EA029698B1 - Субъединичная вакцина против цирковируса свиней типа 2 (pcv2) - Google Patents

Субъединичная вакцина против цирковируса свиней типа 2 (pcv2) Download PDF

Info

Publication number
EA029698B1
EA029698B1 EA201491123A EA201491123A EA029698B1 EA 029698 B1 EA029698 B1 EA 029698B1 EA 201491123 A EA201491123 A EA 201491123A EA 201491123 A EA201491123 A EA 201491123A EA 029698 B1 EA029698 B1 EA 029698B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
agde
arginine
rsu2
azr
azp
Prior art date
Application number
EA201491123A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491123A1 (ru
Inventor
Тсунь-Юньг Ко
Хсу-Чун Габриэль Чэнь
Шу-Хсыан Ян
Юй-Сань Чэнь
Original Assignee
Сбк Вирбак Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48573551&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA029698(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Сбк Вирбак Лимитед filed Critical Сбк Вирбак Лимитед
Publication of EA201491123A1 publication Critical patent/EA201491123A1/ru
Publication of EA029698B1 publication Critical patent/EA029698B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
    • C12N2720/12122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
    • C12N2720/12134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к субъединичной вакцине против цирковируса свиней типа 2 (PCV2), конкретно - к иммуногенной композиции против цирковируса свиней типа 2 (PCV2), содержащей антигенный пептид, а также к способу получения антигенного пептида, кодируемого ORF2 из PCV2. Антигенный пептид выбран из необогащенного аргинином пептида и рекомбинантного химерного белка.

Description

Изобретение относится к субъединичной вакцине против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), конкретно - к иммуногенной композиции против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), содержащей антигенный пептид, а также к способу получения антигенного пептида, кодируемого ΟΚΕ2 из РСУ2. Антигенный пептид выбран из необогащенного аргинином пептида и рекомбинантного химерного белка.
029698 Β1
029698
Предпосылки изобретения
1. Область техники
Настоящее изобретение относится к субъединичной вакцине против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), конкретно, к иммуногенной композиции против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), содержащей антигенный пептид, а также к способу получения антигенного пептида, кодируемого ОКЕ2 из РСУ2.
2. Описание уровня техники
Известно, что цирковирус свиней типа 2 (РСУ2) связан с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (РМ^8) и синдромом дерматита и нефропатии у свиней (РИИЗ). РМ^8 впервые был обнаружен у свиней в Канаде в 1991 году, а впоследствии были сообщения о его встречаемости по всему миру. Синдром привел к большой потере в свиноводческой индустрии во всем мире. Главные симптомы РМ^8 включают прогрессирующую потерю веса, тахипноэ, диспноэ, разлитие желчи и т.д. Визуальные патологические изменения в ткани включают лимфоцитарный и грануломатозный инфильтрат, лимфаденопатию, лимфоцитарный и грануломатозный гепатит и нефрит.
Цирковирус свиней (РСУ) впервые был обнаружен в линии клеток почки свиньи (РК-15, АТСС ССЬ33) в 1982 году. Хотя цирковирус свиней может постоянно инфицировать клетки РК-15, вирус не оказывает цитопатический эффект (СРЕ) в инфицированных клетках РК-15. Даже, несмотря на то, что цирковирус свиней может инфицировать свиней, он не приводит к поражениям у инфицированных свиней. Вирус назвали цирковирусом свиней типа 1 (РСУ1). РСУ1 является двенадцатигранным вирусом с одноцепочечной ДНК с кольцевым геномом из 1759 п.о. Полученный из РК-15 РСУ классифицировали в семейство Сиеоутбае в 1995 году.
Полученный из РК-15 РСУ1 считается апатогенным. В отличие от этого, вирусный мутант, выделенный из свиней с РМ^8 в 1997 году, является патогенным и называется цирковирус свиней типа 2 (РСУ2). Синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (РМ^8) является высоко контагиозным заболеванием свиней. Он главным образом инфицирует супоросных свиноматок и их поросят и оказывает серьезное воздействие на здоровье свиней.
РСУ2 является вирусом с одноцепочечной кольцевой ДНК диаметром 17 нм, и размер его генома составляет 1,76 т.н. Геномный анализ при помощи программного обеспечения показывает суммарно 11 открытых рамок считывания (ОКЕ), транскрибируемых в направлениях по часовой стрелке и против часовой стрелки. Среди 11 ОКЕ ОКЕ1 и ОКЕ2 вероятно представляют собой наиболее важные гены. Ген ОКЕ1 кодирует белки Кер и Кер', которые связаны с репликацией вируса. Известно, что ген ОКЕ2 кодирует иммуногенный структурный белок капсида из РСУ2, который применяют для индукции иммунного ответа у организмов.
Инактивированная вакцина против РСУ2 является наиболее распространенной коммерчески доступной вакциной против РСУ2. Однако разработка инактивированной вакцины требует, чтобы линии клеток не содержали загрязнителя, а возможность неполной инактивации вируса посредством химических реактивов является наиболее значительным недостатком инактивированной вакцины. Другим недостатком является то, что антигенные структуры вируса могут быть изменены посредством химической обработки, что приведет к невозможности индукции достаточного иммунного ответа для уничтожения вируса и невозможности защиты свиней от инфицирования заболеванием. Таким образом, разработка инактивированной вакцины может быть сложной и дорогостоящей, а безопасность вакцины может быть под вопросом.
В отличие от инактивированной вакцины, в которой целый вирус является вакцинным антигеном, в субъединичной вакцине применяют часть белков из патогена в качестве белка-антигена и белок-антиген вводят прививкой животным или людям для индукции иммунитета. Субъединичную вакцину можно получать посредством клонирования генов, кодирующих белки-антигены из патогенов, а затем получения больших количеств белков-антигенов при помощи генетической инженерии. Безопасность является наиболее значительным преимуществом субъединичной вакцины, так как в ней применяют части патогена вместо целого патогена для прививания свиней с отсутствием проблемы неполной инактивации. В традиционной субъединичной вакцине против РСУ2 применяют белок ОКЕ2 из РСУ2 в качестве белкаантигена; тем не менее, уровень экспрессии полноразмерного белка ОКЕ2 из РСУ2 в прокариотических системах экспрессии является достаточно низким и не отвечает требованиям получения вакцины. Таким образом, разработка фрагментов антигена из ОКЕ2 из РСУ2, которые могут характеризоваться высоким уровнем экспрессии в биологических системах экспрессии, целесообразна для коммерческого применения субъединичной вакцины против РСУ2.
- 1 029698
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), содержащей антигенный пептид, и способу получения антигенного пептида, кодируемого 0РЕ2 из РСУ2.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), содержащей антигенный пептид, выбранный из:
(a) необогащенного аргинином пептида, который:
(ί) кодируется открытой рамкой считывания 2 (0КЕ2) из РСУ2,
(ίί) не содержит обогащенный аргинином домен, включающий Ν-концевые аминокислотные остатки 1-78 полноразмерного пептида, кодируемого 0РЕ2 из РСУ2,
(ίίί) содержит остатки аргинина в количестве, не превышающем половины от количества остатков аргинина обогащенного аргинином домена, и
(ίν) имеет аминокислотную последовательность ЗЕЦ ГО N0: 6, ЗЕЦ ГО N0: 8, ЗЕЦ ГО N0: 10 или 8ЕС ГО N0: 12;
(b) рекомбинантного химерного белка, включающего от Оконца до С-конца:
(ί) пептид рецептор-связывающего домена I и трансмембранного нацеливающего домена II экзотоксина А из Ркеийотопак аетидшока (РЕ) с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 35,
(ίί) необогащенный аргинином пептид по п.(а),
(ίίί) сигнальный пептид Еук-Акр-ОЫ-Ьеи (КЭЕЬ) с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 31.
Согласно одному варианту осуществления представлена иммуногенная композиция, дополнительно содержащая антигенные пептиды, которые кодируются открытыми рамками считывания 0КЕ1 и 0КЕ3, отличными от 0КЕ 2 из РСУ2.
Согласно другому варианту осуществления представлена иммуногенная композиция, дополнительно содержащая по меньшей мере один патогенный антиген, выбранный из антигена вируса свиного гриппа (81У), антигена вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РККЗУ), антигена микоплазмы, антигена свиного парвовируса (РРУ), антигена рожи свиней или антигена вируса псевдобешенства.
Согласно другому варианту осуществления представлена иммуногенная композиция, дополнительно содержащая один или несколько ингредиентов, выбранных из наполнителей, растворителя, эмульгатора, суспендирующих средств, связывающих средств, среды для лекарства, стабилизирующих средств, хелатообразующих средств, загустителей, консервантов, смазывающего средства, поверхностноактивного вещества, адъюванта и биологических носителей.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения антигенного пептида, кодируемого 0КЕ2 из РСУ2, включающему:
(a) вырезание из полноразмерной последовательности ДНК 0РЕ2 из РСУ2 последовательности ДНК, кодирующей обогащенный аргинином домен, включающий ^концевые аминокислотные остатки 1-78, с получением последовательности ДНК, кодирующей необогащенный аргинином пептид, который содержит остатки аргинина в количестве, не превышающем половины от количества остатков аргинина обогащенного аргинином домена, и который имеет аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕС ГО N0: 8, 8ЕС ГО N0: 10 или 8ЕС ГО N0: 12; и
(b) встраивание последовательности ДНК, полученной на стадии (а), в биологическую систему экспрессии и обеспечение экспрессии указанной ДНК с получением указанного антигенного пептида.
Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), в которой фрагменты белка из 0КЕ2 из РСУ2, которые могут характеризоваться высоким уровнем экспрессии в биологических системах экспрессии, применяют в качестве белков-антигенов для введения прививкой животным для индукции соответствующего иммунитета против инфекции РСУ2 у животных.
Настоящая иммуногенная композиция разработана посредством генетической инженерии для получения при помощи простого способа низкозатратной, высокоочищенной, с хорошим уровнем безопасности иммуногенной композиции против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2).
В связи с тем фактом, что уровень экспрессии полноразмерного белка 0КЕ2 из РСУ2 в биологических системах экспрессии является достаточно низким, для достижения указанных выше целей применяют генетическую инженерию. Последовательности ДНК (такие как 8ЕЦ ГО N0: 1), которые кодируют полноразмерные белки 0КЕ2 из РСУ2, разрезали на фрагменты различных размеров и фрагменты ДНК вставляли в векторы экспрессии, а затем экспрессировали в хозяевах. Измеряли уровни экспрессированных белков для определения того, какие фрагменты ДНК могут давать высокие уровни белков в системах экспрессии белков.
Результаты анализа белковой последовательности и исследований экспрессии белка показывают, что в полноразмерном белке 0КЕ2 из РСУ2 есть приблизительно 30 аргининов, из которых по меньшей мере две трети аргининов обнаружены на Оконце белка 0РЕ2 из РСУ2, и что чем большее количество аргининов на Оконце будут удалены, тем выше будет уровень экспрессии фрагмента белка 0КЕ2. Кроме того, после того как первые 234 нуклеотида на 5'-конце полноразмерной последовательности ДНК из
- 2 029698
ОКЕ2 из РСУ2 были удалены, фрагмент белка, кодируемый оставшимся фрагментом ДНК (т.е. от нуклеотида 235 на 5'-конце до стоп-кодона), можно экспрессировать в большом масштабе.
Значение технических и научных терминов, которые описаны в данном документе, сможет легко понять любой специалист в данной области.
Настоящее изобретение описано более подробно в приведенных далее иллюстративных примерах. Хотя примеры могут представлять собой только выбранные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что приведенные далее примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлены результаты филогенетического анализа геномных последовательностей РСУ2.
На фиг. 2 проиллюстрирована схематическая диаграмма фрагментов ОРЕ2 из РСУ2, в которых праймерами для ПЦР являются рР1, рР2, рР3, рР4, рК1, рК2 и рК3.
На фиг. 3 показаны результаты анализа δΌδ-РАСЕ рекомбинантных белков различных фрагментов 2а-ОКЕ2 из РСУ2, экспрессированных в Е.сой. Целые белки Е.сой собирали через 6 ч после индукции с помощью 1РТО и затем разделяли при помощи 15% δΌδ-РЛОЕ, в котором дорожки 1-9 показывают маркеры молекулярного веса, пустой вектор рЕТ24а (в качестве отрицательного контроля), фрагмент ОКЕ2 2а-Р1 из РСУ2 (12,7 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р2 из РСУ2 (11,6 кДа), фрагмент ОРЕ2 2а-Р3 из РСУ2 (12,1 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р4 из РСУ2 (16,5 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р5 из РСУ2 (21,4 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р6 из РСУ2 (20,8 кДа) и полноразмерный 2а-ОРЕ2 из РСУ2 (27,5 кДа) соответственно.
На фиг. 4 представлены результаты вестерн-блоттинга рекомбинантных белков различных фрагментов 2а-ОРЕ2 из РСУ2. Дорожки 1-9 показывают маркеры молекулярного веса, пустой вектор рЕТ24а (в качестве отрицательного контроля), фрагмент ОРЕ2 2а-Р1 из РСУ2 (12,7 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р2 из РСУ2 (11,6 кДа), фрагмент ОРЕ2 2а-Р3 из РСУ2 (12,1 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р4 из РСУ2 (16,5 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р5 из РСУ2 (21,4 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Р6 из РСУ2 (20,8 кДа) и полноразмерный 2а-ОКЕ2 из РСУ2 (27,5 кДа) соответственно.
На фиг. 5 представлены результаты ЕЫБЛ РСУ2 образцов сыворотки, собранных в различные моменты времени у крыс, вакцинированных рекомбинантными белками различных фрагментов 2а-ОКЕ2 из РСУ2, соответственно. *, р<0,05. (Р1: после иммунизации; РВ: после бустер-инъекции)
На фиг. 6 проиллюстрированы результаты ΕΕΙδΑ РСУ2 образцов сыворотки, собранных в различные моменты времени у мышей, вакцинированных рекомбинантными белками фрагмента 2а-Р2 и рекомбинантными белками фрагмента РЕ-2а-Р2-КЭЕЕ, соответственно. *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; #, р<0,05; ##, р<0,01; ###, р<0,001. (Р1: после иммунизации; РВ: после бустер-инъекции)
На фиг. 7 показаны результаты ΕΕΙδΑ РСУ2 образцов сыворотки, собранных в различные моменты времени у мышей, вакцинированных рекомбинантными белками фрагмента РЕ-2а-Р2-КОЕЕ и вакциной с целым вирусом РСУ2, соответственно. *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001 ; #, р<0,05; ##, р<0,01; ###, р<0,001 (Р1: после иммунизации; РВ: после бустер-инъекции).
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
Пример 1. Построение и определение антигенных пептидов субъединичной вакцины против РСУ2.
В связи с тем фактом, что уровень экспрессии полноразмерного белка ОКЕ2 из РСУ2 в биологических системах экспрессии является достаточно низким, последовательности ДНК, которые кодируют полноразмерные белки ОКЕ2 из РСУ2, разрезали на фрагменты различных размеров и фрагменты ДНК встраивали в векторы экспрессии, а затем экспрессировали в хозяевах. Уровни экспрессированных белков измеряли для определения того, какие фрагменты ДНК могут давать высокие уровни белков в белковых системах экспрессии.
Широко применяемую прокариотическую систему экспрессии (ЕксйепсЫа сой) применяли в приведенных далее примерах для анализа и в иллюстративных целях.
1. Амплификация фрагментов гена ОКЕ2 из РСУ2 различных размеров.
Полноразмерный ген ОРЕ2 из РСУ2, применяемый в данном примере, характеризуется последовательностью δερ ΙΌ ЫО: 1. Последовательности гена ОКЕ2 из РСУ2, представленные у \+апд е1 а1. (\+апд е1 а1., Уилк Кекеатсй 2009, Оеиейс тапаОоп апа1у515 оГ СЫиезе кШипк оГ ротсше сисоутк 1уре 2), применяли в качестве стандартных последовательностей для филогенетического анализа δερ ΙΌ ЫО: 1. Результат показал, что последовательность ОРЕ2 из РСУ2 (ЬЕР ГО ЫО: 1) принадлежит к подгруппе РСУ22а (которая показана на фиг. 1). Праймеры (которые описаны в табл. 1) предназначены для амплификации фрагментов различных размеров гена ОКЕ2 из РСУ2-2а (2а-ОРЕ2) при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Как показано на фиг. 2, полноразмерный ген 2а-ОРЕ2 амплифицировали при помощи специфических праймеров рР1 (прямой праймер) и рК1 (обратный праймер) посредством ПЦР. Полноразмерный ген 2а-ОКЕ2 (2а-ОКЕ2) характеризуется последовательностью ДНК δΕ^ ГО ЫО: 1, а фрагменты различных размеров 2а-ОРЕ2 из РСУ2 называли 2а-Р1, 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4, 2а-Р5 и 2а-Р6 соответственно. Фрагмент 2а-Р1 характеризуется последовательностью ДНК δΕ^ ГО ЫО: 3, которая является нуклеотидами 1-234 на 5'-конце 2а-ОКЕ2. Фрагмент 2а-Р2 характеризуется последовательностью ДНК δΕ^ ГО ЫО: 5,
- 3 029698
которая является нуклеотидами 235-468 на 5'-конце 2а-ОКЕ2. Фрагмент 2а-Р3 характеризуется последовательностью ДНК 8ЕР ГО N0: 7, которая является нуклеотидами 469-699 на 5'-конце 2а-ОКР2. Фрагмент 2а-Р4 характеризуется последовательностью ДНК ВЕС) ГО N0: 9, которая является нуклеотидами 349-699 на 5'-конце 2а-ОКЕ2. Фрагмент 2а-Р5 характеризуется последовательностью ДНК 8ЕР ГО N0: 11, которая является нуклеотидами 235-699 на 5'-конце 2а-ОКР2. Фрагмент 2а-Р6 характеризуется последовательностью ДНК 8ЕР ГО N0: 13, которая является нуклеотидами 1-468 на 5'-конце 2а-ОКЕ2. Все прямые праймеры содержали сайт рестрикции ΗΐηάΙΙΙ, а все обратные праймеры содержали сайт рестрикции ΧΙιοΙ.
