CN104109678A

CN104109678A - 化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用

Info

Publication number: CN104109678A
Application number: CN201310131737.2A
Authority: CN
Inventors: 张春玲; 于瑞嵩; 倪建平; 李春华; 李震; 何锡忠; 蒋凤英; 张婉华; 董世娟; 周宗清; 彭丽英; 张俊平
Original assignee: Shanghai Jiamu Biological Products Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Jiamu Biological Products Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-04-16
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2014-10-22

Abstract

一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因、其改造方法及应用，包括PCV2ORF2基因序列的来源及改造、引物的设计与合成、PCV2 ORF2短片段DNA的合成、全长基因的合成及合成后序列、表达载体的构建和目的基因在毕赤酵母中的表达等步骤。本发明综合参考了PTDS法和PAS法，使基因合成费用降低，步骤简单(两步PCR)，错误率低，合成周期短。在整个化学合成的过程中，运用了高保真的Taq酶，使误配的碱基序列能够在合成过程中得以修正，从而最大限度的减少了错误碱基的产生。将该基因克隆入酵母表达载体构建重组表达质粒，重组表达质粒规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可制备亚单位疫苗或核酸疫苗。

Description

化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白，尤其涉及一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)分为PCV1和PCV2两种基因型，其中PCV2有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)，还是育肥猪的猪皮炎和肾病综合征(Porcine Dermatitisand Nephropathy Syndrome，PDNS)的主要病因。由于该病属于免疫抑制疾病，可引发严重的继发感染从而危害猪群健康，是继猪繁殖与呼吸综合征之后又一个严重危害全球养猪业的重大疾病，在我国规模化猪群中PCV2感染率超过90％。近两年在国际上已获得批准的猪圆环病毒疫苗有4个，其中2个是通过基因工程技术手段研制的疫苗，但其技术手段均获得了严格的国际专利保护，这给研发新型PCV2疫苗设置了较高的门槛。猪圆环病毒2型基因工程疫苗研究的难点是如何提蛋白产量和免疫原性，国际上已有很多研究利用大肠杆菌、杆状病毒和腺病毒系统表达的产物进行免疫原性评估，在产量和免疫原性上很难两全。目前，国内外尚无利用毕赤酵母表达系统制备基因工程疫苗。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统经过近十年发展，已成为较完善的外源基因表达系统，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜于扩大为工业规模。酵母系统具有操作简单、产量高、对蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能的优点。

发明内容

本发明的目的，就是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，包括以下步骤：

1)PCV2 ORF2基因序列的来源及改造

运用DNAstar(DNASTAR，Inc.)、RNA structure(Rochester University)软件对猪圆环病毒ORF2的RNA的复杂二级结构进行了分析，对基因进行同义改造得到毕赤酵母密码子优化的ORF2编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)引物的设计与合成

设计了18条引物，记为引物1-18，用于化学合成ORF2基因序列，引物1-18对应的序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列21bp；

3)PCR扩增400bp片段和300bp片段

将步骤2)中所述18条引物分别以ddH₂O溶解至终浓度30μM；分为两组，第一组为引物1-10，第2组为引物11-18；

400bp片段的扩增：将第一组中的引物2-9各取5μL混合，加入10μLddH₂O混合均匀，取1μL作为扩增模板；以引物1和10为primer扩增400bp片段；

300bp片段的扩增：将第二组中的引物12-17各取5μL混合，加入20μLddH₂O混合均匀，取1μL作为扩增模板；以引物11和18为primer扩增300bp片段；

两个片段的PCR扩增的反应程序为；94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，扩增30个循环之后，72℃延伸10min；

4)全长基因的合成

取上述400bp片段和300bp片段为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.19所示的序列为引物，进行PCR反应，一次性合成ORF2基因；

5)表达载体的构建

设计6条引物，分别扩增Cap基因密码子优化前、后全长以及不含信号肽的四种基因片段，将四种基因片段分别与毕赤酵母表达载体连接，构建四种重组表达载体，6条引物的序列如SEQ ID NO.20-SEQ ID NO.25所示；

