ES2661026T3 - Vacuna de subunidades de circovirus porcino tipo 2 - Google Patents

Vacuna de subunidades de circovirus porcino tipo 2 Download PDF

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Abstract

Composición inmunogénica de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), que comprende un péptido antigénico seleccionado de uno de: a) un péptido no rico en arginina de un marco de lectura abierto 2 (ORF2) de PCV2 seleccionado del grupo consistente en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57; o b) una proteína de fusión recombinante que comprende, desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo de la proteína de fusión recombinante: un péptido PE que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 35; el péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 (a); y un péptido señal KDEL que tiene la secuencia de SEQ ID No: 31.

Description

Vacuna de subunidades de circovirus porcino tipo 2
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a una vacuna de subunidades de circovirus porcino tipo 2 (PCV2), en particular a una vacuna de subunidades de PCV2 que comprende un péptido de PCV2 de marco de lectura abierto (ORF2) que puede expresarse abundantemente como un antígeno y adicionalmente un vehículo o adyuvante adecuados.
2.
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Es sabido que el circovirus porcino tipo 2 (PCV2) está relacionado con el síndrome multisistémico de desmedro posdestete (PMWS) y el síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS, por sus siglas en inglés). El PMWS se descubrió por primera vez en cerdos en Canadá en 1991 y posteriormente se ha dado informado del mismo en todo el mundo. El síndrome ha causado enormes pérdidas en la industria productora de cerdos a escala mundial. Entre los síntomas principales del PMWS se incluyen pérdida de peso progresiva, taquipnea, disnea, ictericia, etcétera. Entre los cambios visiblemente patológicos en los tejidos se incluyen infiltrado linfocitario y granulomatoso, linfadenopatía, hepatitis linfocitaria y granulomatosa y nefritis.
El circovirus porcino (PCV) fue reconocido por primera vez en una línea celular de riñón de cerdo (PK-15, ATCC CCL33) en 1982. Aunque el circovirus porcino puede contaminar continuamente células PK-15, el virus no causa un efecto citopático (CPE) en las células PK-15 contaminadas. Aunque el circovirus porcino puede infectar a cerdos, no causa lesiones en los cerdos infectados. El virus se denomina circovirus porcino tipo 1 (PCV1). El PCV1 es un virus ADN monocatenario icosaédrico con un genoma circular de 1.759 ppbb. El PCV derivado de PK-15 se clasificó en la familia Circoviridae en 1995.
El PCV1 derivado de PK-15 se considera apatógeno. En cambio, la mutación del virus aislada de cerdos con PMWS en 1997 es patógena y se denomina circovirus porcino tipo 2 (PCV2). El síndrome multisistémico de desmedro posdestete (PMWS) es una enfermedad porcina muy contagiosa. Infecta principalmente a cerdas preñadas y sus lechones y afecta gravemente a la salud de los cerdos.
El PCV2 es un ADN-virus monocatenario circular con un diámetro de 17 nm y su genoma tiene un tamaño de 1,76 kb. El análisis genómico con software muestra un total de 11 marcos de lectura abiertos (ORF) transcritos en el sentido de las agujas del reloj y en sentido opuesto a las agujas del reloj. Entre los 11 ORF, el ORF1 y el ORF2 son probablemente los genes más importantes. El gen de ORF1 codifica proteínas Rep y Rep’, que están relacionadas con la replicación vírica. Se sabe que el gen de ORF2 codifica la proteína de cápside de estructura inmunógena de PCV2, que se utiliza para inducir una respuesta inmunitaria en organismos.
La vacuna de PCV2 inactivado es la vacuna de PCV comercialmente disponible más común. Sin embargo, el desarrollo de una vacuna inactivada requiere que las líneas celulares estén libres de contaminantes y la posibilidad de una inactivación incompleta del virus mediante agentes químicos es la desventaja más importante de la vacuna inactivada. Otra desventaja es que las estructuras antigénicas del virus pueden verse alteradas por un tratamiento químico, lo que lleva a que no sea posible inducir una respuesta inmunitaria suficiente para eliminar el virus y que no sea posible proteger a los cerdos contra una infección por la enfermedad. Por tanto, el desarrollo de una vacuna inactivada puede ser difícil y costoso y la seguridad de la vacuna puede ser preocupante.
A diferencia de la vacuna inactivada, en la que todo el virus es el antígeno de la vacuna, la vacuna de subunidades utiliza parte de las proteínas del patógeno como proteínas antigénicas y la proteína antigénica se inocula a animales o humanos para inducir la inmunidad. La vacuna de subunidades puede prepararse clonando genes que codifican proteínas antigénicas de patógenos y produciendo a continuación grandes cantidades de las proteínas antigénicas por ingeniería genética. La seguridad es la ventaja más importante de la vacuna de subunidades, ya que ésta utiliza parte de un patógeno en lugar de un patógeno completo para la vacunación de cerdos, sin el problema de una inactivación incompleta. La vacuna de subunidades de PCV2 convencional utiliza la proteína de ORF2 de PCV2 como proteína antigénica; sin embargo, el nivel de expresión de la proteína de ORF2 de PCV2 de longitud completa en sistemas de expresión procarióticos es bastante bajo y no cumple los requisitos de la producción de vacunas. Por tanto, el desarrollo de fragmentos antigénicos de ORF2 de PCV2 que puedan expresarse altamente en sistemas de expresión biológicos es útil para la aplicación comercial de la vacuna de subunidades de PCV2.
El documento WO 99/29871 A1 y las publicaciones SHANG S. B. y col.: "Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus, and antigenic phenotype of porcine circovirus Type 2", MOLECULAR IMMUNOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 46, nº 3, 1 de enero de 2009, páginas 327-334, ZHONG-ZI LOU y col.: "Prokaryotic expression and potential application of the truncated PCV-2 capsid protein", VIROLOGICA SINICA, vol. 25, nº 2, 1 de abril de 2010 (201 0-04-01), páginas 88-97 y GUO, LONGJUN y col.: "Identification of Antigenj Epitope Located at the N Terminal Nuclear Localization Signal Region in Capsid Protein of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2)", SCIENTIA AGRICULTURA SINICA, vol. 43, nº 7, julio de 2010, páginas 1480-1486, se refieren al circovirus porcino.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La descripción proporciona secuencias de ADN que codifican fragmentos de proteína de ORF2 de PCV2 y los fragmentos de proteína de ORF2 de PCV2 pueden expresarse altamente en sistemas de expresión biológicos.
La descripción proporciona también una vacuna de subunidades de PCV2 en la que se utilizan fragmentos de proteína de ORF2 de PCV2, que pueden expresarse altamente en sistemas de expresión biológicos, como proteínas antigénicas a inocular a animales para inducir una inmunidad suficiente contra la infección por PCV2 en los animales.
La descripción proporciona además una vacuna de subunidades desarrollada por ingeniería genética para producir una vacuna de subunidades de PCV2 de bajo coste, alta pureza y alta seguridad, con procesos de producción sencillos.
Debido al hecho de que el nivel de expresión de la proteína de ORF2 de PCV2 de longitud completa en sistemas de expresión biológicos es bastante bajo, se utilizó ingeniería genética para lograr los objetivos arriba indicados. Se cortaron en fragmentos de diferentes tamaños secuencias de ADN (tales como la SEQ ID nº: 1) que codifican proteínas de ORF2 de PCV2 de longitud completa y los fragmentos de ADN se insertaron en vectores de expresión y a continuación se expresaron en huéspedes. Se evaluaron los niveles de las proteínas expresadas para determinar qué fragmentos de ADN pueden producir altos niveles de proteínas en sistemas de expresión de proteínas.
Los resultados de los análisis de secuencia de las proteínas y los ensayos de expresión de proteínas demuestran que hay aproximadamente 30 argininas en una proteína de ORF2 de PCV2 de longitud completa, donde al menos dos tercios de las argininas están situadas en el extremo N de la proteína de ORF2 de PCV2, y que cuantas más argininas se supriman en el extremo N, tanto mayor es el nivel del fragmento de proteína de ORF2 expresado. Además, una vez suprimidos los primeros 234 nucleótidos en el extremo 5’ de una secuencia de ADN de longitud completa de ORF2 de PCV2, el fragmento de proteína codificado por el fragmento de ADN remanente (es decir desde el nucleótido 235 en el extremo 5’ a un codón de parada) puede expresarse ampliamente.
Por tanto, la vacuna de subunidades de PCV2 proporcionada en la descripción comprende un péptido antigénico de PCV2 con un vehículo o adyuvante adecuado. El péptido antigénico puede expresarse ampliamente en sistemas de expresión y es un péptido no rico en arginina de un ORF2 de PCV2. Los índices de arginina del péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 son iguales a no más de la mitad (1/2) de los índices de arginina de un dominio rico en arginina en el extremo N del ORF2 de PCV2 de longitud completa. Cuando el índice de arginina de un dominio rico en arginina en el extremo N de un ORF2 de PCV2 de longitud completa es 20, el índice de arginina del péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 es un número entero entre 0 y 10. Alternativamente, cuando el índice de arginina de un dominio rico en arginina en el extremo N de un ORF2 de PCV2 de longitud completa es 21, el índice de arginina del péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 es un número entero entre 0 y 10. Alternativamente, cuando el índice de arginina de un dominio rico en arginina en el extremo N de un ORF2 de PCV2 de longitud completa es 22, el índice de arginina del péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 es un número entero entre 0 y 11. En la descripción, el dominio rico en arginina tiene residuos 1-78 en el extremo N de un ORF2 de PCV2 de longitud completa (que está codificado por los nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de una secuencia de ADN de cadena completa del ORF2 de PCV2). En la descripción, el péptido no rico en arginina tiene la secuencia peptídica desde el residuo 79 hasta el último residuo de aminoácido en el extremo C de un ORF2 de PCV2 de longitud completa (que está codificado por la secuencia de ADN desde el nucleótido 235 en el extremo 5’ hasta un codón de parada en el extremo 3’ de una secuencia de ADN de longitud completa del ORF2 de PCV2).