Таблица 1
Перечень последовательностей праймеров для амплификации фрагментов гена ОКЕ2 из РСУ2 различных размеров
Фрагмент Праймер
Последовательностьпримечание
0КЕ2
Г1
рР1
рК.1
рР1
рКЗ
Прямой СССААОСТТОСАТОАСОТАТССААОО праймер АООСО
Обратный ССОстСОАООООТТТААОТОООООО праймер ТСТТТА
Прямой СССААОСТТОСАТОАСОТАТССААОО праймер АООСО
Обратны й ССОС1С0АООТСОТТААТАТТАААТСТ праймер САТС
ЗЕО ГО N0: 23
ЗЕО ГО N0: 24
ЗЕО ГО N0: 23
ЗЕО ГО N0: 28
Г2
рГ2
рК2
Прямой
праймер
СССААОСТТОСТТТОТТСССССОООА
ооооо
Обратный ССОСТСОАООТАООАОААОООТТОО праймер ОООАТТ
ЗЕО ГО N0: 25
ЗЕО ГО N0: 26
ГЗ
Г4
рГЗ
рК.1
рГ4
рК.1
Прямой СССААОСТТОССАСТСССООТАСТТТ праймер АСССС
Обратны й ССОСТСОАООООТТТААОТОООООО праймер ТСТТТА
Прямой
праймер
СССААОСТТОСООАОТОООСТССАСТ
ОСТОТ
Обратный ССОСТСОАООООТТТААОТОООООО праймер ТСТТТА
ЗЕО ГО N0: 27
ЗЕО ГО N0: 24
ЗЕО ГО N0: 29
ЗЕО ГО N0: 24
Г5
рГ2
рК.1
Прямой СССААОСТТОСТТТОТТСССССОООА поаймео ООООО
Обратный ССОСТСОАООООТТТААОТОООООО праймер ТСТТТА
ЗЕО ГО N0: 25
ЗЕО ГО N0: 24
Гб
рГ1
рК2
прямой СССААОСТТОСАТОАСОТАТССААОО праймер АООСО
Обратный ССОСТСОАООТАООАОААОООТТОО праймер ОООАТТ
ЗЕО ГО N0: 23
ЗЕО ГО N0: 26
Примечание: Последовательности, помеченные снизу - , являются последовательностями
сайта рестрикции ΗΐηάΙΙΙ (ААОСТТ), а последовательности, помеченные снизу , являются последовательностями сайта рестрикции ΧΙιοΙ (СТСОАО).
Условия для реакции ПЦР включали 95°С в течение 5 мин, 25 циклов 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с, и 72°С в течение 5 мин для элонгации. Размеры продуктов ПЦР 2аОКЕ2, 2а-Р1, 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4, 2а-Р5 и 2а-Р6 составляли 699 п.о., 234 п.о., 234 п.о., 231 п.о., 351 п.о., 465 п.о. и 468 п.о. соответственно и подтверждены при помощи электрофореза в 2% агарозном геле. После подтверждения продукты ПЦР очищали при помощи набора для очистки РСК.-М (Уюдепе).
2. Построение плазмид рЕТ24а, содержащих фрагменты ОКЕ2 из РСУ2 различных размеров.
1 мкг очищенных продуктов ПЦР и 1 мкг вектора экспрессии рЕТ24а (Хоуауеп) расщепляли при помощи двух ферментов рестрикции (Хе\у Еп§1апй Вю1аЪ§) 1 мкл ΗΐηάΙΙΙ и 1 мкл ΧΙιοΙ соответственно в течение 8 ч при 37°С. После реакции расщепления с помощью ферментов рестрикции расщепленные продукты ПЦР и вектор экспрессии рЕТ24 очищали при помощи системы РСК-М С1еап ир 8у§1еш (Уюдепе) соответственно. Очищенные продукты ПЦР лигировали с очищенным векторов экспрессии
- 4 029698
рЕТ24а с получением плазмид рЕТ24а-2а-Р1, рЕТ24а-2а-Р2, рЕТ24а-2а-Р3, рЕТ24а-2а-Р4, рЕТ24а-2а-Р5, рЕТ24а-2а-Р6 и рЕТ24а-2а-ОКР2, а затем плазмиды трансформировали в клетки-хозяева (Е.соП). Отбирали трансформантов, содержащих продукты ПЦР, и последовательности ДНК подтверждали при помощи секвенирования ДНК. Затем получали бактерии, содержащие указанные выше плазмиды.
3. Экспрессия белка и подтверждение фрагментов ОКР2 из РСУ2 различных размеров.
Бактерии, содержащие указанные выше плазмиды, инкубировали в 2 мл среды ЬВ при 37°С в течение 16-18 ч и затем инокулировали в соотношении 1:50 в среду ЬВ, содержащую 25 мкг/мл канамицина, для последующего инкубирования при 37 в инкубаторе с 200 об/мин до тех пор, пока О.Э. при 600 нм не составила 0,6. После этого, Р-О-тригалактозид (1РТО) добавляли до конечной концентрации 1 мМ и клетки-хозяева Е.соП инкубировали при 37°С в инкубаторе с 200 об/мин в течение еще 6 ч. Затем 1 мл клеток хозяев Е.соП центрифугировали при 10000хд и осадок обрабатывали посредством В-РЕКТМ Вас1спа1 РгоЮш ЕхЛасПои (приобретенным у Р1ЕК.СЕ) для проверки того, являются ли рекомбинантные белки растворимыми белками или находятся в тельцах включения, при помощи следующих этапов. Осадок добавляли в 40 мкл реагента, перемешивали при помощи вортексного шейкера в течение 1 мин и центрифугировали при 10000х§ для отделения растворимых белков (верхняя часть) от нерастворимых телец включений (нижняя часть). Растворимые белки растворяли в 1х буфере для разбавления образца для δΌδ-РЛОЕ, а осадок добавляли в 2х буфера для разбавления образца для δΌδ-РЛОЕ. Образцы помещали в термоблок с температурой 100°С на 20 мин, а затем центрифугировали. Супернатант анализировали при помощи 15% δΌδ-РЛОЕ для измерения экспрессии рекомбинантных белков.
Рекомбинантные белки получали посредством индукции бактериальной культуры с помощью 1РТО. Рекомбинантный белок 2а-ОКБ2 характеризуется аминокислотной последовательностью δΞΟ ΙΌ N0: 2. Рекомбинантный белок 2а-Р1 характеризуется аминокислотной последовательностью δΞΟ ΙΌ NО: 4. Рекомбинантный белок 2а-Р2 характеризуется аминокислотной последовательностью δΞΟ ΙΌ NО: 6. Рекомбинантный белок 2а-Р3 характеризуется аминокислотной последовательностью δΞΟ ΙΌ NО: 8. Рекомбинантный белок 2а-Р4 характеризуется аминокислотной последовательностью δΞΟ ΙΌ NО: 10. Рекомбинантный белок 2а-Р5 характеризуется аминокислотной последовательностью δΞΟ ΙΌ NО: 12. Рекомбинантный белок 2а-Р6 характеризуется аминокислотной последовательностью δΞΟ ΙΌ NО: 14.
Экспрессию рекомбинантных белков анализировали при помощи δΌδ-РЛОЕ, и результаты показаны на фиг. 3, причем дорожка 1 показывает маркер молекулярного веса, дорожка 2 показывает отрицательный контроль (пустой вектор рЕТ24а), дорожка 3 показывает рекомбинантный белок 2а-Р1 (12,7 кДа), дорожка 4 показывает рекомбинантный белок 2а-Р2 (11,6 кДа), дорожка 5 показывает рекомбинантный белок 2а-Р3 (12,1 кДа), дорожка 6 показывает рекомбинантный белок 2а-Р4 (16,5 кДа), дорожка 7 показывает рекомбинантный белок 2а-Р5 (21,4 кДа), дорожка 8 показывает рекомбинантный белок 2а-Р6 (20,8 кДа) и дорожка 9 показывает полноразмерный рекомбинантный белок 2а-ОКР2 (27,5 кДа). Среди 6 фрагментов 2а-ОКР2 фрагменты 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4 и 2а-Р5 экспрессировались в больших количествах (фиг. 3, дорожки 4-7). Рассчитанные размеры фрагментов белков 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4 и 2а-Р5 соответствовали их фактическим размерам, составлявшим 11,6, 12,1, 16,5 и 21,4 кДа соответственно.
Далее, применяли вестерн-блоттинг для проверки, являлись ли экспрессированные рекомбинантные белки фрагментами 2а-ОКР2 из РСУ2. После электрофореза δΌδ-РЛОЕ переносили на полиамидную мембрану РУОР. Полученную мембрану блокировали при помощи блокирующего буфера, который представляет собой ТВδТ (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 150 мМ №С1, 0,1% Твин 20), содержащий 5% обезжиренного молока в течение 1 ч при комнатной температуре для предотвращения не специфического связывания белков. После этого белки выявляли при помощи моноклональных антител мыши, конъюгированных с щелочной фосфатазой (АР), к химерным белкам с 6Х гистидиновой меткой в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим шестикратным промыванием при помощи ТВδТ, по 5 мин каждое. После промывания добавляли субстрат ЖТ/ВОР (Вю-КаП). Через 10 мин реакцию останавливали путем добавления воды.
Результаты вестерн-блоттинга показаны на фиг. 4, причем дорожка 1 показывает маркер молекулярного веса, дорожка 2 показывает отрицательный контроль (пустой вектор рЕТ24а), дорожка 3 показывает рекомбинантный белок 2а-Р1 (12,7 кДа), дорожка 4 показывает рекомбинантный белок 2а-Р2 (11,6 кДа), дорожка 5 показывает рекомбинантный белок 2а-Р3 (12,1 кДа), дорожка 6 показывает рекомбинантный белок 2а-Р4 (16,5 кДа), дорожка 7 показывает рекомбинантный белок 2а-Р5 (21,4 кДа), дорожка 8 показывает рекомбинантный белок 2а-Р6 (20,8 кДа), и дорожка 9 показывает полноразмерный рекомбинантный белок 2а-ОКР2 (27,5 кДа). Результаты вестерн-блоттинга совпадали с результатами анализа δΌδ-РЛОЕ (который показан на фиг. 3). Полноразмерный рекомбинантный белок 2а-ОКР2 не мог экспрессироваться (фиг. 4, дорожка 9). Среди 6 фрагментов из 2а-ОКР2 фрагменты 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4 и 2а-Р5 экспрессировались в больших количествах (фиг. 4, дорожки 4-7). Рассчитанные размеры фрагментов белков 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4 и 2а-Р5 соответствовали их фактическим размерам, составлявшим 11,6 кДа, 12,1 кДа, 16,5 кДа и 21,4 кДа, соответственно. Однако отсутствовала экспрессия рекомбинантного белка 2а-Р1 или рекомбинантного белка 2а-Р6 (фиг. 4, дорожки 3 и 8). Поскольку как рекомбинант- 5 029698
ный белок 2а-Р1, так и рекомбинантный белок 2а-Р6 содержали нуклеотиды 1-234 на 5'-конце полноразмерной последовательности ДНК из 2а-ОКР2 из РСУ2 (см. фиг. 2), некоторые последовательности в нуклеотидах 1-234 могли затрагивать экспрессию белка ОКТ2 из РСУ2. Анализ аминокислотных последовательностей фрагмента 2а-Р1 (нуклеотиды 1-234 на 5'-конце 2а-ОКР2 из РСУ2, ЗЕС) ГО N0: 3) и фрагмента 2а-Р2 + 2а-Р3 (нуклеотиды 235-699 (без стоп-кодона) на 5'-конце 2а-ОКР2 из РСУ2, ЗЕС) ГО NО: 11) показывал, что количества аргининов в аминокислотной последовательности (ЗЕР ГО NО: 4) фрагмента 2а-Р1 в два раза или больше превышали количества аргининов в аминокислотной последовательности (ЗЕР ГО NО: 12) фрагмента 2а-Р2 + 2а-Р3 (как показано в табл. 2). Анализ добавления или делеции аргинина показывал, что деления избыточного аргинина могла повышать экспрессию белка ОКТ2 из РСУ2.
Таблица 2
Анализ количеств аргининов в аминокислотной последовательности 2а-ОКР2 из РСУ2
2а-Р1 2а-Р2 + 2а-РЗ
Кодон Аминокисло та Количество Кодон Аминокисло та Количество
АОА Аргинин 5 АОА Аргинин 3
АОО Аргинин 3 АОО Аргинин 3
СОА Аргинин 1 СОС Аргинин 1
СОС Аргинин 10 СОО Аргинин 1
СОТ Аргинин 2 СОТ Аргинин 1
Итого 21 Итого 9
Пример 2. Анализ иммуногенности антигенных пептидов субъединичной вакцины против РСУ2.
1. Иммунизация крыс.
Получали субъединичную вакцину против РСУ2 с рекомбинантными белками 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4 и 2а-Р5, полученными в примере 1, соответственно и полным адъювантом Фрейнда. Крыс вакцинировали субъединичной вакциной против РСУ2 для анализа иммуногенности антигенных пептидов субъединичной вакцины против РСУ2.
Не содержащих конкретных патогенов здоровых крыс возрастом от пяти до шести недель рандомно разделяли на 5 групп по 3 крысы в каждой. Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗА) показывал, что все 15 крыс были отрицательными по антителам к РСУ2. Каждой крысе из 4 групп вакцинации (группы 1-4) вводили инъекцией подкожно 200 мкг рекомбинантного белка, и общий объем каждой инъекции составлял 300 мкл при соотношении 1:1 (об./об.) белка к адъювантной композиции. Крысам из группы 5 вводили инъекцией 300 мкл РВЗ и использовали в качестве отрицательного контроля. Через две недели после первичной иммунизации (ρ.ΐ.) крыс из 4 групп вакцинации бустировали такой же дозой 4 различных рекомбинантных белков соответственно. Образцы сыворотки собирали через 0, 2, 4 и 8 недель после первичной иммунизации. Все образцы сыворотки тестировали с помощью ЕЫЗА для измерения титра антител к РСУ2.
2. Определение антител к РСУ2 при помощи ЕЫЗА.
В данном примере использовали планшеты с 96 лунками, содержащими патогенный антиген РСУ2 (300 нг/лунка), в качестве планшетов для ЕЫЗА. Планшеты для ЕЫЗА промывали 3 раза 50 ммоль/л РВЗ (рН 7,2), содержащим 500 мкл/л Твин-20 (т. е. РВЗТ) в течение от 3 до 5 мин каждый раз. Для блокировки планшетов для ЕЫЗА добавляли 200 мкл 0,15% блокирующего раствора ВЗА в каждую лунку планшетов для ЕЫЗА и затем планшеты для ЕЫЗА инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После чего планшеты для ЕЫЗА промывали РВЗ. Образцы сыворотки крыс разбавляли в 50 раз (1:50) с помощью РВЗ, а затем последовательно разбавляли в два раза. Каждый образец имел 8 повторов. Разбавленные образцы сыворотки добавляли в лунки планшетов (100 мкл/лунка) для ЕЫЗА и планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После инкубирования планшеты промывали РВЗ. Затем в лунки добавляли антитело к 1дС крысы, конъюгированное с щелочной фосфатазой (АР). После инкубирования в течение 1 ч при 37°С планшеты промывали РВЗ. Для визуализации результатов в лунки добавляли паранитрофенилфосфат (ρNРР). После инкубации реакцию останавливали путем добавления 1 М \'аО1 Н Оптическую плотность каждой лунки считывали при помощи устройства для считывания оптической плотности при 405 нм. Каждый образец анализировали в двух повторностях и значения О.О. от дублей усредняли.
Результаты ЕЫЗА показаны на фиг. 5. Все рекомбинантные белки 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4 и 2а-Р5, полученные в примере 1, были способны индуцировать сывороточные антитела к РСУ2 у тестируемых животных. Среди рекомбинантных белков рекомбинантный белок 2а-Р2 (ЗЕР ГО NО: 6) индуцировал наиболее высокий уровень сывороточного антитела к РСУ2. Для статистического анализа все группы сравнивали с отрицательным контролем РВЗ в различных моментах забора образца, и обнаруживали значимые различия между отрицательным контролем и каждой группой вакцинации (р<0,05).
Кроме того, свиней вакцинировали рекомбинантными белками 2а-Р2, 2а-Р3, 2а-Р4 и 2а-Р5 соответственно, и все рекомбинантные белки были способны индуцировать сывороточные антитела к РСУ2 у свиней. В дополнение к этому вакцинированных свиней заражали вирусом РСУ2 для оценки эффектив- 6 029698
ности рекомбинантных белков. Сначала рекомбинантные белки составляли в качестве субъединичной вакцины и вводили инъекцией свиньям. Затем свиней заражали вирусом РСУ2. Результаты показывали, что степени защиты групп иммунизации были более высокими, чем таковые у отрицательного контроля (без вакцинации). В контексте настоящего документа степени защиты включают понижение вирусемии и смягчение симптомов, вызываемых РСУ2. Таким образом, результаты показывали, что субъединичная вакцина РСУ2, полученная при помощи рекомбинантных белков, могла эффективно индуцировать иммунитет у животных и увеличивать показатель выживаемости животных.
Пример 3. Построение и экспрессия антигенных пептидов субъединичной вакцины против РСУ22а.
Результаты в примере 2 показывали, что среди рекомбинантных белков пептид Р2 из ΘΚΤ2 из РСУ2 индуцировал самый высокий уровень сывороточного антитела к РСУ2. Для того чтобы усилить иммуногенность субъединичной вакцины против РСУ2, рецептор-связывающий домен I и трансмембранный нацеливающий домен II экзотоксина А из Рзеибошопаз аегидтоза (т. е. белка РЕ) и сигнал задержки в ЕК-сигнальный пептид ΚΌΕΕ сливали с пептидом 2а-Е2, полученным в примере 1, на Ν- и С-концах соответственно, с получением химерного белка (РЕ-2а-Е2-КВЕБ) для индукции соответствующего иммунитета к инфекции РСУ2 у животных.
