CN104039814A - 猪第二型环状病毒次单位疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗猪第二型环状病毒(PCV2)免疫组合物，包含抗原肽，该抗原肽为PCV2第二开放阅读区(ORF2)非富含精氨酸肽(non-Arginine-rich peptide)和/或将该PCV2ORF2非富含精氨酸肽进一步与PE肽和KDEL肽构建形成的重组融合蛋白。

Description

猪第二型环状病毒次单位疫苗
技术领域
本发明系关于一种猪第二型环状病毒 (Porcine circovirus type 2, PCV2)次单位疫苗， 特别是指一种可以被大量表现的 PCV2 0RF2蛋白质片段做为抗原蛋白质， 以及加入适 当的载剂或佐剂而形成的猪第二型环状病毒次单位疫苗。 背景技术
猪第二型环状病毒已知与离乳后多系统消耗性综合症 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)、 猪皮肤炎肾病症候群 (Porcine Dermatitis And Nephropathy Syndrome, PDNS)有关。 PMWS最早于 1991在加拿大发现，且之后于全世界各地陆续有 被报导。 该病对于全球养猪业造成严重损失， 其主要病征为患猪体重渐进性丧失 (progressive weight loss)、急性呼吸症 (tachypnea)、呼吸困难 (dyspnea)、黄疸 (jaundice)等。 病理学上， 肉眼及组织病变有淋巴球性肉芽肿性浸润 (lymphocytic and granulomatous infiltrate)、 淋巴结病（lymphadenopathy)、 淋巴球性肉芽肿性肝炎（lymphocytic and granulomatous hepatitis)及肾炎 (nephritis)。
猪环狀病毒 (porcine circovirus, PCV)最早于 1982 年在猪肾细胞株 (PK-15, ATCC CCL31)中被发现，虽然会持续感染该细胞，但是并不产生细胞病变效应 (cytopathic effect, CPE), 另外该病毒虽会感染猪只， 但是并不造成任何病变， 该病毒株系命名为 PCV1。 PCV1病毒为一环狀单股、 全长 1759 bp的正二十面体 (icosahedron)病毒， 在 1995年被 归類为环狀病毒科 CCircoviridae)的一员。
自 PK-15细胞中分离出的 PCV1被认定是不具备病源性， 而于 1997年自罹患离乳 后多系统消耗性综合症 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)猪只体内， 分离出对猪只具有病原性的突变猪环状病毒， 该病毒株命名为 PCV2。 离乳后多系统消 耗性综合症 (PMWS)是一种具有高度传染力的猪只疾病，该病主要感染幼猪及怀孕母猪， 严重影响猪只健康。
PCV2病毒直径大小为 17 nm， 具有环状单股 DNA， DNA大小为 1.76 Kb， 基因组 序列经软体分析后发现顺时针加上逆时针共有 11 个开放阅读区 (open reading frame, ORF)， 其中 ORFl、 ORF2是 2个最主要的基因。 ORF1可转录出 Rep及 Rep'蛋白， 和 该病毒的复制有关 (Mankertz et al, 2001)。已知 ORF2本身是 PCV2病毒的免疫性结构壳 体蛋白（immunogenic structure capsid protein), 用以诱导生物体产生免疫反应。
最常见的市售 PCV2疫苗为 PCV2死毒疫苗， 然而死毒疫苗研发上需取得无其他病 毒感染的细胞株， 且其最大的缺点在于无法确保在制备死毒疫苗过程中， 化学药剂是否 完全不活化病毒株； 而另一缺点在于以化学药剂来杀死病原菌很有可能会改变病原菌的 抗原结构， 使得所诱发出来的免疫反应无法中和病原菌的毒性， 因此造成该死毒疫苗无 法保护猪只避免感染此疾病； 由此可知， 死毒疫苗产品发展不易、 成本高， 且其安全性 堪虑。
相对于死毒疫苗是以整株病毒作为疫苗的抗原，次单位疫苗则是取病原菌中一部分 的蛋白质作为抗原蛋白质， 并将该抗原蛋白质作为疫苗接种到动物或人体中， 使接种后 的动物或人体可产生免疫力。 它的制备方式是先选殖病原菌中的抗原蛋白质的基因， 然 后以遗传工程的技术将此抗原蛋白质大量生产。 其最大的优点是安全性高， 因为它只是 病原菌的一个部分， 所以注射到猪只体内的并不是一个完整的病原菌， 不会有病原菌不 活化不完全的顾虑。 习用 PCV2次单位疫苗系使用 ORF2蛋白片段作为抗原蛋白质； 然 而 ORF2的全长蛋白质在原核生物表现系统中表现量很低，不符制备疫苗的需求。因此， 研发可以在生物表现系统中表现量高的 PCV2 ORF2疫苗抗原片段， 将有助于 PCV2次 单位疫苗的商业应用。 发明内容
本发明提供一种 PCV2病毒 ORF2蛋白片段的 DNA序列，该 DNA序列可于生物表 现系统中表现出大量的 PCV2病毒 ORF2蛋白片段。
本发明并提供一种 PCV2次单位疫苗， 系以可在生物表现系统中大量表现的 PCV2 病毒 ORF2蛋白片段作为疫苗的抗原蛋白， 使该疫苗在施打于动物体后， 可以诱导动物 体产生足以抵抗 PCV2病毒感染的免疫力。
本发明并提供一种利用基因重组技术所研发的次单位疫苗， 以生产制程简单、 成本 低、 纯度高、 安全性佳的 PCV2次单位疫苗。
由于 PCV2病毒 ORF2蛋白全长片段难以在生物系统中大量表现， 为达成上述发明 目的，本案发明人利用基因重组技术，将 PCV2病毒中编码 ORF2全长蛋白 (如 SEQ ID NO: 2所示)的 DNA序列 (如 SEQ ID NO: 1所示)， 进行不同长度的切割， 再将所形成的各 DNA 片段分别构筑至蛋白表达载体上， 于生物系统中表现蛋白质， 以决定于生物系统 中可产生高量蛋白质的 DNA片段。
经蛋白质序列分析以及蛋白表现量试验结果显示， PCV2病毒 ORF2全长蛋白共有 约 30个精胺酸 (Arginine)，其中三分之二以上的精胺酸集中于 ORF2蛋白的胺基端 (amino terminal, N端)， 当 ORF2蛋白 N端的精胺酸数目被去除的越多， ORF2蛋白片段在生 物表现系统中的表现量就越多； 而去除编码 ORF2蛋白的 DNA序列 5'端 234 bp后所剩 的 DNA片段 (δ卩 5，端 235 bp至终止密码子 (stop codon)之间的片段)， 可以在生物表现系 统中大量表现。
是以， 本发明所提供的 PCV2次单位疫苗， 包括一 PCV2抗原蛋白质片段， 以及适 当的载剂或佐剂； 该抗原蛋白质片段可于生物表现系统中大量表现， 系为 PCV2病毒的 O F2非富含精胺酸胜肽 (non-Arginine-rich peptide), 该 PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽 的精胺酸数量系为该 PCV2 ORF2全长胜肽的 N端富含精胺酸区域 (Arginine-rich domian) 的精胺酸数量的二分之一 （1/2) 以下； 于一实施例中， 当该 PCV2 0RF2的 N端富含精 胺酸区域的精胺酸数量为 20时，则于该 PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽的精胺酸数量等 于 0或 1至 10之间的正整数； 于另一实施例中， 当该 PCV2 ORF2的 N端富含精胺酸 区域的精胺酸数量为 21时， 则于该 PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽的精胺酸数量等于 0 或 1至 10之间的正整数； 于又一实施例中， 当该 PCV2 ORF2的 N端富含精胺酸区域 的精胺酸数量为 22时， 则于该 PCV2 ORF2非富含精胺酸胜肽的精胺酸数量等于 0或 1 至 11之间的正整数。
于一实施例中，该富含精胺酸区域为该 PCV2 O F2全长胜肽的胺基端 (N端)第 1-78 个胺基酸的区域 (；相当于 DNA序列的 5端第 1-234个核苷酸之间的区域);于一实施例中， 该非富含精胺酸胜肽为该 PCV2 ORF2全长胜肽的胺基端 (N端)第 79个胺基酸至羧基端 (C端)最后一个胺基酸间的胜肽 (相当于 DNA序列的 5'端第 235个核苷酸至 3'端终止密 码子之间的区域)。
该 PCV2 O F2全长胜肽与如 SEQ ID No: 2、 SEQ ID No: 16、 SEQ ID No: 20、 SEQ ID No: 51及 SEQ ID No: 53所示的序列其中之一具有至少 80%序列同源性 (homology), 较佳者，具有 85%序列同源性，更佳者，具有 90%序列同源性，甚至是 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同源性。 于一较佳实施例中， 该 PCV2 ORF2 全长胜肽系为如 SEQ ID No: 2、 SEQ ID No: 16、 SEQ ID No: 20、 SEQ ID No: 51及 SEQ ID No: 53所示的序列其中之一。
