CN101128478A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒的n蛋白突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种经遗传修饰的PRRS病毒及编码它的多核苷酸。本发明还提供了包含所述经遗传修饰病毒和多核苷酸的疫苗。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒的N蛋白突变体
技术领域
本发明提供了一种经遗传修饰的PRRS病毒及编码它的多核苷酸。本发明还提供了包含所述经遗传修饰的病毒和多核苷酸的疫苗。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)特征为母猪和小猪的流产、死产和其它繁殖问题，以及仔猪的呼吸疾病。其致病原为PRRS病毒--巢状病毒目(Nidovirales)和动脉炎病毒科(Arteriviridae)的成员。1980年代后期，在北美和欧洲几乎同时出现该病毒的两种基因型。PRRS病毒现在几乎遍布所有产猪国，并被认为是影响全球养猪业的经济上最为重要的疾病之一。
目前，对抗PRRS的商业疫苗包括改良的活疫苗和死疫苗(灭活疫苗)。死疫苗由于其不能诱导针对异源PRRS病毒株的强大的免疫作用而受到批评。改良的活疫苗在细胞培养中通过连续传代减毒，直到失去毒性。改良的活疫苗比起死疫苗诱发更为广大的保护，但是会带来大量安全性关注，包括残余的毒性、传播至未接种疫苗的猪以及遗传回复为毒性(genetic reversion to virulence)。由于减毒过程中发生的抗原改变，这类疫苗也可失去一些对抗PRRS病毒地方株的保护能力。因此迫切需要新颖的及改良的活疫苗对抗PRRS来提供保护。
附图概述
图1.(A)图示P129核壳体蛋白中NLS突变的位置和序列。(B)假感染的、P129感染的和P129-GG感染的MARK-145细胞的显微照片。上排显示使用相差显微镜技术的典型斑块，下排显示使用FITC缀合的单克隆抗体SDOW17对感染的病灶的荧光抗体染色。注意：用P129-GG感染细胞的核与核仁内没有核壳体(nucleocapsid)染色。
图2.(A)感染后第0天到第28天各治疗组病毒血症猪的数量(每组7只猪)。(B)感染后第0天到第28天各治疗组猪血清的平均病毒效价。(C)感染后第0天到第28天各治疗组猪血清中的平均ELISA抗体水平(S/P比值)。(D)图2C中所示血清的再滴定，测定前将所有的样品稀释为1∶5以更好的区别高效价样品中的差异。(E)四周的研究期间受感染的猪的平均血清中和效价。
序列概述
SEQ ID NO：1北美PRRSV分离株VR2332的N蛋白残基41-47
SEQ ID NO：2VR2332NoLS区序列
SEQ ID NO：3Lelystad NoLS区序列
SEQ ID NO：4VR2332分离株的NES区
SEQ ID NO：5Lelystad分离株的NES区
SEQ ID NO：6来自P129分离株的N蛋白氨基酸序列
SEQ ID NO：7来自P129分离株的ORF7(编码N蛋白)的核苷酸序列
SEQ ID NO：8引物P SHUTTLE FWD
SEQ ID NO：9引物P-SHUTTLE-REV
SEQ ID NO：10诱变引物KK43/44GG-Fwd
SEQ ID NO：11诱变引物KK43/44GG-REV
SEQ ID NO：12表8的缺失突变体。野生型P129的NLS2区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13表8的缺失突变体。野生型P129的NLS2区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：14表8的缺失突变体。P129-GG的NLS2区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15表8的缺失突变体。P129-GG的NLS2区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16表8的缺失突变体。P129-d43/44的NLS2区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17表8的缺失突变体。P129-d43/44的NLS2区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18表8的缺失突变体。P129-d43/44/46的NLS2区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19表8的缺失突变体。P129-d43/44/46的NLS2区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20表8的缺失突变体。P129-d44/46/47的NLS2区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21表8的缺失突变体。P129-d44/46/47的NLS2区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22表8的缺失突变体。P129-d46/47/48的NLS2区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23表8的缺失突变体。P129-d46/47/48的NLS2区的核苷酸序列。
SEQ ID NO：24 P129-d43/44F
SEQ ID NO：25 P129-d43/44/46F
SEQ ID NO：26 P129-d44/46/47F
SEQ ID NO：27 P129-d46/47/48F
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SEQ ID NO：29 P129-d43/44/46R
SEQ ID NO：30 P129-d44/46/47R
SEQ ID NO：31 P129-d46/47/48R
引用的参考文献
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发明内容
本发明提供了经遗传修饰的PRRS病毒，其核壳体(N)蛋白的NLS-2区、NoLS区和/或NES区内被修饰，使得产生的PRRS病毒被减毒。本发明另外还提供了编码该经遗传修饰的病毒的感染性RNA和包含下述DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述DNA序列编码上述感染性RNA分子。
本发明还提供了所述病毒的生物学上纯的培养物(即基本上不含其它病毒)，并且本发明描述了包含编码感染性RNA分子的DNA序列的病毒载体，所述RNA分子编码如上所述的遗传修饰的PRRS病毒。
本发明还提供了经转染的宿主细胞，其包含任何的上述病毒、感染性RNA分子、分离的多核苷酸或病毒载体。
本发明还提供了用于保护猪免受PRRS病毒感染的疫苗，该疫苗包含如上所述的经遗传修饰的PRRS病毒；如上所述编码经遗传修饰的PRRS病毒的感染性RNA分子；如上所述的经分离的多核苷酸分子(任选地，以质粒的形式)，其编码所述经遗传修饰的PRRS病毒；或上述编码经遗传修饰的PRRS病毒的病毒载体；它们的量为能够引起针对PRRS病毒感染的免疫保护的有效量；以及兽医学可用的载体。
本发明还提供了NLS-2的抗回复(reversion-resistant)突变体。本发明优选的实施方案(特别是用于疫苗目的的)将含有额外的核苷酸取代和/或缺失，以使回复的可能性最小化，并使其它侧翼残基突变为碱性残基(如赖氨酸和精氨酸)从而恢复该区域中NLS基元功能的可能性最小化。
本发明还提供了用于保护猪免受PRRS病毒感染的方法，包括用能有效地引起针对PRRS病毒感染的免疫保护的数量的上述疫苗对动物进行免疫。
本发明提供了用于制造经遗传修饰的PRRS病毒的方法，该方法包括突变编码感染性RNA分子的DNA序列，并使用合适的表达体系表达遗传修饰的PRRS病毒，所述感染性RNA分子编码如上所述的PRRS病毒。
野生型或经遗传修饰的PRRS病毒均可使用本领域公知的合适的表达体系从经分离的多核苷酸分子中表达，所述表达体系的例子描述于本申请。例如，经分离的多核苷酸分子可以是如下文进一步详细描述的质粒形式，其能够在体外合适的宿主细胞中表达编码的病毒。
本发明的其它特点将在叙述中显而易见。
发明详述
本文公开了通过突变或缺失病毒核壳体或N蛋白(由ORF7编码)中NLS-2区、NoLS区或NES区来使毒性PRRS病毒减毒的方法，还公开了包含所述减毒病毒的免疫原性组合物和通过用所述免疫原性组合物接种来保护猪免受PRRS感染的方法。已通过该方法减毒的PRRS病毒应保留毒性地方株的抗原特性，从而比基于细胞培养减毒病毒的疫苗提供更为有效的保护。