В данном примере рекомбинантный белок (РЕ-2а-Е2-КВЕБ) получали посредством генетической инженерии. Последовательности ДНК, кодирующие представляющие интерес белки, клонировали в вектор экспрессии для построения плазмиды рЕТ24а-РЕ-2а-Е2-КВЕБ. У плазмиды индуцировали экспрессию рекомбинантного белка РЕ-2а-Е2-КВЕБ. Сначала последовательность ДНК (ЗЕр ГО N0: 30), кодирующую сигнальный пептид КРЕБ, клонировали в вектор рЕТ24а с получением плазмиды рЕТ24аКВЕБ. После чего последовательность ДНК (ЗЕр ГО N0: 5) фрагмента 2а-Е2, полученного в примере 1, клонировали в плазмиду рЕТ24а-КВЕБ с получением плазмиды рЕТ24а-2а-Е2-КВЕБ. Наконец, последовательность ДНК (ЗЕр ГО N0: 34), кодирующую белок РЕ, клонировали в плазмиду рЕТ24а-2а-Е2-КВЕБ с получением плазмиды рЕТ24а-РЕ-2а-Е2-КВЕБ.
1. Построение рЕТ24а-КЕВБ.
Последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид КВЕБ, (ЗЕр ГО N0: 31) показана как ЗЕр ГО N0: 30. Последовательность ДНК амплифицировали при помощи ПЦР. Далее приведены последовательности специфичных к КЕВБ праймеров.
Прямой праймер (с сайтом рестрикции ΗΐηάΙΙΙ):
5 ’-СССДАССТТСТСААААААСАСОААСТОАСАОАТОААСТОАААОА-З’ (8Е<) ГО N0: 32).
Обратный праймер (с сайтом рестрикции ХНо):
5’-ОТОС1ССДЦСАОТТСОТСТТТСАОТТСАТСТ-3’ (8Е(2 ГО N0: 33).
Условия для реакции ПЦР включали 94°С в течение 3 мин, 5 циклов 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 20 с, и 72°С в течение 1 мин для элонгации. Продукт ПЦР и вектор рЕТ24а подвергали двойному расщеплению ферментами рестрикции при помощи ΗΐηάΙΙΙ и ХНоЕ Затем расщепленные продукты ПЦР и вектор рЕТ24а очищали, соответственно, с последующим лигированием для клонирования продукта ПЦР в рЕТ24а с получением рЕТ24а-КВЕБ. Затем конструкт рЕТ24а-КЕВБ трансформировали в клетки-хозяева (Е.соН) для осуществления массовой репликации. Реплицированные продукты ПЦР дополнительно подтверждали при помощи секвенирования.
2. Построение рЕТ24а-2а-Е2-КВЕБ.
Последовательность ДНК 2а-Е2 (ЗЕр ГО N0: 5), полученную в примере 1, амплифицировали при помощи ПЦР. Далее показаны праймеры ПЦР.
Прямой праймер рЕ2-1 (с сайтом рестрикции Зас^:
5’-ССАОСТСТТТОТТСССССОООАОООООО-3’ (8Е<2 ГО N0: 38).
Обратный праймер рК2-1 (с сайтом рестрикции ΗΐηάΙΙΙ):
5’-СССААС:СТТСтТАООАОААОООТТООООСтАТТ-3’ (8Е(2 ГО N0: 39).
Условия для реакции ПЦР включали 95°С в течение 5 мин, 25 циклов 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с и 72°С в течение 5 мин для элонгации. Продукт ПЦР и плазмиду рЕТ24а-КВЕБ подвергали двойному расщеплению ферментами рестрикции при помощи ЗаД и ΗΐηάΙΙΙ. Затем расщепленные продукты ПЦР и плазмиду рЕТ24а-КВЕБ очищали соответственно с последующим лигированием для клонирования продукта ПЦР в рЕТ24а-КВЕБ с получением рЕТ24а-2а-Е2-КВЕБ. Затем конструкт трансформировали в клетки-хозяева (Е.соН) для осуществления массовой репликации. Реплицированные продукты ПЦР дополнительно подтверждали при помощи секвенирования.
3. Построение рЕТ24а-РЕ-2а-Е2-КВЕБ.
Последовательность ДНК, кодирующая белок РЕ (ЗЕр ГО N0: 35), показана как ЗЕр ГО N0: 34. Последовательность ДНК амплифицировали при помощи ПЦР. Далее приведены последовательности специфичных к РЕ праймеров.
Прямой праймер (с сайтом рестрикции ВашИ):
5СОССАТСССААСААОССТТСОАС -3’ (8Е() ГО N0: 36).
Обратный праймер (с сайтами рестрикции ЕсоК4 и Зас^:
5СССААТТССАССТСССАСОТСАСССТСАССАС-З ’ (8Е<2 ГО N0: 37).
- 7 029698
Условия для реакции ПЦР включали 94°С в течение 5 мин, 30 циклов 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин, 72°С в течение 1,5 мин и 72°С в течение 7 мин для элонгации. Продукт ПЦР и плазмиду рЕТ24а-2а-Е2-КИЕЕ подвергали двойному расщеплению ферментами рестрикции при помощи ВатН1 и Зас1. Затем расщепленные продукты ПЦР и плазмиду рЕТ24а-2а-Е2-КОЕЕ очищали соответственно с последующим лигированием для клонирования продукта ПЦР в рЕТ24а-2а-Е2-КОЕЕ с получением рЕТ24а-РЕ-2а-Е2-КИЕЕ. Затем конструкт рЕТ24а-РЕ-2а-Е2-КОЕЬ трансформировали в клетки-хозяева (Е.сой) для осуществления массовой репликации. Реплицированные продукты ПЦР дополнительно подтверждали при помощи секвенирования. Антигенный химерный белок РЕ-2а-Е2-КОЕЕ характеризуется аминокислотной последовательностью ЗЕС) II) N0: 41, а последовательность ДНК, кодирующая химерный белок, представляет собой ЗЕО ГО N0: 40.
4. Экспрессия белка РЕ-2а-Е2-КИЕЕ.
Е.сой, содержащую плазмиду рЕТ24а-РЕ-2а-Е2-КЕОЕ, инкубировали в среде ЕВ. Бактериальную культуру индуцировали при помощи добавления 1РТС для экспрессии антигенного химерного белка РЕ-2а-Е2-КЕОЕ (ЗЕО ГО N0: 41). Способы экспрессии и экстракции белка описаны в примере 1.
Пример 4. Анализ последовательностей 0КЕ2 из РСУ2 различных подгрупп.
Помимо подгруппы 2а, существуют другие подгруппы вируса РСУ2. Далее показаны результаты анализов количеств аргининов аминокислотных последовательностей, кодируемых нуклеотидами 1-234 на 5'-конце 0КЕ2 из РСУ2, и аминокислотных последовательностей, кодируемых последовательностями ДНК от нуклеотида 235 до последнего нуклеотида 0КЕ2 из РСУ2 подгрупп РСУ2-2Й, 2с, 26 и 2е соответственно.
Последовательности гена 0КЕ2 из РСУ2, представленные у \Еапд е1 а1. (Алию е1 а1., Упи§ Кезеагсй, 2009, Сепейс уалайоп апа1у§1§ оЕ Сйтезе §1гат§ оЕ рогсте спсоупиз 1уре 2.), применяли в качестве стандартных последовательностей для филогенетического анализа ЗЕС) ГО N0: 15 и ЗЕО ГО N0: 19. Результат показывал, что последовательности 0КЕ2 из РСУ2 с ЗЕС) ГО N0: 15 и ЗЕС) ГО N0: 19 принадлежали к подгруппе РСУ2-2Й и подгруппе РСУ2-26, соответственно (как показано на фиг. 1). Кроме того, последовательности 0КЕ2 из РСУ2 с ЗЕО ГО N0: 50 и ЗЕС) ГО N0: 52 служили в качестве стандартного штамма подгруппы РСУ2-2с и подгруппы РСУ2-2е, соответственно.
Результаты анализа последовательности подгруппы РСУ2-2Й показаны в табл. 3. Фрагмент 0КЕ2 подгруппы РСУ2-2Й (2Й-0КЕ2) характеризуется нуклеотидной последовательностью ЗЕС) 10 N0: 15 и аминокислотной последовательностью ЗЕС) 10 N0: 16. 21 аргининовый остаток находился в аминокислотных последовательностях, кодируемых нуклеотидами 1-234 на 5'-конце 2Й-0КЕ2, причем 10 аргининовых остатков находились в аминокислотных последовательностях (ЗЕО 10 N0: 18), кодируемых нуклеотидами 235-699 (без стоп-кодона ЗЕС) ГО N0: 17) 2Й-0КЕ2. Результаты анализа последовательностей подгруппы РСУ2-2Й согласовывались с результатами подгруппы РСУ2-2а. Количества аргининов на \-конце обоих белков 0КЕ2 в два раза или более превышали количества аргининов в остальной части белков 0КЕ2 (что показано в табл. 2 и 3).
Таблица 3
Анализ количеств аргининов аминокислотной последовательности 2Й-0КЕ2 РСУ2
Подгруппа РСУ2-26 нуклеотиды 1-234 Подгруппа РСУ2-26 нуклеотиды 235-699
Кодон Аминокислота Количество Кодон Аминокислота Количество
АОА Аргинин 5 АОА Аргинин 5
АОО Аргинин 3 АОО Аргинин 1
СОА Аргинин 1 СОА Аргинин 0
СОС Аргинин 9 СОС Аргинин 3
СОО Аргинин 1 СОО Аргинин 0
СОТ Аргинин 2 СОТ Аргинин 1
Итого 21 Итого 10
Результаты анализа последовательности подгруппы РСУ2-2с показаны в табл. 4. Фрагмент 0КЕ2 подгруппы РСУ2-2с (2с-0КЕ2) характеризуется нуклеотидной последовательностью ЗЕС) 10 N0: 50 и аминокислотной последовательностью ЗЕС) 10 N0: 51. 20 аргининовых остатков находились в аминокислотных последовательностях, кодируемых нуклеотидами 1-234 на 5'-конце 2с-0КЕ2, причем 10 аргининовых остатков находились в аминокислотных последовательностях (ЗЕС) 10 N0: 55), кодируемых нуклеотидами 235-702 (ЗЕС) 10 N0: 54) 2с-0КЕ2. Результаты анализа последовательностей подгруппы РСУ2-2с согласовывались с таковыми подгруппы РСУ2-2а и подгруппы РСУ2-2Й. Количества аргининов на \-конце всех трех белков 0КЕ2 в два раза или более превышали количества аргининов в остальной части белков 0КЕ2 (что показано в табл. 2-4).
- 8 029698
Таблица 4
Анализ количеств аргининов аминокислотной последовательности 2е-ОКЕ2 РСУ2
Подгруппа РСУ2-2с нуклеотиды 1-234 Подгруппа РСУ2-2с нуклеотиды 235-702
Кодон Аминокислота Количество Кодон Аминокислота Количество
АСА Аргинин 5 АОА Аргинин 6
АОО Аргинин 3 АОО Аргинин 1
СОА Аргинин 0 СОА Аргинин 0
СОС Аргинин 9 СОС Аргинин 2
СОО Аргинин 1 СОО Аргинин 0
СОТ Аргинин 2 СОТ Аргинин 1
Итого 20 Итого 10
Результаты анализа последовательности подгруппы РСУ2-26 показаны в табл. 5. Фрагмент ОКЕ2 подгруппы РСУ2-26 (26-ОКБ2) характеризуется нуклеотидной последовательностью 8ЕР ГО N0: 19 и аминокислотной последовательностью 8ЕР ГО N0: 20. 21 аргининовый остаток находился в аминокислотных последовательностях, кодируемых нуклеотидами 1-234 на 5'-конце 26-ОКР2, причем 10 аргининовых остатков находились в аминокислотных последовательностях (8ЕР ГО NО: 21), кодируемых нуклеотидами 235-702 (без стоп-кодона 8ΙΤ9 ГО NО: 22) 26-ОКР2. Результаты анализа последовательностей подгруппы РСУ2-26 согласовывались с таковыми подгруппы РСУ2-2а, подгруппы РСУ2-2Е и подгруппы РСУ2-2с. Количества аргининов на Ν-конце всех четырех белков ОКЕ2 в два раза или более превышали количества аргининов в остальной части белков ОКЕ2 (что показано в табл. 2-5).
Таблица 5
Анализ количеств аргининов аминокислотной последовательности 26-ОКЕ2 РСУ2
Подгруппа РСУ2-2с1 нуклеотиды 1-234 Подгруппа РСУ2-24 нуклеотиды 235-702
Кодон Аминокислота Количество Кодон Аминокислота Количество
АОА Аргинин 5 АОА Аргинин 4
АОО Аргинин 3 АОО Аргинин 3
СОА Аргинин 1 СОА Аргинин 0
СОС Аргинин 10 СОС Аргинин 1
СОО Аргинин 0 СОО Аргинин 1
СОТ Аргинин 2 СОТ Аргинин 1
Итого 21 Итого 10
Результаты анализа последовательности подгруппы РСУ2-2е показаны в табл. 6. Фрагмент ОКЕ2 подгруппы РСУ2-2е (2е-ОКЕ2) характеризуется нуклеотидную последовательность 8ЕР ГО NО: 52 и аминокислотную последовательность 8ЕР ГО NО: 53. 20 аргининовых остатков находились в аминокислотных последовательностях, кодируемых нуклеотидами 1-234 на 5'-конце 2е-ОКЕ2, в то время как 9 аргининовых остатков находились в аминокислотных последовательностях (8ЕР ГО NО: 57), кодируемых нуклеотидами 235-699 (без стоп-кодона 8ЕР ГО NО: 56) 2е-ОКЕ2. Результаты анализа последовательностей подгруппы РСУ2-2е согласовывались с таковыми подгруппы РСУ2-2а, подгруппы РСУ2-2Е, подгруппы РСУ2-2с и подгруппы РСУ2-26. Количества аргининов на Ν-конце всех пяти белков ОКР2 в два раза или более превышали количества аргининов в остальной части белков ОКЕ2 (что показано в табл. 2-6).
Таблица 6
Анализ количеств аргининов аминокислотной последовательности 2е-ОКЕ2 РСУ2
Подгруппа РСУ2-2е нуклеотиды 1-234 Подгруппа РСУ2-2е нуклеотиды 235-699
Кодон Аминокисло та Количество Кодон Аминокисло та Количество
АОА Аргинин 5 АОА Аргинин 4
АОО Аргинин 3 АОО Аргинин 2
СОА Аргинин 0 СОА Аргинин 0
СОС Аргинин 9 СОС Аргинин 2
СОО Аргинин 1 СОО Аргинин 0
СОТ Аргинин 2 СОТ Аргинин 1
Итого 20 Итого 9
Уровни экспрессии обогащенных аргининами и необогащенных аргининами белковых доменов подгруппы РСУ2-2Е, подгруппы РСУ2-2с, подгруппы РСУ2-26 и подгруппы РСУ2-2е также анализиро- 9 029698
вали при помощи способа, описанного в примере 1. Результаты были сопоставимы с результатами из примера 1. Уровень экспрессии обогащенных аргининами белковых доменов на Ν-конце был низким, тогда как уровень экспрессии необогащенного аргинином белкового домена был высоким. Кроме того, анализ добавления или делеции аргинина показывал, что делеция избыточного аргинина может повысить экспрессию белка из ΟΚΕ2 из РСУ2, что также сопоставимо с результатами подгруппы РСУ2-2а.
Обогащенный аргинином домен характеризуется аминокислотной последовательностью из приблизительно остатков 1-78 на Ν-конце полноразмерного пептида ΟΚΕ2 из РСУ2, а необогащенный аргинином домен характеризуется аминокислотной последовательностью приблизительно от 79 до последнего остатка на С-конце.
Пример 5. Построение и экспрессия антигенных пептидов субъединичной вакцины против РСУ22Ь.
1. Построение и экспрессия рЕТ24а-2Ь-Р2.
В данном примере ген ΟΚΕ2 подгруппы РСУ2-2Ь из примера 4 использовали при построении антигенного пептида субъединичной вакцины против РСУ2. Как описано в примерах 1 и 3, фрагмент Р2 (нуклеотиды 235-468 на 5'-конце полноразмерной последовательности ДНК гена ΟΚΕ2 из РСУ2-2Ь, фрагмент 2Ь-Р2) клонировали в вектор экспрессии. Фрагмент 2Ь-Р2 подгруппы РСУ2-2Ь характеризуется нуклеотидной последовательностью δΕ() ΙΌ ΝΟ: 17 и аминокислотной последовательностью δЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 18. Нуклеотидную последовательность фрагмента 2Ь-Р2 амплифицировали при помощи ПЦР. Далее показаны праймеры ПЦР.
Прямой праймер рР-2Ь (с сайтом рестрикции ЗасЦ:
5СОАОСТСТТТСТТСССССАООАОСОООС -3’ (ЗЕ() Ю N0: 42).
Обратный праймер рК-2Ь (с сайтом рестрикции ΗΐηάΙΙΙ):
5СССААССТТСТАССАСААССССТСОСТТАТ-З’ (8ЕЦ Ю N0: 43).
Условия для реакции ПЦР включали 95°С в течение 5 мин, 25 циклов 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с и 72°С в течение 5 мин для элонгации. Продукт ПЦР и вектор экспрессии рЕТ24а (ΝονΗΕοη) подвергали двойному расщеплению ферментами рестрикции при помощи За^ и ΗΐηάΙΙΙ. Затем расщепленные продукты ПЦР и вектор экспрессии рЕТ24а очищали, соответственно, с последующим лигированием для клонирования продукта ПЦР в вектор экспрессии рЕТ24 с получением плазмиды рЕТ24а-2Ь-Е2. Затем конструкт трансформировали в клетки-хозяева (Е. сой) для осуществления массовой репликации. Реплицированные продукты ПЦР дополнительно подтверждали при помощи секвенирования. Е.сой, содержащую плазмиду рЕТ24а-2Ь-Е2, инкубировали в среде ЕВ. Бактериальную культуру индуцировали при помощи добавления №ТО для экспрессии антигенного белка 2Ь-Е2 (ЗЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 18). Способы экспрессии и экстракции белка описаны в примере 1.
2. Построение и экспрессия рЕТ24а-РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ.
Помимо применения пептида 2Ь-Е2 в качестве антигенного пептида субъединичной вакцины против РСУ2, в данном примере белок РЕ и сигнальный пептид КОНЕ сливали с пептидом 2Ь-Е2 на Ν- и С-концах соответственно с получением рекомбинантного химерного белка РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ для индуцирования соответствующего иммунитета против инфекции РСУ2 у животных.