El ORF2 de PCV2 descrito aquí tiene una secuencia peptídica de longitud completa de una de las siguientes: SEQ ID nº: 2, SEQ ID nº: 16, SEQ ID nº: 20, SEQ ID nº: 51 y SEQ ID nº: 53.
Además, la descripción proporciona una proteína de fusión de ORF2 de PCV2 como péptido antigénico empleando las funciones del dominio de unión a receptor I y el dominio diana transmembrana II de la exotoxina
A de Pseudomonas aeruginosa (es decir proteína PE) y una señal de retención de retículo endoplásmico (RE) (es decir el “péptido señal KDEL”).
La proteína PE de Pseudomonas aeruginosa puede utilizarse como guía de una proteína diana con respecto a su ubicación objetivo mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, el dominio de unión al receptor de la exotoxina A de Peudomonas aeruginosa es responsable de la unión a los receptores de membrana de las células diana (células CD8 + T) y a continuación los complejos ligando-receptor entran en los endosomas de las células diana por endocitosis. Tras una escisión enzimática con una proteasa en los endosomas, se suministran a los aparatos de Golgi y al retículo endoplásmico (RE) fragmentos de proteína truncados (que contienen el dominio de guía transmembrana y la proteína diana enlazada), que posteriormente son sometidos a translocación al citoplasma de las células diana por el dominio de guiado transmembrana.
Además, cuando se enlaza un péptido señal KDEL en el extremo C de una proteína diana, ésta será transportada al RE por el péptido señal KDEL y a continuación interactuará en el RE.
Por tanto, la descripción proporciona una proteína de fusión de ORF2 de PCV2 como péptido antigénico utilizando las funciones de la proteína PE y del péptido señal KDEL. La proteína PE y el péptido señal KDEL se fusionan con un fragmento de proteína de ORF2 de PCV2 y los extremos N y C, respectivamente, para producir la proteína de fusión (PE-fragmento ORF2-KDEL) a inocular a animales con el fin de inducir una inmunidad suficiente contra la infección por PCV2 en los animales.
En algunas realizaciones, los péptidos antigénicos utilizados aquí incluyen fragmentos de ORF2 de PCV2. Los fragmentos de ORF2 tienen una secuencia peptídica según una de las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57 y se obtuvieron por ingeniería genética. Las secuencias de ADN (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 17, 21, 54, 56) que codificaban los fragmentos de ORF2 de PCV2 se clonaron en vectores de expresión para obtener plásmidos que contenían un fragmento de ADN que codificaba un péptido antigénico. A continuación se transformaron los plásmidos en células huésped para expresar los péptidos antigénicos.
Las proteínas de fusión (PE-fragmento ORF2-KDEL) aquí descritas se obtuvieron por ingeniería genética. Las secuencias de ADN (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 17, 21, 54, 56) que codificaban los fragmentos de ORF2 de PCV2, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 34) que codificaba la proteína PE y la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 30) que codificaba el péptido de señal KDEL se clonaron en vectores de expresión para obtener plásmidos que contenían un fragmento de ADN que codificaba una proteína de fusión. A continuación se transformaron los plásmidos en células huésped para expresar las proteínas de fusión.
Entre los vectores de expresión se incluyen, de forma no exclusiva, vectores pET y vectores pGEX. En una realización, el vector de expresión es pET24a. Entre los sistemas de expresión (células huésped) se incluyen, de forma no exclusiva, sistemas de expresión procarióticos (como Escherichia coli), sistemas de expresión eucarióticos (como células animales (por ejemplo células CHO) y células vegetales). En una realización, el sistema de expresión es E. coli.
Entre los adyuvantes se incluyen, de forma no exclusiva, adyuvantes acuosos (como hidróxido de aluminio), alumbre de potasio, adyuvante incompleto de Freund, adyuvantes de tipo oleoso, adyuvantes solubles en agua
o adyuvantes de emulsión agua en aceite en agua (W/O/W). En una realización, el adyuvante es un adyuvante de tipo oleoso.
La composición inmunógena descrita aquí comprende además péptidos de otros ORF de PCV2. Entre los otros ORF de PCV2 se incluyen, de forma no exclusiva, ORF1 y ORF3. Además, la composición inmunógena aquí descrita comprende también un antígeno de patógeno. El antígeno de patógeno se selecciona del grupo consistente en antígeno de virus de la gripe porcina (SIV), antígeno de virus de síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), antígeno de micoplasma, antígeno de parvovirus porcino (PPV), antígeno de erisipela y antígeno de virus de seudorrabia (enfermedad de Aujeszky).
Además, la composición inmunógena aquí descrita comprende también uno o más de uno de los siguientes: vehículos, disolventes, emulsionantes, agentes de suspensión, agentes de descomposición, agentes de unión, excipientes, estabilizantes, quelantes, diluyentes, gelificantes, conservantes, lubricantes, tensioactivos, adyuvantes y portadores biológicos.
El significado de los términos técnicos y científicos aquí descritos puede ser entendido claramente por una persona con conocimientos ordinarios de la técnica.
La presente invención se describe más detalladamente en los siguientes ejemplos ilustrativos. Aunque los ejemplos solo pueden representar realizaciones seleccionadas de la invención, debería entenderse que los siguientes ejemplos son ilustrativos y no limitativos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1: proporciona un análisis filogenético de secuencias de genoma de PCV2.
FIG. 2: diagrama esquemático de los fragmentos de ORF2 de PCV2 donde pF1, pF2, pF3, pF4, pR1, pR2 y pR3 son cebadores para la PCR.
FIG. 3: muestra los resultados del análisis SDS-PAGE de proteínas recombinantes de diferentes fragmentos 2a-ORF2 de PCV2 expresados en E. coli. Se recogieron proteínas completas de E. coli 6 horas después de una inducción con IPTG, que a continuación se resolvieron mediante SDS-PAGE al 15%, en la que las pistas 1-9 mostraban escaleras de peso molecular, vector pET24a vacío (como control negativo), fragmento 2a-F1 de ORF2 de PCV2 (12,7 kDa), fragmento 2a-F2 de ORF2 de PCV2 (11,6 kDa), fragmento 2a-F3 de ORF2 de PCV2 (12,1 kDa), fragmento 2a-F4 de ORF2 de PCV2 (16,5 kDa), fragmento 2a-F5 de ORF2 de PCV2 (21,4 kDa), fragmento 2a-F6 de ORF2 de PCV2 (20,8 kDa) y 2a-ORF2 de PCV2 de longitud completa (27,5 kDa), respectivamente.
FIG. 4: resultados de una transferencia western de proteínas recombinantes de diferentes fragmentos 2a-ORF2 de PCV2. Las pistas 1-9 muestran escaleras de peso molecular, vector pET24a vacío (como control negativo), fragmento 2a-F1 de ORF2 de PCV2 (12,7 kDa), fragmento 2a-F2 de ORF2 de PCV2 (11,6 kDa), fragmento 2a-F3 de ORF2 de PCV2 (12,1 kDa), fragmento 2a-F4 de ORF2 de PCV2 (16,5 kDa), fragmento 2a-F5 de ORF2 de PCV2 (21,4 kDa), fragmento 2a-F6 de ORF2 de PCV2 (20,8 kDa) y 2a-ORF2 de PCV2 de longitud completa (27,5 kDa), respectivamente.
FIG. 5: resultados de un ELISA de PCV2 de muestras de suero recogidas en diferentes momentos de ratas vacunadas con proteínas recombinantes de diferentes fragmentos 2a-ORF2 de PCV2, respectivamente. *, p<0,05. (PI: posterior a la inmunización; PR: posterior al refuerzo).
FIG. 6: resultados de un ELISA de PCV2 de muestras de suero recogidas en diferentes momentos de ratones vacunados con proteínas recombinantes del fragmento 2a-F2 y proteínas recombinantes del fragmento PE-2a-F2-KDEL, respectivamente. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; #, p<0,05; ##, p<0,01; ###, p<0,001. (PI: posterior a la inmunización; PR: posterior al refuerzo).
FIG. 7: resultados de un ELISA de PCV2 de muestras de suero recogidas en diferentes momentos de ratones vacunados con proteínas recombinantes del fragmento PE-2a-F2-KDEL y la vacuna de virus entero PCV2, respectivamente. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; #, p<0,05; ##, p<0,01; ###, p<0,001. (PI: posterior a la inmunización; PR: posterior al refuerzo).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN PREFERENTE
Ejemplo 1 Construcción y determinación de péptidos antigénicos de vacuna de subunidades de PCV2
Debido al hecho de que el nivel de expresión de la proteína de ORF2 de PCV2 de longitud completa en sistemas de expresión biológicos es bastante bajo, se cortaron secuencias de ADN que codifican proteínas de ORF2 de PCV2 de longitud completa en fragmentos de diferentes tamaños y los fragmentos de ADN se insertaron en vectores de expresión y a continuación se expresaron en huéspedes. Se evaluaron los niveles de las proteínas expresadas para determinar qué fragmentos de ADN pueden producir altos niveles de proteínas en sistemas de expresión de proteínas.