此外，本发明并利用绿脓杆菌 CP^m owomw aerag ora)外毒素 A (exotoxin A)的受体 结合区 (receptor binding domain I)及运输结构区 (transmembrane targeting domain II)的蛋 白（即 PE蛋白）以及内质网回收讯号 (ER retention signal,即 KDEL蛋白质讯号序列 (signal peptide))的特性， 提供一种 PCV2 ORF2融合蛋白抗原片段。
绿脓杆菌 PE蛋白系可作为目标蛋白的引导媒介， 其作用的方式为： 首先， 绿脓杆 菌外毒素 A 的受体结合区蛋白负责与目标细胞 (CD8+ T 细胞)的细胞膜上的细胞受体 (receptor)结合， 经由细胞内噬作用 (endocytosis)进入细胞的内膜体 (endosome)中， 当绿脓 杆菌外毒素 A被内膜体中的蛋白酶切割后， 绿脓杆菌外毒素 A的运输结构区蛋白会将 剩余的蛋白片段 (含运输结构区蛋白及其后所连接的目标蛋白）由内膜体位移至细胞质 内， 与高基氏体 (Golgi body)及内质网 (endoplasmic reticulum, ER)结合， 进而将目标蛋白 引导至目标细胞中。
另外， 若一目标蛋白的 C端具有一 KDEL蛋白质讯号序列 (signal peptide), 则在该 KDEL蛋白质讯号序列的作用下， 目标蛋白会被回收至内质网， 进而进入内质网进行作 用。
因此，本发明进一步利用 PE蛋白及 KDEL蛋白质讯号序列的特性，提供一种 PCV2 ORF2融合蛋白抗原片段， 系于 PCV2病毒 ORF2蛋白片段的 N端加上 PE蛋白， 且于 该 PCV2病毒 ORF2蛋白片段的 C端加上 KDEL蛋白质讯号序列 (signal peptide), 以产 生抗原融合蛋白 (PE-ORF2片段 -KDEL), 使该疫苗在施打于动物体后， 可以诱导动物体 产生足以抵抗 PCV2病毒感染的免疫力。
于部分实施态样中， 本发明所用的抗原蛋白包含但不限于 PCV2病毒 ORF2蛋白片 段，该 ORF2蛋白片段系与如 SEQ ID No: 6、 SEQ ID No: 8、 SEQ ID No: 10、 SEQ ID No: 12、 SEQ ID No: 18、 SEQ ID No: 22, SEQ ID No: 55及 SEQ ID No: 57所示的序列其中 之一具有至少 80%序列同源性， 较佳者， 具有 85%序列同源性， 更佳者， 具有 90%序列 同源性， 甚至是 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同源性。 于一较佳实施例中， 该 PCV2病毒 ORF2蛋白片段系为如 SEQ ID No: 6、 SEQ ID No: 8、 SEQ ID No: 10、 SEQ ID No: 12、 SEQ ID No: 18、 SEQ ID No: 22、 SEQ ID No: 55及 SEQ ID No: 57所示的序列其中之一，该蛋白片段系藉由基因转殖方式而得;分别将编码 PCV2 病毒 ORF2蛋白片段的 DNA序列 (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 , 17, 21 , 54, 56)选殖到表现载体 中， 各形成含有编码抗原蛋白的 DNA序列的质体， 再将该质体转殖到生物表现宿主中， 经蛋白质表现后而得到的抗原蛋白。
本发明所用的抗原融合蛋白 (PE-ORF2片段 -KDEL)系藉由基因转殖方式而得， 系将 上述编码 PCV2 O F2的 DNA部分片段序列 (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 , 17, 21 , 54, 56)、 编 码 PE蛋白质讯号序列的 DNA片段序列 (如 SEQ No: 34所示)， 以及编码 KDEL蛋白质 讯号序列的 DNA片段序列 (如 SEQ No: 30所示)选殖到表现载体系统中， 形成含有编码 抗原融合蛋白的 DNA序列的质体， 再将该质体转殖到表现宿主中， 经蛋白质表现后而 得到的抗原融合蛋白。
该表现载体系统包含但不限于 pET载体系统以及 pGEX载体系统等;于一实施例中， 该表现载体为 pET24a; 该生物表现系统 (宿主)包含但不限于： 原核表现系统 (如： 大肠 杆菌 co/0)、 真核表现系统 (如： 动物细胞 (CHO cell)、 植物细胞)， 于一实施 例中， 该表现系统为大肠杆菌 (E. coli)。
该佐剂包含但不限于水性氢氧化铝胶、 明矾、 Freimd氏不完全佐剂、 油质佐剂、 水 溶性佐剂、 或水包油包水双相佐剂 (water-in-oil-in-water, W/0/W); 于一实施例中， 该佐 剂为油质佐剂。
本发明所提供的免疫组合物， 进一步可包含 PCV2 其他开放阅读区 (open reading frame, ORF)的抗原蛋白， 该 PCV2其他 ORF的抗原蛋白包含但不限于： ORFl、 ORF3。 此外， 该免疫组合物可进一步包含一种病原抗原， 该病原抗原系选自由下列群组所组成 者： 猪流感病毒 (SIV)抗原、 猪繁殖与呼吸症候群病毒 (PRRSV)抗原、 猪霉浆菌 (Mycoplasma)、 猪小病毒 (Parvovirus, PPV)、 猪丹毒 ( Erysipelas )， 以及伪狂犬病 (Aujeszky's disease)
另， 本发明所提供的免疫组合物可进一步包含一或多种选自于下者： 载剂、 溶剂、 乳化剂、 悬浮剂、 分解剂、 黏结剂、 赋形剂、 安定剂、 螯合剂、 稀释剂、 胶凝剂、 防腐 剂、 润滑剂、 界面活性剂、 佐剂、 生物型载体。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语， 除非另外有所定义， 皆为该所属领域具 有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明系以下面的实施例予以示范阐明， 但本发明不受下述实施例所限制。 附图说明
图 1为猪第二型环状病毒 (PCV2)基因组序列的亲缘树分析图。
图 2为 PCV2 0RF2分段表现示意图， 其中 pFl、 pF2、 pF3、 pF4、 p K pR2、 p 3 为 PCR引子。
图 3为以 SDS-PAGE分析以大肠杆菌分别表现 PCV2 2a-O F2各片段重组蛋白的结 果； 将大肠杆菌以 IPTG诱导 6小时后， 收集全菌蛋白， 以 15% SDS-PAGE分析； 其中 第 1道为标准分子量 (molecular weight ladder); 第 2道为 pET24a载体 (负对照组)； 第 3 道为 PCV2 ORF2 2a-Fl片段 (12.7 KDa); 第 4道为 PCV2 ORF2 2a-F2片段 (11.6 KDa); 第 5道为 PCV2 O F2 2a-F3片段 (12.1 KDa);第 6道为 PCV2 ORF2 2a-F4片段 (16.5 KDa); 第 7道为 PCV2 O F2 2a-F5片段 (21.4 KDa);第 8道为 PCV2 ORF2 2a-F6片段 (20.8 KDa); 第 9道为 PCV2 2a-O F2全长片段 (27.5 KDa)。
图 4为以西方墨渍法检测 PCV2 2a-ORF2各片段重组蛋白表现的结果； 其中第 1道 为标准分子量 (molecular weight ladder);第 2道为 pET24a载体 (负对照组)；第 3道为 PCV2 O F2 2a-Fl片段 (12.7 KDa);第 4道为 PCV2 ORF2 2a-F2片段 (11.6 KDa);第 5道为 PCV2 O F2 2a-F3片段 (12.1 KDa);第 6道为 PCV2 O F2 2a-F4片段 (16.5 KDa);第 7道为 PCV2 O F2 2a-F5片段 (21.4 KDa);第 8道为 PCV2 O F2 2a-F6片段 (20.8 KDa);第 9道为 PCV2 2a-O F2全长片段 (27.5 KDa)。
图 5为大鼠分别以各不同长度片段的 2a-ORF2重组蛋白免疫后，不同时间采集的血 液样本以 PCV2 ELISA测定抗体力价的结果， *表示 ρ < 0.05。
图 6为小鼠分别以 2a-F2重组蛋白以及 PE-2a-F2-KDEL重组蛋白免疫后，不同时间 采集的血液样本以 PCV2 ELISA测定抗体力价的结果， *表示 p < 0.05， **表示 p < 0.01， ***表示 ρ < 0.001 ; #表示 ρ < 0.05， 鼎表示 ρ < 0.01， 漏表示 ρ < 0.001。
图 7为小鼠分别以 PE-2a-F2-KDEL重组蛋白以及 PCV2全病毒疫苗免疫后，不同时 间采集的血液样本以 PCV2 ELISA测定抗体力价的结果， *表示 p < 0.05， **表示 p <