由ORF7编码的PRRSV的核壳体蛋白(N)是磷酸化的(Wootton，Rowland和Yoo，2002)并形成同型二聚体(Wootton和Yoo，2003)的小碱性蛋白。最近已确定了其晶体结构(Doan和Dokland，2003)。N蛋白在感染的细胞中似乎有多重功能。除了形成包裹基因组RNA的球形壳体结构外(其为细胞质中发生的过程)，N蛋白的部分转运进核并特定地转运至感染细胞的核仁。N蛋白的氨基酸序列含有两个核定位信号(NLS)、核仁定位信号(NoLS)和核输出信号(NES)以便分别转运进入核与核仁，以及转运出核(Rowland等，1999；Rowland等，2003；Rowland和Yoo，2003)。虽然处于核仁中，但N蛋白能与小核仁RNA-相关纤维蛋白相互作用，并可调节感染细胞中rRNA加工和核糖体生物发生以便病毒复制(Yoo等，2003)。在本发明中，我们展示出：N蛋白的NLS、NoLS和NES基元中的突变和缺失可产生核运输错乱的有活力病毒，且含有这类突变的病毒可用作对抗PRRS的疫苗。
这种类型的病毒突变自身或者与其它减毒突变组合对于设计新的PRRS疫苗都是有价值的。
定义
就本发明的目的而言，“有效的免疫保护应答”“免疫保护”和类似的术语指：针对一种或多种病原体抗原决定簇，以保护接种疫苗的动物免受病原体感染的免疫反应。就本发明的目的而言，针对病原体感染的保护不仅包括完全预防感染，而且包括与未接种疫苗的感染动物相比，接种疫苗的动物中任何可监测的病原体感染程度或比例的降低，或任何可监测的由病原体感染引起的疾病或任何症状或病症严重性的降低。可在之前未被病原体感染的和/或接种疫苗时未被病原体感染的动物中诱导有效的免疫保护应答。还可在接种疫苗时已经被病原体感染的动物中诱导有效的免疫保护应答。
如果经遗传修饰的PRRS病毒与其未经修饰的亲本株相比毒性较小，则其为“减毒”的。如果病毒株的一种或多种确定疾病严重性的参数显示统计学显著性降低，则其“毒性更小”。这类参数可包括病毒血症水平、发烧、呼吸性窘迫严重性、生殖症状严重性或肺损伤的数量或严重性等。
“欧洲PRRS病毒”是指具有与下述PRRS病毒相关的遗传特征的任何PRRS病毒株，所述PRRS病毒1991年左右在欧洲第一次被分离(参阅例如Wensvoort，G.，et al.，1991，Vet.Q.13：121-130)。“欧洲PRRS病毒”在本领域中有时也称为“Lelystad病毒”。
除非另有说明，本文使用“经遗传修饰的”是指通过人工干涉的遗传突变，“突变的”是指将一个氨基酸替换为另一个，或将编码核苷酸替换为另一个(例如C替换为T)，即所谓的“取代”，优选以编码的氨基酸被改变的形式进行，或指任何其它突变，如“缺失”或“插入”。突变通常在编码核苷酸序列中进行。
“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”是指被本发明病毒感染后能够产生感染性PRRS的细胞系。这类细胞包括猪肺泡巨噬细胞和猪肺泡巨噬细胞的衍生物、MA-104细胞和MA-104细胞的衍生物、MARC-145细胞和MARC-145细胞的衍生物以及用PRRS病毒受体转染的细胞。特别优选用于展示本发明小空斑现象的是MARC-145细胞。术语“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”还可包括活猪体内的细胞。
就本发明的目的而言“免疫应答”指直接针对特定抗原决定簇或协助分解或抑制特定抗原决定簇的抗体和/或细胞(如T淋巴细胞)的产生。
“北美PRRS病毒”是指具有与北美PRRS病毒分离株相关遗传特征的任何PRRS病毒，所述北美PRRS病毒分离株例如但不仅限于于1990年代早期左右在美国第一次被分离的PRRS病毒(参阅例如Collins，J.E.，etal.，1992，J.Vet.Diagn.Invest.4：117-126)、北美PRRS病毒分离株MN-lb(Kwang，J.等，1994，J.Vet.Diagn.Invest.6：293-296)、PRRS的QuebecIAF-exp91株(Mardassi，H.等，1995，Arch.Virol.140：1405-1418)和北美PRRS病毒分离株VR 2385(Meng，X.-J等，1994，J.Gen.Virol.75：1795-1801)。遗传特征是指北美PRRS病毒株共享的基因组核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。
本文使用“开放读码框”或“ORF”是指编码不含插入的终止密码子的特定PRRS病毒蛋白质所需的最小核苷酸序列。
本文使用“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，例如猪。本文使用术语“PRRS病毒”除非另有说明，是指任何北美或欧洲PRRS病毒株。
“PRRS”包括PRRS病毒感染引起的猪的疾病症状。这类症状的例子包括但不仅限于发烧、怀孕母猪流产、呼吸性窘迫、肺损伤、食欲丧失和幼猪死亡。本文使用“不能产生PRRS”的PRRS病毒是指能够感染猪，但是不能产生通常与猪中PRRS感染相关的任何疾病症状的病毒。
本文使用的PRRSV“N蛋白”或“ORF7”被定义为由PRRS病毒欧洲和北美基因型的ORF7编码的多肽。目前已知的N蛋白同种型的例子为以编号PRU87392报道于Genbank中的北美PRRS原型分离株VR2322的123个氨基酸的多肽，和以编号A26843报道于Genbank中的欧洲原型PRRS分离株Leylystad的128个残基的N蛋白。
“PRRSV N蛋白NLS-1区”或“PRRSV ORF7 NLS-1区”是指位于成熟N蛋白约最前端15个N-端残基内的“pat4”或“nuc1”核定位信号(Nakai& Kanehisa，1992；Rowland & Yoo，2003)，其含有四个连续的碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸)，或三个碱性残基和一个组氨酸或脯氨酸。举例来说，VR2332 NLS-1区序列为KRKK并位于残基9-12，而Lelysate序列为KKKK并位于N蛋白的残基10-13。
“PRRSV N蛋白NLS-2区”或“PRRSV ORF7 NLS-2区”是指N蛋白中第二个核定位信号，其可采用两种形式之一。在北美PRRS病毒中，NLS-2具有一种被我们命名为“pat8”基元的模式，其始于脯氨酸，之后的三个残基内跟随一个五残基序列，该序列五个残基中至少含有三个碱性残基(K或R)(由Nakai & Kanehisa，1992；Rowland & Yoo，2003描述的“pat7”或“nuc2”的轻度修饰)。举例来说，这种序列位于北美PRRS分离株VR2332的N蛋白残基41-47，并以序列PGKKNKKK(SEQ ID NO：1)为代表。在欧洲PRRS病毒中NLS-2具有“pat4”或“nuc1”基元，其为四个碱性氨基酸，或与组氨酸和脯氨酸结合的三个碱性残基的连续片段(Nakai & Kanehisa，1992；Rowland & Yoo，2003)。欧洲PRRSV分离株Lelystad的NLS-2位于残基47-50并以序列KKKK为代表。
“PRRSV N蛋白NoLS区”或“PRRSV ORF7 NoLS区”是指总长度约32个氨基酸并且在靠近其氨基端处包含NLS-2区的核仁定位信号。举例来说，VR2332 NoLS区序列位于残基41-72并以序列
PGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSER(SEQ ID NO：2)为代表(Rowland & Yoo，2003)，且相应的Lelystad分离序列位于残基42-73并以序列PRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTER(SEQ ID NO：3)为代表。
“PRRSV N蛋白NES区”或“PRRSV ORF7 NES区”是指含有位于接近N蛋白羧基端的LXL基元的核输出信号。NES基元为X-R(2-5)-X-R2-X-R-Y，其中X为亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，Y为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸，且R为任何氨基酸。如下文所示，北美和欧洲原型分离株均具有5残基间隔区，与该结构一致。
“经转染的宿主细胞”实际上是指美国专利5,600,662中所述的任何宿主细胞，该宿主细胞用PRRS病毒RNA转染时可产生第一代PRRS病毒体。如果期望进一步的生产性感染，应使用下文定义的“能够支持PRRS病毒复制的宿主细胞”。
可使用本领域常规技术人员已知的重组技术对多核苷酸分子进行遗传突变，包括如本领域已知的通过定向诱变、或通过随机诱变例如通过暴露于化学诱变剂或辐射中。所述突变可通过本领域已知的标准方法完成，例如对所述的感染性拷贝(例如Meulenberg等，Adv.Exp.Med.Biol，1998，440：199-206)进行定向诱变(参阅例如Sambrook等(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
因此，本发明还提供了用于制造经遗传修饰的北美PRRS病毒的方法，该方法包括：对编码感染性RNA分子的DNA序列加以突变，使用合适的表达体系表达经遗传修饰的PRRS病毒，所述感染性RNA分子编码如上所述的PRRS病毒。可使用本领域公知的合适的表达体系，从分离的多核苷酸分子中表达经遗传修饰的PRRS病毒，所述表达体系的例子描述于本申请中。例如，分离的多核苷酸分子可以是如下文进一步详细描述的质粒形式，其能够在体外合适的宿主细胞中表达编码的病毒。