6)目的基因在毕赤酵母中的表达

将构建好的四种重组表达载体，电转化进入野生型毕赤酵母菌GS115中，经Zeocin抗性筛选后获得大量多拷贝重组子；经甲醇诱导，SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明，能够分泌表达的只有经密码子优化且含有目的基因信号肽的重组子，目的蛋白分子质量约为30KDa，免疫印迹试验能与多抗及单抗发生反应。

步骤4)所述PCR反应的反应体系为：

反应体系如下：

上述体系中，PCR仪程序设置为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，扩增28个循环之后，72℃延伸10min。

步骤5)所述扩增的程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min。

步骤5)所述6条引物中，SEQ ID NO.20所示序列和SEQ ID NO.21所示序列为扩增密码子优化前用上游引物，SEQ ID NO.22所示序列为密码子优化前用下游引物；SEQ ID NO.24所示序列和SEQ ID NO.25所示序列为扩增密码子优化后用上游引物，SEQ ID NO.23所示序列为密码子优化后用下游引物；并且，上游引物5’端都含有XhoI酶切位点，下游引物5’端都含有NotI酶切位点。

上述猪圆环病毒Cap蛋白基因的应用，所述重组表达载体规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可用于制备亚单位疫苗或核酸疫苗。

本发明综合参考了PTDS法和PAS法，使基因合成费用降低，步骤简单(两步PCR)，错误率低，合成周期短。基因改造后避免了高GC含量、重复序列和复杂二级结构。引物设计长度为60bp左右，重复序列为21bp，退火温度在55℃左右，为成功合成基因片段奠定了基础。为了减少错误率，引物合成采用了PAGE纯化的方法。在PCR反应体系中，外侧引物(引物1、10和引物11、18)的使用量是内部引物(引物2～9、引物11～17)的20倍，内部引物作为“模板”发挥作用，保证了合成后的DNA长度涵盖了所有引物序列。第二步PCR用第一步的产物作为模板，最外侧引物(引物1、18)作为引物，确保了整个基因片段的链接。在整个化学合成的过程中，运用了高保真的Taq酶，使错误的碱基序列能够在合成过程中修正，最大限度的减少了错误碱基的产生。目前国内外尚无利用化学合成法合成PCV2Cap蛋白基因序列的报道。因此将该基因克隆入酵母表达载体构建重组表达质粒，利用酵母表达系统对PCV2的Cap蛋白进行分泌表达，这一技术是本研究的关键。重组表达质粒规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可制备亚单位疫苗或核酸疫苗。

本发明具有以下的优点和特点：

1、基因合成方法费用降低，步骤简单(两步PCR)，错误率低，合成周期短。

2、利于目的基因高效表达.在不改变蛋白质的氨基酸序列下改造了碱基序列，使密码子尽量满足宿主菌较高使用率的密码子；构建的四种表达质粒，能够分泌表达的只有经密码子优化且含有目的基因信号肽的重组子。

3、利于目的基因的分泌表达，ORF2基因序列中有许多串联或单联的稀有密码子，基因改造后避免了高GC含量，重复序列和复杂二级结构。

附图说明

图1为两个片段的PCR扩增图；图中所示，M为DL200DNA标准；1，2为第一轮PCR产物。

图2为ORF2基因全长的PCR扩增图；图中所示，M为DL2000DNA标准；1、2、3、4为第二轮PCR产物；0为空白对照；

图3为目的基因的PCR扩增结果；图中所示，1为阴性对照，2-3为不含信号肽片段，4-5为含信号肽片段，M为DL2000DNA标准；

图4为重组表达载体酶切鉴定图谱；图中所示，1、6为DL2000和DL-12000Maker，2-5为重组质粒；

图5为重组酵母菌株表达产物的SDS-PAGE鉴定图谱；图中所示，1为空载体酵母菌表达产物，2为重组pPICZa-yCap质粒表达产物；3、4、5分别为pPICZa-Cap、pPICZa-dCap，pPICZa-yCap重组质粒表达产物；M为蛋白分子量标准；