0.01， ***表示 ρ < 0.001 ; #表示 ρ < 0.05， 鼎表示 ρ < 0.01， 漏表示 ρ < 0.001。 具体实施方式
实施例一 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及决定
由于 PCV2病毒 ORF2蛋白全长片段难以在生物表现系统中大量生产， 因此本案发 明人将 PCV2 O F2蛋白的基因分成不同 DNA片段， 并将这些不同的 DNA片段构筑至 载体上， 于生物表现系统中表现各 DNA片段编码的蛋白质， 并分析各 DNA片段在生 物表现系统中的蛋白质产量， 以决定于生物表现系统中可产生高量蛋白质的较佳 DNA 片段。
以下， 系以常用的原核生物表现系统 (大肠杆菌)用以分析及说明。
1. 增幅不同长度 PCV2 0RF2基因片段
本实施例中所使用的 PCV2 ORF2基因序列全长如 SEQ ID No: 1所示， 根据 Wang 等人 (Wang et al., Virus Research 2009, Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2)所提供的序列作为亲源关系树标准序列来分析 SEQ ID No: 1；结 果显示该 PCV2 ORF2序列 (SEQ ID No: 1)属于 PCV2 2a亚群 (subgroup)的一员 (如图 1所 示)。 针对上述 PCV2 2a 的 ORF2 (；以下称为 2a-ORF2)基因序列设计可增幅不同长度 2a-O F2 基因片段的引子 (；如表一所示）， 以进行聚合酶连锁反应 (polymerase chain reaction, PCR)增幅各片段。
如图 2所示， 全长的 2a-ORF2基因片段以专一性引子 pFl(正向引子)及 pRl(反向引 子)进行 PCR增幅， 取得全长 2a-ORF2基因片段的 DNA序列如 SEQ ID NO: 1所示， 以 下简称 2a-ORF2; 而不同长度的 PCV2 2a-ORF2基因片段则分别命名为 2a-Fl、 2a-F2、 2a-F3、 2a-F4、 2a-F5及 2a-F6。 2a-Fl片段位于 PCV2 2a-ORF2的 5'端第 1至 234个核 苷酸的位置， 2a-Fl片段的 DNA序列如 SEQ ID NO: 3所示。 2a-F2片段位于 PCV2 ORF2 的 5'端第 235至 468个核苷酸的位置， 2a-F2片段的 DNA序列如 SEQ ID NO: 5所示。 2a-F3片段位于 PCV2 O F2的 5'端第 469至 699个核苷酸的位置， 2a-F3片段的 DNA 序列如 SEQ ID NO: 7所示。 2a-F4片段位于 PCV2 O F2的 5'端第 349至 699个核苷酸 的位置， 2a-F4片段的 DNA序列如 SEQ ID NO: 9所示。 2a-F5片段位于 PCV2 O F2的 5'端第 235至 699个核苷酸的位置， 2a-F5片段的 DNA序列如 SEQ ID NO: 11所示。 2a-F6 片段位于 PCV2 ORF2的 5'端第 1至 468个核苷酸的位置， 2a-F6片段的 DNA序列如 SEQ ID NO: 13所示。 所有的正向引子 (forward primer)均设计具 H «t m的限制酶切位， 而反 向引子 (reverse primer)均设计具 Xho I的限制酶切位。 表一、 用以增幅不同长度的 PCV2 ORF2基因片段的引子序列表
片段 引子 序列 ft
pFl 正向引子 CCCAAGCTTGCATGACGTATCCAAGGAGGCG SEQ ID NO: 23
ORF2
pRl 反向引子 CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA SEQ ID NO: 24 pFl 正向引子 CCCAAGCTTGCATGACGTATCCAAGGAGGCG SEQ ID NO: 23
F1
pR3 反向引子 CCGC1CQAQGTCGTTAATATTAAATCTCATC SEQ ID NO: 28 pF2 正向引子 CCCAAGCTTGCTTTGTTCCCCCGGGAGGGGG SEQ ID NO: 25
F2
pR2 反向引子 CCGCTCGAGGTAGGAGAAGGGTTGGGGGATT SEQ ID NO: 26 pF3 正向引子 CCCAAGCTTGCCACTCCCGGTACTTTACCCC SEQ ID NO: 27
F3
pRl 反向引子 CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA SEQ ID NO: 24 pF4 正向引子 CCCAAGCTTGCGGAGTGGGCTCCACTGCTGT SEQ ID NO: 29
F4
pRl 反向引子 CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA SEQ ID NO: 24 pF2 正向引子 CCCAAGCTTGCTTTGTTCCCCCGGGAGGGGG SEQ ID NO: 25
F5
pRl 反向引子 CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTA SEQ ID NO: 24 pFl 正向引子 CCCAAGCTTGCATGACGTATCCAAGGAGGCG SEQ ID NO: 23
F6
pR2 反向引子 CCGCTCGAGGTAGGAGAAGGGTTGGGGGATT SEQ ID NO: 26 注： 序列下方以 标示者为酵素切位 H t III的序列 (AAGCTT), 序列下方以 标 示者为酵素切位 Xho I的序列 CCTCGAG)。
PCR反应条件为： 95°C反应 5分钟后， 进行 95°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒， 共 25个循环， 最后以 72°C反应 5分钟以进行延伸反应 (elongation); 所得的 PCR产物 大小分别为： 2a-ORF2为 699 bp、 2a-Fl为 234 bp、 2a-F2为 234 bp、 2a-F3为 231 bp、 2a-F4 为 351 bp、 2a-F5 为 465 bp、 2a-F6 为 468 bp。 并以 2 %洋菜胶电泳 (agarose electrophoresis)鉴定各 PCR产物片段大小。 鉴定无误后， 以 PCR-M纯化套组 (Viogene) 纯化各 PCR产物。
2. 将不同长度 PCV2 O F2基因片段构筑于 pET24a表现载体
分别将 1 g PCR产物与 1 的 pET24a表现载体 (Novagen), 以 1 l Hind m及 1 μΐ Xho I (New England Biolabs)两种限制酶进行限制酶切割反应（Restriction Enzyme Cleavage Reaction),于 37°C反应 8小时。再以 PCR-M Clean up System纯化套组 (Viogene) 纯化酶切后的 PCR产物及 pET24a表现载体，接着进行接合反应 (ligation)。将各 PCR产 物选殖到 ET24a 载体以取得 ET24a-2a-Fl、 pET24a-2a-F2、 pET24a-2a-F3、 pET24a-2a-F4、 pET24a-2a-F5、 pET24a-2a-F6及 pET24a-2a-ORF2质体， 并将上述质体 分别利用转殖作用 (transformation)送入表现宿主大肠杆菌 (E. CO/ )中， 经选殖挑选出菌株 中带有 PCR片段的质体后， 进行定序确认增殖的 PCR产物序列无误， 以得到含有上述 质体的菌株。
3. 不同长度 PCV2 O F2基因片段的蛋白表达及确认
先将含有上述质体的菌株以 2 ml的 LB培养基， 于 37°C培养 16-18小时， 再将菌 液以 1 : 50的比例接种至 LB培养基中， 培养基中含有 25 g/ml kanamycin， 置于 37°C、 200 rpm的培养箱中培养，直到菌液浓度达 O.D 600 nm为 0.6时，加入 β-D-thiogalactoside (IPTG)使其最终浓度为 1 mM， 再于 37°C、 200 rpm的培养箱中培养 6小时， 吸取 1 ml 菌液，经 10,000 xg离心后，取离心后的菌块以 B-PERTM细菌蛋白质萃取试剂 (B-PERTM Bacterial Protein Extraction, 购自 PIERCE)来确认重组蛋白为可溶性蛋白或是包涵体 (inclusion body)。 确认方法为于菌块中加入 40 μΐ的反应试剂， 剧烈震荡 (vortex) 1分钟 后， 10,000 xg离心， 离心后重组蛋白在上层部份为可溶性蛋白， 在下层部份则为包涵 体。 将可溶性蛋白溶于 SDS-PAGE 用的 lx sample buffer, 下层的菌块则加入 2x 的 SDS-PAGE sample buffer。 以干浴槽 100°C煮沸 20分钟后离心之， 吸取上层液体部份， 以 15 %的 SDS-PAGE确认重组蛋白表现的情况。