北美PRRSV N蛋白序列高度保守，且报导的序列彼此具有约93-100％的同一性。北美和欧洲PRRSV N蛋白约57％-59％相同并分享共同的结构基元。
举例来说，VR2332 NES区序列位于残基106-117处，如序列LPTHHTVRLIRV(SEQ ID NO：4)(Rowland & Yoo，2003)所示，而Lelystad分离序列位于残基107-118处，如序列LPVAHTVRLIRV(SEQ ID NO：5)所示。
在以下包括了Genbank中北美PRRSV序列中所有序列的共有序列中，带有(*)的位置完全保守。可替代的氨基酸显示在各位置下方。
LPTHHTVRLIRV(SEQ ID NO：4)
**VAQ******A
 Q
 V
 G
上述氨基酸的编码基于所提到的数据库条目。在所有其它可能以不同方式编码的PRRS分离株中，通过鉴定目的PRRS病毒株中保守的特征性氨基酸并将其与参考病毒株比对，很容易识别正确的区域。本发明的一个目的是修饰PRRS病毒或其编码核酸，使得通过取代、缺失或插入使一个或多个保守区消失，从而得到减毒的表型。
通过修饰本发明编码病毒的多核苷酸，引入使得保守的NLS-2基元、NoLS区或NES基元消失的缺失、插入或取代。在优选的实施方案中，包含1、2、3、4或5个氨基酸的缺失或插入引起保守基元的消失，并产生减毒的病毒。
可根据其物理性质和对二级和三级蛋白结构的贡献对氨基酸加以分类。在本领域中保守取代被认为是：将一个氨基酸取代为具有类似特性的另一氨基酸。典型的保守取代列于下文紧接的表1(来自1997年三月13日公开(PCT/GB96/02197，9/6/96提交)的WO 97/09433，第10页)中。
表1
保守取代1
侧链特性        氨基酸
脂肪族
非极性          GAP
                ILV
极性不带电荷    CSTM
                NQ
极性带电荷      DE
                KR
芳香族          HFWY
其它            NQDE
或者，保守性氨基酸可以如Lehninger，[Biochemistry，第二版；WorthPublishers，Inc.NY:NY(1975)，第71-77页]所述分类，如下文紧接的表2中所列
表2
保守取代II
侧链特性            氨基酸
                                                
非极性(疏水的)
A.脂肪族：          ALIVP
B.芳香族：          FW
C.含硫：            M
D.边缘：            G
不带电荷-极性
A.羟基：            STY
B.酰胺：            NQ
C.硫氢基：          C
D.边缘：            G
带正电(碱性)：      KRH
带负电(酸性)：      DE
另一选择的典型的保守取代列于下文紧跟的表3。
表3
保守取代III
原始残基                     示例性取代
Ala(A)                        Val，Leu，Ile
Arg(R)                        Lys，Gln，Asn
Asn(N)                        Gln，His，Lys，Arg
Asp(D)                        Glu
Cys(C)                        Ser
Gln(Q)                        Asn
Glu(E)                        Asp
His(H)        Asn，Gln，Lys，Arg
Ile(I)        Leu，Val，Met，Ala，Phe，
Leu(L)        Ile，Val，Met，Ala，Phe
Lys(K)        Arg，Gln，Asn
Met(M)        Leu，Phe，Ile
Phe(F)        Leu，Val，Ile，Ala
Pro(P)        Gly
Ser(S)        Thr
Thr(T)        Ser
Trp(W)        Tyr
Tyr(Y)        Trp，Phe，Thr，Ser
Val(V)        Ile，Leu，Met，Phe，Ala
制备遗传修饰的PRRS病毒
重组DNA技术包括极为多变和强大的分子生物学技术，所述技术的目的在于在DNA水平上修饰核酸并使得在分子水平上分析和修饰基因组成为可能。在该方面，病毒(例如PRRS病毒)由于其基因组尺寸小而特别适合于这类操作。然而，重组DNA技术并非能直接应用于非反转录RNA病毒，因为这些病毒复制中不包含DNA中间体步骤。对这类病毒而言，必须先发展感染性cDNA克隆产生修饰的病毒，然后重组DNA技术可以应用于它们的基因组，制造修饰的病毒。感染性克隆可通过在研究中构建病毒的全长(基因组长度)cDNA(本文使用广义的RNA的DNA拷贝，并不仅限于狭义的mRNA的DNA拷贝)获得，之后在用全长cDNA转染的细胞中体内合成感染性转录物，但是感染性转录物也可通过对体外连接的部分长度的cDNA片段(其包括全长病毒基因组)进行体外转录获得。在所有的情况下，转录的RNA带有对被引入cDNA的所有修饰，并可用于进一步传代由此修饰的病毒。
对欧洲PRRS病毒分离体或Lelystad病毒的感染性克隆的制备描述于美国专利号6,268,199，其整体通过引用并入本文。称为P129(Lee等，2005；Yoo等，2004)的北美PRRS病毒分离体的感染性cDNA克隆的制备描述于美国专利6,500,662，其整体通过引用并入本文。P129 cDNA的序列公开于Genbank编号AF494042和美国专利6,500,662中。我们以下的工作利用这类感染性克隆，其在质粒背景中由CMV立即早期启动子表达，其被命名为pCMV-S-P129，并且还公开于美国专利6,500,662中。如美国专利6,500,662所述，还有其它质粒和启动子适用于本文的用途。
如果知道任何目的开放读码框的全序列和目的氨基酸残基的位置，普通技术人员仅需要参考密码子表即可在所需的特定位置设计改变。
氨基酸表及其代表性缩写、符号和密码子公开在下文表4中。
表4
  氨基酸   缩写   符号   密码子(s)
  丙氨酸   Ala   A   GCA   GCC   GCG   GCU
  半胱氨酸   Cys   C   UGC   UGU
  天冬氨酸   Asp   D   GAC   GAU
  谷氨酸   Glu   E   GAA   GAG
  苯丙氨酸   Phe   F   UUC   UUU
  甘氨酸   Gly   G   GGA   GGC   GGG   GGU
  组氨酸   His   H   CAC   CAU
  异亮氨酸   Ile   I   AUA   AUC   AUU
  赖氨酸   Lys   K   AAA   AAG
  亮氨酸   Leu   L   UUA   UUG   CUA   CUC   CUG   CUU
  甲硫氨酸   Met   M   AUG
  天冬酰胺   Asn   N   AAC   AAU
  脯氨酸   Pro   P   CCA   CCC   CCG   CCU
  谷氨酰胺   Gln   Q   CAA   CAG
  精氨酸   Arg   R   AGA   AGG   CGA   CGC   CGG   CGU
  丝氨酸   Ser   S   AGC   AGU   UCA   UCC   UCG   UCU
  苏氨酸   Thr   T   ACA   ACC   ACG   ACU
  缬氨酸   Val   V   GUA   GUC   GUG   GUU
  色氨酸   Trp   W   UGG
  酪氨酸   Tyr   Y   UAC   UAU
密码子构成mRNA及其对应的cDNA分子中核苷酸三联体序列。存在于mRNA中时，密码子以碱基尿嘧啶(U)为特征，但是存在于DNA中时，密码子以碱基胸腺嘧啶(T)为特征。多核苷酸中编码相同氨基酸残基的密码子简单改变，不会改变所编码的多肽的序列或结构。很明显地，当一短语陈述特定的3各核苷酸序列“编码”任何特定氨基酸时，普通技术人员会明白上表提供了鉴定所讨论的特定核苷酸的方法。举例而言，如果特定的三个核苷酸序列编码赖氨酸，上表揭示两种可能的三联体序列为AAA和AAG。甘氨酸由GGA、GGC、GGT(如果在RNA中为GGU)和GGG编码。为了在编码的蛋白质中将赖氨酸改变为甘氨酸，可在编码核酸序列中用GGA和GGC、GGT或GGG代替AAA或AAG三联体。来自P129分离体的N蛋白或ORF7蛋白的编码序列举例如下。
  表5-----来自P129分离体的N蛋白的编码序列
  M   P   N   N   N   G   K   Q   Q   K   K   K 12AMG CCA AAT AAC AAC GGC AAG CAG CAA AAG AAA AAG36
  K   G   N   G   Q   P   V   N   Q   L   C   Q24AAG GGG AAT GGC CAG CCA GTC AAT CAG CTG TGC CAG72
