供されるいずれかのＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）であることを認識するべきである。一実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に記載されるようなＳｐＣａｓ９ドメインまたはＳｐＣａｓ９バリアントドメインである。一部の実施形態では、本明細書に提供されるいずれかのＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）は、本明細書に提供されるいずれかのシチジンデアミナーゼおよびアデノシンデアミナーゼに融合されていてもよい。本明細書に開示される塩基エディターのドメインは、任意の順番で配置することができる。
例えば、限定はないが、一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造を含む：
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ。
一部の実施形態では、融合タンパク質のアデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊８およびシチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である。
例示的な融合タンパク質構造は以下を含む：
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ９］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９］－［ＴａｄＡ＊８］－ＣＯＯＨ。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ、脱塩基性エディター、とアデノシンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）とを含む融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。一部の実施形態では、リンカーは、シチジンデアミナーゼドメインとアデノシンデアミナーゼドメインとｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。一部の実施形態では、上記の一般構造に用いられる「－」は、任意選択的なリンカーの存在を標示する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に提供されるいずれかのリンカーを介して融合される。例えば、一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐとは、下記に「リンカー」という題の項にて示されるいずれかのリンカーを介して融合される。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ１２ドメインを有する例示的なＣａｓ９またはＣａｓ１２の融合タンパク質の一般構造は、以下の構造のいずれかを含み、式中、ＮＬＳは核局在化配列（例えば、本明細書に提供されるいずれかのＮＬＳ）であり、ＮＨ２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である。
ＮＨ２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬ２－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ。
一部の実施形態では、ＮＬＳはリンカーに存在するか、または、ＮＬＳは、例えば本明細書に記載のリンカーの側面に位置する。一部の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端ＮＬＳは、二部分構成のＮＬＳである。二部分構成のＮＬＳは、２つの塩基性アミノ酸クラスターを含み、それらは比較的短いスペーサー配列によって分離されている（そのため、一部分構成のＮＬＳではなく、二部分構成－２部分である）。ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫは、遍在性の二部分構成のシグナルのプロトタイプ、すなわち約１０アミノ酸のスペーサーによって分離された塩基性アミノ酸の２つのクラスターである。例示的な二部分構成のＮＬＳの配列は以下である：ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＮＬＳを含む融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。一部の実施形態では、１つまたは複数のドメインまたはタンパク質（例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、またはＮＬＳ）の間のリンカー配列が存在する。
本開示の融合タンパク質が１つまたは複数の追加の特徴を含み得ることを認識するべきである。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、阻害物質、細胞質局在化配列、核輸送配列などの輸送配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含んでいてもよい。本明細書に提供される適したタンパク質タグとしては、以下に限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆタグ（例えば、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグが挙げられる。追加の適した配列は当業者に明らかになるものとなる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数のＨｉｓタグを含む。
例示的でさらに非制限的な融合タンパク質は、それぞれが本明細書に参照によりその全体を本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４４９３５およびＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１６２８８に記載されている。
核局在化配列（ＮＬＳ）を含む融合タンパク質
一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、１つまたは複数（例えば、２個、３個、４個、５個）の核標的化配列、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。一実施形態では、二部分構成のＮＬＳが用いられる。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳを含むタンパク質が（例えば、核輸送によって）細胞核内へ移入するのを促進するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるいずれかの融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、融合タンパク質のＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ｎＣａｓ９ドメインまたはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、デアミナーゼのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、デアミナーゼのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、１つまたは複数のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、リンカーなく融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、本明細書に記載または参照されるいずれか１つのＮＬＳ配列のアミノ酸配列を含む。追加の核局在化配列は、当技術分野に公知であり、当業者に明らかとなる。例えば、ＮＬＳ配列は、その内容が例示的な核局在化配列の開示について本明細書に参照により組み込まれるPlankらのＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０に記載されている。一部の実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＶＶＫＲＰＲＫＰＫＫＫＲＫＶ、またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳはリンカーに存在するか、またはＮＬＳはリンカー、例えば、本明細書に記載のリンカーの側面に位置する。一部の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端ＮＬＳは、二部分構成のＮＬＳである。二部分構成のＮＬＳは、２つの塩基性アミノ酸クラスターを含み、それらは比較的短いスペーサー配列によって分離されている（そのため、一部分構成のＮＬＳではなく、二部分構成－２部分である）。ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫは、遍在性の二部分構成のシグナルのプロトタイプ、すなわち約１０アミノ酸のスペーサーによって分離された塩基性アミノ酸の２つのクラスターである。例示的な二部分構成のＮＬＳの配列は以下である：ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳ ＰＫＫＫＲＫＶ。
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質はリンカー配列を含まない。一部の実施形態では、１つまたは複数のドメインまたはタンパク質の間のリンカー配列が存在する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼおよびＣａｓ９ドメインを有する例示的なＣａｓ９融合タンパク質の一般構造は、以下の構造のいずれか１つを含み、式中、ＮＬＳは核局在化配列（例えば、本明細書に提供されるいずれかのＮＬＳ）であり、ＮＨ２は、融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは、融合タンパク質のＣ末端である。
ＮＨ２－ＮＬＳ－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－ＮＬＳ［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９ドメイン］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［Ｃａｓ９ドメイン］－［シチジンデアミナーゼ］－ＮＬＳ－ＣＯＯＨ。.
本開示の融合タンパク質が１つまたは複数の追加の特徴を含み得ることを認識するべきである。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、阻害物質、細胞質局在化配列、核輸送配列などの輸送配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含んでいてもよい。本明細書に提供される適したタンパク質タグとしては、以下に限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆタグ（例えば、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグが挙げられる。追加の適した配列は当業者に明らかになるものとなる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数のＨｉｓタグを含む。
１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを用いることができる。例えば、用いられる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のＮＬＳがあり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アンモ末端にもしくはその近くにＮＬＳを、カルボキシ末端にもしくはその近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超えるＮＬＳを、またはこれらの任意の組合せ（例えば、アンモ末端に１つまたは複数のＮＬＳ、およびカルボキシ末端に１つまたは複数ＮＬＳ）を含む。１つを超えるＮＬＳが存在する場合、それぞれを他とは独立して選択することができ、それゆえに、１コピーを超えておよび／または１つまたは複数のコピーに存在する１つまたは複数の他のＮＬＳとの組合せで、単一のＮＬＳが存在し得る。
本方法に用いられるＣＲＩＳＰＲ酵素は、約６個のＮＬＳを含み得る。ＮＬＳに最も近いアミノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約５０アミノ酸以内である場合、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０アミノ酸以内である場合、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端の近くにあると考えられる。
内部挿入を含む融合タンパク質
本明細書に提供されるのは、核酸プログラマブル核酸結合タンパク質、例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐに融合されている異種ポリペプチドを含む融合タンパク質である。異種ポリペプチドは、天然または野生型のｎａｐＤＮＡｂｐポリペプチド配列には見られないポリペプチドとすることができる。異種ポリペプチドは、ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端でｎａｐＤＮＡｂｐに融合することができるか、またはｎａｐＤＮＡｂｐ内部位置で挿入することができる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、ｎａｐＤＮＡｂｐの内部位置で挿入される。
一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、デアミナーゼまたはその機能性断片である。例えば、融合タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１）のＮ末端断片およびＣ末端断片の側面に位置するデアミナーゼのポリペプチドを含み得る。融合タンパク質内のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼとすることができる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ７．１０またはＴａｄＡ＊８）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡはＴａｄＡ＊８である。本明細書に記載されるようなＴａｄＡ配列（例えば、ＴａｄＡ７．１０またはＴａｄＡ＊８）は、上記の融合タンパク質に適したデアミナーゼである。
デアミナーゼは、循環置換型デアミナーゼとすることができる。例えば、デアミナーゼは、循環置換型アデノシンデアミナーゼとすることができる。一部の実施形態では、デアミナーゼは、循環置換体ＴａｄＡであり、ＴａｄＡ参照配列で付番してアミノ酸残基１１６で循環置換されている。一部の実施形態では、デアミナーゼは循環置換型ＴａｄＡであり、ＴａｄＡ参照配列で付番してアミノ酸残基１３６で循環置換されている。一部の実施形態では、デアミナーゼは循環置換型ＴａｄＡであり、ＴａｄＡ参照配列で付番してアミノ酸残基６５で循環置換されている。
融合タンパク質は、１つを超えるデアミナーゼを含み得る。融合タンパク質は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれを超えるデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は１つのデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は２つのデアミナーゼを含む。融合タンパク質内の２つ以上のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはそれらの組合せとされ得る。２つ以上のデアミナーゼはホモ二量体とされ得る。２つ以上のデアミナーゼはヘテロ二量体とされ得る。２つ以上のデアミナーゼは、直列でｎａｐＤＮＡｂｐに挿入され得る。一部の実施形態では、２つ以上のデアミナーゼは、ｎａｐＤＮＡｂｐに直列で存在しなくてもよい。
一部の実施形態では、融合タンパク質内のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその断片である。Ｃａｓ９ポリペプチドは、バリアントＣａｓ９ポリペプチドとされ得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ポリペプチドまたはその断片である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドまたはその断片である。融合タンパク質内のＣａｓ９ポリペプチドは、完全長Ｃａｓ９ポリペプチドとされ得る。一部の場合では、融合タンパク質内のＣａｓ９ポリペプチドは、完全長Ｃａｓ９ポリペプチドでなくてもよい。Ｃａｓ９ポリペプチドは、天然のＣａｓ９タンパク質に比べて、例えば、Ｎ末端またはＣ末端で、切詰され得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、循環置換型Ｃａｓ９タンパク質とされ得る。Ｃａｓ９ポリペプチドは、標的ポリヌクレオチドおよびガイド核酸配列をやはり結合することができるＣａｓ９ポリペプチドの断片、部分、またはドメインとされ得る。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、またはそれらの断片もしくはバリアントである。
融合タンパク質のＣａｓ９ポリペプチドは、天然に発生したＣａｓ９ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含み得る。
融合タンパク質のＣａｓ９ポリペプチドは、下記に規定されるＣａｓ９アミノ酸配列（下記に「Ｃａｓ９参照配列」と呼ばれる）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を含み得る：
Figure 2022545950000014
（単下線：ＨＮＨドメイン；二重下線：ＲｕｖＣドメイン）。
Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片の側面に配置された異種の触媒ドメインを含む融合タンパク質も、本明細書に記載されるような方法における塩基編集に有用である。Ｃａｓ９および１つまたは複数のデアミナーゼドメイン、例えば、アデノシンデアミナーゼを含むか、またはＣａｓ９配列の側面に配置されたアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質も、特異性および効率性の高い標的配列の塩基編集に有用である。一実施形態では、キメラＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチド内に挿入された異種の触媒ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を含有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９内に挿入されたアデノシンデアミナーゼドメインとシチジンデアミナーゼドメインとを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＮ末端に融合される。
アデノシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼとＣａｓ９とを有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように示される：
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（アデノシンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。
一部の実施形態では、上記の一般構造に用いられる「－」は、任意選択的なリンカーの存在を標示する。
様々な実施形態では、触媒ドメインは、ＤＮＡ修飾活性（例えば、デアミナーゼ活性）、例えばアデノシンデアミナーゼ活性などを有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ７．１０）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡはＴａｄＡ＊８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８はＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８はＣａｓ９内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、ＴａｄＡ＊８はＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ９内に融合され、ＴａｄＡ＊８はＮ末端に融合される。ＴａｄＡ＊８とシチジンデアミナーゼとＣａｓ９とを有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように示される：
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡ＊８）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ９（ＴａｄＡ＊８）］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－［ＴａｄＡ＊８］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ９（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。
一部の実施形態では、上記の一般構造に用いられる「－」は、任意選択的なリンカーの存在を標示する。
異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、適した場所でｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１））に挿入することができ、それゆえに例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐは、標的ポリヌクレオチドとガイド核酸とを結合する能力を保持する。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、デアミナーゼの機能（例えば、塩基編集活性）またはｎａｐＤＮＡｂｐの機能（例えば、標的核酸およびガイド核酸に結合する能力）を損なうことなくｎａｐＤＮＡｂｐ内に挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、例えば、障害のある領域または結晶解析により示されるような高温因子もしくはＢ因子を含む領域で、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。あまり整列されていないか、乱雑であるか、または構造化されていないタンパク質の領域、例えば、溶媒曝露領域およびループは、構造または機能を損なうことなく挿入するために用いることができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、可撓性ループ領域または溶媒曝露領域でｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１ポリペプチドの可撓性ループに挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）の挿入場所は、Ｃａｓ９ポリペプチドの結晶構造のＢ因子解析によって決定される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、平均よりも高いＢ因子（例えば、総タンパク質または乱雑な領域を含むタンパク質ドメインに比べて高いＢ因子）を備えるＣａｓ９ポリペプチドの領域に挿入される。Ｂ因子または温度因子は、原子の揺らぎをそれらの平均的な位置から（例えば、温度依存的な原子振動または結晶格子の静的無秩序性の結果として）標示することができる。骨格原子についてＢ因子が高い（例えば、平均Ｂ因子よりも高い）ことは、局所移動性の比較的高い領域であることを標示し得る。そのような領域は、構造または機能を損なうことなくデアミナーゼを挿入するために用いることができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、総タンパク質の平均Ｂ因子よりも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、または２００％超の高いＢ因子を備えるＣα原子を有する残基を含む場所で、挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、ある残基を含むＣａｓ９タンパク質ドメインの平均Ｂ因子よりも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、または２００％超の高いＢ因子を備えるＣα原子を有する当該残基を含む場所で、挿入することができる。平均よりも高いＢ因子を備えるＣａｓ９ポリペプチド位置としては、例えば、上記Ｃａｓ９参照配列で付番した際の残基７６８、７９２、１０５２、１０１５、１０２２、１０２６、１０２９、１０６７、１０４０、１０５４、１０６８、１２４６、１２４７、および１２４８を挙げることができる。平均よりも高いＢ因子を備えるＣａｓ９ポリペプチド領域としては、例えば、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の残基７９２～８７２、７９２～９０６、および２～７９１が挙げられる。
異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の７６８、７９１、７９２、１０１５、１０１６、１０２２、１０２３、１０２６、１０２９、１０４０、１０５２、１０５４、１０６７、１０６８、１０６９、１２４６、１２４７、および１２４８からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基でｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸７６８～７６９位、７９１～７９２位、７９２～７９３位、１０１５～１０１６位、１０２２～１０２３位、１０２６～１０２７位、１０２９～１０３０位、１０４０～１０４１位、１０５２～１０５３位、１０５４～１０５５位、１０６７～１０６８位、１０６８～１０６９位、１２４７～１２４８位、もしくは１２４８～１２４９位、またはその対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸７６９～７７０位、７９２～７９３位、７９３～７９４位、１０１６～１０１７位、１０２３～１０２４位、１０２７～１０２８位、１０３０～１０３１位、１０４１～１０４２位、１０５３～１０５４位、１０５５～１０５６位、１０６８～１０６９位、１０６９～１０７０位、１２４８～１２４９位、もしくは１２４９～１２５０位、またはその対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の７６８、７９１、７９２、１０１５、１０１６、１０２２、１０２３、１０２６、１０２９、１０４０、１０５２、１０５４、１０６７、１０６８、１０６９、１２４６、１２４７、および１２４８からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置換される。挿入位置に関する上記Ｃａｓ９参照配列への言及は、説明の目的のためであることを理解するべきである。本明細書に考察されるような挿入は、上記Ｃａｓ９参照配列のＣａｓ９ポリペプチド配列に限定されないが、バリアントＣａｓ９ポリペプチド、例えばＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、ヌクレアーゼドメインを欠いたＣａｓ９バリアント、切詰型Ｃａｓ９、またはＨＮＨドメインを部分的もしくは完全に欠いたＣａｓ９ドメインの対応する場所での挿入を含む。
異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の７６８、７９２、１０２２、１０２６、１０４０、１０６８、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸７６８～７６９位、７９２～７９３位、１０２２～１０２３位、１０２６～１０２７位、１０２９～１０３０位、１０４０～１０４１位、１０６８～１０６９位、もしくは１２４７～１２４８位、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸７６９～７７０位、７９３～７９４位、１０２３～１０２４位、１０２７～１０２８位、１０３０～１０３１位、１０４１～１０４２位、１０６９～１０７０位、もしくは１２４８～１２４９位、またはそれらの対応するアミノ酸位置の間に挿入される。一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の７６８、７９２、１０２２、１０２６、１０４０、１０６８、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換える。
異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、本明細書に記載されるようなアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。一実施形態では、異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１００２、１００３、１０２５、１０５２～１０５６、１２４２～１２４７、１０６１～１０７７、９４３～９４７、６８６～６９１、５６９～５７８、５３０～５３９、および１０６０～１０７７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で、ｎａｐＤＮＡｂｐに挿入することができる。デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、その残基のＮ末端またはＣ末端で挿入するか、またはその残基を置き換えることができる。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、残基のＣ末端で挿入される。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基に挿入される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の残基７９２～８７２、７９２～９０６、もしくは２～７９１、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基の代わりに挿入される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、ＣＢＥ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸残基、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１６、１０２３、１０２９、１０４０、１０６９、および１２４７からなる群から選択されるアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基７６８、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基７６８または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基７６８または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基７６８または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基７９１で挿入されるか、またはアミノ酸残基７９２または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基７９１のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸７９２または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸７９１のＣ末端で挿入されるか、アミノ酸７９２または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸７９１を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸７９２、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０１６、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０１６または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０１６または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０１６または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２２で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０２３または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２２のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸１０２３または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２２のＣ末端で挿入されるか、またはアミノ酸１０２３または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２２を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸残基１０２３、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２６で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０２９または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２６のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸１０２９または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２６のＣ末端で挿入されるか、またはアミノ酸１０２９または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０２６を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸残基１０２９、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０４０、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０４０または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０４０または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０４０または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０５２で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０５４または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０５２のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸１０５４または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０５２のＣ末端で挿入されるか、またはアミノ酸１０５４または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０５２を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸残基１０５４、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０６７で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６８で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６９または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０６７のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６８のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６９または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０６７のＣ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６８のＣ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６９または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１０６７を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６８を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸残基１０６９または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１２４６で挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４７で挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４８または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１２４６のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４７のＮ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４８または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＮ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１２４６のＣ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４７のＣ末端で挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４８または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基のＣ末端で挿入される。一部の実施形態では、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基１２４６を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４７を置き換えるように挿入されるか、またはアミノ酸残基１２４８または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を置き換えるように挿入される。
一部の実施形態では、異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの可撓性ループに挿入される。可撓性ループ部分は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の５３０～５３７、５６９～５７０、６８６～６９１、９４３～９４７、１００２～１０２５、１０５２～１０７７、１２３２～１２４７、もしくは１２９８～１３００、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基からなる群から選択することができる。可撓性ループ部分は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１～５２９、５３８～５６８、５８０～６８５、６９２～９４２、９４８～１００１、１０２６～１０５１、１０７８～１２３１、もしくは１２４８～１２９７、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基からなる群から選択することができる。
異種ポリペプチド（例えば、アデニンデアミナーゼ）は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基：１０１７～１０６９、１２４２～１２４７、１０５２～１０５６、１０６０～１０７７、１００２～１００３、９４３～９４７、５３０～５３７、５６８～５７９、６８６～６９１、１２４２～１２４７、１２９８～１３００、１０６６～１０７７、１０５２～１０５６、もしくは１０６０～１０７７、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基に相当するＣａｓ９ポリペプチド領域内に挿入することができる。
異種ポリペプチド（例えば、アデニンデアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの欠失領域の代わりに挿入することができる。欠失領域は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端部分に相当し得る。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の残基７９２～８７２、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基に相当する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の残基７９２～９０６、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基に相当する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の残基２～７９１、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基に相当する。一部の実施形態では、欠失領域は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の残基１０１７～１０６９、またはその対応するアミノ酸残基に相当する。
例示的な内部融合塩基エディターを下記の表Ａに示す：
Figure 2022545950000015
異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの構造ドメインまたは機能ドメイン内に挿入することができる。異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの２つの構造ドメインまたは機能ドメインの間に挿入することができる。異種ポリペプチド（例えば、デアミナーゼ）は、Ｃａｓ９ポリペプチドの構造ドメインまたは機能ドメインの代わりに、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドからそのドメインを欠失させた後に、挿入することができる。Ｃａｓ９ポリペプチドの構造ドメインまたは機能ドメインとしては、例えば、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、ＰＩ、またはＨＮＨを挙げることができる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、ＲｕｖＣＩＩＩ、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、ＰＩ、またはＨＮＨドメインからなる群から選択される１つまたは複数のドメインを欠いている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドはヌクレアーゼドメインを欠いている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドはＨＮＨドメインを欠いている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドはＨＮＨドメインの一部を欠き、それゆえにＣａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨ活性が低減されているかまたは無効にされている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼドメインの欠失を含み、デアミナーゼは、ヌクレアーゼドメインを置き換えるように挿入されている。一部の実施形態では、ＨＮＨドメインは欠失され、デアミナーゼがその代わりに挿入されている。一部の実施形態では、１つまたは複数のＲｕｖＣドメインが欠失され、デアミナーゼが代わりに挿入されている。
異種ポリペプチドを含む融合タンパク質は、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端およびＣ末端断片の側面に配置され得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片の側面に配置されたデアミナーゼを含む。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、標的ポリヌクレオチド配列を結合することができる。Ｎ末端断片のＣ末端またはＣ末端断片のＮ末端は、Ｃａｓ９ポリペプチドの可撓性ループの一部を含み得る。Ｎ末端断片のＣ末端またはＣ末端断片のＮ末端は、Ｃａｓ９ポリペプチドのアルファ－ヘリックス構造の一部を含み得る。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＤＮＡ結合ドメインを含み得る。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＲｕｖＣドメインを含み得る。Ｎ末端断片またはＣ末端断片は、ＨＮＨドメインを含み得る。一部の実施形態では、Ｎ末端断片とＣ末端断片のどちらも、ＨＮＨドメインを含まない。
一部の実施形態では、融合タンパク質が標的核酸塩基を脱アミノ化する際に、Ｎ末端Ｃａｓ９断片のＣ末端は、標的核酸塩基に近接するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質が標的核酸塩基を脱アミノ化する際に、Ｃ末端Ｃａｓ９断片のＮ末端は、標的核酸塩基に近接するアミノ酸を含む。標的核酸塩基とＮ末端Ｃａｓ９断片のＣ末端内またはＣ末端Ｃａｓ９断片のＮ末端内のアミノ酸との間を近接させるために、異なるデアミナーゼの挿入場所は異なり得る。例えば、ＡＢＥの挿入位置は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際の１０１５、１０２２、１０２９、１０４０、１０６８、１２４７、１０５４、１０２６、７６８、１０６７、１２４８、１０５２、および１２４６からなる群から選択されるアミノ酸残基または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基とすることができる。
融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片（すなわち、融合タンパク質中のデアミナーゼの側面に配置されたＮ末端Ｃａｓ９断片）は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端を含み得る。融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００アミノ酸の長さを含み得る。融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基：１～５６、１～９５、１～２００、１～３００、１～４００、１～５００、１～６００、１～７００、１～７１８、１～７６５、１～７８０、１～９０６、１～９１８、もしくは１～１１００、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基に対応する配列を含み得る。Ｎ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基：１～５６、１～９５、１～２００、１～３００、１～４００、１～５００、１～６００、１～７００、１～７１８、１～７６５、１～７８０、１～９０６、１～９１８、もしくは１～１１００、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基と少なくとも：８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を備える配列を含み得る。
融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片（すなわち、融合タンパク質中のデアミナーゼの側面に配置されたＣ末端Ｃａｓ９断片）は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＣ末端を含み得る。融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、または１３００アミノ酸の長さを含み得る。融合タンパク質のＣ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基：１０９９～１３６８、９１８～１３６８、９０６～１３６８、７８０～１３６８、７６５～１３６８、７１８～１３６８、９４～１３６８、もしくは５６～１３６８、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基に対応する配列を含み得る。Ｎ末端Ｃａｓ９断片は、上記のＣａｓ９参照配列で付番した際のアミノ酸残基：１０９９～１３６８、９１８～１３６８、９０６～１３６８、７８０～１３６８、７６５～１３６８、７１８～１３６８、９４～１３６８、もしくは５６～１３６８、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基と少なくとも：８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を備える配列を含み得る。
融合タンパク質のＮ末端Ｃａｓ９断片およびＣ末端Ｃａｓ９断片は、まとめて、完全長の天然のＣａｓ９ポリペプチド配列、例えば、上記のＣａｓ９参照配列に規定されたようなものに対応していなくてもよい。
本明細書に記載の融合タンパク質は、非標的部位（例えば、オフターゲット部位）での脱アミノ化を低減されて、例えば、ゲノムワイドな偽の脱アミノ化を低減されるなど、標的化された脱アミノ化をもたらすことができる。本明細書に記載の融合タンパク質はまた、非標的部位でのバイスタンダーの脱アミノ化を低減されて、標的化された脱アミノ化をもたらすことができる。望まない脱アミノ化またはオフターゲットの脱アミノ化は、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されたデアミナーゼを含む末端融合タンパク質に比べて、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減され得る。望まない脱アミノ化またはオフターゲットの脱アミノ化は、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されたデアミナーゼを含む末端融合タンパク質に比べて、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍低減され得る。
一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）は、Ｒループの範囲内で２つ以下の核酸塩基を脱アミノ化する。一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼは、Ｒループの範囲内で３つ以下の核酸塩基を脱アミノ化する。一部の実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼは、Ｒループの範囲内で２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以下の核酸塩基を脱アミノ化する。Ｒループは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡの相補的な構造と一本鎖ＤＮＡとの会合とを含む三本鎖の核酸構造である。本明細書に用いられる際に、標的ポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ複合体または塩基編集複合体に接触する際にＲループが形成され得るが、その場合、ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡの一部は、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡの一部にハイブリダイズし置き換わる。一部の実施形態では、Ｒループは、スペーサー配列と標的ＤＮＡ相補的な配列とのハイブリダイズ領域を含む。Ｒループ領域は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の核酸塩基対の長さである。一部の実施形態では、Ｒループ領域は約２０核酸塩基対の長さである。本明細書に用いられる際に、Ｒループ領域はガイドポリヌクレオチドにハイブリダイズする標的ＤＮＡ鎖に限定されないことを理解するべきである。例えば、Ｒループ領域内の標的核酸塩基の編集は、ガイドＲＮＡに対する相補的な鎖を含むＤＮＡ鎖に対するものとしてもよいし、ガイドＲＮＡに相補的な鎖の反対鎖であるＤＮＡ鎖に対するものとしてもよい。一部の実施形態では、Ｒループの領域での編集は、標的ＤＮＡ配列においてガイドＲＮＡとは非相補的な鎖（プロトスペーサー鎖）上で核酸塩基を編集することを含む。
本明細書に記載される融合タンパク質は、規準の塩基編集とは異なり、編集の枠内で、標的の脱アミノ化をもたらすことができる。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド配列中のＰＡＭ配列より約１から約２０塩基上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド配列中のＰＡＭ配列より約２から約１２塩基上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列より約１から９塩基対、約２から１０塩基対、約３から１１塩基対、約４から１２塩基対、約５から１３塩基対、約６から１４塩基対、約７から１５塩基対、約８から１６塩基対、約９から１７塩基対、約１０から１８塩基対、約１１から１９塩基対、約１２から２０塩基対、約１から７塩基対、約２から８塩基対、約３から９塩基対、約４から１０塩基対、約５から１１塩基対、約６から１２塩基対、約７から１３塩基対、約８から１４塩基対、約９から１５塩基対、約１０から１６塩基対、約１１から１７塩基対、約１２から１８塩基対、約１３から１９塩基対、約１４から２０塩基対、約１から５塩基対、約２から６塩基対、約３から７塩基対、約４から８塩基対、約５から９塩基対、約６から１０塩基対、約７から１１塩基対、約８から１２塩基対、約９から１３塩基対、約１０から１４塩基対、約１１から１５塩基対、約１２から１６塩基対、約１３から１７塩基対、約１４から１８塩基対、約１５から１９塩基対、約１６から２０塩基対、約１から３塩基対、約２から４塩基対、約３から５塩基対、約４から６塩基対、約５から７塩基対、約６から８塩基対、約７から９塩基対、約８から１０塩基対、約９から１１塩基対、約１０から１２塩基対、約１１から１３塩基対、約１２から１４塩基対、約１３から１５塩基対、約１４から１６塩基対、約１５から１７塩基対、約１６から１８塩基対、約１７から１９塩基対、約１８から２０塩基対離れているかまたは上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超える数の塩基対離れているかまたは上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、または９塩基対上流である。一部の実施形態では、標的核酸塩基は、ＰＡＭ配列から約２、３、４、または６塩基対上流である。
融合タンパク質は、１つを超える異種ポリペプチドを含み得る。例えば、融合タンパク質は、１つもしくは複数のＵＧＩドメインおよび／または１つもしくは複数の核局在化シグナルを追加的に含み得る。２つ以上の異種ドメインは、直列に挿入され得る。２つ以上の異種ドメインは、ＮａｐＤＮＡｂｐ内で直列とはならないような場所に挿入され得る。
融合タンパク質は、デアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐポリペプチドとの間にリンカーを含み得る。リンカーは、ペプチドまたは非ペプチドのリンカーとし得る。例えば、リンカーは、ＸＴＥＮ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳとし得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端断片とＣ末端断片とは、リンカーによりデアミナーゼに接続される。一部の実施形態では、Ｎ末端断片とＣ末端断片とは、リンカーを用いることなくデアミナーゼドメインに接合される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含むが、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にはリンカーを含まない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含むが、Ｎ末端Ｃａｓ９断片とデアミナーゼとの間にリンカーを含まない。
一部の実施形態では、融合タンパク質中のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ１２ポリペプチド、例えばＣａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、またはその断片である。Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バリアントＣａｓ１２ポリペプチドとし得る。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片またはＣ末端断片は、核酸プログラマブルＤＮＡ結合ドメインまたはＲｕｖＣドメインを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ１２ポリペプチドと触媒ドメインとの間にリンカーを含有する。他の実施形態では、リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＳＧＧＳまたはＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧである。他の実施形態では、リンカーは剛性のリンカーである。上記の態様の他の実施形態では、リンカーは、ＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣまたはＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣによってコードされる。
Ｃａｓ１２ポリペプチドのＮ末端断片およびＣ末端断片の側面に配置された異種の触媒ドメインを含む融合タンパク質も、本明細書に記載されるような方法における塩基編集に有用である。Ｃａｓ１２および１つまたは複数のデアミナーゼドメイン、例えば、アデノシンデアミナーゼを含むか、またはＣａｓ１２配列の側面に配置されたアデノシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質も、特異性および効率性の高い標的配列の塩基編集に有用である。一実施形態では、キメラＣａｓ１２融合タンパク質は、Ｃａｓ１２ポリペプチド内に挿入された異種の触媒ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、またはアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ）を含有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓ１２内に挿入されたアデノシンデアミナーゼドメインとシチジンデアミナーゼドメインとを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、アデノシンデアミナーゼはＮ末端に融合される。アデノシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼとＣａｓ１２とを有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように示される：
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２（アデノシンデアミナーゼ）］－［シチジンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（アデノシンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ；
ＮＨ２－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－［アデノシンデアミナーゼ］－ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２－［アデノシンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－ＣＯＯＨ。
一部の実施形態では、上記の一般構造に用いられる「－」は、任意選択的なリンカーの存在を標示する。