En los ejemplos siguientes se utiliza para el análisis y la ilustración un sistema de expresión procariótico frecuentemente utilizado (Escherichia coli).
1. Amplificación de fragmentos génicos de ORF2 de PCV2 de diferentes tamaños
El gen de ORF2 de PCV2 utilizado en este ejemplo tiene la secuencia SEQ ID NO: 1. Para el análisis filogenético de la SEQ ID NO: 1 se utilizan como secuencias estándar secuencias génicas de ORF2 de PCV2 proporcionadas por Wang y col. (Wang y col., Virus Research 2009, Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2). Los resultados muestran que la secuencia de ORF2 de PCV2 (SEQ ID NO: 1) pertenece al subgrupo 2a de PCV2 (como se muestra en la FIG. 1). Los cebadores (mostrados en la Tabla 1) se diseñaron para amplificar diferentes tamaños de fragmentos del gen 2a ORF2 de PCV2 (2a-ORF2) por reacción en cadena de polimerasa (PCR).
Como se muestra en la FIG. 2, el gen de 2a-ORF2 de longitud completa se amplificó con los cebadores específicos pF1 (cebador directo) y pR1 (cebador inverso) por PCR. El gen de 2a-ORF2 de longitud completa (2a-ORF2) tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 y los diferentes tamaños de fragmentos del 2a-ORF2 de PCV2 se denominaron 2a-F1, 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4, 2a-F5 y 2a-F6, respectivamente. El fragmento 2a-F1 tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3, que son los nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de 2a-ORF2. El fragmento 2a-F2 tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO:5, que son los nucleótidos 235-468 en el extremo 5’ de 2a-ORF2. El fragmento 2a-F3 tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 7, que son los nucleótidos 469
699 en el extremo 5’ de 2a-ORF2. El fragmento 2a-F4 tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 9, que son los nucleótidos 349-699 en el extremo 5’ de 2a-ORF2. El fragmento 2a-F5 tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 11, que son los nucleótidos 235-699 en el extremo 5’ de 2a-ORF2. El fragmento 2a-F6 tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 13, que son los nucleótidos 1-468 en el extremo 5’ de 2a-ORF2. Todos los cebadores directos tienen un sitio de restricción Hind III y todos los cebadores inversos tienen un sitio de restricción Xho
I.
Tabla 1 Listado de secuencias de cebadores para la amplificación de diferentes tamaños de fragmentos de gen de ORF2 de PCV2
Fragmento ORF2 F1
Cebador pF1 pR1 pF1 pR3 Cebador directo Cebador inverso Cebador directo Cebador inverso C Secuencianota SEQ ID NO: 28
Cebador
pF2 SEQ ID NO: 25 directoF2 Cebador
pR2 SEQ ID NO: 26
inverso Cebador pF3
SEQ ID NO: 27 directoF3 CebadorpR1 SEQ ID NO: 24
inverso Cebador
pF4 SEQ ID NO: 29 directoF4 CebadorpR1 SEQ ID NO: 24
inverso Cebador
pF2
SEQ ID NO: 25 directoF5 CebadorpR1 SEQ ID NO: 24
inverso Cebador
pF1 SEQ ID NO: 23 directoF6 CebadorpR2 SEQ ID NO: 26
inverso Nota: Las secuencias marcadas con “______” por debajo son las secuencias del sitio de restricción Hind III
(AAGCTT) y las secuencias marcadas con “ ” son las secuencias del sitio de restricción Xho I (CTCGAG).
Las condiciones para la reacción PCR comprenden: 95ºC durante 5 minutos, 25 ciclos de 95ºC durante 30
10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 5 minutos para el alargamiento. Los tamaños de los productos de PCR 2a-ORF2, 2a-F1, 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4, 2a-F5 y 2a-F6 son 699 ppbb, 234 ppbb, 234 ppbb, 231 ppbb, 351 ppbb, 465 ppbb y 468 ppbb, respectivamente, y se confirmaron mediante electroforesis en agarosa al 2%. Tras la confirmación, los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación PCR-M (Viogene).
15 2. Construcción de plásmidos de pET24a que contienen diferentes tamaños de fragmentos de ORF2 de PCV2
Un (1) µg de los productos de PCR purificados y 1 µg de vector de expresión pET24a (Novagen) se digirieron con dos enzimas de restricción (New England Biolabs), 1 µl de Hind III y 1 µl de Xho I, respectivamente, durante 8 horas a 37ºC. Después de la reacción de escisión por la enzima de restricción, los productos de PCR digeridos y el vector de expresión pET24a se purificaron con PCR-M Clean up System (Viogene) respectivamente. Los
20 productos de PCR purificados se ligaron con el vector de expresión pET24a purificado para formar los plásmidos pET24a-2a-F1, pET24a-2a-F2, pET24a-2a-F3, pET24a-2a-F4, pET24a-2a-F5, pET24a-2a-F6 y pET24a-2a-ORF2 y a continuación se transformaron los plásmidos en células huésped (E. coli). Se seleccionaron los transformantes que contenían los productos de PCR y se confirmaron las secuencias de ADN por secuenciación de ADN. Se obtuvieron bacterias que contenían los plásmidos arriba indicados.
25 3. Expresión de proteína y confirmación de diferentes tamaños de fragmentos de ORF2 de PCV2
Se incubaron bacterias que contenían los plásmidos arriba indicados en 2 ml de medio LB a 37ºC durante 1618 horas y a continuación se inocularon en una relación 1:50 en medio LB que contenía 25 µg/ml de kanamicina para incubarlos posteriormente en un incubador a 37ºC, 200 rpm, hasta que el O.D. 600 nm fue 0,6. Después, se añadió ß-D-tiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM y se incubaron las células huésped
E. coli en un incubador a 37ºC, 200 rpm durante 6 horas más. A continuación se centrifugó 1 ml de las células huésped E. coli a 10.000 xg y se trató el aglomerado con B-PERTM Bacterial Protein Extraction (comprado a PIERCE) para comprobar si las proteínas recombinantes eran proteínas solubles o en cuerpos de inclusión mediante los pasos siguientes. El aglomerado se añadió a 40 µl de reactivo, se mezcló con un agitador de vórtice durante 1 minuto y se centrifugó a 10.000 xg para separar proteínas solubles (parte superior) de cuerpos de inclusión insolubles (parte inferior). Se disolvieron las proteínas solubles en 1x tampón de muestra SDS-PAGE y se añadió el aglomerado a 2x tampón de muestra SDS-PAGE. Las muestras se colocaron en un bloque térmico a 100ºC durante 20 minutos y a continuación se centrifugaron. Se analizó el sobrenadante por SDS-PAGE al 15% para medir la expresión de las proteínas recombinantes.
Las proteínas recombinantes se produjeron induciendo un cultivo bacteriano con IPTG. La proteína recombinante 2a-ORF2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La proteína recombinante 2a-F1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. La proteína recombinante 2a-F2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. La proteína recombinante 2a-F3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. La proteína recombinante 2a-F4 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. La proteína recombinante 2a-F5 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. La proteína recombinante 2a-F6 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
La expresión de las proteínas recombinantes se analizó por SDS-PAGE y los resultados se muestran en la FIG. 3, en la que la pista 1 muestra escaleras de peso molecular, la pista 2 muestra el control de negativo (vector pET24a vacío), la pista 3 muestra la proteína recombinante 2a-F1 (12,7 kDa), la pista 4 muestra la proteína recombinante 2a-F2 (11,6 kDa), la pista 5 muestra la proteína recombinante 2a-F3 (12,1 kDa), la pista 6 muestra la proteína recombinante 2a-F4 (16,5 kDa), la pista 7 muestra la proteína recombinante 2a-F5 (21,4 kDa), la pista 8 muestra la proteína recombinante 2a-F6 (20,8 kDa) y la pista 9 muestra la proteína recombinante 2a-ORF2 de longitud completa (27,5 kDa). Entre los 6 fragmentos de 2a-ORF2, los fragmentos 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4 y 2a-F5 se expresaron en grandes cantidades (FIG. 3, pistas 4-7). Los tamaños estimados de las proteínas de fragmentos 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4 y 2a-F5 coinciden con sus tamaños reales de 11,6 kDa, 12,1 kDa, 16,5 kDa y 21,4 kDa, respectivamente.
A continuación se utilizó una transferencia western para comprobar si las proteínas recombinantes expresadas eran fragmentos de 2a-ORF2 de PCV2. Después de la electroforesis, la SDS-PAGE se transfirió sobre una membrana de nailon PVDF. La membrana resultante se bloqueó con tampón de bloqueo, TBST (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, 0,1 % Tween 20) conteniendo un 5% de leche desnatada, durante 1 h, a temperatura ambiente, para impedir una unión no específica de proteínas. Después se identificaron las proteínas utilizando anticuerpos monoclonales anti-6x his de ratón conjugados con fosfatasa alcalina (FA) contra las proteínas de fusión 6X his-tag durante 1 hora a temperatura ambiente, a lo que siguieron 6 lavados con TBST, 5 minutos en cada caso. Después del lavado se añadió sustrato NBT/BCIP (Bio-Rad). Después de 10 minutos se detuvo la reacción añadiendo agua.