  M   L   G   K   I   I   A   Q   Q   N   Q   S36ATG CTG GGT AAA ATC ATC GCC CAG CAA AAC CAG TCC108
  R   G   K   G   P   G   K   K   S   K   K   K 48 AGA GGC AAG GGA CCG GGC AAG AAA AGT AAG AAG AAA 144
  N   P   E   K   P   H   F   P   L   A   T   E 60 AAC CCG GAG AAG CCC CAT TTT CCT CTA GCG ACC GAA180
  D   D   V   R   H   H   F   T   P   G   E   R 72 GAT GAC GTC AGG CAT CAC TTC ACC CCT GGT GAG CGG216
  Q   L   C   L   S   S   I   Q   T   A   F   N84CAA TTG TGT CTG TCG TCG ATC CAG ACT GCC TTT AAC252
  Q   G   A   G   T   C   T   L   S   D   S   G96CAG GGC GCT GGA ACT TCT ACC CTG TCA GAT TCA GGG288
  R   I   S   Y   T   V   E   F   S   L   P   T 108AGG ATA AGT TAC ACT GTG GAG TTT AGT TTG CCG ACG324
  H   H   T   V   R   L   I   R   V   T   A   S120CAT CAT ACT GTG CGC CTG ATC CGC GTC ACA GCA TCA360
  P   S   A123  (SEQ ID NO：6)CCC TCA GCA369(SEQ ID NO：7)
NLS-2区中经修饰的突变体蛋白质N多核苷酸序列的构建通过实施例2中的阐述性例子来展示。
应当理解NLS-1、NoLS或NES区域中的突变可使用类似的技术和类似的结果完成。
证明遗传修饰的PRRS病毒是减毒的
为了证明特定遗传修饰的病毒株是减毒的，可使用下述实验。
每个试验至少包含10头来自无PRRSV农场的母猪。经检测这些动物无PRRS病毒特异血清抗体，并对PRRSV呈阴性。所有包含在试验中的动物来源和品种都相同。将动物随机分组。
怀孕后90天通过每个鼻孔鼻内施用1ml 105 TCID50的PRRSV进行攻击。每个测试计划至少有三组：一组用P129攻击；一个测试组用可能减毒的病毒攻击；和一组严格对照组。
如果严格对照组在研究期间维持PRRSV阴性，且P129攻击组与严格对照相比出生的健康活幼猪至少减少25％，则认为该研究有效。
减毒(即毒性较小)辈定义为一个或多个决定繁殖性能或其它症状的参数的统计学显著变化：
与未改造的亲代病毒株感染组相比，对于测试组(可能的减毒病毒)而言，至少一个以下参数显著降低将是减毒的标志：
a)死产频率
b)怀孕后112天之时或之前流产
c)木乃伊化幼猪数量
d)活力较差和虚弱的幼猪数量
e)断奶前死亡率
此外，优选与未改造亲代病毒株感染组相比，测试组中以下参数之一显著提高：
f)每头母猪断奶的幼猪数量
g)每头母猪产出的健康活幼猪数量。
或者，可检测PRRSV感染的呼吸症状或其它症状，如下文实施例3所述确定减毒。
疫苗
减毒的病毒株对于疫苗的配制颇有价值。
如果本疫苗保护猪免受PRRS病毒感染，则其为有效。如果对一头或更多未感染的猪施用疫苗后用生物学上纯的病毒分离体(例如VR2385、VR 2386、P129等)攻击，导致任何总体的或组织病理学改变(例如肺损伤)和/或疾病症状与分离体在未保护的类似猪中通常引起的这些改变或症状相比(即相对于合适的对照而言)严重性减轻，则该疫苗保护猪免受PRRS病毒感染。更具体来说，要显示该疫苗有效，可通过将疫苗施用给一头或更多需要疫苗的合适的猪，然后在适当长的时间(例如3周)后用大量(10(3-7)TCID(50))生物学上纯的PRRSV分离体攻击。约一周后从攻击的猪中抽取血样，然后尝试从血样中分离病毒(例如参阅下文实验VIII示例的病毒分离程序)。分离出大量病毒表示疫苗并非有效，而分离出较少数量的病毒(或没有病毒)指出疫苗可能有效。
因此，可定量(即与适当的对照组相比实质化肺组织减少的百分比)或定性(例如从血中分离PRRSV、在肺、扁桃体或淋巴结组织样品中通过免疫测定检测PRRSV抗原)地评价本疫苗的效力。可以定量地(例如体温/发烧)、半定量地(例如呼吸窘迫的严重性(下文详细解释))或定性地(例如一种或多种症状的存在与否，或一种或多种症状的严重性减轻，所述症状如发绀、肺炎、肺损伤等)评价猪繁殖与呼吸疾病的症状。
未感染的猪是未暴露于猪繁殖与呼吸疾病感染剂，或已经暴露于猪繁殖与呼吸疾病感染剂但是未显示该疾病症状的猪。感染的猪是显示PRRS症状或能从其中分离出PRRSV的猪。
本发明的疫苗可按照公认惯例配制，以含有包括人(如适用)在内的动物可接受的载体，例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并可配制为便于持续释放。稀释剂包括水、盐水、右旋糖(dextrose)、乙醇、甘油等。等张剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖及其它。稳定剂包括白蛋白及其它。其它合适的疫苗载体和添加剂(包括但不仅限于特别适用于配制改造的活疫苗的载体和添加剂)是已知的，并会是本领域技术人员显而易见的。参阅例如Remington′sPharmaceutical Science，18th ed.，1990，Mack Publishing，其通过引用并入本文。
本发明的疫苗还可包含一种或多种额外的免疫调节成分，例如佐剂或细胞因子及其它。可用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性例子包括RIBI佐剂体系(Ribi Inc.，Hamilton，Mont.)、明矾、矿物胶(例如氢氧化铝胶)、水包油乳剂、油包水乳剂，例如Freund′s完全佐剂和Freund′s不完全佐剂、Block共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)、AMPHIGEN佐剂、皂苷、Quil A或其它皂苷级分、单磷酰脂质A和Avridine脂胺佐剂。可用于本发明疫苗中的水包油乳剂的非限制性例子包括经改造的SEAM62和SEAM 1/2配方。改造的SEAM62为含有5％(v/v)鲨烯(Sigma)、1％(v/v)SPAN 85洗涤剂(ICI Surfactants)、0.7％(v/v)TWEEN 80洗涤剂(ICISurfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200pg/ml Quil A，100[mgr]g/ml胆固醇以及0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳剂。改造的SEAM 是包含5％(v/v)鲨烯、1％(v/v)SPAN 85洗涤剂、0.7％(v/v)Tween 80洗涤剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A以及50μg/ml胆固醇的水包油乳剂。可包含在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白介素、干扰素或其它已知的细胞因子。
任选地可对本发明的疫苗加以配制，以持续释放本发明的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体。这类持续释放配方包括与生物相容性多聚体(例如聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、胶原等)组合物结合的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体。药物递送载体中的可降解多聚体的结构、选择和使用已经综述于若干出版物中，包括A.Domb等，1992，Polymers for Advanced Technologies 3：279-292，其在通过引用并入本文。在药物配方中选择和使用多聚体的其它指导可见于本领域已知文献中，例如M.Chasin and R.Langer(eds)，1990，″BiodegradablePolymers as Drug Delivery Systems″in：Drugs and the PharmaceuticalSciences，Vol.45，M.Dekker，N.Y.，其也通过引用并入本文。或者，或另外地，可将病毒、质粒或病毒载体微囊包埋以促进给药和疗效。用于微囊包埋抗原的方法为本领域公知，并包括如美国专利号3,137,631、美国专利号3,959,457、美国专利号4,205,060、美国专利号4,606,940、美国专利号4,744,933、美国专利号5,132,117、国际专利公开WO 95/28227中所述的技术，所有资料通过引用并入本文。