様々な実施形態では、触媒ドメインは、ＤＮＡ修飾活性（例えば、デアミナーゼ活性）、例えばアデノシンデアミナーゼ活性などを有する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ（例えば、ＴａｄＡ７．１０）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡはＴａｄＡ＊８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８はＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８はＣａｓ１２内に融合され、シチジンデアミナーゼはＮ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、ＴａｄＡ＊８はＣ末端に融合される。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼはＣａｓ１２内に融合され、ＴａｄＡ＊８はＮ末端に融合される。ＴａｄＡ＊８とシチジンデアミナーゼとＣａｓ１２とを有する融合タンパク質の例示的な構造は、以下のように示される：
Ｎ－［Ｃａｓ１２（ＴａｄＡ＊８）］－［シチジンデアミナーゼ］－Ｃ；
Ｎ－［シチジンデアミナーゼ］－［Ｃａｓ１２（ＴａｄＡ＊８）］－Ｃ；
Ｎ－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－［ＴａｄＡ＊８］－Ｃ；または
Ｎ－［ＴａｄＡ＊８］－［Ｃａｓ１２（シチジンデアミナーゼ）］－Ｃ。
一部の実施形態では、上記の一般構造に用いられる「－」は、任意選択的なリンカーの存在を標示する。
他の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数の触媒ドメインを含有する。他の実施形態では、１つまたは複数の触媒ドメインのうち少なくとも１つが、Ｃａｓ１２ポリペプチド内に挿入されるか、またはＣａｓ１２のＮ末端またはＣ末端で融合される。他の実施形態では、１つまたは複数の触媒ドメインのうち少なくとも１つが、Ｃａｓ１２ポリペプチドのループ内、アルファヘリックス領域内、非構造化部分内、または溶媒アクセス可能部分内に挿入される。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉである。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイＣａｓ１２ｂ、バチルス・サーモアミロボランスＣａｓ１２ｂ、バチルス属Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、またはアリシクロバチルス・アシディフィラスＣａｓ１２ｂと少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイＣａｓ１２ｂ、バチルス・サーモアミロボランスＣａｓ１２ｂ、バチルス属Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、またはアリシクロバチルス・アシディフィラスＣａｓ１２ｂと少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイＣａｓ１２ｂ、バチルス・サーモアミロボランスＣａｓ１２ｂ、バチルス属Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、またはアリシクロバチルス・アシディフィラスＣａｓ１２ｂと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ポリペプチドは、バチルス・ヒサシイＣａｓ１２ｂ、バチルス・サーモアミロボランスＣａｓ１２ｂ、バチルス属Ｖ３－１３Ｃａｓ１２ｂ、またはアリシクロバチルス・アシディフィラスＣａｓ１２ｂの断片を含有するか、または本質的に成る。
他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸１５３～１５４位、２５５～２５６位、３０６～３０７位、９８０～９８１位、１０１９～１０２０位、５３４～５３５位、６０４～６０５位、もしくは３４４～３４５位の間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、もしくはＣａｓ１２ｉの対応するアミノ酸残基の間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１５３とＳ１５４との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ２５５とＥ２５６との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｄ９８０とＧ９８１との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ１０１９とＬ１０２０との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｆ５３４とＰ５３５との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ６０４とＧ６０５との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｈＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｈ３４４とＦ３４５との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸１４７位と１４８位との間、２４８位と２４９位との間、２９９位と３００位との間、９９１位と９９２位との間、もしくは１０３１位と１０３２位との間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、もしくはＣａｓ１２ｉの対応するアミノ酸残基の間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１４７とＤ１４８との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ２４８とＧ２４９との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ２９９とＥ３００との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ９９１とＥ９９２との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＢｖＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｋ１０３１とＭ１０３２との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸１５７位と１５８位との間、２５８位と２５９位との間、３１０位と３１１位との間、１００８位と１００９位との間、もしくは１０４４位と１０４５位との間、またはＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、もしくはＣａｓ１２ｉの対応するアミノ酸残基に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｐ１５７とＧ１５８との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｖ２５８とＧ２５９との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｄ３１０とＰ３１１との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ１００８とＥ１００９との間に挿入される。他の実施形態では、触媒ドメインは、ＡａＣａｓ１２ｂのアミノ酸Ｇ１０４４とＫ１０４５との間に挿入される。
他の実施形態では、融合タンパク質は、核局在化シグナル（例えば、二部分構成の核局在化シグナル）を含有する。他の実施形態では、核局在化シグナルのアミノ酸配列は、ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡである。上記の態様の他の実施形態では、核局在化シグナルは、以下の配列によってコードされる：
ＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣ。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、ＲｕｖＣドメインの触媒活性を封じる変異を含有する。他の実施形態では、Ｃａｓ１２ｂポリペプチドは、Ｄ５７４Ａ、Ｄ８２９Ａおよび／またはＤ９５２Ａ変異を含有する。他の実施形態では、融合タンパク質は、タグ（例えば、インフルエンザヘマグルチニンタグ）をさらに含有する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、内部に融合された核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン、例えばアデノシンデアミナーゼドメインの全部または一部）を有するｎａｐＤＮＡｂｐドメイン（例えば、Ｃａｓ１２由来ドメイン）を含む。一部の実施形態では、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣａｓ１２ｂである。一部の実施形態では、塩基エディターは、内部に融合されたＴａｄＡ＊８ドメインを下記の表Ｂに示される遺伝子座に挿入されて有する、ＢｈＣａｓ１２ｂドメインを含む。
Figure 2022545950000016
非制限的な例として、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＢＥ８．１３）は、ＢｈＣａｓ１２ｂに挿入されて、核酸配列を効果的に編集する融合タンパク質（例えば、ＡＢＥ８．１３－ＢｈＣａｓ１２ｂ）を生じ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基編集システムは、Ｃａｓ９に挿入されたＴａｄＡを有するＡＢＥを含む。
ＰＡＭの排他性を低減されたＣａｓ９ドメイン
典型的には、Ｓ．ピロゲネス由来のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）などのＣａｓ９タンパク質は、特定の核酸領域に結合する規準のＮＧＧ ＰＡＭ配列を必要とするが、この配列では、「ＮＧＧ」の「Ｎ」は、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇはグアノシンである。これによりゲノム内の所望の塩基を編集する能力が限定され得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基編集融合タンパク質は、精確な場所、例えば、ＰＡＭの上流である標的塩基を含む領域に配される必要があることがある。例えば、その全体の内容をここに参照により組み込まれるKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)を参照されたい。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供されるいずれかの融合タンパク質は、規準の（例えばＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含有しないヌクレオチド配列を結合することができるＣａｓ９ドメインを含有し得る。非規準のＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、当技術分野に記載されており、当業者に明らかになるものとなる。例えば、非規準のＰＡＭ配列を結合するＣａｓ９ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)；Nishimasu, H., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space” Science. 2018 Sep 21;361(6408):1259-1262, Chatterjee, P., et al., Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog” Sci Adv. 2018 Oct 24;4(10):eaau0766. doi: 10.1126/sciadv.aau0766に記載されており、それぞれの全体の内容はここに参照により組み込まれる。
核酸塩基編集ドメイン
本明細書に記載されるのは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）とを含む融合タンパク質を含む塩基エディターである。塩基エディターは、標的配列を認識することのできるガイドポリヌクレオチドと相互作用することによって、標的ポリヌクレオチド配列中の１つまたは複数の塩基を編集するようにプログラムすることができる。標的配列が認識されていると、塩基エディターは、ポリヌクレオチド上に繋留され、そこでは、編集が発生するものとなり、次いで、塩基エディターのデアミナーゼドメイン構成成分は、標的塩基を編集することができる。
一部の実施形態では、核酸塩基編集ドメインは、デアミナーゼドメインを含む。本明細書に具体的に記載されるように、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む。実施形態では、塩基エディターは、標的Ｃ・Ｇ塩基対をＴ・Ａに変換するシチジン塩基エディター（例えばＢＥ４）と、Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換するアデニン塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０など）とを含む。一部の実施形態では、用語「シトシンデアミナーゼ」および「シチジンデアミナーゼ」は、互換的に用いることができる。一部の実施形態では、用語「アデニンデアミナーゼ」および「アデノシンデアミナーゼ」は、互換的に用いられる。核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、そのどちらも本明細書に参照によりその全体が組み込まれている。また、全体の内容が参照によりここに組み込まれる、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；およびKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照されたい。
ＡからＧへの編集
一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼを含めたデアミナーゼドメインを含み得る。そのような塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、アデニン（Ａ）を脱アミノ化して、グアニン（Ｇ）の塩基対形成特性を示すイノシン（Ｉ）を形成することによって、Ａ核酸塩基からＧ核酸塩基への編集を促進することができる。アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中でデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化する（すなわち、アミン基を除去する）ことが可能である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸塩基エディターは、１つまたは複数のタンパク質ドメインを合わせて融合することによって作製され、それによって融合タンパク質を生成することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を高める１つまたは複数の特徴（例えば、効率、選択性、および特異性）を含む。例えば、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性の低減されたＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を持たないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と呼ばれる二重鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有し得る。いかなる特定の理論に拘束されることを望む訳ではないが、触媒残基（例えば、Ｈ８４０）の存在により、Ｃａｓ９の活性が維持されて、標的とされたＡの反対のＴを含有する非編集（例えば、非脱アミノ化）鎖を切断する。Ｃａｓ９の触媒残基の変異（例えば、Ｄ１０からＡ１０）は、標的とされたＡ残基を含有する編集鎖の切断を防止する。そのようなＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡにより規定された標的配列に基づき、特異的な場所で一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生成することができ、非編集鎖の修復に繋がり、最終的な結果として非編集鎖の上でＴからＣへの変化を生じる。一部の実施形態では、ＡからＧへの塩基エディターは、イノシン塩基除去修復の阻害物質、例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）ドメインまたは触媒として不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼをさらに含む。いかなる特定の理論に拘束されることを望む訳ではないが、ＵＧＩドメインまたは触媒として不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼは、脱アミノ化されたアデノシン残基（例えば、イノシン）の塩基除去修復を阻害または防止することができ、塩基エディターの活性または効率を高めることができる。
アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む、任意のポリヌクレオチドに作用し得る。ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼを含む塩基エディターは、ＲＮＡを含むポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することができる。例えば、塩基エディターは、ＲＮＡポリヌクレオチドおよび／またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドの標的Ａを脱アミノ化することのできるアデノシンデアミナーゼドメインを含み得る。一実施形態では、塩基エディターに組み込まれたアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ、例えば、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２）の全部または一部を含む。別の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたアデノシンデアミナーゼは、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）の全部または一部を含む。アデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターはまた、ＤＮＡポリヌクレオチドのＡ核酸塩基を脱アミノ化することを可能とし得る。一実施形態では、塩基エディターのアデノシンデアミナーゼドメインは、ＡＤＡＴがＤＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化することを可能にする１つまたは複数の変異を含む、ＡＤＡＴの全部または一部を含む。例えば、塩基エディターは、以下の変異：Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｉ１５７Ｆのうち１つもしくは複数を含む大腸菌由来のＡＤＡＴ（ＥｃＴａｄＡ）、または別のアデノシンデアミナーゼの対応する変異を含み得る。
アデノシンデアミナーゼは、任意の適した生物（例えば、大腸菌）由来とすることができる。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供されるいずれかの変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ内の変異）に対応する１つまたは複数の変異を含む天然のアデノシンデアミナーゼである。任意の相同なタンパク質内の対応する残基は、例えば、配列のアラインメントおよび相同な残基の決定によって特定することができる。本明細書に記載される任意の変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ内に特定された任意の変異）に対応する任意の天然の（例えば、ｅｃＴａｄＡとの相同性を有する）アデノシンデアミナーゼ内の変異が、それゆえに生成され得る。
ＴａｄＡ
具体的な実施形態では、ＴａｄＡは、本明細書に参照によりその全体を組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）に記載されるＴａｄＡのうちいずれか１つである。
具体的な実施形態では、融合タンパク質は、単一の（例えば、単量体として提供される）ＴａｄＡ＊８バリアントである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている。一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヘテロ二量体として、ＴａｄＡ＊８バリアントに連結されている野生型ＴａｄＡ（ＴａｄＡ（ｗｔ））を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヘテロ二量体として、ＴａｄＡ＊８バリアントに連結されているＴａｄＡ＊７．１０を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８バリアント単量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８バリアントとＴａｄＡ（ｗｔ）とのヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８バリアントとＴａｄＡ＊７．１０とのヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８バリアントのヘテロ二量体を含むＡＢＥ８である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８バリアントは、表７から選択される。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、表７から選択される。関連の配列は以下の通りである：
野生型ＴａｄＡ（ＴａｄＡ（ｗｔ））または「ＴａｄＡ参照配列」
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD
ＴａｄＡ＊７．１０：
MSEVEFSHEYW MRHALTLAKR ARDEREVPVG AVLVLNNRVI GEGWNRAIGL HDPTAHAEIM ALRQGGLVMQ NYRLIDATLY VTFEPCVMCA GAMIHSRIGR VVFGVRNAKT GAAGSLMDVL HYPGMNHRVE ITEGILADEC AALLCYFFRM PRQVFNAQKK AQSSTD
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に示されるいずれかのアデノシンデアミナーゼに規定されたいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に示されるアデノシンデアミナーゼが、１つまたは複数の変異（例えば、本明細書に示されるいずれかの変異）を含み得ることを認識するべきである。本開示は、ある特定のパーセント同一性に加えて、本明細書に記載されるいずれかの変異またはそれらの組合せを有する、任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に示されるいずれかのアデノシンデアミナーゼに比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれを超える変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、当技術分野に公知のまたは本明細書に記載されるいずれか１つのアミノ酸配列と比べて、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個同一の隣接したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、完全長の大腸菌ＴａｄＡデアミナーゼである。例えば、ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、以下のアミノ酸配列を含む：
MRRAFITGVFFLSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEI KAQKKAQSSTD。
しかし、本願において有用な追加のアデノシンデアミナーゼが当業者に明らかとなり、かつ本開示の範囲内にあることを認識するべきである。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）のホモログであってもよい。限定はないが、例示的なＡＤＡＴホモログのアミノ酸配列は、以下の通りである：
スタフィロコッカス・アウレウスＴａｄＡ：
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAHAEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCSGS LMNLLQQSNFNHRAIVDKGVLKEACSTLLTTFFKNLRANKKSTN
バチルス・サブチリスＴａｄＡ：
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEMLVIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKGGCSGTLMNLLQEERFNHQAEVVSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLSE
サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ティフィムリウム）ＴａｄＡ：
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIKALKKADRAEGAGPAV
シェワネラ・プトレファシエンス（Ｓ．プトレファシエンス）ＴａｄＡ：
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAHAEILCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGTVVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE
ヘモフィルス・インフルエンザＦ３０３１（Ｈ．インフルエンザ）ＴａｄＡ：
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTΑΗAEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFGASDYKTGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK
カウロバクター・クレセンタス（Ｃ．クレセンタス）ＴａｄＡ：
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADDPKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI
ジオバクター・スルフレデュセンス（Ｇ．スルフレデュセンス）ＴａｄＡ：
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP
大腸菌ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）の一実施形態は以下を含む：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィムリウム、シェワネラ・プトレファシエンス、ヘモフィルス・インフルエンザ、カウロバクター・クレセンタス、またはバチルス・サブチリス由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは大腸菌由来である。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＴａｄＡ７．１０に連結されている野生型ＴａｄＡを含み、ＴａｄＡ７．１０は、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている。具体的な実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡ７．１０ドメインを含む。他の実施形態では、ＡＢＥ７．１０エディターは、ＴａｄＡ７．１０とＴａｄＡ（ｗｔ）とを含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列を含む。本明細書に示されるいずれかのアデノシンデアミナーゼに規定されたいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。本明細書に示されるアデノシンデアミナーゼが、１つまたは複数の変異（例えば、本明細書に示されるいずれかの変異）を含み得ることを認識するべきである。本開示は、ある特定のパーセント同一性に加えて、本明細書に記載されるいずれかの変異またはそれらの組合せを有する、任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に示されるいずれかのアデノシンデアミナーゼに比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれを超える変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、当技術分野に公知のまたは本明細書に記載されるいずれか１つのアミノ酸配列と比べて、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個同一の隣接したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
（例えば、ＴａｄＡ参照配列に基づいて）本明細書に提供される任意の変異が、他のアデノシンデアミナーゼ、例えば大腸菌ＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）、Ｓ．アウレウスＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）、または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）などに導入され得ることを認識するべきである。追加のデアミナーゼを同様にアラインメントして、本明細書に提供されるように変異され得る相同なアミノ酸残基を特定してもよいことが、当業者に明らかとなろう。そのため、ＴａｄＡ参照配列に特定された任意の変異は、相同なアミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄａ）に作製され得る。本明細書に提供される任意の変異が、ＴａｄＡ参照配列または別のアデノシンデアミナーゼにおいて個別にまたは任意の組合せで作製され得ることを認識するべきである。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＤ１０８Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｄ１０８Ｇ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｖ、Ｄ１０８Ａ、もしくはＤ１０８Ｙ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１０６Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１０６Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、野生型ＴａｄＡまたはｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＥ１５５Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＥ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、もしくはＥ１５５Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＤ１４７Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＤ１４７Ｙ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１０６Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、もしくはＤ１４７Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｅ１５５Ｄ、Ｅ１５５Ｇ、またはＥ１５５Ｖ変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＤ１４７Ｙを含む。
例えば、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、および／もしくはＤ１４７Ｙ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含有し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内に以下の変異群（変異群を「；」により区分する）を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む：Ｄ１０８ＮおよびＡ１０６Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６ＶおよびＥ１５５Ｖ；Ａ１０６ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｅ１５５ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＥ５５Ｖ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ｅ５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６Ｖ、Ｅ５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ；ならびにＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖ、およびＤ１４７Ｙ。しかし、本明細書に提供される対応する変異の任意の組合せがアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に作製され得ることを認識するべきである。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｘ、Ｔ１７Ｘ、Ｌ１８Ｘ、Ｗ２３Ｘ、Ｌ３４Ｘ、Ｗ４５Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ａ５６Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｅ８５Ｘ、Ｍ９４Ｘ、Ｉ９５Ｘ、Ｖ１０２Ｘ、Ｆ１０４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｋ１１０Ｘ、Ｍ１１８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ａ１３８Ｘ、Ｆ１４９Ｘ、Ｍ１５１Ｘ、Ｒ１５３Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｘ、および／もしくはＫ１５７Ｘ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に１つもしくは複数の対応する変異を含み、式中、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｔ１７Ｓ、Ｌ１８Ｅ、Ｗ２３Ｌ、Ｌ３４Ｓ、Ｗ４５Ｌ、Ｒ５１Ｈ、Ａ５６Ｅ、もしくはＡ５６Ｓ、Ｅ５９Ｇ、Ｅ８５Ｋ、もしくはＥ８５Ｇ、Ｍ９４Ｌ、１９５１、Ｖ１０２Ａ、Ｆ１０４Ｌ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７Ｃ、もしくはＲ１０７Ｈ、もしくはＲ１０７Ｐ、Ｄ１０８Ｇ、もしくはＤ１０８Ｎ、もしくはＤ１０８Ｖ、もしくはＤ１０８Ａ、もしくはＤ１０８Ｙ、Ｋ１１０Ｉ、Ｍ１１８Ｋ、Ｎ１２７Ｓ、Ａ１３８Ｖ、Ｆ１４９Ｙ、Ｍ１５１Ｖ、Ｒ１５３Ｃ、Ｑ１５４Ｌ、Ｉ１５６Ｄ、および／もしくはＫ１５７Ｒ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に１つもしくは複数の対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、および／もしくはＮ１２７Ｘ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に１つもしくは複数の対応する変異を含み、式中、Ｘは、任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、および／もしくはＮ１２７Ｓ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に１つもしくは複数の対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｋ１６１Ｘ、Ｑ１６３Ｘ、および／もしくはＴ１６６Ｘ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異のうち１つまたは複数を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｍ６１Ｉ、Ｌ６８Ｑ、Ｍ７０Ｖ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、Ｑ１５４ＨもしくはＱ１５４Ｒ、Ｅ１５５ＧもしくはＥ１５５ＶもしくはＥ１５５Ｄ、Ｋ１６１Ｑ、Ｑ１６３Ｈ、および／もしくはＴ１６６Ｐ変異のうち１つまたは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に１つまたは複数の対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、およびＱ１５４Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＱ１６３Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＴ１６６Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ内に対応する１つもしくは複数変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、およびＱ１５４Ｈからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｍ６１Ｉ、Ｍ７０Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｑ１５４Ｒ、Ｅ１５５Ｇ、およびＱ１６３Ｈからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列にＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｖ、およびＴ１６６Ｐからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５Ｄ、およびＫ１６１Ｑからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｒ１２６Ｗ、Ｌ６８Ｑ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つの変異、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、およびＥ１５５Ｇからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。
本明細書に提供される任意の変異および任意の追加の変異（例えば、ｅｃＴａｄＡアミノ酸配列に基づく）は、任意の他のアデノシンデアミナーゼ内に導入され得る。本明細書に提供される任意の変異が、ＴａｄＡ参照配列または別のアデノシンデアミナーゼ（例えばｅｃＴａｄＡ）において個別にまたは任意の組合せで作製され得る。
ＡからＧへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびGaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature, 551, 464-471 (2017)に記載されており、それらの全体の内容はここに参照により組み込まれる。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に１つまたは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＤ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｇ、もしくはＤ１０８Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ１０７ＣおよびＤ１０８Ｎ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＱ１５４Ｈ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｒ２４Ｗ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、およびＮ１２７Ｓ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＳ２Ｘ、Ｈ８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｉ１５６Ｘおよび／もしくはＫ１６０Ｘ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼに１つもしくは複数の対応する変異を含み、式中、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列にＳ２Ａ、Ｈ８Ｙ、Ｉ４９Ｆ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｎ１２７Ｓ、Ｉ１５６Ｆおよび／もしくはＫ１６０Ｓ変異の１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼに１つもしくは複数の対応する変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ）を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｌ８４Ｘ変異アデノシンデアミナーゼを含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内に対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＬ８４Ｆ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ１２３Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ１２３Ｙ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＩ１５７Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＩ１５７Ｆ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＬ８４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、およびＩ１５６Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、 ５つ、６つ、もしくは７つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＳ２Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、およびＥ１５５Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、 ５つ、もしくは６つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列中にＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、およびＫ１６０Ｘからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列にＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、 ５つ、６つ、もしくは７つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列にＳ２Ａ、Ｉ４９Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、 ５つ、もしくは６つの変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、およびＫ１６０Ｓからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つの変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する１つもしくは複数の変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＥ２５Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ａ１４２Ｘ、および／もしくはＡ１４３Ｘ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異のうち１つまたは複数を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、Ｅ２５Ｙ、Ｒ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｋ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、Ｒ１０７Ｓ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ、Ａ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑおよび／またはＡ１４３Ｒ変異のうち１つまたは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼに１つもしくは複数の対応する変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ）を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内に対応する本明細書に記載の変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に１つもしくは複数の対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＥ２５Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、もしくはＥ２５Ｙ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ２６Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、もしくはＲ２６Ｋ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ１０７Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ１０７Ｐ、Ｒ０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、もしくはＲ１０７Ｓ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１４２Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１４３Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑおよび／もしくはＡ１４３Ｒ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ３６Ｘ、Ｎ３７Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｎ７２Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ｅ１３４Ｘ、Ｓ１４６Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｋ１５７Ｘ、および／もしくはＫ１６１Ｘ変異のうち１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異のうち１つまたは複数を含み、式中、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列にＨ３６Ｌ、Ｎ３７Ｔ、Ｎ３７Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｌ、Ｉ４９Ｖ、Ｒ５１Ｈ、Ｒ５１Ｌ、Ｍ７０Ｌ、Ｎ７２Ｓ、Ｄ７７Ｇ、Ｅ１３４Ｇ、Ｓ１４６Ｒ、Ｓ１４６Ｃ、Ｑ１５４Ｈ、Ｋ１５７Ｎ、および／もしくはＫ１６１Ｔ変異の１つもしくは複数を、または別のアデノシンデアミナーゼに１つもしくは複数の対応する変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ）を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ３６Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＨ３６Ｌ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＮ３７Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＮ３７ＴもしくはＮ３７Ｓ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＰ４８Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＰ４８ＴもしくはＰ４８Ｌ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ５１Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼに対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ５１ＨもしくはＲ５１Ｌ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＳ１４６Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＳ１４６ＲもしくはＳ１４６Ｃ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＫ１５７Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＫ１５７Ｎ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＰ４８Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＰ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、もしくはＰ４８Ａ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１４２Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＡ１４２Ｎ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＷ２３Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＷ２３ＲもしくはＷ２３Ｌ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ１５２Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）に対応する変異を含み、式中、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ内の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を標示する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列内にＲ１５２ＰもしくはＲ５２Ｈ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）内に対応する変異を含む。
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、変異Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｌ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｓ１４６Ｃ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、Ｉ１５６Ｆ、およびＫ１５７Ｎを含み得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ参照配列に比して以下の変異の組合せを含み、組合せの各変異は「＿」により区分され、変異の各組合せは丸括弧の間にある：
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｒ１０７Ｃ＿Ｄ１０８Ｎ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｒ２４Ｗ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ）、
（Ｈ８Ｙ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｎ１２７Ｓ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｋ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｉ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｄ１０８Ｆ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｍ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ５９Ａ触媒活性無し＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｙ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｇ２２Ｐ＿Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ）、
（Ｇ２２Ｐ＿Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ＿Ｓ１３８Ａ）、
（Ｄ１０３Ａ＿Ｄ１０４Ｎ＿Ｓ１３８Ａ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ
＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿
Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｍ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｐ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ
＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｃ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ａ＿Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｎ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ
＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｒ１０７Ｈ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｄ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｅ２５Ｄ＿Ｒ２６Ｇ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｒ１０７Ｋ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ａ１４２Ｎ＿Ａ１４３Ｌ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｎ３７Ｔ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｍ７０Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｑ１５４Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｅ１３４Ｇ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｈ３６Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｎ３７Ｓ＿Ｒ５１Ｈ＿Ｄ７７Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｈ９６Ｌ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６０Ｅ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｇ６７Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｔ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｑ７１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｌ１３７Ｍ＿Ａ１４３Ｅ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｅ２５Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ９１Ｔ＿Ｆ１０４Ｉ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｎ７２Ｄ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｇ１２５Ａ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ｓ９７Ｃ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｗ２３Ｇ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｄ２４Ｇ＿Ｐ４８Ｌ＿Ｑ７１Ｒ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｑ１５９Ｌ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ
＿Ｋ１５７Ｎ）、（Ｎ３７Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ＿Ｋ１６０Ｅ）、
（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ａ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｒ７４Ｑ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ｒ９８Ｑ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｒ１２９Ｑ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ）、
（Ｐ４８Ｓ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｌ１５７Ｎ）、
（Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ａ１４２Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｓ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ｔ＿Ｉ４９Ｖ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｈ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ
＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ａ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｗ２３Ｌ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｒ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１６１Ｔ）、
