UA113192C2 - Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2) - Google Patents

Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2) Download PDF

Info

Publication number
UA113192C2
UA113192C2 UAA201407508A UAA201407508A UA113192C2 UA 113192 C2 UA113192 C2 UA 113192C2 UA A201407508 A UAA201407508 A UA A201407508A UA A201407508 A UAA201407508 A UA A201407508A UA 113192 C2 UA113192 C2 UA 113192C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
pcm2
oke2
peptide
arginine
bek
Prior art date
Application number
UAA201407508A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48573551&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA113192(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed filed Critical
Publication of UA113192C2 publication Critical patent/UA113192C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
    • C12N2720/12122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
    • C12N2720/12134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується імуногенної композиції проти цирковірусу свиней типу 2 (PCV2), яка містить антигенний пептид, який є незбагаченим аргініном пептидом ORF2 з PCV2, або рекомбінантним химерним білком, що включає від аміно-кінця до карбоксильного кінця рекомбінантного химерного білка пептид РЕ, незбагачений аргініном пептид з ORF2 з PCV2, та сигнальний пептид KDEL. Винахід також стосується способу отримання фрагмента PCV2, що включає розташування послідовності ДНК, що кодує незбагачений аргініном пептид з ORF2 з PCV2, і експресію зазначеної послідовності ДНК з отриманням фрагмента антигену імуногенної композиції проти PCV2.

Description

(54) ІМУНОГЕННА КОМПОЗИЦІЯ ПРОТИ ЦИРКОВІРУСУ СВИНЕЙ ТИПУ 2 (РСМ2) (57) Реферат:
Винахід стосується імуногенної композиції проти цирковірусу свиней типу 2 (РСМУ2), яка містить антигенний пептид, який є незбагаченим аргініном пептидом ОКЕ2 з РСМ2, або рекомбінантним химерним білком, що включає від аміно-кінця до карбоксильного кінця рекомбінантного химерного білка пептид РЕ, незбагачений аргініном пептид з ОКЕ2 з РСУ2, та сигнальний пептид КОЕГ. Винахід також стосується способу отримання фрагмента РСМ2, що включає розташування послідовності ДНК, що кодує незбагачений аргініном пептид з ОКЕ2 з РСМ2, і експресію зазначеної послідовності ДНК з отриманням фрагмента антигену імуногенної композиції проти РСМ2.
ТЕО ІК КОМУ КМИМЕ
УК дах Кк
ЯК декана кв БЕ ХК ЕК, ще 4 4 як шк 7 т.і «Ще маше сх 5 м З аж Е Ж Еос -у є ши :
ШО, щ ш
В щ « ше З ев ЩА | : щі І. / в ї ЩЕ Я Ї Є ШКО : ЗННННа : рес 5 Її ї ЗЕ - ВШНЕЕ «ЗБЕ ї БОШ ї
Ви вк» с НИЙ "раз 5 ШЕ ШЕ
КУ : ЕВ "Ж І | І що І В . ітнжоень БВ; Тен У ВВ
ЗБ ж аикя
ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ
1. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Даний винахід відноситься до субодиничної вакцини проти цирковірусу свиней типу 2 (РСМУ2), конкретно, до субодиничної вакцини проти РСМ2, що містить пептид відкритої рамки зчитування (ОКЕ2) з РСМ2, який може надмірно експресуватися у якості антигена, і додатково придатний носій або ад'ювант. 2.ОПИС РІВНЯ ТЕХНІКИ
Відомо, що цирковірус свиней типу 2 (РСМ2) пов'язаний з синдромом мультисистемного виснаження після відлучення (РМУМУ5) і синдромом дерматиту і нефропатії у свиней (РОМ5). РМУМУЗ вперше був виявлений у свиней в Канаді в 1991 році, а згодом було повідомлено про його зустрічальність в усьому світі. Синдром призвів до великої втрати в свинарській індустрії у всьому світі. Головні симптоми РМУУЗ включають прогресуючу втрату ваги, тахіпное, диспное, розлиття жовчі і т. д. Візуальні патологічні зміни в тканині включають лімфоцитарний та гранулематозний інфільтрат, лімфаденопатію, лімфоцитарний та гранулематозний гепатит і нефрит.
Цирковірус свиней (РСМ) вперше був виявлений в лінії клітин нирки свині (РК-15, АТОС
ССІ 33) в 1982 році. Хоча цирковірус свиней може постійно інфікувати клітини РК-15, вірус не спричиняє цитопатичного ефекту (СРЕ) в інфікованих клітинах РК-15. Навіть, незважаючи на те, що цирковірус свиней може інфікувати свиней, він не призводить до уражень в інфікованих свиней. Вірус назвали цирковірусом свиней типу 1 (РСМІ1). РСМ1 є дванадцятигранним вірусом з одноланцюговою ДНК з кільцевим геномом з 1759 п. о. Отриманий з РК-15 РСМ класифікували в сімейство С/сомігідає в 1995 році.
Отриманий з РК-15 РСМ1 вважається апатогенним. На відміну від цього, вірусний мутант, виділений із свиней з РМУУЗ в 1997 році, є патогенним і називається цирковірус свиней типу 2 (РСМ2). Синдром мультисистемного виснаження після відлучення (РММУУ5) є високо контагіозним захворюванням свиней. Він головним чином інфікує поросних свиноматок та їх поросят і серйозно впливає на здоров'я свиней.
РСМ2 є вірусом з одноланцюговою кільцевою ДНК діаметром 17 нм, і розмір його геному складає 1,76 т. н. Геномний аналіз за допомогою програмного забезпечення показує сумарно 11
Зо відкритих рамок зчитування (ОРЕ), що транскрибуються в напрямках за годинниковою стрілкою та проти годинникової стрілки. Серед 11 ОРЕ, ОКЕ1 і ОКЕ2 імовірно являють собою найбільш важливі гени. Ген ОКЕ1 кодує білки Кер і Кер/', які пов'язані з реплікацією вірусу. Відомо, що ген
ОМЕ2 кодує імуногенний структурний білок капсида з РСМ2, який застосовують для індукції імунної відповіді в організмів.
Інактивована вакцина проти РСМ2 є найбільш розповсюдженою комерційно доступною вакциною проти РСМ2. Однак розробка інактивованої вакцини потребує, щоб лінії клітин не містили забруднювача, а можливість неповної інактивації вірусу за допомогою хімічних реактивів є найбільш значним недоліком інактивованої вакцини. Іншим недоліком є те, що антигенні структури вірусу можуть бути змінені шляхом хімічної обробки, що призведе до неможливості індукції достатньої імунної відповіді для знищення вірусу і неможливості захисту свиней від інфікування захворюванням. Таким чином, розробка інактивованої вакцини може бути складною і дорогою, а безпека вакцини може викликати питання.
На відміну від інактивованої вакцини, в якій цілий вірус є вакцинним антигеном, в субодиничній вакцині застосовують частину білків із патогена у якості білка-антигена і білок- антиген уводять щепленням тваринам або людям для індукції імунітету. Субодиничну вакцину можна отримувати шляхом клонування генів, що кодують білки-антигени з патогенів, а потім отримання великих кількостей білків-антигенів за допомогою генної інженерії. Безпека є найбільш значною перевагою субодиничної вакцини, оскільки в ній застосовують частини патогена замість цілого патогена для щеплення свиней з відсутністю проблеми неповної інактивації. В традиційній субодиничній вакцині проти РСУ2 застосовують білок ОМЕ2 з РСУ2 у якості білка-антигена; тим не менш, рівень експресії повнорозмірного більюла ОКЕ2 з РСМ2 в прокаріотичних системах експресії є достатньо низьким і не відповідає вимогам отримання вакцини. Таким чином, розробка фрагментів антигена з ОКЕ2 з РСМ2, які можуть характеризуватися високим рівнем експресії в біологічних системах експресії, доцільна для комерційного застосування субодиничної вакцини проти РСМУ2.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Дане розкриття відноситься до послідовностей ДНК, що кодують фрагменти білка з ОРМЕ2 з
РСМ2, і фрагменти білка з ОКЕ2 з РСМ2 можуть характеризуватися високим рівнем експресії в біологічних системах експресії. бо Дане розкриття також відноситься до субодиничної вакцини проти РСМ2, в якій фрагменти білка з ОКЕ2 з РСМ2, які можуть характеризуватися високим рівнем експресії в біологічних системах експресії, застосовують в якості білків-антигенів для введення щепленням тваринам для індукції відповідного імунітету проти інфекції РСМ2 у тварин.
Дане розкриття додатково відноситься до субодиничної вакцини, розробленої шляхом генної інженерії для отримання за допомогою простого способу недорогої, високоочищеної, з хорошим рівнем безпеки субодиничної вакцини проти РСМ2.
У зв'язку з тим фактом, що рівень експресії повнорозмірного більюьа ОКЕ2 з РСМ2 в біологічних системах експресії є достатньо низьким, для досягнення зазначених вище цілей застосовують генну інженерію. Послідовності ДНК (такі як 5ЕО ІЮ МО: 1), які кодують повнорозмірні білюи ОКЕ2 з РСМ2, розрізали на фрагменти різних розмірів і фрагменти ДНК вставляли в вектори експресії а потім експресували в хазяїнах. Вимірювали рівні експресованих білків для визначення того, які фрагменти ДНК можуть давати високі рівні білків в системах експресії білків.
Результати аналізу білкової послідовності і досліджень експресії білка показують, що в повнорозмірному білюу ОКЕ2 з РСМ2 є приблизно 30 аргінінів, з яких щонайменше дві треті аргінінів виявлені на М-кінці білка ОМЕ2 з РСМ2, і що чим більша кількість аргінінів на М-кінці буде видалена, тим вище буде рівень експресії фрагмента білка ОКЕ2. Крім того, після того як перші 234 нуклеотиди на 5'-кінці повнорозмірної послідовності ДНК з ОКЕ2 з РСМ2 були видалені, фрагмент білка, що кодується фрагментом ДНК, що залишився (тобто від нуклеотиду 235 на 5"-кінці до стоп-кодона), можна експресувати у великому масштабі.
Внаслідок цього, субодинична вакцина проти РСМ2, представлена в даному розкритті, містить антигенний пептид з РСМ2 з придатним носієм або ад'ювантом. Антигенний пептид може експресуватися в великому масштабі в системах експресії і є незбагаченим аргініном пептидом з ОКЕ2 з РСМ2. Кількості аргінінів незбагаченого аргініном пептиду з ОКЕ2 з РСМ2 складають не більше половини (1/2) кількостей аргінінів збагаченого аргініном домену на М-кінці повнорозмірного ОКЕ2 з РСМ2. В одному варіанті здійснення, якщо число аргінінів збагаченого аргініном домену на М-кінці повнорозмірного ОКЕ2 з РСМ2 складає 20, то число аргінінів незбагаченого аргініном пептиду з ОКЕ2 з РСМУ2 становить одне з цілих чисел від 0 до 10. В іншому варіанті здійснення, якщо число аргінінів збагаченого аргініном домену на М-кінці
Зо повнорозмірного ОМЕ2 з РСУ2 складає 21, то число аргінінів незбагаченого аргініном пептиду з
ОКРЕ2 з РСУ2 становить одне з цілих чисел від 0 до 10. В ще одному варіанті здійснення, якщо число аргінінів збагаченого аргініном домену на М-кінці повнорозмірного ОКЕ2 з РСМ2 складає 22, то число аргінінів незбагаченого аргініном пептиду з ОКЕ2 з РСМУ2 становить одне з цілих чисел від О до 11.
В одному варіанті здійснення збагачений аргініном домен характеризується залишками 1-78 на М-кінці повнорозмірного ОКЕ2 з РСМ2 (який кодується нуклеотидами 1-234 на 5'-кінці повнорозмірної послідовності ДНК з ОКЕ2 з РСУ2). В одному варіанті здійснення збагачений аргініном пептид характеризується пептидною послідовністю від залишку 79 до останнього амінокислотного залишку на С-кінці повнорозмірного ОКЕ2 з РСМ2 (який кодується послідовністю ДНК від нуклеотиду 235 на 5'-кінці до стоп-кодона на 3'-кінці повнорозмірної послідовності ДНК з ОКРЕ2 з РСМУ2).
Розкритий в даному документі ОКЕ2 з РСМУ2 має повнорозмірну пептидну послідовність, що характеризується щонайменше 8095, переважно 8595, більш переважно 9095, ще більш переважно 9195, 9295, 93905, 94905, 9595, 9695, 9795, 9890 або 9995 гомології з однією з хЕО ІЮ МО: 2, ЗБО ІЮО МО: 16, 5БЕО ІЮО МО: 20, 5БО ІО МО: 51 ї 5ЕО ІО МО: 53. У переважному варіанті здійснення розкритий в даному документі ОКЕ2 з РСМ2 характеризується повнорозмірною пептидною послідовністю однією з ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 20, 5ЕО ІЮ МО: 51 і ЗЕО ІЮ МО: 53.
На додаток до цього, дане розкриття відноситься до химерного білка ОКЕ2 з РСМ2 в якості антигенного пептиду із застосуванням функціональних елементів рецептор-зв'язувального домену І і трансмембранного домену ІІ, що націлює, екзотоксину А з Рзепйотопаз аегидіпоза (тобто "білка РЕ") і сигналу затримки в ендоплазматичному ретикулумі (ЕК) (тобто "сигнального пептиду КОЕГ".
Білок РЕ з Рзхеййотопаз аєгидіпоза можна застосовувати в якості гіда цільового білка до його цільового положення, згідно з наведеним далі способом. Спочатку, рецептор- зв'язувальний домен екзотоксину А з Рехеййотопаз аегидіпоза забезпечує зв'язування з рецепторами на мембрані клітин-мішеней (СОв8' Т-клітин), а потім ліганд-рецепторні комплекси проникають в ендосоми клітин-мішеней шляхом ендоцитозу. Після ферментативного відщеплення за допомогою протеази в ендосомах укорочені фрагменти білка (що містять бо трансмембранний домен, що націлює, і зв'язаний цільовий білок) доставляються в тільця
Гольджі та ендоплазматичний ретикулум (ЕК) і далі переміщуються в цитоплазму клітин- мішеней за допомогою трансмембранного домену, що націлює.
Крім того, при приєднанні сигнального пептиду КОЕГЇ. на С-кінець цільового білка цільовий білок буде транспортуватися в ЕК за допомогою сигнального пептиду КОЕЇ, а потім взаємодіяти в ЕК.
Таким чином, дане розкриття відноситься до химерного білка ОКЕ2 з РСМ2 в якості антигенного пептиду шляхом застосування функціональних елементів білка РЕ і сигнального пептиду КОЕЇ. Білок РЕ і сигнальний пептид КОЕЇ зливають з фрагментом білка ОКЕ2 з РСМ2 на М- та С-кінцях, відповідно, з отриманням химерного білка (РЕ-фрагмент ОМКЕ2-КОЕЇ) для введення щепленням тваринам з метою індукції достатньої імунної відповіді проти інфекції
РСУ?2 у тварин.
В деяких варіантах здійснення застосовувані в даному документі антигенні пептиди включають без обмежень фрагменти ОКЕ2 з РСМ2. Фрагменти ОКЕ2 мають пептидну послідовність, що характеризується щонайменше 8095, переважно 8595, більш переважно 9095, ще більш переважно 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9690, 9795, 9895 або 9995 гомології з однією з
ЗЕОІО МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО І МО: 12, 5ЕО ІЮО МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 22,
ЗЕО ІЮО МО: 55 та 5ЕО ІЮО МО: 57. В переважному варіанті здійснення фрагменти ОКЕ2 з РСМ2 мають пептидну послідовність однієї з «ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІРО МО: 18, 5ЕО ІЮО МО: 22, 5ЕО ІЮ МО: 55 та 5ЕО ІЮО МО: 57, і були отримані за допомогою генної інженерії. Послідовності ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 5, 7, 9, 11, 17, 21, 54, 56), що кодують фрагменти ОКЕ2 з РСМ2, клонували в вектори експресії з отриманням плазмід, що містять фрагмент ДНК, який кодує антигенний пептид. Плазміди потім трансформували в клітини-хазяїни для експресії антигенних пептидів.