Los resultados de la transferencia western se muestran en la FIG. 4, en la que la pista 1 muestra escaleras de peso molecular, la pista 2 muestra el control negativo (vector pET24a vacío), la pista 3 muestra la proteína recombinante 2a-F1 (12,7 kDa), la pista 4 muestra la proteína recombinante 2a-F2 (11,6 kDa), la pista 5 muestra la proteína recombinante 2a-F3 (12,1 kDa), la pista 6 muestra la proteína recombinante 2a-F4 (16,5 kDa), la pista 7 muestra la proteína recombinante 2a-F5 (21,4 kDa), la pista 8 muestra la proteína recombinante 2a-F6 (20,8 kDa) y la pista 9 muestra la proteína recombinante 2a-ORF2 de longitud completa (27,5 kDa). Los resultados de la transferencia western coinciden con los resultados del análisis por SDS-PAGE (como se muestra en la FIG. 3). La proteína recombinante 2a-ORF2 de longitud completa no puede expresarse (FIG. 4, pista 9). Entre los 6 fragmentos de 2a-ORF2, los fragmentos 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4 y 2a-F5 se expresaron en grandes cantidades (FIG. 4, pistas 4-7). Los tamaños estimados de las proteínas de fragmentos 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4 y 2a-F5 coinciden con sus tamaños reales de 11,6 kDa, 12,1 kDa, 16,5 kDa y 21,4 kDa, respectivamente. Sin embargo, no hay expresión de la proteína recombinante 2a-F1 ni de la proteína recombinante 2a-F6 (FIG. 4, pistas 3 y 8). Dado que tanto la proteína recombinante 2a-F1 como la proteína recombinante 2a-F6 contienen nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de la secuencia de ADN de longitud completa del 2a-ORF2 de PCV2 (véase la FIG. 2), algunas secuencias en los nucleótidos 1-234 pueden afectar a la expresión de la proteína de ORF2 de PCV2. El análisis de las secuencias de aminoácidos del fragmento 2a-F1 (nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de 2a-ORF2 de PCV2, SEQ ID NO: 3) y el fragmento 2a-F2 + 2a-F3 (nucleótidos 235-699 (sin el codón de parada) en el extremo 5’ de 2a-ORF2 de PCV2, SEQ ID NO: 11) muestra que los índices de arginina de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) del fragmento 2a-F1 son dos veces o más los índices de arginina de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) del fragmento 2a-F2 + 2a-F3 (como se muestra en la Tabla
2). El análisis de adición o deleción de arginina muestra que una deleción excesiva de arginina puede aumentar la expresión de proteínas de ORF2 de PCV2.
Tabla 2 Análisis de índices de arginina de la secuencia de aminoácidos de 2a-ORF2 de PCV2
2a-F1
2a-F2 + 2a-F3
Codón
Aminoácido Cantidad Codón Aminoácido Cantidad
AGA
Arginina 5 AGA Arginina 3
AGG
Arginina 3 AGG Arginina 3
CGA
Arginina 1 CGC Arginina 1
CGC
Arginina 10 CGG Arginina 1
CGT
Arginina 2 CGT Arginina 1
Total
21 Total 9
Ejemplo 2 Análisis de inmunogenicidad de péptidos antigénicos de vacuna de subunidades de PCV2
5 1. Inmunización de ratas
Se preparó una vacuna de subunidades de PCV2 con las proteínas recombinantes 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4 y 2a-F5 preparadas en el Ejemplo 1, respectivamente, y adyuvante completo de Freund. Se vacunaron ratas con la vacuna de subunidades de PCV2 para analizar la inmunogenicidad de los péptidos antigénicos de la vacuna de subunidades de PCV2.
10 Se dividieron aleatoriamente ratas sanas de cinco a seis semanas de edad, libres de gérmenes patógenos específicos (SPF), en 5 grupos de 3 ratas cada uno. Un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) mostró que las 15 ratas eran negativas para anticuerpos anti-PCV2. A cada rata de los 4 grupos de vacunación (grupos 1 a 4) se le inyectó vía subcutánea 200 µg de proteína recombinante, el volumen total de cada inyección de 300 µl con una relación 1:1 (v/v) proteína:formulación de adyuvante. A las ratas del grupo 5 se les inyectó
15 300 µl de PBS y éstas sirvieron de control negativo. Dos semanas después de la inmunización primaria (i.p.), las ratas de los 4 grupos de vacunación recibieron como refuerzo la misma dosis de las 4 proteínas recombinantes diferentes respectivas. Se recogieron muestras de suero en las semanas 0, 2, 4 y 8 posteriores a la inmunización primaria. Todas las muestras de suero se ensayaron mediante ELISA para medir el título de anticuerpos anti-PCV2.
20 2. Detección de anticuerpos anti-PCV2 mediante ELISA
En este ejemplo se utilizaron como placas ELISA placas de noventa y seis pocillos que contenían antígeno de patógeno PCV2 (300 ng/pocillo). Las placas ELISA se lavaron 3 veces con 50 mmol/l de PBS (pH 7,2) que contenía 500 µl/l de Tween-20 (por ejemplo PBST) durante 3 a 5 minutos cada vez. Para bloquear las placas ELISA, se añadieron 200 µl de solución de bloqueo BSA al 0,15% a cada pocillo de las placas ELISA y a 25 continuación se incubaron las placas ELISA durante 2 horas a 37ºC. Después se lavaron las placas ELISA con PBS. Las muestras de suero de rata se diluyeron cincuenta veces (1:50) con PBS y a continuación se diluyeron en una relación de 1:2 en serie. Cada muestra tuvo 8 repeticiones. Las muestras de suero diluidas se añadieron a los pocillos de las placas ELISA (100 µl/pocillo) y las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Tras la incubación, las placas se lavaron con PBS. A continuación se añadió a los pocillos anticuerpo IgG anti-rata
30 conjugado con fosfatasa alcalina (FA). Después de incubar durante 1 hora a 37ºC, las placas se lavaron con PBS. Para visualizar los resultados se añadió a los pocillos para-nitrofenilfosfato (pNPP). Después de la incubación se detuvo la reacción añadiendo NaOH 1M. Se leyó la densidad óptica de cada pocillo utilizando densidad óptica a 405 nm. Cada muestra se analizó por duplicado y se calculó la media de los valores O.D. de los duplicados.
35 Los resultados del ELISA se muestran en la FIG. 5. Todas las proteínas recombinantes de 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4 y 2a-F5 preparadas en el Ejemplo 1 son capaces de inducir anticuerpos séricos contra PCV2 en los animales sometidos a ensayo. Entre las proteínas recombinantes, la proteína recombinante 2a-F2 (SEQ ID NO: 6) indujo el mayor nivel de anticuerpo sérico contra PCV2. Para el análisis estadístico, se compararon todos los grupos con el control negativo con PBS en distintos momentos de muestreo, existiendo importantes diferencias entre
40 el control negativo y cada grupo de vacunación (p<0,05).
Además, se vacunaron cerdos con las proteínas recombinantes de 2a-F2, 2a-F3, 2a-F4 y 2a-F5, respectivamente, y todas las proteínas recombinantes fueron capaces de inducir anticuerpos séricos contra PCV2 en los cerdos. Además, los cerdos vacunados fueron sometidos a una prueba de provocación con virus PCV2 para evaluar la eficacia de las proteínas recombinantes. En primer lugar, se formularon las proteínas 45 recombinantes como una vacuna de subunidades que les fue inyectada. A continuación se sometió a los cerdos a una prueba de provocación con virus PCV2. Los resultados muestran que los porcentajes de protección de los grupos de inmunización son mayores que los del control negativo (sin vacunación). Los porcentajes de
protección utilizados aquí incluyen una disminución en la viremia y una mitigación de los síntomas del PCV2. Por tanto, los resultados demuestran que la vacuna de subunidades de PCV2 preparada con las proteínas recombinantes puede inducir eficazmente inmunidad en animales y aumentar su tasa de supervivencia.
Ejemplo 3 Construcción y expresión de péptidos antigénicos de vacuna de subunidades de PCV2 2a
Los resultados del Ejemplo 2 demuestran que, entre las proteínas recombinantes, el péptido F2 de ORF2 de PCV2 induce el mayor nivel de anticuerpo sérico contra PCV2. Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de la vacuna de subunidades de PCV2, se fusionaron el dominio de unión a receptor I y el dominio de guiado transmembrana II de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (es decir la proteína PE) y una señal de retención del RE -un péptido señal KDEL con el péptido 2a-F2 preparado en el Ejemplo 1 en los extremos N y C, respectivamente, para producir una proteína de fusión (PE-2a-F2-KDEL) con el fin de inducir una inmunidad suficiente contra la infección por PCV2 en animales.
La proteína recombinante (PE-2a-F2-KDEL) se preparó por ingeniería genética en este ejemplo. Las secuencias de ADN que codificaban las proteínas de interés se clonaron en un vector de expresión para construir el plásmido pET24a-PE-2a-F2-KDEL. Se indujo al plásmido a expresar la proteína recombinante PE-2a-F2-KDEL. En primer lugar, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 30) que codificaba el péptido señal KDEL se clonó en un vector pET24a para formar el plásmido pET24a-KDEL. Después, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 5) del fragmento 2a-F2 obtenido en el Ejemplo 1 se clonó en el plásmido pET24a-KDEL para formar el plásmido pET24a-2a-F2-KDEL. Finalmente, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 34) que codificaba la proteína PE se clonó en el plásmido pET24a-2a-F2-KDEL para formar el plásmido pET24a-PE-2a-F2-KDEL.