（Ｗ２３Ｒ＿Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）、
（Ｈ３６Ｌ＿Ｐ４８Ａ＿Ｒ５１Ｌ＿Ｌ８４Ｆ＿Ａ１０６Ｖ＿Ｄ１０８Ｎ＿Ｈ１２３Ｙ＿Ａ１４２Ｎ＿Ｓ１４６Ｃ＿Ｄ１４７Ｙ＿Ｒ１５２Ｐ＿Ｅ１５５Ｖ＿Ｉ１５６Ｆ＿Ｋ１５７Ｎ）。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を高める１つまたは複数の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される任意の融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性の低減されたＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される任意の融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を持たないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と呼ばれる二重鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有し得る。
アデノシンデアミナーゼ
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質はアデノシンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基中のアデニンを脱アミノ化することができる。アデノシンデアミナーゼは、任意の適した生物（例えば、大腸菌）由来としてよい。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供されるいずれかの変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ内の変異）に対応する１つまたは複数の変異を含む天然のアデノシンデアミナーゼである。当業者は、任意の相同なタンパク質中の対応する残基を、例えば、配列のアラインメントおよび相同な残基の決定によって特定することができるものとなる。したがって、当業者は、本明細書に記載されるいずれかの変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ内に特定されたいずれかの変異）に対応する任意の天然の（例えば、ｅｃＴａｄＡとの相同性を有する）アデノシンデアミナーゼ内の変異を生成することができるものとなる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは原核生物由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは細菌由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィムリウム、シェワネラ・プトレファシエンス、ヘモフィルス・インフルエンザ、カウロバクター・クレセンタス、またはバチルス・サブチリス由来である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは大腸菌由来である。
また本明細書に提供されるのは、効率（＞５０～６０％）および特異性の増加したアデノシンデアミナーゼバリアントである。具体的には、本明細書に記載されるアデノシンデアミナーゼバリアントは、ポリヌクレオチド内の所望の塩基を編集する可能性が高く、変更を意図されない（すなわち、「バイスタンダー」の）塩基を編集する可能性が低い。一部の実施形態では、本発明の核酸塩基エディターは、以下の配列に変更を含むアデノシンデアミナーゼバリアントである：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
（ＴａｄＡ＊７．１０とも称する）。具体的な実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、下記の変更のうち１つまたは複数を含む：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、およびＱ１５４Ｒ。変更Ｙ１２３Ｈとは、Ｙ１２３Ｈ ＴａｄＡ（野生型）に戻ったＴａｄＡ＊７．１０内の変更Ｈ１２３Ｙを指す。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊７．１０は、下記の変更を含む：Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ。具体的な実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは、残基１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、および１５７で始まるＣ末端に欠失を含む。
他の実施形態では、塩基エディターは、以下の変更のうち１つまたは複数を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含む単量体である：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡ＊８）は、以下の変更を含む単量体である：Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ。他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼと、１つまたは複数の以下の変更を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、以下の変更を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である：Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ。
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片を含むかまたはそれから実質的になるＴａｄＡ＊８である：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は切詰型である。一部の実施形態では、切詰型ＴａｄＡ＊８は、完全長ＴａｄＡ＊８に比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠いている。一部の実施形態では、切詰型ＴａｄＡ＊８は、完全長ＴａｄＡ＊８に比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠いている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは完全長ＴａｄＡ＊８である。
一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、ＴａｄＡ＊８．２４、ＴａｄＡ＊８．２５、またはＴａｄＡ＊８．２６である。
他の実施形態では、本開示の塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に比べて以下の変更：Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／もしくはＤ１６７Ｎのうち１つもしくは複数、または別のＴａｄＡ中に対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）を含む単量体である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアント（ＴａｄＡ＊８）は、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に比べてＲ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎからなる群から選択される変更の組合せ、または別のＴａｄＡ中の対応する変異を含む、単量体である。
他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に比べて以下の変更：Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／もしくはＤ１６７Ｎのうち１つもしくは複数、または別のＴａｄＡ中に対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である。他の実施形態では、塩基エディターは、野生型アデノシンデアミナーゼと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に比べてＲ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎからなる群から選択される変更の組合せ、または別のＴａｄＡ中の対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である。
他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に比べて以下の変更：Ｒ２６Ｃ、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉおよび／もしくはＤ１６７Ｎのうち１つもしくは複数、または別のＴａｄＡ中に対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊７．１０ドメインと、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ参照配列に比べてＲ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｒ２６Ｃ＋Ａ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎ；Ｖ８８Ａ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｆ１４９Ｙ；およびＡ１０９Ｓ＋Ｔ１１１Ｒ＋Ｄ１１９Ｎ＋Ｈ１２２Ｎ＋Ｙ１４７Ｄ＋Ｆ１４９Ｙ＋Ｔ１６６Ｉ＋Ｄ１６７Ｎからなる群から選択される変更の組合せ、または別のＴａｄＡ中の対応する変異を含むアデノシンデアミナーゼバリアントドメイン（例えば、ＴａｄＡ＊８）とを含む、ヘテロ二量体である。
一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、表５Ａに示されるようなバリアントである。表５Ａは、ＴａｄＡアミノ酸配列内のある特定のアミノ酸位置の番号、およびＴａｄＡ－７．１０アデノシンデアミナーゼ内のこれらの位置に存在するアミノ酸を示す。また、表５Ａは、その全体の内容を参照により本明細書に組み込まれるM. Richter et al., 2020, Nature Biotechnology, doi.org/10.1038/s41587-020-0453-zに記載されるようなファージ支援型非連続性性進化（ＰＡＮＣＥ）およびファージ支援型連続性進化（ＰＡＣＥ）後の、ＴａｄＡ－７．１０に比したＴａｄＡバリアント内のアミノ酸変化を示す。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ＴａｄＡ＊８ａ、ＴａｄＡ＊８ｂ、ＴａｄＡ＊８ｃ、ＴａｄＡ＊８ｄ、またはＴａｄＡ＊８ｅである。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８はＴａｄＡ＊８ｅである。
Figure 2022545950000017
一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基中のアデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、アデニンデアミナーゼは、本明細書に提供されるいずれかの変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ内の変異）に対応する１つまたは複数の変異を含む天然のアデノシンデアミナーゼである。当業者は、任意の相同なタンパク質内の対応する残基を、例えば、配列のアラインメントおよび相同な残基の決定によって特定することができるものとなる。したがって、当業者は、本明細書に記載されるいずれかの変異（例えば、ｅｃＴａｄＡ内に特定されたいずれかの変異）に対応する任意の天然の（例えば、ｅｃＴａｄＡとの相同性を有する）アデノシンデアミナーゼ内の変異を生成することができるものとなる。
一部の実施形態では、ＮＧＴ ＰＡＭへの特異性を有するアデノシンデアミナーゼ塩基エディターが、下記の表５Ｂに示されるように生成されてもよい。
Figure 2022545950000018
一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントはバリアント１である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントはバリアント２である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントはバリアント３である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントはバリアント４である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントはバリアント５である。一部の実施形態では、ＮＧＴＮバリアントはバリアント６である。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼバリアント（例えばＴａｄＡ＊８）に連結されている野生型ＴａｄＡを含み、このバリアントは、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている。具体的な実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡ＊８ドメインを含む。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とを含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。例示的なＴａｄＡアミノ酸配列は以下を含む：
ＴａｄＡ（ｗｔ）：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD
ＴａｄＡ＊７．１０：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
ＴａｄＡ＊８：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD。
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書に示されるいずれかのアデノシンデアミナーゼに規定されたいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に示されるアデノシンデアミナーゼが、１つまたは複数の変異（例えば、本明細書に示されるいずれかの変異）を含み得ることを認識するべきである。本開示は、ある特定のパーセント同一性に加えて、本明細書に記載されるいずれかの変異またはそれらの組合せを有する、任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に示されるいずれかのアデノシンデアミナーゼに比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれを超える変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、当技術分野に公知のまたは本明細書に記載されるいずれか１つのアミノ酸配列と比べて、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個同一の隣接したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、ボールド体で示される以下の任意の位置に１つまたは複数の変異を含む。他の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は、下線により示される任意の位置に１つまたは複数の変異を含む：
MSEVEFSHEY WMRHALTLAK RARDEREVPV GAVLVLNNRV IGEGWNRAIG 50
LHDPTAHAEI MALRQGGLVM QNYRLIDATL YVTFEPCVMC AGAMIHSRIG 100
RVVFGVRNAK TGAAGSLMDV LHYPGMNHRV EITEGILADE CAALLCYFFR 150
MPRQVFNAQK KAQSSTD
例えば、ＴａｄＡ＊８は、アミノ酸位置８２および／または１６６に変更（例えば、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ）を単独で含むか、または以下：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、およびＱ１５４Ｒのいずれか１つもしくは複数との組合せを含む。具体的な実施形態では、以下の変更が作製される：Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ＊８であり、以下の配列またはアデノシンデアミナーゼ活性を有するその断片を含むか、またはそれから本質的に成る：
MSEVEFSHEY WMRHALTLAK RARDEREVPV GAVLVLNNRV IGEGWNRAIG
LHDPTAHAEI MALRQGGLVM QNYRLIDATL YVTFEPCVMC AGAMIHSRIG
RVVFGVRNAK TGAAGSLMDV LHYPGMNHRV EITEGILADE CAALLCTFFR
MPRQVFNAQK KAQSSTD
一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊８は切詰型である。一部の実施形態では、切詰型ＴａｄＡ＊８は、完全長ＴａｄＡ＊８に比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ末端アミノ酸残基を欠いている。一部の実施形態では、切詰型ＴａｄＡ＊８は、完全長ＴａｄＡ＊８に比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠いている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼバリアントは完全長ＴａｄＡ＊８である。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載のアデノシンデアミナーゼバリアント（例えばＴａｄＡ＊８）に連結されている野生型ＴａｄＡを含み、このバリアントは、Ｃａｓ９ニッカーゼに連結されている。具体的な実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、単量体として提供される）単一のＴａｄＡ＊８ドメインを含む。他の実施形態では、塩基エディターは、ＴａｄＡ＊８とＴａｄＡ（ｗｔ）とを含み、これらはヘテロ二量体を形成することができる。
ＣからＴへの編集
一部の実施形態では、本明細書に開示される塩基エディターは、ポリヌクレオチドの標的シチジン（Ｃ）塩基を脱アミノ化してチミンの塩基対形成特性を有するウリジン（Ｕ）を産生することのできるデアミナーゼを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、例えば、ポリヌクレオチドが二本鎖（例えば、ＤＮＡ）である場合、次いで、ウリジン塩基をチミジン塩基に（例えば、細胞性修復機構によって）置換して、Ｃ：ＧからＴ：Ａへの遷移を起こすことができる。他の実施形態では、塩基エディターによる核酸内でのＣからＵへの脱アミノ化は、ＵからＴへの置換に付随することはない。
Ｕを生じるためのポリヌクレオチド中の標的Ｃの脱アミノ化は、本明細書に記載の塩基エディターによって実行され得る塩基編集の一種の非限定的な一例である。別の例では、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、シトシン（Ｃ）塩基からグアニン（Ｇ）塩基への変換を媒介することができる。例えば、塩基エディターのシチジンデアミナーゼドメインによるシチジンの脱アミノ化によって産生されるポリヌクレオチドのＵは、脱塩基部位を産生する塩基除去修復機構によって（例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）ドメインによって）、ポリヌクレオチドから切除することができる。次いで、脱塩基部位の反対側の核酸塩基を（例えば、塩基修復機構によって）Ｃなどの別の塩基に、例えば損傷乗り越えポリメラーゼによって置換することができる。脱塩基部位の反対の核酸塩基をＣに置き換えるのが典型的ではあるものの、他の置換（例えば、Ａ、Ｇ、またはＴ）も起こり得る。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の塩基エディターは、ポリヌクレオチド中で標的ＣからＵに脱アミノ化することができる脱アミノ化ドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン）を含む。さらに、下記に記載されるように、塩基エディターは、脱アミノ化の結果起こるＵの変換を促進する追加のドメインを含み得るが、一部の実施形態では、この脱アミノ化は、ＴまたはＧへのものである。例えば、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、ＣからＴへの塩基編集事象と競合するＵからＴへの置換を媒介する、ウラシルグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）ドメインを含み得る。別の例では、損傷乗り越えポリメラーゼが、脱塩基部位の反対のＣの組込みを促進し得ることから（すなわち、ＣからＧへの塩基編集事象と競合する脱塩基部位でのＧの組込みを結果として生じる）、塩基エディターは、ＣからＧへの塩基編集の効率を高める損傷乗り越えポリメラーゼを組み込み得る。
シチジンデアミナーゼをドメインとして含む塩基エディターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む任意のポリヌクレオチド中の標的Ｃを、脱アミノ化することができる。典型的には、シチジンデアミナーゼは、ポリヌクレオチドの一本鎖部分の状況に配置されたＣ核酸塩基を触媒する。一部の実施形態では、標的Ｃを含む全ポリヌクレオチドは一本鎖とされ得る。例えば、塩基エディター内に組み込まれたシチジンデアミナーゼは、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド内で標的Ｃを脱アミノ化し得る。他の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターは、二本鎖ポリヌクレオチドに作用し得るが、標的Ｃは、脱アミノ化反応時に一本鎖状態にあるポリヌクレオチドの一部に配置され得る。例えば、ＮＡＧＰＢドメインがＣａｓ９ドメインを含む実施形態では、いくつかのヌクレオチドは、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－標的ＤＮＡ複合体の形成の間に塩基対形成されないままとされ得、結果としてＣａｓ９「Ｒループ複合体」を形成する。これらの塩基対形成されないヌクレオチドは、一本鎖特異的ヌクレオチドデアミナーゼ酵素（例えば、シチジンデアミナーゼ）の基質としての役割を果たす一本鎖ＤＮＡのバブルを形成し得る。
一部の実施形態では、塩基エディターのシチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼの全部または一部を含み得る。ＡＰＯＢＥＣは、進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリーである。このファミリーのメンバーは、ＣからＵへの編集酵素である。ＡＰＯＢＥＣ様タンパク質のＮ末端ドメインは触媒ドメインであるのに対し、Ｃ末端ドメインは疑似触媒ドメインである。さらに具体的には、触媒ドメインは、亜鉛依存性シチジンデアミナーゼドメインであり、シチジンの脱アミノ化に重要である。ＡＰＯＢＥＣファミリーメンバーとしては、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（「ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ」は今ではこれを指す）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、および活性化誘導型（シチジン）デアミナーゼが挙げられる。一部の実施形態では、ＡＰＯＢＥＣファミリーのメンバーとしては、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ｒＡＰＯＢＥＣ１にＡＰＯＢＥＣ１配列を置き換えられたＢＥ４、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＢＯＢＥＣ１にＡＰＯＢＥＣ１配列を置き換えられたＢＥ４、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１にＡＰＯＢＥＣ１配列を置き換えられたＢＥ４；Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３ＦにＡＰＯＢＥＣ１配列を置き換えられたＢＥ４；ＡｍＡＰＯＢＥＣ１にＡＰＯＢＥＣ１配列を置き換えられたＢＥ４；ＳｓＡＰＯＢＥＣ２にＡＰＯＢＥＣ１配列を置き換えられたＢＥ４が挙げられる。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼの全部または一部を含む。一 部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼの全部または一部を含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、活性化誘導型デアミナーゼ（ＡＩＤ）の全部または一部を含む。一部の実施形態では塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）の全部または一部を含む。塩基エディターが任意の適した生物（例えば、ヒトまたはラット）由来のデアミナーゼを含み得ることを認識するべきである。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウス由来する。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインは、ラットに由来する（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１）。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインはヒトＡＰＯＢＥＣ１である。一部の実施形態では、塩基エディターのデアミナーゼドメインはｐｍＣＤＡ１である。
ＰｍＣＤＡ１のアミノ酸配列および核酸配列を本明細書中、下記に示す。
＞ｔｒ｜Ａ５Ｈ７１８｜Ａ５Ｈ７１８＿ＰＥＴＭＡ シトシン デアミナーゼ ＯＳ＝ウミヤツメ ＯＸ＝７７５７ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１ アミノ酸配列：
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAV
核酸配列：＞ＥＦ０９４８２２．１ ウミヤツメ単離ＰｍＣＤＡ．２１シトシンデアミナーゼｍＲＮＡ、完全コード配列：
TGACACGACACAGCCGTGTATATGAGGAAGGGTAGCTGGATGGGGGGGGGGGGAATACGTTCAGAGAGGACATTAGCGAGCGTCTTGTTGGTGGCCTTGAGTCTAGACACCTGCAGACATGACCGACGCTGAGTACGTGAGAATCCATGAGAAGTTGGACATCTACACGTTTAAGAAACAGTTTTTCAACAACAAAAAATCCGTGTCGCATAGATGCTACGTTCTCTTTGAATTAAAACGACGGGGTGAACGTAGAGCGTGTTTTTGGGGCTATGCTGTGAATAAACCACAGAGCGGGACAGAACGTGGAATTCACGCCGAAATCTTTAGCATTAGAAAAGTCGAAGAATACCTGCGCGACAACCCCGGACAATTCACGATAAATTGGTACTCATCCTGGAGTCCTTGTGCAGATTGCGCTGAAAAGATCTTAGAATGGTATAACCAGGAGCTGCGGGGGAACGGCCACACTTTGAAAATCTGGGCTTGCAAACTCTATTACGAGAAAAATGCGAGGAATCAAATTGGGCTGTGGAACCTCAGAGATAACGGGGTTGGGTTGAATGTAATGGTAAGTGAACACTACCAATGTTGCAGGAAAATATTCATCCAATCGTCGCACAATCAATTGAATGAGAATAGATGGCTTGAGAAGACTTTGAAGCGAGCTGAAAAACGACGGAGCGAGTTGTCCATTATGATTCAGGTAAAAATACTCCACACCACTAAGAGTCCTGCTGTTTAAGAGGCTATGCGGATGGTTTTC
ヒト活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のコード配列（ＣＤＳ）のアミノ酸および核酸配列を下記に示す。
>ｔｒ｜Ｑ６ＱＪ８０｜Ｑ６ＱＪ８０＿ヒト活性化誘導型シチジンデアミナーゼ ＯＳ＝ヒト ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＡＩＣＤＡ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１ アミノ酸配列：
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELL
FLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRK
AEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKAPV
ヒト活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のコード配列（ＣＤＳ）のアミノ酸配列および核酸配列を下記に示す。
＞ｔｒ｜Ｑ６ＱＪ８０｜Ｑ６ＱＪ８０＿ヒト活性化誘導型シチジンデアミナーゼ ＯＳ＝ヒト（Homo sapiens） ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＡＩＣＤＡ ＰＥ＝２ ＳＶ＝１ アミノ酸配列：
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELL
FLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRK
AEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKAPV
核酸配列：＞ＮＧ＿０１１５８８．１：５００１－１５６８１ ヒト 活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、１２番染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ（ＬＲＧ＿１７）：
AGAGAACCATCATTAATTGAAGTGAGATTTTTCTGGCCTGAGACTTGCAGGGAGGCAAGAAGACACTCTGGACACCACTATGGACAGGTAAAGAGGCAGTCTTCTCGTGGGTGATTGCACTGGCCTTCCTCTCAGAGCAAATCTGAGTAATGAGACTGGTAGCTATCCCTTTCTCTCATGTAACTGTCTGACTGATAAGATCAGCTTGATCAATATGCATATATATTTTTTGATCTGTCTCCTTTTCTTCTATTCAGATCTTATACGCTGTCAGCCCAATTCTTTCTGTTTCAGACTTCTCTTGATTTCCCTCTTTTTCATGTGGCAAAAGAAGTAGTGCGTACAATGTACTGATTCGTCCTGAGATTTGTACCATGGTTGAAACTAATTTATGGTAATAATATTAACATAGCAAATCTTTAGAGACTCAAATCATGAAAAGGTAATAGCAGTACTGTACTAAAAACGGTAGTGCTAATTTTCGTAATAATTTTGTAAATATTCAACAGTAAAACAACTTGAAGACACACTTTCCTAGGGAGGCGTTACTGAAATAATTTAGCTATAGTAAGAAAATTTGTAATTTTAGAAATGCCAAGCATTCTAAATTAATTGCTTGAAAGTCACTATGATTGTGTCCATTATAAGGAGACAAATTCATTCAAGCAAGTTATTTAATGTTAAAGGCCCAATTGTTAGGCAGTTAATGGCACTTTTACTATTAACTAATCTTTCCATTTGTTCAGACGTAGCTTAACTTACCTCTTAGGTGTGAATTTGGTTAAGGTCCTCATAATGTCTTTATGTGCAGTTTTTGATAGGTTATTGTCATAGAACTTATTCTATTCCTACATTTATGATTACTATGGATGTATGAGAATAACACCTAATCCTTATACTTTACCTCAATTTAACTCCTTTATAAAGAACTTACATTACAGAATAAAGATTTTTTAAAAATATATTTTTTTGTAGAGACAGGGTCTTAGCCCAGCCGAGGCTGGTCTCTAAGTCCTGGCCCAAGCGATCCTCCTGCCTGGGCCTCCTAAAGTGCTGGAATTATAGACATGAGCCATCACATCCAATATACAGAATAAAGATTTTTAATGGAGGATTTAATGTTCTTCAGAAAATTTTCTTGAGGTCAGACAATGTCAAATGTCTCCTCAGTTTACACTGAGATTTTGAAAACAAGTCTGAGCTATAGGTCCTTGTGAAGGGTCCATTGGAAATACTTGTTCAAAGTAAAATGGAAAGCAAAGGTAAAATCAGCAGTTGAAATTCAGAGAAAGACAGAAAAGGAGAAAAGATGAAATTCAACAGGACAGAAGGGAAATATATTATCATTAAGGAGGACAGTATCTGTAGAGCTCATTAGTGATGGCAAAATGACTTGGTCAGGATTATTTTTAACCCGCTTGTTTCTGGTTTGCACGGCTGGGGATGCAGCTAGGGTTCTGCCTCAGGGAGCACAGCTGTCCAGAGCAGCTGTCAGCCTGCAAGCCTGAAACACTCCCTCGGTAAAGTCCTTCCTACTCAGGACAGAAATGACGAGAACAGGGAGCTGGAAACAGGCCCCTAACCAGAGAAGGGAAGTAATGGATCAACAAAGTTAACTAGCAGGTCAGGATCACGCAATTCATTTCACTCTGACTGGTAACATGTGACAGAAACAGTGTAGGCTTATTGTATTTTCATGTAGAGTAGGACCCAAAAATCCACCCAAAGTCCTTTATCTATGCCACATCCTTCTTATCTATACTTCCAGGACACTTTTTCTTCCTTATGATAAGGCTCTCTCTCTCTCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAACACACACCCCGCCAACCAAGGTGCATGTAAAAAGATGTAGATTCCTCTGCCTTTCTCATCTACACAGCCCAGGAGGGTAAGTTAATATAAGAGGGATTTATTGGTAAGAGATGATGCTTAATCTGTTTAACACTGGGCCTCAAAGAGAGAATTTCTTTTCTTCTGTACTTATTAAGCACCTATTATGTGTTGAGCTTATATATACAAAGGGTTATTATATGCTAATATAGTAATAGTAATGGTGGTTGGTACTATGGTAATTACCATAAAAATTATTATCCTTTTAAAATAAAGCTAATTATTATTGGATCTTTTTTAGTATTCATTTTATGTTTTTTATGTTTTTGATTTTTTAAAAGACAATCTCACCCTGTTACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCAATCATAGCTTTCTGCAGTCTTGAACTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGTTGGGATACAGTCATGAGCCACTGCATCTGGCCTAGGATCCATTTAGATTAAAATATGCATTTTAAATTTTAAAATAATATGGCTAATTTTTACCTTATGTAATGTGTATACTGGCAATAAATCTAGTTTGCTGCCTAAAGTTTAAAGTGCTTTCCAGTAAGCTTCATGTACGTGAGGGGAGACATTTAAAGTGAAACAGACAGCCAGGTGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTCTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGATCGCTTGAGCCCTGGAGTTCAAGACCAGCCTGAGCAACATGGCAAAACGCTGTTTCTATAACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCATGTGCCTGTGGTCCCAGCTACTAGGGGGCTGAGGCAGGAGAATCGTTGGAGCCCAGGAGGTCAAGGCTGCACTGAGCAGTGCTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGGACCAGACCTTGCCTCAAAAAAATAAGAAGAAAAATTAAAAATAAATGGAAACAACTACAAAGAGCTGTTGTCCTAGATGAGCTACTTAGTTAGGCTGATATTTTGGTATTTAACTTTTAAAGTCAGGGTCTGTCACCTGCACTACATTATTAAAATATCAATTCTCAATGTATATCCACACAAAGACTGGTACGTGAATGTTCATAGTACCTTTATTCACAAAACCCCAAAGTAGAGACTATCCAAATATCCATCAACAAGTGAACAAATAAACAAAATGTGCTATATCCATGCAATGGAATACCACCCTGCAGTACAAAGAAGCTACTTGGGGATGAATCCCAAAGTCATGACGCTAAATGAAAGAGTCAGACATGAAGGAGGAGATAATGTATGCCATACGAAATTCTAGAAAATGAAAGTAACTTATAGTTACAGAAAGCAAATCAGGGCAGGCATAGAGGCTCACACCTGTAATCCCAGCACTTTGAGAGGCCACGTGGGAAGATTGCTAGAACTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAACACAGTGAAACTCCATTCTCCACAAAAATGGGAAAAAAAGAAAGCAAATCAGTGGTTGTCCTGTGGGGAGGGGAAGGACTGCAAAGAGGGAAGAAGCTCTGGTGGGGTGAGGGTGGTGATTCAGGTTCTGTATCCTGACTGTGGTAGCAGTTTGGGGTGTTTACATCCAAAAATATTCGTAGAATTATGCATCTTAAATGGGTGGAGTTTACTGTATGTAAATTATACCTCAATGTAAGAAAAAATAATGTGTAAGAAAACTTTCAATTCTCTTGCCAGCAAACGTTATTCAAATTCCTGAGCCCTTTACTTCGCAAATTCTCTGCACTTCTGCCCCGTACCATTAGGTGACAGCACTAGCTCCACAAATTGGATAAATGCATTTCTGGAAAAGACTAGGGACAAAATCCAGGCATCACTTGTGCTTTCATATCAACCATGCTGTACAGCTTGTGTTGCTGTCTGCAGCTGCAATGGGGACTCTTGATTTCTTTAAGGAAACTTGGGTTACCAGAGTATTTCCACAAATGCTATTCAAATTAGTGCTTATGATATGCAAGACACTGTGCTAGGAGCCAGAAAACAAAGAGGAGGAGAAATCAGTCATTATGTGGGAACAACATAGCAAGATATTTAGATCATTTTGACTAGTTAAAAAAGCAGCAGAGTACAAAATCACACATGCAATCAGTATAATCCAAATCATGTAAATATGTGCCTGTAGAAAGACTAGAGGAATAAACACAAGAATCTTAACAGTCATTGTCATTAGACACTAAGTCTAATTATTATTATTAGACACTATGATATTTGAGATTTAAAAAATCTTTAATATTTTAAAATTTAGAGCTCTTCTATTTTTCCATAGTATTCAAGTTTGACAATGATCAAGTATTACTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTTTTGGTCTTGTTGCCCATGCTGGAGTGGAATGGCATGACCATAGCTCACTGCAACCTCCACCTCCTGGGTTCAAGCAAAGCTGTCGCCTCAGCCTCCCGGGTAGATGGGATTACAGGCGCCCACCACCACACTCGGCTAATGTTTGTATTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAGAGGATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGATGTAGGCCACTGCGCCCGGCCAAGTATTGCTCTTATACATTAAAAAACAGGTGTGAGCCACTGCGCCCAGCCAGGTATTGCTCTTATACATTAAAAAATAGGCCGGTGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAAGCCAAGGCGGGCAGAACACCCGAGGTCAGGAGTCCAAGGCCAGCCTGGCCAAGATGGTGAAACCCCGTCTCTATTAAAAATACAAACATTACCTGGGCATGATGGTGGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGGATCCGCGGAGCCTGGCAGATCTGCCTGAGCCTGGGAGGTTGAGGCTACAGTAAGCCAAGATCATGCCAGTATACTTCAGCCTGGGCGACAAAGTGAGACCGTAACAAAAAAAAAAAAATTTAAAAAAAGAAATTTAGATCAAGATCCAACTGTAAAAAGTGGCCTAAACACCACATTAAAGAGTTTGGAGTTTATTCTGCAGGCAGAAGAGAACCATCAGGGGGTCTTCAGCATGGGAATGGCATGGTGCACCTGGTTTTTGTGAGATCATGGTGGTGACAGTGTGGGGAATGTTATTTTGGAGGGACTGGAGGCAGACAGACCGGTTAAAAGGCCAGCACAACAGATAAGGAGGAAGAAGATGAGGGCTTGGACCGAAGCAGAGAAGAGCAAACAGGGAAGGTACAAATTCAAGAAATATTGGGGGGTTTGAATCAACACATTTAGATGATTAATTAAATATGAGGACTGAGGAATAAGAAATGAGTCAAGGATGGTTCCAGGCTGCTAGGCTGCTTACCTGAGGTGGCAAAGTCGGGAGGAGTGGCAGTTTAGGACAGGGGGCAGTTGAGGAATATTGTTTTGATCATTTTGAGTTTGAGGTACAAGTTGGACACTTAGGTAAAGACTGGAGGGGAAATCTGAATATACAATTATGGGACTGAGGAACAAGTTTATTTTATTTTTTGTTTCGTTTTCTTGTTGAAGAACAAATTTAATTGTAATCCCAAGTCATCAGCATCTAGAAGACAGTGGCAGGAGGTGACTGTCTTGTGGGTAAGGGTTTGGGGTCCTTGATGAGTATCTCTCAATTGGCCTTAAATATAAGCAGGAAAAGGAGTTTATGATGGATTCCAGGCTCAGCAGGGCTCAGGAGGGCTCAGGCAGCCAGCAGAGGAAGTCAGAGCATCTTCTTTGGTTTAGCCCAAGTAATGACTTCCTTAAAAAGCTGAAGGAAAATCCAGAGTGACCAGATTATAAACTGTACTCTTGCATTTTCTCTCCCTCCTCTCACCCACAGCCTCTTGATGAACCGGAGGAAGTTTCTTTACCAATTCAAAAATGTCCGCTGGGCTAAGGGTCGGCGTGAGACCTACCTGTGCTACGTAGTGAAGAGGCGTGACAGTGCTACATCCTTTTCACTGGACTTTGGTTATCTTCGCAATAAGGTATCAATTAAAGTCGGCTTTGCAAGCAGTTTAATGGTCAACTGTGAGTGCTTTTAGAGCCACCTGCTGATGGTATTACTTCCATCCTTTTTTGGCATTTGTGTCTCTATCACATTCCTCAAATCCTTTTTTTTATTTCTTTTTCCATGTCCATGCACCCATATTAGACATGGCCCAAAATATGTGATTTAATTCCTCCCCAGTAATGCTGGGCACCCTAATACCACTCCTTCCTTCAGTGCCAAGAACAACTGCTCCCAAACTGTTTACCAGCTTTCCTCAGCATCTGAATTGCCTTTGAGATTAATTAAGCTAAAAGCATTTTTATATGGGAGAATATTATCAGCTTGTCCAAGCAAAAATTTTAAATGTGAAAAACAAATTGTGTCTTAAGCATTTTTGAAAATTAAGGAAGAAGAATTTGGGAAAAAATTAACGGTGGCTCAATTCTGTCTTCCAAATGATTTCTTTTCCCTCCTACTCACATGGGTCGTAGGCCAGTGAATACATTCAACATGGTGATCCCCAGAAAACTCAGAGAAGCCTCGGCTGATGATTAATTAAATTGATCTTTCGGCTACCCGAGAGAATTACATTTCCAAGAGACTTCTTCACCAAAATCCAGATGGGTTTACATAAACTTCTGCCCACGGGTATCTCCTCTCTCCTAACACGCTGTGACGTCTGGGCTTGGTGGAATCTCAGGGAAGCATCCGTGGGGTGGAAGGTCATCGTCTGGCTCGTTGTTTGATGGTTATATTACCATGCAATTTTCTTTGCCTACATTTGTATTGAATACATCCCAATCTCCTTCCTATTCGGTGACATGACACATTCTATTTCAGAAGGCTTTGATTTTATCAAGCACTTTCATTTACTTCTCATGGCAGTGCCTATTACTTCTCTTACAATACCCATCTGTCTGCTTTACCAAAATCTATTTCCCCTTTTCAGATCCTCCCAAATGGTCCTCATAAACTGTCCTGCCTCCACCTAGTGGTCCAGGTATATTTCCACAATGTTACATCAACAGGCACTTCTAGCCATTTTCCTTCTCAAAAGGTGCAAAAAGCAACTTCATAAACACAAATTAAATCTTCGGTGAGGTAGTGTGATGCTGCTTCCTCCCAACTCAGCGCACTTCGTCTTCCTCATTCCACAAAAACCCATAGCCTTCCTTCACTCTGCAGGACTAGTGCTGCCAAGGGTTCAGCTCTACCTACTGGTGTGCTCTTTTGAGCAAGTTGCTTAGCCTCTCTGTAACACAAGGACAATAGCTGCAAGCATCCCCAAAGATCATTGCAGGAGACAATGACTAAGGCTACCAGAGCCGCAATAAAAGTCAGTGAATTTTAGCGTGGTCCTCTCTGTCTCTCCAGAACGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCCTCCGCTACATCTCGGACTGGGACCTAGACCCTGGCCGCTGCTACCGCGTCACCTGGTTCACCTCCTGGAGCCCCTGCTACGACTGTGCCCGACATGTGGCCGACTTTCTGCGAGGGAACCCCAACCTCAGTCTGAGGATCTTCACCGCGCGCCTCTACTTCTGTGAGGACCGCAAGGCTGAGCCCGAGGGGCTGCGGCGGCTGCACCGCGCCGGGGTGCAAATAGCCATCATGACCTTCAAAGGTGCGAAAGGGCCTTCCGCGCAGGCGCAGTGCAGCAGCCCGCATTCGGGATTGCGATGCGGAATGAATGAGTTAGTGGGGAAGCTCGAGGGGAAGAAGTGGGCGGGGATTCTGGTTCACCTCTGGAGCCGAAATTAAAGATTAGAAGCAGAGAAAAGAGTGAATGGCTCAGAGACAAGGCCCCGAGGAAATGAGAAAATGGGGCCAGGGTTGCTTCTTTCCCCTCGATTTGGAACCTGAACTGTCTTCTACCCCCATATCCCCGCCTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTGAAGATTATTTTTACTGCTGGAATACTTTTGTAGAAAACCACGAAAGAACTTTCAAAGCCTGGGAAGGGCTGCATGAAAATTCAGTTCGTCTCTCCAGACAGCTTCGGCGCATCCTTTTGGTAAGGGGCTTCCTCGCTTTTTAAATTTTCTTTCTTTCTCTACAGTCTTTTTTGGAGTTTCGTATATTTCTTATATTTTCTTATTGTTCAATCACTCTCAGTTTTCATCTGATGAAAACTTTATTTCTCCTCCACATCAGCTTTTTCTTCTGCTGTTTCACCATTCAGAGCCCTCTGCTAAGGTTCCTTTTCCCTCCCTTTTCTTTCTTTTGTTGTTTCACATCTTTAAATTTCTGTCTCTCCCCAGGGTTGCGTTTCCTTCCTGGTCAGAATTCTTTTCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAAACAAACAAAAAACCCAAAAAAACTCTTTCCCAATTTACTTTCTTCCAACATGTTACAAAGCCATCCACTCAGTTTAGAAGACTCTCCGGCCCCACCGACCCCCAACCTCGTTTTGAAGCCATTCACTCAATTTGCTTCTCTCTTTCTCTACAGCCCCTGTATGAGGTTGATGACTTACGAGACGCATTTCGTACTTTGGGACTTTGATAGCAACTTCCAGGAATGTCACACACGATGAAATATCTCTGCTGAAGACAGTGGATAAAAAACAGTCCTTCAAGTCTTCTCTGTTTTTATTCTTCAACTCTCACTTTCTTAGAGTTTACAGAAAAAATATTTATATACGACTCTTTAAAAAGATCTATGTCTTGAAAATAGAGAAGGAACACAGGTCTGGCCAGGGACGTGCTGCAATTGGTGCAGTTTTGAATGCAACATTGTCCCCTACTGGGAATAACAGAACTGCAGGACCTGGGAGCATCCTAAAGTGTCAACGTTTTTCTATGACTTTTAGGTAGGATGAGAGCAGAAGGTAGATCCTAAAAAGCATGGTGAGAGGATCAAATGTTTTTATATCAACATCCTTTATTATTTGATTCATTTGAGTTAACAGTGGTGTTAGTGATAGATTTTTCTATTCTTTTCCCTTGACGTTTACTTTCAAGTAACACAAACTCTTCCATCAGGCCATGATCTATAGGACCTCCTAATGAGAGTATCTGGGTGATTGTGACCCCAAACCATCTCTCCAAAGCATTAATATCCAATCATGCGCTGTATGTTTTAATCAGCAGAAGCATGTTTTTATGTTTGTACAAAAGAAGATTGTTATGGGTGGGGATGGAGGTATAGACCATGCATGGTCACCTTCAAGCTACTTTAATAAAGGATCTTAAAATGGGCAGGAGGACTGTGAACAAGACACCCTAATAATGGGTTGATGTCTGAAGTAGCAAATCTTCTGGAAACGCAAACTCTTTTAAGGAAGTCCCTAATTTAGAAACACCCACAAACTTCACATATCATAATTAGCAAACAATTGGAAGGAAGTTGCTTGAATGTTGGGGAGAGGAAAATCTATTGGCTCTCGTGGGTCTCTTCATCTCAGAAATGCCAATCAGGTCAAGGTTTGCTACATTTTGTATGTGTGTGATGCTTCTCCCAAAGGTATATTAACTATATAAGAGAGTTGTGACAAAACAGAATGATAAAGCTGCGAACCGTGGCACACGCTCATAGTTCTAGCTGCTTGGGAGGTTGAGGAGGGAGGATGGCTTGAACACAGGTGTTCAAGGCCAGCCTGGGCAACATAACAAGATCCTGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAGAGAGGGCCGGGCGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGCCGGGCGGATCACCTGTGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCAAAACCCCGTCTGTACTCAAAATGCAAAAATTAGCCAGGCGTGGTAGCAGGCACCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGTGGAGGTTGCAGTAAGCTGAGATCGTGCCGTTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGCAAGACTCTGTCTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAACAATATTTGGGAGAGAAGGATGGGGAAGCATTGCAAGGAAATTGTGCTTTATCCAACAAAATGTAAGGAGCCAATAAGGGATCCCTATTTGTCTCTTTTGGTGTCTATTTGTCCCTAACAACTGTCTTTGACAGTGAGAAAAATATTCAGAATAACCATATCCCTGTGCCGTTATTACCTAGCAACCCTTGCAATGAAGATGA
GCAGATCCACAGGAAAACTTGAATGCACAACTGTCTTATTTTAATCTTATTGTACATAAGTTTGTAAAAGAGTTAAAAATTGTTACTTCATGTATTCATTTATATTTTATATTATTTTGCGTCTAATGATTTTTTATTAACATGATTTCCTTTTCTGATATATTGAAATGGAGTCTCAAAGCTTCATAAATTTATAACTTTAGAAATGATTCTAATAACAACGTATGTAATTGTAACATTGCAGTAATGGTGCTACGAAGCCATTTCTCTTGATTTTTAGTAAACTTTTATGACAGCAAATTTGCTTCTGGCTCACTTTCAATCAGTTAAATAAATGATAAATAATTTTGGAAGCTGTGAAGATAAAATACCAAATAAAATAATATAAAAGTGATTTATATGAAGTTAAAATAAAAAATCAGTATGATGGAATAAACTTG
本開示の態様によるＣａｓ９に融合され得る他の例示的なデアミナーゼを下記に示す。実施形態では、デアミナーゼは活性化誘導型デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣデアミナーゼである。一部の実施形態では、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば、局在化シグナルのないドメイン（核輸送シグナル、細胞質局在化シグナルのない核局在化配列）を用いることができることが認識されるべきである。
ヒトＡＩＤ：
Figure 2022545950000019
（下線：核局在化配列；二重下線：核輸送シグナル）
マウスＡＩＤ：
Figure 2022545950000020
（下線：核局在化配列；二重下線：核輸送シグナル）
イヌＡＩＤ：
Figure 2022545950000021
（下線：核局在化配列；二重下線：核輸送シグナル）
ウシＡＩＤ：
Figure 2022545950000022
（下線：核局在化配列；二重下線：核輸送シグナル）
ラットＡＩＤ：
Figure 2022545950000023
（下線：核局在化配列；二重下線：核輸送シグナル）
ｃｌＡＩＤ（イヌ（Canis lupus familiaris））：
MDSLLMKQRKFLYHFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGHLRNKSGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGYPNLSLRIFAARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENREKTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL
ｂｔＡＩＤ（ウシ（Bos Taurus））：
MDSLLKKQRQFLYQFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSPTSFSLDFGHLRNKAGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGYPNLSLRIFTARLYFCDKERKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL
ｍＡＩＤ（マウス（Mus musculus））：
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL
ＲｒＡ３Ｆ（キンシコウ（Rhinopithecus roxellana））
MKPQIRDHRPNPMEAMYPHIFYFHFENLEKAYGRNETWLCFTVEIIKQYLPVPWKKGVFRNQVDPETHCHAEKCFLSWFCNNTLSPKKNYQVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLAEHSNVKLTIYTARLYYFWDTDYQEGLRSLSEEGASVEIMDYEDFQYCWENFVYDDGEPFKRWKGLKYNFQSLTRRLREILQ
上記のＲｒＡ３Ｆ配列では、本明細書（例えば、実施例３および実施例４）に記載されるようなロイシン（Ｌ）に置換された１３０位のフェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基、すなわちＦ１３０Ｌ変異をボールド体および下線で示す：
ａｍＡＰＯＢＥＣ－１（アメリカアリゲーター（Alligator mississippiensis））
MADSSEKMRGQYISRDTFEKNYKPIDGTKEAHLLCEIKWGKYGKPWLHWCQNQRMNIHAEDYFMNNIF
KAKKHPVHCYVTWYLSWSPCADCASKIVKFLEERPYLKLTIYVAQLYYHTEEENRKGLRLLRSKKVIIRVMDISDYNYCWKVFVSNQNGNEDYWPLQFDPWVKENYSRLLDIFWESKCRSPNPW
ｒＡＰＯＢＥＣ－１（ラット（Rattus norvegicus））：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK
ｍａＡＰＯＢＥＣ－１（ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus））：
MSSETGPVVVDPTLRRRIEPHEFDAFFDQGELRKETCLLYEIRWGGRHNIWRHTGQNTSRHVEINFIEKFTSERYFYPSTRCSIVWFLSWSPCGECSKAITEFLSGHPNVTLFIYAARLYHHTDQRNRQGLRDLISRGVTIRIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEVYWPRYPNLWMRLYALELYCIHLGLPPCLKIKRRHQYPLTFFRLNLQSCHYQRIPPHILWATGFI
ｐｐＡＰＯＢＥＣ－１（オランウータン（Pongo pygmaeus））：
MTSEKGPSTGDPTLRRRIESWEFDVFYDPRELRKETCLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERRFHSSISCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSQHPGVTLVIYVARLFWHMDQRNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLAFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVTWR
ｐｐＡＰＯＢＥＣ－１Ｈ１２２Ａ（オランウータン）
MTSEKGPSTGDPTLRRRIESWEFDVFYDPRELRKETCLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERRFHSSISCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSQHPGVTLVIYVARLFWAMDQRNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLAFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVTWRLK
上記のｐｐＡＰＯＢＥＣ１配列では、１２２位のアミノ酸残基は、本明細書（例えば、実施例３および実施例４）に記載されるように、上記の非変異型ｐｐＡＰＯＢＥＣ１配列中のＨ１２２Ａ変異を反映する。
ｏｃＡＰＯＢＥＣ１（アナウサギ（Oryctolagus cuniculus））：
MASEKGPSNKDYTLRRRIEPWEFEVFFDPQELRKEACLLYEIKWGASSKTWRSSGKNTTNHVEVNFLEKLTSEGRLGPSTCCSITWFLSWSPCWECSMAIREFLSQHPGVTLIIFVARLFQHMDRRNRQGLKDLVTSGVTVRVMSVSEYCYCWENFVNYPPGKAAQWPRYPPRWMLMYALELYCIILGLPPCLKISRRHQKQLTFFSLTPQYCHYKMIPPYILLATGLLQPSVPWR