Розкриті в даному документі химерні білки (РЕ-фрагмент ОКЕ2-КОЕЇ) отримували за допомогою генної інженерії. Послідовності ДНК (5ЕО ІЮ МО: 5, 7, 9, 11, 17, 21, 54, 56), що кодують фрагменти ОКЕ2 з РСУ2, послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 34), що кодує білок РЕ, і послідовність ДНК (5ЕО ІО МО: 30), що кодує сигнальний пептид КОЕГ, клонували у вектори експресії з отриманням плазмід, які містять фрагмент ДНК, що кодує химерний білок. Плазміди потім трансформували в клітини-хазяїни для експресії химерних білків.
Зо Вектори експресії включають без обмеження вектори рЕТ і вектори рОЕХ. В одному варіанті здійснення вектором експресії є рЕТ24а. Системи експресії (клітини-хазяїни) включають без обмеження прокаріотичні системи експресії (такі як ЕвсНепсніа сої), еукаріотичні системи експресії (такі як клітини тварин (наприклад, клітина СНО) і клітини рослин). В одному варіанті здійснення системою експресії є Е. со).
Ад'ювант включає без обмеження водний ад'ювант (такий як гідроксид алюмінію), алюмокалієвий галун, неповний ад'ювант Фрейнда, масляний ад'ювант, розчинний у воді ад'ювант або ад'ювант за типом емульсії "вода-в-маслі-у-воді" (МИ/ОЛЛ). В одному варіанті здійснення ад'ювантом є масляний ад'ювант.
Розкрита в даному документі імуногенна композиція додатково містить антигенні пептиди з інших ОРЕ з РСМ2. Інші ОКЕ з РСМУ2 включають без обмеження ОРЕ1 та ОРЕЗ3. На додаток до цього, розкрита в даному документі імуногенна композиція додатково містить патогенний антиген. Патогенний антиген обраний з групи, що включає антиген вірусу свинячого грипу (ІМ), антиген вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РКК5БУ), антиген мікоплазми, антиген парвовірусу свиней (РРМ), антиген бешихи свиней і антиген вірусу псевдосказу (хвороби Ауєскі).
На додаток до цього, розкрита в даному документі імуногенна композиція додатково містить одне або декілька з наступного: наповнювачі, розчинник, емульгатор, суспендуючий засіб, засіб для розкладання, зв'язувальний засіб, середовище для ліків, стабілізуючий засіб, хелатоутворюючий засіб, розріджувач, загусник, консервант, засіб, що обумовлює плинність, поверхнево-активну речовину, ад'ювант і біологічні носії.
Значення технічних і наукових термінів, які описані в даному документі, зможе легко зрозуміти кожний фахівець в даній галузі.
Даний винахід більш докладно описаний у наведених далі ілюстративних прикладах. Хоча приклади можуть являти собою тільки обрані варіанти здійснення даного винаходу, слід розуміти, що наведені далі приклади є ілюстративними, а не обмежуючими.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
На фіг. 1 представлені результати філогенетичного аналізу геномних послідовностей РСМ2.
На фіг. 2 проілюстрована схематична діаграма фрагментів ОКЕ2 з РСМ2, в яких праймерами для ПЛР є ре, рЕ2, рЕЗ, рЕ4, рК1, ркКа2 та рК3. бо На фіг. З показані результати аналізу ЗХО5-РАСЕ рекомбінантних білків різних фрагментів
2га-ОКЕ2 з РСУ2, експресованих в Є. со). Цілі білки Є. со// збирали через 6 годин після індукції за допомогою ІРТО і потім розділяли за допомогою 1595 505-РАСЕ, в якому доріжки 1-9 показують маркери молекулярної ваги, порожній вектор рЕТ24а (в якості негативного контролю), фрагмент ОКЕ2 2а-Е1 з РСУ2 (12,7 кДа), фрагмент ОВЕ2 г2а-Е2 з РСУ2 (11,6 кДа), фрагмент
ОВЕ2 2а-ЕЗ з РСУ?2 (12,1 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Е4 з РСУ?2 (16,5 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Е5 з
РСМ2 (21,4 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Еб з РСУ?2 (20,8 кДа) і повнорозмірний 2а-ОКЕ2 з РСУ2 (27,5 кДа), відповідно.
На фіг. 4 представлені результати вестерн-блотингу рекомбінантних білків різних фрагментів 2а-ОКЕ2 з РСМ2. Доріжки 1-9 показують маркери молекулярної ваги, порожній вектор рЕТ24а (в якості негативного контролю), фрагмент ОКЕ2 2а-Е1 з РСМ2 (12,7 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Е2 з РСМУ2 (11,6 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-ЕЗ з РСМ2 (12,1 кДа), фрагмент
ОВЕ2 2а-Е4 з РСУ?2 (16,5 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Е5 з РСУ2 (21,4 кДа), фрагмент ОКЕ2 2а-Е6 з
РСМ2 (20,8 кДа) і повнорозмірний 2а-ОКЕ2 з РСМ2 (27,5 кДа), відповідно.
На фіг. 5 представлені результати ЕГІЗА РСУМ2 зразків сироватки, зібраних в різні моменти часу у щурів, вакцинованих рекомбінантними білками різних фрагментів 2а-ОКЕ2 з РСМ2, відповідно. ", р « 0,05. (РІ: після імунізації; РВ: після бустер-ін'єкції)
На фіг. 6 проілюстровані результати ЕГІБА РСУМ2 зразків сироватки, зібраних в різні моменти часу у мишей, вакцинованих рекомбінантними білками фрагмента 2а-Р2 і рекомбінантними білками фрагмента РЕ-2га-Р2-КОЕЇ,, відповідно. ", р «0,05; ра 015, раб 001 Я, ра 0,05;
Я, р 001 ЯН, рок 0,001. (РІ: після імунізації; РВ: після бустер-ін'єкції).
На фіг. 7 показані результати ЕГІ5А РСУМ?2 зразків сироватки, зібраних в різні моменти часу у мишей, вакцинованих рекомбінантними білками фрагмента РЕ-2га-Р2-КОЕЇ і вакциною з цілим вірусом РСМ2, відповідно. 7, р«0,0557, раб, р«0001;9, рак005; й ра ОН рік 0,001. (РІ: після імунізації; РВ: після бустер-ін'єкції)
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ПЕРЕВАЖНОГО ВАРІАНТА ЗДІЙСНЕННЯ
Приклад 1. Будування та визначення антигенних пептидів субодиничної вакцини проти РСМ2
У зв'язку з тим фактом, що рівень експресії повнорозмірного більюьа ОКЕ2 з РСМ2 в біологічних системах експресії є досить низьким, послідовності ДНК, що кодують повнорозмірні білки ОКЕ2 з РСМ2, розрізали на фрагменти різних розмірів і фрагменти ДНК вбудовували в
Зо вектори експресії, а потім експресували в хазяїнах. Рівні експресованих білків вимірювали для визначення того, які фрагменти ДНК можуть давати високі рівні білків в білкових системах експресії.
Широко застосовувану прокаріотичну систему експресії (ЕзсПепісніа сої) застосовували у наведених далі прикладах для аналізу і в ілюстративних цілях. 1. Ампліфікація фрагментів гена ОКЕ2 з РСМ2 різних розмірів
Повнорозмірний ген ОКЕ2 з РСМ2, застосовуваний в даному прикладі, характеризується послідовністю 5ЕО ІО МО: 1. Послідовності гена ОКРЕ2 з РСМ2, представлені у УМапо еї аї. (ММапд еї аї., Міги5 Везєагсі 2009, Сепеїїс мапайоп апаїувів ої Спіпезе в5ігаіп5 ої рогсіпе сігсоміги5 їуре 2.3, застосовували в якості стандартних послідовностей для філогенетичного аналізу ЗЕО ІЮ
МО: 1. Результат показав, що послідовність ОМЕ2 з РСМ2 (5ЕО ІЮО МО: 1) належить до підгрупи
РСМ2 2а (яка показана на фіг. 1). Праймери (які описані в таблиці 1) призначені для ампліфікації фрагментів різних розмірів гена ОКЕ2 з РСМ2 2а (2а-ОКЕ2) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Як показано на фіг. 2, повнорозмірний ген 2а-ОКЕ2 ампліфікували за допомогою специфічних праймерів рЕї (прямий праймер) і рК1 (зворотний праймер) шляхом ПЛР.
Повнорозмірний ген 2га-ОВЕ2 (2а-ОКЕг2) характеризується послідовністю ДНК 5ЕО ІЮО МО: 1, а фрагменти різних розмірів 2а-ОКЕ2 з РСМУ2 називали 2а-Е1, 2а-Е2, 2а-Е3, 2а-Е4, 2а-Е5 і 2а-Еб, відповідно. Фрагмент 2а-Е1 характеризується послідовністю ДНК 5ЕБО ІО МО: 3, яка є нуклеотидами 1-234 на 5'-кінці 2а-ОКЕ2. Фрагмент 2а-Е2 характеризується послідовністю ДНК
ЗБО ІО МО: 5, яка є нуклеотидами 235-468 на 5-кінці 2а-ОКЕ2. Фрагмент 2а-ЕЗ характеризується послідовністю ДНК 5ЕО ІЮО МО: 7, яка є нуклеотидами 469-699 на 5'-кінці 2а-
ОРЕ2. Фрагмент 2а-Е4 характеризується послідовністю ДНК ЗЕО ІЮО МО: 9, яка є нуклеотидами 349-699 на 5-кінці 2а-ОКЕ2. Фрагмент 2а-Е5 характеризується послідовністю ДНК 5ЕО ІЮ МО: 11, яка є нуклеотидами 235-699 на 5-кінці 2а-ОКЕ2. Фрагмент 2а-Еб характеризується послідовністю ДНК 5ЕО ІЮ МО: 13, яка є нуклеотидами 1-468 на 5-кінці 2а-ОКЕ2. Усі прямі праймери містили сайт рестрикції Ніла ІІ, а всі зворотні праймери містили сайт рестрикції Хо І.
Таблиця 1. Перелік послідовностей праймерів для ампліфікації фрагментів гена ОРЕ2 з
РСУМ?2 різних розмірів
Фрагмент Праймер Послідовність примітка ре Прямий со ТОсАТОдовтТАТОСАЛОСА ФЕО ІЮ МО: 23
ОВЕ2 праймер ву Зворотний СсСссеастодвАа,аасатттААлатасавас!то ФЕО ІЮ МО: 24
Р праймер /ТТТА '
Прямий СССАдастТасСАТаАСаТтАТССААСааА , ві ре праймер сесе ЗЕО І МО: 23
Зворотний СсСсастоадаатТсСсТТААТАТТАААТСТС , раз праймер АТС ЗЕО І МО: 28
Прямий СсСАдастасттагпососСв,асАС , щ рег праймер сесе ЗЕО І МО: 25
Зворотний СсСсаСтодвсАЧватАаасАсаАА,аасТТацва , рнаг праймер ССАТТ ЗЕО ІЮ МО: 26
Прямий СССАдасттассСАСТоССааЙтТАСТТТАС , щ рез праймер сос ЗЕО ІЮ МО: 27
Зворотний СсСссеастодвАа,аасатттААлатасааваИ!то , рА!1 праймер ТІТА ЗЕО ІЮ МО: 24
Прямий СССсАдасттасСса,асАаатавасТССАСТа , га рг4 праймер стет ЗЕО І МО: 29
Зворотний сссстосХдасасТттТААдатТасоаоаТо , рА!1 праймер ТІТА ЗЕО ІЮ МО: 24
Прямий СсСАдастасттагпососСв,асАС , й рег праймер сесе ЗЕО І МО: 25
Зворотний СсСссестодвАа,аасатттААлатасааваИ!то , рА!1 праймер ТІТА ЗЕО ІЮ МО: 24
Прямий СССАдастТасСАТаАСаТтАТССААСааА , вв ре праймер сесе ЗЕО І МО: 23
Зворотний ссастосвдастТАаасАадлдаваттавоа , рнаг праймер ССАТТ ЗЕО ІЮ МО: 26
Примітка: послідовності, позначені знизу " ", є послідовностями сайту рестрикції Ніла (ААОСТТ), а послідовності, позначені знизу" (/", є послідовностями сайту рестрикції Хно (СТСОАС).
Умови для реакції ПЛР включали 957С протягом 5 хвилин, 25 циклів 957С протягом 30 секунд, 55"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 5 хвилин для елонгації. Розміри продуктів ПЛР 228-ОВЕ2, 2а-Е1, 2а-Е2, 2а-Е3, 2а-Е4, г2а-Е5 і 2а-Е6 становили 699п.0.,234п.0.,234п.0.,231п1.0.,351п.0.,4651п1..0. і 468 п. о., відповідно, і підтверджені за допомогою електрофорезу в 295 агарозному гелі. Після підтвердження, продукти ПЛР очищали за допомогою набору для очищення РСЕ-М (Міодепе). 2. Будування плазмід рЕТ24а, що містять фрагменти ОКЕ2 з РСУМ2 різних розмірів.
Один (1) мкг очищених продуктів ПЛР і 1 мкг вектора експресії рЕТ24а (Момадеп) розщеплювали за допомогою двох ферментів рестрикції (Мем Епдіапа Віоїаб5) 1 мкл Н/ла! ЦІ ї 1 мкл Хло І, відповідно, протягом 8 годин при 37"С. Після реакції розщеплення за допомогою ферментів рестрикції розщеплені продукти ПЛР і вектор експресії рЕТ24 очищали за допомогою системи РСК-М СіІвап ир Зубіет (Міоодепе), відповідно. Очищені продукти ПЛР лігували з очищеним вектором експресії рЕТ24а з отриманням плазмід рЕТ24а-2а-Е1, рЕТ24а-г2а-Е2, рЕТ24а-га-ЕЗ3, рЕТ24а-га-Е4, рЕТ24а-2да-Е5, рЕТ24а-г2а-Е6 і рЕТ24а-2га-ОКН2, а потім плазміди трансформували в клітини-хазяїни (Е. со/). Відбирали трансформантів, що містять продукти
ПЛР, і послідовності ДНК підтверджували за допомогою секвенування ДНК. Потім отримували бактерії, що містять зазначені вище плазміди. 3. Експресія білка і підтвердження фрагментів ОКЕ2 з РСУ?2 різних розмірів
Бактерії, що містять зазначені вище плазміди, інкубували в 2 мл середовища І В при 377 протягом 16-18 годин і потім інокулювали в співвідношенні 1:50 в середовище І В, що містить 25 мкг/мл канаміцину, для наступного інкубування при 37"С в інкубаторі з 200 об./хв. до тих пір, поки О.О. при 600 нм не становила 0,6. Після цього, В-Ю-тригалактозид (ІРТО) додавали до кінцевої концентрації 1 мМ і клітини-хазяїни Є. со//; інкубували при 37"С в інкубаторі з 200 об./хв. протягом ще б годин. Потім 1 мл клітин хазяїнів Е. со// центрифугували при 10000х9, і осад обробляли шляхом В-РЕКТМ Васієгіа! Ргоївеіп Ехігасіоп (придбаним у РІЕКСЕ) для перевірки того, чи є рекомбінантні білки розчинними білками або знаходяться в тільцях включення, за допомогою наступних етапів. Осад додавали в 40 мкл реагенту, перемішували за допомогою вортексного шейкера протягом 1 хвилини і центрифугували при 10000 худ для відділення розчинних білків (верхня частина) від нерозчинних тілець включень (нижня частина). Розчинні білки розчиняли в їх буфері для розведення зразка для 5О0О5-РАСЕ, а осад додавали в 2х буфера для розведення зразка для 505-РАСЕ. Зразки поміщали в термоблок з температурою 1002С на 20 хвилин, а потім центрифугували. Супернатант аналізували за допомогою 1595 505-
РАСЕ для вимірювання експресії рекомбінантних білків.
Рекомбінантні білки отримували шляхом індукції бактеріальної культури за допомогою ІРТО.
Рекомбінантний білок 2а-ОКЕ2 характеризується амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 2.
Рекомбінантний білок 2а-Е1 характеризується амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 4.
Рекомбінантний білок 2а-Е2 характеризується амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 6.
Рекомбінантний білок 2га-ЕЗ характеризується амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 8.