以 IPTG诱导含有上述质体的菌株产生重组蛋白， 其中 2a-ORF2重组蛋白的胺基酸 序列如 SEQ ID No: 2所示； 2a-Fl重组蛋白的胺基酸序列如 SEQ ID No: 4所示， 2a-F2 重组蛋白的胺基酸序列如 SEQ ID No: 6所示， 2a-F3重组蛋白的胺基酸序列如 SEQ ID No: 8所示， 2a-F4重组蛋白的胺基酸序列如 SEQ ID No: 10所示， 2a-F5重组蛋白的胺基酸 序列如 SEQ ID No: 12所示， 2a-F6重组蛋白的胺基酸序列如 SEQ ID No: 14所示。
以 SDS-PAGE确认各片段重组蛋白表现的结果如图 3所示，第 1道为标准分子量梯 度 (Molecular weight ladder),第 2道为负对照组 (pET24a)，第 3道为 2a-Fl重组蛋白（12.7 kDa)， 第 4道为 2a-F2重组蛋白（11.6 kDa)， 第 5道为 2a-F3重组蛋白（12.1 kDa)， 第 6 道为 2a-F4重组蛋白（16.5 kDa)，第 7道为 2a-F5重组蛋白 (21.4 kDa)， 第 8道为 2a-F6重 组蛋白 (20.8 kDa)， 第 9道为 2a-ORF2全长重组蛋白 (27.5 kDa)。于 2a-ORF2的 6个片段 中， 2a-F2、 2a-F3、 2a-F4、 2a-F5片段都能大量表现 (；图 3第 4、 5、 6、 7道)， 其分子量 位置与预测的 11.6kDa、 12.1kDa、 16.5kDa、 21.4kDa符合。
接着以西方墨渍分析法 (Western Blot)确认表达重组蛋白是否为 PCV2 2a-ORF2的片 段。 将 SDS-PAGE电泳分析后的胶体转印到 PVDF尼龙膜 (Nylon membrane)上。 转印后 将尼龙膜置于填塞液 (Blocking buffer: 5 % Skim milk, in TBST)于室温作用 1小时， 以去 除非特异性反应。 之后， 加入第一级抗体： 老鼠抗 6x组织胺酸的单株抗体 [标帜碱性磷 酸酶 (AP)]于室温作用 1小时，再以 TBST液 (10 mM Tris-HCl H 8.0, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween 20)清洗 6次， 每次各 5分钟。 洗涤后， 加受质 (NBT/BCIP, Bio-Rad)呈色约 10分 钟后， 以清水水洗终止呈色反应。
西方墨渍分析法结果如图 4 所示， 第 1 道为标准分子量梯度 (Molecular weight ladder),第 2道为负对照组 (pET24a)，第 3道为 2a-Fl重组蛋白（12.7 kDa)，第 4道为 2a-F2 重组蛋白（11.6 kDa)，第 5道为 2a-F3重组蛋白（12.1 kDa)，第 6道为 2a-F4重组蛋白（16.5 kDa)， 第 7道为 2a-F5重组蛋白 (21.4 kDa)， 第 8道为 2a-F6重组蛋白 (20.8 kDa)， 第 9 道为 2a-ORF2全长重组蛋白 (27.5 kDa)。西方墨渍分析法结果与 SDS-PAGE分析结果 (如 图 3所示)相同。 2a-ORF2全长重组蛋白（图 4第 9道)无法表现； 2a-ORF2的 6个片段中， 2a-F2、 2a-F3、 2a-F4、 2a-F5片段的蛋白都能被大量表现 (图 4第 4、 5、 6、 7道)， 其分 子量位置与预测的 11.6kDa、 12.1kDa、 16.5kDa、 21.4kDa符合。 然而， 2a-Fl禾 P 2a-F6 片段并没有重组蛋白的表现 (图 4第 3、 8道)，由于 2a-Fl和 2a-F6片段都涵盖了从 PCV2 2a-ORF2的 5'端第 1至 234个核苷酸的基因片段 (请参阅图 2所示)， 因此， 造成 ORF2 基因无法大量表现的原因可能是该 2a-Fl片段内的某些序列， 故针对 2a-Fl片段 (PCV2 2a-O F2的 5'端第 1至 234个核苷酸， SEQ ID No: 3)及 2a-F2 + 2a-F3片段 (PCV2 2a-O F2 的 5'端第 235至 699个核苷酸 (不含终止密码子)， SEQ ID No: 11)的胺基酸序列分析后， 发现 2a-Fl片段胺基酸序列 (SEQ ID No: 4)的精胺酸 (Arginine)含量是 2a-F2 + 2a-F3片段 胺基酸序列 (SEQ ID No: 12)的 2倍以上 (如表二所示)； 本案发明人进一步将该些精胺酸 增加或删除后，去分析蛋白质表现，发现将该些过多的精胺酸减少后，确实可增加 PCV2 O F2的蛋白表现量。
表二、 PCV2 2a-ORF2胺基酸序列中精胺酸的数量分析
2a-Fl 2a-F2 + 2a-F3
密码子 胺基酸 数量 密码子 胺基酸 数量
AGA 精胺酸 5 AGA 精胺酸 3
AGG 精胺酸 3 AGG 精胺酸 3
CGA 精胺酸 1 CGC 精胺酸 1
CGC 精胺酸 10 CGG 精胺酸 1
CGT 精胺酸 2 CGT 精胺酸 1 总数 21 总数 9 实施例二 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的免疫原性 (immimogenicity)的决定
1. 大鼠免疫试验
将实施例一所得到的 2a-F2、 2a-F3、 2a-F4、 2a-F5重组蛋白以弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant)制备为各种 PCV2次单位疫苗， 并进行大鼠 (rats)免疫试验， 以分析各 重组蛋白的引发试验动物产生抗 PCV2抗体的免疫原性。
取 5〜6周龄健康雌性清洁级大鼠 15只作为试验动物， 所有大鼠的猪第二型环状病 毒 (PCV2)酵素结合免疫吸附分析 (ELISA)抗体皆呈阴性。 将这 15只大鼠随机分为 5组， 每组 3只； 第 1~4组中， 每只大鼠分别以皮下注射 (subcutaneously, S.C.)注射 200 μ§重 组蛋白， 注射疫苗总体积为 300 μί， 其中重组蛋白与佐剂的体积比为 1 : 1。 第 5组则 注射 300 PBS作为负对照组。 两周后用相同免疫剂量加强免疫一次； 各组隔离饲养 观察，首次免疫后第 0、2、4、8周分别采血分离血清，以酵素连结免疫分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清内抗猪第二型环状病毒 (PCV2)的抗体力价。
2. 血清抗体的判定 - 以 ELISA测定抗 PCV2抗体力价
以含有 PCV2病毒抗原 (300 ng/孔)的 96孔抗原盘作为检测套组。 以含有 500 μΙ/L Tween-20的 50 mmol/L PBS (pH 7.2) (即 PBST)洗涤抗原盘 3次，每次 3~5分钟； 再于抗 原盘中加入 0.15% BSA填充液 (blocking solution)(20( L/孔)， 以填充 (block)抗原盘， 并 于 37°C下作用 2小时后， 以 PBS洗涤。将待检测的大鼠血清以 PBS缓冲液以 1 : 50倍 数稀释， 然后再做倍比稀释； 每个样品 8重复， 每孔加 ΙΟΟμί稀释的大鼠血清， 于 37°C 下作用 1小时后， 以 PBS洗涤； 然后加入碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP)标定的 anti-mouse IgG抗体， 于 37°C下作用 1小时后， 以 PBS洗涤； 接着加入磷酸对硝基苯 酯 (para-Nitrophenylphosphate, pNPP)溶液显色， 最后用 1M的 NaOH终止反应后判定结 果。 读取各样本在 405 nm波长下的吸光值， 每个样本读取两次， 并取平均值进行分析。
ELISA分析结果如图 5所示。 在实施例一所得到的 2a-F2、 2a-F3、 2a-F4、 2a-F5重 组蛋白皆可诱发试验动物产生抗 PCV2的血清抗体； 其中又以 2a-F2重组蛋白片段 (SEQ ID No: 6)可以引发试验动物产生最高量之抗 PCV2血清抗体，且相较于注射 PBS的负对 照组， 抗体产生量皆具有显著差异 <0.05)。
本案发明人进一步亦将该 2a-F2、 2a-F3、 2a-F4、 2a-F5重组蛋白进行猪只免疫， 结 果发现该等重组蛋白皆可诱发猪只产生抗 PCV2血清抗体。 此外， 亦藉由 PCV2攻毒试 验评估该等重组蛋白的免疫保护效力： 将该等重组蛋白配制成次单位疫苗后， 进行猪只 免疫后， 再以 PCV2病毒株攻毒， 结果发现经攻毒后， 免疫组的保护率高于对照组 (未施 以疫苗者)； 此处所指的保护率提高包含： 病毒血症的降低、 PCV2病征的减缓。 因此， 证实该等重组蛋白所制备的 PCV2次单位疫苗可有效提供动物产生免疫力， 以提高动物 的存活率。 实施例三 PCV2 2a次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及表达