1. Construcción de pET24a-KEDL
La secuencia de ADN que codifica el péptido señal KDEL (SEQ ID NO: 31) se muestra como SEQ ID NO: 30. La secuencia de ADN se amplificó por PCR. A continuación se muestran las secuencias de los cebadores de especificidad de KEDL.
Cebador directo (con un sitio de restricción Hind III):
Hind III Cebador inverso (con un sitio de restricción Xho I):
Xho I
Las condiciones para la reacción PCR comprenden: 94ºC durante 3 minutos, 5 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 20 segundos, y 72ºC durante 1 minuto para el alargamiento. El producto de PCR y el vector pET24a se sometieron a una doble digestión con enzimas de restricción con Hind III y Xho
I. Después se purificaron los productos de PCR y el vector pET24a digeridos, respectivamente, a lo que siguió una ligadura para clonar el producto de PCR en pET24a para formar pET24a-KDEL. A continuación se transformó el constructo pET24a-KEDL en células huésped (E. coli) para llevar a cabo una replicación en masa. Los productos de PCR replicados se confirmaron posteriormente mediante secuenciación.
2. Construcción de pET24a-2a-F2-KDEL
La secuencia de ADN 2a-F2 (SEQ ID NO: 5) obtenida en el Ejemplo 1 se amplificó por PCR. A continuación se muestran los cebadores PCR.
Cebador directo pF2-1 (con un sitio de restricción Sac I):
Sac I Cebador inverso pR2-1 (con un sitio de restricción Hind III):
Hind III
Las condiciones para la reacción PCR comprenden: 95ºC durante 5 minutos, 25 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 5 minutos para el alargamiento. El producto de PCR y el plásmido pET24a-KDEL se sometieron a una doble digestión por enzimas de restricción con Sac I y Hind III. Después se purificaron los productos de PCR y el plásmido pET24a-KDEL digeridos, respectivamente, a lo que siguió una ligadura para clonar el producto de PCR en pET24a-KDEL para formar pET24a-2a-F2-KDEL. A continuación se transformó el constructo en células huésped (E. coli) para llevar a cabo una replicación en masa. Los productos de PCR replicados se confirmaron posteriormente mediante secuenciación.
3. Construcción de pET24a-PE-2a-F2-KDEL
La secuencia de ADN que codifica la proteína PE (SEQ ID NO: 35) se muestra como SEQ ID NO: 34. La secuencia de ADN se amplificó por PCR. A continuación se muestran las secuencias de cebadores de especificidad de PE.
Cebador directo (con un sitio de restricción BamH I):
BamH I Cebador inverso (con un sitio de restricción EcoRI y un sitio de restricción Sac I)
EcoR I Sac I
Las condiciones para la reacción PCR comprenden: 94ºC durante 5 minutos, 30 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1,5 minutos, y 72ºC durante 7 minutos para el alargamiento. El producto de PCR y el plásmido pET24a-2a-F2-KDEL se sometieron a una doble digestión con enzimas de restricción con BamH I y Sac I. Después se purificaron los productos de PCR y el plásmido pET24a-2a-F2-KDEL digeridos, respectivamente, a lo que siguió una ligadura para clonar el producto de PCR en pET24a-2a-F2-KDEL para formar pET24a-PE-2a-F2-KDEL. A continuación se transformó el constructo pET24a-PE-2a-F2-KDEL en células huésped (E. coli) para llevar a cabo una replicación en masa. Los productos de PCR replicados se confirmaron posteriormente mediante secuenciación. La proteína de fusión antigénica PE-2a-F2-KDEL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y la secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión es SEQ ID NO: 40.
4. Expresión de proteína PE-2a-F2-KDEL
Se incubó en medio LB E. coli que contenía el plásmido pET24a-PE-2a-F2-KEDL. Mediante la adición de IPTG, se indujo al cultivo bacteriano a expresar la proteína de fusión antigénica PE-2a-F2-KEDL (SEQ ID NO: 41). En el Ejemplo 1 se describen procedimientos para la expresión y la extracción de la proteína.
Ejemplo 4 Análisis de secuencias de ORF2 de PCV2 de subgrupos diferentes
Además del subgrupo 2a, existen otros subgrupos del virus PCV2. A continuación se muestran, respectivamente, los análisis de los índices de arginina de las secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de ORF2 de PCV2 y las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADN desde el nucleótido 235 hasta el último nucleótido de ORF2 de PCV2 de los subgrupos de PCV2 2b, 2c, 2d y 2e.
Para el análisis filogenético de las SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 19 se utilizan como secuencias estándar secuencias génicas de ORF2 de PCV2 proporcionadas por Wang y col. (Wang y col., Virus Research 2009, Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2). Los resultados demuestran que las secuencias SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 19 de ORF2 de PCV2 pertenecen al subgrupo 2b de PCV2 y al subgrupo 2d de PCV2, respectivamente (como se muestra en la FIG. 1). Además, las secuencias SEQ ID NO:
50 y SEQ ID NO: 52 de ORF2 de PCV2 sirven de cepa estándar del subgrupo 2c de PCV2 y el subgrupo 2e de PCV2, respectivamente.
Los resultados de los análisis de secuencias del subgrupo 2b de PCV2 se muestran en la Tabla 3. El fragmento de ORF2 del subgrupo 2b de PCV2 (2b-ORF2) tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15 y la 5 secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Hay 21 residuos de arginina en las secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de 2b-ORF2, mientras que hay 10 residuos de arginina en las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) codificadas por los nucleótidos 235-699 (sin el codón de terminación, SEQ ID NO: 17) de 2b-ORF2. Los resultados de los análisis de las secuencias del subgrupo 2b de PCV2 concuerdan con los del subgrupo 2a de PCV2. Los índices de arginina en el extremo N de ambas
10 proteínas de ORF2 son dos veces o más los índices de arginina de la parte restante de las proteínas de ORF2 (como se muestra en las Tablas 2 y 3).
Tabla 3 Análisis de índices de arginina de la secuencia de aminoácidos de 2b-ORF2 de PCV2
Subgrupo PCV2-2b -nucleótidos 1-234
Subgrupo PCV2-2b -nucleótidos 235-699
Codón AGA AGG CGA CGC CGG CGT Aminoácido Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Cantidad 5 3 1 9 1 2
Codón AGA AGG CGA CGC CGG CGT Aminoácido Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Cantidad 5 1 0 3 0 1
Total 21
Total 10
Los resultados de los análisis de secuencias del subgrupo 2c de PCV2 se muestran en la Tabla 4. El fragmento
15 de ORF2 del subgrupo 2c de PCV2 (2c-ORF2) tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 50 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. Hay 20 residuos de arginina en las secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de 2c-ORF2, mientras que hay 10 residuos de arginina en las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 55) codificadas por los nucleótidos 235-702 (SEQ ID NO: 54) de 2c-ORF2. Los resultados de los análisis de las secuencias del subgrupo 2c de PCV2 concuerdan con los
20 del subgrupo 2a de PCV2 y el subgrupo 2b de PCV2. Los índices de arginina en el extremo N de las tres proteínas de ORF2 son dos veces o más los índices de arginina de la parte restante de las proteínas de ORF2 (como se muestra en las Tablas 2, 3 y 4).
Tabla 4 Análisis de índices de arginina de la secuencia de aminoácidos de 2c-ORF2 de PCV2
Subgrupo PCV2-2c -nucleótidos 1-234
Subgrupo PCV2-2c -nucleótidos 235-702
Codón AGA AGG CGA CGC CGG CGT Aminoácido Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Cantidad 5 3 0 9 1 2
Codón AGA AGG CGA CGC CGG CGT Aminoácido Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Cantidad 6 1 0 2 0 1
Total 20
Total 10
25 Los resultados de los análisis de las secuencias del subgrupo 2d de PCV2 se muestran en la Tabla 5. El fragmento de ORF2 del subgrupo 2d de PCV2 (2d-ORF2) tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Hay 21 residuos de arginina en las secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de 2d-ORF2, mientras que hay 10 residuos de arginina en las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 21) codificadas por los nucleótidos 235-702 (sin el
30 codón de parada, SEQ ID NO: 22) de 2d-ORF2. Los resultados de los análisis de secuencias del subgrupo 2d de PCV2 concuerdan con los del subgrupo 2a de PCV2, el subgrupo 2b de PCV2 y el subgrupo 2c de PCV2. Los índices de arginina en el extremo N de las cuatro proteínas de ORF2 son dos veces o más los índices de arginina de la parte restante de las proteínas de ORF2 (como se muestra en las Tablas 2, 3, 4 y 5).