Рекомбінантний білок 2а-Е4 характеризується амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 10.
Рекомбінантний білок 2а-Е5 характеризується амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 12.
Рекомбінантний білок 2а-Е6 характеризується амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 14.
Експресію рекомбінантних білків аналізували за допомогою 50О5-РАСЕ, і результати показані на фіг. З, причому доріжка 1 показує маркер молекулярної ваги, доріжка 2 показує негативний контроль (пустий вектор рЕТ24а), доріжка З показує рекомбінантний білок 2а-Е1 (12,7 кДа), доріжка 4 показує рекомбінантний білок 2а-Е2 (11,6 кДа), доріжка 5 показує рекомбінантний білок 2а-ЕЗ (12,1 кДа), доріжка 6 показує рекомбінантний білок 2а-Е4 (16,5 кДа), доріжка 7 показує рекомбінантний білок 2а-Е5 (21,4 кДа), доріжка 8 показує рекомбінантний
Зо білок 2а-Еб6 (20,8 кДа) і доріжка 9 показує повнорозмірний рекомбінантний білок 2а-ОВЕ2 (27,5 кДа). Серед б фрагментів 2а-ОКЕ2 фрагменти 2а-Е2, г2а-ЕЗ3, га-Е4 і 2а-Р5 експресувалися в великих кількостях (фіг. 3, доріжки 4-7). Розраховані розміри фрагментів білків 2а-Е2, 2а-ЕЗ, г2а-
Е4 і 2а-Е5 відповідали їх фактичним розмірам, що становили 11,6 кДа, 12,1 кДа, 16,5 кДа і 21,4 кДа, відповідно.
Далі, застосовували вестерн-блотинг для перевірки, чи були експресовані рекомбінантні білки фрагментами 2а-ОКЕ2 з РСМ2. Після електрофорезу 505-РАСЕ переносили на поліамідну мембрану РМОР. Отриману мембрану блокували за допомогою блокувального буфера, який являє собою ТВ5Т (10 мМ трис-НСІ, рН 8,0, 150 мМ Масі, 0,195 Твін 20), що містить 595 знежиреного молока протягом 1 години при кімнатній температурі для запобігання неспецифічного зв'язування білків. Після цього білюи виявляли за допомогою моноклональних антитіл миші, кон'югованих з лужною фосфатазою (АР), до химерних білків з 6Х гістидиновою міткою протягом 1 години при кімнатній температурі з наступним шестиразовим промиванням за допомогою ТВ5Т, по 5 хвилин кожне. Після промивання додавали субстрат МВТ/ВСІР (Віо-Над).
Через 10 хвилин реакцію зупиняли шляхом додавання води.
Результати вестерн-блотинга показані на фіг. 4, причому доріжка 1 показує маркер молекулярної ваги, доріжка 2 показує негативний контроль (пустий вектор рЕТ24а), доріжка З показує рекомбінантний білок 2а2-Е1 (12,7 кДа), доріжка 4 показує рекомбінантний білок 2а-Е2 (11,6 кДа), доріжка 5 показує рекомбінантний білок 2а-ЕЗ3 (12,1 кДа), доріжка 6 показує рекомбінантний білок 2а-Е4 (16,5 кДа), доріжка 7 показує рекомбінантний білок 2а-Е5 (21,4 кДа), доріжка 8 показує рекомбінантний білок 2а-Е6 (20,8 кДа), і доріжка 9 показує повнорозмірний рекомбінантний білок 2а-ОКЕ2 (27,5 кДа). Результати вестерн-блотинга співпадали з результатами аналізу 5О5-РАСЕ (який показаний на фіг. 3). Повнорозмірний рекомбінантний білок 2а-ОКЕ2 не міг експресуватися (фіг. 4, доріжка 9). Серед б фрагментів з 2а-ОВЕ2 фрагменти 2а-Е2, га-ЕЗ, га-Е4 і 2а-Е5 експресувалися в великих кількостях (фіг. 4, доріжки 4-7).
Розраховані розміри фрагментів білків 2а-Е2, 2а-Е3, г2а-Е4 і 2а-Е5 відповідали їх фактичним розмірам, що становили 11,6 кДа, 12,1 кДа, 16,5 кДа і 21,4 кДа, відповідно. Однак, була відсутня експресія рекомбінантного білка 2а-Е1 або рекомбінантного білка 2а-Еб6 (фіг. 4, доріжки З і 8).
Оскільки як рекомбінантний білок 2а-Е1, так і рекомбінантний білок 2а2-Е6 містили нуклеотиди 1- 234 на 5-кінці повнорозмірної послідовності ДНК з 2а-ОКЕ2 з РСМ2 (див. фіг. 2), деякі 60 послідовності в нуклеотидах 1-234 могли зачіпати експресію білюка ОКЕ2 з РСМ2. Аналіз амінокислотних послідовностей фрагмента 2а-Е1 (нуклеотиди 1-234 на 5'-кінці 2а-ОКЕ2 з РСМ2,
ЗЕО ІО МО: 3) і фрагмента 2а-Е2 -- 2а-ЕЗ (нуклеотиди 235-699 (без стоп-кодона) на 5'-кінці 2а-
ОКЕ2 з РСМ2, 5ЕО ІЮ МО: 11) показував, що кількості аргінінів в амінокислотній послідовності (ЗЕО ІЮ МО: 4) фрагмента 2а-Е1 в два рази або більше перевищували кількості аргінінів в амінокислотній послідовності (ЗЕО ІО МО: 12) фрагмента 2а-Е2 -- 2а-ЕЗ (як показано в таблиці 2). Аналіз додавання або делеції аргініну показував, що делеція надлишкового аргініну могла підвищувати експресію білка з ОМКЕ2 з РСМ2.
Таблиця 2. Аналіз кількостей аргінінів в амінокислотній послідовності 2а-ОКЕ2 з РСМ2 да-г1 2а-Е2 4 2а-ЕЗ
Кодон Амінокислота Кількість Кодон Амінокислота Кількість
АСА Аргінін 5 АСА Аргінін З до,а Аргінін З до,а Аргінін З баА Аргінін 1 Сас Аргінін 1
Сас Аргінін 10 Сас; Аргінін 1 сат Аргінін 2 сат Аргінін 1
Загалом 21 Загалом в)
Приклад 2. Аналіз імуногенності антигенних пептидів субодиничної вакцини проти РСМ2 1. Імунізація щурів
Отримували субодиничну вакцину проти РСУ2 з рекомбінантними білками 2а-Е2, 2а-ЕЗ3, г2а-
Е4 та 2а2-Е5, отриманими в прикладі 1, відповідно, і повним ад'ювантом Фрейнда. Щурів вакцинували субодиничною вакциною проти РСМ2 для аналізу імуногенності антигенних пептидів субодиничної вакцини проти РСМ2.
Здорових щурів, які не мали конкретних патогенів, віком від п'яти до шести тижнів рандомно розділяли на 5 груп по З щури в кожній. Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА) показував, що всі 15 щурів були негативними за антитілами до РСМ2. Кожному щуру з 4 груп вакцинації (групи 1-4) вводили ін'єкцією підшкірно 200 мкг рекомбінантного білка, і загальний об'єм кожної ін'єкції становив 300 мкл при співвідношенні 1:1 (0б./06.) білка до ад'ювантної композиції. Щурам з групи 5 вводили ін'єкцією 300 мкл РВЗ5 і використовували в якості негативного контролю. Через два тижні після первинної імунізації (р.і.) щурам з 4 груп вакцинації повторно уводили таку ж дозу 4 різних рекомбінантних білків, відповідно. Зразки сироватки збирали через 0, 2, 4 і 8 тижнів після первинної імунізації. Всі зразки сироватки тестували за допомогою ЕГІЗА для вимірювання титру антитіл до РСМ2. 2. Визначення антитіл до РСМ2 за допомогою ЕГІЗА
В даному прикладі використовували планшети з дев'яноста шістьма лунками, що містять патогенний антиген РСМ2 (300 нг/лунка), в якості планшетів для ЕГІЗА. Планшети для ЕГІЗА
Зо промивали З рази 50 ммоль/л РВЗ (рН 7,2), що містить 500 мкл/л Твін-20 (тобто РВ5Т) протягом від З до 5 хвилин кожен раз. Для блокування планшетів для ЕГІ5А додавали 200 мкл 0,15965 блокувального розчину В5А в кожну лунку планшетів для ЕГІ5А, і потім планшети для ЕГІЗА інкубували протягом 2 годин при 37"С. Після чого планшети для ЕГІЗА промивали РВ5. Зразки сироватки щурів розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомогою РВ5, а потім послідовно розводили в два рази. Кожен зразок мав 8 повторів. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів (100 мкл/лунка) для ЕГ І5ЗА і планшети інкубували протягом 1 години при 37"С.
Після інкубування планшети промивали РВ5. Потім в лунки додавали антитіло до дО щура, кон'юговане з лужною фосфатазою (АР). Після інкубування протягом 1 години при 377С планшети промивали РВ5. Для візуалізації результатів в лунки додавали пара- нітрофенілфосфат (рМРР). Після інкубації реакцію зупиняли шляхом додавання 1М Маон.
Оптичну щільність кожної лунки зчитували за допомогою пристрою для зчитування оптичної щільності при 405 нм. Кожен зразок аналізували у двох повторностях і значення 0.0. від дублів усереднювали.
Результати ЕГІ5А показані на фіг. 5. Всі рекомбінантні білки 2а-Е2, 2а-ЕЗ, 2а-Е4 та 2а-Е5, отримані в прикладі 1, були здатні індукувати сироваткові антитіла до РСМ2 у тестованих тварин. Серед рекомбінантних білків рекомбінантний білок 2а-Е2 (5ЕБО ІЮО МО: 6) індукував найбільш високий рівень сироваткового антитіла до РСМ2. Для статистичного аналізу всі групи порівнювали з негативним контролем РВЗ у різних моментах забору зразка, і виявляли значущі відмінності між негативним контролем і кожною групою вакцинації (р-0,05).
Крім того, свиней вакцинували рекомбінантними білками 2а-Е2, 2а-Е3, 2а-Р4 та 2а-Е5, відповідно, і всі рекомбінантні білки були здатні індукувати сироваткові антитіла до РСМ2 у свиней. На додаток до цього вакцинованих свиней заражали вірусом РСМ2 для оцінки ефективності рекомбінантних білків. Спочатку рекомбінантні білки складали в якості субодиничної вакцини і вводили ін'єкцією свиням. Потім, свиней заражали вірусом РСМ2.
Результати показували, що ступені захисту груп імунізації були вищими, ніж такі у негативного контролю (без вакцинації). В контексті даного документа ступені захисту включають зниження вірусемії і пом'якшення симптомів, спричинених РСУ2. Таким чином, результати показували, що субодинична вакцина РСМ2, отримана за допомогою рекомбінантних білків, могла ефективно індукувати імунітет у тварин і збільшувати показник виживаності тварин.
Приклад 3. Будування та експресія антигенних пептидів субодиничної вакцини проти РСМ2 га
Результати в прикладі 2 показували, що серед рекомбінантних білків пептид 2 з ОКЕ2 з
РСМ2 індукував найвищий рівень сироваткового антитіла до РСМ2. Для того щоб посилити імуногенність субодиничної вакцини проти РСМ2, рецептор-зв'язувальний домен | і трансмембранний домен ЇЇ, що націлює, екзотоксину А з Рзепдотопах аєгидіпоза (тобто білка
РЕ) і сигнал затримки в ЕК - сигнальний пептид КОЕЇГ. зливали з пептидом 2а-Е2, отриманим в прикладі 1, на М- ї С-кінцях, відповідно, з отриманням химерного білка (РЕ-2а-Р2-КОЕЇ) для індукції відповідного імунітету до інфекції РСМ2 у тварин.
В даному прикладі рекомбінантний білок (РЕ-2а-Р2-КОЕЇ) отримували за допомогою генної інженерії. Послідовності ДНК, що кодують білки, що представляють інтерес, клонували у вектор експресії для будування плазміди рЕТ24а-РЕ-2а-Р2-КОЕЇ. У плазміди індукували експресію рекомбінантного білка РЕ-2а-Б2-КОЕЇ. Спочатку, послідовність ДНК (ЗЕО ІО МО: 30), що кодує сигнальний пептид КОЕЇ,, клонували у вектор рЕТ24а з отриманням плазміди рЕТ24а-КОЕЇ..
Після чого, послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 5) фрагмента 2а-Р2, отриманого в прикладі 1, клонували в плазміду рЕТ24а-КОБЇ з отриманням плазміди рЕТ24а-2а-Б2-КОЕЇГ.. Нарешті, послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 34), що кодує білок РЕ, клонували в плазміду рРЕТ24а-2а-Б2-
КОЕЇГ з отриманням плазміди рЕТ24а-РЕ-2да-Б2-КОБЕЇ.. 1. Будування рЕТ24а-КЕОІ.
Послідовність ДНК, що кодує сигнальний пептид КОЕЇ,, (ЗЕО ІЮ МО: 31) показана як 5ЕО ІЮ
МО: 30. Послідовність ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР. Далі наведені послідовності специфічних до КЕО'Г. праймерів.
Зо Прямий праймер (з сайтом рестрикції Н/ла 1) 5-СССАдДаСТІСТСААДААААпАСпААСТаАпАпАТаААСТОаАААСА-З' (5ЕО ІЮ МО: 32)
Ніпа
Зворотний праймер (з сайтом рестрикції Хпо) 5-атастесадасСсАсаСТСатсТ ТсАСТТСАТСТ-3" (5ЕО ІЮ МО: 33)
Хо
Умови для реакції ПЛР включали 947"С протягом З хвилин, 5 циклів 9572 протягом 1 хвилини, 557С протягом 1 хвилини, і 72"С протягом 20 секунд, і 72"С протягом 1 хвилини для елонгації. Продукт ПЛР і вектор рЕТ24а піддавали подвійному розщепленню ферментами рестрикції за допомогою Ніла ПІ ї Хро І. Потім, розщеплені продукти ПЛР і вектор рЕТ24а очищали, відповідно, з наступним лігуванням для клонування продукту ПЛР в рЕТ24а з отриманням рЕТ24а-КОЕЇ.. Потім, конструкт РЕТ24а-КЕОІ. трансформували в клітини-хазяїни (Е. сої) для здійснення масової реплікації. Репліковані продукти ПЛР додатково підтверджували за допомогою секвенування. 2. Будування рЕТ24а-2а-Е2-КОЕЇ.
Послідовність ДНК 2а-Б2 (З5ЕБО ІЮО МО: 5), отриману в прикладі 1, ампліфікували за допомогою ПЛР. Далі показані праймери ПЛР.
Прямий праймер реЕ2-1 (з сайтом рестрикції бас І) 5-свластетттаттссосСсасадасас(ояа-з (ЗЕО ІО МО: 38) басі
Зворотний праймер ркКа-1 (з сайтом рестрикції Ніла ІП) 5-сссддасттатаасасАааддасвсаТ т асавиаАтТт-з (ЗЕО ІО МО: 39)
Ніпа
Умови для реакції ПЛР включали 957С протягом 5 хвилин, 25 циклів 957С протягом 30 секунд, 55"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 5 хвилин для елонгації. Продукт ПЛР і плазміду рЕТ24а-КОЕЇ піддавали подвійному розщепленню ферментами рестрикції за допомогою 5ас І і Ніла ІІ. Потім, розщеплені продукти ПЛР і плазміду рЕТ24а-КОЕГЇ. очищали, відповідно, з наступним лігуванням для клонування продукту ПЛР в рЕТ24а-КОЕГ. з отриманням рЕТ24а-2га-Р2-КОЕЇ.. Потім, конструкт трансформували в клітини- хазяїни (б. сої) для здійснення масової реплікації. Репліковані продукти ПЛР додатково 60 підтверджували за допомогою секвенування.
3. Будування рЕТ24а-РЕ-2а-Б2-КОЕЇЇ.
Послідовність ДНК, що кодує білок РЕ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 35), показана як 5ЕО ІЮО МО: 34.
Послідовність ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР. Далі наведені послідовності специфічних до РЕ праймерів.