由实施例二的试验结果可知， PCV2 ORF2的 F2蛋白片段可引发试验动物产生最高 量之抗 PCV2血清抗体； 为了提高 PCV2次单位疫苗的免疫原性， 在本实施例中， 将实 施例一所得的 2a-F2 蛋白片段的 N 端加上绿脓杆菌 (ftem owomw aerag^ora)外毒素 A(exotoxin A)的受体结合区 (receptor binding domain I)及运输结构区 (transmembrane targeting domain Π)的蛋白（即 PE蛋白）， 且于该 2a-F2蛋白片段的 C端加上内质网回收 讯号 (ER retention signal) - KDEL蛋白质讯号序列 (signal peptide), 以产生抗原融合蛋白 (PE-2a-F2-KDEL), 以期诱导生物体产生更佳的免疫反应。
该抗原融合蛋白 (PE-2a-F2-KDEL)系透过基因转殖技术，将编码各蛋白的 DNA序列 转入表现载体中， 形成一抗原融合蛋白表现载体 (pET24a-PE-2a-F2-KDEL)， 并诱导该抗 原融合蛋白表现载体表现该抗原融合蛋白 (PE-2a-F2-KDEL)。 首先， 取编码 KDEL蛋白 质讯号序列的 DNA序列 (SEQ ID No: 30)，转殖到 pET24a质体中，以形成 pET24a-KDEL 质体； 然后， 取实施例一所得的 2a-F2 片段 DNA 序列 (SEQ ID No: 5)， 转殖到该 pET24a-KDEL质体中，以形成 pET24a-2a-F2-KDEL质体；最后，取编码 PE蛋白的 DNA 序列（SEQ ID No: 34)， 转殖到该 pET24a-2a-F2-KDEL 质体中 ， 以形成 pET24a-PE-2a-F2-KDEL质体。
1. pET24a-KEDL质体的构筑
编码 KDEL蛋白质讯号序列 (SEQ ID No: 31)的 DNA序列如 SEQ ID No: 30所示， 以 PCR进行扩增， KEDL专一性引子 (； KEDL specificity primers)的序列如下所示： 正向引子 (；含有 HincHU限制酶酶切位置)：
Hz III
反向引子 (含有 ½ I限制酶酶切位置)：
5 ' -GTG QSd(JCAGTTCGTCTTTCAGTTCATCT-3 ' (SEQ ID No: 33) Xho I
PCR反应条件为： 94°C反应 3分钟后， 进行 95°C 1分钟、 55°C 1分钟、 72°C 20秒， 共 5个循环， 最后以 72°C反应 1分钟以进行延伸反应 (elongation); 分别将 PCR产物与 pET24a载体进行双酶切 (以 Hind III及 Xho I两种限制酶进行酶切反应)， 再将酶切后的 PC 产物与 pET24a载体进行纯化以及接合 (ligation)作用，以将 PCR产物选殖到 pET24a 载体形成 pET24a-KEDL质体， 并将 pET24a-KEDL质体利用转殖作用 (transformation)送 入寄主细胞大肠杆菌 (E. 中， 以进行大量增殖， 并进行定序确认增殖的 PCR产物序 列无误。
2. pET24a-2a-F2-KDEL质体的构筑
以 PCR增殖实施例一所得的 2a-F2 DNA片段 (SEQ ID No: 5)， PC 引子序列如下： 正向引子 pF2-l (含有 c l限制酶酶切位置)：
5 '-CGAGCTCTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGG-3 ' (SEQ ID No: 38)
Sac I
反向引子 pR2-l (；含有 H"i m限制酶酶切位置)：
5 ' -CCC AAGCTTGTAGGAGAAGGGTTGGGGGATT-3 ' (SEQ ID No: 39) Hind III
PCR反应条件为： 95°C反应 5分钟后， 进行 95°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒， 共 25个循环， 最后以 72°C反应 5分钟以进行延伸反应 (elongation); 分别将 PCR产物与上 述 pET24a-KEDL质体进行双酶切 (；以 Sac I及 Hind III两种限制酶进行酶切反应)， 再将 酶切后的 PCR产物与 pET24a-KEDL质体进行纯化以及接合作用， 以将 PCR产物选殖 到 pET24a-KEDL 质体形成 pET24a-2a-F2-KEDL 质体， 并将该质体利用转殖作用 (transformation)送入寄主细胞大肠杆菌 (E. CO/ )中， 以进行大量增殖， 并进行定序确认增 殖的 PCR产物序列无误。
3. pET24a-PE-2a-F2-KDEL质体的构筑
编码 PE蛋白（SEQ ID No: 35)的 DNA序列如 SEQ ID No: 34所示，以 PCR进行扩增， PE专一性引子 (PE specificity primers)的序列如下所示：
正向引子 (；含有 SawH I限制酶酶切位置)： 5 '- CGGGATCCGAAGAAGCGTTCGAC -3 ' (SEQ ID No: 36)
Bamii I
反向引子 (含有 EcoRI及 Sac I限制酶酶切位置)：
5 '- CGGAATTCGAGCTCGCAGGTCAGGCTCACCAC-3 ' (SEQ ID No: 37)
EcoR I Sac I
PC 反应条件为： 94°C反应 5分钟后， 进行 95°C 1分钟、 55°C 1分钟、 72°C 1.5分钟， 共 30 个循环， 最后以 72°C 反应 7 分钟以进行延伸反应； 分别将 PCR产物与上述 pET24a-2a-F2-KEDL质体进行双酶切 (以 BamH I及 Sac I两种限制酶进行酶切反应)， 再 将酶切后的 PCR产物与 pET24a-2a-F2-KEDL质体进行纯化以及接合作用，以将 PCR产 物选殖到 pET24a-2a-F2-KDEL 质体， 形成 pET24a-PE-2a-F2-KEDL 质体， 并将 pET24a-PE-2a-F2-KEDL 质体利用转殖作用 (transformation)送入表现宿主大肠杆菌 co/ )中， 并进行定序确认增殖的 PCR产物序列无误。 PE-2a-F2-KEDL抗原融合蛋白的 DNA序列则如 SEQ ID No: 40所示， 而其胺基酸序列则如 SEQ ID No: 41所示。
4. PE-2a-F2-KDEL抗原蛋白的表达
将上述含有 pET24a-PE-2a-F2-KEDL质体的大肠杆菌 (E. co/ )以 LB培养基培养， 并 以 IPTG诱导 PE-2a-F2-KEDL抗原融合蛋白 (SEQ ID No: 41)表达， 蛋白表达及萃取方法 如实施例一所述。 实施例四 不同亚群 (subgroup)的 PCV2 ORF2序列的分析
除了 2a亚群 (subgroup)之外， 猪第二型环状病毒 (PCV2)还有其他亚群的病毒株， 以 下分别针对一 2b亚群 PCV2病毒株、 2c亚群 PCV2病毒株、 2d亚群 PCV2病毒株、 及 2e亚群 PCV2病毒株的 PCV2 ORF2序列， 分析其 ORF2的 5 '端第 1至 234个核苷酸以 及第 235至最后一个核苷酸之间片段的精胺酸 (Arginine)含量。
首先， 根据 Wang等人 (Wang et al.， Virus Research 2009, Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2)所提供的序列作为亲源关系树标准序列来分析 SEQ ID No: 15、 SEQ ID No: 19，结果显示该 SEQ ID No: 15属于 PCV2 2b亚群 (subgroup) 的一员；该 SEQ ID No: 19属于 PCV2 2d亚群 (subgroup)的一员（如图 1所示)；而 SEQ ID No:50及 SEQ ID No:52则分别为 PCV2 2c亚群及 PCV2 2e亚群的标准株。
PCV2 2b亚群株的序列分析结果如表三所示， 该 PCV2 2b亚群株的 2b-ORF2核苷 酸序列如 SEQ ID No: 15所示，胺基酸序列如 SEQ ID No: 16所示;其中， 2b-O F2的 5' 端第 1至 234个核苷酸片段编码 21个精胺酸， 而 2b-ORF2的 5'端第 235至 699个核苷 酸 (不含终止密码子)序列如 SEQ ID No: 17所示， 其胺基酸序列如 SEQ ID No: 18所示， 该片段编码 10个精胺酸； PCV2 2b亚群株的序列分析结果与 PCV2 2a亚群株的序列分 析结果一致，两者 ORF2蛋白 N端序列的精胺酸含量皆为其他部份精胺酸含量的 2倍以 上 (如表二及表三所示)。
表三、 PCV2 2b-ORF2胺基酸序列中精胺酸的数量分析