图6为重组表达产物的Western-blotting鉴定图谱，图中所示，1为酵母重组质粒pPICZa-yCap，2为酵母重组质粒pPICZa-c，3为蛋白Maker。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。

1)PCR2ORF2基因序列的来源及改造：猪圆环病毒ORF2基因经分析含毕赤酵母稀有密码子个数较多，运用DNAstar(DNASTAR，Inc.)，RNA structure(Rochester University)等软件对其RNA的复杂二级结构进行了分析，对基因进行同义改造得到毕赤酵母密码子优化的ORF2编码基因。优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示：

2)引物的设计与合成：设计了18条引物(上海捷瑞生物有限公司)，记为引物1-18，用于化学合成ORF2基因序列，引物1-18对应的序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列21bp；

3)PCR扩增400bp片段和300bp片段

两个片段的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，扩增30个循环之后，72℃延伸10min；

图1为两个片段的PCR扩增图。

4)全长基因的合成

反应体系如下：

图2为ORF2基因全长的PCR扩增图。

5)表达载体的构建

设计6条引物，分别扩增Cap基因密码子优化前、后全长以及不含信号肽的基因片段。将四种基因片段与毕赤酵母表达载体连接，构建重组表达载体4种。扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min。6条引物如下表所示：

其中1、2为扩增密码子优化前用上游引物，3为密码子优化前用下游引物；5、6为扩增密码子优化后用上游引物，4为密码子优化后用下游引物。上游5’端都含有XhoI酶切位点，下游引物5’端都含有NotI的酶切位点。图3为目的基因的PCR扩增结果，图4为重组表达载体酶切鉴定图谱。

6)目的基因在毕赤酵母中的表达

将构建好的四种不同基因片段的重组表达载体，电转化进入野生型毕赤酵母菌GS115中，经Zeocin抗性筛选后获得大量多拷贝重组子；经甲醇诱导，SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明，能够分泌表达的只有经密码子优化且含有目的基因信号肽的重组子，目的蛋白分子质量约为30KDa，免疫印迹试验能与多抗及单抗发生反应。图5为重组酵母菌株表达产物的SDS-PAGE鉴定图谱。图6为重组表达产物的Western-blotting鉴定图。

序列表

<110>上海佳牧生物制品有限公司，上海市农业科学院

<120>化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法和应用

<160>25

<210>1

<211>705

<212>DNA

<213>猪圆环病毒PCV2Cap蛋白基因序列

<400>1

atgacttacc caagaagaag atacagaaga agaagacata gaccaagatc tcatttgggt 60

caaattttga gaagaagacc atggttggtt catccaagac atagatacag atggagaaga 120

aagaacggta tttttaacac tagattgtct agaacttttg gttacactat taagagaact 180

actgttaaga ctccatcttg ggctgttgat atgatgagat ttaacattaa cgattttttg 240

ccaccaggtg gtggttctaa cccaagatct gttccatttg aatactacag aattagaaag 300

gttaaggttg aattttggcc atgttctcca attactcaag gtgatagagg tgttggttct 360

tctgctgtta ttttggatga taactttgtt actaaggcta ctgctttgac ttacgatcca 420

tacgttaact actcttctag acatactatt actcaaccat tttcttacca ttctagatac 480

tttactccaa agccagtttt ggattctact attgattact ttcaaccaaa caacaagaga 540

aaccaattgt ggttgagatt gcaaactgct ggtaacgttg atcatgttgg tttgggtact 600

gcttttgaaa actctattta cgatcaagaa tacaacatta gagttactat gtacgttcaa 660

tttagagaat ttaacttgaa ggatccacca ttgaacccaa agtga 705；

<210>2

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgacttacc caagaagaag atacagaaga agaagacata gaccaagatc tcatttgggt 60；