Прямий праймер (з сайтом рестрикції Ватн І) 5- бадаАТоСаААсСААлаСа ттосАС -3 (ЗЕО ІО МО: 36)
Ватн
Зворотний праймер (з сайтами рестрикції Есокі і бас І) 5- басААттосАаа,астасСАсаТСАпасСТСАССАС-3 /(ЗЕО ІЮ МО: 37)
ЕсовВ | бас
Умови для реакції ПЛР включали 94"С протягом 5 хвилин, 30 циклів 957С протягом 1 хвилини, 557С протягом 1 хвилини, і 72"С протягом 1,5 хвилини, і 727"С протягом 7 хвилин для елонгації. Продукт ПЛР ї плазміду рЕТ24а-2а-Р2-КОЕЇ. піддавали подвійному розщепленню ферментами рестрикції за допомогою Ватн І і бас І. Потім, розщеплені продукти ПЛР і плазміду рЕТ24а-2а-Б2-КОЕЇГ. очищали, відповідно, з наступним лігуванням для клонування продукту ПЛР в рРЕТ24а-2а-Б2-КОЕЇ. з отриманням рЕТ24а-РЕ-2а-Б2-КОЕЇГ.. Потім, конструкт РЕТ24а-РЕ-2а-Б2-
КОЕГ. трансформували в клітини-хазяїни (Є. со/)) для здійснення масової реплікації. Репліковані продукти ПЛР додатково підтверджували за допомогою секвенування. Антигенний химерний білок РЕ-2га-Б2-КОЕЇ характеризується амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 41, а послідовність ДНК, що кодує химерний білок, являє собою ЗЕО ІЮ МО: 40. 4. Експресія білка РЕ-2а-Е2-КОЕЇГ.
Е. сої, що містить плазміду рЕТ24а-РЕ-2а-Р2-КЕРІ, інкубували в середовищі ІВ.
Бактеріальну культуру індукували за допомогою додавання ІРТО для експресії антигенного химерного білка РЕ-2га-Б2-КЕОІ (ЗЕО ІО МО: 41). Способи експресії і екстракції білка описані в прикладі 1.
Приклад 4. Аналіз послідовностей ОКЕ2 з РСУМ2 різних підгруп
Крім підгрупи 2а існують інші підгрупи вірусу РСМ2. Далі показані результати аналізів кількостей аргінінів амінокислотних послідовностей, що кодуються нуклеотидами 1-234 на 5- кінці ОКЕ2 з РСМ2, та амінокислотних послідовностей, що кодуються послідовностями ДНК від нуклеотиду 235 до останнього нуклеотиду ОКЕ2 з РСМУ2 підгруп РСМ2 2, 2с, 24 і 2е, відповідно.
Послідовності гена ОКЕ2 з РСМ2, представлені у УМмапд еї аї. (Умапод еї аї., Міги5 Кезеагсп 2009, Сепеїїс мапайоп апаїузіб ої Спіпезе зігаіпе ої рогсіпе сігсомігив їуре 2.), застосовували в якості стандартних послідовностей для філогенетичного аналізу БЕО ІЮ МО: 15 та 5ЕО ІЮ МО: 19. Результат показував, що послідовності ОКЕ2 з РСМ2 з 5ЕО ІЮО МО: 15 і 5ЕО ІЮ МО: 19 належали до підгрупи РСМ2 265 і підгрупи РСУ2 24, відповідно (як показано на фіг. 1). Крім того, послідовності ОКЕ2 із РСМ2 з БЕО ІЮ МО: 50 та 5ЕО ІО МО: 52 слугували в якості стандартного штаму підгрупи РСМ2 2с і підгрупи РСМ2 2е, відповідно.
Результати аналізу послідовності підгрупи РСМ2 25 показані в таблиці 3. Фрагмент ОМЕ2 підгрупи РСМ2 265 (20-ОКЕ2) характеризується нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 15 і амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 16. 21 аргініновий залишок знаходився в амінокислотних послідовностях, що кодуються нуклеотидами 1-234 на 5"-кінці 20-ОКЕ2, причому 10 аргінінових залишків знаходилися в амінокислотних послідовностях (ЗЕ ІЮО МО: 18), що кодуються нуклеотидами 235-699 (без стоп-кодона ЗЕО ІЮ МО: 17) 20-ОМКЕ2. Результати аналізу послідовності підгрупи РСМ2 2р0 узгоджувалися з результатами підгрупи РСМ2 2а. Кількості аргінінів на М-кінці обох білків ОМЕ2 в два рази або більше перевищували кількості аргінінів в іншій частині білків ОМЕ2 (що показано в таблицях 2 та 3).
Таблиця 3. Аналіз кількостей аргінінів амінокислотної послідовності 25-ОВЕ2 РСМ2
Підгрупа РСМ2-25 - Підгрупа РСМ2-26 - нуклеотиди 1-234 нуклеотиди 235-699
Кодон Амінокислота Кількість Кодон Амінокислота Кількість
АСА Аргінін 5 АСА Аргінін 5 до,а Аргінін З до,а Аргінін 1 баА Аргінін 1 баА Аргінін 0
Сас Аргінін 9 Сас Аргінін З
Сас; Аргінін 1 Сас; Аргінін 0 сат Аргінін 2 сат Аргінін 1
Загалом 21 Загалом 10
Результати аналізу послідовності підгрупи РСМ2 2с показані в таблиці 4. Фрагмент ОМКЕ2 підгрупи РСМ2 2с (206-ОКЕ2) характеризується нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 50 і амінокислотною послідовністю ЗЕ ІО МО: 51. 20 аргінінових залишків знаходилися в амінокислотних послідовностях, що кодуються нуклеотидами 1-234 на 5'-кінці 20-ОКЕ2, причому 10 аргінінових залишків знаходилися в амінокислотних послідовностях (ЗЕО ІЮ МО: 55), що кодуються нуклеотидами 235-702 (5ЕО ІЮ МО: 54) 2с-ОКЕ2. Результати аналізу послідовності підгрупи РСМ2 2с узгоджувалися з такими підгрупи РСМ2 2а і підгрупи РСМ2 26. Кількості аргінінів на М-кінці всіх трьох білків ОКЕ2 у два рази або більше перевищували кількості аргінінів в іншій частині білків ОКЕ2 (що показано в таблицях 2, З і 4).
Таблиця 4. Аналіз кількостей аргінінів амінокислотної послідовності 20-ОВЕ2 РСМУ2
Підгрупа РСМ2-2с - Підгрупа РСМ2-2с - нуклеотиди 1-234 нуклеотиди 235-702
Кодон Амінокислота Кількість Кодон Амінокислота Кількість
АСА Аргінін 5 АСА Аргінін (в до,а Аргінін З до,а Аргінін 1 баА Аргінін 0 баА Аргінін 0
Сас Аргінін 9 Сас Аргінін 2
Сас; Аргінін 1 Сас; Аргінін 0 сат Аргінін 2 сат Аргінін 1
Загалом 20 Загалом 10
Результати аналізу послідовності підгрупи РСМ2 2а показані в таблиці 5. Фрагмент ОКЕ2 підгрупи РСМ2 2а (249-ОКЕ2) характеризується нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 19 і амінокислотною послідовністю ЗЕ ІО МО: 20. 21 аргініновий залишок знаходився в амінокислотних послідовностях, що кодуються нуклеотидами 1-234 на 5'"-кінці 24-ОКЕ2, причому 10 аргінінових залишків знаходилися в амінокислотних послідовностях (ЗЕ ІЮО МО: 21), що кодуються нуклеотидами 235-702 (без стоп-кодона ЗЕО ІЮ МО: 22) 24-ОВЕ2. Результати аналізу послідовностей підгрупи РСМУ2 2а узгоджувалися з такими підгрупи РСМ2 2а, підгрупи РСМ2 25 та підгрупи РСМ2 26. Кількості аргінінів на М-кінці всіх чотирьох білків ОКЕ2 в два рази або більше перевищували кількості аргінінів в іншій частині білків ОМЕ2 (що показано в таблицях 2, 3, 4 і 5).
Таблиця 5. Аналіз кількостей аргінінів амінокислотної послідовності 24-ОВЕ2 РСМ2
Підгрупа РСМ2-2а - Підгрупа РСМ2-2а - нуклеотиди 1-234 нуклеотиди 235-702
Кодон Амінокислота Кількість Кодон Амінокислота Кількість
АСА Аргінін 5 АСА Аргінін 4 до,а Аргінін З до,а Аргінін З баА Аргінін 1 баА Аргінін 0
Сас Аргінін 10 Сас Аргінін 1
Сас; Аргінін 0 Сас; Аргінін 1 сат Аргінін 2 сат Аргінін 1
Загалом 21 Загалом 10
Результати аналізу послідовності підгрупи РСМ2 2е показані в таблиці 6. Фрагмент ОКЕ2 підгрупи РСМ2 2е (2е-ОКЕ2) характеризується нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 52 і амінокислотною послідовністю ЗЕ ІО МО: 53. 20 аргінінових залишків знаходилися в амінокислотних послідовностях, що кодуються нуклеотидами 1-234 на 5-кінці 2е6-ОКЕ2, в той час як 9 аргінінових залишків знаходилися в амінокислотних послідовностях (5ЕО ІЮО МО: 57),
Зо що кодуються нуклеотидами 235-699 (без стоп-кодона 5ЗЕО ІЮО МО: 56) 26-ОКЕ2. Результати аналізу послідовності підгрупи РСМ2 2е узгоджувалися з такими підгрупи РСМ2 2а, підгрупи
РСМ2 26, підгрупи РСМ2 2с та підгрупи РСМ2 24. Кількості аргінінів на М-кінці всіх п'яти білків
ОРЗ в два рази або більше перевищували кількості аргінінів в іншій частині білків ОМЕ2 (що показано в таблицях 2, 3, 4, 5 і 6).
Таблиця 6. Аналіз кількостей аргінінів амінокислотної послідовності 26-ОВЕ2 РСМ2
Підгрупа РСМ2-26е - Підгрупа РСМ2-2е - нуклеотиди 1-234 нуклеотиди 235-699
Кодон Амінокислота Кількість Кодон Амінокислота Кількість
АСА Аргінін 5 АСА Аргінін 4 до,а Аргінін З до,а Аргінін 2 баА Аргінін 0 баА Аргінін 0
Сас Аргінін 9 Сас Аргінін 2
Сас; Аргінін 1 Сас; Аргінін 0 сат Аргінін 2 сат Аргінін 1
Загалом 20 Загалом 9
Рівні експресії збагачених аргінінами і незбагачених аргінінами білкових доменів підгрупи
РСМ2 2Б, підгрупи РСМ2 2с, підгрупи РСМ2 2а та підгрупи РСМ2 2е також аналізували за допомогою способу, описаного в прикладі 1. Результати були порівняні з результатами з прикладу 1. Рівень експресії збагачених аргінінами білкових доменів на М-кінці був низьким, тоді як рівень експресії незбагаченого аргініном білкового домену був високим. Крім того, аналіз додавання або делеції аргініну показував, що делеція надлишкового аргініну може підвищити експресію білка з ОКЕ2 з РСУ2, що також порівнювано з результатами підгрупи РСУ2 2а.
Збагачений аргініном домен характеризується амінокислотною послідовністю з приблизно залишків 1-78 на М-кінці повнорозмірного пептиду ОКЕ2 з РСМ2, а незбагачений аргініном домен характеризується амінокислотною послідовністю приблизно від 79 до останнього залишку на С-кінці.
Приклад 5. Будування і експресія антигенних пептидів субодиничної вакцини проти РСМ2 25 1. Будування і експресія рРЕТ24а-20-Е2
В даному прикладі ген ОКЕ2 підгрупи РСМ2 25 з прикладу 4 використали під час будування антигенного пептиду субодиничної вакцини проти РСМ2. Як описано в прикладах 1 і 3, фрагмент
Е2 (нуклеотиди 235-468 на 5'-кінці повнорозмірної послідовності ДНК гена ОКЕ2 з РСМ2 2, фрагмент 2р-Б2) клонували в вектор експресії. Фрагмент 25-52 підгрупи РСМ2 25 характеризується нуклеотидною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 17 та амінокислотною послідовністю
ЗЕО ІЮ МО: 18. Нуклеотидну послідовність фрагмента 26-Е2 ампліфікували за допомогою ПЛР.
Далі показані праймери ПЛР.
Прямий праймер реЕ-265 (з сайтом рестрикції бас 1): 5- садастоттоттососСАдасвсааавасвсас -3 (ЗЕО ІЮО МО: 42) бас і
Зворотний праймер ркК-26Б (з сайтом рестрикції Ніла 1): 5- ссСсддасттатаасАааддасвсастасатТАТ-3" (ЗЕО ІЮО МО: 43)
Ніпа ПІ
Зо Умови для реакції ПЛР включали 957С протягом 5 хвилин, 25 циклів 957"С протягом 30 секунд, 55"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 5 хвилин для елонгації. Продукт ПЛР і вектор експресії рЕТ24а (Момадеп) піддавали подвійному розщепленню ферментами рестрикції за допомогою бас І і Ніпа ІІ. Потім, розщеплені продукти
ПЛР ї вектор експресії рЕТ24а очищали, відповідно, з наступним лігуванням для клонування продукту ПЛР в вектор експресії рЕТ24 з отриманням плазміди рЕТ24а-2р-Е2. Потім, конструкт трансформували в клітини-хазяїни (БД. со/) для здійснення масової реплікації. Репліковані продукти ПЛР додатково підтверджували за допомогою секвенування. б. со), що містить плазміду рЕТ24а-20-Е2, інкубували в середовищі І В. Бактеріальну культуру індукували за допомогою додавання ІРТО для експресії антигенного білка 20-Е2 (5ЕО ІЮ МО: 18). Способи експресії і екстракції білка описані в прикладі 1. 2. Будування і експресія РЕТ24а-РЕ-20-Б2-КОБЕЇ.
Крім застосування пептиду 2Б-Е2 в якості антигенного пептиду субодиничної вакцини проти
РСМ2, в даному прикладі білок РЕ і сигнальний пептид КОЕЇ. зливали з пептидом 2рБ-Е2 на М- та
С-кінцях, відповідно, з отриманням рекомбінантного химерного білка РЕ-20-Б2-КОБЕЇ для індукування відповідного імунітету проти інфекції РСМ2 у тварин.
Рекомбінантний химерний білок РЕ-20-Б2-КОЕЇ. характеризується послідовністю ДНК ЗЕО
ІО МО: 44 і амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 45. Принцип будування плазміди, що експресує рекомбінантний химерний білок РЕ-20-Е2-КОЕГ (рЕТ24а-РЕ-20-Б2-КОЕЇ), був таким же, як і принцип, описаний в прикладі 3. Спочатку, послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 30), що кодує сигнальний пептид КОЕГ, клонували в вектор рЕТ24а з отриманням плазміди рЕТ24а-КОБЕЇ.
Спосіб будування плазміди РЕТ24а-КОЕЇ описаний в прикладі 3. Після чого, послідовність ДНК (ЗЕО І МО: 17) фрагмента 2р-Е2 клонували в плазміду рРЕТ24а-КОЕЇ. з отриманням плазміди рЕТ24а-20-Б2-КОЕЇ. Нарешті, послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 34), що кодує білок РЕ, клонували в плазміду рЕТ24а-20-Б2-КОБЕЇ з отриманням плазміди рЕТ24а-РЕ-20-Б2-КОБЕЇ.
Спосіб будування плазміди рЕТ24а-РЕ-20-ЕБ2-КОЕЇ описаний у прикладі 3. Потім, БЕ. со/), що містить плазміду РЕТ24а-РЕ-20-Е2-КОЕЇ, інкубували в середовищі І В. Бактеріальну культуру індукували за допомогою додавання ІРТО для експресії рекомбінантного білка РЕ-20-Б2-КОЕЇ. (ЗЕО ІО МО: 45). Способи експресії і екстракції білка описані в прикладі 1.