2b亚群株-第 1-234个核苷酸 2b亚群株-第 235-699个核苷酸 密码子 胺基酸 数量 密码子 胺基酸 数量
AGA 精胺酸 5 AGA 精胺酸 5
AGG 精胺酸 3 AGG 精胺酸 1
CGA 精胺酸 1 CGA 精胺酸 0
CGC 精胺酸 9 CGC 精胺酸 3
CGG 精胺酸 1 CGG 精胺酸 0
CGT 精胺酸 2 CGT 精胺酸 1 总数 21 总数 10 PCV2 2c亚群株的序列分析结果如表四所示，该 PCV2 2c亚群株的 2c-ORF2核苷酸 序列如 SEQ ID No: 50所示， 胺基酸序列如 SEQ ID No: 51所示； 其中， 2c-ORF2的 5' 端第 1至 234个核苷酸片段编码 20个精胺酸， 而 2C-ORF2的 5，端第 235至 702个核苷 酸序列如 SEQ ID No: 54所示， 其胺基酸序列如 SEQ ID No: 55所示， 该片段编码 10个 精胺酸； PCV2 2c亚群株的序列分析结果与 PCV2 2a及 2b亚群株的序列分析结果一致， 三者 ORF2蛋白 N端序列的精胺酸含量皆为其他部份精胺酸含量的 2倍以上 (如表二、 表三、 表四所示)。
表四、 PCV2 2C-ORF2胺基酸序列中精胺酸的数量分析 2c亚群株-第 1-234个核苷酸 2c亚群株-第 235-702个核苷酸 密码子 胺基酸 数量 密码子 胺基酸 数量
AGA 精胺酸 5 AGA 精胺酸 6
AGG 精胺酸 3 AGG 精胺酸 1
CGA 精胺酸 0 CGA 精胺酸 0
CGC 精胺酸 9 CGC 精胺酸 2
CGG 精胺酸 1 CGG 精胺酸 0
CGT 精胺酸 2 CGT 精胺酸 1 总数 20 总数 10
PCV2 2d亚群株的序列分析结果如表五所示， 该 PCV2 2d亚群株的 2d-ORF2核苷 酸序列如 SEQ ID No: 19所示，胺基酸序列如 SEQ ID No: 20所示；其中， 2d-ORF2的 5' 端第 1至 234个核苷酸片段编码 21个精胺酸， 而 2d-ORF2的 5'端第 235至 702个核苷 酸片段 (不含终止密码子)序列如 SEQ ID No: 21所示，其胺基酸序列如 SEQ ID No: 22所 示， 该片段编码 10个精胺酸； PCV2 2d亚群株的序列分析结果与 PCV2 2a、 2b、 及 2c 亚群株的序列分析结果一致，四者 ORF2蛋白 N端序列的精胺酸含量皆为其他部份精胺 酸含量的 2倍以上 (如表二、 表三、 表四及表五所示)。
表五、 PCV2 2d-ORF2胺基酸序列中精胺酸的数量分析
2d亚群株-第 1-234个核苷酸 2d亚群株-第 235-702个核苷酸 密码子 胺基酸 数量 密码子 胺基酸 数量
AGA 精胺酸 5 AGA 精胺酸 4
AGG 精胺酸 3 AGG 精胺酸 3
CGA 精胺酸 1 CGA 精胺酸 0
CGC 精胺酸 10 CGC 精胺酸 1
CGG 精胺酸 0 CGG 精胺酸 1
CGT 精胺酸 2 CGT 精胺酸 1 总数 21 总数 10 PCV2 2e亚群株的序列分析结果如表六所示，该 PCV2 2e亚群株的 2e-ORF2核苷酸 序列如 SEQ ID No: 52所示， 胺基酸序列如 SEQ ID No: 53所示； 其中， 2e-ORF2的 5' 端第 1至 234个核苷酸片段编码 20个精胺酸， 而 2e-ORF2的 5，端第 235至 699个核苷 酸片段 (不含终止密码子)序列如 SEQ ID No: 56所示，其胺基酸序列如 SEQ ID No: 57所 示， 该片段编码 9个精胺酸； PCV2 2e亚群株的序列分析结果与 PCV2 2a、 2b、 2c及 2d 亚群株的序列分析结果一致，五者 ORF2蛋白 N端序列的精胺酸含量皆为其他部份精胺 酸含量的 2倍以上 (如表二、 表三、 表四、 表五及表六所示)。
表六、 PCV2 2e-ORF2胺基酸序列中精胺酸的数量分析
2e亚群株-第 1-234个核苷酸 2e亚群株-第 235-699个核苷酸 密码子 胺基酸 数量 密码子 胺基酸 数量
AGA 精胺酸 5 AGA 精胺酸 4
AGG 精胺酸 3 AGG 精胺酸 2
CGA 精胺酸 0 CGA 精胺酸 0
CGC 精胺酸 9 CGC 精胺酸 2
CGG 精胺酸 1 CGG 精胺酸 0
CGT 精胺酸 2 CGT 精胺酸 1 总数 20 总数 9 与实施例一相同， 本案亦分析了 PCV2 2b亚群株、 PCV2 2c亚群株、 PCV2 2d亚群 株及 PCV2 2e亚群株的 N端富含精胺酸区域 (Arginitie-rich domian), 及非富含精胺酸区 ¾(non-Arginine-rich domain)的蛋白表现量， 发现与实施例一结果相同， 该 N端富含精 胺酸区域所编译的蛋白片段难以被表达； 然而， 该非富含精胺酸区域所编译的蛋白片段 可易于生物表现系统中被表达； 且进一步将该些精胺酸增加或删除后， 并分析蛋白质表 现后， 亦发现结果与 PCV2 2a亚群株一致， 当该些过多的精胺酸数量减少后， 发现确实 可增加 PCV2 O F2的蛋白表现量。
其中该富含精胺酸区域约在 PCV2 ORF2全长胜肽的 N端第 1至 78个胺基酸之间 的区域； 该非富含精胺酸区域约在 PCV2 ORF2的 N端第 79个胺基酸至 C端最后一个 胺基酸之间的区域。 实施例五 PCV2 2b次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及表达
1. pET24a-2b-F2质体的构筑及表达
本实施例针对实施例四的 PCV2 2b亚群株的 ORF2基因进行次单位疫苗抗原蛋白片 段的构筑。 同实施例一及三， 选用 F2片段 (PCV2 2b的 ORF2基因 5 '端第 235-468个核 苷酸， 以下称为 2b-F2片段)进行构筑。 该 PCV2 2b亚群株的 2b-F2片段的核苷酸序列 如 SEQ ID No: 17所示， 其胺基酸序列如 SEQ ID No: 18所示。 以 PCR扩增 2b-F2片段 核苷酸序列， PCR引子序列如下- 正向引子 pF-2b (；含有 Sac I限制酶酶切位置)：
5 '- CGAGCTCTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGC -3 ' (SEQ ID No: 42)
Sac I
反向引子 pR-2b (含有 Himim限制酶酶切位置)：
5 '- CCCAAGCTTGTAGGAGAAGGGCTGGGTTAT-3 ' (SEQ ID No: 43) Hind III
PCR反应条件为： 95°C反应 5分钟后， 进行 95°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒， 共 25个循环， 最后以 72°C反应 5分钟以进行延伸反应 (elongation); 分别将 PCR产物与 pET24a表现载体 (Novagen)进行双酶切 (以 Sac I及 Hind III两种限制酶进行酶切反应)， 再将酶切后的 PCR产物与 pET24a表现载体进行纯化以及接合作用， 以将 PCR产物选 殖到 pET24a表现载体形成 pET24a-2b-F2质体，并将该质体利用转殖作用 (transformation) 送入寄主细胞大肠杆菌 (E. 中， 以进行大量增殖， 并进行定序确认增殖的 PCR产物 序列无误。 接着将上述含有 pET24a-2b-F2质体的大肠杆菌 (E. CO/ )以 LB培养基培养， 并以 IPTG诱导 2b-F2抗原蛋白 (SEQ ID No: 18)表达， 蛋白表达及萃取方法如实施例一 所述。
2. pET24a-PE-2b-F2-KDEL质体的构筑及表达
在本实施例中， 除了以 2b-F2胺基酸片段作为 PCV2次单位疫苗的抗原片段之外， 也在 2b-F2胺基酸片段的 N端及 C端分别加上 PE蛋白及 KDEL蛋白质讯号序列，形成 抗原融合蛋白 PE-2b-F2-KDEL， 以期诱导生物体产生更佳的免疫反应。
抗原融合蛋白 PE-2b-F2-KDEL的 DNA序列如 SEQ ID No: 44所示， 而其胺基酸序 列如 SEQ ID No: 45 所示。 表达该抗原融合蛋白 PE-2b-F2-KDEL 的质体 (pET24a-PE-2b-F2-KDEL)的构筑策略同实施例三。首先，取编码 KDEL蛋白质讯号序列 的 DNA序列 (SEQ ID No: 30)， 转殖到 pET24a质体中， 以形成 pET24a-KDEL质体， pET24a-KDEL质体的构筑方式如实施例三所述。 然后， 取上述 PCR增殖的 2b-F2片段 DNA序列 (SEQ ID No: 17)，转殖到该 pET24a-KDEL质体中，以形成 pET24a-2b-F2-KDEL 质体。最后，取编码 PE蛋白的 DNA序列 (SEQ ID No: 34)，转殖到该 pET24a-2b-F2-KDEL 质体中， 以形成 pET24a-PE-2b-F2-KDEL质体， pET24a-PE-2b-F2-KDEL质体的构筑方 式亦如实施例三所述。接着将上述含有 pET24a-PE-2b-F2-KEDL质体的大肠杆菌 (E. coli) 以 LB培养基培养，并以 IPTG诱导 PE-2b-F2-KEDL抗原融合蛋白 (SEQ ID No: 45)表达， 蛋白表达及萃取方法如实施例一所述。 实施例六 PCV2 2d次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及表达