Рекомбинантный химерный белок РН-2Ь-1;2-К1)Н1. характеризуется последовательностью ДНК ЗЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 44 и аминокислотной последовательностью ЗЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 45. Принцип построения плазмиды, экспрессирующей рекомбинантный химерный белок РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ (рЕТ24а-РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ), был таким же, как и принцип, описанный в примере 3. Сначала, последовательность ДНК (δЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 30), кодирующую сигнальный пептид К1)Н1., клонировали в вектор рЕТ24а с получением плазмиды рЕТ24а-КОЕБ. Способ построения плазмиды рЕТ24а-КОЕБ описан в примере 3. После чего последовательность ДНК (δЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 17) фрагмента 2Ь-Е2 клонировали в плазмиду рЕТ24а-КОЕБ с получением плазмиды рЕТ24а-2Ь-Е2-КОЕЕ. Наконец, последовательность ДНК (δЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 34), кодирующую белок РЕ, клонировали в плазмиду рЕТ24а-2Ь-Е2-КОЕЕ с получением плазмиды рЕТ24а-РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ. Способ построения плазмиды рЕТ24а-РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ описан в примере
3. Затем Е.сой, содержащую плазмиду рЕТ24а-РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ, инкубировали в среде ЕВ. Бактериальную культуру индуцировали при помощи добавления НПО для экспрессии рекомбинантного белка РЕ-2Ь-Е2-КОЕЕ (δЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 45). Способы экспрессии и экстракции белка описаны в примере 1.
Пример 6. Построение и экспрессия антигенных пептидов субъединичной вакцины против РСУ22ά.
1. Построение и экспрессия рЕТ24а-2й-Е2.
В данном примере ген ΟΚΕ2 подгруппы РСУ2-26 из примера 4 применяли при построении антигенного пептида субъединичной вакцины против РСУ2. Как описано в примерах 1 и 3, фрагмент Е2 (нуклеотиды 235-468 на 5'-конце полноразмерной последовательности ДНК гена ΟΚΕ2 РСУ2-26, фрагмент 2ά-Ε2) клонировали в вектор экспрессии. Фрагмент 2ά-Ε2 подгруппы РСУ2-26 характеризуется нуклеотидной последовательностью ЗЕ^ ΙΙ) ΝΟ: 21 и аминокислотной последовательностью ЗЕ^ П) ΝΟ: 22. Нуклеотидную последовательность фрагмента 2ά-Ε2 амплифицировали при помощи ПЦР. Далее показаны праймеры ПЦР.
- 10 029698
Прямой праймер ρΕ-2ά (с сайтом рестрикции 5ас1):
5’- ССАССТСТТТСТТСССССАООАОООООС -3’ (8ЕЦ Ю N0: 46).
Обратный праймер ρΚ-2ά (с сайтом рестрикции ΗΐηάΙΙΙ):
5 СССААОСТТОТАООАОААОООСТОООТТАТ -3 ’ (ЗЕ(3 ГО N0: 47).
Условия для реакции ПЦР включали 95°С в течение 5 мин, 25 циклов 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с и 72°С в течение 5 мин для элонгации. Продукт ПЦР и вектор экспрессии рЕТ24а (Ыоуадеп) подвергали двойному расщеплению ферментами рестрикции при помощи 5ас1 и ΗΐηάΙΙΙ. Затем расщепленные продукты ПЦР и вектор экспрессии рЕТ24а очищали соответственно с последующим лигированием для клонирования продукта ПЦР в вектор экспрессии рЕТ24а с получением плазмиды ρΕΤ24α-2ά-Ε2. Затем конструкт трансформировали в клетки-хозяева (Е.соН) для осуществления массовой репликации. Реплицированные продукты ПЦР дополнительно подтверждали при помощи секвенирования. Е.соН, содержащую плазмиду ρΕΤ24α-2ά-Ε2, инкубировали в среде БВ. Бактериальную культуру индуцировали при помощи добавления ΙΡΤΘ для экспрессии антигенного белка 2ά-Ε2 (δΕ^ ΙΌ N0: 22). Способы экспрессии и экстракции белка описаны в примере 1.
2. Построение и экспрессия ρΕΤ24α-ΡΕ-2ά-Ρ2-ΚΏΕΕ.
Помимо применения пептида 2ά-Ε2 в качестве антигенного пептида субъединичной вакцины против РСУ2, в данном примере белок РЕ и сигнальный пептид ΚΟΕΕ сливали с пептидом 2ά-Ε2 на Ν- и С-концах соответственно для получения рекомбинантного химерного белка ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ для индуцирования соответствующего иммунитета против инфекции РСУ2 у животных.
Рекомбинантный химерный белок ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ характеризуется последовательностью ДНК δΕ^ ГО N0: 48 и аминокислотной последовательностью δΕ^ ГО N0: 49. Принцип построения плазмиды, экспрессирующей рекомбинантный химерный белок ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ (ρΕΤ24α-ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ), был таким же, как и принцип, описанный в примере 3. Сначала последовательность ДНК (δΕ^ ГО N0: 30), кодирующую сигнальный пептид ΚΟΕΙ., клонировали в вектор рЕТ24а с получением плазмиды рЕТ24аΚΟΕΕ. Способ построения плазмиды ρΕΤ24α-ΚΏΕΕ описан в примере 3. После чего последовательность ДНК (δΕ^ ГО N0: 21) фрагмента 2ά-Ε2 клонировали в плазмиду ρΕΤ24α-ΚΏΕΕ с получением плазмиды ρΕΤ24α-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ. Наконец, последовательность ДНК (δΕ^ ГО N0: 34), кодирующую белок РЕ, клонировали в плазмиду ρΕΤ24α-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ с получением плазмиды ρΕΤ24α-ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ. Способ построения плазмиды ρΕΤ24α-ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ описан в примере 3. Затем Е.соН, содержащую плазмиду ρΕΤ24α-ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ, инкубировали в среде БВ. Бактериальную культуру индуцировали при помощи добавления ΙΡΤΘ для экспрессии рекомбинантного белка ΡΕ-2ά-Ε2-ΚΏΕΕ (δΕ^ ΙΌ N0: 49). Способы экспрессии и экстракции белка описаны в примере 1.
Пример 7. Анализ иммуногенности антигенных пептидов субъединичной вакцины-1 против ΡСV2.
1. Иммунизация мышей.
Субъединичную вакцину против ΡΟΫ2 получали с рекомбинантным белком 2а-Е2 (δΕ^ ГО N0: 6), полученным в примере 1, и рекомбинантным белком РЕ-2а-Ε2-Κ^Ε^ (δΕ^ ГО N0: 41), полученным в примере 3, соответственно и полным адъювантом Фрейнда. Мышей вакцинировали субъединичной вакциной против ΡСV2 для анализа иммуногенности антигенных пептидов субъединичной вакцины против ΡΟ72.
Здоровых δΡΕ мышей возрастом от пяти до шести недель рандомно разделяли на 3 группы по 3 мыши в каждой. Твердофазный иммуноферментный анализ (ΕΕΙδΆ) показывал, что все 9 мышей были отрицательными на антитела к ΡСV2. Каждой мыши из 2 групп вакцинации (группы 1 и 2) вводили инъекцией подкожно 100 мкг рекомбинантного белка. Мышам из группы 3 вводили инъекцией ΡΒδ и использовали в качестве отрицательного контроля. Через две недели после первичной иммунизации (ρ.ί.) мышей из 2 групп вакцинации бустировали такой же дозой 2 различных рекомбинантных белков, соответственно. Образцы сыворотки собирали через 2, 4, 5 и 8 недель после первичной иммунизации. Все образцы сыворотки тестировали с помощью ΕΕΙδΆ для измерения титра антител к ΡСV2.
2. Определение антител к Ρ^2 при помощи ΕΕΙδΆ.
В данном примере использовали планшеты с девяноста шестью лунками, содержащими патогенный антиген ΡΟΫ2 (300 нг/лунка), в качестве планшетов для ΕΕΙδΑ. Планшеты для ΕΕΙδΑ промывали 3 раза 50 ммоль/л ΡΒδ (ρΗ 7,2), содержащим 500 мкл/л Твин-20 (т. е. ΡΒδΤ), в течение от 3 до 5 мин каждый раз. Для блокировки планшетов для ΕΕΙδΑ добавляли 200 мкл 0,15% блокирующего раствора ΒδΑ в каждую лунку планшетов для ΕΕΙδΑ, а затем планшеты для ΕΕΙδΑ инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После чего планшеты для ΕΕΙδΑ промывали ΡΒδ. Образцы сыворотки мышей разбавляли в пятьдесят раз (1:50) с помощью ΡΒδ, а затем последовательно разбавляли в два раза. Каждый образец имел 8 повторов. Разбавленные образцы сыворотки добавляли в лунки планшетов для ΕΕΙδΑ (100 мкл/лунка) и планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После инкубирования планшеты промывали ΡΒδ. Затем в лунки добавляли антитело к ΙβΟ мыши, конъюгированное с щелочной фосфатазой (АР). После инкубирования в течение 1 ч при 37°С планшеты промывали ΡΒδ. Для визуализации результатов в лунки добавляли пара-нитрофенилфосфат (ρ^Ρ). После инкубации реакцию останавливали путем добавления 1М №011. Оптическую плотность каждой лунки считывали при помощи устройства для считывания оптической
- 11 029698
плотности при 405 нм. Каждый образец анализировали в двух повторностях и значения Θ.Ό. от дублей усредняли.
Результаты ЕЫЗЛ показаны на фиг. 6. Рекомбинантный белок РЕ-2а-Р2-КЭЕЕ (5ЕО ГО N0: 41) индуцировал более высокий уровень сывороточных антител к РСУ2 у тестируемых животных, чем индуцировал рекомбинантный белок 2а-Р2 (5Е0 ГО N0: 6). Различия между уровнями сывороточных антител к РСУ2 в группе 1 и группе 2 были значимыми через 4 недели после первичной иммунизации (р<0,05). Различия между уровнями сывороточных антител к РСУ2 в группе 1 и группе 2 были более значимыми на неделе 6 после первичной иммунизации (р<0,01). Дополнительно, по сравнению с уровнем антител отрицательного контроля, уровни антител группы 1 и группы 2 были значимо выше (р<0,01).
Пример 8. Анализ иммуногенности антигенных пептидов субъединичной вакцины-2 против РСУ2.
1. Иммунизация мышей.
В данном примере иммуногенность раскрытого в настоящем документе рекомбинантного белка РЕ2а-Б2-КЭЕЕ у тестируемых животных сравнивали с иммуногенностью целого вируса РСУ2 у тестируемых животных.
Субъединичную вакцину против РСУ2 получали с рекомбинантным белком РЕ-2а-Б2-КЭЕЕ (5Е0 ГО N0: 41), полученным в примере 3, и масляным адъювантом Мойашйе Ι3Α 206 (Зерртс, Франция). Кроме того, вакцину на основе целого вируса РСУ2 создавали при помощи инактивированного целого вируса РСУ2 (106ТСГО50/мл) и масляного адъюванта Мойашйе Ι3Α 206 (Зеррю, Франция). В одной дозе вакцины на основе целого вируса РСУ2 было 100 мкл инактивированного целого вируса РСУ2 и 250 мкл адъюванта. Для вакцинирования мышей применяли две вакцины.
Здоровых ЗРР мышей возрастом от пяти до шести недель рандомно разделяли на 3 группы по 5 мышей в каждой. Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ1ЗЛ) показывал, что все 15 мышей были отрицательными по антителам к РСУ2. Каждой мыши из группы 1 вводили инъекцией подкожно 100 мкг рекомбинантного белка. Каждой мыши из группы 1 вводили инъекцией подкожно одну дозу вакцины на основе целого вируса РСУ2. Мышам из группы 3 вводили инъекцией масляный адъювант Мойашйе Ι3Α 206 и использовали в качестве отрицательного контроля. Через три недели после первичной иммунизации (р.1.), мышей из 2 групп вакцинации бустировали такой же дозой 2 различных вакцин соответственно. Образцы сыворотки собирали через 0, 1, 2, 3, 4 и 5 недель после первичной иммунизации. Все образцы сыворотки тестировали с помощью ЕЫЗЛ для измерения титра антител к РСУ2.
2. Определение антител к РСУ2 при помощи ЕЬ1ЗЛ.
Способ определения ЕЬ1ЗА антител к РСУ2 описан в примере 7. Результаты ЕЬ1ЗА показаны на фиг. 7. Рекомбинантный белок РЕ-2а-Б2-КЭЕЕ (ЗЕО ГО N0: 41) индуцировал более высокий уровень сывороточных антител к РСУ2 у тестируемых животных, чем индуцировал антиген целого вируса РСУ2. Различия между уровнями сывороточных антител к РСУ2 в группе 1 и группе 2 были более значимыми через 1 неделю после первичной иммунизации (р<0,001). Дополнительно, по сравнению с уровнем антител отрицательного контроля, уровень антител мышей вакцинированных рекомбинантным белком РЕ-2а-Б2-КЭЕЕ (группа 1) был значимо выше (р<0,001).
Кроме того, свиней вакцинировали рекомбинантными белками 2а-Б2 и РЕ-2а-Б2-КЭЕЕ соответственно, и оба рекомбинантных белка были способны индуцировать сывороточные антитела к РСУ2 у свиней. В дополнение к этому, вакцинированных свиней заражали вирусом РСУ2 для оценки эффективности рекомбинантных белков. Сначала рекомбинантные белки составляли в качестве субъединичной вакцины и вводили инъекцией свиньям. Затем свиней заражали вирусом РСУ2. Результаты показывали, что степени защиты групп иммунизации были более высокими, чем таковые у отрицательного контроля (без вакцинации). В контексте настоящего документа степени защиты включают понижение вирусемии и смягчение симптомов, вызываемых РСУ2. Таким образом, результаты показывали, что субъединичная вакцина РСУ2, полученная при помощи рекомбинантных белков, могла эффективно индуцировать иммунитет у животных и увеличивать показатель выживаемости животных.
Дополнительно, белки 0КЕ2 или их фрагменты подгруппы РСУ2-26, подгруппы РСУ2-2с, подгруппы РСУ2-2Й и подгруппы РСУ2-2е получали при помощи способов, описанных в примерах 1-3, соответственно, и иммуногенность белков 0КБ2 или их фрагментов анализировали при помощи способов описанных в примерах 7 и 8. Результаты показывали, что фрагменты 0КБ2 таких подгрупп РСУ2 (например, фрагмент Р2) и их рекомбинантные химерные белки (например, РЕ-Б2-КЭЕЕ) могут индуцировать иммунитет у животных (таких как свиньи) и предупреждать у животных инфекцию РСУ2.
Субъединичная вакцина РСУ2, обеспеченная настоящим изобретением, имела приведенные далее преимущества по сравнению с другими традиционными методиками.
Субъединичную вакцину РСУ2, обеспеченную настоящим изобретением, получали посредством генетической инженерии, при которой фрагменты белка 0КЕ2 из РСУ2, которые могут быть экспрессированы в более высокой степени в биологических системах экспрессии, клонировали и применяли в качестве антигенных пептидов субъединичной вакцины. Субъединичная вакцина могла индуцировать соответствующий иммунитет к инфекции РСУ2 у животных, и фрагменты белка 0КЕ2 из РСУ2 могли быть массово воспроизведены при помощи генетической инженерия для уменьшения стоимости производства вакцины.
- 12 029698
Другая субъединичная вакцина РСУ2, обеспеченная настоящим изобретением, содержала антигенный химерный белок РЕ-Р2-КОЕЬ, который являлся рекомбинантным белком пептида Р2 из ΘΚΕ2 из РСУ2, белка РЕ и сигнального пептида КЭЕЬ. Испытания на животных показывали, что данная субъединичная вакцина против РСУ2 могла соответствующим образом индуцировать более высокий иммунитет к инфекции РСУ2 у животных.
Субъединичную вакцину, обеспеченную настоящим изобретением, разрабатывали посредством генетической инженерии, и вакцина обладала следующими преимуществами: простой способ получения, низкая стоимость, высокая чистота, большой выход и хорошая безопасность.
Конечно же, может быть осуществлено множество изменений и модификаций в описанном выше варианте осуществления по настоящему изобретению без отступления от его объема. Соответственно, чтобы способствовать прогрессу в науке и полезных областях техники, настоящее изобретение раскрывают и подразумевают, что оно ограничено лишь объемом прилагаемой формулы изобретения.
- 13 029698
Перечень последовательностей
<110> СБК Вирбак Биотек Ко., Лтд.