Tabla 5 Análisis de índices de arginina de la secuencia de aminoácidos de 2d-ORF2 de PCV2
Subgrupo PCV2-2d -nucleótidos 1-234 Subgrupo PCV2-2d -nucleótidos 235-702
Codón
Aminoácido Cantidad
AGA
Arginina 5
AGG
Arginina 3
CGA
Arginina 1
CGC
Arginina 10
Codón
Aminoácido Cantidad
AGA
Arginina 4
AGG
Arginina 3
CGA
Arginina 0
CGC
Arginina 1
Subgrupo PCV2-2d -nucleótidos 1-234
Subgrupo PCV2-2d -nucleótidos 235-702
CGG CGT Arginina Arginina 0 2
CGG CGT Arginina Arginina 1 1
Total 21
Total 10
Los resultados de los análisis de las secuencias del subgrupo 2e de PCV2 se muestran en la Tabla 6. El fragmento de ORF2 del subgrupo 2e de PCV2 (2e-ORF2) tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 52 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Hay 20 residuos de arginina en las secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos 1-234 en el extremo 5’ de 2e-ORF2, mientras que hay 9 residuos 5 de arginina en las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 57) codificadas por los nucleótidos 235-699 (sin el codón de parada, SEQ ID NO: 56) de 2e-ORF2. Los resultados de los análisis de secuencias del subgrupo 2e de PCV2 concuerdan con los del subgrupo 2a de PCV2, el subgrupo 2b de PCV2, el subgrupo 2c de PCV2 y el subgrupo 2d de PCV2. Los índices de arginina en el extremo N de las cinco proteínas de ORF2 son dos veces o más los índices de arginina de la parte restante de las proteínas de ORF2 (como se muestra en las
10 Tablas 2, 3, 4, 5 y 6).
Tabla 6 Análisis de índices de arginina de la secuencia de aminoácidos de 2e-ORF2 de PCV2
Subgrupo PCV2-2e -nucleótidos 1-234
Subgrupo PCV2-2e -nucleótidos 235-699
Codón AGA AGG CGA CGC CGG CGT Aminoácido Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Cantidad 5 3 0 9 1 2
Codón AGA AGG CGA CGC CGG CGT Aminoácido Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Arginina Cantidad 4 2 0 2 0 1
Total 20
Total 9
Los niveles de expresión de proteína de los dominios ricos en arginina y los dominios no ricos en arginina del subgrupo 2b de PCV2, el subgrupo 2c de PCV2, el subgrupo 2d de PCV2 y el subgrupo 2e de PCV2 se analizan también por el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Los resultados concuerdan con los resultados del 15 Ejemplo 1. El nivel de expresión de proteína de los dominios ricos en arginina en el extremo N es bajo, mientras que el nivel de expresión de proteína del dominio no rico en arginina es alto. Además, el análisis de la adición
o deleción de la arginina muestra que la deleción de la arginina excesiva puede aumentar la expresión de proteínas de ORF2 de PCV2, lo que también concuerda con los resultados del subgrupo 2a de PCV2.
El dominio rico en arginina tiene una secuencia de aminoácidos de aproximadamente los residuos 1-78 en el
20 extremo N del péptido de longitud completa de ORF2 de PCV2 y el dominio no rico en arginina tiene una secuencia de aminoácidos aproximadamente desde el residuo 79 hasta el último residuo en el extremo C.
Ejemplo 5 Construcción y expresión de péptidos antigénicos de vacuna de subunidades de PCV2 2b
1. Construcción y expresión de pET24a-2b-F2
En este ejemplo se utilizó el gen de ORF2 del subgrupo 2b de PCV2 del Ejemplo 4 en la construcción del
25 péptido antigénico de la vacuna de subunidades de PCV2. Como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 3, el fragmento de F2 (nucleótidos 235-468 en el extremo 5’ de la secuencia de ADN de longitud completa del gen de 2b ORF2 de PCV2, fragmento 2b-F2) se clona en un vector de expresión. El fragmento 2b-F2 del subgrupo 2b de PCV2 tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. La secuencia de nucleótidos del fragmento 2b-F2 se amplificó por PCR. A continuación se muestran
30 los cebadores de la PCR.
Cebador directo pF-2b (con un sitio de restricción Sac I):
Sac I Cebador inverso pR-2b (con un sitio de restricción Hind III):
Hind III
Las condiciones para la reacción PCR comprenden: 95ºC durante 5 minutos, 25 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 5 minutos para el alargamiento. El producto de PCR y el vector de expresión pET24a (Novagen) se sometieron a una doble digestión por enzimas de restricción con Sac I y Hind III. Después se purificaron los productos de PCR y el vector de expresión pET24a digeridos, respectivamente, a lo que siguió una ligadura para clonar el producto de PCR en el vector de expresión pET24a para formar el plásmido pET24a-2b-F2. A continuación se transformó el constructo en células huésped (E. coli) para llevar a cabo una replicación en masa. Los productos de PCR replicados se confirmaron posteriormente por secuenciación. Se incubó en medio LB E. coli que contenía el plásmido pET24a-2b-F2. Mediante la adición de IPTG, se indujo al cultivo bacteriano a expresar la proteína antigénica 2b-F2 (SEQ ID NO: 18). En el Ejemplo 1 se describen procedimientos para la expresión y la extracción de la proteína.
2. Construcción y expresión de pET24a-PE-2b-F2-KDEL
Además de utilizar el péptido 2b-F2 como péptido antigénico de la vacuna de subunidades de PCV2, en este ejemplo se fusionaron la proteína PE y el péptido de señal KDEL con el péptido 2b-F2 en los extremos N y C, respectivamente, para producir la proteína de fusión recombinante PE-2b-F2-KDEL con el fin de inducir la suficiente inmunidad contra la infección por PCV2 en animales.
La proteína de fusión recombinante PE-2b-F2-KDEL tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 44 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. La estrategia para la construcción del plásmido que expresa la proteína de fusión recombinante PE-2b-F2-KDEL (pET24a-PE-2b-F2-KDEL) es la misma que la estrategia descrita en el Ejemplo 3. En primer lugar, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 30) que codifica el péptido de señal KDEL se clonó en un vector pET24a para formar el plásmido pET24a-KDEL. El procedimiento para la construcción del plásmido pET24a-KDEL se describe en el Ejemplo 3. Después, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 17) del fragmento 2b-F2 se clonó en el plásmido pET24a-KDEL para formar el plásmido pET24a-2b-F2-KDEL. Finalmente, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 34) que codifica la proteína PE se clonó en el plásmido pET24a-2b-F2-KDEL para formar el plásmido pET24a-PE-2b-F2-KDEL. El procedimiento para la construcción del plásmido pET24a-PE-2b-F2-KDEL se describe en el Ejemplo 3. A continuación, se incubó en medio LB E. coli que contenía el plásmido pET24a-PE-2b-F2-KDEL. Mediante la adición de IPTG, se indujo al cultivo bacteriano a expresar la proteína recombinante PE-2b-F2-KDEL (SEQ ID NO: 45). En el Ejemplo 1 se describen procedimientos para la expresión y la extracción de la proteína.
Ejemplo 6 Construcción y expresión de péptidos antigénicos de vacuna de subunidades de PCV2 2d
1. Construcción y expresión de pET24a-2d-F2
En este ejemplo se utilizó el gen de ORF2 del subgrupo 2d de PCV2 del Ejemplo 4 en la construcción del péptido antigénico de la vacuna de subunidades de PCV2. Como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 3, el fragmento de F2 (nucleótidos 235-468 en el extremo 5’ de la secuencia de ADN de longitud completa del gen de 2d ORF2 de PCV2, fragmento 2d-F2) se clona en un vector de expresión. El fragmento 2d-F2 del subgrupo 2d de PCV2 tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. La secuencia de nucleótidos del fragmento 2d-F2 se amplificó por PCR. A continuación se muestran los cebadores de PCR.
Cebador directo pF-2d (con un sitio de restricción Sac I):
Sac I Cebador inverso pR-2d (con un sitio de restricción Hind III):
Hind III
Las condiciones para la reacción PCR comprenden: 95ºC durante 5 minutos, 25 ciclos de 95º°C durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 5 minutos para el alargamiento. El producto de PCR y el vector de expresión pET24a (Novagen) se sometieron a una doble digestión con enzimas de restricción con Sac I y Hind III. Después se purificaron los productos de PCR y el vector de expresión pET24a digeridos, respectivamente, a lo que siguió una ligadura para clonar el producto de PCR en el vector de expresión pET24a para formar el plásmido pET24a-2d-F2. A continuación se transformó
el constructo en células huésped (E. coli) para llevar a cabo una replicación en masa. Los productos de PCR replicados se confirmaron posteriormente mediante secuenciación. Se incubó en medio LB E. coli que contenía el plásmido pET24a-2d-F2. Mediante la adición de IPTG, se indujo al cultivo bacteriano a expresar la proteína antigénica 2d-F2 (SEQ ID Bo: 22). En el Ejemplo 1 se describen procedimientos para la expresión y la extracción de la proteína.
2. Construcción y expresión de pET24a-PE-2d-F2-KDEL
Además de utilizar el péptido 2d-F2 como péptido antigénico de la vacuna de subunidades de PCV2, en este ejemplo se fusionaron la proteína PE y el péptido de señal KDEL con el péptido 2d-F2 en los extremos N y C, respectivamente, para producir la proteína de fusión recombinante PE-2d-F2-KDEL con el fin de inducir la suficiente inmunidad contra la infección por PCV2 en animales.
La proteína de fusión recombinante PE-2d-F2-KDEL tiene una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 48 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. La estrategia para la construcción del plásmido que expresa la proteína de fusión recombinante PE-2d-F2-KDEL (pET24a-PE-2d-F2-KDEL) es la misma que la estrategia descrita en el Ejemplo 3. En primer lugar, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 30) que codifica el péptido de señal KDEL se clonó en un vector pET24a para formar el plásmido pET24a-KDEL. El procedimiento para la construcción del plásmido pET24a-KDEL se describe en el Ejemplo 3. Después, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 21) del fragmento 2d-F2 se clonó en el plásmido pET24a-KDEL para formar el plásmido pET24a-2d-F2-KDEL. Finalmente, la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 34) que codifica la proteína PE se clonó en el plásmido pET24a-2d-F2-KDEL para formar el plásmido pET24a-PE-2d-F2-KDEL. El procedimiento para la construcción del plásmido pET24a-PE-2d-F2-KDEL se describe en el Ejemplo 3. A continuación, se incubó en medio LB E. coli que contenía el plásmido pET24a-PE-2d-F2-KDEL. Mediante la adición de IPTG, se indujo al cultivo bacteriano a expresar la proteína recombinante PE-2d-F2-KDEL (SEQ ID NO: 49). En el Ejemplo 1 se describen procedimientos para la expresión y la extracción de la proteína.