Приклад 6. Будування і експресія антигенних пептидів субодиничної вакцини проти РСМ2 2а 1. Будування і експресія рЕТ24а-2а-Е2
В даному прикладі ген ОКЕ2 підгрупи РСМ2 24 з прикладу 4 застосовували під час будування антигенного пептиду субодиничної вакцини проти РСМ2. Як описано в прикладах 1 і
З, фрагмент Е2 (нуклеотиди 235-468 на 5'-кінці повнорозмірної послідовності ДНК гена ОКЕ2
РСМ2 240, фрагмент 24-Е2) клонували в вектор експресії. Фрагмент 249-Е2 підгрупи РСМ2 2а характеризується нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 21 та амінокислотною послідовністю
ЗЕО ІЮ МО: 22. Нуклеотидну послідовність фрагмента 24-Е2 ампліфікували за допомогою ПЛР.
Далі показані праймери ПЛР.
Прямий праймер реЕ-2а4 (з сайтом рестрикції бас 1): 5- садастоеттотососСАдасвсааававсас -3 (ЗЕО ІЮ МО: 46) бас
Зворотний праймер рі-2а (з сайтом рестрикції Ніла 1): 5- СССсСААдасттатаааАаАд,асастасаттТАТ -3' (ЗЕО ІО МО: 47)
Ніпа ПІ
Умови для реакції ПЛР включали 957С протягом 5 хвилин, 25 циклів 957С протягом 30 секунд, 55"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 30 секунд, і 72"С протягом 5 хвилин для елонгації. Продукт ПЛР і вектор експресії рЕТ24а (Момадеп) піддавали подвійному розщепленню ферментами рестрикції за допомогою бас І і Ніпа ІІ. Потім, розщеплені продукти
ПЛР ї вектор експресії рЕТ24а очищали, відповідно, з наступним лігуванням для клонування продукту ПЛР у вектор експресії рЕТ24а з отриманням плазміди рЕТ24а-2а-Е2. Потім, конструкт
Зо трансформували в клітини-хазяїни (БД. со/) для здійснення масової реплікації. Репліковані продукти ПЛР додатково підтверджували за допомогою секвенування. б. со), що містить плазміду рЕТ24а-24-Е2, інкубували в середовищі ІВ. Бактеріальну культуру індукували за допомогою додавання ІРТО для експресії антигенного білка 24-Е2 (5ЕО ІЮ МО: 22). Способи експресії і екстракції білка описані в прикладі 1. 2. Будування і експресія РЕТ24а-РЕ-2а-Б2-КОБЕЇ.
Крім застосування пептиду 28-Е2 в якості антигенного пептиду субодиничної вакцини проти
РСМ2, в даному прикладі білок РЕ і сигнальний пептид КОЕЇ. зливали з пептидом 2а4-Е2 на М- та
С-кінцях, відповідно, для отримання рекомбінантного химерного білка РЕ-2а-Р2-КОЕЇ. для індукування відповідного імунітету проти інфекції РСМ2 у тварин.
Рекомбінантний химерний білок РЕ-2а-Р2-КОЕЇ. характеризується послідовністю ДНК ЗЕО
ІО МО: 48 і амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 49. Принцип будування плазміди, що експресує рекомбінантний химерний білок РЕ-2а-Е2-КОЕГ (рЕТ24а-РЕ-2а-Б2-КОЕЇ), був таким же, як і принцип, описаний в прикладі 3. Спочатку, послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 30), що кодує сигнальний пептид КОЕЇ,, клонували в вектор рЕТ24а з отриманням плазміди рЕТ24а-КОЕЇ..
Спосіб будування плазміди рЕТ24а-КОЕЇ описаний в прикладі 3. Після чого, послідовність ДНК (ЗЕО ІЮО МО: 21) фрагмента 24-Е2 клонували в плазміду РЕТ24а-КОЕГ. з отриманням плазміди рЕТ24а-2а-Б2-КОЕЇ. Нарешті, послідовність ДНК (5ЕО ІЮ МО: 34), що кодує білок РЕ, клонували в плазміду рЕТ24а-2а-Р2-КОБЕЇ з отриманням плазміди рЕТ24а-РЕ-2а-Б2-КОБЕЇ.
Спосіб будування плазміди рЕТ24а-РЕ-2а-Р2-КОЕЇ. описаний в прикладі 3. Потім, БЕ. со/ї, що містить плазміду РЕТ24а-РЕ-2а-Е2-КОЕЇ, інкубували в середовищі І В. Бактеріальну культуру індукували за допомогою додавання ІРТО для експресії рекомбінантного білка РЕ-2а-Б2-КОЕЇ. (ЗЕО ІО МО: 49). Способи експресії і екстракції білка описані в прикладі 1.
Приклад 7. Аналіз імуногенності антигенних пептидів субодиничної вакцини-1 проти РСМ2 1. Імунізація мишей
Субодиничну вакцину проти РСУ2 отримували з рекомбінантним білком 2а-Е2 (5ЕО ІЮ МО: 6), отриманим в прикладі 1, і рекомбінантним білком РЕ-2га-Б2-КОЕЇ (5ЕО ІО МО: 41), отриманим в прикладі З, відповідно, і повним ад'ювантом Фрейнда. Мишей вакцинували субодиничною вакциною проти РСМ2 для аналізу імуногенності антигенних пептидів субодиничної вакцини проти РСМ2. 60 Здорових 5РЕ мишей віком від п'яти до шести тижнів рандомно розділяли на З групи по З миші в кожній. Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА) показував, що всі 9 мишей були негативними на антитіла до РСМ2. Кожній миші з 2 груп вакцинації (групи 1 і 2) вводили ін'єкцією підшкірно 100 мкг рекомбінантного білка Мишам з групи З вводили ін'єкцією РВ5 і використовували в якості негативного контролю. Через два тижні після первинної імунізації (р.і.) мишам з 2 груп вакцинації повторно вводили таку ж дозу 2 різних рекомбінантних білків, відповідно. Зразки сироватки збирали через 2, 4, 5 і 8 тижнів після первинної імунізації. Всі зразки сироватки тестували за допомогою ЕГІЗА для вимірювання титру антитіл до РСМ2. 2. Визначення антитіл до РСМ2 за допомогою ЕГІЗА
В даному прикладі використовували планшети з дев'яноста шістьма лунками, що містять патогенний антиген РСМ2 (300 нг/лунка), в якості планшетів для ЕГІЗА. Планшети для ЕГІЗА промивали З рази 50 ммоль/л РВ5 (рН 7,2), що містить 500 мкл/л Твін-20 (тобто РВ5Т), протягом від З до 5 хвилин кожен раз. Для блокування планшетів для ЕГІЗА додавали 200 мкл 0,1595 блокувального розчину ВЗА в кожну лунку планшетів для ЕГІЗА, а потім планшети для
ЕГІЗА інкубували протягом 2 годин при 37"С. Після чого планшети для ЕГІЗА промивали РВ5.
Зразки сироватки мишей розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомогою РВ5, а потім послідовно розводили в два рази. Кожен зразок мав 8 повторів. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів для ЕГІ5А (100 мкл/лунка) та планшети інкубували протягом 1 години при 37"С. Після інкубування планшети промивали РВ5Б. Потім в лунки додавали антитіло до до миші, кон'юговане з лужною фосфатазою (АР). Після інкубування протягом 1 години при 37"С планшети промивали РВ5. Для візуалізації результатів у лунки додавали пара- нітрофенілфосфат (рМРР). Після інкубації реакцію зупиняли шляхом додавання 1М Ммаон.
Оптичну щільність кожної лунки зчитували за допомогою пристрою для зчитування оптичної щільності при 405 нм. Кожен зразок аналізували у двох повторностях і значення 0.0. від дублів усереднювали.
Результати ЕГІЗА показані на фіг. 6. Рекомбінантний білок РЕ-2а-Б2-КОЕЇ (5ЕО ІО МО: 41) індукував більш високий рівень сироваткових антитіл до РСМ2 у тестованих тварин, ніж індукував рекомбінантний білок 2а-Е2 (5ЕО ІЮ МО: 6). Відмінності між рівнями сироваткових антитіл до РСМ2 в групі 1 та в групі 2 були значущими через 4 тижні після первинної імунізації (р « 0,05). Відмінності між рівнями сироваткових антитіл до РСМУ2 в групі 1 та в групі 2 були більш
Зо значущими на тижні б після первинної імунізації (р « 0,01). Додатково, порівняно з рівнем антитіл негативного контролю, рівні антитіл групи 1 і групи 2 були значно вище (р «0,01).
Приклад 8. Аналіз імуногенності антигенних пептидів субодиничної вакцини-2 проти РСМ2 1. Імунізація мишей
В даному прикладі імуногенність розкритого в даному документі рекомбінантного білка РЕ- 2а-Б2-КОЕЇГ у тестованих тварин порівнювали з імуногенністю цілого вірусу РСМ2 у тестованих тварин.
Субодиничну вакцину проти РСМ2 отримували з рекомбінантним білком РЕ-2а-Б2-КОЕЇ (ЗЕО ІО МО: 41), отриманим в прикладі 3, і масляним ад'ювантом Мопіапіде І5А 206 (Зерріс,
Франція). Крім того, вакцину на основі цілого вірусу РСМ2 отримували за допомогою інактивованого цілого вірусу РСМ2 (105 ТСІЮОво/мл) і масляного ад'юванта Мопіапіде ІЗА 206 (Зерріс, Франція). В одній дозі вакцини на основі цілого вірусу РСМ2 було 100 мкл інактивованого цілого вірусу РСМ2 їі 250 мкл ад'юванта. Для вакцинації мишей застосовували дві вакцини.
Здорових 5РЕ мишей віком від п'яти до шести тижнів рандомно розділяли на З групи по 5 мишей в кожній. Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА) показував, що всі 15 мишей були негативними за антитілам до РСМ2. Кожній миші з групи 1 вводили ін'єкцією підшкірно 100 мкг рекомбінантного білка. Кожній миші з групи 1 вводили ін'єкцією підшкірно одну дозу вакцини на основі цілого вірусу РСМ2. Мишам з групи З вводили ін'єкцією масляний ад'ювант Мопітапіде
ІЗА 206 і використовували в якості негативного контролю. Через три тижні після первинної імунізації (р.ї.), мишам з 2 груп вакцинації повторно вводили таку ж дозу 2 різних вакцин, відповідно. Зразки сироватки збирали через 0, 1, 2, 3, 4 і 5 тижнів після первинної імунізації. Всі зразки сироватки тестували за допомогою ЕГІЗА для вимірювання титру антитіл до РСМ2. 2. Визначення антитіл до РСМ2 за допомогою ЕГІЗА
Спосіб визначення ЕГІБА антитіл до РСМ2 описаний у прикладі 7. Результати ЕГІ5А показані на фіг. 7. Рекомбінантний білок РЕ-2а-Б2-КОЕЇ (5ЕБО ІЮО МО: 41) індукував більш високий рівень сироваткових антитіл до РСМ2 у тестованих тварин, ніж індукував антиген цілого вірусу РСМ2. Відмінності між рівнями сироваткових антитіл до РСМ2 в групі 1 та в групі 2 були значущими через 1 тиждень після первинної імунізації (р « 0,001). Додатково, порівняно з рівнем антитіл негативного контролю, рівень антитіл мишей, вакцинованих рекомбінантним 60 білком РЕ-2га-Е2-КОЕЇ (група 1), був значно вище (р «0,001).
Крім того, свиней вакцинували рекомбінантними білками 2а-Е2 і РЕ-2а-Б2-КОЕЇ,, відповідно, і обидва рекомбінантні білки були здатні індукувати сироваткові антитіла до РСМ2 у свиней. На додаток до цього, вакцинованих свиней заражали вірусом РСМ2 для оцінки ефективності рекомбінантних білків. Спочатку рекомбінантні білки складали в якості субодиничної вакцини і вводили ін'єкцією свиням. Потім, свиней заражали вірусом РСМ2. Результати показували, що ступені захисту груп імунізації були вищими, ніж такі у негативного контролю (без вакцинації). В контексті даного документу ступені захисту включають зниження вірусемії і пом'якшення симптомів, спричинених РСМ2. Таким чином, результати показували, що субодинична вакцина
РСМ2, отримана за допомогою рекомбінантних білків, могла ефективно індукувати імунітет у тварин і збільшувати показник виживаності тварин.
Додатково, білою ОКЕ2 або їх фрагменти підгрупи РСМ2 26, підгрупи РСМ2 2с, підгрупи
РСМ2 2а і підгрупи РСМ2 2е отримували за допомогою способів, описаних у прикладах 1-3, відповідно, і імуногенність білків ОМКЕ2 або їх фрагментів аналізували за допомогою способів, описаних у прикладах 7 і 8. Результати показували, що фрагменти ОКЕ2 таких підгруп РСМ2 (наприклад, фрагмент Е2) і їх рекомбінантні химерні білки (наприклад, РЕ-Р2-КОЕЇ) можуть індукувати імунітет у тварин (таких як свині) і попереджати у тварин інфекцію РСМ2.
Субодинична вакцина РСУ2, забезпечена даним розкриттям, мала наведені далі переваги порівняно з іншими традиційними методиками.
Субодиничну вакцину РСМ2, забезпечену даним розкриттям, отримували за допомогою генної інженерії, при якій фрагменти білка ОКЕ2 з РСУ2, які можуть бути експресовані в більш високій мірі в біологічних системах експресії, клонували і застосовували в якості антигенних пептидів субодиничної вакцини. Субодинична вакцина могла індукувати відповідний імунітет до інфекції РСМ2 у тварин, і фрагменти білка ОКЕ2 з РСМ2 могли бути масово відтворені за допомогою генної інженерія для зменшення вартості виробництва вакцини.
Інша субодинична вакцина РСМ2, забезпечена даним розкриттям, містила антигенний химерний білок РЕ-Р2-КОЕЇ,, який був рекомбінантним білком пептиду Е2 з ОМЕ2 з РСУМ2, білка
РЕ ї сигнального пептиду КОЕГ. Випробування на тваринах показали, що дана субодинична вакцина проти РСМ2 могла відповідним чином індукувати більш високий імунітет до інфекції
РСУ?2 у тварин.
Зо Субодиничну вакцину, забезпечену даним розкриттям, розробляли за допомогою генної інженерії, і вакцина мала наступні переваги: простий спосіб отримання, низька вартість, висока чистота, великий вихід і хороша безпека.
Звичайно ж, може бути здійснено безліч змін і модифікацій в описаному вище варіанті здійснення за даним винаходом без відступу від його обсягу. Відповідно, щоб сприяти прогресу в науці і корисних галузях техніки, даний винахід розкривають і передбачають, що він обмежений лише обсягом доданої формули винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«-110з СЕМ Вірбак ЗістекоКо., Йти. «1202 Субодивична вакцина проти пирковірусу свиней типу 2 1РОХд) «130» РІа-ОТЮ «БО» Пе Б/в, «уї» 8011-12-06 «і50ж РОТ/СМІОТ2ИоБЗО7 «Ії 2039-95-65 «160 5» «Мт» рагепегли версїтд п.5 «їх «?1їз Ба «212» ДЕК кхвій» Цеирковіруєс свиней -40025 1 вЕчЧавсасатс свадоачасу Бессесчсва сяаадасасе чдсссосодсвно ссабескде 5 сачаксоксе чЧесусосцсос седчесточкс сасссесусос ассаєвасед скацчазазчфе 120 явааваєдаса Сссксвасає ссдсексхтос сесаєсттся чагасасече савзуссадо, 180 асвуксачаа счсссссскя засодечавс асзаєдчачає ссваєвікаа созесвесась ака сссссчуздовуа чозуучассав свпадаєосої асасосткса вакавсєвсвао азгвачазач 309 тсстаззусва зассссучдос сбасгсссся аєсясссада чсдасацчав азсдачессс з асбчстаєта ссствззасча газесесоса зсгвазачсся сацшсосстаас сбабуасосо о васасваасті зспсестсесу ссасаєваєс сессвассст сесбоствасса ссссоучкас «що себасессаз дасессусссс суаскосась ассчаєссасє бБосвзассава садсвавнлач 50 азаєсазаєсс яЧдсезазасс асеазассосу довазсасчч ассасотвяд ссссячеасе 50
ЯдсчсссЯааа асачсваааста сувссацчас сасалаєдісо чсЯсаастає чсаєоевсав «бо сссачачаазас сбааєсства ацасоссоса сесазассо Ба «8102 «11» ха «хз ВІНОК «8135 Цирковіруй свиней «4002 З
Меє тик тук рко дк вк йхЯ Рпе дкч Аа дгу Вуд Нів Ака ро Аку ї 5 19 ї5
Бек Нів Бей сіу біп тіє пе Ак Ако Ак Бко Тхроїєц Уді нів рхо 23 25 30
Ака Нів Ака Тук вхо тТтр Ак дк був АБИ Б1у Тіє РНа АвпотТнт Акч 35 а З це обек вка тах Ве о зту Тукє тає уаї ув А13 Беу Тих Уїі Вхд тах
БО 55 в
Бко бек тТкр о Аїа Чаї АвроМмеЄ Мек АЕя Ве Аби Іі Авп одярБ пе увї 55 70 7 во.