ｍｄＡＰＯＢＥＣ－１（ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis domestica））：
MNSKTGPSVGDATLRRRIKPWEFVAFFNPQELRKETCLLYEIKWGNQNIWRHSNQNTSQHAEINFMEKFTAERHFNSSVRCSITWFLSWSPCWECSKAIRKFLDHYPNVTLAIFISRLYWHMDQQHRQGLKELVHSGVTIQIMSYSEYHYCWRNFVDYPQGEEDYWPKYPYLWIMLYVLELHCIILGLPPCLKISGSHSNQLALFSLDLQDCHYQKIPYNVLVATGLVQPFVTWR
ｐｐＡＰＯＢＥＣ－２（オランウータン）：
MAQKEEAAAATEAASQNGEDLENLDDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPANFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQGKGGQVQASRGYLEDEHAAAHAEEAFFNTILPAFDPALRYNVTWYVSSSPCAACADRIIKTLSKTKNLRLLILVGRLFMWEELEIQDALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYVWQNFVEQEEGESKAFQPWEDIQENFLYYEEKLADILK
ｂｔＡＰＯＢＥＣ－２（ウシ）：
MAQKEEAAAAAEPASQNGEEVENLEDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPAHYFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQASRGYLEDEHATNHAEEAFFNSIMPTFDPALRYMVTWYVSSSPCAACADRIVKTLNKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALRKLKEAGCRLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
ｓｓＡＰＯＢＥＣ－２（イノシシ（Sus scrofa））
MDPQRLRQWPGPGPASRGGYGQRPRIRNPEEWFHELSPRTFSFHFRNLRFASGRNRSYICCQVEGKNCFFQGIFQNQVPPDPPCHAELCFLSWFQSWGLSPDEHYYVTWFISWSPCCECAAKVAQFLEENRNVSLSLSAARLYYFWKSESREGLRRLSDLGAQVGIMSFQDFQHCWNNFVHNLGMPFQPWKKLHKNYQRLVTELKQILREEPATYGSPQAQGKVRIGSTAAGLRHSHSHTRSEAHLRPNHSSRQHRILNPPREARARTCVLVDASWICYR
ｍＡＰＯＢＥＣ－３－（１）（マウス）：
MQPQRLGPRAGMGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLGYAKGRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFLYWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQIVRFLATHHNLSLDIFSSRLYNVQDPETQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKRLLTNFRYQDSKLQEILRPCYISVPSSSSSTLSNICLTKGLPETRFWVEGRRMDPLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHRMKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVTITCYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFWPWKGLEIISRRTQRRLRRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMS
マウスＡＰＯＢＥＣ－３－（２）：
Figure 2022545950000024
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ラットＡＰＯＢＥＣ－３：
Figure 2022545950000025
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ｈＡＰＯＢＥＣ－３Ａ（ヒト）：
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN
ｈＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ（ヒト）：
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPRLDAKIFRGQVYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYSEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLRKAYGRNESWLCFTMEVVKHHSPVSWKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFWDTDYQEGLRSLSQEGASVEIMGYKDFKYCWENFVYNDDEPFKPWKGLKYNFLFLDSKLQEILE
アカゲザル（Rhesus macaque）ＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
MVEPMDPRTFVSNFNNRPILSGLNTVWLCCEVKTKDPSGPPLDAKIFQGKVYSKAKYHPEMRFLRWFHKWRQLHHDQEYKVTWYVSWSPCTRCANSVATFLAKDPKVTLTIFVARLYYFWKPDYQQALRILCQKRGGPHATMKIMNYNEFQDCWNKFVDGRGKPFKPRNNLPKHYTLLQATLGELLRHLMDPGTFTSNFNNKPWVSGQHETYLCYKVERLHNDTWVPLNQHRGFLRNQAPNIHGFPKGRHAELCFLDLIPFWKLDGQQYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISNNEHVSLCIFAARIYDDQGRYQEGLRALHRDGAKIAMMNYSEFEYCWDTFVDRQGRPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAI（イタリック体：核酸編集ドメイン：下線：細胞質局在化シグナル）
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
Figure 2022545950000026
（イタリック体：核酸編集ドメイン：下線：細胞質局在化シグナル）
ミドリサルＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
Figure 2022545950000027
（イタリック体：核酸編集ドメイン：下線：細胞質局在化シグナル）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｇ：
Figure 2022545950000028
（イタリック体：核酸編集ドメイン：下線：細胞質局在化シグナル）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ：
Figure 2022545950000029
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
Figure 2022545950000030
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ラットＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
MQPQGLGPNAGMGPVCLGCSHRRPYSPIRNPLKKLYQQTFYFHFKNVRYAWGRKNNFLCYEVNGMDCALPVPLRQGVFRKQGHIHAELCFIYWFHDKVLRVLSPMEEFKVTWYMSWSPCSKCAEQVARFLAAHRNLSLAIFSSRLYYYLRNPNYQQKLCRLIQEGVHVAAMDLPEFKKCWNKFVDNDGQPFRPWMRLRINFSFYDCKLQEIFSRMNLLREDVFYLQFNNSHRVKPVQNRYYRRKSYLCYQLERANGQEPLKGYLLYKKGEQHVEILFLEKMRSMELSQVRITCYLTWSPCPNCARQLAAFKKDHPDLILRIYTSRLYFWRKKFQKGLCTLWRSGIHVDVMDLPQFADCWTNFVNPQRPFRPWNELEKNSWRIQRRLRRIKESWGL
ウシＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
DGWEVAFRSGTVLKAGVLGVSMTEGWAGSGHPGQGACVWTPGTRNTMNLLREVLFKQQFGNQPRVPAPYYRRKTYLCYQLKQRNDLTLDRGCFRNKKQRHAERFIDKINSLDLNPSQSYKIICYITWSPCPNCANELVNFITRNNHLKLEIFASRLYFHWIKSFKMGLQDLQNAGISVAVMTHTEFEDCWEQFVDNQSRPFQPWDKLEQYSASIRRRLQRILTAPI
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
MNPQIRNPMEWMYQRTFYYNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIRRGHSNLLWDTGVFRGQMYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLSAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAKFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYNEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEIIRHLMDPDTFTFNFNNDPLVLRRHQTYLCYEVERLDNGTWVLMDQHMGFLCNEAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGQVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFEYCWDTFVYRQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQVRASSLCMVPHRPPPPPQSPGPCLPLCSEPPLGSLLPTGRPAPSLPFLLTASFSFPPPASLPPLPSLSLSPGHLPVPSFHSLTSCSIQPPCSSRIRETEGWASVSKEGRDLG
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ：
Figure 2022545950000031
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ゴリラＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ
Figure 2022545950000032
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：
Figure 2022545950000033
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：
Figure 2022545950000034
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ウシＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：
Figure 2022545950000035
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ：
Figure 2022545950000036
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ：
MALLTAKTFSLQFNNKRRVNKPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGHLKNKKKDHAEIRFINKIKSMGLDETQCYQVTCYLTWSPCPSCAGELVDFIKAHRHLNLRIFASRLYYHWRPNYQEGLLLLCGSQVPVEVMGLPEFTDCWENFVDHKEPPSFNPSEKLEELDKNSQAIKRRLERIKSRSVDVLENGLRSLQLGPVTPSSSIRNSR
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｄ：
Figure 2022545950000037
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－１：
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR
マウスＡＰＯＢＥＣ－１：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK
ラットＡＰＯＢＥＣ－１：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK
ヒトＡＰＯＢＥＣ－２：
MAQKEEAAVATEAASQNGEDLENLDDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPANFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQGKGGQVQASRGYLEDEHAAAHAEEAFFNTILPAFDPALRYNVTWYVSSSPCAACADRIIKTLSKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYVWQNFVEQEEGESKAFQPWEDIQENFLYYEEKLADILK
マウスＡＰＯＢＥＣ－２：
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEVQSKGGQAQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
ラットＡＰＯＢＥＣ－２：
MAQKEEAAEAAAPASQNGDDLENLEDPEKLKELIDLPPFEIVTGVRLPVNFFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQATQGYLEDEHAGAHAEEAFFNTILPAFDPALKYNVTWYVSSSPCAACADRILKTLSKTKNLRLLILVSRLFMWEEPEVQAALKKLKEAGCKLRIMKPQDFEYLWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
ウシＡＰＯＢＥＣ－２：
MAQKEEAAAAAEPASQNGEEVENLEDPEKLKELIELPPFEIVTGERLPAHYFKFQFRNVEYSSGRNKTFLCYVVEAQSKGGQVQASRGYLEDEHATNHAEEAFFNSIMPTFDPALRYMVTWYVSSSPCAACADRIVKTLNKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEIQAALRKLKEAGCRLRIMKPQDFEYIWQNFVEQEEGESKAFEPWEDIQENFLYYEEKLADILK
ウミヤツメ ＣＤＡ１（ｐｍＣＤＡｌ）：
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQ LNENRWLEKTLKRAEKRRSELSFMIQVKILHTTKSPAV
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ Ｄ３１６Ｒ Ｄ３１７Ｒ：
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQVYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKFNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHFMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISFTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ Ａ鎖：
MDPPTFTFNFNNEPWWGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISFTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLD EHSQDLSGRLRAILQ
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ Ａ鎖 Ｄ１２０Ｒ Ｄ１２１Ｒ：
MDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYRRQGRCQEGLRTLAEAGAKISFMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQ
ｈＡＰＯＢＥＣ－４（ヒト）：
MEPIYEEYLANHGTIVKPYYWLSFSLDCSNCPYHIRTGEEARVSLTEFCQIFGFPYGTTFPQTKHLTFYELKTSSGSLVQKGHASSCTGNYIHPESMLFEMNGYLDSAIYNNDSIRHIILYSNNSPCNEANHCCISKMYNFLITYPGITLSIYFSQLYHTEMDFPASAWNREALRSLASLWPRVVLSPISGGIWHSVLHSFISGVSGSHVFQPILTGRALADRHNAYEINAITGVKPYFTDVLLQTKRNPNTKAQEALESYPLNNAFPGQFFQMPSGQLQPNLPPDLRAPVVFVLVPLRDLPPMHMGQNPNKPRNIVRHLNMPQMSFQETKDLGRLPTGRSVEIVEITEQFASSKEADEKKKKKGKK
ｍＡＰＯＢＥＣ－４（マウス）：
MDSLLMKQKKFLYHFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSATSCSLDFGHLRNKSGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVAEFLRWNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIGIMTFKDYFYCWNTFVENRERTFKAWEGLHENSVRLTRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRMLGF
ｒＡＰＯＢＥＣ－４（ラット）：
MEPLYEEYLTHSGTIVKPYYWLSVSLNCTNCPYHIRTGEEARVPYTEFHQTFGFPWSTYPQTKHLTFYELRSSSGNLIQKGLASNCTGSHTHPESMLFERDGYLDSLIFHDSNIRHIILYSNNSPCDEANHCCISKMYNFLMNYPEVTLSVFFSQLYHTENQFPTSAWNREALRGLASLWPQVTLSAISGGIWQSILETFVSGISEGLTAVRPFTAGRTLTDRYNAYEINCITEVKPYFTDALHSWQKENQDQKVWAASENQPLHNTTPAQWQPDMSQDCRTPAVFMLVPYRDLPPIHVNPSPQKPRTVVRHLNTLQLSASKVKALRKSPSGRPVKKEEARKGSTRSQEANETNKSKWKKQTLFIKSNICHLLEREQKKIGILSSWSV
ｍｆＡＰＯＢＥＣ－４（カニクイザル（Macaca fascicularis））：
MEPTYEEYLANHGTIVKPYYWLSFSLDCSNCPYHIRTGEEARVSLTEFCQIFGFPYGTTYPQTKHLTFYELKTSSGSLVQKGHASSCTGNYIHPESMLFEMNGYLDSAIYNNDSIRHIILYCNNSPCNEANHCCISKVYNFLITYPGITLSIYFSQLYHTEMDFPASAWNREALRSLASLWPRVVLSPISGGIWHSVLHSFVSGVSGSHVFQPILTGRALTDRYNAYEINAITGVKPFFTDVLLHTKRNPNTKAQMALESYPLNNAFPGQSFQMTSGIPPDLRAPVVFVLLPLRDLPPMHMGQDPNKPRNIIRHLNMPQMSFQETKDLERLPTRRSVETVEITERFASSKQAEEKTKKKKGKK
ｐｍＣＤＡ－１（ウミヤツメ）：
MAGYECVRVSEKLDFDTFEFQFENLHYATERHRTYVIFDVKPQSAGGRSRRLWGYIINNPNVCHAELILMSMIDRHLESNPGVYAMTWYMSWSPCANCSSKLNPWLKNLLEEQGHTLTMHFSRIYDRDREGDHRGLRGLKHVSNSFRMGVVGRAEVKECLAEYVEASRRTLTWLDTTESMAAKMRRKLFCILVRCAGMRESGIPLHLFTLQTPLLSGRVVWWRV
ｐｍＣＤＡ－２（ウミヤツメ）：
MELREVVDCALASCVRHEPLSRVAFLRCFAAPSQKPRGTVILFYVEGAGRGVTGGHAVNYNKQGTSIHAEVLLLSAVRAALLRRRRCEDGEEATRGCTLHCYSTYSPCRDCVEYIQEFGASTGVRVVIHCCRLYELDVNRRRSEAEGVLRSLSRLGRDFRLMGPRDAIALLLGGRLANTADGESGASGNAWVTETNVVEPLVDMTGFGDEDLHAQVQRNKQIREAYANYASAVSLMLGELHVDPDKFPFLAEFLAQTSVEPSGTPRETRGRPRGASSRGPEIGRQRPADFERALGAYGLFLHPRIVSREADREEIKRDLIVVMRKHNYQGP
ｐｍＣＤＡ－５（ウミヤツメ）：
MAGDENVRVSEKLDFDTFEFQFENLHYATERHRTYVIFDVKPQSAGGRSRRLWGYIINNPNVCHAELILMSMIDRHLESNPGVYAMTWYMSWSPCANCSSKLNPWLKNLLEEQGHTLMMHFSRIYDRDREGDHRGLRGLKHVSNSFRMGVVGRAEVKECLAEYVEASRRTLTWLDTTESMAAKMRRKLFCILVRCAGMRESGMPLHLFT
ｙＣＤ（サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae））:
MVTGGMASKWDQKGMDIAYEEAALGYKEGGVPIGGCLINNKDGSVLGRGHNMRFQKGSATLHGEISTLENCGRLEGKVYKDTTLYTTLSPCDMCTGAIIMYGIPRCVVGENVNFKSKGEKYLQTRGHEVVVVDDERCKKIMKQFIDERPQDWFEDIGE
ｒＡＰＯＢＥＣ－１（デルタ１７７～１８６）：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK
ｒＡＰＯＢＥＣ－１（デルタ２０２～２１３）：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQHYQRLPPHILWATGLK
マウスＡＰＯＢＥＣ－３：
Figure 2022545950000038
（イタリック体：核酸編集ドメイン）
本開示の一部の態様は、本明細書に記載されるいずれかの融合タンパク質のデアミナーゼドメイン触媒活性を、例えばデアミナーゼドメイン中に点変異を作製することによって調節することが、融合タンパク質（例えば、塩基エディター）の処理能力に影響を及ぼすという認識に基づく。例えば、塩基編集融合タンパク質内のデアミナーゼドメインの触媒活性を低減するが除外しない変異によって、標的残基に隣接する残基の脱アミノ化をデアミナーゼドメインが触媒する機会が起こりにくいものとなり、それによって脱アミノ化の枠が狭まるものとなる。この脱アミノ化の枠を狭める能力によって、特異的な標的残基に隣接する残基の望まない脱アミノ化を防止することができ、これにより、オフターゲット効果を減少させるかまたは防止することができる。
例えば、一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１Ｘ、Ｈ１２２Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１１８Ｘ、Ｗ９０Ｘ、Ｗ９０Ｘ、およびＲ１３２Ｘからなる群から選択される１つまたは複数の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み得るが、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１Ｒ、Ｈ１２２Ｒ、Ｒ１２６Ａ、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１１８Ａ、Ｗ９０Ａ、Ｗ９０Ｙ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つもしくは複数の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み得る。
一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６Ｘ、Ｄ３１７Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３１３Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｒ３２６Ｘからなる群から選択される１つもしくは複数の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ内の１つもしくは複数の対応する変異を含み得るが、式中、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、本明細書に提供される任意の融合タンパク質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６Ｒ、Ｄ３１７Ｒ、Ｒ３２０Ａ、Ｒ３２０Ｅ、Ｒ３１３Ａ、Ｗ２８５Ａ、Ｗ２８５Ｙ、Ｒ３２６Ｅからなる群から選択される１つもしくは複数の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ内の１つもしくは複数の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。
一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＨ１２１ＲおよびＨ１２２Ｒ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ内の１つもしくは複数の対応する変異を含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１１８Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ｙ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０ＹおよびＲ１２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＲ１２６ＥおよびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０ＹおよびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｒＡＰＯＢＥＣ１のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。
一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＤ３１６ＲおよびＤ３１７Ｒ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される任意の融合タンパク質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３１３Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ｙ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５ＹおよびＲ３２０Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＲ３２０ＥおよびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５ＹおよびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧのＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み得る。
複数の改変型シチジンデアミナーゼが商業的に利用可能であり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ＳａＢＥ３、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＥＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、およびＹＥＥ－ＢＥ３が挙げられ、それらはＡｄｄ遺伝子（プラスミド８５１６９、８５１７０、８５１７１、８５１７２、８５１７３、８５１７４、８５１７５、８５１７６、８５１７７）から入手可能である。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれたデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼの全部または一部を含む。
ＣからＴへの核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）およびKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)に記載されており、それらの全体の内容はここに参照により組み込まれる。
本明細書に提供される融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼは、シトシンまたは５－メチルシトシンからウラシルまたはチミンに脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼは、ＤＮＡ中でシトシンを脱アミノ化することができる。シチジンデアミナーゼは、任意の適した生物を由来としてもよい。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、本明細書に提供される任意の変異に対応する１つまたは複数の変異を含む天然のシチジンデアミナーゼである。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、５’－ＮＧＣ－３’ＰＡＭへの特異性を有し、本明細書の実施例４および実施例５に記載されるような変異を含むことがある。一部の実施形態では、記載されるような５’－ＮＧＣ－３’ＰＡＭへの特異性を有するシチジンデアミナーゼを含む塩基エディターが提供される。当業者は、任意の相同なタンパク質内の対応する残基を、例えば、配列のアラインメントおよび相同な残基の決定によって特定することができるものとなる。したがって、当業者は、本明細書に記載されるいずれかの変異に対応する任意の天然のシチジンデアミナーゼ内の変異を生成することができるものとなる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは原核生物由来である。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは細菌由来である。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは哺乳動物（例えばヒト）由来である。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、本明細書に規定されたシチジンデアミナーゼのアミノ酸配列のうちいずれか１つに少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に示されるシチジンデアミナーゼが、１つまたは複数の変異（例えば、本明細書に示されるいずれかの変異）を含み得ることを認識するべきである。本開示は、ある特定のパーセント同一性に加えて、本明細書に記載されるいずれかの変異またはそれらの組合せを有する、任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、参照配列または本明細書に示されるいずれかのシチジンデアミナーゼに比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個、またはそれを超える変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、当技術分野に公知のまたは本明細書に記載されるいずれか１つのアミノ酸配列と比べて、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、または少なくとも１７０個同一の隣接したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の融合タンパク質は、２つ以上の核酸編集ドメインを含む。一部の実施形態では、核酸編集ドメインは、ＣからＵへの塩基変化を触媒し得る。一部の実施形態では、核酸編集ドメインはデアミナーゼドメインである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは活性化誘導型デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。一部の実施形態では、デアミナーゼは脊椎動物デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは無脊椎動物デアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスのデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはヒトデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼはラットデアミナーゼであり、例えば、ｒＡＰＯＢＥＣｌである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ウミヤツメ（Petromyzon marinus）シチジンデアミナーゼ１（ｐｍＣＤＡｌ）である。一部の実施形態では、デアミナーゼはヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇである。一部の実施形態では、デアミナーゼはヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇの断片である。一部の実施形態では、デアミナーゼは、Ｄ３１６Ｒ Ｄ３１７Ｒ変異を含むヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇバリアントである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇの断片であり、Ｄ３１６Ｒ Ｄ３１７Ｒ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態では、核酸編集ドメインは、本明細書に記載される任意のデアミナーゼのデアミナーゼドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）、または少なくとも９９．５％同一である。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される融合タンパク質は、融合タンパク質の塩基編集活性を高める１つまたは複数の特徴を含む。例えば、本明細書に提供される任意の融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性の低減されたＣａｓ９ドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供される任意の融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を持たないＣａｓ９ドメイン（ｄＣａｓ９）、またはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と呼ばれる二重鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を切断するＣａｓ９ドメインを有し得る。
ガイドＲＮＡを含むＣａｓ９複合体
本開示の一部の態様は、本明細書に提供される任意の融合タンパク質と、融合タンパク質のＣａｓ９ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９、ヌクレアーゼ活性のＣａｓ９、またはＣａｓ９ニッカーゼ）に結合されているガイドＲＮＡとを含む、複合体を提供する。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、１５～１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に相補的な少なくとも１０個の隣接したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列に相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列はＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物、または動物のゲノム内の配列である。一部の実施形態では、標的配列は、ヒトのゲノム内の配列である。一部の実施形態では、標的配列の３’端は、規準のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）のすぐ隣である。一部の実施形態では、標的配列の３’端は、非規準のＰＡＭ配列（例えば、表１に挙げられた配列または５’－ＮＡＡ－３’）のすぐ隣である。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、目的の遺伝子（例えば、疾患または障害に関連する遺伝子）内の配列に相補的である。
本開示の一部の態様は、本明細書に提供される融合タンパク質または複合体を用いる方法を提供する。例えば、本開示の一部の態様は、本明細書に提供されるいずれかの融合タンパク質に、および少なくとも１つのガイドＲＮＡに、ＤＮＡ分子を接触することを含む方法を提供し、この場合、ガイドＲＮＡは、約１５～１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に相補的な少なくとも１０個の隣接したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列の３’端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列のすぐ隣である。一部の実施形態では、標的配列の３’端は、ＮＧＡ、ＮＧＣＧ、ＮＧＮ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、ＮＧＴＮ、または５’（ＴＴＴＶ）配列のすぐ隣である。
それぞれの配列内の特異的な位置または残基の数が具体的なタンパク質および用いる付番スキームに依存することが理解されよう。付番は、例えば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質自体とで異なる可能性があり、種間の配列の差異は、付番に影響を及ぼすことがある。当業者は、当技術分野に周知される方法によって、例えば、配列のアラインメントおよび相同な残基の決定によって、任意の相同なタンパク質およびその各コード核酸の各残基を特定することができるものとなる。
標的部位、例えば、編集する変異を含む部位を標的として本明細書に開示される任意の融合タンパク質を向けるために、典型的には、融合タンパク質をガイドＲＮＡと併せて共発現することが必要であることが、当業者に明らかとなろう。本明細書の他の箇所にさらに詳細に説明されているように、ガイドＲＮＡは、典型的にはＣａｓ９の結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワークと、Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質に配列特異性を付与するガイド配列とを含む。あるいは、ガイドＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとは、２つの核酸分子として別々に提供されてもよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列が標的配列に相補的な配列を含むという構造を含む。ガイド配列は、典型的には、２０ヌクレオチドの長さである。特異的なゲノム標的部位を標的としてＣａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合タンパク質を向けるのに適したガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づき当業者に明らかになろう。そのような適したガイドＲＮＡ配列は、典型的には、編集する標的ヌクレオチドの上流または下流５０ヌクレオチド以内の核酸配列に相補的なガイド配列を含む。適した特異的な標的配列を標的として任意の所与の融合タンパク質を向けるのに適した一部の例示的なガイドＲＮＡ配列は、本明細書に提供されている。
追加のドメイン
本明細書に記載の塩基エディターは、核酸塩基編集、ポリヌクレオチドの核酸塩基の修飾または変更を促進する一助となる、任意のドメインを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）、核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）、および１つまたは複数の追加のドメインを含む。一部の場合では、追加のドメインは、塩基エディターの酵素機能もしくは触媒機能、塩基エディターの結合機能を促進し得るか、または所望の塩基編集の結果に干渉する可能性のある細胞性機構（例えば酵素）の阻害物質となり得る。
一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）ドメインを含み得る。ＵＧＩドメインは、例えば、Ｃの脱アミノ化によって形成されたＵをＣ核酸塩基に戻す変換を阻害することによって、シチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターの効率を高めることができる。一部の場合では、Ｕ：Ｇヘテロ二重ＤＮＡの存在に対する細胞性ＤＮＡ修復応答は、細胞における核酸塩基編集の効率の減少の原因となりかねない。そのような場合、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、細胞におけるＤＮＡからのＵの除去を触媒し得るが、この除去は、塩基除去修復（ＢＥＲ）を開始し、殆どの場合には結果として、Ｕ：Ｇ対からＣ：Ｇ対への反転を生じ得る。そのような場合、ＢＥＲは、単鎖に結合し、編集された塩基をブロックし、ＵＧＩを阻害し、ＢＥＲを阻害し、編集された塩基を保護し、および／または非編集の鎖の修復を促す、１つまたは複数のドメインを含む塩基エディターにより阻害され得る。そのため、本開示は、ＵＧＩドメインを含む塩基エディター融合タンパク質を想定している。
一部の実施形態では、塩基エディターは、二本鎖切断（ＤＳＢ）結合タンパク質の全部または一部をドメインとして含む。例えば、ＤＳＢ結合タンパク質としては、ＤＳＢの端に結合することができ、分解から保護することができる、バクテリオファージＭｕのＧａｍタンパク質を挙げることができる。その全体の内容をここに参照により組み込まれるKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)を参照されたい。
一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）の全部または一部をドメインとして含み得る。例えば、塩基エディターは、真核ＮＡＰを全部または一部を含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する。一部の場合では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼエータである。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、真核ポリメラーゼアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エータ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミュー、またはニュー構成成分である。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれるＮＡＰまたはその一部は、核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一のアミノ酸配列を含む。
塩基エディターシステム
本明細書に提供される塩基エディターシステムは、（ａ）対象のポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）の標的ヌクレオチド配列を、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターシステムと、少なくとも１つのガイドポリ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）に接触させることであって、上述のドメインが、ポリヌクレオチド結合ドメインに融合され、それによって、本明細書に記載されるような核酸分子内の１つまたは複数の塩基に変化を誘導することができる核酸塩基エディターを形成し、上記標的ヌクレオチド配列が、標的とされた核酸塩基対を含むこと；（ｂ）標的領域の鎖の分離を誘導すること；（ｃ）標的領域の単鎖中、標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換すること；および（ｄ）標的領域の１本以下の鎖を切断することであって、第１の核酸塩基塩基に相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に相補的な第４の核酸塩基に置き換えられることを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は省略されることを認識するべきである。一部の実施形態では、標的とされた核酸塩基対は、１つまたは複数の遺伝子中の複数の核酸塩基対である。一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターシステムは、１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能である。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子に位置する。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、１つまたは複数の遺伝子に位置し、少なくとも１つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。
一部の実施形態では、切断された単鎖（ニック鎖）は、ガイド核酸にハイブリダイズされる。一部の実施形態では、切断された単鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖の反対にある。一部の実施形態では、塩基エディターはＣａｓ９ドメインを含む。一部の実施形態では、第１の塩基はアデニンであり、第２の塩基はＧ、Ｃ、Ａ、またはＴではない。一部の実施形態では、第２の塩基はイノシンである。
本明細書に提供されるような塩基編集システムは、ゲノム編集に新しいアプローチを提供し、このアプローチは、触媒として欠損のあるストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９と、シチジンデアミナーゼと、塩基除去修復の阻害物質とを含有する融合タンパク質を用いて、二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく、ドナーＤＮＡ鋳型を要することなく、ならびに確率論的な挿入および欠失を過剰に誘導することなく、プログラマブルな単一ヌクレオチド（Ｃ→ＴまたはＡ→Ｇ）の変化をＤＮＡに誘導する。
本明細書に提供されるのは、塩基エディターシステムを用いて核酸塩基を編集するためのシステム、組成物、および方法である。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと核酸塩基を編集するための核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）とを含む塩基エディター（ＢＥ）；およびポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに連係するガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインと核酸塩基を編集するための核酸塩基編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）とを含む塩基エディター（ＢＥ）；およびポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに連係するガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルＲＮＡ結合ドメインである。一部の場合では、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとされ得る。一部の実施形態では、用語「シトシンデアミナーゼ」および「シチジンデアミナーゼ」は、互換的に用いられ得る。一部の実施形態では、用語「アデニンデアミナーゼ」および「アデノシンデアミナーゼ」は、互換的に用いられ得る。一部の場合では、デアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼとされ得る。一部の場合では、デアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼとされ得る。核酸塩基編集タンパク質の詳細は、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、そのそれぞれは本明細書に参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。また、全体の内容が参照によりここに組み込まれる、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；およびKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照されたい。
一部の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドを利用して、標的核酸配列を標的としてデアミナーゼを向けてもよい。一部の実施形態では、単一の対のガイドポリヌクレオチドを利用して、標的核酸配列を標的として異なるデアミナーゼを向けてもよい。
塩基エディターシステムの核酸塩基構成成分およびポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合構成成分は、共有結合または非共有結合により互いに会合している。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって、標的ヌクレオチド配列を標的とすることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインに融合または連結することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、非共有結合によりデアミナーゼドメインと相互作用するかまたは会合することによって、標的ヌクレオチド配列を標的としてデアミナーゼドメインを向けることができる。例えば、一部の実施形態では、核酸塩基編集構成成分、例えば、デアミナーゼ構成成分は、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部である追加の異種部分またはドメインと相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる、追加の異種部分またはドメインを含み得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドと相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合するか、相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドと結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーと結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーと結合することが可能であり得る。追加の異種部分はタンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕ Ｃｏｍコートタンパク質ドメイン、滅菌アルファモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。
塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチド構成成分をさらに含んでいてもよい。塩基エディターシステムの構成成分が、共有結合、非共有結合相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組合せを介して、互いに会合し得ることを認識するべきである。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ガイドポリヌクレオチドによって、標的ヌクレオチド配列を標的とすることができる。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターシステムの核酸塩基編集構成成分、例えば、デアミナーゼ構成成分は、ガイドポリヌクレオチドの部分またはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）と相互作用もしくは会合することができるかまたは複合体を形成することができる、追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含み得る。一部の実施形態では、追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、デアミナーゼドメインと融合または連結され得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドと相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合するか、相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドと結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーと結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーと結合することが可能であり得る。追加の異種部分はタンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕ Ｃｏｍコートタンパク質ドメイン、滅菌アルファモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。
一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、塩基除去修復（ＢＥＲ）構成成分の阻害物質をさらに含み得る。塩基エディターシステムの構成成分が、共有結合、非共有結合相互作用、またはそれらの会合および相互作用の任意の組合せを介して、互いに会合し得ることを認識するべきである。ＢＥＲ構成成分の阻害物質は、塩基除去修復阻害物質を含むことがある。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害物質は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）とされ得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害物質は、イノシン塩基除去修復の阻害物質とされ得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害物質は、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインによって、標的ヌクレオチド配列を標的とすることができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、塩基除去修復の阻害物質に融合または連結することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、デアミナーゼドメインおよび塩基除去修復の阻害物質に融合または連結することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインは、非共有結合により塩基除去修復の阻害物質と相互作用するかまたは会合することによって、標的ヌクレオチド配列を標的として塩基除去修復の阻害物質を向けることができる。例えば、一部の実施形態では、塩基除去修復構成成分の阻害物質は、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインの一部である追加の異種部分またはドメインと相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することができる、追加の異種部分またはドメインを含み得る。一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害物質は、ガイドポリヌクレオチドによって、標的ヌクレオチド配列を標的とすることができる。例えば、一部の実施形態では、塩基除去修復の阻害物質は、ガイドポリヌクレオチドの部分またはセグメント（例えば、ポリヌクレオチドモチーフ）と相互作用もしくは会合することができるかまたは複合体を形成することができる、追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）を含み得る。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドの追加の異種部分またはドメイン（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質などのポリヌクレオチド結合ドメイン）は、塩基除去修復の阻害物質と融合または連結され得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドと結合するか、相互作用するか、会合するか、または複合体を形成することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ガイドポリヌクレオチドと結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリペプチドリンカーと結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、ポリヌクレオチドリンカーと結合することが可能であり得る。追加の異種部分はタンパク質ドメインであり得る。一部の実施形態では、追加の異種部分は、Ｋ相同性（ＫＨ）ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質ドメイン、ＰＰ７コートタンパク質ドメイン、ＳｆＭｕ Ｃｏｍコートタンパク質ドメイン、滅菌アルファモチーフ、テロメラーゼＫｕ結合モチーフおよびＫｕタンパク質、テロメラーゼＳｍ７結合モチーフおよびＳｍ７タンパク質、またはＲＮＡ認識モチーフであり得る。
一部の実施形態では、塩基エディターは、編集された鎖の塩基除去修復を阻害する。一部の実施形態では、塩基エディターは、非編集の鎖を保護または結合する。一部の実施形態では、塩基エディターはＵＧＩ活性を有する。一部の実施形態では、塩基エディターは、触媒として不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ニッカーゼ活性を含む。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、ＰＡＭ部位の上流である。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、ＰＡＭ部位の下流である。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。
一部の実施形態では、方法は、規準の（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ部位を必要としない。一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、リンカーまたはスペーサーを含む。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、１～２５アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、５～２０アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸の長さである。