脂质体也可用于提供病毒、质粒或病毒载体的持续释放。有关如何制造并使用脂质体配方的细节可见于美国专利号4,016,100、美国专利号4,452,747、美国专利号4,921,706、美国专利号4,927,637、美国专利号4,944,948、美国专利号5,008,050和美国专利号5,009,956，所有上述资料通过引用并入本文。
任何上述疫苗的有效数量可通过常规方法确定，从低剂量的病毒、质粒或病毒载体开始，然后提高剂量并监测疗效。有效数量可以在单次施用疫苗或多次施用疫苗后获得。当确定每只动物的最佳剂量时，可考虑已知因素。这些已知因素包括动物的品种、大小、年龄和整体状况、动物中存在的其它药物等。优选在考虑其它的动物研究的结果后选择实际剂量。
用于监测是否达到适当免疫应答的方法是在接种疫苗后检测动物中的血清转化和抗体效价。优选由医生或兽医基于对所有相关因子(其中一些在上文中描述)的分析来确定接种疫苗的时间以及加强次数(如果有的话)。
可使用已知技术，考虑本领域技术人员可确定的因素(例如要接种疫苗的动物的体重)确定本发明病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量。本发明疫苗中本发明病毒的剂量优选在约101到约109pfu(蚀斑(plaque)形成单位)范围内，更优选从约102到约108pfu，并最优选从约103到约107pfu。本发明疫苗中本发明质粒的剂量优选从约0.1μg到约100mg范围内，更优选从约1μg到约10mg，甚至更优选从约10μg到约1mg。本发明疫苗中本发明感染性RNA分子的剂量优选从约0.1到约100mg范围内，更优选从约1μg到约10mg，甚至更优选从约10μg到约1mg。本发明疫苗中本发明病毒载体的剂量优选从约101pfu到约109pfu范围内，更优选从约102pfu到约108pfu，甚至更优选从约103到约107pfu。合适的剂量大小从约0.5ml到约10ml范围内，更优选从约1ml到约5ml。
举例来说，疫苗可经口服、肠胃外、皮内、皮下、肌肉内、鼻内或静脉内递送。口服递送可包括例如将组合物添加至动物的食物或饮料中。与疫苗剂量相关的因素包括例如猪的体重和年龄。
本发明还提供了用于制备包含本文所述PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的疫苗的方法，该方法包括将有效量的本发明PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体之一与药学或兽医学用途可接受的载体组合。
另外，可如美国专利6,500,662所述，修饰本发明的减毒活疫苗，以编码异源抗原决定簇，使用已知重组技术将所述异源抗原决定簇插入PRRS病毒基因组。可用作本发明异源抗原决定簇的抗原决定簇包括来自处PRRS病毒外的猪病原体的抗原决定簇，其包括但不仅限于来自选自以下的猪病原体的抗原决定簇：猪细小病毒、猪环病毒、猪轮状病毒、猪流感、假狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、经典的猪霍乱病毒、非洲猪瘟病毒、脑炎心肌炎病毒、猪副黏液病毒、Actinobacilluspleuropneumoniae，Actinobacillus suis，Bacillus anthraci，Bordetellabronchiseptica，Clostridium haemolyticum，Clostridium perfringens，Clostridium tetani，Escherichia coli，Erysipelothdix rhusiopathiae，Haemophilusparasuis，Leptospira spp.，Mycoplasma hyopneumoniae，Mycoplasma hyorhinis，Mycoplasma hyosynovia，Pasteurella multocida，Salmonella choleraesuis，Salmonella typhimurium，Streptococcus equismilis，and Streptococcus suis。编码来自上述猪病原体的抗原决定簇的核苷酸序列为本领域已知，并可通过公开基因数据库如由NCBI提供的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html)获得。
根据本申请书的全文(包括发明详述)，本领域技术人员将知道本发明的其它特色和变更，且所有这类特色均应为本发明的方面。同样，本文描述的本发明的特色可与额外的实施方案再结合，其也应为本发明的方面，无论该特色的结合是否是上文作为本发明实施方案的一个方面所特别提到的。而且，只有本文描述为本发明关键性的这类限制被视为限制；缺乏本文描述为关键性限制的本发明的变更应为本发明的方面。应当明白，除前述说明和实施例中具体描述的方式外，本发明可以其它方式实施。
根据上述教导的启示，本发明可能有许多修饰和变更，因此属于本发明的范围内。
本发明通过以下实施例进一步说明，但不仅限于下列实施例。
实施例1：构建穿梭质粒pTB-shuttle-PRRSV-3997
构建穿梭质粒，以向全长PRRS病毒基因组cDNA克隆中引入特定修饰。PCR扩增代表病毒基因组最3’端的3,977bp片断(核苷酸位置11,504到15,416，包括21个残基的聚腺苷酸尾)和84bp的下游载体序列。PCR反应包括5ng pCMV-S-P129质粒DNA(US 6,500,662B1)、300ng正向引物P-shuttle-Fwd(5’-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3’)(SEQID NO：8)：位置11,504到11,530)、300ng反向引物P-shuttle-Rev引物(5’-ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC-3’)(SEQ ID NO：9)：位置15,500到15,475)、dCTP、dGTP、dATP和dTTP各1mM、1×PCR缓冲液[10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH 8.8)、2mMMgSO4、0.1％Triton X-100]和2.5U的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，使用GeneAmp PCR系统2400(Perkin Elmer)。反应加热到95℃5分钟，并在以下条件下进行35个循环的扩增：95℃变性30秒，55℃引物退火1分钟和72℃延伸3分钟。使用MicroCartridgeTM PCR克隆试剂盒XL(GenomicsOne；Buffalo，New York)将PCR产物克隆进pTtueBlue载体中，产生pTB-shuttle-PRRSV-3997。
实施例2：修饰NLS-2序列产生P129-GG病毒
使用基于PCR的定点突变来修饰位于核壳体(N)蛋白(nucleocapsidprotein)氨基酸位置41到47的核定位信号2(NLS-2)基元。在北美基因型PRRS病毒中，该NLS基元通常为PGKKNKK(如在原型分离株VR-2332或加拿大分离株PA-8中)或其衍生物如PGKKSKK(在分离株P129和93-47324中发现)。多个带正电赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基的存在被认为对完整的NLS信号功能是重要的。使用穿梭质粒和诱变引物对KK43/44GG-Fwd(5′-GGCAAGGGACCGGGAGGGGGAAATAAGAAGAAAAAC-3′)(SEQ ID NO：10)-：基因组位置14,984到15,019)和KK43/44GG-Rev(5′-GTTTTTCTTCTTATTTCCCCCTCCCGGTCCCTTGCC-3′)(SEQ ID NO：11)-：基因组位置14,984到15,019)将N蛋白位置43和44的赖氨酸残基(P129基因组核苷酸位置14,999-15,004)替换为甘氨酸残基，其中下划线部分指出用于从KKS到GGN氨基酸取代的密码子改变。PCR反应使用5ng pTB-shuttle-PRRSV-3997质粒DNA(US 6,500,662B1)、300ng正向引物P-shuttle-Fwd(5’-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3’)(SEQ IDNO：8)：位置11,504到11,530)、正向和反向引物各300ng、dCTP、dGTP、dATP和dTTP各1mM、1×PCR缓冲液[10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH 8.8)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100]和2.5U的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)。样品在以下条件下进行16个循环：94℃变性30秒，55℃引物退火1分钟和68℃引物延伸12分钟30秒。PCR循环后，用10U的DpnI消化PCR产物，以去除甲基化的质粒DNA模板。通过热激用4μl含有突变质粒的PCR-Dpn I消化反应物转化大肠杆菌(E.coli)XL1-Blue细胞，并涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上。随机挑取菌落并过夜培养。使用QIAprep离心小量制备试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA。通过核苷酸测序确认目的突变(PGGGNKK)的存在，并将产生的质粒命名为pTB-shuttle-N-GG。