Ето Вко ШЩіу сі1у З1у ТНК о Ави Був їшЛе бет 112 ркб вве бій тТук тТух 85 50 5
Акт ї1е Акач Ппув Чаї Був аї 910 рре Тер Рус Сув бек рко т16 ТЕ 10а 05 110
Зіпосіу АвроАка О1іу уаї біу бек тнж АтТа заї їїе Бей вБЮ Авр дви 115 120 ї25 виз уаї о тТвЕ Буд Аза ТвкК вла пем ївк Тук АБр овВхо ту у Авий тух
130 135 148
Бету бех Вха Нів ТБж Іі Рко бЗію ко Рбе бек Тук Нів бек дка Тук 145 150 155 150
ЕМпе тах Ркс пув Бко Уді рец АБр Зек тТрт їі АвроТух рве сбіп Рхо 165 Ітй 175
Авйп Бек Був АДкЯ дБпосСІв тї3і6 Ткр бен Акад Гей сб) Тпх о Зеї Азїа Авп 180 185 150 чаї Авр Нів Маї Зіу Ппей піу Тх діа Рве бій Депо бек руг Тук двр 155 хо. 795 біп АвроТук дви Тіз дхая уаї Тчх Меб Тух уаї зів бе ку іє рБе 215 215 вх дви пев був Авр рко Рхо Бей Був рКо роде: 230 «хК10з 3 «21ї11їз: 234 «Мій ДК «213» Цирковірус свиней «аж 3 атчасукасс саачоачося бсссзсача содаацасасс здсссссосв ставсскцас 50 сачаєсвосс дсосдссдосо сбаЗссесчес сасспсосясе асочесасот сучасна ї29 авдазвасчаса сбесгссавасас ссзсесобос сятсасоссся часавсассує саовзачераче 182 асацссачаай сЗсосЕсеова чеасууУсачеас абсзчаєсочадчас сеаабассза стає 238 «2102 4 «?і1ї 78 -ейїв БІЛОК «213» Пирковірує гвинай -3002 4
Ме ХпПх Тук рко Ахч Акч Ака РЕ Аха о АхЯ дк Акт нів АКЯ вхо АФ 1 я 10 15
Бек нів пей о сб1іу біп їі Бешобку Ака ахч рРхо Тр обей Узі нів ро
За 25 за
ЛЕ Нів Ака тух Акт Тер Акч Аку пув АвдоЗкУ 18 рРБе Авьб отих Акт рей щех йгЯ тТржх Рпе Зіу тух Тк оМаї був Віа Бех Тв уаї Акад оте во б 58
Ро чех Тр Аза уаї Авр Меє Мес Ахч Рпе Авп ої1е Аві Ар
Б та й «й «ЗА» иа «йі2з НЕ «віЗ» Пирковірує свиней «асо сЕбзсбсссс саддачузач дассаасаза аксеЕстасас ссьседаавка сбасачаавка бо ачазачасьава ачуссзазке седвсоссяас гесссаасов сесачечсцча садчеачачя 120 ччсрссасса серзЕвавесо адаєчаєвас СЕбсЯарааска задссасаче сесвасстає ї8о часссстаг: у гваастаско срессяссає асзвасесссосс азосостоте стає Б жя «ріб» «ам» 7 «в12» БІЛОК «З13з Цирковіруєс свивей
«400 а пе саї вк ко сіУ бігу зіу тк АБа був тів беж Ії Рко рпе: Бій ї 5 10 15 тТух тує Ака їЇ1е Аж Пув маї пув уві бій рре Тур ркз Сув Бех рко 20 25 за
Ії ТЕ сіб сіу Аве Ак біу уаї сіу Бек ТВт Аіа чаї Те Пей Авр жо 5
АвроАвй це уаї ти цув Ма тих Аїв Без ТВ Тух Авровко Тук чаї
Зо БО 50
Анп оТук Бек дех Ажу Нів ТвЕ тТіє ро бій Бко вне бек ту 65 о 5 «1927 «її З3У «їй» ЛЕК. «ТЗ» ПирковАрує свиней «оп сасссосаЯЕ асрстассосс азаасссобо сссЗвсоєсса стасбсавса свбосвасса й засачсваяа ччаассазасє Ссочебчазут стасвзавсосс сечова часової а: 380 чзсеісязра сізсчсЕсЯа айасачіваа басуасосачзу ассасазває сезсабавсє 180 зкчЕвсасас вактссаицача асБєвасессь заадваєсвсес свобсвавос с 31 «810» В «2315 77 «ати БІЛОК «вті» Цирковібуєс свиней «ад В
Нів Бек дкч Тук ве Тбж Вко пуб Рго уаї рей Авр бек ТВкЕ т18в АБр ї | 5 10 15
Ту Впе біл бу Авт бек оГув Ака ав обі іє Тер ойей Ах теза бів 3; 25 30 їх Бек Аї1а Взп Заії АБр Нів УуУаії 61у їен дбіу ТНЖ Аза РБе іч Аве ї5
Ясж був Тук Бр Піп АБротТує Ап ої16 Аку уа1ї Тв оМеб Тух баї ОЇтЬ с 58 50
Ре аку бій пе Аяй Ге) Був АброРхо рРЖОо Гей був рко 5 7 75 «230» 5 «її ЗБ «газ ДНК «2Аз» Пирковіурує бвиней «0 З ччачеачасс ссассоссУє сассссачає чабаасксся гзассвачеас сасачсесеа о асссзЕдасе сссаєсттава стасссосптос сЯссасасайа ссссосааєсє ссесссоссве 125 сассесодеє астЕсСасспо ввавсскуєс ссбдаєтесса стахсдЗасва сссссаасса ї8а азаасачсаваа човассачакє стачсецазе ствсвавесі сессаваєче зчасвсасаса гай чпессісочка ссасЧкрсЗа азвзасадьаза гасозссачя ассасвакак соугосавсь зпо авчіахєсасас аасссСадчача агсбааєссс завзчасоссс саєссзався с зві кхаїйз КО «її Тї7 «ій» БІЛОК
«»13з Церковірує свиней «4005 19 бЗіу маї Сіу Бек тТрх Аїа уаї тіе тез Авр о Авр Дак Ре аї Тих Був ії З 19 15 діа тк діа Бей ТЕ Тух АвороБко Тух уаїю Ав тує ех Бех Аке нів о з зо
Три тів рго бій ро Рве Бек Тух Ні йех Ак тТук ре ТЕ вхо Був 35 49 ї5
Рус Уазї їй Аврочек ТБ тів Аво Тух Рре бій вБЕОо Ап опех ув вк ві БВ ва
Ави с ій тів Тур опец БЖ Ппез Бій Так Бек Аза ввй Ууаї Авр Мія Увї та 5 во біу демо сіу ТИЖ діа Бе ОТй Ав бек їув Тух Авросій двр о Тук Ав 85 о 95
І1е Аку уаї ТБЕЖ Меє Тух Маї ай: рРБе Ах сій пе Авпдо пей Ппув Ав 105 105 419
Рке вКО Ба Був о вко «зт» 431 «21їз 65 «ВР» ЛИХ «233з Цирковірує свиней «в» ТЕ
ЕсЕвЕссссо счазазудач чассовасана абсксвасбає ссевесоваба стасвчаавса БО азаазчуєса вачЕсчаасї січасостас всоссадеса сосачавсЯв сачччцдачесу ї2о зассссасту сбаксавісс ачасчасвас гсбдсваєса ацуссасауе сесаваасстає їв часеосстася базассассс скоссчссає асавссосос зассосЕсоке ссассаєссо ча сачзсассста сесовавасєс бЧчЕосеісчав Ессастаєвся актсасєесссса ассважсаче 309 заваччаавес взчасссачес чацчссасза ассссузсва абчеЕудасса серадасево зво зегастасеє ссдатаасач газаєасчаєс саддастаса абасссчечє зассаєдває 420 чФсасач«ссса чачаасстаа Єссбаавцас ссоссассса аасос ав «віх 15 «2112 155 «1йм БІЛОК «2132 Чиркаовірує свиней «00» 17 вре уаї Рко рхко Фіу біу бїу Твж деп обув І1є бек х1іє Бко Впе сін ї 5 10 15 тТук Тух дДкя тіє дк Ццув уві Ппув чаї св вве їтвр Кто Сув Вех шо 36
Тіє ТІ зіп пу Авр одху СІту Маії СТУ бек Твк Аїз Маї її Без Авр з5 0 45
Авр о аБа Ейе уаї ТНЕ цув Аїа ТНК АтТа Пец Так о Тух Авровко тТух уві вО й дви Туїх Бек Бех дру Ні ТК Ії рго біп о Вко Ре дет Сук Нів бек 5 о те зо де тТук рпе Тих Бк Був Рто Маї Мер Авропек ТВ ОТХіе Авротух ре 85 о ЗБ шЧри вхо лап обех цув вк Ав осСій Ї1їе Ттр о Бед Ахя Бо бій ТВх бек
БЯ 185 іхо та Ав чаї Ввр онНів Чаї йпуу реч бку тих Аза Епде сій де Бех Був 115 150 і55 тук Авр зЗіп дво тує вп оГіве дко маії тТвкоМеї Тукх уаї бБіп рпе Ага їт3о ї35 ї4о із БНе Ав оБецп Гуз деровБхо рко ре) Був Руто 145 ї5БО 155 «ві» т «811» 48 «ВЕ ДНК «вка» Цирковірує свиней «400з 13 аєдасусаєс савазчачуєсу рЕсссодсада совачасаєс чессссасач ссавсвсоо 50 сачаєсссссо чесасосздсвс ссуЗсксяко сасссссясе ассссаєсстя сбезчачаабу ї89 ваазваєсоаса ссстсавасас ссяасевоксс ссосасєссься часабассар свазчераце ї80 азсачтсацдвна сусссссссУ засчарачас асзасвзачає ссаабвєсва сзасесрЯсь 2430 ссеєсуздаз чочочассаа савааєсссоє яеассссттсЯ аакассасач забаасбвага запо чЧчеЕсвачасся аакссосчцсс ссусессссова зассасосвуц деЕЧчасвноадоз аусадосвсе Зо ассоссовЕа сгстачаєча саастссСаса зесгзадоасса своссосває сбабсчаєссоя ий сасставаєс асссспоссч ссасавсавье ссосавессї Кебсебає 48 кто» та «8115 155 «кава» БІЛОК «шіЗ» Цирковірус свикоей «вп 14
Ме Тр Туковго АкЯ Ах аку Рпе Ага да Ага АКУ Ні Ахо Ко лк ї її 10 35
Бек нія ем спіу біб тіє зва Ака Ага Вхд Бк Тер обем ува нів БКо 25 25 30
Ака Ні дк тук АкЯй Тко АК дея Був ввп сту ті Бе Авп отак Аху
Пец Бех Ак Тих ве сіу Тук тп узі Був Аїа Бех Ту Чаї Ахе ТЕ зо БЕ БО вто беж Тур Аїв Уві АвроМес Меб Акта рве Ап оті два Авр о РНе уаї 70 75 во
Бто Ркй бі біу біу так дДвл гу Її Бек Т1іе Рг РБе Бій Хук Тук 85 зо ЗУ
Ака Її бхч пух Чаї ув Уві бій Бе Тхрорго Сув беж вто їТте тТвг ї9б0 їа5 119 сії Ту Авр о Ах сО1у аї сбіу бех ТОЖ АтТа Маї її Бей АБр о авр Дві 11х5 125 а
ББе уаї ТВж гук Аїа ТВЕ Аїв рес твкЕ Тек Аврорхо Тук Маії Ба Тук 1360 ї35 таб ех Бек Акч Нів Твк І11е Рко сіб Бгто Бе бек отук 145 ї5О 155 «8105 15 «-31їз 702 «912з ДНК 213» МупШковіруєсє швикви «400 15 агчасубаєс сазачвучся сСбассосача зуаздасаєс чессосясач ссассквбода 85 садвіссься чссассусос седасесЯєс сасссссяос ассуєсассу сгодадчаваа 720 азаазсцЯса босісвасас ссчосесвсо сусасссєсЯя чакасассає свачесддвасе во асасссваав ссассстсостя частасячас асзасчачає гсзасассза Єдастссссс 40 сесесвачач чадусссява сососусьсо сбцдсссеєвУу ваграсгасва засазцдаавч 300 чЕсазчУустУ аабЕстудсс ссдоссоссоя абсасссаче дедасзазча ачесчеадсссо ЗЕВ ачеЕчесасса сіссазчзаєча бавсвссцса зсаваудсса садсессссає стасцдасссе 26 гаєпсвадсс аскссвосоЯ ссабассаєса асосечсосе бсксорассов осксссвсає «80 сксассесса звссеЗвсСос ачаєссссвсо аседассась єссавосава саасазаача зао зассацескак чассдадчасї асазаєссчоє ччайасчсазч пссасаказа ссгроадсаосх вад чечстсдава азсазсасаза счассазчаз Еасаавсавос пгосавссає чвасасасза 6650 госачачаає Єкзакестсва адассоссоса сссавсосько аа та 810 16 к21ї» 233 «па» БІТОК «йРі» Цирковірує свиней «ай 16.