一部の実施形態では、標的領域は、標的の枠を含み、標的の枠は、標的核酸塩基対を含む。一部の実施形態では、標的の枠は、１～１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的の枠は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、標的の枠内である。一部の実施形態では、標的の枠は、塩基対の意図される編集を含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書に提供される任意の塩基エディターを用いて実行される。一部の実施形態では、標的の枠は、脱アミノ化の枠である。
一部の実施形態では、非制限的で例示的なシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）としては、ＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９－ＵＧＩ）、ＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ－ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）－ＵＧＩ）、ＢＥ３－Ｇａｍ、ｓａＢＥ３、ｓａＢＥ４－Ｇａｍ、ＢＥ４、ＢＥ４－Ｇａｍ、ｓａＢＥ４、またはｓａＢ４Ｅ－Ｇａｍが挙げられる。ＢＥ４は、ＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）リンカーを３２アミノ酸に、Ｃａｓ９ｎ－ＵＧＩリンカーを９アミノ酸に延ばし、ＵＧＩの第２のコピーを、別の９－アミノ酸リンカーを有する構築物のＣ末端に添加して単一の塩基エディター構築物とする。塩基エディターｓａＢＥ３およびｓａＢＥ４は、Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）をより小さなＳ．アウレウスＣａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）に置き換えられて有する。ＢＥ３－Ｇａｍ、ｓａＢＥ３－Ｇａｍ、ＢＥ４－Ｇａｍ、およびｓａＢＥ４－Ｇａｍでは、１７４残基のＧａｍタンパク質が１６アミノ酸のＸＴＥＮリンカーを介して、ＢＥ３、ｓａＢＥ３、ＢＥ４、およびｓａＢＥ４のＮ末端に融合されている。
一部の実施形態では、アデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）は、ＤＮＡにおいてアデニンを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＢＥ３のＡＰＯＢＥＣ１構成成分を天然のまたは工学的に改変された大腸菌ＴａｄＡ、ヒトＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡ、またはヒトＡＤＡＴ２に置き換えることによって生成される。一部の実施形態では、ＡＢＥは、進化型のＴａｄＡバリアントを含む。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ１．２（ＴａｄＡ＊－ＸＴＥＮ－ｎＣａｓ９－ＮＬＳ）である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ＊は、Ａ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ変異を含む。
一部の実施形態では、ＡＢＥは第２世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１であり、これは追加の変異Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５ＶをＴａｄＡ＊（ＴａｄＡ＊２．１）に含む。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．２であり、これはヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｅ１２５Ｑ変異を有するＡＡＧ）の触媒として不活化されたバージョンに融合されているＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．３であり、これは大腸菌ＥｎｄｏＶの触媒として不活化されたバージョン（Ｄ３５Ａ変異により不活化）に融合されているＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．６であり、これはリンカーをＡＢＥ２．１内のリンカーのように長く２倍有する（３２アミノ酸、（ＳＧＧＳ）２－ＸＴＥＮ－（ＳＧＧＳ）２）。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．７であり、これは追加の野生型ＴａｄＡ単量体に繋留されたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．８であり、これは追加のＴａｄＡ＊２．１単量体に繋留されたＡＢＥ２．１である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．９であり、これは進化型ＴａｄＡ（ＴａｄＡ＊２．１）とＡＢＥ２．１のＮ末端との直接的な融合対である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１０であり、これは野生型ＴａｄＡとＡＢＥ２．１のＮ末端との直接的な融合体である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１１であり、これはＴａｄＡ＊単量体のＮ末端に不活性化型のＥ５９Ａ変異を有するＡＢＥ２．９である。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ２．１２であり、これは内部ＴａｄＡ＊単量体に不活性化型のＥ５９Ａ変異を有するＡＢＥ２．９である。
一部の実施形態では、ＡＢＥは第３世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ３．１であり、これは３つの追加のＴａｄＡ変異（Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、およびＩ１５７Ｆ）を有するＡＢＥ２．３である。
一部の実施形態では、ＡＢＥは第４世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ４．３であり、これは追加のＴａｄＡ変異Ａ１４２Ｎ（ＴａｄＡ＊４．３）を有するＡＢＥ３．１である。
一部の実施形態では、ＡＢＥは第５世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ５．１であり、これは、生き残ったクローン（Ｈ３６Ｌ、Ｒ５１Ｌ、Ｓ１４６Ｃ、およびＫ１５７Ｎ）由来のコンセンサス変異セットをＡＢＥ３．１に取り込むことによって生成される。一部の実施形態では、ＡＢＥはＡＢＥ５．３であり、これは、内部進化型ＴａｄＡ＊に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥは、下記の表６に示されるようなＡＢＥ５．２、ＡＢＥ５．４、ＡＢＥ５．５、ＡＢＥ５．６、ＡＢＥ５．７、ＡＢＥ５．８、ＡＢＥ５．９、ＡＢＥ５．１０、ＡＢＥ５．１１、ＡＢＥ５．１２、ＡＢＥ５．１３、またはＡＢＥ５．１４である。一部の実施形態では、ＡＢＥは第６世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、下記の表６に示されるようなＡＢＥ６．１、ＡＢＥ６．２、ＡＢＥ６．３、ＡＢＥ６．４、ＡＢＥ６．５、またはＡＢＥ６．６である。一部の実施形態では、ＡＢＥは第７世代のＡＢＥである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、下記の表６に示されるようなＡＢＥ７．１、ＡＢＥ７．２、ＡＢＥ７．３、ＡＢＥ７．４、ＡＢＥ７．５、ＡＢＥ７．６、ＡＢＥ７．７、ＡＢＥ７．８、ＡＢＥ７．９、またはＡＢＥ７．１０である。
Figure 2022545950000039
Figure 2022545950000040
一部の実施形態では、アデノシン塩基エディターは第８世代のＡＢＥ（ＡＢＥ８）である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＴａｄＡ＊８バリアントを含有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ＊８バリアントを含有する単量体構築物である。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１であり、これは、Ｙ１４７Ｔ変異（ＴａｄＡ＊８．１）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２であり、これは、Ｙ１４７Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．２）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．３であり、これは、Ｑ１５４Ｓ変異（ＴａｄＡ＊８．２）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．４であり、これは、Ｙ１２３Ｈ変異（ＴａｄＡ＊８．３）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．５であり、これは、Ｖ８２Ｓ変異（ＴａｄＡ＊８．４）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．６であり、これは、Ｔ１６６Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．６）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．７であり、これは、Ｑ１５４Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．７）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．８であり、これは、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＹ１２３Ｈ変異（ＴａｄＡ＊８．８）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．９であり、これは、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４ＲおよびＩ７６Ｙ変異（ＴａｄＡ＊８．９）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１０であり、これは、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＴ１６６Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．１０）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１１であり、これは、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．１１）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１２であり、これは、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ変異（ＴａｄＡ＊８．１２）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１３であり、これは、Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異（ＴａｄＡ＊８．１３）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。
一部の実施形態では、ＡＢＥ８は、ＴａｄＡ＊８バリアントに融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１４であり、これは、Ｙ１４７Ｔ変異（ＴａｄＡ＊８．１４）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１５であり、これは、Ｙ１４７Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．１５）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１６であり、これは、Ｑ１５４Ｓ変異（ＴａｄＡ＊８．１６）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１７であり、これは、Ｙ１２３Ｈ変異（ＴａｄＡ＊８．１７）を有するＴａｄ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１８であり、これは、Ｖ８２Ｓ変異（ＴａｄＡ＊８．１８）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．１９であり、これは、Ｔ１６６Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．１９）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２０であり、これは、Ｑ１５４Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．２０）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２１であり、これは、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＹ１２３Ｈ変異（ＴａｄＡ＊８．２１）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２２であり、これは、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異（ＴａｄＡ＊８．２２）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２３であり、これは、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｒ、およびＴ１６６Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．２３）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２４であり、これは、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｒ変異（ＴａｄＡ＊８．２４）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２５であり、これは、Ｙ１４７ＴおよびＱ１５４Ｓ変異（ＴａｄＡ＊８．２５）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８．２６であり、これは、Ｙ１２３Ｈ、Ｙ１４７Ｒ、およびＩ７６Ｙ変異（ＴａｄＡ＊８．２６）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。
一部の実施形態ではＡＢＥは、下記の表７Ａに示されるＡＢＥ８．１、ＡＢＥ８．２、ＡＢＥ８．３、ＡＢＥ８．４、ＡＢＥ８．５、ＡＢＥ８．６、ＡＢＥ８．６、ＡＢＥ８．７、ＡＢＥ８．８、ＡＢＥ８．９、ＡＢＥ８．１０、ＡＢＥ８．１１、ＡＢＥ８．１２、ＡＢＥ８．１３、ＡＢＥ８．１４、ＡＢＥ８．１５、ＡＢＥ８．１６、ＡＢＥ８．１７、ＡＢＥ８．１８、ＡＢＥ８．１９、ＡＢＥ８．２０、ＡＢＥ８．２１、ＡＢＥ８．２２、ＡＢＥ８．２３、ＡＢＥ８．２４、ＡＢＥ８．２５、またはＡＢＥ８．２６である。
Figure 2022545950000041
一部の実施形態では、ＡＢＥは、下記の表７Ａ－１に示されるジェノタイプを有する：
Figure 2022545950000042
下記の表７Ａ－２に示すように、４０個のＡＢＥ８のジェノタイプを記載する。ＡＢＥの進化型大腸菌ＴａｄＡ部分における残基の位置を標示する。ＡＢＥ８における変異による変化を、ＡＢＥ７．１０変異とは異なる場合に示す。一部の実施形態では、ＡＢＥは、下記の表７Ａ－２に示されるＡＢＥのうち１つのジェノタイプを有する。
Figure 2022545950000043
Figure 2022545950000044
一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ８）は、循環置換体Ｃａｓ９（例えば、ＣＰ５）と二部分構成の核局在化配列とを含むスキャフォールドにアデノシンデアミナーゼバリアント（例えば、ＴａｄＡ＊８）をクローニングすることによって生成される。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）は、ＮＧＣ ＰＡＭＣＰ５バリアント（Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲ Ｃａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、またはＡＢＥ８）は、ＡＧＡ ＰＡＭ ＣＰ５バリアント（Ｓ．ピロゲネスＣａｓ９またはｓｐＶＲＱＲ Ｃａｓ９）である。
一部の実施形態では、塩基エディターは、ＡＢＥ８．１であり、以下の配列またはアデノシンデアミナーゼ活性を有するその断片を含むか、またはそれから本質的に成る：
ＡＢＥ８．１＿Ｙ１４７Ｔ＿ＣＰ５＿ＮＧＣ ＰＡＭ＿単量体
Figure 2022545950000045
上記の配列では、標準文字がアデノシンデアミナーゼの配列を示し、ボールド体の配列がＣａｓ９由来の配列を標示し、イタリック体の配列がリンカー配列を示し、下線部の配列が二分核定位配列を示す。
一部の実施形態では、塩基エディターは、ＡＢＥ８．１であり、以下の配列またはアデノシンデアミナーゼ活性を有するその断片を含むか、またはそれから本質的に成る：
ｐＮＭＧ－Ｂ３３５ ＡＢＥ８．１＿Ｙ１４７Ｔ＿ＣＰ５＿ＮＧＣ ＰＡＭ＿単量体：
Figure 2022545950000046
上記の配列では、標準文字がアデノシンデアミナーゼの配列を示し、ボールド体の配列がＣａｓ９由来の配列を標示し、イタリック体の配列がリンカー配列を示し、下線部の配列が二分核定位配列を示す。
一部の実施形態では、塩基エディターは、ＡＢＥ８．１４であり、以下の配列またはアデノシンデアミナーゼ活性を有するその断片を含むか、またはそれから本質的に成る：
ＮＧＣ ＰＡＭ ＣＰ５を有するｐＮＭＧ－３５７＿ＡＢＥ８．１４
Figure 2022545950000047
上記の配列では、標準文字がアデノシンデアミナーゼの配列を示し、ボールド体の配列がＣａｓ９由来の配列を標示し、イタリック体の配列がリンカー配列を示し、下線部の配列が二分核定位配列を示す。
一部の実施形態では、本発明のＡＢＥ８は、以下の配列から選択される：
01. monoABE8.1_bpNLS + Y147T
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02. monoABE8.1_bpNLS + Y147R
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03. monoABE8.1_bpNLS + Q154S
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04. monoABE8.1_bpNLS + Y123H
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05. monoABE8.1_bpNLS + V82S
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06. monoABE8.1_bpNLS + T166R
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07. monoABE8.1_bpNLS + Q154R
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08. monoABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_Y123H
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09. monoABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_I76Y
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11. monoABE8.1_bpNLS + Y147T_Q154R
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14. monoABE8.1_bpNLS + V82S + Q154R
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一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ａ－ｍであり、これは、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ａ）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｂ－ｍであり、これは、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｂ）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｃ－ｍであり、これは、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｃ）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｄ－ｍであり、これは、Ｖ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、およびＦ１４９Ｙ変異（ＴａｄＡ＊８ｄ）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｅ－ｍであり、これは、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｅ）を有するＴａｄＡ＊７．１０を含有する単量体構築物を有する。
一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ａ－ｄ、これは、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ａ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｂ－ｄであり、これは、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｂ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｃ－ｄであり、これは、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｃ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｄ－ｄであり、これは、Ｖ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、およびＦ１４９Ｙ変異（ＴａｄＡ＊８ｄ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｅ－ｄであり、これは、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｅ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合された野生型大腸菌ＴａｄＡを含有するヘテロ二量体構築物を有する。
一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ａ－７であり、これは、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ａ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｂ－７であり、これは、Ｖ８８Ａ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｂ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｃ－７であり、これは、Ｒ２６Ｃ、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｃ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｄ－７であり、これは、Ｖ８８Ａ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、およびＦ１４９Ｙ変異（ＴａｄＡ＊８ｄ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含有するヘテロ二量体構築物を有する。一部の実施形態では、ＡＢＥ８はＡＢＥ８ｅ－７であり、これは、Ａ１０９Ｓ、Ｔ１１１Ｒ、Ｄ１１９Ｎ、Ｈ１２２Ｎ、Ｙ１４７Ｄ、Ｆ１４９Ｙ、Ｔ１６６Ｉ、およびＤ１６７Ｎ変異（ＴａｄＡ＊８ｅ）を有するＴａｄＡ＊７．１０に融合されたＴａｄＡ＊７．１０を含有するヘテロ二量体構築物を有する。
一部の実施形態では、ＡＢＥは、下記の表７Ｂに示されるようなＡＢＥ８ａ－ｍ、ＡＢＥ８ｂ－ｍ、ＡＢＥ８ｃ－ｍ、ＡＢＥ８ｄ－ｍ、ＡＢＥ８ｅ－ｍ、ＡＢＥ８ａ－ｄ、ＡＢＥ８ｂ－ｄ、ＡＢＥ８ｃ－ｄ、ＡＢＥ８ｄ－ｄ、またはＡＢＥ８ｅ－ｄである。一部の実施形態では、ＡＢＥは、ＡＢＥ８ｅ－ｍまたはＡＢＥ８ｅ－ｄである。ＡＢＥ８ｅは、ＳｐＣａｓ９以外のＣａｓホモログ、例えば、ＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９－ＫＫＨ、Ｃａｓ１２ａホモログ、例えば、ＬｂＣａｓ１２ａ、ｅｎＡｓ－Ｃａｓ１２ａ、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ならびに循環置換型ＣＰ１０２８－ＳｐＣａｓ９およびＣＰ１０４１－ＳｐＣａｓ９と共に用いた場合に、効率的なアデニン塩基編集活性と少ないインデル形成とを示す。表ＸでＡＢＥ８ｅに対し示された変異に加えて、Ｖ１０６Ｗ置換をＴａｄＡドメインに導入することによって、オフターゲットＲＮＡおよびＤＮＡ編集が低減された（M. Richter et al., 2020, Nature Biotechnology, doi.org/10.1038/s41587-020-0453-zに記載されており、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
Figure 2022545950000048
一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）の全部または一部を含むドメインをさらに含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）などのウラシル結合タンパク質（ＵＢＰ）の全部または一部を含むドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸ポリメラーゼの全部または一部を含むドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターに組み込まれた核酸ポリメラーゼまたはその一部は、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。
一部の実施形態では、塩基エディターのドメインは、多重ドメインを含み得る。例えば、Ｃａｓ９に由来するポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む塩基エディターは、野生型または天然のＣａｓ９のＲＥＣローブおよびＮＵＣローブに対応するＲＥＣローブおよびＮＵＣローブを含み得る。別の例では、塩基エディターは、ＲｕｖＣＩドメイン、ＢＨドメイン、ＲＥＣ１ドメイン、ＲＥＣ２ドメイン、ＲｕｖＣＩＩドメイン、Ｌ１ドメイン、ＨＮＨドメイン、Ｌ２ドメイン、ＲｕｖＣＩＩＩドメイン、ＷＥＤドメイン、ＴＯＰＯドメイン、またはＣＴＤドメインのうち１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターの１つまたは複数のドメインは、そのドメインを含むポリペプチドの野生型バージョンに対する変異（例えば、置換、挿入、欠失）を含む。例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインのＨＮＨドメインは、Ｈ８４０Ａ置換を含み得る。別の例では、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインのＲｕｖＣＩドメインは、Ｄ１０Ａ置換を含み得る。
本明細書に開示される塩基エディターの異なるドメイン（例えば、隣接ドメイン）が、１つまたは複数のリンカードメイン（例えば、ＸＴＥＮリンカードメイン）を用いてまたは用いずに、互いに接続され得る。一部の実施形態では、リンカードメインは、結合（例えば、共有結合）とされ得るか、化学基とされ得るか、または２つの分子もしくは部分、例えば、融合タンパク質の２つのドメイン、例えば、第１のドメイン（例えば、Ｃａｓ９由来ドメイン）と第２のドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン）とを連結する分子とされ得る。一部の実施形態では、リンカーは共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミド連結の炭素窒素結合である。ある特定の実施形態では、リンカーは、環式または非環式の、置換または非置換の、分岐または非分岐の脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーはポリマー性（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、炭素環部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）をベースとする。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アリール部分またはヘテロアリール部分を含む。ある特定の実施形態では、リンカーはフェニル環をベースとする。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核基（例えば、チオール、アミノ）の付加を促進する官能化部分を含み得る。任意の求電子基がリンカーの一部として用いられ得る。例示的な求電子基としては、以下に限定されないが、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインと核酸編集タンパク質の触媒ドメインとを含むＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメインに接合する。一部の実施形態では、リンカーは、ｄＣａｓ９および第２のドメイン（例えば、ＵＧＩ、シチジンデアミナーゼ、など）に接合する。
典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するかまたはそれらを側面に配し、共有結合を介してそれぞれ接続され、ゆえに上記２つを接続する。一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、２～１００アミノ酸の長さであり、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、または１５０～２００アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、約３から約１０４（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）アミノ酸の長さである。さらに長いかまたは短いリンカーも想定される。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＸＴＥＮリンカーとも呼ばれることがあるアミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含む。核酸塩基エディターの活性のために最適な長さを達成するために、融合タンパク質ドメインを連結するための任意の方法が採用され得る（例えば、高可撓性のリンカーである形態（ＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（Ｇ）ｎから、より剛性のリンカーである形態（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳに及ぶ（例えば、全体の内容を本明細書に参照により組み込まれるGuilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82を参照）、または（ＸＰ）ｎモチーフ。一部の実施形態では、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、式中、ｎは１、３、または７である。一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質のＣａｓ９ドメインは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含むリンカーを介して融合される。一部の実施形態では、リンカーは、複数のプロリン残基を含み、５～２１、５～１４、５～９、５～７アミノ酸の長さであり、例えば、ＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡ、ＰＡＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡＰＡ、Ｐ（ＡＰ）４、Ｐ（ＡＰ）７、Ｐ（ＡＰ）１０である（例えば、全体の内容を本明細書に参照により組み込まれるTan J, Zhang F, Karcher D, Bock R. Engineering of high-precision base editors for site-specific single nucleotide replacement. Nat Commun. 2019 Jan 25;10(1):439を参照）。そのようなプロリンリッチリンカーは、「剛性」リンカーとも呼ばれる。
リンカー
ある特定の実施形態では、リンカーを用いて、本発明の任意のペプチドまたはペプチドドメインに連結してもよい。リンカーは、共有結合のように単純でもよいし、ポリマーリンカーの多数の原子の長さとしてもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは、ポリペプチドであるか、またはアミノ酸をベースとしている。他の実施形態では、リンカーはペプチド様ではない。一部の実施形態では、リンカーは共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミド連結の炭素－窒素結合である。ある特定の実施形態では、リンカーは、環式または非環式の、置換または非置換の、分岐または非分岐の脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーはポリマー性（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、炭素環部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）をベースとする。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の実施形態では、リンカーはアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、リンカーはペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、アリール部分またはヘテロアリール部分を含む。ある特定の実施形態では、リンカーはフェニル環をベースとする。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核基（例えば、チオール、アミノ）の付加を促進する官能化部分を含んでいてもよい。任意の求電子基がリンカーの一部として用いられてもよい。例示的な求電子基としては、以下に限定されないが、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられる。
一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドもしくはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、結合（例えば共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、約３から約１０４（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００）アミノ酸の長さである。
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐとは、４、１６、３２、または１０４アミノ酸の長さのリンカーを介して融合される。一部の実施形態では、リンカーは、約３から約１０４アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の融合タンパク質は、リンカーを介して互いに融合されているシチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとを含む。核酸塩基エディターの活性のために最適な長さを達成するために、デアミナーゼドメイン（例えば、工学的に改変されたｅｃＴａｄＡ）とＣａｓ９ドメインとの間の様々なリンカーの長さおよび可撓性が採用され得る（例えば、高可撓性のリンカーである形態（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（Ｇ）ｎから、より剛性のリンカーである形態（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＳＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳに及ぶ（例えば、全体の内容を本明細書に参照により組み込まれるGuilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82を参照）、および（ＸＰ）ｎ）。一部の実施形態では、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎモチーフを含み、式中、ｎは１、３、または７である。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の融合タンパク質のシチジンデアミナーゼとアデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインとは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳを含むリンカー（例えば、ＸＴＥＮリンカー）を介して融合される。
一部の実施形態では、標的領域は、標的の枠を含み、標的の枠は、標的核酸塩基対を含む。一部の実施形態では、標的の枠は、１～１０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的の枠は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、塩基対の意図される編集は、標的の枠内である。一部の実施形態では、標的の枠は、塩基対の意図される編集を含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書に提供される任意の塩基エディターを用いて実行される。一部の実施形態では、標的の枠は、脱アミノ化の枠である。
さらに、一部の場合では、Ｇａｍタンパク質は、塩基エディターのＮ末端に融合され得る。一部の場合では、Ｇａｍタンパク質は、塩基エディターのＣ末端に融合され得る。バクテリオファージＭｕのＧａｍタンパク質は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の末端に結合して、それらを分解から保護することができる。一部の実施形態では、Ｇａｍを用いてＤＳＢのフリーな末端に結合することによって、塩基編集の過程の間のインデル形成を低減することができる。一部の実施形態では、１７４残基のＧａｍタンパク質は、塩基エディターのＮ末端に融合される。Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)を参照されたい。一部の場合では、１つまたは複数の変異は、野生型ドメインに比べて塩基エディタードメインの長さを変えることができる。例えば、少なくとも１つのドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸の欠失は、塩基エディターの長さを低減し得る。別の場合では、１つまたは複数の変異は、野生型ドメインに比べてドメインの長さを変えない。例えば、任意のドメイン内の置換は、塩基エディターの長さを変える／変えない。
一部の実施形態では、本明細書に示される塩基編集融合タンパク質は、精確な場所に配置される必要があり、例えば、そこでは、画定された領域（例えば、「脱アミノ化の枠」）内に標的塩基が配される。一部の場合では、標的は、４塩基領域内とすることができる。一部の場合では、そのような画定された標的領域は、ＰＡＭのおよそ１５塩基上流とすることができる。全体の内容が参照によりここに組み込まれる、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；およびKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照されたい。
画定された標的領域は、脱アミノ化の枠とされ得る。脱アミノ化の枠は、塩基エディターが標的ヌクレオチドに作用して脱アミノ化する画定された領域とされ得る。一部の実施形態では、脱アミノ化の枠は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基の領域内である。一部の実施形態では、脱アミノ化の枠は、ＰＡＭの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流である。
本開示の塩基エディターは、標的ポリヌクレオチド配列の編集を促進する任意のドメイン、特徴、またはアミノ酸配列を含み得る。例えば、一部の実施形態では、塩基エディターは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、デアミナーゼドメインとポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインとの間に局在化する。一部の実施形態では、塩基エディターのＮＬＳは、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメインに対しＣ末端に局在化する。
本明細書に開示される塩基エディターに存在し得る他の例示的な特徴は、局在化配列、例えば、細胞質局在化配列、核輸送配列などの輸送配列、または他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列である。本明細書に提供される適したタンパク質タグとしては、以下に限定されないが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆタグ（例えば、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグが挙げられる。追加の適した配列は当業者に明らかになるものとなる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数のＨｉｓタグを含む。
融合タンパク質に含まれ得るタンパク質ドメインの非限定的な例としては、デアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ）、ウラシルグリコシラーゼ阻害物質（ＵＧＩ）ドメイン、エピトープタグ、およびレポーター遺伝子配列が挙げられる。
エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、以下に限定されないが、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含めた自家蛍光タンパク質が挙げられる。追加のタンパク質配列としては、ＤＮＡ分子を結合するかまたは他の細胞性分子に結合するアミノ酸配列を挙げることができ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体が挙げられる。
塩基エディター効率
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、標的化ゲノム編集を媒介するのに広く用いられている。殆どのゲノム編集の適用では、Ｃａｓ９は、ガイドポリヌクレオチド（例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））と複合体を形成し、ｓｇＲＮＡ配列により指定された標的部位で二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導する。細胞は、主に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を介してこのＤＳＢに応答するが、ＮＨＥＪ修復経路は結果として、遺伝子を中断させるフレームシフト変異を引き起こす確率論的な挿入または欠失（インデル）を生じる。ＤＳＢの側面に位置する配列と高度の相同性を有するドナーＤＮＡ鋳型の存在下では、遺伝子編集は、相同性指向型修復（ＨＤＲ）として知られる代替の経路を介して達成され得る。都合の悪いことに、殆どの非摂動論的な条件下では、ＨＤＲは効率が悪く、細胞の状態および細胞のタイプに依存し、より大きなインデルの頻度に凌駕される。ヒトの疾患に関連する公知の遺伝子バリエーションの殆どが点変異であることから、精確な点変異をより高い効率で難なく作製することのできる方法が求められている。本明細書に示される塩基編集システムは、二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく、ドナーＤＮＡ鋳型を要することなく、確率論的な挿入および欠失を過剰に誘導することなく、ゲノム編集をもたらす新しい方法を提供する。
本明細書に示される塩基エディターは、著しく大きな割合のインデルを生成することなく、特異的ヌクレオチド塩基を改変することができる。用語「インデル」とは、本明細書に用いられる際には、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。そのような挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異に繋がることがある。一部の実施形態では、標的ヌクレオチド配列中に数多くの挿入または欠失（すなわちインデル）を生成することなく核酸内で特異的なヌクレオチドを効率的に改変する（例えば、変異または脱アミノ化する）、塩基エディターを生成することが望ましい。ある特定の実施形態では、本明細書に示される任意の塩基エディターは、インデルに比べてより大きな割合の目的の改変（例えば、点変異または脱アミノ化）を生成することができる。
一部の実施形態では、本明細書に示される任意の塩基エディターシステムは、結果として標的ポリヌクレオチド配列に５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０９％未満、０．０８％未満、０．０７％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％、または０．０１％未満のインデル形成を生じる。
本開示の一部の態様は、本明細書に示される任意の塩基エディターが、著しく数多くの目的外の変異、例えば目的外の点変異などを生成することなく、点変異などの目的の変異を核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）中で効率的に生成することができるという認識に基づく。一部の実施形態では、本明細書に示される任意の塩基エディターは、少なくとも０．０１％の目的の変異（すなわち、少なくとも０．０１％の塩基編集効率）を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に示される任意の塩基エディターは、少なくとも０．０１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の目的の変異を生成することができる。
一部の実施形態では、本明細書に示される塩基エディターは、１：１を超える目的の点変異とインデルとの比率を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に示される塩基エディターは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも８．５：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１１：１、少なくとも１２：１、少なくとも１３：１、少なくとも１４：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはそれを超える目的の点変異とインデルとの比率を生成することができる。
目的の変異およびインデルの数は、例えば、その全体の内容をここに参照により組み込まれる国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）；Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；およびKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)に記載されるような適した方法を用いて決定することができる。
一部の実施形態では、インデルの頻度を計算するために、配列解析のリードが、インデルの発生し得る枠の両側に位置する２つの１０ｂｐ配列との正確な一致について走査される。正確な一致が位置しない場合には、リードは解析から除外される。このインデル枠の長さが参照配列と正確に一致する場合には、リードは、インデルを含有しないものとして分類される。インデル枠が参照配列よりも長いかまたは短い２つ以上の塩基である場合には、次いで、配列解析のリードは、それぞれ挿入または欠失として分類される。一部の実施形態では、本明細書に示される塩基エディターは、核酸の領域中のインデルの形成を制限し得る。一部の実施形態では、この領域は、塩基エディターによって標的とされたヌクレオチドにあるか、または塩基エディターによって標的とされる２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのヌクレオチド内の領域である。
標的ヌクレオチド領域に形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム内の核酸）が塩基エディターに曝露される回数の量に依存し得る。一部の実施形態では、インデルの数または割合は、標的ヌクレオチド配列（例えば、細胞のゲノム内の核酸）を塩基エディターに曝露してから少なくとも１時間後、少なくとも２時間後、少なくとも６時間後、少なくとも１２時間後、少なくとも２４時間後、少なくとも３６時間後、少なくとも４８時間後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、少なくとも５日後、少なくとも７日後、少なくとも１０日後、または少なくとも１４日後に決定される。本明細書に記載される塩基エディターの特性が、本明細書に示される任意の融合タンパク質、または融合タンパク質を用いる方法に適用され得ることを認識するべきである。
多重編集
一部の実施形態では、本明細書に提供される塩基エディターシステムは、１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対の多重編集が可能である。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子に位置する。一部の実施形態では、複数の核酸塩基対は、１つまたは複数の遺伝子に位置し、少なくとも１つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。一部の実施形態では、多重編集は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、多重編集は、１つまたは複数の塩基エディターシステムを含み得る。一部の実施形態では、多重編集は、単一ガイドポリヌクレオチドを有する１つまたは複数の塩基エディターシステムを含み得る。一部の実施形態では、多重編集は、複数のガイドポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の塩基エディターシステムを含み得る。一部の実施形態では、多重編集は、単一の塩基エディターシステムを伴う１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要としない、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要とする、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、多重編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドとの混合物を含み得る。本明細書に記載される任意の塩基エディターを用いる多重編集の特性が、本明細書に示される任意の塩基エディターを用いる方法の任意の組合せに適用され得ることを理解するべきである。また、本明細書に記載される任意の塩基エディターを用いる多重編集が、複数の核酸塩基対を順次編集することを含み得ることも理解するべきである。
一部の実施形態では、上記複数の核酸塩基対は、１つを超える遺伝子にある。一部の実施形態では、上記複数の核酸塩基対は、同じ遺伝子にある。一部の実施形態では、上記１つを超える遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子は、異なる遺伝子座に位置する。
一部の実施形態では、編集とは、少なくとも１つのタンパク質コード領域中の複数の核酸塩基対の編集である。一部の実施形態では、編集とは、少なくとも１つのタンパク質非コード領域中の複数の核酸塩基対の編集である。一部の実施形態では、編集とは、少なくとも１つのタンパク質コード領域および少なくとも１つのタンパク質非コード領域中の複数の核酸塩基対の編集である。
一部の実施形態では、編集は、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドに連係する。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、１つまたは複数の塩基エディターシステムを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、単一ガイドポリヌクレオチドに連係する１つまたは複数の塩基エディターシステムを含み得る。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、複数のガイドポリヌクレオチドに連係する１つまたは複数の塩基エディターシステムを含み得る。一部の実施形態では、編集は、単一の塩基エディターシステムを伴う１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドに連係する。一部の実施形態では、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要としない、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドに連係する。一部の実施形態では、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要とする、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドに連係する。一部の実施形態では、編集は、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要としない少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド配列への結合を標的とするためのＰＡＭ配列を必要とする少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドとの混合物に連係する。本明細書に記載される任意の塩基エディターを用いる多重編集の特性が、本明細書に示される任意の塩基エディターを用いる方法の任意の組合せに適用され得ることを理解するべきである。また、編集が、複数の核酸塩基対を順次編集することを含み得ることも理解するべきである。
塩基エディターを用いる方法
転写を可能にするＳＤＳ関連遺伝子の編集は、治療および基礎研究における遺伝子編集の新しいストラテジーを開拓する。
本開示は、遺伝子変換に関連するか、または遺伝子変換ならびに点変異に起因する疾患（例えばＳＤＳ）であると診断された対象の治療のための方法を提供し、上記点変異は、スプライシングに影響し（例えば、スプライスドナーまたはアクセプター部位を変える）、このスプライシングは、本明細書に示される塩基エディターシステムによって修正することができる。例えば、一部の実施形態では、そのような疾患、例えば、遺伝子変換または他の遺伝子変異に起因する疾患に罹っている対象に、有効量の核酸塩基エディター（例えば、アデノシンデアミナーゼ塩基エディターまたはシチジンデアミナーゼ塩基エディター）を投与することを含む方法が提供され、核酸塩基エディターは、スプライシングが可能になるように遺伝子変換を編集するか、または疾患関連遺伝子中の別の変異を編集する（例えば、ストップコドンをミスセンス変異に変換するか、スプライスアクセプターまたはドナー部位を挿入するか、または変異を含むスプライスドナーまたはアクセプター部位を修正する）。
ある特定の態様では、異常な遺伝子スプライシングおよび／または未熟なタンパク質切詰を結果として生じるＳＢＤＳタンパク質をコードするＳＢＤＳ（ＳＢＤＳＰを含む）遺伝子中の変異（例えば、遺伝子変換）に関連または起因する、ＳＤＳの治療のための方法が提供される。遺伝子変換の影響は、デアミナーゼ媒介性遺伝子編集によって改善し、この遺伝子編集は、例えば、転写を可能にするかまたは正常なスプライシングを可能にする点変異を導入する。
それぞれの配列、例えば、疾患関連遺伝子またはそのコードされるタンパク質のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における特定の位置または残基の付番は、それぞれ、具体的なタンパク質および用いられる付番スキームに依存することが理解されよう。付番は、例えば、成熟タンパク質の前駆体と成熟タンパク質自体とで異なることがあり、種間の配列の差異は、付番に影響を及ぼすことがある。当業者は、当技術分野に周知される方法によって、例えば、配列のアラインメントおよび相同な残基の決定によって、任意の相同なタンパク質およびその各コード核酸の各残基を特定することができるものとなる。
本明細書に示されるのは、疾患または障害に関連する標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基を編集するための塩基エディターまたは塩基エディターシステムを用いる方法である。一部の実施形態では、塩基エディター（例えば、アデノシンデアミナーゼおよびＣａｓ９ドメインを含む）の活性は、遺伝子変換の編集または点変異（例えば、スプライスアクセプターまたはドナー部位を変更する変異）の修正を結果として生じる。一部の実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連するＧ→Ａ点変異を含み、その場合、変異体Ａ塩基の脱アミノ化は、疾患または障害に関連しない配列を結果として生じる。一部の実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連するＴ→Ｃ点変異を含み、その場合、変異体Ｃ塩基の脱アミノ化は、疾患または障害に関連しない配列を結果として生じる。他の実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、スプライシングを中断する遺伝子変換事象によって変更されており、遺伝子変換内の部位の脱アミノ化によって、転写およびスプライシングが可能になる。
一部の実施形態では、標的ＤＮＡ配列は、タンパク質（例えば、ＳＢＤＳタンパク質）をコードし、点変異はコドン内にあり、野生型コドンに比べると変異体コドンによりコードされるアミノ酸の変化を結果として生じる。一部の実施形態では、変異体Ａの脱アミノ化は、変異体コドンによりコードされるアミノ酸の変化を結果として生じる。一部の実施形態では、変異体Ａの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンを結果として生じる。一部の実施形態では、変異体Ｃの脱アミノ化は、変異体コドンによりコードされるアミノ酸の変化を結果として生じる。一部の実施形態では、変異体Ｃの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンを結果として生じる。一部の実施形態では、対象は、疾患もしくは障害があるか、またはそれがあると診断されている。
一部の実施形態では、本明細書に示されるアデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡのデオキシアデノシン残基のアデニンを脱アミノ化することができる。本開示の他の態様は、アデノシンデアミナーゼ（例えば、本明細書に記載されるようにＤＮＡ中でデオキシアデノシンを脱アミノ化するアデノシンデアミナーゼ）と、特異的なヌクレオチド配列に結合できるドメイン（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質）とを含む融合タンパク質を提供する。例えば、アデノシンはイノシン残基に変換され得るが、このイノシン残基は、典型的にはシトシン残基と塩基対を形成する。そのような融合タンパク質は、核酸配列の標的化編集にとりわけ有用である。そのような融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの標的化編集、例えば、変異体細胞または動物の生成；標的化変異の導入、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞における、例えば、続いて同じまたは別の対象内に再導入される対象から得られる細胞における、遺伝子的な欠陥の修正または編集；およびｉｎ ｖｉｖｏでの標的化変異の導入に使用することができ、例えば、転写を可能にする遺伝子的な欠陥の編集が本明細書に示される核酸塩基エディターを用いて処置され得る。本開示は、デアミナーゼ、デアミナーゼおよび核酸塩基エディターを利用する融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、組成物、方法、キット、システムなどを提供する。