<120> Субъединичная вакцина против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2)
<130> Р14-0101
<150> ИЗ 61/567,248
<151> 2011-12-06
<150> РСТ/СЫ2012/085907
<151> 2012-12-05
<160> 57
<170> Рабепб1п версия 3.5
<210> 1
<211> 699
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 1
абдасдбабс сааддаддсд бббссдсада сдаадасасс дсссссдсад ссабсббддс 60
садабссбсс дссдссдссс сбддсбсдбс сасссссдсс ассдббассд сбддадаадд 120
ааааабддса бсббсаасас ссдссбсбсс сдсассббсд дабабасбдб сааддсбадс 180
асадбсадаа сдсссбссбд ддсддбддас абдабдадаб ббаабаббаа сдасбббдбб 240
сссссдддад дддддассаа саааабсбсб абасссбббд аабасбасад аабаадааад 300
дббааддббд ааббсбддсс сбдсбсссса абсасссадд дбдасадддд адбдддсбсс 360
асбдсбдбба ббсбадабда баасбббдба асбааддсса садсссбаас сбабдасссс 420
бабдбааасб асбссбсссд ссабасаабс ссссаасссб бсбссбасса сбсссддбас 480
бббассссаа аассбдбссб бдаббссасб аббдаббасб бссаассааа садсаааадд 540
аабсадаббб ддсбдаддсб асааассбсд дсааабдбдд ассасдбадд ссбсддбасб 600
дсдббсдааа асадбаааба сдассаддас басаабабсс дбдбаасбаб дбабдбасаа 660
ббсададааб ббаабсббаа адасссссса сббааассс 699
<210> 2
<211> 233
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 2
- 14 029698
МеЬ ТЪг Туг Рго Агд Агд Агд РЪе Агд Агд Агд Агд Нтз Агд Рго Агд
1 5 10 15
Зег Нтз Ьеи С1у С1п 11е Ьеи Агд Агд Агд Рго Тгр Ьеи Уа1 Нтз Рго
20 25 30
Агд Нтз Агд Туг Агд Тгр Агд Агд Ьуз Азп С1у 11е РЪе Азп ТЪг Агд
35 40 45
Ьеи Зег Агд ТЪг РЪе С1у Туг ТЪг Уа1 Ьуз А1а Зег ТЪг Уа1 Агд ТЪг
50 55 60
Рго Зег Тгр А1а Уа1 Азр МеЬ МеЬ Агд РЪе Азп 11е Азп Азр РЪе Уа1
65 70 75 80
Рго Рго С1у С1у С1у ТЪг Азп Ьуз 11е Зег 11е Рго РЪе С1и Туг Туг
85 90 95
Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 С1и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго 11е ТЪг
100 105 110
01 η С1у Азр Агд С1у Уа1 С1у Зег ТЪг А1а Уа1 11е Ьеи Азр Азр Азп
115 120 125
РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а ТЪг А1а Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг
130 135 140
Зег Зег Агд Нтз ТЪг 11е Рго С1п Рго РЪе Зег Туг Нтз Зег Агд Туг
145 150 155 160
РЪе ТЪг Рго Ьуз Рго Уа1 Ьеи Азр Зег ТЪг 11е Азр Туг РЪе С1п Рго
165 170 175
Азп Зег Ьуз Агд Азп С1п 11е Тгр Ьеи Агд Ьеи С1п ТЪг Зег А1а Азп
180 185 190
Уа1 Азр Нтз Уа1 С1у Ьеи С1у ТЪг А1а РЪе С1и Азп Зег Ьуз Туг Азр
195 200 205
01 п Азр Туг Азп 11е Агд Уа1 ТЪг МеЬ Туг Уа1 С1п РЪе Агд С1и РЪе
210 215 220
Азп Ьеи Ьуз Азр Рго Рго Ьеи Ьуз Рго
225 230
<210> 3
<211> 234
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 3
аЬдасдЬаЬс сааддаддсд ЬНссдсада сдаадасасс дсссссдсад ссаЬсЬЬддс 60
садаЬссЬсс дссдссдссс сЬддсЬсдЬс сасссссдсс ассдЬЬассд сЬддадаадд 120
аааааЬддса ЕсЕЕсаасас ссдссЬсЬсс сдсассЕЕсд даЬаЬасЬдЬ сааддсЬадс 180
асадЬсадаа сдсссЕссЕд ддсддЬддас аЕдаЕдадаЕ ЬЬааЬаЬЬаа сдас 234
- 15 029698
<210> 4
<211> 78
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 4
МеЬ ТЪг Туг Рго Агд Агд Агд РЪе Агд Агд Агд 15 10
Зег Ша Ьеи О1у О1п Не Ьеи Агд Агд Агд Рго
20 25
Агд Ша Агд Туг Агд Тгр Агд Агд Ьуз Азп О1у
35 40
Ьеи Зег Агд ТЪг РЪе С1у Туг ТЪг Уа1 Ьуз А1а
50 55
Рго Зег Тгр А1а Уа1 Азр МеЬ МеЬ Агд РЪе Азп 65 70 75
Агд Шз Агд Рго Агд 15
Тгр Ьеи Уа1 Шз Рго 30
Не РЪе Азп ТЪг Агд 45
Зег ТЪг Уа1 Агд ТЪг 60
Т1е Азп Азр
<210> 5
<211> 234
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 5
ЬЬЬдЬЪсссс сдддаддддд дассаасааа аЬсЬсЬаЬас ссЬЬЬдааЬа сЬасадааЬа 60
адаааддЬЬа аддЬЬдааЬЪ сЬддсссЬдс ЬссссааЬса сссадддЬда саддддадЬд 120
ддсЬссасЬд сЛдНаНсЪ адаЬдаЬаас ЬЬЬдЬаасЬа аддссасадс ссЬаассЬаЪ 180
дассссЬаЬд ЬааасЬасЬс сЬсссдссаЬ асааЬссссс аасссЪЬсЬс сЬас 234
<210> 6
<211> 78
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 6
РЪе Уа1 Рго Рго О1у С1у О1у ТЪг Азп Ьуз Не Зег 11е Рго РЪе О1и
1 5 10 15
Туг Туг Агд 11е Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 О1и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго
20 25 30
Т1е ТЪг О1п О1у Азр Агд О1у Уа1 О1у Зег ТЪг А1а Уа1 Т1е Ьеи Азр
35 40 45
16 029698
Азр Азп РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а ТЪг 50 55
Азп Туг Зег Зег Агд Нтз ТЪг Не 65 70
<210> 7
<211> 231
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 7
сас5сссдд5 асШасссс аааасс5д5с аасадсаааа ддаа5сада5 55ддс5дадд ддсс5сдд5а с5дсд55сда ааасад5ааа а5д5а5д5ас ааШсадада 3555335055
<210> 8
<211> 77
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
А1а Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1 60
Рго О1п Рго РЪе Бег Туг 75
с55да55сса с5а55да55а с55ссаасса 60
с5асааасс5 сддсааа5д5 ддассасд5а 120
5асдассадд ас5асаа5а5 ссд5д5аас5 180
ааадассссс сас55ааасс с 231
<400> 8
Нтз Зег Агд Туг РЪе ТЪг Рго Ьуз
1 5
Туг РЪе С1п Рго Азп Зег Ьуз Агд
20
ТЪг Зег А1а Азп Уа1 Азр Нтз Уа1
35 40
Зег Ьуз Туг Азр С1п Азр Туг Азп
50 55
РЪе Агд С1и РЪе Азп Ьеи Ьуз Азр
65 70
Рго Уа1 Ьеи Азр Зег ТЪг Не Азр 10 15
Азп О1п 11е Тгр Ьеи Агд Ьеи О1п
25 30
01 у Ьеи 61у ТЪг А1а РЪе 61и Азп
45
Не Агд Уа1 ТЪг Ме5 Туг Уа1 С1п 60
Рго Рго Ьеи Ьуз Рго 75
<210> 9
<211> 351
<212> ДНК
<213> Цирковирус
<400> 9
ддад5дддс5 ссас5дс5д5
да5аас555д 5аас5ааддс сасадссс5а 60
- 17 029698
ассЬаЬдасс ссЬаЬдЬааа сЬасЬссЬсс сдссаЬасаа Ьсссссаасс сЬЬсЬссЬас 120
сасЬсссддЬ асЬЬЬасссс аааассЬдЬс сЬЬдаЬЬсса сЬаЬЬдаЬЬа сЬЬссаасса 180
аасадсаааа ддааЬсадаЬ ЬЬддсЬдадд сЬасааассЬ сддсаааЬдЬ ддассасдЬа 240
ддссЬсддЬа сЬдсдЬЬсда ааасадЬааа Ьасдассадд асЬасааЬаЬ ссдЬдЬаасЬ 300
аЬдЬаЬдЬас ааЬЬсадада аЬЬЬааЬсЬЬ ааадассссс сасЬЬааасс с 351
<210> 10
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 10
О1у Уа1 О1у Зег ТЪг А1а Уа1 Не
1 5
А1а ТЪг А1а Ьеи ТЪг Туг Азр Рго
20
ТЪг 11е Рго О1п Рго РЪе Зег Туг 35 40
Рго Уа1 Ьеи Азр Зег ТЪг 11е Азр 50 55
Азп О1п 11е Тгр Ьеи Агд Ьеи О1п
65 70
О1у Ьеи О1у ТЪг А1а РЪе О1и Азп
85
11е Агд Уа1 ТЪг МеЬ Туг Уа1 О1п 100
Рго Рго Ьеи Ьуз Рго 115
Ьеи Азр Азр Азп РЪе Уа1 ТЪг Ьуз 10 15
Туг Уа1 Азп Туг Зег Зег Агд Шз
25 30
Шз Зег Агд Туг РЪе ТЪг Рго Ьуз
45
Туг РЪе О1п Рго Азп Зег Ьуз Агд 60
ТЪг Зег А1а Азп Уа1 Азр Шз Уа1 75 80
Зег Ьуз Туг Азр О1п Азр Туг Азп 90 95
РЪе Агд О1и РЪе Азп Ьеи Ьуз Азр 105 110
<210> 11
<211> 465
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 11
ЬЬЬдЬЬсссс сдддаддддд дассаасааа аЬсЬсЬаЬас ссЬЬЬдааЬа сЬасадааЬа 60
адаааддЬЬа аддЬЬдааЬЬ сЬддсссЬдс ЬссссааЬса сссадддЬда саддддадЬд 120
ддсЬссасЬд сЬдЬЬаЬЬсЬ адаЬдаЬаас ЬЬЬдЬаасЬа аддссасадс ссЬаассЬаЬ 180
дассссЬаЬд ЬааасЬасЬс сЬсссдссаЬ асааЬссссс аасссЬЬсЬс сЬассасЬсс 240
сддЬасЬЬЬа ссссаааасс ЬдЬссЬЬдаЬ ЬссасЬаЬЬд аЬЬасЬЬсса ассааасадс 300
ааааддааЬс адаЬЬЬддсЬ даддсЬасаа ассЬсддсаа аЬдЬддасса сдЬаддссЬс 360
- 18 029698
<210> 13
<211> 468
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 13
абдасдКаКс сааддаддсд ЫШссдсада сдаадасасс дсссссдсад ссаКсЬ+ддс 60
садабссКсс дссдссдссс с+ддсЪсдбс сасссссдсс ассд+Кассд сбддадаадд 120
ааааабддса СсССсаасас ссдссКсКсс сдсассККсд даба'Ьас'Ьд'Ь сааддсбадс 180
асадбсадаа сдсссЬссСд ддсддбддас абдаКдадаК ΚΚηηΚηΚΚηη сдас'Ь'Ь'Ьд'Ь'Ь 240
сссссдддад дддддассаа сазаабсКсЬ абассс'Ь'Ь'Ьд ааКасбасад ааЬаадааад 300
- 19 029698
дЁЁааддЁЁд ааЁЁсЁддсс сЁдсЁсссса аЁсасссадд дЁдасадддд адЁдддсЁсс 360 асЁдсЁдЁЁа ЁЁсЁадаЁда ЁаасЁЁЁдЁа асЁааддсса садсссЁаас сЁаЁдасссс 420 ЁаЁдЁааасЁ асЁссЁсссд ссаЁасааЁс ссссаасссЁ ЁсЁссЁас 468
<210> 14
<211> 156
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 14 МеЁ ТЪг Туг 1
Зег Шз Ьеи
Агд Шз Агд 35
Ьеи Зег Агд 50
Рго Зег Тгр 65
Рго Рго О1у
Агд Не Агд
О1п О1у Азр 115
РЪе Уа1 ТЪг
130
Зег Зег Агд 145
Рго Агд 5
О1у О1п 20
Туг Агд
ТЪг РЪе
А1а Уа1
О1у О1у 85
Ьуз Уа1 100
Агд О1у
Ьуз А1а
Шз ТЪг
Агд Агд РЪе Агд Агд Агд Агд Шз Агд Рго Агд
10
15
Не Ьеи Агд Агд Агд Рго Тгр Ьеи Уа1 Шз Рго
25
30
Тгр Агд Агд Ьуз Азп О1у Не РЪе Азп ТЪг Агд
О1у Туг 55
Азр МеЁ 70
ТЪг Азп
40
45
ТЪг Уа1 Ьуз А1а Зег ТЪг Уа1 Агд ТЪг 60
МеЁ Агд РЪе Азп Не Азп Азр РЪе Уа1
75
80
Ьуз Не Зег Не Рго РЪе О1и Туг Туг
90
95
Ьуз Уа1 О1и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго Не ТЪг 105 110
Уа1 О1у Зег ТЪг А1а Уа1 11е Ьеи Азр Азр Азп
ТЪг А1а
135
11е Рго
150
120
125
Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг 140
О1п Рго РЪе Зег Туг 155
<210> 15
<211> 702
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 15
аЁдасдЁаЁс сааддаддсд ЁЁассддада адаадасасс дсссссдсад ссаЁсЁЁдда 60
садаЁссЁсс дссдссдссс сЁддсЁсдЁс сасссссдсс ассдЁЁассд сЁддадаадд 120
аааааЁддса ЕсЕЕсаасас ссдссЁсЁсс сдсассЕЕсд даЁаЁасЁаЁ саадсдаасс 180
асадЁсаааа сдсссЕссЕд ддсддЁддас аСдаСдадаС ЁсааЁаЁЁаа ЁдасЁЁЁсЁЁ 240
- 20 029698
сссссаддад ддддс+сааа сссссдс+с+ д+дссс+++д аа+ас+асад аа+аадааад 300
д++аадд++д аа++с+ддсс с+дс+ссссд а+сасссадд д+дасадддд ад+дддс+сс 360
ад+дс+д++а ++с+ада+да +аас+++д+а асаааддсса садссс+сас с+а+дасссс 420
+а+д+ааас+ ас+сс+сссд сса+асса+а асссадссс+ +с+сс+асса с+сссдс+ас 480
+++ассссса аасс+д+сс+ ада++ссас+ а++да++ас+ +ссаассааа саасаааада 540
аа+садс+д+ ддс+дадас+ асааас+дс+ ддааа+д+ад ассасд+адд сс+сддсас+ 600
дсд++сдааа асад+а+а+а сдассаддаа +асаа+а+сс д+д+аасса+ д+а+д+асаа 660
++сададаа+ адасссссса с++аассс++ аа 702
<210> 16
<211> 233
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 16
Ме+ ТЪг Туг Рго Агд Агд Агд Туг Агд Агд Агд Агд Шз Агд Рго Агд
1 5 10 15
Зег Ηίδ Ьеи С1у С1п 11е Ьеи Агд Агд Агд Рго Тгр Ьеи Уа1 Шз Рго
20 25 30
Агд Ηίδ Агд Туг Агд Тгр Агд Агд Ьуз Азп С1у 11е РЪе Азп ТЪг Агд
35 40 45
Ьеи Зег Агд ТЪг РЪе С1у Туг ТЪг Не Ьуз Агд ТЪг ТЪг Уа1 Ьуз ТЪг
50 55 60
Рго Зег Тгр А1а Уа1 Азр Ме+ Ме+ Агд РЪе Азп 11е Азп Азр РЪе Ьеи
65 70 75 80
Рго Рго С1у С1у С1у Зег Азп Рго Агд Зег Уа1 Рго РЪе С1и Туг Туг
85 90 95
Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 С1и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго 11е ТЪг
100 105 110
С1п С1у Азр Агд С1у Уа1 С1у Зег Зег А1а Уа1 11е Ьеи Азр Азр Азп
115 120 125
РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а ТЪг А1а Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг
130 135 140
Зег Зег Агд Шз ТЪг 11е ТЪг С1п Рго РЪе Зег Туг Шз Зег Агд Туг
145 150 155 160
РЪе ТЪг Рго Ьуз Рго Уа1 Ьеи Азр Зег ТЪг 11е Азр Туг РЪе С1п Рго
165 170 175
Азп Азп Ьуз Агд Азп С1п Ьеи Тгр Ьеи Агд Ьеи С1п ТЪг А1а С1у Азп
180 185 190
Уа1 Азр Шз Уа1 С1у Ьеи С1у ТЪг А1а РЪе С1и Азп Зег 11е Туг Азр
195 200 205
С1п С1и Туг Азп Т1е Агд Уа1 ТЪг Ме+ Туг Уа1 С1п РЪе Агд С1и РЪе
21 029698
210 215
Азп Ьеи Ьуз Азр Рго Рго Ьеи Азп Рго
220
225
230
<210> 17
<211> 234
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 17
ЪЬЬсЬЬсссс саддаддддд сЬсааасссс сдсЬсЬдЬдс ссЬЬЬдааЪа сЬасадааЬа 60
адаааддЬЬа аддЬЬдааЬЬ сЬддсссЬдс ЬссссдаЬса сссадддЬда саддддадЬд 120
ддсЬссадЬд сЬдЬЬаЪЬсЬ адаЬдаЬаас ЬЬЬдЬаасаа аддссасадс ссЬсассЬаЬ 180
дассссЬаЬд ЬааасЬасЬс сЬсссдссаЬ ассаЬаассс адсссЬЬсЪс сЬас 234
<210> 18
<211> 78
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 18
РЪе Ьеи Рго Рго О1у О1у О1у Зег Азп Рго Агд Зег Уа1 Рго РЪе О1и 1 5
10
15
Туг Туг Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 О1и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго
20
25
30
11е ТЪг С1п С1у Азр Агд С1у Уа1 С1у Зег Зег А1а Уа1 11е Ьеи Азр
35
40
45
Азр Азп РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а ТЪг А1а Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1
50
55
60
Азп Туг Зег Зег Агд Н1з ТЪг 11е ТЪг С1п Рго РЪе Зег Туг
65
70
75
<210> 19
<211> 705
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 19
аЬдасдЬаЬс сааддаддсд ЬЬассдсада сдаадасасс дсссссдсад ссаЬсЬЬддс 60
садаЬссЬсс дссдссдссс сЬддсЬадЬс сасссссдсс ассдЬЬассд сЬддадаадд 120
- 22 029698
ааааабддса бсббсаасас ссдссбсбсс сдсассабсд дббабасбдб саадаааасс 180
асадбсадаа сдсссбссбд даабдбддас абдабдадаб ббаабаббаа бдаббббсбб 240
сссссаддад ддддсбсаад сссссбсасб дбдсссбббд аабасбасад аабааддаад 300
дббааддббд ааббсбддсс сбдсбсссса абсасссадд дбдасадддд адбдадсбсс 360