1. pET24a-2d-F2质体的构筑及表达
本实施例针对实施例四的 PCV2 2d亚群株的 ORF2基因进行次单位疫苗抗原蛋白片 段的构筑。 同实施例一及三， 选用 F2片段 (PCV2 2d的 ORF2基因 5 '端第 235-468个核 苷酸， 以下称为 2d-F2片段)进行构筑。 该 PCV2 2d亚群株的 2d-F2片段的核苷酸序列 如 SEQ ID No: 21所示， 其胺基酸序列如 SEQ ID No: 22所示。 以 PCR扩增 2b-F2片段 核苷酸序列， PCR引子序列如下：
正向引子 pF-2d (含有 Sac I限制酶酶切位置)：
5 '- CGAGCTCTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGC -3 ' (SEQ ID No: 46)
Sac I
反向引子 pR-2d (含有 Himi m限制酶酶切位置)：
5 '- CCCAAGCUGTAGGAGAAGGGCTGGGTTAT -3 ' (SEQ ID No: 47)
Hind III PCR反应条件为： 95°C反应 5分钟后， 进行 95°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒， 共 25个循环， 最后以 72°C反应 5分钟以进行延伸反应 (elongation); 分别将 PCR产物与 pET24a表现载体 (Novagen)进行双酶切 (以 Sac I及 Hind III两种限制酶进行酶切反应)， 再将酶切后的 PCR产物与 pET24a表现载体进行纯化以及接合作用， 以将 PCR产物选 殖到 pET24a表现载体形成 pET24a-2d-F2质体，并将该质体利用转殖作用 (transformation) 送入寄主细胞大肠杆菌 (E. 中， 以进行大量增殖， 并进行定序确认增殖的 PCR产物 序列无误。 接着将上述含有 pET24a-2d-F2质体的大肠杆菌 (E. CO/ )以 LB培养基培养， 并以 IPTG诱导 2d-F2抗原融合蛋白 (SEQ ID No: 22)表达， 蛋白表达及萃取方法如实施 例一所述。
2. pET24a-PE-2d-F2-KDEL质体的构筑及表达
在本实施例中， 除了以 2d-F2胺基酸片段作为 PCV2次单位疫苗的抗原片段之外， 也在 2d-F2胺基酸片段的 N端及 C端分别加上 PE蛋白及 KDEL蛋白质讯号序列，形成 抗原融合蛋白 PE-2d-F2-KDEL， 以期诱导生物体产生更佳的免疫反应。
抗原融合蛋白 PE-2d-F2-KDEL的 DNA序列如 SEQ ID No: 48所示， 而其胺基酸序 列如 SEQ ID No: 49 所示。 表达该抗原融合蛋白 PE-2d-F2-KDEL 的质体 (pET24a-PE-2d-F2-KDEL)的构筑策略同实施例三。首先，取编码 KDEL蛋白质讯号序列 的 DNA序列 (SEQ ID No: 30)， 转殖到 pET24a质体中， 以形成 pET24a-KDEL质体， pET24a-KDEL质体的构筑方式如实施例三所述。 然后， 取上述 PCR增殖的 2d-F2片段 DNA序列 (SEQ ID No: 21)，转殖到该 pET24a-KDEL质体中，以形成 pET24a-2d-F2-KDEL 质体。最后，取编码 PE蛋白的 DNA序列 (SEQ ID No: 34)，转殖到该 pET24a-2d-F2-KDEL 质体中， 以形成 pET24a-PE-2d-F2-KDEL质体， pET24a-PE-2d-F2-KDEL质体的构筑方 式亦如实施例三所述。接着将上述含有 pET24a-PE-2d-F2-KEDL质体的大肠杆菌 (E. coli) 以 LB培养基培养，并以 IPTG诱导 PE-2d-F2-KEDL抗原融合蛋白 (SEQ ID No: 49)表达， 蛋白表达及萃取方法如实施例一所述。 实施例七 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的免疫原性 (immimogenicity)的分析 -1
1. 小鼠免疫试验 将实施例一所得到的 2a-F2 重组蛋白（SEQ ID No: 6)以及实施例三所得到的
PE-2a-F2-KDEL重组蛋白 (SEQ ID No: 41)分别以弗氏完全佐剂制备为 PCV2次单位疫 苗， 并进行小鼠 (mice)免疫试验， 以比较这两种重组蛋白引发试验动物产生抗 PCV2抗 体的免疫原性。
取 5〜6周龄健康雌性清洁级 Balb/c小鼠 9只作为试验动物，所有小鼠的猪第二型环 状病毒 (PCV2) ELISA抗体皆呈阴性。 将这 9只小鼠随机分为 3组， 每组 3只； 第 1、 2 组中， 每只小鼠分别以腹腔注射 (intraperitoneally, LP.)注射 100 μg 重组蛋白 2a-F2 及 PE-2a-F2-KDEL。第 3组则注射 PBS作为负对照组。两周后用相同免疫剂量加强免疫一 次； 各组隔离饲养观察， 首次免疫后第 2、 4、 5、 6周分别采血分离血清， 以 ELISA测 定血清内抗 PCV2的抗体力价。
2. 血清抗体的判定 - 以 ELISA测定抗 PCV2抗体力价
以含有 PCV2病毒抗原 (300 ng/孔)的 96孔抗原盘作为检测套组。 以含有 500 μΙ/L Tween-20的 50 mmol/L PBS (pH 7.2) (即 PBST)洗涤抗原盘 3次，每次 3~5分钟； 再于抗 原盘中加入 0.15% BSA填充液 (blocking solution)(20( L/孔)， 以填充 (block)抗原盘， 并 于 37°C下作用 2小时后， 以 PBS洗涤。将待检测的小鼠血清以 PBS缓冲液以 1 : 50倍 数稀释， 然后再做倍比稀释； 每个样品 8重复， 每孔加 ΙΟΟμί稀释的小鼠血清， 于 37°C 下作用 1小时后， 以 PBS洗涤； 然后加入碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, AP)标定的 anti-mouse IgG抗体， 于 37°C下作用 1小时后， 以 PBS洗涤； 接着加入磷酸对硝基苯 酯 (para-Nitrophenylphosphate, pNPP)溶液显色， 最后用 1M的 NaOH终止反应后判定结 果。 读取各样本在 405 nm波长下的吸光值， 每个样本读取两次， 并取平均值进行分析。
ELISA 分析结果如图 6 所示。 相较于 2a-F2 重组蛋白片段 (SEQ ID No: 6)，
PE-2a-F2-KDEL重组蛋白 (SEQ ID No: 41)可以引发试验动物产生较高量的抗 PCV2血清 抗体， 且于首次免疫第 4周后， 第 1组及第 2组小鼠产生的血清抗体量开始具有显著差 异 < 0.05); 到了首次免疫后第 6周， 两组产生的血清抗体量差异更大 < 0.001)。 另 夕卜， 相较于注射 PBS的负对照组， 第 1组及第 2组小鼠的抗体产生量皆具有显著差异 (p <0.01)。 实施例八 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的免疫原性 (immimogenicity)的分析 -2
1. 小鼠免疫试验
在本实施例中，比较本发明 PE-2a-F2-KDEL重组蛋白次单位疫苗以及 PCV2全病毒 疫苗引发试验动物产生抗 PCV2抗体的免疫原性。
将实施例三所得到的 PE-2a-F2-KDEL 重组蛋白（SEQ ID No: 41)以油质佐剂 Montanide ISA206 (Seppic, France)制备为 PCV2次单位疫苗。 另外， 取不活化的 PCV2 全病毒 (106TCID5Q/ml)， 以油质佐剂 Montanide ISA206 (Seppic, France)制备为 PCV2全病 毒疫苗， 每一剂量的 PCV2全病毒疫苗含有 100 μΐ不活化的 PCV2全病毒以及 250 μΐ 佐剂。 接着进行小鼠免疫试验。
取 5〜6周龄健康雌性清洁级 Balb/c小鼠 15只作为试验动物， 所有小鼠的猪第二型 环状病毒 (PCV2) ELISA抗体皆呈阴性。 将这 15只小鼠随机分为 3组， 每组 5只； 第 1 组中的每只小鼠分别以腹腔注射 (LP.)注射 100 μg重组蛋白。第 2组中的每只小鼠分别以 腹腔注射 (I.P.)注射一剂量的 PCV2全病毒疫苗。第 3组则注射油质佐剂 Montanide ISA206 作为负对照组。 三周后用相同免疫剂量加强免疫一次； 各组隔离饲养观察， 首次免疫后 第 0、 1、 2、 3、 4、 5周分别采血分离血清， 以 ELISA测定血清内抗 PCV2的抗体力价。 2. 血清抗体的判定 - 以 ELISA测定抗 PCV2抗体力价