目的の変異の生成
一部の実施形態では、本明細書に示される方法の目的は、遺伝子編集を介して機能不全遺伝子の機能を回復させることである。一部の実施形態では、機能不全遺伝子の機能は、スプライシングを可能にする目的の変異を導入することによって回復される。本明細書に示される核酸塩基編集タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子編集ベースのヒトの治療について、例えば、ヒト細胞培養において疾患関連変異（例えば、遺伝子変換）を編集することによって検証することができる。本明細書に示される核酸塩基編集タンパク質、例えば、ポリヌクレオチドプログラマブルヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９）と核酸塩基編集ドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメイン）とを含む融合タンパク質を用いて、任意の単一の点ＡからＧまたはＣからＴの変異を修正し得ることが、当業者により認識されるものとなる。前者の場合では、変異体ＡからＩへの脱アミノ化により変異が修正され、後者の場合では、変異体Ｔと塩基対形成されているＡの脱アミノ化とそれに続く１ラウンドの複製により変異が修正される。一部の実施形態では、編集は修正を生じないが、転写を可能にする変更を導入する。
一部の実施形態では、本開示は、かなりの数の目的外の変異、例えば目的外の点変異などを生成することなく、核酸（例えば、対象のゲノム内の核酸）内の「目的の変異」、例えば点変異などを効率的に生成することができる、塩基エディターを提供する。一部の実施形態では、目的の変異は、目的の変異を生成するように特異的に設計されたガイドポリヌクレオチド（例えばｇＲＮＡ）に結合されている特異的塩基エディター（例えば、シチジン塩基エディターまたはアデノシン塩基エディター）によって生成される変異である。一部の実施形態では、目的の変異は、疾患または障害に関連する変異である。一部の実施形態では、目的の変異は、疾患または障害に関連するアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点変異である。一部の実施形態では、目的の変異は、疾患または障害に関連するシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への点変異である。一部の実施形態では、目的の変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域内のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点変異である。一部の実施形態では、目的の変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域内のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への点変異である。一部の実施形態では、目的の変異は、ストップコドン、例えば、遺伝子のコード領域内の未熟なストップコドンを生成する点変異である。一部の実施形態では、目的の変異は、ストップコドンを排除する変異である。
一部の実施形態では、本明細書に示される任意の塩基エディターは、１：１を超える目的の変異と目的外の変異との比率（例えば、目的の点変異：目的外の点変異）を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に示される任意の塩基エディターは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも５００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはそれを超える目的の変異と目的外の変異との比率（例えば、目的の点変異：目的外の点変異）を生成することができる。
塩基エディターの効率の詳細は、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、そのどちらも本明細書に参照によりその全体が組み込まれている。また、全体の内容が参照によりここに組み込まれる、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；およびKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照されたい。
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子における複数の核酸塩基対の編集は、少なくとも１つの目的の変異の形成を結果として生じる。一部の実施形態では、少なくとも１つの目的の変異の形成は、変異に起因する疾患の精確な修正を結果として生じる。他の実施形態では、編集は、標的遺伝子の転写を可能にする変更を導入する。そのような変更としては、スプライスドナーまたはアクセプター部位の挿入、ストップコドンを変更して転写を可能にするミスセンス変異の導入、またはスプライスコドンの修正もしくは導入が挙げられる。本明細書に記載される塩基エディターの多重編集の特性が、本明細書に示される塩基エディターを用いる方法の任意の組合せに適用され得ることが理解されるべきである。
ＳＢＤＳポリヌクレオチドにおける病原性変異の編集
一実施形態では、目的の変異は、遺伝子変換事象によって導入されたストップコドンを変更し、ストップコドンは、ＳＢＤＳポリペプチドの未熟な切詰を結果として生じ、転写を可能にする点変異を導入する。点変異は、遺伝子変換を受けているかまたは異常なスプライシングを引き起こす点変異を含むＳＢＤＳ遺伝子のスプライシングを回復させる、新しいスプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位を導入する。一部の実施形態では、新しいスプライスアクセプターまたはスプライスドナー部位の挿入は、正常なスプライシングを回復させないが、しかし、野生型活性を有するかまたはＳＤＳを有するもしくは発症するリスクがある対象の細胞で発現された際に治療効果を有するのに十分な活性を有する、ＳＢＤＳ タンパク質の発現を可能にする。
一部の実施形態では、目的の変異は、ＳＤＳに関連するＳＢＤＳ遺伝子中のスプライス部位（例えば、ドナーまたはアクセプター）における、病原性変異または疾患原因変異の精確な修正である。一部の実施形態では、病原性変異は、疾患または障害に関連するＧ→Ａ点変異であり、この場合、ＡからＧへの塩基エディター（ＡＢＥ）による変異体Ａ塩基の脱アミノ化は、疾患または障害に関連しない配列を結果として生じる。一部の実施形態では、病原性変異はＣ→Ｔ点変異である。Ｃ→Ｔ点変異は、例えば、ＡからＧへの塩基エディター（ＡＢＥ）を反対鎖に標的として向け、病原性のＴ核酸塩基の相補的なＡを編集することによって、修正することができる。一部の実施形態では、病原性変異は、疾患または障害に関連するＴ→Ｃ点変異であり、この場合、ＣからＴへの塩基エディター（ＢＥまたはＣＢＥ）による変異体Ｃ塩基の脱アミノ化は、疾患または障害に関連しない配列を結果として生じる。一部の実施形態では、病原性変異はＡ→Ｇ点変異である。Ａ→Ｇ点変異は、例えば、ＣＢＥを反対鎖に標的として向け、病原性のＧ核酸塩基の相補的なＣを編集することによって、修正することができる。一部の実施形態では、変異は、異常なスプライシングおよび／またはフレームシフトを引き起こすＳＢＤＳ遺伝子内の２５８＋２Ｔ＞Ｃ変異である。他の実施形態では、変異は、異常なスプライシングおよび／またはフレームシフトを引き起こすＳＢＤＳ遺伝子内の８３～１８４ＴＡ＞ＣＴ変異である。
送達システム
本明細書に開示される塩基エディターは、ウイルスベクターに含有される核酸にコードされ得る。ウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を挙げることができる。ウイルスベクターは、適用に基づき選択することができる。例えば、ＡＡＶは、その穏やかな免疫原性ゆえに、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子送達に一般的に用いられる。アデノウイルスは、強力な免疫原性応答を誘導することから、ワクチンとして一般的に用いられる。ウイルスベクターのパッケージング能により、ベクター内にパッケージング可能な塩基エディターのサイズが制限されることがある。例えば、ＡＡＶのパッケージング能は、２つの１４５塩基の末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む約４．５ｋｂである。
ＡＡＶは、パルボウイルスファミリーに属する小さな一本鎖ＤＮＡ依存性ウイルスである。４．７ｋｂの野生型（ｗｔ）ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質と３つのカプシドタンパク質とをそれぞれコードする２つの遺伝子から成り、両側面に１４５ｂｐの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が配置されている。ビリオンは、３つのカプシドタンパク質Ｖｐ１、Ｖｐ２、およびＶｐ３から構成され、これらは、同じオープンリーディングフレームから、しかし異なるスプライシング（Ｖｐ１）および選択的翻訳開始部位（Ｖｐ２およびＶｐ３のそれぞれ）により１：１：１０の比率で産生される。Ｖｐ３は、ビリオン中で最も豊富なサブユニットであり、ウイルスの向性を規定する細胞表面での受容体の認識に関与する。ウイルスの伝染性において機能するホスホリパーゼドメインが、Ｖｐ１の固有のＮ末端に同定されている。
ｗｔ ＡＡＶと同様に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ベクターの導入遺伝子カセットの側面に配置するためにシス作用性の１４５ｂｐのＩＴＲを利用し、最大４．５ｋｂを外来ＤＮＡのパッケージングに与える。感染に続いて、ｒＡＡＶは、本発明の融合タンパク質を発現し、環状のヘッド・トゥ・テールコンカテマーとしてエピゾーマルに存在することによって、宿主ゲノム内に組み込まれることなく残り続けることができる。このシステムを用いたｒＡＡＶの成功例はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで数多くあるものの、遺伝子のコード配列の長さがｗｔ ＡＡＶゲノム以上のサイズである場合、このパッケージング能の制約ゆえに、ＡＡＶ媒介性遺伝子送達の使用が制限されている。
上記のＡＡＶベクターのパッケージング能の低さは、このサイズを超える数多くの遺伝子の送達および／または大きな生理学的調節因子の使用を難題としている。これらの難題には、例えば、送達されるタンパク質を２つ以上の断片に分けることによって対処することができ、その場合、Ｎ末端断片は、分割されたインテイン－Ｎに融合され、Ｃ末端断片は、分割されたインテイン－Ｃに融合される。これらの断片は、次いで、２つ以上のＡＡＶベクター内にパッケージングされる。本明細書に用いられる際に、「インテイン」とは、側面に位置するＮ末端エクステインおよびＣ末端エクステイン（例えば、接合される断片）を連結する、自己スプライシングタンパク質イントロン（例えば、ペプチド）を指す。異種タンパク質断片を接合するためのある特定のインテインの使用は、例えば、Wood et al., J. Biol. Chem. 289(21); 14512-9 (2014)に記載されている。例えば、別々のタンパク質断片に融合される場合に、インテインＩｎｔＮおよびＩｎｔＣは、互いに認識し、それらをスプライスアウトすると同時にそれらの融合されていた側面に位置するタンパク質断片のＮ末端エクステインとＣ末端エクステインとを連結し、それによって２つのタンパク質断片から完全長のタンパク質を再構成する。他の適したインテインは、当業者に明らかとなろう。
本発明の融合タンパク質の断片は、長さが様々となり得る。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが２アミノ酸から約１０００アミノ酸に及ぶ。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約５アミノ酸から約５００アミノ酸に及ぶ。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２０アミノ酸から約２００アミノ酸に及ぶ。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約１０アミノ酸から約１００アミノ酸に及ぶ。他の長さの適したタンパク質断片は、当業者に明らかになるものとなる。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の一部または断片は、インテインに融合される。ヌクレアーゼは、インテインのＮ末端またはＣ末端に融合される。一部の実施形態では、融合タンパク質の一部または断片は、インテインに融合され、ＡＡＶカプシドタンパク質に融合される。インテイン、ヌクレアーゼ、およびカプシドタンパク質は、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で併せて融合することができる。一部の実施形態では、インテインのＮ末端は、融合タンパク質のＣ末端に融合され、インテインのＣ末端は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端に融合される。
一実施形態では、デュアルＡＡＶベクターが、大きな導入遺伝子発現カセットを２つの別々の半片（５’端および３’端、またはヘッドおよびテール）に分割することによって生成され、カセットの半片はそれぞれ単一のＡＡＶベクター（＜５ｋｂ）にパッケージングされる。次いで、両方のデュアルＡＡＶベクターが同じ細胞に共感染し、その後：（１）５’ゲノムと３’ゲノムとの間の相同組換え（ＨＲ）（デュアルＡＡＶ重複ベクター）；（２）５’ゲノムと３’ゲノムとのＩＴＲ－媒介性テイル・トゥ・ヘッドコンカテマー化（デュアルＡＡＶトランス－スプライシングベクター）；または（３）これらの２つの機構の組合せ（デュアルＡＡＶハイブリッドベクター）が起こると、完全長の導入遺伝子の発現カセットの再組立てが達成される。ｉｎ ｖｉｖｏでデュアルＡＡＶベクターを使用する結果、完全長タンパク質の発現が生じる。デュアルＡＡＶベクターのプラットフォームの使用は、＞４．７ｋｂのサイズの導入遺伝子の効率的かつ実行可能な遺伝子導入ストラテジーを代表するものである。
塩基エディターを設計するための開示されたストラテジーは、ウイルスベクター内にパッケージングできる塩基エディターを生成するために有用であり得る。塩基エディターの送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、培養または宿主において特異的な細胞を標的としてウイルスを向け、ウイルス性のペイロードを核または宿主細胞ゲノムと遣り取りするための、高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、培養内の細胞、患者（ｉｎ ｖｉｖｏ）に直接的に投与することもできるし、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで処置するのに用いることもでき、改変された細胞は、任意選択的に患者（ｅｘ ｖｉｖｏ）に投与することができる。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子移入に用いるレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、および単純ヘルペスウイルスのベクターを含む。宿主ゲノム内の組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合に、挿入された導入遺伝子の長期の発現をもたらす。さらに、数多くの異なる細胞タイプおよび標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって、変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂性細胞に形質導入するかまたは感染させることのできるレトロウイルスベクターであり、典型的には高いウイルス力価を生じる。そのため、レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は、標的組織に依存するものとなる。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能を有する、シス作用性の長い末端反復配列から構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、複製およびベクターのパッケージングに充分であり、次いで、ベクターが、標的細胞内に治療遺伝子を組み込んで永続的な導入遺伝子の発現をもたらすために用いられる。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992)；Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992)；Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990)；Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989)；Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、標的細胞内への効率的な組み込みのための所与の長さよりも小さなポリヌクレオチド配列を要する。例えば、９ｋｂ超の長さのレトロウイルスベクターは、結果として、より小さなサイズのものに比べて低いウイルス力価を生じることがある。一部の態様では、本開示の塩基エディターは、レトロウイルスベクターを介して効率的なパッケージングと標的細胞内への送達とを可能にするのに十分なサイズである。一部の場合では、塩基エディターは、ガイド核酸および／または標的化可能なヌクレアーゼシステムの他の構成成分と併せて発現される場合であっても効率的なパッキングと送達とを可能にするようなサイズである。
一過性発現が好適である適用では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、数多くの細胞のタイプで非常に高い形質導入効率を可能とし、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価と発現レベルとが得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に生産することができる。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ生産において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療手順のために、標的核酸により細胞を形質導入するために用いることができる（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987)；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ ９３／２４６４１；Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)；Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照。組換えAAVベクターの構築物は複数の刊行物に記載され、そのようなものとしては、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)；Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)；Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)；およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)が挙げられる。
そのため、本明細書に記載される塩基エディターは、ウイルスベクターを用いて送達され得る。塩基エディターシステムの１つまたは複数の構成成分は、１つまたは複数のウイルスベクターにコードされ得る。例えば、塩基エディターおよびガイド核酸は、単一のウイルスベクター上にコードされ得る。他の場合では、塩基エディターおよびガイド核酸は、異なるウイルスベクター上にコードされる。どちらの場合も、塩基エディターおよびガイド核酸はそれぞれ、プロモーターおよびターミネーターに動作可能に連結され得る。
ウイルスベクター上にコードされる構成成分の組合せは、選ばれたウイルスベクターのカーゴサイズの制約によって決定され得る。
塩基エディターの非ウイルス性送達
塩基エディターに用いる非ウイルス性送達のアプローチも利用可能である。非ウイルス性核酸ベクターの重要なカテゴリーの１つはナノ粒子であり、これは有機物とすることも無機物とすることもできる。ナノ粒子は当技術分野に周知されている。任意の適したナノ粒子設計を用いて、ゲノム編集システムの構成成分またはそのような構成成分をコードする核酸を送達することができる。例として、有機（例えば、脂質および／またはポリマー）ナノ粒子が、本開示のある特定の実施形態における送達ビヒクルとしての使用に適することがある。ナノ粒子製剤での使用のための例示的な脂質および／または遺伝子移入を表８（下記）に示す。
Figure 2022545950000049
Figure 2022545950000050
表９では、遺伝子移入および／またはナノ粒子製剤における使用のための例示的なポリマーを挙げる。
Figure 2022545950000051
表１０は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための送達方法の概要を示す。
Figure 2022545950000052
別の態様では、ゲノム編集システム構成成分またはそのような構成成分をコードする核酸、例えば、Ｃａｓ９またはそのバリアントなどの核酸結合タンパク質と、目的のゲノム核酸配列を標的とするｇＲＮＡとの送達は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を細胞に送達することによって達成されてもよい。ＲＮＰは、核酸結合タンパク質、例えば、Ｃａｓ９を標的化ｇＲＮＡとの複合体に含む。ＲＮＰは、公知の方法、例えば、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、またはカチオン性脂質により媒介される方法、例えば、Zuris, J.A. et al., 2015, Nat. Biotechnology, 33(1):73-80に報告されるものなどを用いて、細胞に送達されてもよい。ＲＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ塩基編集システムでの使用に有利であり、特にトランスフェクトの難しい細胞、例えば初代細胞などに有利である。さらに、ＲＮＰは、細胞でのタンパク質発現に伴って起こり得る困難も軽減することができ、特に、ＣＲＩＳＰＲプラスミド内に用いられ得る真核プロモーター、例えばＣＭＶまたはＥＦ１Ａがあまり発現されない場合に軽減することができる。有利なことに、ＲＮＰの使用では、細胞内への外来ＤＮＡの送達が必要とされない。しかも、核酸結合タンパク質とｇＲＮＡとの複合体を含むＲＮＰは経時的に分解されるため、ＲＮＰの使用は、オフターゲット効果を制限する可能性がある。プラスミドベースの手法と同様の様式で、ＲＮＰを用いて結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９バリアント）を送達し、相同性指向型修復（ＨＤＲ）に方向付けることができる。
塩基エディターをコードする核酸分子の発現を駆動するのに用いられるプロモーターは、ＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。このことは、ベクター内でスペースを取りかねない追加のプロモーター因子の必要性を排除するのに有利となり得る。この空いた追加のスペースは、追加の因子、例えばガイド核酸または選択マーカーなどの発現を駆動するために用いることができる。ＩＴＲ活性は比較的弱いため、選ばれたヌクレアーゼの過剰発現に起因する潜在的な毒性を低減するのに用いることができる。
任意の適したプロモーターを用いて、塩基エディターと、適切であればガイド核酸との発現を駆動することができる。遍在性の発現のために、使用可能なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖または軽鎖などが挙げられる。脳細胞または他のＣＮＳ細胞での発現のために、適したプロモーターとしては、全てのニューロンにシナプシンＩ、興奮ニューロンにＣａＭＫＩＩアルファ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴなどを挙げることができる。肝細胞での発現のために、適したプロモーターとしては、アルブミンプロモーターが挙げられる。肺細胞での発現のために、適したプロモーターとしてはＳＰ－Ｂを挙げることができる。内皮細胞のために、適したプロモーターとしてはＩＣＡＭを挙げることができる。造血細胞のために、適したプロモーターとしては、ＩＦＮベータまたはＣＤ４５を挙げることができる。骨芽細胞のために、適したプロモーターとしてはＯＧ－２を挙げることができる。
一部の場合では、本開示の塩基エディターは、同じ核酸分子内で塩基エディターとその適合するガイド核酸との別々のプロモーターに発現を駆動させるには充分に小さなサイズである。例として、ベクターまたはウイルスベクターは、塩基エディターをコードする核酸に動作可能に連結された第１のプロモーターと、ガイド核酸に動作可能に連結された第２のプロモーターとを含み得る。
ガイド核酸の発現を駆動するのに用いられるプロモーターとしては、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌＩＩＩプロモーター、ｇＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の発現のためのＰｏｌＩＩプロモーターおよびイントロンカセットの使用を挙げることができる。
１つまたは複数のガイド核酸を伴うかまたは伴わない本明細書に記載される塩基エディターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、または他のプラスミドもしくはウイルスベクターのタイプを用いて、具体的には、例えば、米国特許第８，４５４，９７２（アデノウイルスについての製剤、投与量）、米国特許第８，４０４，６５８（ＡＡＶについての製剤、投与量）、および米国特許第５，８４６，９４６（ＤＮＡプラスミドについての製剤、投与量）から、ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ、およびアデノウイルスの関与する臨床試験および臨床試験に関する刊行物から得られる製剤または投与量を用いて、送達され得る。例えば、ＡＡＶについては、投与経路、製剤、および投与量を、米国特許第８，４５４，９７２号のように、およびＡＡＶの関与する臨床試験のようにすることができる。アデノウイルスについては、投与経路、製剤、および投与量は、米国特許第８，４０４，６５８号のように、およびアデノウイルスの関与する臨床試験のようにすることができる。プラスミド送達については、投与経路、製剤、および投与量は、米国特許第５，８４６，９４６号のように、およびプラスミドの関与する臨床試験のようにすることができる。投与量は、平均７０ｋｇの個体（例えば成人男性）に基づくかまたは外挿することができ、異なる体重および種の患者、対象、哺乳動物に調整することができる。投与の頻度は、年齢、性別、全身の健康状態を含む通常の要因、患者または対象の他の状態、および対処中の特定の状態および症状に応じて、医療従事者または獣医療従事者（例えば、医師、獣医師）の裁量内にある。ウイルスベクターは、目的の組織に注入することができる。細胞型特異的な塩基編集については、塩基エディターおよび任意選択的なガイド核酸の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動させることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、ＡＡＶは、他のウイルスベクターを超えて有利となり得る。一部の場合では、ＡＡＶは低い毒性を可能とし、それは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因する。一部の場合では、ＡＡＶは、宿主ゲノム内に組み込まれないため、挿入型変異を引き起こす可能性を低減することを可能にする。
ＡＡＶは、４．５または４．７５Ｋｂのパッケージングの限界がある。このことは、開示された塩基エディターならびにプロモーターおよび転写ターミネーターを、単一のウイルスベクター内に合わせることができることを意味する。４．５または４．７５Ｋｂを超える構築物は、ウイルス産物の大幅な低減に繋がり得る。例えば、ＳｐＣａｓ９は非常に大きく、遺伝子自体は４．１Ｋｂ超であり、ＡＡＶ内へのパッキングが困難となっている。そのため、本開示の実施形態は、従来の塩基エディターよりも長さの短い、開示された塩基エディターを利用することを含む。一部の例では、塩基エディターは４ｋｂ未満である。開示された塩基エディターは、４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、または１．５ｋｂ未満とすることができる。一部の場合では、本開示の塩基エディターは４．５ｋｂ以下の長さである。
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはそれらの組合せとすることができる。標的とされる細胞に関してＡＡＶのタイプを選択することができ、例えば、脳細胞または神経細胞を標的とするために、ＡＡＶセロタイプ１、２、５、またはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはそれらの任意の組合せを選択することができ、心臓組織を標的とするためにＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。これらの細胞に関するある特定のＡＡＶセロタイプの一覧は、Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008))に見ることができる。
レンチウイルスは、有糸分裂細胞と有糸分裂後細胞の両方に感染し自身の遺伝子を発現する能力を有する、複合レトロウイルスである。最も一般に知られるレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、このウイルスは、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範な細胞タイプを標的とする。
レンチウイルスは以下のように調製することができる。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルス移入プラスミド骨格を含有）をクローニングした後、継代の浅い（ｐ＝５）ＨＥＫ２９３ＦＴを、トランスフェクションの前日にＴ７５フラスコにて、１０％ウシ胎児血清を含み抗生物質を含まないＤＭＥＭ中に播種して集密度５０％とした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、トランスフェクションを４時間後に行った。１０μｇのレンチウイルス移入プラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）と以下のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇシュードタイプ）および７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）とを用いて、細胞をトランスフェクトする。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０μＬのリポフェクタミン２０００および１００ｕＬのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行うことができる。６時間後、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質不含のＤＭＥＭに培地を交換する。これらの方法は、細胞培養の間に血清を用いるが、血清不含の方法が好適である。
レンチウイルスは、以下のように精製することができる。ウイルス上清を４８時間後に採取する。上清をまず残骸除去し、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを通して濾過する。次いで、超遠心機で２時間、２４，０００ｒｐｍでスピンする。ウイルスペレットを５０μＬのＤＭＥＭに４℃で一晩再懸濁する。次いで、等分してすぐに－８０℃で凍結する。
別の実施形態では、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとした最小限の非霊長類レンチウイルスベクターも想定される。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ．ＲＴＭ、すなわち、網膜下注射を介して送達されるものと想定される血管新生抑制タンパク質エンドスタチンおよびアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子治療ベクターである。別の実施形態では、自己不活性化レンチウイルスベクターの使用が想定される。
本システムの任意のＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡまたは塩基エディターコードｍＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達される。塩基エディターコードｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて生成され得る。例えば、ヌクレアーゼｍＲＮＡは、以下の因子：Ｔ７プロモーター、任意選択的なｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）、ヌクレアーゼ配列、および３’ＵＴＲ、例えばベータグロビン－ポリＡテール由来の３’ＵＴＲなどを含有するＰＣＲカセットを用いて合成され得る。カセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に用いられ得る。ガイドポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）はまた、Ｔ７プロモーターを含有するカセットとそれに続く配列「ＧＧ」およびガイドポリヌクレオチド配列から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて転写され得る。
発現を亢進しあり得る毒性を低減するために、塩基エディターコード配列および／またはガイド核酸は、１つまたは複数の改変ヌクレオシドを含むように、例えばシュード－Ｕまたは５－メチル－Ｃを用いて、改変することができる。
一部の実施形態の開示は、細胞または生物を改変する方法を包含する。細胞は、原核細胞または真核細胞とし得る。細胞は哺乳類細胞とし得る。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、齧歯類、またはマウスの細胞としてよい。本開示の塩基エディター、組成物、および方法によって細胞に導入される改変は、細胞および細胞の子孫が、例えば抗体、デンプン、アルコール、または他の所望の細胞性産生物などの生体産物の産生の向上のために変更されるようにすることができる。本開示の方法によって細胞に導入される改変は、生産される生物製品を変える変更を細胞および細胞の子孫が含むようにすることができる。
システムは、１つまたは複数の異なるベクターを含み得る。一態様では、塩基エディターは、所望の細胞タイプ、優先的には真核細胞、好ましくは哺乳類細胞またはヒト細胞での発現のために、コドン最適化されている。
概して、コドン最適化とは、生得の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約または約を超える１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個、またはそれを超えるコドン）を、その生得のアミノ酸配列を維持しながら目的の宿主細胞の遺伝子内でより高頻度でまたは最も高頻度で用いられるコドンに置き換えることによって、その宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変する過程を指す。様々な種が、特定のアミノ酸の或るコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、次いで、中でも、翻訳されているコドンの性質と特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存するものと考えられている。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、概して、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子を、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせることができる。コドン使用表は、例えば、www.kazusa.orjp/codon/（２００２年７月９日に閲覧）で入手可能な「コドン使用データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は、複数の方法で適応させることができる。Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列のコドンを最適化するコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えばＧｅｎｅＦｏｒｇｅ（アプタジェン（Aptagen）；ジェイコバス、ペンシルバニア州）なども利用可能である。一部の実施形態では、工学的に改変されたヌクレアーゼをコードする配列内の１つまたは複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個、もしくはそれを超えるかまたは全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対し最も高頻度で用いられるコドンに対応する。
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することのできるウイルス粒子を形成するために用いられる。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ．２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージングする細胞株を生産することによって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングとその後の宿主内への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現するポリヌクレオチドのための発現カセットに置き換えられている。欠けているウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングと宿主ゲノム内への組込みに必要なＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠いたヘルパープラスミドを含有する細胞株に、パッケージングすることができる。また、この細胞株には、アデノウイルスをヘルパーとして感染させることができる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製とヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現とを促進することができる。一部の場合のヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠いているために、顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりも感受性のあるアデノウイルスに対し加熱処理することによって、低減させることができる。
医薬組成物
本開示の他の態様は、本明細書に記載される塩基エディター、融合タンパク質、または融合タンパク質－ガイドポリヌクレオチド複合体のいずれかを含む医薬組成物に関する。用語「医薬組成物」とは、本明細書に用いられる際には、医薬用途に製剤化された組成物を指す。一部の実施形態では、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、追加の剤（例えば、特異的な送達、半減期の延長、または他の治療化合物）を含む。
ここで用いられる際に、用語「医薬的に許容可能な担体」とは、身体のある１つの部位（例えば、送達部位）から別の部位（例えば、器官、組織、または身体の一部）への化合物の搬送または輸送に関与する医薬的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクル、例えば液体または固体フィルターなど、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくは亜鉛、もしくは立体酸）、または溶媒被包材を意味する。医薬的に許容可能な担体は、製剤の他の成分に親和性がある（例えば、生理学的に親和性がある、滅菌されている、生理学的なｐＨであるなど）が対象の組織を損なわないという意味で「許容可能」である。
医薬的に許容可能な担体として役割を果たす材料の非制限的な一部の例としては：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロースなど；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなど；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックスなど；（９）油、例えば、ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油など；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルなど；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェン不含水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝剤；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）充填剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸など、（２３）血清アルコール、例えばエタノールなど；ならびに（２３）医薬製剤に採用される他の非毒性の親和性物質が挙げられる。また、湿潤剤、着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、着香剤、芳香剤、保存剤、および抗酸化剤も製剤中に存在する。「賦形剤」、「担体」、「医薬的に許容可能な担体」、「ビヒクル」などの用語は、本明細書に互換的に用いられる。
医薬組成物は、生理学的ｐＨを反映する所定のレベルで、例えば、約５．０から約８．０の範囲で製剤のｐＨを維持するための、１つまたは複数のｐＨ緩衝化合物を含み得る。水性液体製剤に用いられるｐＨ緩衝化合物は、アミノ酸またはアミノ酸の混合物、例えば、ヒスチジンまたはヒスチジンとグリシンなどのアミノ酸の混合物などとすることができる。あるいは、ｐＨ緩衝化合物は、好ましくは、製剤のｐＨを所定レベルで、例えば、約５．０から約８．０の範囲などで維持し、カルシウムイオンをキレートしない剤である。ｐＨ緩衝化合物の説明的な例としては、以下に限定されないが、イミダゾールおよび酢酸イオンが挙げられる。ｐＨ緩衝化合物は、所定のレベルで製剤のｐＨを維持するのに適した任意の量で存在し得る。
また、医薬組成物は、１つまたは複数の浸透調整剤、すなわち、製剤の浸透特性（例えば、張性、重量オスモル濃度、および／または浸透圧）をレシピエント個体の血流および血液細胞で許容可能なレベルに調整する化合物も含有する。浸透調整剤は、カルシウムイオンをキレートしない剤とすることができる。浸透調整剤は、製剤の浸透特性を調整する当業者に公知または利用可能な任意の化合物とすることができる。当業者は、本発明の製剤の使用に対する所与の浸透調整剤の適合性を、経験的に決定し得る。適した浸透調整剤のタイプの説明的な例としては、以下に限定されないが：塩、例えば、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムなど；糖、例えば、スクロース、デキストロース、およびマンニトールなど；アミノ酸、例えば、グリシンなど；ならびに１つまたは複数のこれらの剤および／またはタイプの剤の混合物が挙げられる。浸透調整剤は、製剤の浸透特性を調整するのに十分な任意の濃度で存在し得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、対象への送達のために、例えば、遺伝子編集のために製剤化される。本明細書に記載される医薬組成物を投与する適した経路としては、限定はないが：局所的、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、器官内、硬膜外、くも膜下腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内の投与が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、疾患部位（例えば、腫瘍部位）に局所的に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、または例えばシアラスティック膜などの膜、もしくは繊維などを含めた多孔性、非多孔性、もしくはゼリー状の材料であるインプラントによって、対象に投与される。
他の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、徐放性システムで送達される。一実施形態では、ポンプを用いることができる（例えば、Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。別の実施形態では、ポリマー材を用いることができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et ah, 1989, J. Neurosurg. 71: 105）。他の徐放性システムは、例えば、前出のLangerに考察されている。
一部の実施形態では、医薬組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内投与または皮下投与に適応された組成物として、定型的な手順に従って製剤化される。一部の実施形態では、注射による投与のための医薬組成物は、可溶化剤、および注射の部位での痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔剤としての、滅菌等張使用における溶液である。概して、成分は、別々とするかまたは合わせて混合するかのどちらかで、例えば、ある量の活性剤を標示する密封された容器、例えばアンプルまたはサシェなどの中の凍結乾燥粉末または水分不含の濃縮物として、単位剤形で供給される。医薬が注入によって投与される場合、滅菌の医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分注することができる。医薬組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合できるように、アンプルの注射用滅菌水または生理食塩水を付与することがある。
全身投与に用いる医薬組成物は、液体、例えば、滅菌生理食塩水、乳酸リンゲルまたはハンクス溶液とし得る。さらに、医薬組成物は、固形とし、使用の直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態も想定される。医薬組成物は、脂質粒子または小胞、例えば、リポソームまたは微結晶などの中に含有させることができ、それらもまた非経口の投与に適している。この粒子は、組成物が中に含有される限り、単層または複層などの任意の適した構造とすることができる。化合物は、融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５～１０モル％）のカチオン性脂質を含有する「安定化プラスミド－脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に捕捉され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆によって安定化され得る（Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6: 1438-47）。正電荷の脂質、例えば、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレオイロキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルサルフェートまたは「ＤＯＴＡＰ」などは、そのような粒子および小胞に特に好適である。そのような脂質粒子の調製は周知されている。例えば、そのそれぞれを本明細書に参照により組み込まれる米国特許第４，８８０，６３５号；第４，９０６，４７７号；第４，９１１，９２８号；第４，９１７，９５１号；第４，９２０，０１６号；および第４，９２１，７５７号を参照されたい。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、単位容量として投与またはパッケージングすることができる。用語「単位容量」とは、本開示の医薬組成物を参照して用いられる際に、対象に用いる単一の投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤；すなわち、担体またはビヒクルに関連して所望の治療効果を生じるように計算された、ある所定量の活性材を含有している。
さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物を含有する容器と、（ｂ）医薬的に許容可能な希釈剤を含有する第２の容器（例えば、本発明の凍結乾燥された化合物の再構成または希釈に滅菌的に用いられる とを含む医薬キットとして提供され得る。任意選択的にそのような容器に付随するのは、医薬品または生物由来製品の製造、使用、または販売を規制する行政機関によって規定された様式の通知書であり、この通知書は、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売の当局による認可を反映する。
別の態様では、上記の疾患の治療に有用な材料を含有する製品が含まれている。一部の実施形態では、製品は、容器およびラベルを含む。適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。一部の実施形態では、容器は、本明細書に記載される疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌されたアクセスポートを有し得る。例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルとし得る。組成物中の活性剤は、本発明の化合物である。一部の実施形態では、容器上のまたは容器に付随するラベルは、選ばれた疾患を治療するためにその組成物が用いられることを標示する。製品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液などを含む、第２の容器をさらに含み得る。それは商業的な観点およびユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得るが、そのようなものとしては、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための指示を含むパッケージ添付文書が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の融合タンパク質、ｇＲＮＡ、および／または複合体は、医薬組成物の一部として提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に示される任意の融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に示される任意の複合体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ｇＲＮＡおよびカチオン性脂質との複合体を形成するＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含むリボ核タンパク質複合体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ｇＲＮＡ、核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質、カチオン性脂質、および医薬的に許容可能な賦形剤を含む。医薬組成物は、１つまたは複数の追加の治療活性物質を任意選択的に含み得る。
ＳＤＳを治療する方法
また、提供されるのは、ＳＤＳおよび／またはＳＤＳを引き起こすＳＢＤＳ遺伝子変換もしくはＳＢＤＳＰに関連する遺伝子変異を治療する方法である。本方法は、本明細書に記載の塩基エディターシステム（例えば、塩基エディターおよびｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む治療有効量の医薬組成物を、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとアデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインとを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとアデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインとを含む組成物を含む。一実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとシチジンデアミナーゼドメインとを含む。一実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとシチジンデアミナーゼドメインとを含む組成物を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとアデノシンデアミナーゼドメインまたはシチジンデアミナーゼドメインとを含む融合タンパク質である。対象の細胞には、塩基エディターと１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとが形質導入され、このガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを標的に向けて、１つまたは複数の変異をＳＢＤＳ（例えばＳＢＤＳＰ）遺伝子内に含有する核酸配列のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更（細胞にアデノシンデアミナーゼドメインが形質導入される場合）またはＣ・ＧからＵ・Ａへの変更（細胞にシチジンデアミナーゼドメインが形質導入される場合）をもたらす。
本明細書の方法は、対象（そのような治療を必要とするものと特定された対象、または疾患のリスクがあるものと疑われそのような治療を必要とする対象を含む）に、有効量の本明細書に記載の組成物を投与することを含む。そのような治療を必要とする対象の特定は、対象または医療従事者の判断の範疇であり、主観的（例えば主張）でも客観的（例えば、試験または診断方法によって測定可能）でもあり得る。
治療方法は、概して、例えば、塩基エディターとそれを必要とする対象（例えば、ヒト患者）のＳＢＤＳまたはＳＢＤＳＰ遺伝子を標的とするｇＲＮＡとをコードするベクターを含む、治療有効量の医薬組成物の投与を含む。そのような治療は、ＳＤＳを患っているか、ＳＤＳに罹っているか、罹りやすいか、またはＳＤＳのリスクがある対象、具体的にはヒト対象に、適切に投与されるものとなる。また、本明細書の組成物は、ＳＢＤＳまたはＳＢＤＳをコードする遺伝子の変異が関与し得る任意の他の障害の治療に用いられてもよい。
一実施形態では、治療の進捗をモニタリングする方法が提供される。本方法は、ＳＤＳに関連する障害またはその症状を患っているかまたはそれに罹りやすい対象における診断マーカー（マーカー）（例えば、ＳＤＳに関連するＳＮＰ）または診断測定値（例えば、スクリーニング、アッセイ）のレベルを決定するステップを含み、その場合、対象は、疾患またはその症状を治療するのに十分な治療量の本明細書の組成物を投与されている。本方法で決定されるマーカーのレベルを、健康で正常な対照または他の罹患者のどちらかにおける既知のマーカーのレベルと比較して、対象の疾患の状態を確定することができる。好適な実施形態では、対象におけるマーカーの第２のレベルを、第１のレベルの決定よりも後の時点で決定し、この２つのレベルを比較して、疾患のコースまたは療法の効能をモニタリングする。ある好適な実施形態では、対象におけるマーカーの治療前レベルを、本発明による治療を始める前に決定する。そして、このマーカーの治療前レベルを、次いで治療開始後の対象におけるマーカーのレベルに比較して、治療の効能を決定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に示される組成物は、標的化されたゲノム改変を対象内でもたらすために、対象、例えばヒト対象に投与される。一部の実施形態では、細胞を対象から取得して、本明細書に示される任意の医薬組成物に接触させる。一部の実施形態では、対象から取り出されてｅｘ ｖｉｖｏで医薬組成物に接触された細胞は、任意選択的に所望のゲノム改変が細胞にもたらされて検出された後に、対象内に再導入される。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を送達する方法は公知であり、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載されており、これらの全ての開示は、参照により本明細書にその全体を組み込まれている。本明細書に示される医薬組成物の記載は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物に向けられているとはいえ、そのような組成物が概ね、あらゆる動物または生物への投与、例えば獣医学的な用途に適していることが、当業者により理解されよう。
組成物を様々な動物への投与に適するものとするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の修飾はよく理解されており、熟練の獣医学の薬理学者は、常法のみで、もしあれば実験により、そのような修飾を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が想定される対象としては、以下に限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類；哺乳動物、家畜動物、ペット、および商業的に妥当な哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／もしくはラットなど；ならびに／または商業的に妥当な鳥類を含めた鳥類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／もしくはシチメンチョウが挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬学分野で公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。概して、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の他の付帯的な成分との会合に至らせるステップ、ならびに次いで、必要であればおよび／または望ましければ、生産物を所望の単回または複数回の用量単位に成型および／またはパッケージングするステップを含む。医薬製剤は、医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含み得るが、そのようなものとしては、本明細書に用いられる際には、所望の具体的な剤形に適した任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤、または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などが挙げられる。RemingtonのThe Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro（Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；本明細書に参照によりその全体を組み込まれる）は、医薬組成物を製剤化する際に用いられる様々な賦形剤とその調製のための公知の手法とを開示している。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を生産するための追加の適した方法、試薬、賦形剤、および溶媒については、その全体を本明細書に参照により組み込まれるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５１３１（公開番号ＷＯ２０１１／０５３９８２ Ａ８、２０１０年１１月２日出願）を参照されたい。
任意の従来の賦形媒体が、例えば、任意の望まない生物学的効果を生じるか、またはその他、医薬組成物の任意の他の構成成分と有害な様式で相互作用するなど、物質またはその誘導体に非親和性である場合を除いて、その使用は、本開示の範囲内にあるものと想定される。
上記に記載されるような組成物は、有効量で投与することができる。有効量は、投与様式、治療されている具体的な状態、および所望のアウトカムに依存するものとなる。また、それは状態のステージ、対象の年齢および物理的な状態、もしあれば併用している療法の性質、および医療従事者によく知られた同様の要因にも依存することがある。治療適用に対しては、それは医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。
キット
本開示の様々な態様は、塩基エディターシステムを含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、核酸塩基エディター融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。融合タンパク質は、デアミナーゼ（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼ）と核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）とを含む。一部の実施形態では、キットは、目的の核酸分子、例えば、ＳＤＳ関連変異を標的とすることのできる少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む。