асбдсбдбба ббсбадабда баасбббдба асаааддсса абдсссбаас сбабдасссс 420
бабдбааасб асбссбсссд ссабассаба асссадсссб бсбссбасса сбсссддбас 480
бббассссда аассбдбссб бдабаддаса абсдаббасб бссаасссаа баасаааада 540
аабсаасбсб ддсбдадасб асааасбасб ддааабдбад ассабдбадд ссбсддсасб 600
дсдббсдааа асадбабаба сдассаддас басаабабсс дбабаассаб дбабдбасаа 660
ббсададааб ббаабсббаа адасссссса сббаасссба адбда 705
<210> 20
<211> 234
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 20
Меб ТЪг Туг Рго Агд Агд Агд Туг Агд Агд Агд Агд Нбз Агд Рго Агд
1 5 10 15
5ег Нбз Ьеи С1у С1п 11е Ьеи Агд Агд Агд Рго Тгр Ьеи Уаб Нбз Рго
20 25 30
Агд Шз Агд Туг Агд Тгр Агд Агд Ьуз Азп Обу Ые РЪе Азп ТЪг Агд
35 40 45
Ьеи 5ег Агд ТЪг Ые Обу Туг ТЪг Уаб Ьуз Ьуз ТЪг ТЪг Уаб Агд ТЪг
50 55 60
Рго 5ег Тгр Азп Уаб Азр Меб Меб Агд РЪе Азп Ые Азп Азр РЪе Ьеи
65 70 75 80
Рго Рго С1у С1у С1у 5ег 5ег Рго Ьеи ТЪг Уаб Рго РЪе С1и Туг Туг
85 90 95
Агд Не Агд Ьуз Уаб Ьуз Уаб Оби РЪе Тгр Рго Суз 5ег Рго Ые ТЪг
100 105 110
С1п С1у Азр Агд С1у Уаб 5ег 5ег ТЪг Аба Уаб Ые Ьеи Азр Азр Азп
115 120 125
РЪе Уаб ТЪг Ьуз Аба Азп Аба Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уаб Азп Туг
130 135 140
5ег 5ег Агд Нбз ТЪг Ые ТЪг Обп Рго РЪе 5ег Туг Нбз 5ег Агд Туг
145 150 155 160
РЪе ТЪг Рго Ьуз Рго Уаб Ьеи Азр Агд ТЪг Ые Азр Туг РЪе С1п Рго
165 170 175
Азп Азп Ьуз Агд Азп С1п Ьеи Тгр Ьеи Агд Ьеи С1п ТЪг ТЪг С1у Азп
180 185 190
Уаб Азр Нбз Уаб Обу Ьеи Обу ТЪг Аба РЪе Оби Азп 5ег Ые Туг Азр
23 029698
195 200 205
С1п Азр Туг Азп Не Агд 11е ТЪг МеЬ Туг Уа1 С1п РЪе Агд С1и РЪе
210 215 220
Азп Ьеи Ьуз Азр Рго Рго Ьеи Азп Рго Ьуз
225 230
<210> 21
<211> 234
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней <400> 21
ЬЬЬсЬЬсссс саддаддддд сЬсаадсссс сЬсасЬдЬдс ссЬЬЬдааЬа сЬасадааЬа 60
аддааддЬЬа аддЬЬдааЬЬ сЬддсссЬдс ЬссссааЬса сссадддЬда саддддадЬд 120
адсЬссасЬд сЬдЬЬаЬЬсЬ адаЬдаЪаас ЬЬЬдЬаасаа аддссааЬдс ссЬаассЬаЬ 180
дассссЬаЬд ЬааасЬасЬс сЬсссдссаЬ ассаЬаассс адсссЪЬсЬс сЬас 234
<210> 22
<211> 78
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 22
РЪе Ьеи Рго Рго О1у О1у О1у Бег Бег Рго Ьеи ТЪг Уа1 Рго РЪе О1и
10
15
Туг Туг Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 С1и РЪе Тгр Рго Суз Бег Рго
20
25
30
11е ТЪг С1п С1у Азр Агд С1у Уа1 Бег Бег ТЪг А1а Уа1 11е Ьеи Азр
35
40
45
Азр Азп РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а Азп А1а Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1
50
55
60
Азп Туг Бег Бег Агд Н1з ТЪг Т1е ТЪг С1п Рго РЪе Бег Туг
65
70
75
<210> 23
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для Б1 из ОКБ2 из РСУ2
- 24 029698
<400> 23
сссаадсббд саЬдасдбаЬ ссааддаддс д 31
<210> 24
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для П из ОР.Г2 из РСУ2 2а
<400> 24
ссдсбсдадд ддЬЬЬаадбд дддддбсЬЬЬ а 31
<210> 25
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для Г2 из ОР.Г2 из РСУ2 2а
<400> 25
сссаадсЬЬд сЬЬЬдЬЬссс ссдддадддд д 31
<210> 26
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для Г2 из ОР.Г2 из РС1/2 2а
<400> 26
ссдсбсдадд Ьаддадаадд дЬЬдддддаб Ь 31
<210> 27
<211> 31
- 25 029698
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для КЗ из ОКГ2 из РСУ2 2а
<400> 27
сссаадсббд ссасбсссдд басбббассс с 31
<210> 28
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для КЗ из ОКГ2 из РСУ2 2а
<400> 28
ссдсбсдадд бсдббаабаб 6333606036 с 31
<210> 29
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для Г 4 из ОКГ2 из РСУ2 2а
<400> 29
сссаадсббд сддадбдддс бссасбдсбд 6 31
<210> 30
<211> 48
<212> ДНК
<213> ЕзсПегхсЫа соИ
<400> 30
сбсаааааад асдаасбдад адабдаасбд ааадасдаас бдбаабда 48
- 26 029698
<210> 31
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> ЕзсРег1сЫа соН
<400> 31
Ьеи Ьуз Ьуз Азр С1и Ьеи Агд Азр С1и Ьеи Ьуз Азр С1и Ьеи 15 10
<210> 32
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для КБЕЬ
<400> 32
сссаадсЬЬс Ьсаааааада сдаасЬдада даЬдаасЬда аада 44
<210> 33
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для КБЕЬ
<400> 33
дЬдсЬсдадс адЬЬсдЬсЬЬ ЬсадЬЬсаЬс Ь 31
<210> 34
<211> 1116
<212> ДНК
<213> Р зеиЧотопаз аегид!поза
<300>
<308> ОепЬапк / К01397
<309> 2002-02-11
<313> (821)..(1936)
- 27 029698
<400> 34
дссдаадаад сЬЬЬсдассЬ сЬддаасдаа Ьдсдссааад ссЬдсдЬдсЬ сдассЬсаад 60
дасддсдЬдс дЬЬссадссд саЬдадсдЬс дасссддсса Ьсдссдасас саасддссад 120
ддсдЬдсЬдс асЬасЬссаЬ ддЬссЬддад ддсддсаасд асдсдсЬсаа дсЬддссаЬс 180
дасаасдссс ЬсадсаЬсас садсдасддс сЬдассаЬсс дссЬсдаадд сддсдЬсдад 240
ссдаасаадс сддЬдсдсЬа садсЬасасд сдссаддсдс дсддсадЬЬд дЬсдсЬдаас 300
ЬддсЬддЬас сдаЬсддсса сдадаадссс ЬсдаасаЬса аддЬдЬЬсаЬ ссасдаасЬд 360
аасдссддса ассадсЬсад ссасаЬдЬсд ссдаЬсЬаса ссассдадаЬ дддсдасдад 420
ЬЬдсЬадсда адсЬддсдсд сдаЬдссасс 55с55сд5са дддсдсасда дадсаасдад 480
аЬдсадссда сдсЬсдссаЬ садссаЬдсс ддддЬсадсд ЬддЬсаЬддс ссадасссад 540
ссдсдссддд аааадсдсЬд дадсдааЬдд дссадсддса аддЬдЬЬдЬд ссЬдсЬсдас 600
ссдсЬддасд дддЬсЬасаа сЬассЬсдсс садсаасдсЬ дсаассЬсда сдаЬассЬдд 660
дааддсаада ЬсЬассдддЬ дсЬсдссддс аасссддсда адсаЬдассЬ ддасаЬсааа 720
сссасддЬса ЬсадЬсаЬсд ссЬдсасЬЬЬ сссдадддсд дсадссЬддс сдсдсЬдасс 780
дсдсассадд сЬЬдссассЬ дссдсЬддад асЬЬЬсассс дЬсаЬсдсса дссдсдсддс 840
Ьдддаасаас ЬддадсадЬд сддсЬаЬссд дЬдсадсддс ЬддЬсдсссЬ сЬассЬддсд 900
дсдсддсЬдЬ сдЬддаасса ддЬсдассад дЬдаЬссдса асдсссЬддс садссссддс 960
адсддсддсд ассЬаддсда адсдаЬссдс дадсадссдд адсаддсссд ЬсЬддсссЬд 1020
асссЬддссд ссдссдадад сдадсдсЬЬс аЬссддсадд дсассддсаа сдасдаддсс 1080
ддсдсддсса асдссдасдЬ ддЬдадссЬд ассЬдс 1116
<210> 35
<211> 372
<212> БЕЛОК
<213> РзеиАотопаз аегид/поза
<400> 35
А1а С1и С1и А1а РЪе Азр Ьеи Тгр Азп С1и Суз А1а Ьуз А1а Суз Уа1
1 5 10 15
Ьеи Азр Ьеи Ьуз Азр С1у Уа1 Агд Зег Зег Агд МеЬ Зег Уа1 Азр Рго
20 25 30
А1а 11е А1а Азр ТЪг Азп С1у С1п С1у Уа1 Ьеи Нтз Туг Зег МеЬ Уа1
35 40 45
Ьеи С1и С1у С1у Азп Азр А1а Ьеи Ьуз Ьеи А1а Не Азр Азп А1а Ьеи
50 55 60
Зег 11е ТЪг Зег Азр С1у Ьеи ТЪг Не Агд Ьеи С1и С1у С1у Уа1 С1и
65 70 75 80
Рго Азп Ьуз Рго Уа1 Агд Туг Зег Туг ТЪг Агд С1п А1а Агд С1у Зег
85 90 95
Тгр Зег Ьеи Азп Тгр Ьеи Уа1 Рго 11е 01 у Нтз С1и Ьуз Рго Зег Азп
100 105 110
28 029698
Не Ьуз Уа1 115 РЪе Не Шз 01и Ьеи 120 Азп А1а О1у Азп С1п 125 Ьеи Зег Шз
МеЁ Зег Рго Не Туг ТЪг ТЪг 01и МеЁ 01у Азр С1и Ьеи Ьеи А1а Ьуз
130 135 140
Ьеи А1а Агд Азр А1а ТЪг РЪе РЪе Уа1 Агд А1а Шз С1и Зег Азп С1и
145 150 155 160
МеЁ С1п Рго ТЪг Ьеи А1а 11е Зег Шз А1а О1у Уа1 Зег Уа1 Уа1 МеЁ
165 170 175
А1а С1п ТЪг С1п Рго Агд Агд О1и Ьуз Агд Тгр Зег С1и Тгр А1а Зег
180 185 190
01 у Ьуз Уа1 Ьеи Суз Ьеи Ьеи Азр Рго Ьеи Азр С1у Уа1 Туг Азп Туг
195 200 205
Ьеи А1а С1п С1п Агд Суз Азп Ьеи Азр Азр ТЪг Тгр С1и С1у Ьуз 11е
210 215 220
Туг Агд Уа1 Ьеи А1а 01у Азп Рго А1а Ьуз Шз Азр Ьеи Азр Не Ьуз
225 230 235 240
Рго ТЪг Уа1 Не Зег Шз Агд Ьеи Шз РЪе Рго С1и С1у С1у Зег Ьеи
245 250 255
А1а А1а Ьеи ТЪг А1а Шз 01п А1а Суз Шз Ьеи Рго Ьеи С1и ТЪг РЪе
260 265 270
ТЪг Агд Шз Агд 01п Рго Агд О1у Тгр О1и С1п Ьеи С1и С1п Суз С1у
275 280 285
Туг Рго Уа1 С1п Агд Ьеи Уа1 А1а Ьеи Туг Ьеи А1а А1а Агд Ьеи Зег
290 295 300
Тгр Азп С1п Уа1 Азр 01п Уа1 Не Агд Азп А1а Ьеи А1а Зег Рго С1у
305 310 315 320
Зег С1у С1у Азр Ьеи 01у 01и А1а Не Агд С1и С1п Рго С1и С1п А1а
325 330 335
Агд Ьеи А1а Ьеи ТЪг Ьеи А1а А1а А1а О1и Зег С1и Агд РЪе Не Агд
340 345 350
01 η С1у ТЪг С1у Азп Азр 01и А1а 01у А1а А1а Азп А1а Азр Уа1 Уа1
355 360 365
Зег Ьеи ТЪг Суз
370
<210> 36
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для РЕ
- 29 029698
<400> 36
сдддабссда адаадсдббс дас 23
<210> 37
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для РЕ
<400> 37
сддааббсда дсбсдсаддб саддсбсасс ас 32
<210> 38
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для Е1 из ОК.Е2 из РСУ2 2а
<400> 38
сдадсбсббб дббсссссдд дадддддд 28
<210> 39
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для Е1 из ОК.Е2 из РСУ2 2а
<400> 39
сссаадсббд баддадаадд дббдддддаб б 31
<210> 40
<211> 1413
- 30 029698
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Объединенная ДНК-последовательность РЕ, ОРЕ2-Е2 из РСУ2 2а и КРЕЬ
<400> 40
ддаБссдаад аадсдББсда ссБсБддаас дааБдсдсса аадссБдсдБ дсБсдассБс 60
ааддасддсд БдсдББссад ссдсаБдадс дБсдасссдд ссаБсдссда сассаасддс 120
садддсдБдс БдсасБасБс саБддБссБд дадддсддса асдасдсдсБ саадсБддсс 180
аБсдасаасд сссБсадсаБ сассадсдас ддссБдасса БссдссБсда аддсддсдБс 240
дадссдааса адссддБдсд сБасадсБас асдсдссадд сдсдсддсад ББддБсдсБд 300
аасБддсБдд БассдаБсдд ссасдадаад сссБсдааса БсааддБдББ саБссасдаа 360
сБдаасдссд дсаассадсБ садссасаБд БсдссдаБсБ асассассда даБдддсдас 420
дадББдсБад сдаадсБддс дсдсдаБдсс ассББсББсд Бсадддсдса сдададсаас 480
дадаБдсадс сдасдсБсдс саБсадссаБ дссддддБса дсдБддБсаБ ддсссадасс 540
садссдсдсс дддаааадсд сБддадсдаа Бдддссадсд дсааддБдББ дБдссБдсБс 600
дасссдсБдд асддддБсБа саасБассБс дсссадсаас дсБдсаассБ сдасдаБасс 660
Бдддааддса адаБсБассд ддБдсБсдсс ддсаасссдд сдаадсаБда ссБддасаБс 720
ааасссасдд БсаБсадБса БсдссБдсас БББсссдадд дсддсадссБ ддссдсдсБд 780
ассдсдсасс аддсББдсса ссБдссдсБд дадасБББса сссдБсаБсд ссадссдсдс 840
ддсБдддаас аасБддадса дБдсддсБаБ ссддБдсадс ддсБддБсдс ссБсБассБд 900
дсддсдсддс БдБсдБддаа ссаддБсдас саддБдаБсс дсаасдсссБ ддссадсссс 960
ддсадсддсд дсдассБадд сдаадсдаБс сдсдадсадс сддадсаддс ссдБсБддсс 1020
сБдасссБдд ссдссдссда дадсдадсдс ББсаБссддс адддсассдд саасдасдад 1080
дссддсдсдд ссаасдссда сдБддБдадс сБдассБдсд адсБсБББдБ Бсссссддда 1140
ддддддасса асааааБсБс БаБасссБББ дааБасБаса дааБаадааа ддББааддББ 1200
дааББсБддс ссБдсБсссс ааБсасссад ддБдасаддд дадБдддсБс сасБдсБдББ 1260
аББсБадаБд аБаасБББдБ аасБааддсс асадсссБаа ссБаБдассс сБаБдБааас 1320
БасБссБссс дссаБасааБ сссссаассс ББсБссБаса адсББсБсаа аааадасдаа 1380
сБдададаБд аасБдааада сдаасБдсБс дад 1413
<210> 41
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Объединенная аминокислотная последовательность РЕ, ОКЕ2-Е2 из РСУ2 2г и КРЕИ
- 31 029698
<400> 41
С1у Зег С1и С1и А1а РЪе Азр Ьеи
1 5
Уа1 Ьеи Азр Ьеи Ьуз Азр С1у Уа1
20
Рго А1а Не А1а Азр ТЪг Азп С1у 35 40
Уа1 Ьеи С1и С1у С1у Азп Азр А1а 50 55
Ьеи Зег Не ТЪг Зег Азр С1у Ьеи
65 70
С1и Рго Азп Ьуз Рго Уа1 Агд Туг
85
Зег Тгр Зег Ьеи Азп Тгр Ьеи Уа1 100
Азп Не Ьуз Уа1 РЪе Не Шз С1и 115 120
Шз Меб Зег Рго 11е Туг ТЪг ТЪг 130 135
Ьуз Ьеи А1а Агд Азр А1а ТЪг РЪе
145 150
С1и Меб С1п Рго ТЪг Ьеи А1а 11е
165
Меб А1а С1п ТЪг С1п Рго Агд Агд 180
Зег С1у Ьуз Уа1 Ьеи Суз Ьеи Ьеи 195 200
Туг Ьеи А1а С1п С1п Агд Суз Азп 210 215
11е Туг Агд Уа1 Ьеи А1а С1у Азп
225 230
Ьуз Рго ТЪг Уа1 11е Зег Шз Агд
245
Ьеи А1а А1а Ьеи ТЪг А1а Шз С1п
260
РЪе ТЪг Агд Шз Агд С1п Рго Агд
275
С1у Туг Рго Уа1 С1п Агд 290
Зег Тгр Азп С1п Уа1 Азр 305 310
С1у Зег С1у С1у Азр Ьеи
Тгр Азп С1и 10
Агд Зег Зег 25
С1п С1у Уа1
Ьеи Ьуз Ьеи
ТЪг Не Агд 75
Зег Туг ТЪг 90
Рго 11е С1у 105
Ьеи Азп А1а
С1и Меб С1у
РЪе Уа1 Агд 155
Зег Шз А1а
170
С1и Ьуз Агд 185
Азр Рго Ьеи
Ьеи Азр Азр
Рго А1а Ьуз 235
Ьеи Шз РЪе
250
А1а Суз Шз 265
С1у Тгр С1и
А1а Ьеи Туг
11е Агд Азп 315
А1а 11е Агд
Суз А1а Ьуз А1а Суз 15
Агд Меб Зег Уа1 Азр 30
Ьеи Шз Туг Зег Меб 45
А1а 11е Азр Азп А1а 60
Ьеи С1и С1у С1у Уа1 80
Агд С1п А1а Агд С1у 95
Шз С1и Ьуз Рго Зег 110
С1у Азп С1п Ьеи Зег 125
Азр С1и Ьеи Ьеи А1а 140
А1а Шз С1и Зег Азп
160
С1у Уа1 Зег Уа1 Уа1 175
Тгр Зег С1и Тгр А1а 190
Азр С1у Уа1 Туг Азп 205
ТЪг Тгр С1и С1у Ьуз 220
Шз Азр Ьеи Азр Не 240
Рго С1и С1у С1у Зег 255
Ьеи Рго Ьеи С1и ТЪг
270
С1п Ьеи С1и С1п Суз 285
Ьеи А1а А1а Агд Ьеи 300
А1а Ьеи А1а Зег Рго
320
С1и С1п Рго С1и С1п
280
Ьеи Уа1
295
С1п Уа1
С1у С1и
32 029698
325 330 335
А1а Агд Ьеи А1а Ьеи ТЪг Ьеи А1а А1а А1а С1и Зег С1и Агд РЪе 11е
340 345 350
Агд С1п С1у ТЪг С1у Азп Азр С1и А1а С1у А1а А1а Азп А1а Азр Уа1
355 360 365