Ejemplo 7 Análisis de inmunogenicidad de péptidos antigénicos de la vacuna de subunidades de PCV2-1
1. Inmunización de ratones
Se preparó vacuna de subunidades de PCV2 con la proteína recombinante 2a-F2 (SEQ ID NO: 6) preparada en el Ejemplo 1 y la proteína recombinante PE-2a-F2-KDEL (SEQ ID NO: 41) preparada en el Ejemplo 3, respectivamente, y adyuvante completo de Freund. Se vacunaron ratones con la vacuna de subunidades de PCV2 para analizar la inmunogenicidad de los péptidos antigénicos de la vacuna de subunidades de PCV2.
Se dividieron aleatoriamente ratones sanos SPF de cinco a seis semanas de edad en 3 grupos de 3 ratones cada uno. Un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) mostró que los 9 ratones eran negativos para anticuerpos anti-PCV2. A cada ratón de los 2 grupos de vacunación (grupos 1 y 2) se le inyectaron vía intraperitoneal 100 µg de proteína recombinante. A los ratones del grupo 3 se les inyectó PBS y éstos sirvieron de control negativo. Dos semanas después de la inmunización primaria (i.p.), los ratones de los 2 grupos de vacunación recibieron como refuerzo la misma dosis de las 2 proteínas recombinantes diferentes, respectivamente. Se recogieron muestras de suero en las semanas 2, 4, 5 y 8 posteriores a la inmunización primaria. Todas las muestras de suero se ensayaron mediante ELISA para medir el título de anticuerpos anti-PCV2.
2. Detección de anticuerpos anti-PCV2 mediante ELISA
En este ejemplo se utilizaron como placas ELISA placas de noventa y seis pocillos que contenían antígeno de patógeno PCV2 (300 ng/pocillo). Las placas ELISA se lavaron 3 veces con 50 mmol/l de PBS (pH 7,2) que contenía 500 µl/l de Tween-20 (por ejemplo PBST) durante 3 a 5 minutos cada vez. Para bloquear las placas ELISA se añadieron 200 µl de solución de bloqueo de BSA al 0,15% a cada pocillo de las placas ELISA y a continuación se incubaron las placas ELISA durante 2 horas a 37ºC. Después se lavaron las placas ELISA con PBS. Las muestras de suero de ratón se diluyeron cincuenta veces (1:50) con PBS y a continuación se diluyeron en una relación de 1:2 en serie. Cada muestra tuvo 8 repeticiones. Las muestras de suero diluidas se añadieron a los pocillos de las placas ELISA (100 µl/pocillo) y las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Tras la incubación, las placas se lavaron con PBS. A continuación se añadió a los pocillos anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (FA). Después de incubar durante 1 hora a 37ºC, las placas se lavaron con PBS. Para visualizar los resultados se añadió a los pocillos para-nitrofenilfosfato (pNPP). Después de la incubación se detuvo la reacción añadiendo NaOH 1M. Se leyó la densidad óptica de cada pocillo utilizando densidad óptica a 405 nm. Cada muestra se analizó por duplicado y se calculó la media de los valores O.D. de los duplicados.
Los resultados del ELISA se muestran en la FIG. 6. La proteína recombinante PE-2a-F2-KDEL (SEQ ID NO: 41) induce en los animales ensayados un mayor nivel de anticuerpos séricos contra PCV2 que la proteína recombinante 2a-F2 (SEQ ID NO: 6). Existen importantes diferencias entre los niveles de anticuerpos séricos contra PCV2 en el Grupo 1 y el Grupo 2 en la semana 4 posterior a la inmunización primaria (p<0,05). Las diferencias entre los niveles de anticuerpos séricos contra PCV2 en el Grupo 1 y el Grupo 2 son más importantes en la semana 6 posterior a la inmunización primaria (p<0,01). Adicionalmente, en comparación con el nivel de anticuerpos del control negativo, los niveles de anticuerpos del Grupo 1 y el Grupo 2 son considerablemente mayores (p<0,01).
Ejemplo 8 Análisis de inmunogenicidad de péptidos antigénicos de la vacuna de subunidades de PCV2 -2
1. Inmunización de ratones
En este ejemplo. la inmunogenicidad de la proteína recombinante PE-2a-F2-KDEL aquí descrita memoria en animales sometidos a ensayo se compara con la inmunogenicidad del virus PCV2 íntegro en animales sometidos a ensayo.
Se produjo una vacuna de subunidades de PCV2 con la proteína recombinante PE-2a-F2-KDEL (SEQ ID NO: 41) preparada en el Ejemplo 3 y adyuvante de tipo oleoso Montanide ISA 206 (Seppic, Francia). Además, se produjo vacuna de virus PCV2 íntegro con virus PCV2 íntegro inactivado (106 TCID50/ml (TCID = dosis infecciosas de cultivo tisular) y adyuvante de tipo oleoso Montanide ISA 206 (Seppic, Francia). En una sola dosis de la vacuna de virus PCV2 íntegro hay 100 µl de virus PCV2 íntegro inactivado y 250 µl de adyuvante. Las dos vacunas se utilizaron para vacunar ratones.
Se dividieron aleatoriamente ratones sanos SPF de cinco a seis semanas de edad en 3 grupos de 5 ratones cada uno. Un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) mostró que los 15 ratones eran negativos para anticuerpos anti-PCV2. A cada ratón del Grupo 1 se le inyectó vía intraperitoneal 100 µg de proteína recombinante. A cada ratón del Grupo 2 se le inyectó vía intraperitoneal una sola dosis de vacuna de virus PCV2 íntegro. A los ratones del grupo 3 se les inyectó adyuvante de tipo oleoso Montanide ISA 206 y éstos sirvieron de control negativo. Tres semanas después de la inmunización primaria (i.p.), los ratones de los 2 grupos de vacunación recibieron como refuerzo la misma dosis de las 2 vacunas diferentes, respectivamente. Se recogieron muestras de suero en las semanas 0, 1, 2, 3, 4 y 5 posteriores a la inmunización primaria. Todas las muestras de suero se ensayaron mediante ELISA para medir el título de anticuerpos anti-PCV2.
2. Detección de anticuerpos anti-PCV2 mediante ELISA
El procedimiento ELISA para la detección de anticuerpos anti-PCV2 se describe en el Ejemplo 7. Los resultados del ELISA se muestran en la FIG. 7. La proteína recombinante PE-2a-F2-KDEL (SEQ ID NO: 41) induce un mayor nivel de anticuerpos séricos contra PCV2 en animales sometidos a ensayo que el antígeno de virus PCV2 íntegro inactivado. Existen importantes diferencias entre los niveles de anticuerpos séricos contra PCV2 en el Grupo 1 y el Grupo 2 en la semana 1 posterior a la inmunización primaria (p<0,001). Adicionalmente, en comparación con el nivel de anticuerpos del control negativo, el nivel de anticuerpos de los ratones vacunados con la proteína recombinante PE-2a-F2-KDEL (Grupo 1) es considerablemente mayor (p<0,001).
Además, se vacunaron cerdos con las proteínas recombinantes de 2a-F2 y PE-2a-F2-KDEL, respectivamente, y ambas proteínas recombinantes fueron capaces de inducir anticuerpos séricos contra PCV2 en los cerdos. Además, los cerdos vacunados fueron sometidos a una prueba de provocación con virus PCV2 para evaluar la eficacia de las proteínas recombinantes. En primer lugar se formularon las proteínas recombinantes como una vacuna de subunidades y se inyectaron las mismas a cerdos. A continuación se sometió a los cerdos a una prueba de provocación con virus PCV2. Los resultados muestran que los porcentajes de protección de los grupos de inmunización son mayores que los del control negativo (sin vacunación). Los porcentajes de protección utilizados aquí incluyen una disminución en la viremia y una mitigación de los síntomas del PCV2. Por tanto, los resultados demuestran que la vacuna de subunidades de PCV2 preparada con las proteínas recombinantes puede inducir eficazmente inmunidad en animales y aumentar su tasa de supervivencia.
Adicionalmente se prepararon proteínas de ORF2 o fragmentos del mismo del subgrupo 2b de PCV2, el subgrupo 2c de PCV2, el subgrupo 2d de PCV2 y el subgrupo 2e de PCV2 mediante los procedimientos descritos en los Ejemplos 1-3, respectivamente, y se analizó la inmunogenicidad de las proteínas de ORF2 o de los fragmentos del mismo mediante los procedimientos descritos en los Ejemplos 7 y 8. Los resultados muestran que los fragmentos de ORF2 de estos subgrupos de PCV2 (por ejemplo, fragmento F2) y las proteínas de fusión recombinantes de los mismos (por ejemplo, PE-F2-KDEL) pueden inducir inmunidad en animales (tales como cerdos) e impedir que éstos se infecten con PCV2.
La vacuna de subunidades de PCV2 proporcionada en la descripción tiene las siguientes ventajas, en comparación con otras técnicas convencionales.