キットは、一部の実施形態では、キットを用いて１つまたは複数のＳＤＳ関連変異を編集するための指示書を与える。指示書は、概して、核酸分子を編集するためのキットの使用に関する情報を含むものとなる。他の実施形態では、指示書は、以下のうち少なくとも１つを含む：事前対策、警告、臨床研究、および／または参考文献。指示書は、容器（存在すれば）上に直接的に、または容器に貼付されたラベルとして、または容器中または容器と共に供給される別々のシート、パンフレット、カード、またはフォルダとして、印刷されていてもよい。さらに別の実施形態では、キットは、指示書を、適した操作パラメーターについてラベルまたは別々の添付文書（パッケージ添付文書）の形で含み得る。さらに別の実施形態では、キットは、検出、較正、または正規化のための標品として用いられる適切な陽性および陰性の対照または対照試料と共に、１つまたは複数の容器を含み得る。キットは、医薬的に許容可能な緩衝液、例えば（滅菌の）リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、またはデキストロース溶液などを含む第２の容器を、さらに含み得る。それは商業的な観点およびユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得るが、そのようなものとしては、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用のための指示を含むパッケージ添付文書が挙げられる。
ある特定の実施形態では、キットは、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に罹っている対象の治療に有用である。
以下の実施例は、説明のみの目的で提供され、本明細書に示される特許請求の範囲の範囲を限定することを意図されていない。
実施例１ 塩基エディターにおけるＰＡＭバリアントの検証
新規のＣＲＩＳＰＲシステムおよびＰＡＭバリアントは、塩基エディター（例えば、ＰＶ１－ＰＶ２８）がＳＢＤＳポリヌクレオチド（例えば、ＳＢＤＳＰポリヌクレオチド）内の変異（例えば、スプライシングを中断させる遺伝子変換）を編集することを可能にする。いくつかの新規のＰＡＭバリアントが評価および検証されている。ＰＡＭの評価および塩基エディターの詳細は、例えば、国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／２０１７／０４５３８１（ＷＯ２０１８／０２７０７８）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３４４（ＷＯ２０１７／０７０６３２）に記載されており、これらのそれぞれは本明細書に参照によりその全体を組み込まれている。また、それぞれの全体の内容がここに参照により組み込まれるKomor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；およびKomor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)も参照されたい。
実施例２ シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する異常なスプライシングを修正するための遺伝子編集
ＳＤＳに関連する変異としては、１８３～１８４位のＴＡ→ＣＴジヌクレオチド変化および２５８＋２Ｔ→Ｃ変化（図１Ａおよび図１Ｂ）が挙げられる。変異２５８＋２Ｔ→Ｃは、イントロン２のドナースプライス部位を中断させると予測されており、観察された８ｂｐの欠失は、２５１～２５２位にある上流の潜在的なスプライスドナー部位の使用に整合する。ジヌクレオチド変更１８３～１８４ＴＡ→ＣＴは、インフレームの終止コドン（Ｋ６２Ｘ）を導入し、２５８＋２Ｔ→Ｃおよび結果として生じる８ｂｐの欠失は、フレームシフトにより、コードされたタンパク質の未熟な切詰を引き起こす（８４Ｃｆｓ３）。
異常なスプライシングを結果として生じるＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異は、シュワックマン・ダイアモンド症候群に関連する。図２Ａおよび図２Ｂに示すように、異常なスプライシング変異は、表１１のｇＲＮＡを用いて、アデノシンデアミナーゼ活性またはシチジンデアミナーゼ活性と必要なＰＡＭ特異性とを有する塩基エディターを用いて修正される。
Figure 2022545950000053
１８３～１８４ＴＡ＞ＣＴ ＲＳ１１３９９３９９１は、図２Ａに示されるように、結果としてストップコドン（ＴＡＡ）を生じる。ＰＶ１～１４の中から選択されたＡＢＥは、ＴＡＡからトリプトファンをコードするＴＧＧへの変換を導入するために用いられる。そのような変換は、アミノ酸６２位でＬＹＳ（Ｋ）の代わりにＴＲＰ（Ｗ）を有するタンパク質の転写を可能にするものとなる。
塩基エディター（ＰＶ１～１４）は、変更（例えば、遺伝子変換）を含むＳＢＤＳ遺伝子を編集するために、図２Ａに図示されるｇＲＮＡに連係して用いられる。エディターＰＶ１～１４は、任意の以下の配列を有するガイドＲＮＡを用いてＳＢＤＳ遺伝子を編集するために用いられる：
５’－ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣ－３’
５’－ＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ－３’。
ＳＤＳ関連変異（例えば、遺伝子変換）の修正に有用なエディター（ＰＶ１－１４）の記載は以下である：
PV1. pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y147T
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
PV2. pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y147R
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
PV3 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Q154S
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRSVFNAQKKAQSSTD
PV4 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y123H
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
PV5 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + V82S
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYSTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
PV6 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + T166R
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSRD
PV7 (pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Q154R
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD
PV8 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_Y123H
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD
PV9 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_I76Y
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLYDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD
PV10 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y147R_Q154R_T166R
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSRD
PV11 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y147T_Q154R
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD
PV12 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + Y147T_Q154S
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRSVFNAQKKAQSSTD
PV13 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + H123Y123H_Y147R_Q154R_I76Y
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLYDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD
PV14 pCMV_monoABE8.1_bpNLS + V82S + Q154R
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYSTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD
以下の中から選択されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｒｓ１１３９９３９９３２５８＋２Ｔ＞Ｃを標的とするために用いられる。図２Ｂに示すように、以下のｇＲＮＡ配列は、スプライス部位に存在するシトシンを脱アミノ化するために、シチジン塩基エディターに連係して用いられ、このシトシンは、チミジンに変換され、それによってスプライシングが復活する：
５’－ＧＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣ－３’
５’－ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ－３’
５’－ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡＵ－３’
一実施形態では、シチジン塩基エディターはＢＥ４であるか、またはＡＰＯＢＥＣもしくはＡＩＤを含む。アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒを含みかつ変更されたＰＡＭ ５’－ＮＧＣ－３’への特異性を有する改変されたＳｐＣａｓ９は、ＳＤＳに関連する変異の修正のために用いられる。変更されたＰＡＭ ５’－ＮＧＧ－３”に対する特異性を有する野生型ＳｐＣａｓ９が、一部の実施形態で用いられてもよい。
スプライシングに影響を及ぼす他の病原性変異は、図２Ａおよび図２Ｂに図示されたものと同様のストラテジーを用いて修正される。
実施例３ ＳＤＳを治療するオンターゲット編集活性が高いシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）
上記に述べたように、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）は、骨髄不全および臨床的に意味のある造血異常という特徴がある、常染色体劣性のパターンで遺伝する疾患である。ＳＤＳは、集団で１／７７，０００（複合ヘテロ接合体）の発生率を有し、ＲＮＡプロセッシングの欠陥をもたらすＳＢＤＳ遺伝子の点変異（ＳＮＰ）に起因する。ＳＤＳ患者は、造血幹細胞療法（ＨＳＣＴ）の拒絶のリスクがより高い。１／３の患者が慢性の好中球減少を有し、そして、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および急性白血病が最大１／３の患者に発生する。今日まで、臨床表現型および治療は、多様性および患者特異性が高い。ＳＤＳ患者に対する治療および医学的介入としては、赤血球輸血、再発および重篤な感染の管理、骨髄移植、および関連の管理が挙げられる。
例えば、本明細書に記載されるように、塩基編集を採用して、ＳＤＳ疾患に関連するＳＮＰを標的とすることによって、正しいスプライシングを回復させることによる、ＳＤＳに対する治療処置を提供する解決策。実施例２に記載されるものに加えて、変異の精確な修正のために、ＳＢＤＳ遺伝子中のよく見られるスプライス部位のＳＮＰを標的とするために開発されたシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）を用いて、実験を実施した。具体的には、ＳＢＤＳ中の標的とした変異はｒｓ１１３９９３９９３ Ｃ→Ｔである（図２Ｃおよび図２Ｂおよび図２Ｄ）。一実施形態では、自己由来のＣＤ３４＋細胞を含むＨＳＣＴが、ＳＢＤＳ遺伝子内のＳＮＰ変異を標的とすることによって正しいスプライシングを回復させるためのＣＢＥ塩基編集に連係して用いられてもよい。
新しい塩基エディターを、ＳＢＤＳ遺伝子内のスプライス部位のＳＮＰ（例えば、ＳＮＰ ｒｓ１１３９９３９９３２５８＋２Ｔ＞Ｃ）を標的とするために生産し評価した（図２Ａ～図２Ｄ）。塩基エディターを、シチジンデアミナーゼ構成成分とＣａｓ９構成成分とを含むシチジン塩基エディターとし、このＣａｓ９構成成分は、（非変異型の野生型Ｃａｓ９（例えば、ＳｐＣａｓ９）ポリペプチド配列に比べて）標的ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）配列（または標的遺伝子）内の非規準のＰＡＭ配列、すなわちＮＧＣ ＰＡＭまたはＮＧＣ含有ＰＡＭ、例えば、ＮＧＣＣ、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＧに結合するためのＣａｓ９の能力を付与する変異の組合せを、Ｃａｓ９アミノ酸配列内に含有していた。記載された変異の組合せを含有するＣａｓ９タンパク質は、「Ｃａｓ９バリアント」と称する。シチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアントとを含むシチジン塩基エディターは、本明細書では「ＮＧＣ ＣＢＥバリアント」と称する。
図３Ａ～図３Ｃは、変更型ＰＡＭ５’－ＮＧＣ－３’に対する特異性を有する改変型Ｃａｓ９バリアント、例えば改変型ＳｐＣａｓ９などを生じるアミノ酸置換が発生する、Ｃａｓ９ポリペプチド配列内のアミノ酸位置を示す。具体的なしかも非制限的な例として、図３Ａ～図３Ｃに「２２４」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、以下のアミノ酸配列／置換の組合せＤ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒを含み；図３Ａ～図３Ｃに「２２５」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、以下のアミノ酸配列／置換の組合せＤ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒを含み；図３Ａ～図３Ｃに「２２６」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒを含み；図３Ａ～図３Ｃに「２２７」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑを含み；図３Ａ～図３Ｃに「２３０」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑを含み；図３Ａ～図３Ｃに「２３５」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑを含み；図３Ａ～図３Ｃに「２３７」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７を含み；図３Ａ～図３Ｃに「２４２」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７を含み；図３Ａ～図３Ｃに「２４４」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７を含み；図３Ａ～図３Ｃに「２４５」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７を含み；図３Ａ～図３Ｃに「２５９」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒを含み；図３Ａ～図３Ｃに「Ｎｕｒｅｋｉ」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒを含み；図３Ａ～図３Ｃに「ＮＧＣＲｄ１」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７を含み；図３Ａ～図３Ｃに「２６７（ＮＧＣＲｄ２）」と称される改変型Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒを含み、これらは、変更型ＰＡＭ５’－ＮＧＣ－３’（または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ）に対する特異性を有し、ＳＤＳに関連する変異の修正に用いられる。これらのＣａｓ９バリアント、ならびに図３Ａ～図３Ｃに示される他のものは、同じ術語、例えば、ＰＶ２２５、ＰＶ２２６、およびＰＶ２３０をそれぞれ有するプラスミドが含有するポリヌクレオチドによってコードされる。これらのプラスミドを、細胞ベース（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに利用して、ＳＢＤＳ遺伝子内の変異型ＳＮＰを標的とするＮＧＣ ＣＢＥ塩基エディターの塩基編集効率を評価する。当業者に認識されることになるように、そのようなプラスミド（プラスミドベクター）は、適したプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターと、シチジンデアミナーゼ構成成分およびヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）バリアントの構成成分をコードする動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列とを含む 。一部の場合では、標的ポリヌクレオチド配列を含有するＳＢＤＳポリヌクレオチド配列の全てまたは関連部分がプラスミドに含まれていてもよいし、別々のプラスミドに含まれていてもよい。一部の実施形態では、適したプロモーター配列と、ＣＢＥ構成成分のポリヌクレオチド配列および／またはＳＢＤＳポリヌクレオチド配列の全てもしくは関連部分とを含有するウイルスベクターが用いられる。一実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。一部の場合では、ＨＥＫ２９３細胞に、標的スプライス部位のＳＮＰを含有するＳＢＤＳポリヌクレオチド配列の全てまたは関連部分を担持するベクター、例えば、レンチウイルスベクターがトランスフェクトされる。
本明細書に記載のバリアントＮＧＣ ＣＢＥのシチジンデアミナーゼ構成成分としては、限定はないが、シチジンデアミナーゼＢＥ４、またはＡＰＯＢＥＣ１配列が本明細書に記載の別のＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼ配列に置き換えられているＢＥ４；または上記もしくは下記に記載される様々なＡＰＯＢＥＣシチジンデアミナーゼが挙げられる。シチジンデアミナーゼｒＡＰＯＢＥＣ１、ＢＥ４－ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＢＥ４－ＰｐＡＢＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＢＥ４－ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＢＥ４－ＲｒＡ３Ｆ、ＢＥ４－ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、およびＢＥ４－ＳｓＡＰＯＢＥＣ２は、本明細書に記載のＣａｓ９バリアントおよびガイドＲＮＡに連係して用いられた際に、塩基編集活性をもたらす。異なる代表的なシチジンデアミナーゼ含有するＣＢＥの相対変異速度を図４に示す。
スプライス部位のＳＮＰ（ＳＮＰ ｒｓ１１３９９３９９３２５８＋２Ｔ＞Ｃ）を含有するＳＢＤＳ標的ポリヌクレオチド配列を標的として正しいスプライシングを回復させるためにＮＧＣ ＣＢＥバリアントに連係して用いられるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および標的ｇＲＮＡを、下記の図５および表１２に示す。
Figure 2022545950000054
本明細書に記載される試験で用いられたｇＲＮＡのためのスキャフォールド配列は以下の通りである：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣ ＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣ ＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ ＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣ ＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵ ＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵ ＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（ＵＵＵ）。
例として、本明細書に記載されるようなＮＧＣ ＣＢＥバリアント、例えば、シチジンデアミナーゼＢＥ４とＣａｓ９バリアント２２６および２３０とに連係して用いられる１９ｍｅｒのｇＲＮＡ（Ｇ８８）と２０ｍｅｒのｇＲＮＡ（Ｇ４４）は、高いパーセンテージのオンターゲット編集と限定的なパーセンテージのバイスタンダー編集、ならびに高度のＣ→Ｔオンターゲット編集を示した （図６Ａおよび図６Ｂ）。図６Ｃでは、シチジンデアミナーゼ、例えばＢＥ４とＣＢＥ中の複数の異なるＣａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９バリアント）とを含むＣＢＥに連係して用いられた２０ｍｅｒのｇＲＮＡ（Ｇ４４）が、高いパーセンテージのオンターゲット塩基編集と低いパーセンテージのバイスタンダー（非特異的）編集とを明示した。標的配列およびＳＮＰ部位は、配列の７位にボールド体の「Ｃ」によって示され、配列の３位の「Ｃ」は、標的配列内のバイスタンダーヌクレオチドを表す。「２２６」と称するＳｐＣａｓ９バリアント（図３Ａ～図３Ｃ）を含むＣＢＥをコードするプラスミドは、図中で「ＰＶ２２６」と呼ばれる。
本明細書に記載されるＮＧＣ ＣＢＥバリアントは、修正のスプライシングを回復させる高いパーセンテージのオンターゲット編集を最適に示し、一方で同時に、低いもしくは限定的なバイスタンダー編集および／またはオフターゲット編集活性を示した。当業者によって理解されるものとなるように、本明細書に記載のシチジン塩基エディターの示した限定的なバイスタンダー編集活性は、塩基編集の枠内で核酸塩基編集が低いパーセンテージであるかまたは限定的に活性であることを指す。
実施例４ ＳＤＳを治療する高いオンターゲット編集活性のために生成されたＮＧＣシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）
いくつかの異なるシチジンデアミナーゼに連係する、図３Ａ～図３Ｃに示される配列を有する本明細書に記載のＣａｓ９バリアント、例えば、２２５、２２６、および２４４などと相互作用するＮＧＣ ＰＡＭを含む、追加のシチジン塩基エディターを生成した。Ｃａｓ９バリアント２２５、２２６、および２４４をコードするプラスミド、すなわちそれぞれ、ＰＶ２２５、およびＰＶ２４４を生成した。さらに、共にまたは別々にのどちらかでＣａｓ９バリアントとシチジンデアミナーゼとの両方をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドを構築した。下記の表１３は、ＳＢＤＳ遺伝子内のｒｓ１１３９９３９９３ Ｃ→Ｔ変異を標的として正しいスプライシングを復活させる能力を評価する研究において作製し用いた、ＮＧＣ ＣＢＥ（Ｃａｓ９バリアントとシチジンデアミナーゼポリペプチドとを含む）を示す。
Figure 2022545950000055
ＮＧＣ ＣＢＥ（シチジンデアミナーゼと、ＮＧＣを含むＰＡＭに結合する能力を有するＣａｓ９タンパク質をもたらすアミノ酸変異の組合せを含有するＣａｓ９バリアント（例えば、ＳｐＣａｓ９バリアント）とを含有する、シチジン塩基エディター）を、１つまたは複数のｇＲＮＡ、具体的には１９ｍｅｒおよび２０ｍｅｒのｇＲＮＡ、例えばそれぞれＧ８８およびＧ４４と併せて、ＳＢＤＳ遺伝子を担持するＨＥＫ２９３細胞において、ＳＢＤＳ遺伝子内のＳＮＰ変異のオンターゲット塩基編集についてアッセイを行った。図７Ａおよび図７Ｂは、１９ｍｅｒおよび２０ｍｅｒのｇＲＮＡ、例えばＧ８８およびＧ４４と併せて用いられた表１３に記載される様々なＮＧＣ ＣＢＥの塩基編集活性のパーセントを示している。シチジンデアミナーゼＰｐＡＰＯＢＥＣ１と図３Ａ～図３Ｃに示されるＣａｓ９配列の特異的な変異の組合せを有するＣａｓ９バリアント２２５、４５４、および４５９とから構成されるＣＢＥを、１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのどちらかのｇＲＮＡと併せて用いて、さらに別の実験を実施し、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列内のスプライス部位のＳＮＰを修正する細胞ベース（ＨＥＫ２９３）アッセイにおける編集／オンターゲットのパーセンテージおよびバイスタンダー編集活性を決定した（図８Ａおよび図８Ｂ）。図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、高いオンターゲット編集が、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１シトジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２６および２４４（図３Ａ～図３Ｃ）それぞれとを含有するＮＧＣ ＣＢＥ４５４および４５９（表１３）により示された。図８Ｃおよび図８Ｄは、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列のスプライス部位のＳＮＰを修正する細胞ベース（ＨＥＫ２９３）アッセイにおける、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡを併せて用いた、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、２２６、および２４４（図３Ａ～図３Ｃ）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲットおよびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ｅおよび図８Ｆは、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列のスプライス部位のＳＮＰを修正する細胞ベース（ＨＥＫ２９３）アッセイにおける、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡを併せて用いた、ＰｍＣＤＡ１シチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、４５３、および４５８（表１３）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲットおよびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ｇおよび図８Ｈは、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列のスプライス部位のＳＮＰを修正する細胞ベース（ＨＥＫ２９３）アッセイにおける、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡを併せて用いた、ＲＲＡ３ＦシチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、４５５、および４６０（表１３）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲットおよびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ｉおよび図８Ｊは、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列のスプライス部位のＳＮＰを修正する細胞ベース（ＨＥＫ２９３）アッセイにおける、１９ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ８８）または２０ｍｅｒ（Ｇｕｉｄｅ４４）のどちらかのｇＲＮＡを併せて用いた、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２シチジンデアミナーゼとＣａｓ９バリアント２２５、４５６、および４６１（表１３）とを含むＮＧＣ ＣＢＥのオンターゲットおよびバイスタンダー塩基編集のパーセンテージを示す。図８Ａ～図８Ｊでは、Ｃａｓ９バリアント２２５（またはＰＶ２２５）は、代替的に「ビームシャッフル」と呼ばれる。
さらに別の研究では、シチジンデアミナーゼポリペプチドに追加のアミノ酸変異を、例えば、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１ポリペプチド配列にＨ１２２Ａ変異を作製して、ＳＢＤＳ遺伝子中のスプライス部位のＳＮＰのオンターゲット塩基編集およびスプライス部位の修正がより好発したか否かを決定した。Ｈ１２２Ａ変異のみに加えて、Ｈ１２２Ａ変異とアミノ酸変異Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、およびＹ１２０ＦもＰｐＡＰＯＢＥＣ１アミノ酸配列に作製して、塩基編集効率（すなわち、オンターゲット編集とバイスタンダー編集とを比べたパーセンテージ）を決定するためのＮＧＣ ＣＢＥを作出した。さらに変異したＮＧＣ ＣＢＥバリアントを１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのｇＲＮＡと併せて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースアッセイに供試した。図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのどちらかのｇＲＮＡでは、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼポリペプチドに作製された追加の変異は、結果として、それらを含有するＮＧＣ ＣＢＥによる塩基編集効率の大幅な増加を生じなかった。図９Ｃおよび図９Ｄは、図９Ａおよび図９Ｂにそれぞれ示されるデータをドットブロットの形式で提示している。
実施例５ ＳＤＳを治療する５’－ＮＧＣ－３’ＰＡＭへの活性を有するＳｐＣａｓ９バリアントを含有する他のＮＧＣシチジン塩基エディター（ＣＢＥ）
ＳＤＳを治療する際の使用のための５’－ＮＧＣ－３’ＰＡＭへの活性を有するＳｐＣａｓ９バリアントを含有する他のＮＧＣシチジン塩基エディターを取得し評価するために、さらに別の変異を有する追加のＳｐＣａｓ９バリアントを作出した。ＳｐＣａｓ９バリアント（ＰＶ２２５およびＰＶ２４４（図３Ａ～図３Ｃ）および他のアミノ酸置換を含有）を含有するこれらのＮＧＣ ＣＢＥは、「ＮＲＣＨ」エディターバリアントと称するが、なぜなら、これらのＳｐＣａｓ９バリアントに含有されたアミノ酸置換が、その内容が参照により本明細書にその全体を組み込まれるS. Miller et al., April, 2020, “Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs,” Nature Biotechnology, 38(4):471-481 (published online 2020 Feb 10. doi: 10.1038/s41587-020-0412-8)に記載されるような「ＮＲＣＨ」ＰＡＭを認識することのできるＳｐＣａｓ９バリアント（すなわち、ＮＲＣＨ ＳｐＣａｓ９）について記載されたものに類似するためであり、式中、Ｒ＝ＡまたはＧであり、Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴである。Miller et al.に記載されるように、シチジンデアミナーゼとＮＲＣＨ ＳｐＣａｓ９バリアントとを含有するシチジン塩基エディターは、ＰＡＭ中の第３の位置のＣ核酸塩基に対する明瞭に進化した選好性を有する。
図１０は、ＮＲＣＨベースのＳｐＣａｓ９バリアントを作出するためにＳｐＣａｓ９タンパク質内に作製された変異および変異の組合せを図示する表を呈示している。図１０に示されるＮＲＣＨ変異の組合せを、いくつかの異なるＳｐＣａｓ９バリアントに含めて、ＳＤＳに関連するＳＢＤＳ遺伝子内のスプライス部位のＳＮＰを修正するために用いられるＮＧＣ ＣＢＥ内のＳｐＣａｓ９バリアント構成成分に最も有益となる変異の組合せを決定した。具体的な例では、所与のシチジンデアミナーゼ、例えばＰｐＡＰＯＢＥＣ１などと、ある特定の変異を含むＳｐＣａｓ９バリアント（図３Ａ～図３Ｃ）とを含有するＮＧＣ ＣＢＥは、上記のMiller et al.に記載されるような、および下記に例示されるようなＮＲＣＨ変異の組合せと併せると、高いパーセンテージのオンターゲット編集と低いパーセンテージのバイスタンダー編集とを提供し得る。具体的な実施形態では、ＮＧＣ ＰＡＭ変異を結合する能力の最も高いＳｐＣａｓ９バリアントを、ＰｐＡＰＯＢＥＣ Ｈ１２２Ａシチジンデアミナーゼと組み合わせて、バイスタンダー効果に比べて高いオンターゲット塩基編集を明示するＣＢＥを特定してもよい。関連する実施形態では、ＮＧＣ ＰＡＭを結合する能力を明示する例えば、図３Ａ～図３Ｃ、表１３、または図１０に示されるようなＳｐＣａｓ９バリアントと、シチジンデアミナーゼ、例えばＰｐＡＰＯＢＥＣ Ｈ１２２Ａとをコードするポリヌクレオチドを含む、ＮＧＣ ＣＢＥプラスミドまたはウイルスベクター構築物が、本明細書に記載されるような細胞ベースのシステムにおいて最も高いオンターゲット編集と最も低いバイスタンダー編集とをもたらす最適な組合せを評価するために含まれる。
具体的な例として、２２５および２４４のＳｐＣａｓ９バリアント内の追加のアミノ酸置換は、Ａ１０Ｔ、Ｉ３２２Ｖ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４２７Ｇ、Ｒ６４５Ｌ、Ｒ７５３Ｇ、Ｒ１１１４Ｇ、Ｑ１２２１Ｈ、Ｙ１３３６、Ｓ１３３８Ｔ、およびＨ１３４９Ｒのうち１つまたは複数（例えば、ＳｐＣａｓ９のＮＲＣＨ変異）を含んでいた。上記の実施例に記載された実験で用いたような１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのｇＲＮＡを併せて用いた、ＮＲＣＨ ＳｐＣａｓ９バリアントとシチジンデアミナーゼとを含有するＮＧＣ ＣＢＥによるオンターゲットおよびバイスタンダーの核酸塩基編集を、細胞ベース（ＨＥＫ２９３）アッセイで評価して、ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列（図１１Ａおよび１１Ｂ）内のスプライス部位のＳＮＰの修正を評定した。図１１Ａおよび図１１Ｂに観察されるように、塩基エディター４６８および４６９（表１０）は、１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのどちらかのｇＲＮＡに連係して用いられた際に、高いパーセンテージのオンターゲット塩基編集を示した。
実施例６ ＮＧＣ ＣＢＥをコードし送達するｍＲＮＡ
代表的なＮＧＣ ＣＢＥエディターをクローニングして、これらの塩基エディターをコードするｍＲＮＡを作り出した。塩基エディターをコードするｍＲＮＡは、細胞中の標的ＤＮＡ、例えばＳＢＤＳ遺伝子における塩基編集を達成するのに最適な送達システムであり、また、診療所での治療用途に特に適している。熟練の実務者が認識するものとなるように、ｍＲＮＡは、編集の枠を転じて編集の効率を増やし得る。より高いパーセンテージのＣ→Ｔ遷移と低いかまたは限定的なパーセンテージのＣ→ＡまたはＣ→Ｇ遷移を有する塩基エディターは、ｍＲＮＡ送達に特に有用であるかまたは適している。そのため、高いパーセンテージのオンターゲット塩基編集を示したＮＧＣ ＣＢＥのいくつか（例えば、ＮＧＣ ＣＢＥ４５４、４５９、および４４９、表１３）をコードするｍＲＮＡを、異なる長さのｇＲＮＡにより評価した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースアッセイを実施して、ｍＲＮＡによりコードされたＮＧＣ ＣＢＥの塩基編集効率およびオンターゲット編集とバイスタンダー編集とを比べたパーセンテージを評価した（図１２Ａ～図１２Ｃ）。図１２Ａ～図１２Ｃでは、ｍＲＮＡ３４０は、ＳｐＣａｓ９バリアント２２５（またはＰＶ２２５）とシチジンデアミナーゼＰＰＡＰＯＢＥＣ１ Ｈ１２２Ａとを含むＣＢＥ＃４４９（表１３）をコードするｍＲＮＡを指し；ｍＲＮＡ３４１は、ＳｐＣａｓ９バリアント２２６（またはＰＶ２２６）と、図３Ａ～図３Ｃ、上記に配列が示されるシチジンデアミナーゼＰＰＡＰＯＢＥＣ１ Ｈ１２２Ａとを含むＣＢＥ＃４５４（表１３）をコードするｍＲＮＡを指し；ｍＲＮＡ３４２は、ＳｐＣａｓ９バリアント２４４（またはＰＶ２４４）とシチジンデアミナーゼＰＰＡＰＯＢＥＣ１ Ｈ１２２Ａとを含むＣＢＥ＃４５９（表１３）をコードするｍＲＮＡを指す。図１２Ａ～１２Ｃに示されるように、ｍＲＮＡ３４２は、最も少ないＣからＡまたはＣからＧへの遷移を示し、特に１８ｍｅｒおよび２０ｍｅｒのｇＲＮＡを用いて使用した際に少なかった。
上記の実施例３～６に記載される実験の結果は、Ｃａｓ９バリアント、すなわち、ＮＧＣ ＰＡＭ（すなわち、５’－ＮＧＣ－３’ＰＡＭバリアント）を結合する能力を付与する変異の組合せを含有するＳｐＣａｓ９バリアントが、低いパーセンテージのオフターゲット効果（バイスタンダー編集）と高いパーセンテージのオンターゲット塩基編集とを達成する塩基編集のための実行可能な選択肢であることを明示する。この結果はさらに、本明細書に記載のＮＧＣ ＣＢＥを用いることにより、バイスタンダー編集を制限するとともに４０％超のオンターゲット効率がもたらされることを明示している。これらのＮＧＣ ＣＢＥは、ｍＲＮＡによってコードすることができ、細胞ベースのシステムでアッセイした際に効率的な塩基編集を示した。具体的には、ある長さのｇＲＮＡ、例えば１８ｍｅｒ（例えば、Ｇおよび２０ｍｅｒのｇＲＮＡは、バイスタンダー（オフターゲット）編集をさらに減少させることができる。したがって、本明細書に記載されるＮＧＣ ＣＢＥ、ならびにその組成物および方法は、ＳＤＳの治療に有益かつ有用な治療をもたらす。
実施例７ 材料および方法
本明細書に記載される実施例により与えられた結果は、以下の材料および方法を用いて得た。
クローニング
用いた標的ポリヌクレオチドおよびｇＲＮＡおよびプライマーのＤＮＡ配列は、本明細書に記載されている。以下のスキャフォールドオリヌクレオチド配列を本明細書に記載される実験に採用した：ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ。ｇＲＮＡについて、スキャフォールド配列は以下のように提示され、式中、ウラシル（Ｕ）はＲＮＡ中でチミジン（Ｔ）に置き換わる：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣ ＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣ ＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ ＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣ ＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵ ＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵ ＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（ＵＵＵ）。
ｇＲＮＡは、本明細書に記載されているかまたは当業者の知識に基づき決定されかつ当業者に理解されるものとなるような病原性変異を含むＳＤＳ遺伝子に対する、スキャフォールド配列およびスペーサー配列（標的配列）を包含する。
塩基編集の方法は当技術分野に公知である。例えば、Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)；Gaudelli, N.M., et al., “Programmable base editing of A・T to G・C in genomic DNA without DNA cleavage” Nature 551, 464-471 (2017)；Komor, A.C., et al., “Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity” Science Advances 3:eaao4774 (2017)、およびRees, H.A., et al., “Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.” Nat Rev Genet. 2018 Dec;19(12):770-788. doi: 10.1038/s41576-018-0059-1を参照されたい。
ＰＣＲは、ＶｅｒａＳｅｑ ＵＬｔｒａＤＮＡポリメラーゼ（エンズマティクス）、またはＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を用いて実施した。塩基エディター（ＢＥ）プラスミドは、ＵＳＥＲクローニング（ニューイングランドバイオラボ）を用いて構築した。デアミナーゼ遺伝子は、ｇＢｌｏｃｋｓ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ）として合成した。本発明に有用なＣａｓ９遺伝子は、下記に列挙され、本明細書に記載されている。Ｃａｓ９遺伝子は、既に報告されているプラスミドから取得した。デアミナーゼおよび融合遺伝子は、ｐＣＭＶ（哺乳類コドン最適化）骨格またはｐＥＴ２８ｂ（大腸菌コドン最適化）骨格内にクローニングした。ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは、部位特異的変異誘発を用いて構築した。
簡潔に述べれば、本発明に有用なプライマーを、製造業者の指示書に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を用いて、５’リン酸化した。次に、上記リン酸化プライマーと、鋳型として目的の遺伝子をコードするプラスミドとを併せて、製造業者の指示書に従ってＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ）を用いて、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（２０Ｕ、ニューイングランドバイオラボ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、ＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム（キアゲン）にて精製し、製造業者の指示書に従ってＱｕｉｃｋＬｉｇａｓｅ（ニューイングランドバイオラボ）を用いて連結した。ＤＮＡベクターの増幅は、Ｍａｃｈ１コンピテントセル（サーモフィッシャーサイエンティフィク）を用いて行った。
ｓｓＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏデアミナーゼアッセイ
全てのｓｓＤＮＡ基質の配列は、標準的な方法を用いて取得した。全てのＣｙ３標識基質は、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（ＩＤＴ）から入手した。デアミナーゼは、製造業者の指示書に従ってＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ転写／翻訳キット（プロメガ）を用いて、１μｇのプラスミドを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで発現した。タンパク質発現の後、５μＬのリアーゼを、３５μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ）（５０ｍＭ酢酸カリウム、２９ｍＭトリス－酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００μｇｍＬ－１ ＢＳＡ、ｐＨ７．９）中のｓｓＤＮＡ（１．８μＭ）およびＵＳＥＲ酵素（１ユニット）と合わせて、３７℃で２時間インキュベートした。切断したＵ含有基質を、１０％ＴＢＥ－尿素ゲル（バイオラッド）上で完全長の未改変基質から分離した。
塩基エディターの発現および精製
大腸菌ＢＬ２１ ＳＴＡＲ（ＤＥ３）コンピテントセル（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を、プラスミド（例えばｐＥＴ２８ｂ－Ｈｉｓ６－ＰＶ１－１４またはｐＥＴ２８ｂ－Ｈｉｓ６－ＡＰＯＢＥＣ－リンカー－ｄＣａｓ９をコードするプラスミド）を用いて形質転換した。結果として得られた発現株を、１００μｇｍＬ－１のカナマイシンを含有するルリア－ベルターニ（ＬＢ）ブロス中、３７℃で一晩増殖させた。細胞を同じ増殖培地内で１：１００に希釈し、３７℃でＯＤ６００＝約０．６まで増殖させた。培養物を４℃で２時間超冷却し、イソプロピル－β－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭで添加してタンパク質発現を誘導した。約１６時間後、４，０００ｇの遠心分離により細胞を収集して、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン（トリス）－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、ソルテックベンチャーズ））に再懸濁した。細胞を超音波処理（出力６Ｗで計８分間の２０秒のパルスオンと２０秒のパルスオフ）によって溶解し、１５分間の２５，０００ｇの遠心分離の後に、溶解上清を単離した。溶解物を、Ｈｉｓ－Ｐｕｒニッケル－ニトリロ酢酸（ニッケル－ＮＴＡ）樹脂（サーモフィッシャーサイエンティフィック）と共に４℃で１時間インキュベートし、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質を捕捉した。樹脂をカラムに移して、４０ｍＬの溶解緩衝液で洗浄した。Ｈｉｓタグ化融合タンパク質を、２８５ｍＭイミダゾールを補充した溶解緩衝液に溶出させて、限外濾過（アミコン－ミリポア、分子量１００ｋＤａをカットオフ）により１ｍＬの総体積に濃縮した。タンパク質を、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン（トリス）－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭ ＴＣＥＰを含有する低塩濃度精製緩衝液にて２０ｍＬに希釈し、ＳＰセファロースファストフロー樹脂（ＧＥライフサイエンシズ）上にロードした。樹脂を４０ｍＬのこの低塩濃度緩衝液により洗浄し、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン（トリス）－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭ ＴＣＥＰを含有する５ｍＬの活性緩衝液によりタンパク質を溶出した。溶出タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより定量した。
ｓｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
Ｔ７プロモーターとそれに続く２０ｂｐのｓｇＲＮＡ標的配列とを含有する線状ＤＮＡ断片を、製造業者の指示書に従ってＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７高収率転写キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。ｓｇＲＮＡ産物を、製造業者の指示書に従ってＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて精製し、ＵＶ吸光度により定量した。
Ｃｙ３コンジュゲートｄｓＤＮＡ基質の調製
典型的には、非標識の配列鎖（例えば、８０ｎｔの非標識鎖の配列）を、ＰＡＧＥ精製オリゴヌクレオチドとしてＩＤＴに発注した。各８０ｎｔの基質の３’端に相補的な２５ｎｔのＣｙ３標識プライマーを、ＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドとしてＩＤＴに発注した。Ｃｙ３標識ｄｓＤＮＡ基質を生成するために、８０ｎｔの鎖（５μＬの１００μＭ溶液）を、ｄＮＴＰｓ（０．７５μＬの１００ｍＭ溶液）を含むＮＥＢｕｆｆｅｒ２（３８．２５μＬの５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９溶液、ニューイングランドバイオラボ）中のＣｙ３標識プライマー（５μＬの１００μＭ溶液）と合一して、９５℃で５分間加熱した後、秒当たり０．１℃の速度で徐々に４５℃に冷却した。このアニーリング期間の後、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ-（５Ｕ、ニューイングランドバイオラボ）を添加して、反応物を３７℃で１時間インキュベートした。溶液を緩衝液ＰＢ（２５０μＬ、キアゲン）およびイソプロパノール（５０μＬ）により希釈し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンカラム（キアゲン）上で精製して、５０μＬのトリス緩衝液により溶出した。
ｄｓＤＮＡへのデアミナーゼアッセイ
精製した融合タンパク質（活性緩衝液中１．９μＭを２０μＬ）を、１当量の適切なｓｇＲＮＡと合わせて、周囲温度で５分間インキュベートした。Ｃｙ３標識ｄｓＤＮＡ基質を、終濃度１２５ｎＭとなるように添加し、結果として得られた溶液を、３７℃で２時間インキュベートした。緩衝液ＰＢ（１００μＬ、キアゲン）およびイソプロパノール（２５μＬ）を添加することによって、ｄｓＤＮＡを融合物から分離し、ＥｃｏｎｏＳｐｉｎマイクロスピンカラム（エポックライフサイエンス）上で精製し、２０μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ）を用いて溶出する。ＵＳＥＲ酵素（１Ｕ、ニューイングランドバイオラボ）を、精製した編集済みｄｓＤＮＡに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。Ｃｙ３標識鎖を、５μＬの反応溶液と１５μＬのＤＭＳＯベースのローディング緩衝液（５ｍＭトリス、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１２．５％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー、０．０２％キシレンシアン、８０％ＤＭＳＯ）とを合わせることによって、その片割れから充分に変性した。完全長のＣ含有基質を、１０％ＴＢＥ－尿素ゲル（バイオラッド）上で任意の切断された編集済みのＵ含有基質から分離し、ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎイメージャー上でイメージングした。
ハイスループットシークエンシングのためのｉｎ ｖｉｔｒｏ編集ｄｓＤＮＡの調製
オリゴヌクレオチドをＩＤＴから入手した。相補的な配列をトリス緩衝液中で合一し（５μＬの１００μＭ溶液）、９５℃で５分間加熱することによってアニーリングした後、秒当たり０．１℃の速度で徐々に４５℃に冷却して、６０ｂｐのｄｓＤＮＡ基質を生成した。精製した融合タンパク質（活性緩衝液中１．９μＭを２０μＬ）を、１当量の適切なｓｇＲＮＡと合一し、周囲温度で５分間インキュベートした。６０ｍｅｒのｄｓＤＮＡ基質を、終濃度１２５ｎＭとなるように添加し、結果として得られた溶液を、３７℃で２時間インキュベートした。緩衝液ＰＢ（１００μＬ、キアゲン）およびイソプロパノール（２５μＬ）を添加することによって、ｄｓＤＮＡを融合物から分離し、ＥｃｏｎｏＳｐｉｎマイクロスピンカラム（エポックライフサイエンス）上で精製し、２０μＬのトリス緩衝液を用いて溶出した。結果として得られた編集済みＤＮＡ（１μＬを鋳型として使用）を、製造業者の指示書に従って、ハイスループットシークエンシング用プライマー対とＶｅｒａＳｅｑ Ｕｌｔｒａ（エンズマティクス）とを用いたＰＣＲにより１３サイクルの増幅で増幅した。ＰＣＲ反応産物を、ＲａｐｉｄＴｉｐｓ（ディフィニティゲノミクス）を用いて精製し、精製したＤＮＡを、シークエンシングアダプターを含有するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、精製し、以前に記載されたようにＭｉＳｅｑハイスループットＤＮＡシークエンサー（イルミナ）にてシークエンシングした。
細胞培養
野生型ＳＤＳＰまたは変異体ＳＤＳＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）およびＵ２ＯＳ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－９６）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地プラスＧｌｕｔａＭａｘ（サーモフィッシャー）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ＨＣＣ１９５４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３３８）は、上記に記載されるようにＲＰＭＩ－１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）中で維持した。ＳＤＳＰ）（タコニックバイオサイエンシズ）を含有する不死化細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と２００μｇｍＬ－１ジェネティシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とを補充したダルベッコ改変イーグル培地プラスＧｌｕｔａＭａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）中で培養した。
トランスフェクション
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地プラスＧｌｕｔａＭａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）を、４８ウェルのコラーゲン被覆ＢｉｏＣｏａｔプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種し、およそ８０～８５％の集密度でトランスフェクトした。簡潔に述べれば、７５０ｎｇのＢＥまたは他のシチジンデアミナーゼおよび／または２００ｎｇのＳｐＣａｓ９、および２５０ｎｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドを、製造業者の指示書に従って、ウェル当たり１．５μＬのリポフェクタミン２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者の指示書に従って適切なＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩプログラムを用いて（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するプログラムＱ－００１を用いたＶキット）トランスフェクトした。一部の場合では、細胞をトランスフェクション後に３日間培養してから培地を除去した。細胞を１×ＰＢＳ溶液（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で洗浄し、３０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＳＤＳ、２５μｇ／ｍＬプロテアーゼＫ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加することによってゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは使用するまで－２０℃で保管した。
ゲノムＤＮＡ試料のハイスループットＤＮＡシークエンシング
トランスフェクトした細胞を３日後に採集し、製造業者の指示書に従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＤＮＡｄｖａｎｃｅゲノムＤＮＡ単離キット（ベックマンコールター）を用いて、ゲノムＤＮＡを単離した。目的のオンターゲットゲノム領域およびオフターゲットゲノム領域を、側面に位置するハイスループットシークエンシングプライマー対を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅は、製造業者の指示書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（サーモフィッシャー）により、５ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行った。サイクル数は、確実に反応が増幅の直線範囲内で停止するように、各プライマー対に対し別々に決定した。ＰＣＲ産物を、ＲａｐｉｄＴｉｐｓ（ディフィニティゲノミクス）を用いて精製した。精製したＤＮＡを、シークエンシングアダプターを含有するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。産物をゲル精製し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（サーモフィッシャー）およびＫＡＰＡライブラリー定量キット－イルミナ（ＫＡＰＡバイオシステムズ）を用いて定量した。試料を、以前に記載されたように（Pattanayak, Nature Biotechnol. 31, 839-843 (2013)）イルミナＭｉＳｅｑにてシークエンシングした。
データ解析
シークエンシングのリードを、ＭｉＳｅｑレポーター（イルミナ）を用いて自動的にデマルチプレックスし、個々のＦＡＳＴＱファイルを、カスタムＭａｔｌａｂにより解析した。スミス－ウォーターマンアルゴリズムを用いて、各リードを対毎に適切な参照配列にアラインメントした。３１未満のＱスコアを有するベースコールは、Ｎに置き換えられため、ヌクレオチド頻度の計算の際には除外された。この処理により、ＭｉＳｅｑベースコーリングエラー率がおよそ１，０００分の１であったものと予想される。リードおよび参照配列がギャップを含んでいなかったアラインメント配列は、アラインメントテーブルに格納され、このテーブルから塩基頻度を各遺伝子座について表に表すことができた。インデル頻度を、以前に記載された基準（Zuris, et al., Nature Biotechnol. 33, 73-80 (2015)を用いてカスタムＭａｔｌａｂスクリプトにより定量化した。インデルが発生し得る枠の両側に位置する２つの１０ｂｐの配列に正確に合致するかについて、シークエンシングのリードをスキャンした。正確な合致が位置しなければ、そのリードを解析から除外した。このインデル枠の長さが参照配列に正確に合致すれば、インデルを含有しないものとしてそのリードを分類した。インデル枠が、参照配列よりも長いかまたは短い２つ以上の塩基であれば、そのシークエンシングのリードを、それぞれ挿入または欠失として分類した。
他の実施形態
前出の記載から、様々な使用および条件に採用するように本明細書に記載される本発明にバリエーションおよび改変が行われ得ることが明らかになろう。そのような実施形態はまた、以下の特許請求の範囲の範疇内にある。
本明細書における可変要素の任意の定義の中にある要素の列挙の記載は、その可変要素の定義を任意の単一の要素または列挙した要素の組合せ（または部分的組合せ）として含む。本明細書における一実施形態の記載は、その実施形態を任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態またはその一部との組合せとして含む。
参照による組込み
本明細書に言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれるが、それは、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることを特にかつ個々に標示しているのと同じ程度である。別段になんらかの標示がなければ、本明細書に言及された刊行物、特許、および特許出願は、本明細書に参照によりその全体を組み込まれる。

Claims (185)

  1. 転写を可能にするようにポリヌクレオチドを編集する方法であって、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中の塩基エディターに前記ポリヌクレオチドを接触させることを含み、前記塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数の前記ガイドポリヌクレオチドが、前記塩基エディターを標的に向けて、転写を可能にする変異を導入する変更をもたらす、方法。
  2. 転写を可能にする前記変異が、終止コドンを変更する変異、スプライスアクセプターもしくはスプライスドナー部位を導入する変異、またはスプライスアクセプターもしくはスプライスドナー部位を修正する変異である、請求項１に記載の方法。
  3. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異を含むＳＢＤＳポリヌクレオチドを編集する方法であって、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中の塩基エディターに前記ＳＢＤＳポリヌクレオチドを接触させることを含み、前記塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数の前記ガイドポリヌクレオチドが、前記塩基エディターを標的に向けて、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異の変更をもたらす、方法。