Ме тТпЕ Тух ВЕО Ако Ак Ака тТух Аж дтЧ вка вх Ні Ак ВгОо Аку 1 5 | 16 ї5
Бек нів їецш Зіу сіп Ії пев Ак Акш Аку РКО ТІВ Пе; уні нів: Ре а 25 ЕТО
Аха нів Аку тТук АкчЯ Тер Ат Ако Був Авпобіу ї3е Бре АБ отв де 35 40 45 пейш Бек Аку Тпх ве Сіу Туж ТНЕ Ії їув Ак тт тТпЕ Ууаї Ппувотну во 5 ей рко Беж ткроАїа Маї Ввр Має Меб Ах ВБе АБпої16 Авп оАвровБре Бей ве то те во рЕо вх осі Сіу зіу Бех Авп Бо Аха Зек уаї Ро ве біц тТукотух
Ь Зо БК
Ак т1Зе Аку пз маії Був маї сів ББе Тк Бо Сув ех ро тТіє Тнх ї0о то5 10 сів біу лер аку б1іу ув б1іу Бех бат Аїй уаї ї118 ем Авр АБр Ав ї15 120 125
Ре Зав отрк Був Аїя Тих Аза пев о ТВт тТух АвровБхо тТух Уві Ав тух. 139 135 15 бех бЗеї АкУ Нів так їі Тк зів БЕбо рае Бех Тух Ні бек Ак тТух 145 15 155 і160 пе ту вжо Пув ВЕ Уаї Без Авр Бех Те хіе Авр оту Ве бік рко 185 1760 175
Авподви пу о Ак Авп бій Бей ткр цей Аку вип Зій тв Аїя у АВ за за5 19
Уаї вве нів уаї ліу пед бі те Аїа РБе о б)ін АспобЗекс тіє Тук дер
За 200 за5 пз бій Бук Авп о тТ1іе Ат За1ї вк о Меб Тук о Уаі бід рве Ате Бій Бре 215 22
Авпобей був Авр оБхб бро Пец Ав РКО 285 230 «КО» 17 «2і1ї» 234 «В12з ДИК «213» Цирковірує твиней «й0Оз 7 писесрессос сасуачачау сесааасссо суссссоакас сосставзата стасазааха 80 ачаазаоєса ачаєсцвасс сбоддссссус бесссдасса сссвоачсцча саучочачсо 179 ччастссачкя сссапсавесе ачзаєсчатвнас сбксагаасза адоссасаче сессасстаює 80 часстосаса Базастасто сбсессдосає ассабсаасес аЗссссрстс скає «З «іп 18 «ЗТї5 78 «2125. БІЛОК «2132 Циркховурує свишей
«по» 18
Впе Пец Буо Ро об51у зіу біу Вес Ввпорко Ага бек Маї Бко Рпе і ї - 10 15 тТук Тук дДка їїє Ажа Пув чаї Пувз уаї бій РБе Ткр Рго Сув Бех Бто 2 РЕ Зо тт ТНЕ 010 біу Авр Аху стіу уаї сіу Бех бет Аїа Чаї ЇТ16 Бей Авр 315 а ав
АвроАбп ре уаі ТВу Був дів Тик Аза ей Тк Тк оавр о рко Туж уві
Бо ва Бо деп отух дет Чек дкаї Нів ТВЕ Іїе ТрЕ бій рРхо рве беж тук 65 та 5 «210 19 «»11з Ок «тій ЕЕ «7132 Цирковіруєс сниней «ап» 18 асчасЯатаїс сазачадчуся сгассасача савачасасс дсссссзсач ссвосесдас «0 сачакссксо чссассасос сідастацдес сасосссзсс ассяассассо сучаауаача 129 азаазасчаса сосссавсає соассссссс сасассаєсЯя чЗебасассує саачаззвасе ї80 асацісачав сасссссссЯа заасагчдас аєдлаєчачає стзасаєссва Єдасвссссь зао сссссззчуач чочУсссаху сессоссасс чрасесврсЯ загасгасач загавоззчаза заб
Зстазачссч аарсстазес седессоссог ассасссадчо дсзасацучу аубдаческос 3859 ассчссасса ссстачасча ссасессцва зсазазчасса абоссскаас ссвечаєссос 420 сассіазасєс аскссісссотр ссазассага ассстазчесвес бессесасса совссчахас ано жссассссцча аасссясось бцдасазчаса абоечаєссасє сесавссосва гаасвазача. 5іа заєсаасссб созсецачасе асзазесасс зуаааєцчсав ассвкабаач ссбесуцсасі 850 чсчрЕсуавза асачсасаса счассачвас сасаасаєсс узбасазассає зсасугасаг 550 ссгсаччачазь сСсзаєсьстаз ацдасссссса сттгаасессба авсща. то «10 оо етїь» й «ій» БІЛОК ки»хЗ3З» Пишковірус свиней «кара 29
Меє Трпж тТух рко дуЗ Акч дк Тук дкч Ак АЖЯ дкЯ Нів АкЕЧ ро дЕщф їх 5 10 ІВ
Бех Нів бе біУу Зій їіє рем АкЯ Акад АкаЯ РКО Тер о пец уа1ї Нів рхо 29 25 зб
Ак нів Ак Тух Аку ТкроАгЯ АкЯ пув Авп обСіу тіе Ре АвюотОх лЕФ
За зо «5 рей нех Аку Таж Ті біу тух ТнНЕ Чаї ув бує Тв Ту аі дка тах 5О 55 й
Рха Бек Ткр Азп Маї Бар о Мес Мес Яку Бе дзпоїіє Ав) АвроББе пе) 65 та 75 во
Бко рко біу сіу Зіу Бек бек рхо Пен ТНу Маї рко Рце зі Тук Тук 95 35
Ака ї12 Да пув Узі пув вії 3 вне Ткр во Су Бех Рко їіє ТЕ
То Щоб 110 ів овіу Авр Ах біу уаї Бек Бек Тих йіа Маї тіє Сей АБр о Авр АБИ 115 ї90 25 тре уаї Тв бує біз Авподвра Те Тну Тух Аврорко Тук Ууав Авпотук ті5 189 йдеш Бех Ак Нія Та Тіє ТБк бій Рго Рре Бек Тук Нів Вех Ак Тух 145 150 155 160
Бе їБжх вхо пуб рКо уаї це двр Ах ТпЖ Ії Авзр Тут Ре біп рко їва 1740 175
Авл вва пу Акч Авпосіп пей тТкроцей Ву без бій Так ТБЕк біу Авп їВо 185 190 чаї двр о нів Маї сіу цей біу тру Аіа РБе бій вп бек ї1іє Тух Авр 195 258 25 зіп дво отує дна т1е аку їі Трх Мес Тує уаї біп рРпе АкуУу бів ВБе 2о 215 229
Авпоїви; бу АвроБго Бко Мей Авпобка пув 275 230 «10 зх кв1ї» 238 «2172з ДНЕ. «віз» Кирковіврує свиней «ад» 71
ЕкссеБссссс саччулзачоча сесяачессос сссасьчбуас сескеслазвба ссасачаве в 5о ачадавоачіча ачдисдаанс ссаассссдю Ессссааєса сссзоаасча сазачзачся 120 ачстсесасся січссзсбсЕ ачасчабєадс сосасавсав азоассвасає соссадессСає 189 чассестатч пазастастс сссссассає атсакааосс ачсоссссеео стає 234 кві» ай «таз 7 «ВІ БІЛОК «еі3» ПиСковірує свиней «ад 22
Бе рец Рко Бто 01 Зіу бфу Баг Бех Рхо пе ТВу о Уаїі Ркоа РБе сій 1 5 1ї0 15
Тук ТУух Ах Тіе АтЯа пув Уаї Буд оуаї Бій Віре Тер Ро Сув Бек РХО 75 Зо
Те ТВкЕ іп зі вроду біу уаї бек бек Тк оАіза Уві ї11є реп Авр. й а 45
Авр о взп о Бле уаї тв о цув бів Ав» дій Бей Так отТух дер оВхо Тух Ууві1 во
Ап отТух бек бех Ака Ніз ТНЕ ГіЄє їх біп Рко РНе Бак тує 55 7 ас «вАО» 85 «21іїз Зі «а? НЕ. «13» Штучна послупевність «вай» кхЕоЗ» Прямий праймер о лня Кі з ОБЕ? в оОРСУЄ «00» 23 сесвзазеста саєчаєчсає ссаасчвоаче в ЕВя «КО». 4 «2ії» Зі «пи ЦЕ «ВЮ3е ШЧтумна посдЕдевніств «Ра «03» Зворотний праймер Для Кі а ОККО з ВОМИ Зв «Об 4 ссечевсачя сугссвачвя задач в зі
«21. а
«211» 31
«тій ДН
«йРам Штучна послідсвмість
«ІЙ
«вІ3х Прямий праймер для БО з СНЖЕ з РИМИ та
«00» 5 сесаачсстУ сссвБаБсссс ссочучачадче в з1
«иїйз 46
«ВЕ ЗІ
«1 пи.
«ВІ» Штучна послідов ствь
«вах
«23» Зезротний праймер лля КО З 'ОнКо ворсу жа
«4005 86 ссоатсссавао бебдачавая чссвдоаадачак о Кк
«ба а
«йїїз 3
«віз ДЕК кшї3» Штучна послідовність
«вах
«283» прямий праймер шля КЗ з ОДЕВ з РОМ та
«ад» 27 сссазасеся содссессоч бассвесаосо сс 3 хаО» 8
«й ЗЕ
«їй ЛНЕ
«13» Штучна послідовність.
«им»
«шшаз Зеоботщший праймер ший 3 з ЗКЕК З РОМ. ла
«400» 88 ссчасссзаєзу сосЧЕсаасає гадассксає с Зі
«20» 25
«иХ1з.
З
«Щи ДЕК
«уЗх Штучна поспіданньсть
«Вл»
«го3У Прямий праймер для БК з ОВБКО з ВСУ ба
«00» 8
«сссзадстка сазачьоудс бесасгасвя Є Кн
«їз» 30 «Ії» 48 «ла» ДЕ «213» Бвопекіспів соіїї «00» 30 сесвазадач асоазасссач ацаєсчаассц азауасдавяо сасдвасда «8 «ТО» зії «Ех їй «ша» БЛОК. «аї3з пвсбекіснів сої ап 31 ей обув опув АнроЗій Ге) Аху Авросіц Бей Був Авробіб ей ї 5 10 «810з 37 «иї1їз 44 «То» ДНК «21їз Штучна посліловнісятх «во вба» Прямий праймер для КОКІ. «ой» 3 сосавчсссс ссвааааача сдсадсечача ззбзаассда авча 44 «йІ1О» 33 -811ї1з 31 «віш» ДНК «213з Шрузнае слссплідсвністі «ато «га» дворотний праймер для КОЖ; «00» 33
ЧдЕасісчаче ачтссасске ссапессаро с зі «230з 34 -21їз 15 «оз ДНЕ «ха» Резибстопав зегизіпова «ВО» «308» СепрБацкЕ / кої397 «Зпе» 3002-22-11 «313» (ВТ... (1936) «400 34 чесадаадавау сесЄсчасиє студвясзва сусуссваву ссгосакЯсє сасовбсаду 50 зчасчасчічо зесссачесч сабозасусо дассодасса Єсуссозасяас озасозчссац ї2а зчечечесЯас ассассесає ачссстчоаЯ Засадсвасу асосчоссоваа зсбосеаве ТВО часаатсчесс ксачзсассас садсуаєсчеає седассаєЄсс чссеєсувача сачеасооав ай седазсвадсе содсзсассв сачстасася счесачасос зосдчосазссе чссосравае 300 счучесязсас ссасслчдсса суачдвадесе бссчаасарса аасзсасссає ссасчаасьо Зо аасцуссзчуса ассацессач ссасанчсся ссдчасстаса сбсассзчачає чачесзасава хо ссцебадсда азсіЗздсасо суаєбоссасс ссссссосксв чудсачсасоа сазсгаєсдач 480 акосачесча счсосуссає сзассасосс Здчавссачесв заг сасас ссадасссад аб ссасасосЗчЗ азаачсусто дадевхасая песавдсоадса ааЗзеЧесаву ссгусосчас ау ссозесгозаса чаасссасав ссасссодас бачсадесчсе збаассЕсча свтасосад БО
Зазцчсазча бобассучУу чесевссвчос аассосудсча адсасуасос ччасаксвай 72 сесавсоуєса ссауссаєсу ссрусасеке ссосздзозвзсу чдсачесссвзЯс сусяаседасе тво чедевссадчо сесассассс чесассзчач всссссассо здесаксочсоса зссзсосаус вай счачаасвас СачазсвУєчу ссаЯссассея зсасацочас бозечессої ссасосуєет збо чечсчасеці сзбучайсса зессчассва сечасссоаса асоасоссвдЯс СадесосЯде ЗО засачечаст асссацасуа ачоечаїссус дадсачесчі адсачасссоу Єссдасоссу 1020 апсссоадсся ссдссдацевч спаасоассес вессуусаце чсассучсав счасчачаєсо тов часєчсядсса асуссдасос здасчадссьва асессс 1316 «2105 35 -21їз 378 «18 ЩІЛОК «-«2і3з йЕецОЯОотопаз аскиауіпова «0» З діа ста бій Аза ве Авроїєю Тхр Ави бім Сув Аза Бу іа Сув Уаї ії: З То 15
Гей АБб о без Був бар остїу Саі АкЯ беж Беї Ак оМеє Бах Уаіїі Аврорго 20 М Зо
Аїз тів А1а др тн Ап обі зЗіп сіу Уаї їео Ні Тут Бех Меб Уаії 15 о 85 пем обі б51іу сіу Авб Авр Ба їши Був Бей Аза Ті Бвю АВи Афа Пец о 5 60 дек ІжХа Тк о шек Авросіу пеш тк пів вка пейп сій бту «1у Уві ази 70 у во
Еко дБ Пув око Уаї Аку тує бек Тух тру Ата зіп Аїа дку Ру чек 85 З за ткроБЕХ Тей Ав обтхр оцей Зві вхо тів бьу 335 сі пу рко Беє Авп її 105 х10 тїа мув Ууді Рре її нів бій без Ава Віа. сіу Ав бій Шец дек НІВ 115 ї20 175 мес беж ро г1е тух ТБж ТЕ б5тз Меє 51у Авр сій Пей цей Ата пу 135 їа5 40
І: Віа вх Авровіа тах рРпе вле увь вка Аза Нів Зїий Шех Ав шпіц 115 150 ї55 160
Ме зів свко тіж Бей діа ї12е Беж Ні Аза бЗтТу уві Бек Уаї Уаї мес 165 ї7О 175
Віа біл) тах піп Бго Ак АкЯ о Зій Бу вка ттроБех ба тк Віа век хво т85 190 сіу Був Уаі ме) Сбув цеа Мей Аню о Бко Пес Авробіу маї Тух Ав отух 185 295: 295
Бей Аза сіп бір Ажу Сув Ав опе АвроАвротВЕ тТкр о бЧіч бі Пув о ї1їФ 259 зї5 230
Тук Акт уві їн Аїз біу Люп Рко Аїа цпув Ні Авропцей Вер Т1іе уз 295 235 235 240
Бхо тнх Уві іє бек Нів Акч Її Нів Ре рРго Фі О1у 91у Беж Пе 245 ї5О 255 із діа пе ТЬх Атіа Нів сів АТа Сув нів Гей бжо рей бій ТнЕ Ве 250 285 270
Тайх дДка Нів Ака сій рто Аку біу Ткр січ бів Бей бі біп Сув Б1у 275 зво 285
Тук Рко Уггі біп о Ака Пец уаї Аза Тем тую Тед АТа діа АкЯ пПез беж зво 795 зов
Ткгр Ав осій баі Авробів уаї Її1е Аху Авп діа Без діа Зек о рко Ту зах 10 Зх за
Бех шіу біу Ар Бей сзіу сіб Атїа Ї1е Ага бін сіп Бо Зїй біт Аїа 33а 335 дкщ цей діва пев тах Пец Аіїв Ата Ата сіб бек сій дк Бе її дк зо 345 35 сіїп очі таж шву Авп о Авросі Аза сту діа Аза АБп о Аіа Авроуаї Маї 85 ЗО 365
Беж пей Тк Сув
З
«21ій»х 36 «Зі «313» ЛЕК «813» Прруйдйна послідовність «ЙО» «ва3з Прямий праймер йля РЕ «й» Зо судчакссда азавчсуєсо час 23 «їй 37 «їв» 3 «12» ЛЕК «ВІЗ» Прручна посліковність «ВО» «3» Зворотний праймер для РЕ «а0йз 37 пчаваксссаж добесзсачає садясьсясс ас 32 «В ЗВ «81ї» ЗВ «ЙТИ» ЦНХ «13» Штучна послідевмість «йо» «Ва» Прямий праймер для КІ з ОККЯ з БОУЄ ха «поз ЗВ сзчзачежссеЕ ассессосас часчачаче 28 «Ві» З «Ві1їз ЗХ «вій» НК «віях Штучна поспдідовність «аб» І «Фах Зворотний праймер вла Кі з ОВЕЙ з ВОМ ха «по» 35 «освачевся саччачаагчЯ чскЗааачає є зі «10» ко «21ї2 1413
«авг ДНК «813» Штучна послідовність 3202 «23» Об'єднана ДЕК-нзослідовність РЕ, ОДКИ-КЙ з РОС? ба та КОЖ «а0бж о ччайссдаав аассесссда сегесгсочнво заасдсосса вацосечсаю серсзчасстьо С звачасчуся басассссау сспсвілаас чсодчасесуд сезесзссуа сассяасяуе їо сазчоеасясос сасасстассес сасчасестя чадучечаса асчласусясс сааадсваЗес 1855 зЕсуасвасу сестсвоусвЕ сассвассає осебуаєса Єссосоєсча вачсадсаке иа чачесчазса адссччсасу стасазссзо асоасуссаачу сусдсуясач Бсчаксосеу 300 застчасвЯс гассчаєсоу ссасзачаач сосіссааса сСозаччсЯве сасссводаа зо ссчЗаасассЯя дсвассачоє садсосасасу седссувссо асассассяча часєчудсчас ато чачссассвч созачесчас чделоезаєбчес асссксскся совзачсаса сочачачсаве ап чазакасаче сочасуссстяс саксачессає дссудасесв зсдгаассахт адсссваасс па садссцдезсес чачааавасе стздачочаа Содпеассачся одсавачесясе засос асте 530 чассосясіЗу зсззчУссса сваассвосто зсссадсавс ассчдсваассс сзчасуарасе б5о сЗзячуаачуєв ачаїстассу Уусасосссесс Здсаасесоц сцтавачсатса сссодавсасе Що аадасссасуя ссзссачсса ссасосадсво ссбсссоачо адсадсачосо досезсусеу во. всосзедсасс зоцчоссчавса сессассяссо чачассесса сссоябсаксоу ссадесасоє аб часіосяазс вассаадса зсосявасває ссячсасацс ядосточрсцс сссосасоєа. 99 чочоасасояс гчЧЕсУукочав ссачуссчас саззбуаєсо дсавосзсссї дчссадсссе з65
Учсачечася зсуассівЗц счавусзаєс счсоачсвас созачсачцс сезбобавес То ссдасссода ссзссусоча чаасзуачдсус єссабсосаче вазчсассуч сгасчассв у 5985 чЧсесчасцсяаЯ ссадсоссза счгчахчаче ссчасосусо адссосвека бсссседача ї140 чччазчасса асваванвскс васасссксс дзасассаса озасаачааа заптанацюс 1209 зчзазегсіччс сегбуустсссс засасссаз чдчсазсазця дачкодасто сассоастоаве 1266 аскстадаєл агзассксЯє вастзацосбс асацесстаа себасчассо сбасчсваво 1390 бассссессс зосабасває ссессавсос БЕссесеЕваса зоссстсісва аазвасаєсзва 1389 сечачачаєса аассовдаатча сзазссасес чад та3 «210» 41 «ВМЕм алі «ейтах БІЛОК. «213» Штучна посліловнисть «Ша «223» об'єднана амінскислотна поислідозністев РЕ, ОБЕ2-КО в РУ га х КрЕЕ «400» ах бі Бею сій сл Аза вВДе Апропем Тер Ави бій Сув Аїд Мув Кіа су
Ії З 16 15
Увазі п еа Авроїец Був о АвросіУу Узі Ага Бех ех вк Меї шШех уві Авр 29 25 30
Бго Віа ті Аіз Авр Тих Авзп бі біп бі Уаі рей Нів Тук Бех. Меб 35 чо 45 таї Ппем зіч біу п)у Ав Авров1іяа цей Пув без Аза ї1їє АББ Аза Вів.