带有GG突变的穿梭质粒(pTB-shuttle-N-GG)和野生型全长基因组克隆(pCMV-S-P129)各含有独特的BsrG I和Spe I位点(分别在位置1,192和3,963，以及位置12,692和15,463)。用这两种酶消化后，从pTB-shuttle-N-GG中凝胶纯化2,772bp BsrG I-Spe I片段，并从pCMV-S-P129中纯化16,120bp BsrG I-Spe I片段。使用T4 DNA连接酶(Invitrogen)将这两种片段连接，以构建GGN-修饰的全长基因组cDNA克隆。用10μl连接反应物转化大肠杆菌菌株DH5-α。从含有氨苄青霉素的LB平板上选择细菌菌落并制备质粒DNA。根据Xma I消化模式选择全长克隆。测序选择的克隆以确认GGN修饰在全长基因组cDNA克隆中的存在。产生的质粒之一被称为为pCMV-S-P129-GG。
在添加有8％胎牛血清(FBS；Gibco BRL)、青霉素(100U/ml)和链霉素(50μg/ml)的Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)中在37℃和5％CO2中培养MARC-145细胞。细胞接种于35mm直径培养皿中，并培养至70％覆盖率。用2μg的pCMV-S-P129-GG质粒DNA，使用Lipofectin(Invitrogen)将细胞转染24小时。经转染的细胞在37℃下于添加有8％FBS的DMEM中孵育5天。转染后3天观察到PRRSV特异的细胞病变效应(CPE)，并在转染后5天观察到扩散至邻近细胞。使用非结构性蛋白质nsp2和nsp3的兔抗血清和N特异性MAb SDOW17通过免疫荧光细胞染色确认CPE的特异性(见图1)。转染后5天收集培养上清液，并称为“P129-GG第1代”(P1)。使用第1代病毒接种新鲜的Marc-145细胞，并将5天后的收集物指定为“第2代”(P2)。以与P2相同的方法制备“第3代”(P3)病毒。各代病毒以1ml等分式样储存在-80℃直至使用。通过噬菌斑测定滴定各代P129-GG病毒，第1、2和3代测定的效价分别为1×102、5×102和5×103pfu/ml。从pCMV-S-P129中产生野生型P129病毒并平行滴定，得到的第1、2和3代效价分别为1×103、1×104和5×105pfu/ml。
实施例3：用P129-GG病毒和亲代P129病毒感染猪(证明P129-GG病毒 被减毒)
将无PRRSV及猪肺炎支原体引发疾病史或未接种PRRSV及猪肺炎支原体的二十一只健康的杂种猪随机分为3个处理组，每组7只猪。大约6周龄时，T01猪接受安慰剂，而T02和T03猪分别接受2.0ml稀释为2.5×104pfu/ml(5.0×104pfu/剂)病毒储液的经遗传修饰的P129-GG病毒(产自质粒pCMV-S-P129-GG)或亲本P129病毒(产自质粒pCMV-S-P129)。每天观察所有猪的临床体征，包括整体情况、抑郁、丧失食欲、打喷嚏、咳嗽和呼吸窘迫。记录肛温和体重。第0、4、7、10、14、21和28天采血样用于PRRSV分离和血清学分析。第14天(每组2只猪)和28天(每组5只猪)进行尸体剖检，并收集组织样品(肺和扁桃体)。评估肺损伤严重性和各肺叶实变百分比。T02和T03组的猪出现轻微PRRS病毒感染、病毒排放至血清和血清转化的症状。未感染对照猪(T01)保持血清病毒血症阴性和PRRS病毒抗体阴性。
与P129亲本病毒感染的猪(T03)相比，用P129-GG virus病毒感染的猪(T02)排放较少病毒至血清(图2a和2b)并产生更高水平的抗PRRSELISA抗体(图2C和2D)和中和抗体(图2e)。
  表6---ELISA抗体水平(S/P)
  第0天   第4天   第7天   第10天   第14天   第21天   第28天
 P129-wt
 28号猪   0.000   0.000   0.061   0.283   0.527   0.689   1.025
 30号猪   0.006   0.000   0.044   0.178   0.527   0.731   0.672
 35号猪   0.000   0.000   0.000   0.027   0.157   0.241   0.197
 40号猪   0.004   0.021   0.030   0.208   0.575   0.723   0.890
 43号猪   0.000   0.000   0.049   0.354   0.419   1.760   2.006
 平均   0.002   0.004   0.037   0.210   0.441   0.829   0.958
 P129-GG
 33号猪   0.000   0.000   0.000   0.356   0.873   1.377   1.705
 36号猪   0.000   0.000   0.019   0.383   1.038   1.536   1.604
 38号猪   0.000   0.000   0.034   0.248   0.383   0.723   1.398
 45号猪   0.004   0.000   0.090   0.288   0.416   0.371   0.386
 46号猪   0.000   0.000   0.066   0.627   1.154   1.438   1.676
 平均   0.001   0.000   0.042   0.380   0.773   1.089   1.354
 平均值   0   4   7   10   14   21   28
 P129-wt   0.002   0.004   0.037   0.210   0.441   0.829   0.958
 P129-GG   0.001   0.000   0.042   0.380   0.773   1.089   1.354
感染后第7、14、21和28天对T01和T03均测定其血清中和效价。通过TCID50在双份96孔板中确定中和效价。各孔中100μl体积的200pfu野生型P129病毒与100μl连续2倍稀释的血清组合(之前在56℃热灭活30分钟)。混合物在37℃孵育1小时，然后转染细胞。转染的细胞孵育5小时并测定CPE。数据在下文给出，并显示用突变病毒感染的猪出现比野生型亲本病毒感染的猪更高的平均中和效价。
表7-感染四周中的中和效价(双份数值)
  P129-wt 第7天 第14天   第21天   第28天
  28号猪30号猪35号猪40号猪43号猪平均 ＜2，＜2＜2，＜2＜2，＜2＜2，＜2＜2，＜2＜2 ＜2，＜22,84,44,42,43.2   4,42,28,42,8＜2,84.2   3.547.583.55.3
  P129-GG
  33号猪36号猪38号猪45号猪46号猪平均 ＜2，＜2＜2，＜2＜2，＜2＜2，＜2＜2，＜2＜2 4,82,28,42,28,84.8   8,1616,168,44,416,1610.8   16163664824.4
PRRSV感染的标志之一是扁桃体中存留病毒。因此，研究结束时(感染后4周)从所有感染的猪和两只模拟感染对照猪中收集扁桃体并通过RT-PCR检查病毒的存留。可以在所有用GG病毒或P129病毒感染的猪中通过RT-PCR检测N基因，而来自模拟感染猪中的扁桃体仍然为阴性。这说明所有的猪在感染后4周排放病毒。为了检测N基因NLS的可能突变，对来自扁桃体的PCR产物进行测序。
在所有的五只猪中，发现在存留于扁桃体的GG病毒中，NLS-2序列通过在位置43或44引入精氨酸而突变。来自扁桃体的野生型P129病毒未突变，并保留野生型NLS-2序列。
实施例4：NLS-2的抗回复突变
通过改变六个核苷酸产生实施例2中描述的P129-GG突变。如实施例3所示，该病毒能够部分或全部回复，并由于随机突变和自然选择可以以相对较高的频率重新获得亲本NLS-阴性表型。优选的本发明实施方案(特别是用于疫苗目的的)将含有额外的核苷酸取代和/或缺失，以使回复的可能性最小化，并使其它侧翼残基突变为碱性残基(如赖氨酸和精氨酸)的可能性最小化从而回复该区域内的功能性NLS基元。需要两个或三个独立核苷酸改变以突变为编码碱性残基的密码子的密码子，优于仅需要一个改变的密码子。缺失突变非常不可能回复，因为该区域的一部分已被去除。对侧翼氨基酸而言可选择替代密码子，从而减少通过突变重新获得pat7、pat4或其它NLS基元的机会。这类“抗回复”突变的例子显示在表6中，并旨在作为代表而非用于限制。根据这些信息，本领域普通技术人员可预见抗回复突变的其它实例。
在表8中，突变病毒P129-d43/44缺失氨基酸43和44。此外，位置45的丝氨酸密码子从AGT改变为TCT以降低其突变为赖氨酸或精氨酸密码子的可能性。位置49的天冬酰胺密码子(AAC)因为相同的原因改变为丝氨酸密码子。在一些天然存在的地方分离株中，位置49为丝氨酸，因此耐受良好。该突变体中保留最小的pat 7 NLS基元(PGSKKKS)，并可具有部分的NLS活性。具有部分NLS活性的病毒被预期为具有位于野生型(亲本)病毒和完全NLS敲除突变体之间的中间表型。这类病毒可特别适用作疫苗。