  4. 前記デアミナーゼが、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記デアミナーゼがアデノシンデアミナーゼである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記アデノシンデアミナーゼは、表７Ａまたは表７Ｂに挙げられたＡＢＥ８またはＡＢＥ８バリアントから選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項４に記載の方法。
  8. 前記シトシンデアミナーゼが、ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ；Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち１つまたは複数から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントが、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. ２つ以上のガイドポリヌクレオチドが、塩基エディターを標的に向けて、シュワックマン・ダイアモンド症候群に関連する２つ以上の変異の変更をもたらす、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  11. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異を含むＳＢＤＳポリヌクレオチドを編集する方法であって、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中のアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）にＳＢＤＳポリヌクレオチドを接触させることを含み、前記塩基エディターは、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドは、塩基エディターを標的に向けて、１８３～１８４ＴＡ＞ＣＴ Ｒｓ１１３９９３９９１のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更をもたらし、ミスセンス変異を生成する、方法。
  12. 前記ガイドポリヌクレオチドが、以下の配列のうち１つを標的とする、請求項４に記載の方法：ＴＧＴＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＴＣまたはＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴ。
  13. 前記ＡＢＥが、５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭ特異性を有する、請求項７に記載の方法。
  14. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する変異を含むＳＢＤＳポリヌクレオチドを編集する方法であって、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとの複合体中のシチジン塩基エディターに前記ＳＢＤＳポリヌクレオチドを接触させることを含み、前記シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）が、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとシチジンデアミナーゼドメインとを含み、１つまたは複数の前記ガイドポリヌクレオチドが、前記塩基エディターを標的に向けて、ｒｓ１１３９９３９９３ ２５８＋２Ｔ＞ＣのＣ・ＧからＴ・Ａへの変更をもたらす、方法。
  15. 前記ＣＢＥが、５’－ＮＧＣ－３’ＰＡＭ特異性または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭへの特異性を有する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ガイドポリヌクレオチドが、ＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣ、ＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣ、ＧＴＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣ、ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴ、ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣ、またはＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣから選択されるポリヌクレオチド標的配列を標的とする、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
  17. 前記接触させることが、細胞、真核細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞内である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記細胞がｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏである、請求項１７に記載の方法。
  19. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する前記変異が、遺伝子変換に起因する、請求項３～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する前記変異が、前記遺伝子の終止コドンを誘発するか、またはスプライシングを変更する、請求項３～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する前記変異が、切詰を有するＳＢＤＳポリペプチドをコードする、請求項３～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記塩基エディターが、ミスセンス変異を導入するか、新しいスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を挿入するか、および／または変異を含むスプライスアクセプター部位もしくはスプライスドナー部位を修正する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、スタフィロコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルス１Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）、ストレプトコッカス・カニスＣａｓ９（ＳｃＣａｓ９）、またがそれらのバリアントから選択されるＣａｓ９である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、野生型もしくは改変型のストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそのバリアントである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記ＳｐＣａｓ９が、ＰＡＭ核酸配列の５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＧ－３’に対する特異性を有する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＳｐＣａｓ９が、ＰＡＭ核酸配列５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントが、表１に挙げられたアミノ酸配列を含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記改変型ＳｐＣａｓ９がｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記改変型ＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントが、図３Ａ～図３Ｃまたは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含む、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記改変されたＳｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９バリアントが、以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含む、請求項３１に記載の方法：
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
    Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。
  33. ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性のまたはニッカーゼのバリアントである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記デアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデノシンまたはシトシンを脱アミノ化することができる、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼが、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、請求項１６に記載の方法。
  37. 前記アデノシンデアミナーゼがＴａｄＡデアミナーゼである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ＴａｄＡデアミナーゼが、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＴａｄＡ＊７．１０が、以下の変更のうち１つまたは複数を含む、請求項３８に記載の方法：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。
  40. 前記ＴａｄＡ＊７．１０が、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙからなる群から選択される変更の組合せを含む、請求項３９に記載の方法：
  41. 前記１つまたは複数のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、前記ｃｒＲＮＡが、ＳＤＳに関連する前記変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記塩基エディターが、ＳＤＳに関連付けられた変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記ｓｇＲＮＡが、以下の配列のうち１つを含む、請求項１２に記載の方法：ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣまたはＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ。
  44. 前記ｓｇＲＮＡが、以下の配列のうち１つを含む、請求項１６に記載の方法：
    ＧＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣ；ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ；ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡ；ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、またはＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ。
  45. 細胞内またはその前駆体内に、
    細胞に、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター、前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；および
    前記塩基エディターを標的に向けて異常なスプライシングに関連する変更をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドを、
    導入することによって産生される細胞。
  46. 前記細胞またはその前駆体が、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞である、請求項４５に記載の細胞。
  47. ＳＢＤＳタンパク質を発現する、請求項４６に記載の細胞。
  48. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に罹っている対象に由来する、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の細胞。
  49. 哺乳類細胞またはヒト細胞である、請求項４５～４８のいずれか１項に記載の細胞。
  50. 前記変異が、異常なスプライシングにより生じる終止コドンおよび／または変異を含む遺伝子変換に起因する、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の細胞。
  51. ＳＤＳに関連する遺伝子変換について選択される、請求項５０に記載の細胞。
  52. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、野生型もしくは改変型のストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそのバリアントである、請求項４５～５１のいずれか１項に記載の細胞。
  53. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された野生型ＳｐＣａｓ９または改変型ＳｐＣａｓ９バリアントを含む、請求項４５～５２のいずれか１項に記載の細胞。
  54. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が、核酸配列５’－ＮＧＣ－３’またはまたは５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する、請求項５３に記載の細胞。
  55. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が、表１に挙げられたＣａｓ９である、請求項５３に記載の細胞。
  56. 前記改変型ＳｐＣａｓ９がｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである、請求項５５に記載の細胞。
  57. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が、図３Ａ～図３Ｃまたは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントである、請求項５２に記載の細胞。
  58. 前記ＳｐＣａｓ９バリアントが、以下から選択されるアミノ酸配列／置換の組合せを含む、請求項５７に記載の細胞：
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
    Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。
  59. 前記プログラマブルポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性のバリアントである、請求項４５～５８のいずれか１項に記載の細胞。
  60. 前記プログラマブルポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインが、ニッカーゼバリアントである、請求項４５～５９のいずれか１項に記載の細胞。
  61. 前記ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む、請求項６０に記載の細胞。
  62. 前記デアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）内のシチジンを脱アミノ化することができるシチジンデアミナーゼドメインであるか、またはＤＮＡ内のアデノシンを脱アミノ化することができるアデノシンデアミナーゼドメインである、請求項４５～６１のいずれか１項に記載の細胞。
  63. 前記アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼが、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、請求項６２に記載の細胞。
  64. 前記アデノシンデアミナーゼがＴａｄＡデアミナーゼである、請求項６３に記載の細胞。
  65. 前記ＴａｄＡデアミナーゼが、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である、請求項６３に記載の細胞。
  66. 前記ＴａｄＡ＊７．１０が、以下の変更のうち１つまたは複数を含む、請求項６５に記載の細胞：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒ。
  67. 前記ＴａｄＡ＊７．１０が、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓからなる群から選択される変更の組合せを含む、請求項６６に記載の細胞。
  68. 前記シトシンデアミナーゼが、ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち１つまたは複数から選択される、請求項６３に記載の細胞。
  69. Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントが、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む、請求項６８に記載の細胞。
  70. 前記１つまたは複数のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、前記ｃｒＲＮＡが、ＳＤＳに関連する変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む、請求項４５～６９のいずれか１項に記載の細胞。
  71. 上記塩基エディターおよび１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、細胞内で複合体を形成する、請求項４５～７０のいずれか１項に記載の細胞。
  72. 前記塩基エディターが、ＳＤＳに関連付けられた前記遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある、請求項７１に記載の細胞。
  73. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）または異常なスプライシングに関連する疾患を、それを必要とする対象において治療する方法であって、請求項４５～７２のいずれか１項に記載の細胞を前記対象に投与することを含む方法。
  74. 前記細胞が、自己由来であるか、前記対象と同種異系または異種である、請求項７３に記載の方法。
  75. 請求項４５～７２のいずれか１項に記載の細胞から増殖または拡大された、単離された細胞または細胞の集団。
  76. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）を対象において治療する方法であって、それを必要とする対象に、
    ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター、または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；および
    前記塩基エディターを標的に向けてＳＤＳに関連する変更をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド
    を投与することを含む方法。
  77. 異常なスプライシングに関連する遺伝子疾患を対象において治療する方法であって、それを必要とする対象に
    ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼドメインとを含む塩基エディター、または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；および
    前記塩基エディターを標的に向けて、スプライシングを変更する病原性変異の変更をもたらす、１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド
    を投与することを含む方法。
  78. 前記対象が哺乳動物またはヒトである、請求項７６または７７に記載の方法。
  79. 前記塩基エディターまたは前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドと、前記１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドとを、前記対象の細胞に送達することを含む、請求項７６または７７に記載の方法。
  80. 前記細胞が、切詰型ポリペプチドを発現する、請求項７６または７７に記載の方法。
  81. 前記変更が、ＳＢＤＳポリヌクレオチド中でＴＡＡ終止をＴＧＧに変換する、請求項７６または７７に記載の方法。
  82. 前記変更が、ＳＤＳに関連する前記ＳＢＤＳポリペプチド中のＫ６２Ｘを変える、請求項７６～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. ＳＤＳに関連する前記遺伝子変換は、切詰型のＳＢＤＳポリペプチドの発現を結果として生じる、請求項７６～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記塩基エディターの修正は、アミノ酸６２位でリジン（Ｋ）をトリプトファン（Ｗ）に置き換える、請求項７６～５８のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、改変型のストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそのバリアントを含む、請求項７６～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された改変型ＳｐＣａｓ９を含む、請求項７６～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が、核酸配列５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が、表１に挙げられたＣａｓ９である、請求項８５～８７に記載の方法。
  89. 前記改変型ＳｐＣａｓ９がｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が、図３Ａ～図３Ｃまたは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントである、請求項８５～８７のいずれか１項に記載の方法。
  91. 前記ＳｐＣａｓ９バリアントが、以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含む、請求項９０に記載の方法：
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
    Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。
  92. ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性のバリアントである、請求項７６～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ニッカーゼのバリアントである、請求項７６～９１のいずれか１項に記載の方法。
  94. 前記ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記デアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデノシンまたはシチジンを脱アミノ化することができる、請求項７６～９４のいずれか１項に記載の方法。
  96. 前記デアミナーゼドメインが、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記アデノシンデアミナーゼがＴａｄＡデアミナーゼである、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記ＴａｄＡデアミナーゼが、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４である、請求項７０に記載の方法。
  99. 前記ＴａｄＡ＊７．１０が、以下の変更：Ｙ１４７Ｔ、Ｙ１４７Ｒ、Ｑ１５４Ｓ、Ｙ１２３Ｈ、Ｖ８２Ｓ、Ｔ１６６Ｒ、Ｑ１５４Ｒのうち１つまたは複数を含むか、または前記ＴａｄＡ＊７．１０が、Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｙ１２３Ｈ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙ；Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｔ１６６Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｒ；Ｙ１４７Ｔ＋Ｑ１５４Ｓ；Ｖ８２Ｓ＋Ｑ１５４Ｓ；およびＹ１２３Ｈ＋Ｙ１４７Ｒ＋Ｑ１５４Ｒ＋Ｉ７６Ｙからなる群から選択される変更の組合せを含む、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記デアミナーゼドメインが、ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち１つまたは複数から選択されるシチジンデアミナーゼである、請求項９６に記載の方法。
  101. Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントが、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記塩基エディターが、前記ＳＢＤＳポリヌクレオチド配列中のＳＮＰ ｒｓ１１３９９３９９３ ２５８＋２Ｔ＞Ｃを標的として正しいスプライシングを回復させる、請求項１００または１０１に記載の方法。
  103. 前記１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、前記ｃｒＲＮＡが、遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む、請求項７６～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記塩基エディターが、ＳＤＳに関連付けられた遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある、請求項７６～１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 細胞またはその前駆体を産生する方法であって、
    （ａ）シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する遺伝子変換を含む誘導多能性幹細胞内に、
    ポリヌクレオチド－プログラマブルヌクレオチド－結合ドメインとシチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインとを含む塩基エディターまたは塩基エディターをコードするポリヌクレオチド；および
    塩基エディターを標的に向けてＳＤＳに関連する変異に変更をもたらす１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド
    を導入すること；ならびに
    （ｂ）前記誘導多能性幹細胞または前駆体を所望の細胞型に分化させること
    を含む方法。
  106. 前記変異が、ＳＤＳに関連する遺伝子変換である、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記細胞または前駆体は、ＳＤＳに罹っている対象から得られる、請求項１０５または１０６に記載の方法。
  108. 前記細胞または前駆体が、哺乳類細胞またはヒト細胞である、請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、改変型ストレプトコッカス・ピロゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、またはそれらのバリアントを含む、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を変更された改変型ＳｐＣａｓ９を含む、請求項１０５～１０９のいずれか１項に記載の方法。
  111. 前記ＳｐＣａｓ９が、核酸配列５’－ＮＧＧ－３’に対する特異性を有し、前記改変型ＳｐＣａｓ９が、核酸配列５’－ＮＧＣ－３’または５’－ＮＧＣ－３’を含むＰＡＭ核酸配列に対する特異性を有する、請求項１０５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が表１に挙げられたＣａｓ９バリアントであるか、または前記改変型ＳｐＣａｓ９がｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＦＲＡＥＲである、請求項１１０に記載の方法。
  113. 前記改変型ＳｐＣａｓ９が、図３Ａ～図３Ｃまたは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントである、請求項１０９～１１１のいずれか１項に記載の方法。
  114. 前記ＳｐＣａｓ９バリアントが、以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含む、請求項１１３に記載の方法：
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
    Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）。
  115. ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼ不活性のまたはニッカーゼのバリアントである、請求項１０５～１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換Ｄ１０Ａまたはその対応するアミノ酸置換を含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）内のアデノシンを脱アミノ化することができ、シチジンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）内のシトシンを脱アミノ化することができる、請求項１０５～１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. 前記アデノシンデアミナーゼが、天然には発生しない改変型アデノシンデアミナーゼである、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４から選択されるＴａｄＡデアミナーゼである、請求項１１７または１１８に記載の方法。
  120. 前記デアミナーゼドメインが、ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントのうち１つまたは複数から選択されるシチジンデアミナーゼである、請求項１１７に記載の方法。
  121. Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントが、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランスコード化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、前記ｃｒＲＮＡが、ＳＤＳに関連する前記遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む、請求項１０５～１２１のいずれか１項に記載の方法。
  123. 上記塩基エディターおよび１つまたは複数のガイドポリヌクレオチドが、細胞内で複合体を形成する、請求項１０５～１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記塩基エディターが、ＳＤＳに関連付けられた前記遺伝子変換を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある、請求項１２３に記載の方法。
  125. 以下のうち１つまたは複数から選択される５’から３’の核酸配列、またはその１、２、３、４、もしくは５ヌクレオチドの５’切詰断片を含むガイドＲＮＡ：ＧＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣ；ＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ；ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡＵ；ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣ；ＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ、ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、およびＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ。
  126. ＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を編集するための塩基エディターシステムであって、
    （ａ）（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    （ｉｉ）前記ＳＢＤＳ遺伝子変換に存在するポリヌクレオチドまたはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
    を含む塩基エディター；および
    （ｂ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと連係するガイドポリヌクレオチドであって、少なくとも一部がＳＢＤＳ遺伝子、ＳＢＤＳ偽遺伝子、またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として前記塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチド
    を含み；
    ポリヌクレオチドまたはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、ＳＢＤＳ遺伝子の転写が可能になる、塩基エディターシステム。
  127. 異常なスプライシングを結果として生じる遺伝子内の変異を編集するための塩基エディターシステムであって、
    （ａ）（ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    （ｉｉ）異常なスプライシングを結果として生じる変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
    を含む塩基エディター；および
    （ｂ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと連係するガイドポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記遺伝子、またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として前記塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチド
    を含み；
    前記変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、転写が可能になる、塩基エディターシステム。
  128. 異常なスプライシングを結果として生じる遺伝子内の病原性変異を編集するための方法であって、
    少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を、
    （ｉ）少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチドと連係する、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、
    （ｉｉ）異常なスプライシングを結果として生じる病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
    を含む塩基エディターに接触させること；ならびに
    標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けると病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、病原性変異を編集すること
    を含み、
    病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することは、結果として、スプライシングを可能にする配列へ病原性変異を変換し、それによって病原性変異を修正する、方法。
  129. ＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を編集する方法であって、
    少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を、
    （ｉ）少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ポリヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けるガイドポリヌクレオチドと連係する、ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと、
    （ｉｉ）病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
    を含む塩基エディターに接触させること；ならびに
    標的ヌクレオチド配列を標的として前記塩基エディターを向けると病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、病原性変異を編集すること
    を含み、
    病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、スプライシングが可能になり、それによってＳＢＤＳ遺伝子の病原性変異を編集する、方法。
  130. ＳＢＤＳ中の前記病原性変異が遺伝子変換に起因する、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記病原性変異が、前記遺伝子の終止コドンを導入するかまたはスプライシングを変更する、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  132. 前記病原性変異が、切詰を有するポリペプチドをコードする、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  133. 前記塩基エディターが、ミスセンス変異を導入するか、新しいスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を挿入するか、または変異を含むスプライスアクセプター部位もしくはスプライスドナー部位を修正する、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  134. 前記塩基エディターは、ＳＢＤＳ遺伝子内のｒｓ１１３９９３９９３ Ｃ→Ｔの変異を含むスプライスドナーＳＮＰ部位を修正する、請求項１３３に記載の方法。
  135. ＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を編集することによって対象においてＳＤＳを治療する方法であって、
    塩基エディターまたは塩基エディターをコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することであって、塩基エディターが：
    （ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    （ｉｉ）病原性変異またはその相補的な核酸塩基内の核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
    を含む、投与すること；ならびに
    ガイドポリヌクレオチドを対象に投与することであって、前記ガイドポリヌクレオチドが、少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を標的として前記塩基エディターを向ける、投与すること；ならびに
    前記標的ヌクレオチド配列を標的として前記塩基エディターを向けた際にＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、前記病原性変異を編集すること
    を含み、
    前記病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することにより、転写が可能になるか、または前記病原性変異が修正される、方法。
  136. 細胞、組織、または器官のＳＢＤＳ遺伝子内の病原性変異を修正することによって、それを必要とする対象においてＳＤＳを治療するための細胞、組織、または器官を産生する方法であって、
    前記細胞、組織、または器官を、
    （ｉ）ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインと
    （ｉｉ）病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインと
    を含む塩基エディターに接触させること；ならびに
    前記細胞、組織、または器官をガイドポリヌクレオチドに接触させることであって、ガイドポリヌクレオチドが、少なくとも一部が上記遺伝子またはそのリバース相補鎖に位置する標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向ける、接触させること；ならびに
    前記標的ヌクレオチド配列を標的として塩基エディターを向けた際に病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、前記変異を編集すること
    を含み、
    前記病原性変異またはその相補的な核酸塩基を脱アミノ化することによって、スプライシングが可能となり、それによってＳＤＳを治療するための前記細胞、組織、または器官が産生される、方法。
  137. 前記変異が遺伝子変換に起因する、請求項１３６に記載の方法。
  138. シュワックマン・ダイアモンド症候群に関連する前記変異が、前記遺伝子の終止コドンを誘発するか、またはスプライシングを変更する、請求項１３６に記載の方法。
  139. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連する前記変異が、切詰を有するＳＢＤＳポリペプチドをコードする、請求項１３６に記載の方法。
  140. 前記塩基エディターが、ミスセンス変異を導入するか、新しいスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位を挿入するか、または変異を含むスプライスアクセプター部位もしくはスプライスドナー部位を修正する、請求項１３６に記載の方法。
  141. 前記細胞、組織、または器官を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１３６に記載の方法。
  142. 前記細胞、組織、または器官が、自己由来であるか、前記対象と同種異系または異種である、請求項１３６に記載の方法。
  143. 前記デアミナーゼドメインが、シチジンデアミナーゼドメインまたはアデノシンデアミナーゼドメインである、請求項１３６に記載の方法。
  144. 前記アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンを脱アミノ化することができ、前記シチジンデアミナーゼが、ＤＮＡ中のシトシンを脱アミノ化することができる、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記ガイドポリヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、請求項１２６～１４４のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  146. 前記ガイドポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列、またはそれらの組合せを含み、前記ｃｒＲＮＡが、ＳＤＳに関連する前記変更を含むＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む、請求項１２６～１４５のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  147. 第２のガイドポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２６～１４６のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  148. 前記第２のガイドポリヌクレオチドが、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、請求項１２６～１４７のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  149. 前記第２のガイドポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列、またはそれらの組合せを含む、請求項１２６～１４７のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  150. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、ヌクレアーゼ活性がないかまたはニッカーゼである、請求項１２６～１４９のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  151. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、請求項１２６～１５０のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  152. 前記Ｃａｓ９ドメインが、ヌクレアーゼ活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性のＣａｓ９である、請求項１２６～１５１のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  153. 前記Ｃａｓ９ドメインがＣａｓ９ニッカーゼを含む、請求項１５２に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  154. 前記ポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインが、工学的に改変されたかまたは改変型のポリヌクレオチドプログラマブルＤＮＡ結合ドメインである、請求項１２６～１５３のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  155. 前記編集により、結果として２０％未満のインデル形成、１５％未満のインデル形成、１０％未満のインデル形成、５％未満のインデル形成、４％未満のインデル形成、３％未満のインデル形成、２％未満のインデル形成、１％未満のインデル形成、０．５％未満のインデル形成、または０．１％未満のインデル形成を生じる、請求項１２６～１５４のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  156. 前記編集が、結果として転位を生じない、請求項１２６～１５５のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムまたは方法。
  157. 前記塩基エディターは、ＳＢＤＳ遺伝子内のｒｓ１１３９９３９９３ Ｃ→Ｔの変異を含むスプライスドナーＳＮＰ部位を修正する、請求項１２６～１５５のいずれか１項に記載の塩基エディターまたは方法。
  158. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）を、それを必要とする対象において治療する方法であって、請求項４５～７２のいずれか１項に記載の細胞を前記対象に投与することを含む方法。
  159. 前記塩基エディターおよび／またはその構成成分が、ｍＲＮＡによってコードされる、請求項１～４４もしくは７６～１２４のいずれか１項に記載の方法、または請求項４５～７２のいずれか１項に記載の細胞、または請求項１２６～１５７のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムもしくは方法。
  160. 前記塩基エディターが、ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な核酸配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との複合体の状態にある、請求項１～４４もしくは７６～１２４のいずれか１項に記載の方法、または請求項１２６～１５７のいずれか１項に記載の塩基エディターシステムもしくは方法。
  161. 前記ｓｇＲＮＡが、前記ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な少なくとも１０個の隣接したヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項１６０に記載の方法または塩基エディターシステム。
  162. 前記ｓｇＲＮＡが、前記ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接したヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項１６１に記載の方法または塩基エディターシステム。
  163. 前記ｓｇＲＮＡが、前記ＳＢＤＳ核酸配列に相補的な１８、１９、または２０個の隣接したヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項１６２に記載の方法または塩基エディターシステム。
  164. ガイドＲＮＡに結合している塩基エディターを含む組成物であって、前記ガイドＲＮＡが、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）に関連するＳＢＤＳ遺伝子に相補的な核酸配列を含む、組成物。
  165. 前記塩基エディターが、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼを含む、請求項１６４に記載の組成物。
  166. 前記アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンを脱アミノ化することができる、請求項１６５に記載の組成物。
  167. 前記アデノシンデアミナーゼが、ＴａｄＡ＊７．１０、ＴａｄＡ＊８．１、ＴａｄＡ＊８．２、ＴａｄＡ＊８．３、ＴａｄＡ＊８．４、ＴａｄＡ＊８．５、ＴａｄＡ＊８．６、ＴａｄＡ＊８．７、ＴａｄＡ＊８．８、ＴａｄＡ＊８．９、ＴａｄＡ＊８．１０、ＴａｄＡ＊８．１１、ＴａｄＡ＊８．１２、ＴａｄＡ＊８．１３、ＴａｄＡ＊８．１４、ＴａｄＡ＊８．１５、ＴａｄＡ＊８．１６、ＴａｄＡ＊８．１７、ＴａｄＡ＊８．１８、ＴａｄＡ＊８．１９、ＴａｄＡ＊８．２０、ＴａｄＡ＊８．２１、ＴａｄＡ＊８．２２、ＴａｄＡ＊８．２３、またはＴａｄＡ＊８．２４のうち１つまたは複数から選択されるＴａｄＡデアミナーゼである、請求項１６６に記載の組成物。
  168. 前記シチジンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のシチジンを脱アミノ化することができる、請求項１６５に記載の組成物。
  169. 前記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ、Ａ３Ｆ、またはそれらの誘導体である、請求項１６８に記載の組成物。
  170. 前記塩基エディターが、
    （ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼを含み；
    （ｉｉ）ヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９を含み；
    （ｉｉｉ）図３Ａ～３Ｃもしくは図１０に示されるアミノ酸置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントを含み；
    （ｉｖ）以下から選択されるアミノ酸配列置換の組合せを含むＳｐＣａｓ９バリアントを含み：
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２５ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２２６ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｑ（２２７ Ｃａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｑ（２３０ ＳｐＣａｓ９）；
    Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｄ、およびＴ１３３７Ｑ（２３５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｑ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｔ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２３７ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｈ、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７（２４２ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｃ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｎ、Ｅ１２１９Ｗ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｎ、およびＴ１３３７（２４４ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３ＬＭ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｓ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７（２４５ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６Ｗ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｍ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ（２５９ ＳｐＣａｓ９）；Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｓ１１３６Ｑ、Ｇ１２１８Ｋ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２、Ｒ１３３５Ａ、およびＴ１３３７Ｒ（Ｎｕｒｅｋｉ ＳｐＣａｓ９）；Ｄ１１３５Ｍ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７（ＮＧＣＲｄ１ ＳｐＣａｓ９）；または
    Ｄ１１３５Ｇ、Ｓ１１３６、Ｓ１２１６Ｇ、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２Ｒ、Ｄ１３３２Ａ、Ｒ１３３５Ｅ、およびＴ１３３７Ｒ（２６７ （ＮＧＣ Ｒｄ２ ＳｐＣａｓ９）；
    （ｖ）ＵＧＩドメインを含まず；ならびに／または
    （ｖｉ）ＢＥ４、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ＰｐＡＰＯＢＥＣ１、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、ＡｍＡＰＯＢＥＣ１、ＳｓＡＰＯＢＥＣ２、ＲｒＡ３Ｆ、Ｆ１３０Ｌ置換を含有するＲｒＡ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ－１がｒＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＡｍＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＳｓＡＰＯＢＥＣ２の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、ＡＰＯＢＥＣ－１がＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアント、もしくはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントから選択されるシチジンデアミナーゼを含む、
    請求項１６４～１６９のいずれか１項に記載の組成物。
  171. （ｖｉ）で、Ｈ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１、またはＡＰＯＢＥＣ－１がＨ１２２Ａ置換を含有するＰｐＡＰＯＢＥＣ１の配列に置き換えられたＢＥ４のバリアントは、Ｒ３３Ａ、Ｗ９０Ｆ、Ｋ３４Ａ、Ｒ５２Ａ、Ｈ１２１Ａ、またはＹ１２０Ｆから選択される１つまたは複数のアミノ酸変異をさらに含む、請求項１７０に記載の組成物。
  172. 医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含む、請求項１６４～１７１のいずれか１項に記載の組成物。
  173. 請求項１７２の組成物を含む、シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）の治療のための医薬組成物。
  174. 前記ｇＲＮＡおよび塩基エディターが、共にまたは別々に製剤化される、請求項１７３に記載の医薬組成物。
  175. 前記ｇＲＮＡは、以下のうち１つまたは複数から選択される５’から３’までの核酸配列またはその１、２、３、４、もしくは５個のヌクレオチドの５’切詰断片を含む、請求項１７３または１７４に記載の医薬組成物：ＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＣＡＵ；ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣ；ＡＡＵＧＵＵＵＣＣＵＡＡＧＧＵＣＡＧＧＵ、ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、ＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ、およびＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＵＡＡＣＡＧＣＵＧＣ。
  176. 哺乳類細胞での発現に適したベクターをさらに含み、前記ベクターは、前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１７３～１７５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  177. 前記塩基エディターをコードする前記ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである、請求項１７６に記載の医薬組成物。
  178. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項１７６または１７７に記載の医薬組成物。
  179. 前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である、請求項１７８に記載の医薬組成物。
  180. 哺乳類細胞での発現に適したリボ核粒子をさらに含む、請求項１７３～１７９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  181. （ｉ）塩基エディターをコードする核酸と（ｉｉ）請求項１２５のガイドＲＮＡとを含む医薬組成物。
  182. 脂質をさらに含む、請求項１７３～１８１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  183. シュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）を治療する方法であって、請求項１７３～１８２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  184. 対象のシュワックマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）の治療における、請求項１７３～１８２のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
  185. 前記対象がヒトである、請求項１８４に記載の使用。
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