La vacuna de subunidades de PCV2 proporcionada en la descripción se prepara por ingeniería genética, donde unos fragmentos de proteína de ORF2 de PCV2 que pueden expresarse altamente en sistemas de expresión biológicos se clonan y se utilizan como péptidos antigénicos de la vacuna de subunidades. La vacuna de subunidades puede inducir suficiente inmunidad contra la infección por PCV2 en animales y los fragmentos de proteína de ORF2 de PCV2 pueden producirse en masa mediante ingeniería genética para reducir el coste de fabricación de la vacuna.
Otra vacuna de subunidades de PCV2 proporcionada en la descripción contiene una proteína de fusión antigénica PE-F2-KDEL, que es una proteína recombinante de péptido F2 de ORF2 de PCV2, proteína PE y péptido de señal KDEL. Los experimentos con animales demuestran que esta vacuna de subunidades de PCV2 puede inducir eficazmente una mayor inmunidad contra la infección por PCV2 en animales.
La vacuna de subunidades proporcionada en la descripción se desarrolla por ingeniería genética y la vacuna tiene las ventajas de un proceso de producción sencillo, bajo coste, gran pureza, alto rendimiento y buena seguridad.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> SBC Virbac Biotech Co., Ltd.
<120> Vacuna de subunidades de circovirus porcino tipo 2 (PCV2)
<130> P14-0100
<150> US 61/567,248
<151> 2011-12-06
<150> PCT/CN2012/085907
<151> 2012-12-05
<160> 57
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 699
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 1
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> Circovirus porcino
<400> 2
<210> 3
<211> 234 10 <212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 3
<210> 4
<211> 78
<212> PRT
<213> Circovirus porcino
<400> 4
<210> 5
<211> 234
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 5
20 <210> 6
<211> 78
<212> PRT
<213> Circovirus porcino
25 <400> 6
<210> 7
<211> 231
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 7
<210> 8
<211> 77
<212> PRT 15 <213> Circovirus porcino
<400> 8
<210> 9
<211> 351
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 9
<210> 10
<211> 117
<212> PRT
<213> Circovirus porcino
<400> 10
5 <210> 11
<211> 465
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
10 <400> 11
<210> 12
<211> 155
<212> PRT
<213> Circovirus porcino
<400> 12
<210> 13
<211> 468
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 13
<210> 14
<211> 156 15 <212> PRT
<213> Circovirus porcino
<400> 14
<210> 15
<211> 702
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 15
<210> 16
<211> 233 15 <212> PRT
<213> Circovirus porcino
<400> 16
5 <210> 17
<211> 234
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
10 <400> 17
<210> 18
<211> 78
<212> PRT 15 <213> Circovirus porcino
<400> 18
<210> 19
<211> 705
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 19
15 <210> 20
<211> 234
<212> PRT
<213> Circovirus porcino
20 <400> 20
5 <210> 21
<211> 234
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
10 <400> 21
<210> 22
<211> 78
<212> PRT 15 <213> Circovirus porcino
<400> 22
10
<210> 23 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador directo para F1 de ORF2 de PCV2
15
<400> 23 cccaagcttg catgacgtat ccaaggaggc g 31
20
<210> 24 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador inverso para F1 de 2a ORF2 de PCV2
25
<400> 24 ccgctcgagg ggtttaagtg gggggtcttt a 31
30
<210> 25 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador directo para F2 de 2a ORF2 de PCV2
35
<400> 25 cccaagcttg ctttgttccc ccgggagggg g 31
40
<210> 26 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
45
<220> <223> Cebador inverso para F2 de 2a ORF2 de PCV2 <400> 26 ccgctcgagg taggagaagg gttgggggat t 31
50
<210> 27 <211> 31
<212> ADN <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Cebador directo para F3 de 2a ORF2 de PCV2
<400> 27 cccaagcttg ccactcccgg tactttaccc c 31
10
<210> 28 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Cebador inverso para F3 de 2a ORF2 de PCV2
20 25
<400> 28 ccgctcgagg tcgttaatat taaatctcat c 31 <210> 29 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador directo para F4 de 2a ORF2 de PCV2
30
<400> 29 cccaagcttg cggagtgggc tccactgctg t 31
35
<210> 30 <211> 48 <212> ADN <213> Escherichia coli
<400> 30 ctcaaaaaag acgaactgag agatgaactg aaagacgaac tgtaatga
48
40
<210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Escherichia coli
45
<400> 31
50
<210> 32 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial
55
<220> <223> Cebador directo para KDEL <400> 32 cccaagcttc tcaaaaaaga cgaactgaga gatgaactga aaga 44
60
<210> 33 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador inverso para KDEL
5
<400> 33 gtgctcgagc agttcgtctt tcagttcatc t 31
10
<210> 34 <211> 1116 <212> ADN <213> Pseudomonas aeruginosa
15
<300> <308> Genbank / K01397 <309> 2002-02-11 <313> (821)..(1936)
<400> 34
20 <210> 35
<211> 372
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
25 <400> 35
<210> 36
<211> 23
5
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
10
<223> Cebador directo para PE
<400> 36
cgggatccga agaagcgttc gac
23
-30
<210> 37
<211> 32
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso para PE
10 <400> 37 cggaattcga gctcgcaggt caggctcacc ac 32
<210> 38
<211> 28 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para F1 de 2a ORF2 de PCV2
<400> 38 cgagctcttt gttcccccgg gagggggg 28
<210> 39 25 <211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> Cebador inverso para F1 de 2a ORF2 de PCV2
<400> 39 cccaagcttg taggagaagg gttgggggat t 31
35 <210> 40
<211> 1413
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Secuencia de ADN combinada de PE, F2 de 2a ORF2 de PCV2, y KDEL
<400> 40
<210> 41
<211> 471 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos combinada de PE, F2 de 2a ORF2 de PCV2, y KDEL
<400> 41
<210> 42 5 <211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Cebador directo para F2 de 2b ORF2 de PCV2
<400> 42 cgagctcttt cttcccccag gagggggc 28
15 <210> 43
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Cebador inverso para F2 de 2b ORF2 de PCV2
<400> 43 cccaagcttg taggagaagg gctgggttat 30
<210> 44
<211> 1413
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de ADN combinada de PE, F2 de 2b ORF2 de PCV2, y KDEL
<400> 44
<210> 45
<211> 471 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos combinada de PE, F2 de 2b ORF2 de PCV2, y KDEL
<400> 45
<210> 46
<211> 28 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para F2 de 2d ORF2 de PCV2
<400> 46 cgagctcttt cttcccccag gagggggc 28
<210> 47 15 <211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Cebador inverso para F2 de 2d ORF2 de PCV2
<400> 47 cccaagcttg taggagaagg gctgggttat 30
25 <210> 48
<211> 1413
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30 <220>
<223> Secuencia de ADN combinada de PE, F2 de 2d ORF2 de PCV2, y KDEL
<400> 48
<210> 49
<211> 471 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos combinada de PE, F2 de 2d ORF2 de PCV2, y KDEL
<400> 49
<210> 50
<211> 705
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 50
<210> 51
<211> 234
<212> PRT 15 <213> Circovirus porcino
<400> 51
<210> 52
<211> 702
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 52
<210> 53
<211> 233
<212> PRT
<213> Circovirus porcino
<400> 53
<210> 54
<211> 471
<212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 54
10
<210> 55
<211> 156
<212> PRT
15
<213> Circovirus porcino
<400> 55
<210> 56
<211> 468 5 <212> ADN
<213> Circovirus porcino
<400> 56
<210> 57
<211> 155
<212> PRT 15 <213> Circovirus porcino
<400> 57

Claims (3)

  1. Reivindicaciones
    1. Composición inmunogénica de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2), que comprende un péptido antigénico seleccionado de uno de:
    a) un péptido no rico en arginina de un marco de lectura abierto 2 (ORF2) de PCV2 seleccionado 5 del grupo consistente en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57; o b) una proteína de fusión recombinante que comprende, desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo de la proteína de fusión recombinante: un péptido PE que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 35; 10 el péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 (a); y un péptido señal KDEL que tiene la secuencia de SEQ ID No: 31.
  2. 2. Composición inmunogénica de PCV2 según la reivindicación 1, que además comprende marcos de lectura abiertos (ORF) distintos del ORF2 del PCV2 y en la que los ORF distintos de ORF2 comprenden ORF1 y ORF3.
    15 3. Composición inmunogénica de PCV2 según la reivindicación 1, que además comprende al menos un antígeno de patógeno seleccionado del grupo consistente en un antígeno de virus de la gripe porcina (SIV), un antígeno de virus de síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), un antígeno de micoplasma, antígeno de parvovirus porcino (PPV), un antígeno de erisipela y un antígeno de virus de seudorrabia.
    20 4. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, que además comprende al menos un agente seleccionado del grupo consistente en vehículos, disolventes, emulsionantes, agentes de suspensión, agentes de descomposición, agentes de unión, excipientes, agentes estabilizantes, agentes quelantes, diluyentes, agentes gelificantes, conservantes, lubricantes, agentes tensioactivos, adyuvantes y portadores biológicos.
    25 5. Procedimiento para producir un fragmento de antígeno de PCV2, que comprende:
    disponer una secuencia de ADN que codifica un péptido no rico en arginina de un ORF2 de PCV2 en un sistema de expresión procariota, seleccionándose el péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 del grupo consistente en las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 57; y
    30 expresar la secuencia de ADN que codifica el péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 para obtener un fragmento de antígeno de la composición inmunogénica de PCV2.
  3. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, donde la secuencia de ADN que codifica el péptido no rico en arginina del ORF2 de PCV2 se selecciona del grupo consistente en las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 56.
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