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcttggatga accaaccatg gtcttcttct caaaatttga cccaaatgag atcttggtct 60；

<210>4

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ccatggttgg ttcatccaag acatagatac agatggagaa gaaagaacgg tatttttaac 60；

<210>5

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tctcttaata gtgtaaccaa aagttctaga caatctagtg ttaaaaatac cgttctttct 60；

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tttggttaca ctattaagag aactactgtt aagactccat cttgggctg tgatatgatg 60；

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

accaccacct ggtggcaaaa aatcgttaat gttaaatctc atcatatcaa cagcccaaga 60；

<210>8

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tttttgccac caggtggtgg ttctaaccca agatctgttc catttgaata ctacagaatt 60；

<210>9

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aattggagaa catggccaaa attcaacctt aacctttcta attctgtagt attcaaatgg 60；

<210>10

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ttttggccat gttctccaat tactcaaggt gatagaggtg ttggttcttc tgctgttatt 60；

<210>11

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

agtcaaagca gtagccttag taacaaagtt atcatccaaa ataacagcag aagaaccaac 60；

<210>12

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

actaaggcta ctgctttgac ttacgatcca tacgttaact actcttctag acatactatt 60；

<210>13

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tggagtaaag tatctagaat ggtaagaaaa tggttgagta atagtatgtc tagaagagta 60；

<210>14

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

cattctagat actttactcc aaagccagtt ttggattcta ctattgatta ctttcaacca 60；

<210>15

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

agtttgcaat ctcaaccaca attggtttct cttgttgttt ggttgaaagt aatcaatagt 60；

<210>16

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ttgtggttga gattgcaaac tgctggtaac gttgatcatg ttggtttggg tactgctttt 60；

<210>17

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

aactctaatg ttgtattctt gatcgtaaat agagttttca aaagcagtac ccaaaccaac 60；

<210>18

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

caagaataca acattagagt tactatgtac gttcaattta gagaatttaa cttgaaggat 60；

<210>19

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

tcactttggg ttcaatggtg gatccttcaa gttaaattct ct 42；

<210>20

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gcctcgagaa gagaaatggc atcttcaaca cc 32；

<210>21

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gcctcgagaa gagaatgacg tatccaagga ggc 33；

<210>22

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gcggccgcag ggttaagtgg ggggtc 26；

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

gcggccgctg ggttcaatgg tggatcc 27；

<210>24

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

ctcgagaaga gaaacggtat ttttaacact ag 32；

<210>25

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

ctcgagaaga gaatgactta cccaagaaga agataca 27。

Claims

1.一种化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)PCV2 ORF2基因序列的来源及改造

2)引物的设计与合成

设计了18条引物，记为引物1-18，用于化学合成ORF2基因序列，引物1-18对应的序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.19所示；相邻的引物方向相反而且重复序列2Ibp；

3)PCR扩增400bp片段和300bp片段

4)全长基因的合成

5)表达载体的构建

6)目的基因在毕赤酵母中的表达

2.如权利要求1所述的化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在于：步骤4)所述PCR反应的反应体系为：

反应体系如下：

3.如权利要求1所述的化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在于：步骤5)所述扩增的程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述的化学合成的猪圆环病毒Cap蛋白基因及其改造方法，其特征在于：步骤5)所述6条引物中，SEQ ID NO.20所示序列和SEQ ID NO.21所示序列为扩增密码子优化前用上游引物，SEQ ID NO.22所示序列为密码子优化前用下游引物；SEQ ID NO.24所示序列和SEQ ID NO.25所示序列为扩增密码子优化后用上游引物，SEQ ID NO.23所示序列为密码子优化后用下游引物；并且，上游引物5’端都含有XhoI酶切位点，下游引物5’端都含有NotI酶切位点。

5.权利要求1中所述猪圆环病毒Cap蛋白基因的应用，其特征在于：所述重组表达载体规模发酵后提取的表达产物，可作为检测PCV2抗体的诊断抗原，也可用于制备亚单位疫苗或核酸疫苗。