同实施例七所述的"以 ELISA测定抗 PCV2抗体力价"的方法。 ELISA分析结果如图 7所示。 相较于 PCV2全病毒疫苗， PE-2a-F2-KDEL重组蛋白 (SEQ ID No: 41)可以引发 试验动物产生较高量的抗 PCV2血清抗体， 且于首次免疫 1周后， 第 1组及第 2组小鼠 产生的血清抗体量便具有显著差异 < 0.001)； 且相较于注射油质佐剂的负对照组， 注 射 PE-2a-F2-KDEL重组蛋白的小鼠的抗体产生量，在首次免疫 1周后便具有显著差异 (p <0.001)。
此外， 将前述的 2a-F2重组蛋白、 PE-2a-F2-KDEL重组蛋白进行猪只免疫， 结果发 现该等重组蛋白皆可诱发猪只产生抗 PCV2血清抗体。 此外， 亦藉由 PCV2攻毒试验评 估该等重组蛋白的免疫保护效力： 将该等重组蛋白配制成次单位疫苗后， 进行猪只免疫 后， 再以 PCV2病毒株攻毒， 结果发现经攻毒后， 免疫组的保护率高于对照组 (未施以疫 苗者)； 此处所指的保护率提高包含： 病毒血症的降低、 PCV2病征的减缓。 因此， 证实 该等重组蛋白所制备的 PCV2次单位疫苗可有效提供动物产生免疫力， 以提高动物的存 活率。
相同地， 本案进一步将 PCV2 2b亚群株、 PCV2 2c亚群株、 PCV2 2d亚群株、 及 PCV2 2e亚群株的 ORF2以实施例一至三的构筑方式构筑， 进而以实施例七、 八所述的 免疫原性分析进行分析， 结果发现， 该等亚群株的 ORF2片段 (如： F2片段)及其融合蛋 白 (如： PE-F2-KDEL)所制备的 PCV2次单位疫苗皆可诱发动物 (如： 猪只)产生抗 PCV2 抗体， 进而保护动物免于被 PCV2病毒感染。
本发明所提供的 PCV2次单位疫苗， 与其他习用技术相互比较时， 更具有下列的优 点：
本发明所提供的 PCV2次单位疫苗系利用基因重组技术，从 PCV2病毒 ORF2蛋白 全长片段中选殖出于生物表现系统中可表现大量蛋白质的片段， 利用该 ORF2蛋白片段 所制备的 PCV2次单位疫苗，不但可以引发动物产生抗 PCV2病毒的免疫力，且该 ORF2 蛋白片段可以基因重组技术大量生产， 亦可降低制造疫苗的成本。
本发明所提供的另一 PCV2次单位疫苗， 系以 PCV2病毒 ORF2的 F2蛋白片段与 PE蛋白及 KDEL蛋白质讯号序列形成 PE-F2-KDEL抗原融合蛋白， 经试验结果显示， 此一次单位疫苗更可提高动物对抗 PCV2病毒的免疫性及效率。
本发明所提供的 PCV2次单位疫苗系利用基因重组技术所研发的次单位疫苗， 其具 备有生产制备简单、 成本低、 纯度高、 产量高及安全性佳等优点。
上列详细说明系针对本发明的一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制 本发明的专利范围， 凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更， 均应包含于本案 的专利范围中。

Claims (17)

1.一种抗猪第二型环状病毒免疫组合物， 包含一抗原胜肽， 该抗原胜肽选自由 及 (b)所组成的群组中至少一者-
(a) PCV2 第二开放阅读区非富含精胺酸胜肽，该 PCV2 0RF2非富含精胺酸胜肽 的精胺酸数量为该 PCV2 ORF2全长胜肽的 N端富含精胺酸区域的精胺酸数量 的 0至二分之一倍； 及
(b) 一重组融合蛋白， 该重组融合蛋白自胺基端到羧基端包含：
一 PE胜肽， 其具有如 SEQ ID No: 35的序列；
一 (a)项的 PCV2 0RF2非富含精胺酸胜肽； 以及
一 KDEL胜肽， 其具有如 SEQ ID No: 31的序列。
2.如权利要求 1所述的免疫组合物， 其中该 PCV2 ORF2全长胜肽具有一胺基酸序 列，该胺基酸序列选自由 SEQ ID No: 2、 SEQ ID No: 16、 SEQ ID No: 20、 SEQ ID No: 51、 及 SEQ ID No: 53所组成的群组中至少一者。
3.如权利要求 1所述的免疫组合物， 其中该 PCV2 0RF2全长胜肽具有一胺基酸序 列，该胺基酸序列与选自 SEQ ID No: 2、 SEQ ID No: 16、 SEQ ID No: 20、 SEQ ID No: 51、 及 SEQ ID No: 53的序列的一具有至少 80%序列同源性。
4.如权利要求 1所述的免疫组合物， 其中该富含精胺酸区域为该 PCV2 0 F2全长 胜肽的胺基端第 1-78个胺基酸。
5.如权利要求 1所述的免疫组合物，进一步包含 PCV2其他开放阅读区 (open reading frame, 0RF)的抗原蛋白， 该 PCV2其他 0RF的抗原蛋白包含 0RF1及 0RF3。
6.如权利要求 1所述的免疫组合物， 进一步包含至少一种病原抗原， 该病原抗原选 自由下列群组所组成者： 猪流感病毒抗原、 猪繁殖与呼吸症候群病毒抗原、 猪霉浆菌、 猪小病毒、 猪丹毒， 以及伪狂犬病。
7.如权利要求 1所述的免疫组合物， 其中该第 (a)项所述的 PCV2 ORF2非富含精胺 酸胜肽， 选自由下列群组所组成者： SEQ ID No: 6、 SEQ ID No: 8、 SEQ ID No: 10、 SEQ
ID No: 12、 SEQ ID No: 18、 SEQ ID No: 22、 SEQ ID No: 55及 SEQ ID No: 57。
8.如权利要求 1所述的免疫组合物， 可进一步包含一或多种选自于下者： 载剂、 溶 剂、 乳化剂、 悬浮剂、 分解剂、 黏结剂、 赋形剂、 安定剂、 螯合剂、 稀释剂、 胶凝剂、 防腐剂、 润滑剂、 界面活性剂、 佐剂、 生物型载体。
9.一种抗猪第二型环状病毒免疫组合物， 包含一抗原胜肽， 该抗原胜肽选自由 (a)及
(b)所组成群组中至少一者- (a) — PCV2 O F2 F2胜肽，为 PCV2 ORF2全长胜肽的 N端第 79- 156个胺基酸； 以及
(b) 一重组融合蛋白， 该重组融合蛋白自胺基端到羧基端包含： 一 PE胜肽， 其具 有如 SEQ ID No: 35的序列； 一 PCV2 O F2 F2胜肽； 以及一 KDEL胜肽， 其 具有如 SEQ ID No: 31的序列。
10.如权利要求 9所述的免疫组合物，其中该 PCV2 0RF2 F2胜肽具有一胺基酸序列， 该胺基酸序列选自由 SEQ ID No: 6、 SEQ ID No: 18、 SEQ ID No: 22、 SEQ ID No: 55及 SEQ ID No: 57所组成的群组中至少一者。
11.如权利要求 9所述的免疫组合物，其中该 PCV2 ORF2 F2胜肽具有一胺基酸序列， 该胺基酸序列与选自 SEQ ID No: 6、 SEQ ID No: 18、 SEQ ID No: 22^ SEQ ID No: 55及 SEQ ID No: 57的序列的一具有至少 80%序列同源性。
12.如权利要求 9所述的免疫组合物，其中该第 (b)项的重组融合蛋白具有选自由 SEQ ID No: 41、 SEQ ID No: 45及 SEQ ID No: 49所组成的群组中至少一者。
13.—种制备猪第二型环状病毒 (PCV2)抗原片段的方法， 包含：
去除 PCV2 O F2 DNA序列中编码 N端富含精胺酸区域的 DNA序列， 以得到一编 码一 PCV2 0RF2非富含精胺酸区域的 DNA序列， 该非富含精胺酸区域的精胺酸数量 为该富含精胺酸区域的精胺酸数量的 0至二分之一倍； 以及
将该编码一 PCV2 0RF2非富含精胺酸区域的 DNA序列置于一生物表现系统中表 现， 得到抗猪第二型环状病毒的免疫组合物的抗原片段。
14.如权利要求 13所述的方法，其中该 PCV2 O F2 DNA序列为选自由 SEQ ID No: 1、 SEQ ID No: 15、 SEQ ID No: 19、 SEQ ID No: 50、 及 SEQ ID No: 52所组成的群组中 至少一者。
15.如权利要求 13所述的方法， 其中该富含精胺酸区域为该 PCV2 ORF2全长 DNA 序列的 5'端第 1-234个核苷酸之间的区域。
16.如权利要求 13所述的方法，其中该非富含精胺酸区域为该 PCV2 ORF2全长 DNA 序列的 5'端第 235个核苷酸至 3'端终止密码子之间的区域。
17.如权利要求 13所述的方法，其中该编码一 PCV2 ORF2非富含精胺酸区域的 DNA 序列， 选自由下列群组所组成者： SEQ ID No: 5、 SEQ ID No: 7、 SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 11、 SEQ ID No: 17、 SEQ ID No: 21、 SEQ ID No: 54及 SEQ ID No: 56。
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