Уа1 Зег Ьеи ТЪг Суз С1и Ьеи РЪе Уа1 Рго Рго С1у С1у С1у ТЪг Азп
370 375 380
Ьуз 11е Зег 11е Рго РЪе С1и Туг Туг Агд 11е Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1
385 390 395 400
01 и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго 11е ТЪг С1п С1у Азр Агд С1у Уа1 С1у
405 410 415
Зег ТЪг А1а Уа1 11е Ьеи Азр Азр Азп РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а ТЪг А1а
420 425 430
Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг Зег Зег Агд Нгз ТЪг 11е Рго
435 440 445
01 η Рго РЪе Зег Туг Ьуз Ьеи Ьеи Ьуз Ьуз Азр С1и Ьеи Агд Азр С1и
450 455 460
Ьеи Ьуз Азр С1и Ьеи Ьеи С1и
465 470
<210> 42
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для ОКР2-Р2 из РСУ2 2Ъ
<400> 42
сдадсЬсЬЬЬ сЬЬсссссад дадддддс 28
<210> 43
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для ОКГ2-Г2 из РСУ2 2Ъ
<400> 43
сссаадсЬЬд Ьаддадаадд дсбдддЬЬаЬ 30
- 33 029698
<210> 44
<211> 1413
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Объединенная ДНК-последовательность РЕ, ОКЕ2-Е2 из ΡΟΥ2 2Ъ и КОЕЬ
<400> 44
ддабссдаад аадсдббсда ссбсбддаас даабдсдсса аадссбдсдб дсбсдассбс 60
ааддасддсд бдсдббссад ссдсабдадс дбсдасссдд ссабсдссда сассаасддс 120
садддсдбдс бдсасбасбс сабддбссбд дадддсддса асдасдсдсб саадсбддсс 180
абсдасаасд сссбсадсаб сассадсдас ддссбдасса бссдссбсда аддсддсдбс 240
дадссдааса адссддбдсд сбасадсбас асдсдссадд сдсдсддсад ббддбсдсбд 300
аасбддсбдд бассдабсдд ссасдадаад сссбсдааса бсааддбдбб сабссасдаа 360
сбдаасдссд дсаассадсб садссасабд бсдссдабсб асассассда дабдддсдас 420
дадббдсбад сдаадсбддс дсдсдабдсс ассббсббсд бсадддсдса сдададсаас 480
дадабдсадс сдасдсбсдс сабсадссаб дссддддбса дсдбддбсаб ддсссадасс 540
садссдсдсс дддаааадсд сбддадсдаа бдддссадсд дсааддбдбб дбдссбдсбс 600
дасссдсбдд асддддбсба саасбассбс дсссадсаас дсбдсаассб сдасдабасс 660
бдддааддса адабсбассд ддбдсбсдсс ддсаасссдд сдаадсабда ссбддасабс 720
ааасссасдд бсабсадбса бсдссбдсас бббсссдадд дсддсадссб ддссдсдсбд 780
ассдсдсасс аддсббдсса ссбдссдсбд дадасбббса сссдбсабсд ссадссдсдс 840
ддсбдддаас аасбддадса дбдсддсбаб ссддбдсадс ддсбддбсдс ссбсбассбд 900
дсддсдсддс бдбсдбддаа ссаддбсдас саддбдабсс дсаасдсссб ддссадсссс 960
ддсадсддсд дсдассбадд сдаадсдабс сдсдадсадс сддадсаддс ссдбсбддсс 1020
сбдасссбдд ссдссдссда дадсдадсдс ббсабссддс адддсассдд саасдасдад 1080
дссддсдсдд ссаасдссда сдбддбдадс сбдассбдсд адсбсбббсб бсссссадда 1140
дддддсбсаа асссссдсбс бдбдсссббб даабасбаса даабаадааа ддббааддбб 1200
дааббсбддс ссбдсбсссс дабсасссад ддбдасаддд дадбдддсбс садбдсбдбб 1260
аббсбадабд абаасбббдб аасаааддсс асадсссбса ссбабдассс сбабдбааас 1320
басбссбссс дссабассаб аасссадссс ббсбссбаса адсббсбсаа аааадасдаа 1380
сбдададабд аасбдааада сдаасбдсбс дад 1413
<210> 45
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
- 34 029698
<223> Объединенная аминокислотная последовательность РЕ, и КЬЕЬ
<400> 45
О1у Зег О1и О1и А1а РЪе Азр Ьеи Тгр Азп О1и Суз А1а Ьуз 15 10
Уа1 Ьеи Азр Ьеи Ьуз Азр О1у Уа1 Агд Зег Зег Агд Меб Зег 20 25 30
Рго А1а Не А1а Азр ТЪг Азп О1у О1п О1у Уа1 Ьеи Шз Туг 35 40 45
Уа1 Ьеи О1и О1у О1у Азп Азр А1а Ьеи Ьуз Ьеи А1а Не Азр 50 55 60
Ьеи Зег Не ТЪг Зег Азр О1у Ьеи ТЪг Не Агд Ьеи О1и О1у 65 70 75
О1и Рго Азп Ьуз Рго Уа1 Агд Туг Зег Туг ТЪг Агд О1п А1а 85 90
Зег Тгр Зег Ьеи Азп Тгр Ьеи Уа1 Рго Не О1у Шз О1и Ьуз 100 105 110
Азп 11е Ьуз Уа1 РЪе Не Шз О1и Ьеи Азп А1а О1у Азп О1п 115 120 125
Нтз Меб Зег Рго 11е Туг ТЪг ТЪг О1и Меб О1у Азр О1и Ьеи 130 135 140
Ьуз Ьеи А1а Агд Азр А1а ТЪг РЪе РЪе Уа1 Агд А1а Нтз О1и 145 150 155
О1и Меб О1п Рго ТЪг Ьеи А1а Не Зег Нтз А1а О1у Уа1 Зег 165 170
Меб А1а О1п ТЪг О1п Рго Агд Агд О1и Ьуз Агд Тгр Зег О1и 180 185 190
Зег О1у Ьуз Уа1 Ьеи Суз Ьеи Ьеи Азр Рго Ьеи Азр С1у Уа1 195 200 205
Туг Ьеи А1а С1п С1п Агд Суз Азп Ьеи Азр Азр ТЪг Тгр С1и 210 215 220
11е Туг Агд Уа1 Ьеи А1а С1у Азп Рго А1а Ьуз Нтз Азр Ьеи 225 230 235
Ьуз Рго ТЪг Уа1 11е Зег Нтз Агд Ьеи Нтз РЪе Рго С1и С1у 245 250
Ьеи А1а А1а Ьеи ТЪг А1а Нтз С1п А1а Суз Нтз Ьеи Рго Ьеи 260 265 270
РЪе ТЪг Агд Нтз Агд С1п Рго Агд С1у Тгр С1и С1п Ьеи С1и 275 280 285
С1у Туг Рго Уа1 С1п Агд Ьеи Уа1 А1а Ьеи Туг Ьеи А1а А1а 290 295 300
Зег Тгр Азп С1п Уа1 Азр С1п Уа1 Т1е Агд Азп А1а Ьеи А1а
ОКЕ2-Е2 из РСУ2 2Ъ
А1а Суз 15
Уа1 Азр
Зег Меб
Азп А1а
С1у Уа1 80
Агд С1у 95
Рго Зег
Ьеи Зег
Ьеи А1а
Зег Азп
160
Уа1 Уа1
175
Тгр А1а
Туг Азп
С1у Ьуз
Азр 11е 240
С1у Зег 255
С1и ТЪг
С1п Суз
Агд Ьеи
Зег Рго
- 35 029698
305 310 315 320
С1у Зег С1у С1у Азр Ьеи С1у С1и А1а Не Агд С1и С1п Рго С1и С1п 325 330 335
А1а Агд Ьеи А1а Ьеи ТЪг Ьеи А1а А1а А1а С1и Зег С1и Агд РЪе Не 340 345 350
Агд С1п С1у ТЪг С1у Азп Азр С1и А1а С1у А1а А1а Азп А1а Азр Уа1 355 360 365
Уа1 Зег Ьеи ТЪг Суз С1и Ьеи РЪе Ьеи Рго Рго С1у С1у С1у Зег Азп 370 375 380
Рго Агд Зег Уа1 Рго РЪе С1и Туг Туг Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1
385 390 395 400
С1и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго Не ТЪг С1п С1у Азр Агд С1у Уа1 С1у
405 410 415
Зег Зег А1а Уа1 11е Ьеи Азр Азр Азп РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а ТЪг А1а 420 425 430
Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг Зег Зег Агд Шз ТЪг Не ТЪг 435 440 445
С1п Рго РЪе Зег Туг Ьуз Ьеи Ьеи Ьуз Ьуз Азр С1и Ьеи Агд Азр С1и 450 455 460
Ьеи Ьуз Азр С1и Ьеи Ьеи С1и
465 470
<210> 46
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для ОКГ2-Г2 из РСУ2 26
<400> 46
сдадсЬсЬЬЬ сЬЬсссссад дадддддс 28
<210> 47
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для ОКГ2-Г2 из РСУ2 26
- 36 029698
<400> 47
сссаадсббд баддадаадд дсбдддббаб 30
<210> 48
<211> 1413
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Объединенная ДНК-последовательность РЕ, ОКЕ2-Е2 из ΡΟΥ2 26 и КОЕЬ
<400> 48
ддабссдаад аадсдббсда ссбсбддаас даабдсдсса аадссбдсдб дсбсдассбс 60
ааддасддсд бдсдббссад ссдсабдадс дбсдасссдд ссабсдссда сассаасддс 120
садддсдбдс бдсасбасбс сабддбссбд дадддсддса асдасдсдсб саадсбддсс 180
абсдасаасд сссбсадсаб сассадсдас ддссбдасса бссдссбсда аддсддсдбс 240
дадссдааса адссддбдсд сбасадсбас асдсдссадд сдсдсддсад ббддбсдсбд 300
аасбддсбдд бассдабсдд ссасдадаад сссбсдааса бсааддбдбб сабссасдаа 360
сбдаасдссд дсаассадсб садссасабд бсдссдабсб асассассда дабдддсдас 420
дадббдсбад сдаадсбддс дсдсдабдсс ассббсббсд бсадддсдса сдададсаас 480
дадабдсадс сдасдсбсдс сабсадссаб дссддддбса дсдбддбсаб ддсссадасс 540
садссдсдсс дддаааадсд сбддадсдаа бдддссадсд дсааддбдбб дбдссбдсбс 600
дасссдсбдд асддддбсба саасбассбс дсссадсаас дсбдсаассб сдасдабасс 660
бдддааддса адабсбассд ддбдсбсдсс ддсаасссдд сдаадсабда ссбддасабс 720
ааасссасдд бсабсадбса бсдссбдсас бббсссдадд дсддсадссб ддссдсдсбд 780
ассдсдсасс аддсббдсса ссбдссдсбд дадасбббса сссдбсабсд ссадссдсдс 840
ддсбдддаас аасбддадса дбдсддсбаб ссддбдсадс ддсбддбсдс ссбсбассбд 900
дсддсдсддс бдбсдбддаа ссаддбсдас саддбдабсс дсаасдсссб ддссадсссс 960
ддсадсддсд дсдассбадд сдаадсдабс сдсдадсадс сддадсаддс ссдбсбддсс 1020
сбдасссбдд ссдссдссда дадсдадсдс ббсабссддс адддсассдд саасдасдад 1080
дссддсдсдд ссаасдссда сдбддбдадс сбдассбдсд адсбсбббсб бсссссадда 1140
дддддсбсаа дсссссбсас бдбдсссббб даабасбаса даабааддаа ддббааддбб 1200
дааббсбддс ссбдсбсссс аабсасссад ддбдасаддд дадбдадсбс сасбдсбдбб 1260
аббсбадабд абаасбббдб аасаааддсс аабдсссбаа ссбабдассс сбабдбааас 1320
басбссбссс дссабассаб аасссадссс ббсбссбаса адсббсбсаа аааадасдаа 1380
сбдададабд аасбдааада сдаасбдсбс дад 1413
<210> 49
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
- 37 029698
<220>
<223> Объединенная аминокислотная последовательность РЕ, и КЬЕЬ
<400> 49
О1у Зег О1и О1и А1а РЬе Азр Ьеи Тгр Азп О1и Суз А1а Ьуз 15 10
Уа1 Ьеи Азр Ьеи Ьуз Азр О1у Уа1 Агд Зег Зег Агд Меб Зег 20 25 30
Рго А1а Не А1а Азр ТЬг Азп О1у О1п О1у Уа1 Ьеи Шз Туг 35 40 45
Уа1 Ьеи О1и О1у О1у Азп Азр А1а Ьеи Ьуз Ьеи А1а 11е Азр 50 55 60
Ьеи Зег 11е ТЬг Зег Азр О1у Ьеи ТЬг 11е Агд Ьеи О1и О1у 65 70 75
О1и Рго Азп Ьуз Рго Уа1 Агд Туг Зег Туг ТЬг Агд О1п А1а 85 90
Зег Тгр Зег Ьеи Азп Тгр Ьеи Уа1 Рго 11е О1у Шз О1и Ьуз 100 105 110
Азп 11е Ьуз Уа1 РЬе 11е Шз О1и Ьеи Азп А1а О1у Азп О1п 115 120 125
Нтз Меб Зег Рго 11е Туг ТЬг ТЬг О1и Меб О1у Азр О1и Ьеи 130 135 140
Ьуз Ьеи А1а Агд Азр А1а ТЬг РЬе РЬе Уа1 Агд А1а Нтз О1и 145 150 155
О1и Меб О1п Рго ТЬг Ьеи А1а 11е Зег Нтз А1а О1у Уа1 Зег 165 170
Меб А1а О1п ТЬг О1п Рго Агд Агд О1и Ьуз Агд Тгр Зег О1и 180 185 190
Зег О1у Ьуз Уа1 Ьеи Суз Ьеи Ьеи Азр Рго Ьеи Азр С1у Уа1 195 200 205
Туг Ьеи А1а С1п С1п Агд Суз Азп Ьеи Азр Азр ТЬг Тгр С1и 210 215 220
11е Туг Агд Уа1 Ьеи А1а С1у Азп Рго А1а Ьуз Нтз Азр Ьеи 225 230 235
Ьуз Рго ТЬг Уа1 11е Зег Нтз Агд Ьеи Нтз РЬе Рго С1и С1у 245 250
Ьеи А1а А1а Ьеи ТЬг А1а Нтз С1п А1а Суз Нтз Ьеи Рго Ьеи 260 265 270
РЬе ТЬг Агд Нтз Агд С1п Рго Агд С1у Тгр С1и С1п Ьеи С1и 275 280 285
С1у Туг Рго Уа1 С1п Агд Ьеи Уа1 А1а Ьеи Туг Ьеи А1а А1а
ОКЕ2-Е2 из РСУ2 26
А1а Суз 15
Уа1 Азр
Зег Меб
Азп А1а
С1у Уа1 80
Агд С1у 95
Рго Зег
Ьеи Зег
Ьеи А1а
Зег Азп
160
Уа1 Уа1
175
Тгр А1а
Туг Азп
С1у Ьуз
Азр 11е 240
С1у Зег 255
С1и ТЬг
С1п Суз
Агд Ьеи
- 38 029698
290 295 300
Зег Тгр Азп С1п Уа1 Азр С1п Уа1 Не Агд Азп А1а Ьеи А1а Зег Рго
305 310 315 320
01 у Зег С1у С1у Азр Ьеи С1у С1и А1а Не Агд С1и С1п Рго С1и С1п
325 330 335
А1а Агд Ьеи А1а Ьеи ТЪг Ьеи А1а А1а А1а С1и Зег С1и Агд РЪе Не
340 345 350
Агд С1п С1у ТЪг С1у Азп Азр С1и А1а С1у А1а А1а Азп А1а Азр Уа1
355 360 365
Уа1 Зег Ьеи ТЪг Суз С1и Ьеи РЪе Ьеи Рго Рго С1у С1у С1у Зег Зег
370 375 380
Рго Ьеи ТЪг Уа1 Рго РЪе С1и Туг Туг Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1
385 390 395 400
01 и РЪе Тгр Рго Суз Зег Рго 11е ТЪг С1п С1у Азр Агд С1у Уа1 Зег
405 410 415
Зег ТЪг А1а Уа1 Не Ьеи Азр Азр Азп РЪе Уа1 ТЪг Ьуз А1а Азп А1а
420 425 430
Ьеи ТЪг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг Зег Зег Агд Шз ТЪг 11е ТЪг
435 440 445
01 η Рго РЪе Зег Туг Ьуз Ьеи Ьеи Ьуз Ьуз Азр С1и Ьеи Агд Азр С1и
450 455 460
Ьеи Ьуз Азр С1и Ьеи Ьеи С1и 465 470
<210> 50
<211> 705
<212> ДНК
<213> Цирковирус свиней
<400> 50
абдасдбабс сааддаддсд ббассддада адаадасасс дсссссдсад ссабсббддс 60
сабабссбсс дссдссдссс сбддсбсдбс сасссссдсс ассдсбассд ббддадаадд 120
ааааабддаа бсббсаабдс ссдссбсбсс сдсбссбббд бббабассдб баабдссбса 180
саддбсбсас сасссбсббд ддсддбддас абдабдадаб ббаабаббаа ссаабббсбб 240
сссссаддад ддддсбсааа сссссбсасб дбдсссбббд аабасбасад аабаадааад 300
дббааадбдд ааббсбббдс аадабссссс абсасссаад дбдасадддд адбдддсбсс 360
асбдсбдбба ббсбааабда баасбббдба асаааддсса садсссбаас сбабдасссс 420
бабдбааасб асбссбсссд ссабассаба асссаасссб бсбссбасса сбсссдсбас 480
бббассссса аассбдбссб бдаббссасб аббдаббасб бссаассааа баасаааада 540
аабсадсбдб ддабдадасб асааасбасб ддааабдбад ассабдбадд ссбсддасас 600
дссбббсааа асадбасааа бдсссаддсс басаабдбсс дбдбаассаб дбабдбасаа 660
ббсададааб ббаабсббаа адасссссса сббаасссба адбда 705
- 39 029698
<210> 51
<211> 234
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 51 Меб ТЪг Туг 1
Зег Шн Ьеи
Агд Шн Агд 35
Ьеи Зег Агд 50
Рго Зег Тгр 65
Рго Рго О1у
Агд Не Агд
О1п О1у Азр 115
РЪе Уа1 ТЪг
130
Зег Зег Агд 145
РЪе ТЪг Рго
Азп Азп Ьуз
Уа1 Азр Шз 195
О1п А1а Туг 210
Азп Ьеи Ьуз 225
Рго Агд Агд 5
О1у Шз 11е 20
Туг Агд Тгр
Зег РЪе Уа1
А1а Уа1 Азр 70
О1у О1у Зег 85
Ьуз Уа1 Ьуз 100
Агд О1у Уа1
Ьуз А1а ТЪг
Шз ТЪг 11е
150
Ьуз Рго Уа1 165
Агд Азп О1п 180
Уа1 О1у Ьеи
Азп Уа1 Агд
Азр Рго Рго 230
Агд Туг Агд Агд Агд 10
Ьеи Агд Агд Агд Рго 25
Агд Агд Ьуз Азп О1у 40
Туг ТЪг Уа1 Азп А1а 55
Меб Меб Агд РЪе Азп 75
Азп Рго Ьеи ТЪг Уа1
90
Уа1 О1и РЪе РЪе А1а
105
О1у Зег ТЪг А1а Уа1 120
А1а Ьеи ТЪг Туг Азр 135
ТЪг О1п Рго РЪе Зег
155
Ьеи Азр Зег ТЪг 11е 170
Ьеи Тгр Меб Агд Ьеи 185
О1у Шз А1а РЪе О1п 200
Уа1 ТЪг Меб Туг Уа1 215
Ьеи Азп Рго Ьуз
Агд Нтз Агд Рго Агд 15