  表8---预期的缺失突变体
                           T                   IQ         D    M    QN    N    I    N    N    E    K         GV    R              E    R    R    N    R    R    R    S    S    D38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53G    K    G    P    G    K    K    S    K    K    K    N    P    E    K    P   wtP129(SEQ ID NO：12)GGC  AAG  GGA  CCG  GGC  AAG  AAA  AGT  AAG  AAG  AAA  AAC  CCG  GAG  AAG CCC  (SEQ ID NO：13)
  38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53G    K    G    P    G    G    G    N    K    K    K    N    P    E    K    P    P129-GG SEQ ID NO：14)GGC  AAG  GGA  CCG  GGA  GGG  GGA  AAT  AAG  AAG  AAA  AAC  CCG  GAG  AAG  CCC  (SEQID NO：15)
  38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53G    K    G    P    G    -    -    S    K    K    K    S    P    E    K    P    P129-d43/44(SEQ ID NO：16)GGC  AAG  GGA  CCG  GGC  ---  ---  TCT  AAG  AAG  AAA  TCC  CCG  GAG  AAG  CCC  (SEQ ID NO：17)
  38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53G    K    G    P    G    -    -    S    -    K    K    S    P    E    K    P    P129-d43/44/46(SEQ ID NO：18)GGC  AAG  GGA  CCG  GGC  ---  ---  TCT  ---  AAG  AAA  TCC  CCG  GAG  AAG  CCC  (SEQ ID NO：19)
  38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53G    K    G    P    G    K    -    S    -    -    K    S    P    E    K    P    P129-d44/46/47(SEQ ID NO：20)GGC  AAG  GGA  CCG  GGC  AAG  ---  TCT  ---  ---  AAA  TCC  CCG  GAG  AAG  CCC  (SEQ ID NO：21)
  38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53G    K    G    P    G    K    K    S    -    -    -    S    P    E    K    P    P129-d46/47/48(SEQ ID NO：22)GGC  AAG  GGA  CCG  GGC  AAG  AAA  TCT  ---  ---  ---  TCC  CCG  GAG  AAG  CCC  (SEQ ID NO：23)
  ·上面顶部的黑体字母是在至少一种NA PRRS病毒中发现的替代残基。·两条加下划线的片段形成5-碱基干，其对于负链合成可能是重要的。·也预期4个和5个残基缺失
表8中显示的其它三个突变体(P129-d43/44/46、P129-d44/46/47和P129-d46/47/48)是缺失三个氨基酸，并也具有上述位置45和49的密码子改变。这些突变缺乏NLS基元，并被预期为具有NLS活性的完全敲除。预期这些病毒在猪中是减毒的，并特别适用作疫苗。
表8中所述突变的正向和反向引物如下：
正向引物(5’-3’)
P129-d43/44F  (SEQ ID NO：24)
GTCCAGAGGCAAGGGACCGGGATCTAAGAAGAAATCCCCGGAG
P129-d43/44/46F(SEQ ID NO：25)
GTCCAGAGGCAAGGGACCGGGATCTAAGAAATCCCCGGAG
P129-d44/46/47F(SEQ ID NO：26)
GCAAGGGACCGGGAAAGTCTAAATCCCCGGAGAAGCCCC
P129-d46/47/48F(SEQ ID NO：27)
GCAAGGGACCGGGAAAGAAATCTTCCCCGGAGAAGCCCC
反向引物(5’-3’)
P129-d43/44R(SEQ ID NO：28)
CTCCGGGGATTTCTTCTTAGATCCCGGTCCCTTGCCTCTGGAC
P129-d43/44/46R(SEQ ID NO：29)
CTCCGGGGATTTCTTAGATCCCGGTCCCTTGCCTCTGGAC
P129-d44/46/47R(SEQ ID NO：30)
GGGGCTTCTCCGGGGATTTAGACTTTCCCGGTCCCTTGC
P129-d46/47/48R(SEQ ID NO：31)
GGGGCTTCTCCGGGGAAGATTTCTTTCCCGGTCCCTTGC
上文的说明和实施例展示：NLS-2区域对病毒繁殖并非必需的，但是如只有扁桃体中存留的病毒发生突变的事实所示，它是PRRSV的重要毒性因子。我们也证实PRRSV N蛋白的NLS与较高的中和抗体和较高的ELISA效价正相关。因此我们确定：除去NLS-2序列基元的突变产生PRRSV减毒株。
本发明的编码说明
1.一种组合物，其包含选自下述组的PRRS感染性剂，所述组由a.)包含N蛋白的经遗传修饰的PRRS病毒，所述N蛋白在选自NLS-2区、NoLS区和NES区中的至少一个保守区被修饰使得该保守区消失，且其中经遗传修饰的PRRS病毒已被减毒；b.)感染性RNA分子，其编码a.)的遗传修饰的PRRS病毒；和c.)分离的多核苷酸分子，其包含编码b.)的感染性RNA分子的DNA序列构成。2.如权利要求1所述的组合物，其被进一步修饰以引起保守的NLS-1区消失。3.如权利要求1所述的组合物，其中通过引入非保守性氨基酸取代使所述保守区消失。4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述保守区至少部分缺失。5.如权利要求1所述的组合物，其中所述保守区为NoLS区。6.如权利要求1所述的组合物，其中所述保守区为NLS-2区。7.如权利要求1所述的组合物，其中所述保守区为NES区。8.如权利要求1所述的组合物，其中所述PRRS病毒为北美PRRS病毒。9.如权利要求1所述的组合物，其中所述PRRS病毒为欧洲PRRS病毒。10.如权利要求8所述的组合物，其中所述保守区为NLS-2区。11.如权利要求10所述的组合物，其中N蛋白的残基42和43为甘氨酸。12.如权利要求10所述的组合物，其中所述N蛋白的残基42和43为甘氨酸而残基44为天冬酰胺。13.如权利要求10所述的组合物，其中所述NLS-2区至少部分缺失。14.如权利要求13所述的组合物，其中所述N蛋白从43到48残基中至少一个缺失。15.如权利要求14所述的组合物，其中所述N蛋白的43和44残基均缺失。17.如权利要求14所述的组合物，其中所述N蛋白的残基43、44和46已缺失。如权利要求14所述的组合物，其中所述N蛋白的残基44、46和47已缺失。19.如权利要求14所述的组合物，其中所述N蛋白的残基46、47和48已缺失。20.如权利要求1-19所述的组合物，其含有额外的核苷酸突变、取代和/或缺失，以使回复的可能性最小化。
21.用于保护猪免受PRRS病毒感染的疫苗，其包含如权利要求1-20中任一项的组合物以及兽医学用途可接受的载体，所述组合物的量能有效产生针对PRRS病毒感染的免疫保护。22.用于保护猪免受PRRS病毒感染的方法，所述方法包括：用能够产生针对PRRS病毒感染的免疫保护的有效量的权利要求20的疫苗免疫动物。23.包含如权利要求1-20所述任一项组合物的经转染的宿主细胞。
24.用于制备经遗传修饰和减毒的PRRS病毒的方法，该方法包括：a.)突变编码感染性RNA分子的DNA序列，以产生包含N蛋白的遗传修饰的PRRS病毒，所述感染性RNA分子编码PRRS病毒，所述N蛋白在选自NLS-2区、NoLS区和NES区的至少一个保守区被修饰，使得该保守区消失；b.)向能够支持PRRS复制的宿主细胞中引入经遗传修饰的PRRS病毒。25.如权利要求24所述的方法，其中所述经遗传修饰的PRRS病毒为北美PRRS病毒。26.如权利要求24所述的方法，其中所述经遗传修饰的PRRS病毒为欧洲PRRS病毒。27.如权利要求24所述的方法，其中所述能够支持PRRS复制的宿主细胞为MARC-145细胞。28.如权利要求24所述的方法，其中所述能够支持PRRS复制的宿主细胞包含在活猪体内。29.本文所述本发明的任意一项或上述权利要求的任意组合。
序列表
<110>辉瑞产品公司
     Yoo，Dongwan
     Lee，Changhee
     Calvert，Jay G.
     Welch，Siao-Kun W.
<120>突变的猪繁殖与呼吸综合症病毒
<130>PC32632A
<160>31
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>猪繁殖殖与呼吸综合症病毒
<400>1
Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys
1               5
<210>2
<211>32
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒
<400>2
Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro
1               5                   10                  15
Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg
            20                  25                  30
<210>3
<211>33
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒
<400>3
Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe
1               5                   10                  15
Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu
            20                  25                  30
Arg
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒
<400>4
Leu Pro Thr His His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val
1               5                   10
<210>5
<211>12
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒
<400>5
Leu Pro Val Ala His Thr Val Arg Leu Ile Arg Val
1               5                   10
<210>6
<211>123
<212>PRT
<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒
<400>6
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Lys Lys Lys Gly Asn Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
            20                  25                  30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Ser Lys Lys Lys
        35                  40                  45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
    50                  55                  60
His His Phe Thr Pro Gly Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln
65                  70                  75                  80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
                85                  90                  95
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
            100                 105                 110
Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala
        115                 120
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ggggcttctc cggggaagat ttctttcccg gtcccttgc         39

Claims (15)

1.一种组合物，其包含选自下列的PRRS感染性剂：a.)包含N蛋白的经遗传修饰的PRRS病毒，所述N蛋白在选自NLS-2区、NoLS区和NES区中的至少一个保守区被修饰，使得该保守区消失，且其中经遗传修饰的PRRS病毒已被减毒；b.)感染性RNA分子，其编码a.)所述的经遗传修饰的PRRS病毒；和c.)分离的多核苷酸分子，其包含编码b.)所述的感染性RNA分子的DNA序列。
2.如权利要求1所述的组合物，其被进一步修饰，使得保守的NLS-1区消失，或通过引入非保守性氨基酸取代使保守区消失，或其保守区至少部分缺失。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述保守区为a.)NoLS区、NLS-2区和/或NES区中的任一个或其组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述PRRS病毒选自以下任一或其组合：北美PRRS病毒或欧洲PRRS病毒。
5.如权利要求3所述的组合物，其中所述PRRS病毒为北美PRRS病毒，且其中所述保守区为NLS-2区。
6.如权利要求5所述的组合物，其选自以下的组合物：
其中所述N蛋白的残基42和43为甘氨酸，
其中所述N蛋白的残基42和43为甘氨酸，而残基44为天冬酰胺，
其中所述NLS-2区至少部分缺失，
其中所述N蛋白从43到48残基中至少一个缺失，
其中所述N蛋白的43和44残基均缺失，
其中所述N蛋白的残基43、44和46已缺失，
其中所述N蛋白的残基44、46和47已缺失，和/或
其中所述N蛋白的残基46、47和48已缺失。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其含有额外的核苷酸突变、取代和/或缺失，以使回复的可能性最小化。
8.用于保护猪免受PRRS病毒感染的疫苗，包含如权利要求1-7中任一项的组合物以及兽医学用途可接受的载体，所述组合物的量为能有效产生针对PRRS病毒感染的免疫保护的量。
9.用于保护猪免受PRRS病毒感染的方法，其包括用能够产生针对PRRS病毒感染的免疫保护的有效数量的权利要求8的疫苗免疫动物。
10.包含如权利要求1-9中任一项所述组合物的经转染的宿主细胞。
11.用于制备经遗传修饰和减毒的PRRS病毒的方法，该方法包括：a.)突变编码感染性RNA分子的DNA序列，以产生包含N蛋白的经遗传修饰的PRRS病毒，所述感染性RNA分子编码PRRS病毒，所述N蛋白在选自NLS-2区、NoLS区和NES区的至少一个保守区被修饰，使得该保守区消失；b.)向能够支持PRRS复制的宿主细胞中引入经遗传修饰的PRRS病毒。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的PRRS病毒被一个或多个额外的核苷酸突变、取代和/或缺失进一步修饰，所述突变、取代和/或缺失使回复的可能性最小化。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的PRRS病毒为北美PRRS病毒或欧洲PRRS病毒。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述能够支持PRRS复制的宿主细胞为MARC-145细胞。
15.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述能够支持PRRS复制的宿主细胞包含在活猪体内。
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