Тгр Ьеи Уа1 Н1з Рго 30
11е РЪе Азп А1а Агд 45
Зег О1п Уа1 Зег Рго
60
11е Азп О1п РЪе Ьеи
80
Рго РЪе О1и Туг Туг 95
Агд Зег Рго 11е ТЪг 110
11е Ьеи Азп Азр Азп 125
Рго Туг Уа1 Азп Туг 140
Туг Нтз Зег Агд Туг 160
Азр Туг РЪе О1п Рго 175
О1п ТЪг ТЪг О1у Азп 190
Азп Зег ТЪг Азп А1а
205
О1п РЪе Агд О1и РЪе 220
<210> 52
<211> 702 <212> ДНК
40 029698
<213> Цирковирус свиней
<400> 52
аЬдасдЬаЬс сааддаддсд ЬЬассддада адаадасасс дсссссдсад ссаЬсЬЬддс 60
саЬаЬссЬсс дссдссдссс сЬддсЬсдЬс сасссссдсс ассдЬЬассд сЬддадаадд 120
аааааЬддса ЬЬЬЬсаасад ссдссЬсЬсс сдсассЬЬсд даЬаЬасЬдЬ сааддсЬасс 180
асадЬсасаа сдсссЬссЬд ддсддЬддас аЬдсЬдадаЬ ЬсааЬаЬЬда сдасЬЬЬсЬЬ 240
сссссдддад дддддассаа сааааЬсЬсЬ аЬасссЬЬЬд адЬасЬасад ааЬаадааад 300
дЬЬааддЬЬд ааЬЬсЬддсс сЬдсЬсссса аЬсасссадд дЬдасадддд адЬЬддаЬсс 360
адЬдсЬдЬаа ЬЬсЬадаЬда ЬаасЬЬЬЬЬс ссЬаадЬсса садсссЬаас сЬаЬдасссс 420
ЬасдЬааасЬ асЬссЬсссд ссаЬассаЬа ссссадсссЬ ЬсЬссЬасса сЬсссдсЬас 480
ЬЬЬассссса аассЬдЬссЬ ЬдаЬЬссасс аЬЬдаЬЬасЬ Ьссаассааа Ьаасаааадд 540
ааЬсадсЬдЬ ддаЬдадааЬ ЬсааассадЬ аааааЬдЬад ассасдЬадд ссЬсддсасЬ 600
дсдЬЬсдааа асадЬаааЬа сдассаддас ЬасааЬаЬсс дЬдЬаассаЬ дЬаЬдЬасаа 660
ЬЬсададааЬ ЬЬааЬсЬЬаа адасссссса сЬЬааасссЬ аа 702
<210> 53
<211> 233
<212> БЕЛОК
<213> Цирковирус свиней
<400> 53
МеЬ ТЬг Туг Рго Агд Агд Агд Туг Агд Агд Агд Агд Шз Агд Рго Агд
1 5 10 15
Зег Шз Ьеи 61у Шз 11е Ьеи Агд Агд Агд Рго Тгр Ьеи Уа1 Шз Рго
20 25 30
Агд Шз Агд Туг Агд Тгр Агд Агд Ьуз Азп 61у 11е РЬе Азп Зег Агд
35 40 45
Ьеи Зег Агд ТЬг РЬе 61у Туг ТЬг Уа1 Ьуз А1а ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг ТЬг
50 55 60
Рго Зег Тгр А1а Уа1 Азр МеЬ Ьеи Агд РЬе Азп 11е Азр Азр РЬе Ьеи
65 70 75 80
Рго Рго 61у 61у 61у ТЬг Азп Ьуз 11е Зег 11е Рго РЬе 61и Туг Туг
85 90 95
Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 61и РЬе Тгр Рго Суз Зег Рго 11е ТЬг
100 105 110
61п 61у Азр Агд 61у Уа1 61у Зег Зег А1а Уа1 11е Ьеи Азр Азр Азп
115 120 125
РЬе РЬе Рго Ьуз Зег ТЬг А1а Ьеи ТЬг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг
130 135 140
Зег Зег Агд Шз ТЬг 11е Рго 61п Рго РЬе Зег Туг Шз Зег Агд Туг
145 150 155 160
РЬе ТЬг Рго Ьуз Рго Уа1 Ьеи Азр Зег ТЬг 11е Азр Туг РЬе 61п Рго
165 170 175
Азп Азп Ьуз Агд Азп 61п Ьеи Тгр МеЬ Агд 11е 61п ТЬг Зег Ьуз Азп
180 185 190
Уа1 Азр Шз Уа1 61у Ьеи 61у ТЬг А1а РЬе 61и Азп Зег Ьуз Туг Азр
195 200 205
61 п Азр Туг Азп 11е Агд Уа1 ТЬг МеЬ Туг Уа1 61п РЬе Агд 61и РЬе
210 215 220
Азп Ьеи Ьуз Азр Рго Рго Ьеи Ьуз Рго
225 230
41 029698

Claims (5)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуногенная композиция против цирковируса свиней типа 2 (РСУ2), содержащая антигенный пептид, выбранный из:
    (a) необогащенного аргинином пептида, который:
    (ΐ) кодируется открытой рамкой считывания 2 (ОКЕ2) из РСУ2,
    (и) не содержит обогащенный аргинином домен, включающий Ν-концевые аминокислотные остатки 1-78 полноразмерного пептида, кодируемого ОКЕ2 из РСУ2,
    (ίίί) содержит остатки аргинина в количестве, не превышающем половины от количества остатков аргинина обогащенного аргинином домена, и
    (ίν) имеет аминокислотную последовательность 8Е^ ΙΌ NО: 6, 8Е^ ΙΌ NО: 8, 8Е^ ΙΌ NО: 10 или 8ЕО ΙΌ ^: 12;
    (b) рекомбинантного химерного белка, включающего от Ν-конца до С-конца:
    (ι) пептид рецептор-связывающего домена I и трансмембранного нацеливающего домена II экзотоксина А из Рзеиботопаз аегидтоза (РЕ) с последовательностью 8Е^ ΙΌ NО: 35,
    (ίι) необогащенный аргинином пептид по п.(а),
    (ίίί) сигнальный пептид Еу§-А§р-О1и-Ееи (КОЕБ) с последовательностью 8Е^ ΙΌ NО: 31.
  2. 2. Иммуногенная композиция по п.1, дополнительно содержащая антигенные пептиды, которые кодируются открытыми рамками считывания ОКЕ1 и ОКЕ3, отличными от ОКЕ2 из РСУ2.
  3. 3. Иммуногенная композиция по п.1, дополнительно содержащая по меньшей мере один патогенный антиген, выбранный из антигена вируса свиного гриппа (8Ιν), антигена вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РКК8У), антигена микоплазмы, антигена свиного парвовируса (РРУ), антигена рожи свиней или антигена вируса псевдобешенства.
  4. 4. Иммуногенная композиция по п.1, дополнительно содержащая один или несколько ингредиентов, выбранных из наполнителей, растворителя, эмульгатора, суспендирующих средств, связывающих средств, среды для лекарства, стабилизирующих средств, хелатообразующих средств, загустителей, консервантов, смазывающего средства, поверхностно-активного вещества, адъюванта и биологических носителей.
  5. 5. Способ получения антигенного пептида, кодируемого ОКЕ2 из РСУ2, включающий:
    (a) вырезание из полноразмерной последовательности ДНК ОКЕ2 из РСУ2 последовательности ДНК, кодирующей обогащенный аргинином домен, включающий Ν-концевые аминокислотные остатки 1-78, с получением последовательности ДНК, кодирующей необогащенный аргинином пептид, который содержит остатки аргинина в количестве, не превышающем половины от количества остатков аргинина обогащенного аргинином домена, и который имеет аминокислотную последовательность 8Е^ ΙΌ NО: 6, 8ЕО ΙΌ ^: 8, 8Е^ ΙΌ ^: 10 или 8Е^ ΙΌ ^: 12; и
    (b) встраивание последовательности ДНК, полученной на стадии (а), в биологическую систему экспрессии и обеспечение экспрессии указанной ДНК с получением указанного антигенного пептида.
    - 42 029698
EA201491123A 2011-12-06 2012-12-05 Субъединичная вакцина против цирковируса свиней типа 2 (pcv2) EA029698B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161567248P 2011-12-06 2011-12-06
PCT/CN2012/085907 WO2013083036A1 (zh) 2011-12-06 2012-12-05 猪第二型环状病毒次单位疫苗

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491123A1 EA201491123A1 (ru) 2014-12-30
EA029698B1 true EA029698B1 (ru) 2018-05-31

Family

ID=48573551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491123A EA029698B1 (ru) 2011-12-06 2012-12-05 Субъединичная вакцина против цирковируса свиней типа 2 (pcv2)

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9657063B2 (ru)
EP (1) EP2789627B1 (ru)
CN (1) CN104039814B (ru)
EA (1) EA029698B1 (ru)
ES (1) ES2661026T3 (ru)
TW (1) TWI473813B (ru)
UA (1) UA113192C2 (ru)
WO (1) WO2013083036A1 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
TWI508974B (zh) * 2010-12-22 2015-11-21 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
PL2994162T3 (pl) 2013-05-08 2021-10-18 Pharmgate Biologics Inc. Szczepionka przeciwko pcv2 i mykoplazmie
CA2985381C (en) * 2015-06-01 2020-03-24 Reber Genetics Co., Ltd. Vaccine compositions against porcine reproductive and respiratory syndrome and porcine circovirus associated diseases
WO2017066772A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Kansas State University Research Foundation Porcine circovirus type 3 immunogenic compositions and methods of making and using the same
SI3762009T1 (sl) 2018-03-08 2023-03-31 Applied Molecular Transport Inc. Iz toksinov izpeljani dostavni konstrukti za peroralno dostavo
TW202031297A (zh) 2018-11-07 2020-09-01 美商應用分子運輸公司 用於經口遞送異種負載之衍生自cholix的載體
CN114341191A (zh) * 2019-08-20 2022-04-12 Km生物医药股份公司 猪圆环病毒2型vlp疫苗
CN112226408B (zh) * 2020-09-30 2024-04-02 西北农林科技大学 一种猪病原或外源性蛋白特异性抗原肽筛选和鉴定的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101180406A (zh) * 2004-12-30 2008-05-14 勃林格殷格翰动物保健有限公司 Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法
CN101884787A (zh) * 2010-07-22 2010-11-17 洛阳普莱柯生物工程有限公司 猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法
CN101936993A (zh) * 2010-07-24 2011-01-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于orf2抗原功能区的检测猪圆环病的方法
CN102127533A (zh) * 2010-12-31 2011-07-20 华南农业大学 重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7595054B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion antigen used as vaccine
CN101104641B (zh) 2006-07-11 2012-04-18 生宝生物科技股份有限公司 作为猪生殖和呼吸道征候群疫苗的prrs病毒的融合蛋白
TWI314559B (en) * 2006-07-14 2009-09-11 Animal Technology Inst Taiwan Fusion protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as prrs vaccine
US20090017064A1 (en) 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
CA2707919C (en) 2007-12-04 2014-02-11 Schweitzer Co., Ltd. A subunit vaccine for aquaculture
CN101948849A (zh) * 2010-09-02 2011-01-19 洛阳普莱柯生物工程有限公司 猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备与应用
TWI508974B (zh) 2010-12-22 2015-11-21 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101180406A (zh) * 2004-12-30 2008-05-14 勃林格殷格翰动物保健有限公司 Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法
CN101884787A (zh) * 2010-07-22 2010-11-17 洛阳普莱柯生物工程有限公司 猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法
CN101936993A (zh) * 2010-07-24 2011-01-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于orf2抗原功能区的检测猪圆环病的方法
CN102127533A (zh) * 2010-12-31 2011-07-20 华南农业大学 重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUO, Longjun et al., Identification of Antigen Epitope Located at the N Terminal Nuclear Localization Signal Region in Capsid Protein of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2), SCIENTIA AGRICULTURA SINICA, July 2010, vol. 43, no. 7, pages 1480-1486 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2789627A1 (en) 2014-10-15
EP2789627B1 (en) 2017-09-27
CN104039814B (zh) 2017-09-01
US9657063B2 (en) 2017-05-23
CN104039814A (zh) 2014-09-10
ES2661026T3 (es) 2018-03-27
UA113192C2 (xx) 2016-12-26
EP2789627A4 (en) 2016-03-09
TW201323437A (zh) 2013-06-16
US20140348864A1 (en) 2014-11-27
WO2013083036A1 (zh) 2013-06-13
EA201491123A1 (ru) 2014-12-30
TWI473813B (zh) 2015-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029698B1 (ru) Субъединичная вакцина против цирковируса свиней типа 2 (pcv2)
JP6150864B2 (ja) ブタサーコウイルス２型（ｐｃｖ２）、それを含有する免疫原性組成物、試験キット、およびその応用
Watterson et al. Preclinical development of a molecular clamp‐stabilised subunit vaccine for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
JP2018507691A (ja) 豚流行性下痢ウイルス株及びそれから得られる免疫原性組成物
CN107847575B (zh) 用于猪生殖与呼吸综合症及猪圆环病毒相关疾病的疫苗组合物
Huang et al. Construction and immunogenicity analysis of Lactobacillus plantarum expressing a porcine epidemic diarrhea virus S gene fused to a DC-targeting peptide
CN102971417B (zh) 自浣熊分离犬细小病毒-2相关病毒
Jin et al. Immune responses induced by recombinant Lactobacillus plantarum expressing the spike protein derived from transmissible gastroenteritis virus in piglets
Guo et al. Construction of a recombinant Lactococcus lactis strain expressing a variant porcine epidemic diarrhea virus S1 gene and its immunogenicity analysis in mice
KR101832610B1 (ko) 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물
KR20220009960A (ko) 재조합 고전적 돼지 열병 바이러스
AU2017380107B2 (en) Isolation of a novel pestivirus causing congenital tremor A
KR100720755B1 (ko) 파보바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물
JP7082196B2 (ja) マイコプラズマ・シノビエ感染を予防または治療するための組成物
CN114437236A (zh) 一种重组非洲猪瘟病毒多表位融合蛋白、制备及其应用
TWI386223B (zh) Duck hepatitis vaccine and its preparation method
CN110229234A (zh) 一种具有免疫保护性的副猪嗜血杆菌融合蛋白CdtB-OppA
WO2018076125A1 (es) Vacuna recombinante contra el circovirus porcino potenciada con un inmunomodulador
GB2624391A (en) Recombinant LSDV vectored bovine coronavirus antigen constructs
KR20030078806A (ko) 전염성 췌장괴저 바이러스의 치료 또는 예방을 위한 백신조성물
Moon et al. Immunogenicity of a Canine Parvovirus 2 Capsid Antigen (VP2-S1) surface-expressed on Lactobacillus casei
Naudé Cloning and evaluation of expression of the open reading frames of a South African G9P [6] rotavirus strain encoding rotavirus structural proteins VP2 and VP6 in bacteria and yeast
WO2012013191A2 (en) Recombinant proteins as vaccines for protection against disease induced by infection with mink astrovirus

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title