Во 5 6о їсч бек її Так обех Ар сїу рей Твк ї1се Ака ей сій бі аіу аз 70 7 що бії вхо ав Був Рко Чаї Ака Тук беж тую Типї ДЯ бій оАта АкЯа б1У 5 зо з
Бех Тхр Бек Бе Ав Тер рез о уаї Рко їїе біу нів сій Був Рко Вех 150 155 139
Авпотіє пув Уаї Рре тї1іе нів Зі Пео лап о вдів б1у Аво бій Пен бех о 125
Нів Меб Бех Рко Ії Тук ТЕЖ о ТнНЕ бій Меї сіу Авр о сї» Бей ей Ба
139 ї35 140
Був їм ліз АкчоАвроА1а Тк Ре Ре уві Яку Аза Нів б1ц бек Ап 145 і5О 155 БИ
Зі Мебї біп Рко так опей Аіа тіє беж Ніш Аїа піуУу уаії Бек Маї узі ї65 Ма 175
Ме Аїа сів тТвк бін вржо ВхЯ Аку Зі Був Аа Тер обех бій Тер одіа ї8о їВБ 1980 век о сіу руб уаї пезй Сув Бей пев Аврорко пен АБробіу таз Тук Ав 185 240 05
Тук Гей вла сі) 0154 АгУ Су Аспоре АБр оАБр ТВу їТїхр ЗІ ОБУ був 216 215 за тів Тут Акз Уаї цем Азїа сту Абпорко Ліз пув нів АвроБбей АБвБотів 225 2359 235 241 їув Рко Так уаї жхіє Бех Ні АхЯ Пец ніЗ Ре РЕо бім сі біу дек 245 25 255 їєц) Вів Аза їні ТЕ ЛІВ Нів біб ові СУ Нів рей Бо Бека сій тк 250 -йв5 270
Бе тк дкЯд нів Ага бій Ррко Ах іу Тр бій біп пем 510 біп Сув 275 з80 285 бЗіу тук вхо уві бів Аке цей уаї АтТа пес тує цей діа АЗїа дгЯ пен 250 295 300
Бек Тер а5п обіп Уві дер осів Маї їі Акй два Аза рез Азія бех ка зав зо з15 20 сіу Бек біу сіу Двр цеч біу іч Азїа піе Ак сій бій Рто бі бій 325 330 325 діа ка Бей Аза спеи Так оце А1а Дів дів біцш Бек 0Що АхЯ Бпе тів зо за5 з5БО
Ака біп біу ТНК біу АвподвБр бі) с Аїз сіу Аза діа дво йіа двр о угі 355 зо зе5
Чаї Бек Без Так Сув З ївц вре Маї Рко БО б3у Сьу у тах Ав зо 378 зво
Був ті Бех ІТ РКО ЕЕ з) Ту Тут Ату їлЕ Ако Був Чаї йув Уві зв 390 395 «по еіаовне Ткр вЕо Сув Бех рРхОо її Тік сіп сту Ар о дка Ту уві 01у ав 430 415
Бет тих Аїв Майї Іі Гей Ав дБр АнбоБНе Уві Так о мув о Ата ТВ вза 424 45 зо зей тТБЕ Тук дво РКО Тук уаї Ав тТух дек Беж АкЯ Нів ТК тіє рко 435 ах 445 бій ко Ре бек о тух Був дей пед був був АвроБЗін ред бЗкКщт АвВробти 455 455 аво ем пуз Арошій Бе Бетсі 65 70 «им» 4 кіз 88 «рув» днк «-235з Штучнкя патлілавніст «ах «га» Прямий сраймер пля сБКа-КиИ з ВШ тю «-2505 45 счачссссЕс сесоссссач чачечавс 28 «810з 48 «21їх 35 «и» ДЕК «ТЗ Штучна послідовність
«ВО «22 Зворотний праймер пля ОВЕ?-К2 з ВСМО ов «400» 43 спсосзачесвсЯ садуазчааоЯ чесчачегає Зо еКій» «й еві1» 1413 «Вій ВИК «Ваз МПеучня снасплівність -020з «223» об'єднана ДЕК-послідовність РЕ, ОДКЕИ-Еа з ОВУ? Бо Кр «00» ча ччасссоваз авасясссза ссссдсваєс звасусяасса задессасяє дессовссос во авдавсазся дода ессач ссясаєавує угечассеяу ссаєсяссдаяа саєссзасоче І120 сачучезбас басаствекєс сабсчресска чачаусЯцса зечасясусь савцебачеиє їно аксцчасвася соссгсаусає Сассазчсуас чссосспасса бесососєсса зодсадесвке зай чазссочааса ачдессочасаса ссасадобає асдочссяач сясасачсвя сСсадвсясся зо аастачекчч бассоатсуд ссасозааач сссводяаса сксаваасявь сарссаєсцай 5 сбцзасчсся зсааосацеє сачдесасасе Бедсозассє асассяссяаа дчасавусчас 29 чачісаскза счавуссвас дсасосасчеос ассссссссет саччасчсв счачзосває ай зачдазсчсачо счасясрсяс саєсадесав чдсодачдакса чоезсязассає досстадасс 5ій сачссчсусс чдадзаавачсЯя ссччачсочЧав сцеачссачуся довачачев дбассічсоко в часссочоссоч асачаЧуста саастассіс дсосачсавос чесдсавссб счасячавкасс 5650
ЕЧасдаачаса ачасссасоч с чахчевсочюо пасавсосУуч счаачсасЧе собачасаво 7го авасссасяч гсассазчсса кечсссдсає ссБессчача чечЧсадесе дуссусчсвУ тно ассчсчсасс зась счсса сстассчеса чадасувоса бСссзєсабея ссасечсує наз чпчесчузаас застоучачевз ФсчеччсевВе ссзЧрусаче чассЯчесяс сесстасося 2360 чсУЧсевас сассасаЗав ссеччесозс садчесаєссс дсваєчесссї зассадсссо зай ччсачеЗасу дочасссавя сугачесваєс суєсчазчсаче содацседає сесессадес 1320 сбувссскоч ссяссчссча чадсзачеуєс бссабссаЗс ачдосвссяз Саавсечастач тво чесечсусот ссвасуссца сасучсдасс сечассвясу адессвевся. бсссссадуа 1149 ччччастсесад асессебусьс совчсосвєс чЧаастасгаса дазтавоувна учеказоче 1502 чвакробеЧче собуєссссоос чабсасссац уЗксасозчо чзазеуученс сачбусечсе тебо аксстіачаєч асазсессч: авсзаачасс взсазссовса ссбсасчасос ссвечсаває 325 кассссвсес дссанпассяє щвасосвассо сЕосссбаса вЧсессссяа адаздасуза ї380 седазчечаєч аастдавача саяааседчскс дач 1413 «210» 45 «йт1» 87 «аа КІ «йраз Штучна посмідовність «вах «332 Об'єднана аміБокислотняа послідовністворт, ОБЕЖ-КУ зо ВСУ? рої КВЕХ, «4002 5 біу Жехк бій бій вра Ббе Авр Ге їхр АБа Зїц Суб Вій Ппув о Аїта Сув 1 5 10 15 узі цеб Ав пем о муУувБ Авросіу Маі Ахе Бек Бек Аке Меб бдех Маї дар 22 25 30
Бхо діа Іі діа Ар ТЬх Ап біу пів Сіу Маї Бво Ні тТух Бек Мес
КІ аб таї ген бів пі біу Азп о Авр Аза Геч Бує Пец; Аба 118 Авр о Авподіав
ВО ух 50 їсеч бек тІзіе Тв Бек Авр біу Ббец Тк Ії Ак цей бій сіу 61у Уаї
759 та яо бра врхо АБпоБбув Вко Уаї АжЯ туї бек Тук Тит АхЯ4 біп Аза Ага сБуУ
Нв за за бах Ту Вех Бей Авп оТкробем уУаї Рко тів СбіУ Нів Бщ1чй Був реко Бах 100 105 її вва їїіе пув Ма1ї Ейе Кі ніш сії рей вВепоАтТа біу АвпосСіпобей бек 115 ТО 135
Ків Ме: Бах рхо ті Тух таж тих бій Меє біуУу АБр о бій ей ей Аїв 135 35 140 ув Беч Аза Ак АвроА1іа Таж вне Бе Уа) Акч Аїа нів бій бек Аве 155 50 155 160 бтиа Меє сій бко тБк їва Аза Тіе бет нів Аїа біу Уаї Бех Уа Чаї 155 170 ут
Меє Аза сів Тк о зЗіп оБко Ага Ака біз рБуз Ака Тхр бек сій Тер Аза 180 ї85 тТЗОо ак біу йув Уазі Ген Сув бий Пец АвроБко їеч Авр оту Ууяї Тук Ав ї55 2хо по
Тух пей Аїа біп с1їп Акассуав Авп ої ВвроАвр о ТБПкЕ Тер Фіз алу пуб 219 15 22а
Ії тут Ахч о Уаї їм» Віа біу Ай РКО Аза Ццув Нів Авропей Авроїтіє 225 230 235 гай
Був орто Трж Уаі ї1їє бех Ніз АкЯ ем нія Вре Рко Бін сіу сіу Бех 745 250 255 тез вла Аїа Беч ТВ Аіа Ніво сів діа Суз нів Пей ко цей бів тн 250 255 270
Рпе Тк Ах Ніє духу Сіп Рхо Ак б1у Тур Зїм бій ей біз біп Сув 275 289 185 біу Тух Рко уаї бій Аку ей уві йіа рей оТук Бей вла Аза ДхЯ Пей 299 285 зва бек Ткр Авп обіп Уді Авробій За1і Тіе Ак Авя Аї3 Пец йдта Бех РхО за зв з15 320
Фіу бег біу 41у Вар Іво бу біз діа їіе Ак СІй бін Бко бій біп 125 зза з35
Аїа дже їн Азія Бей тих Пе Аза Аза Віа сіл бву їн дкЯ о Бпє Ті 34 за5 з5О
Атч біп 51у Тпх ОТу АвпоАвр осіб від Бі А1ї8 Аіа АвноАтТа Ав Уаї 155 зво з65 чУаі Бех пец о тпх Сув Чій Гец Рбе рей срко Ро біу Зіу зіу Бек Авп ї79 375 зяв ко йху беж заз вуо Бпе с біз тТук Тух Вк т1ве с Ака буя Маі буя Уаї 385 з9а 335 400
Зіп Вце тТкроРко Суш дек Рго Ііє їнх біп 51у Авр АхЯ4 ту Маї Ту 4п5 19 415 чек Бек Аіа уаї Ті речо Авр АБр вп Ре Чаї Ту Му Аза тіж Лія гі 430
Тео ТвВк тує Аврорка Теж Ууаї Авпотух Бех Бех дже Нів ТНу ї3єе ТрЕ 435 445 а45
Зіп ро Ре бек ТУух Був цеи Бей був цув АвроЗжа їв) впЕчзсАБЮ 51 450 45 50 тей Пув Ав БЕ їй Без ши ас 470 «2ійз аб «ів В «рРІЕ ДЕ «3135 Штучна пооліденність «вий» «ага» Прямий праймес для ОБЕЯУК» З рома я
Зо
«00» 46 савацсвсосе ссЕсссссоч задач 28 «810» 47 «Вії» 30 «тій» ДНК «2і3» Штучна послідовність «2Яй» «иа» Зворотний поаймер для ОБКО-ЖИ з ВСМй ба кабох 47 сссвачсіс:Ч Сздчасааза зсув зо «кій» 48 «21їз 1313 «вій ДВК «213з Штучиа послідовність «Ох «233» Об'єднані ДИМ послідовність РЕ, ОВЕа-Ко з ВСУдД б КОЖ «4002 88 ячассочнаєт зачсясесоа сссокодаво заасдсасося авассогоасоє ясессассьс. 5О зазчзасачсест сзсосбссву ссусаєчадсе ЯЕсдасссзя ссвссуссяа сассаасачо 125 сазчапосає сасастасто сасадсососся чачаасзасв всзасачсось осзазсозасо ї8о абсзчасдася сесесачсас сасскчсзчас ччеседасса босочюсеоча гочсааасео 240 чаассоваса ачссясечся стасазссво всясуссаяу сасчсчадсач пкоачесЯева зад зассцостчуз сгассчаєссяз ссасзчачаач ссоїсядаса ссадЯчЕчєЕ сабссоасупвпа. 360 сеЧчазсячссЯя чсаассачсв сачссвсаса сечдссчассс асассаєсяа пасавсасває зо чантассач счавучссяче зсезочасаос асскроебБесая сова сасуса сдазазсаве «80
Чачасосваєс савочсїсасо сеассачесає чзосозучеса усасоассає засесазасс 5ІО сачссчеозссо чздзававусо сеЕЧуЧчазечав гЯсуссазеу дсааччсУусє Чеассвасес зоб «всссчссзч асаоцячіств савствоссс чессадсааєс чесчсовзасов счасчаквос Ей скчачаачудса ачакстассу Чобчсесус чдасаасссза сзначесвіЯа себадзасаєо 725 азвзасосасучя Ссаєссадсса бсодссбусвос ссбессаачу чсоачсачось ччоссясасеу 789 асечусусаєс азуссєдссв ссгідсочега цачассьсса сесяссвакося сеачессвоас зай часстдоадавс взасоччацдса чсасачесбає ссаусусачо чес коде ссквоавсву зво зчсячечсЯдс ЕсссУсууай ссадсєсссчає саччкчабвсс сдевасЯсосє чубсачевос зво чссачсаост чпсодассвача сдавасзаєс сусчадсаце сздачсачає ссЯкссачес і029 сЕЧассессоо ссЯссдссча здадесчадесяс брсакссячо зуччасясточ саасчасцчає 1080 пссазсчсоач ссавсчесза сясадечачс ссдасстозся ачстсєсесь бесососазча 1159 чачеачсєсваа чосссстсас сорасесевЕ давсастаса чавсвзазчаав два ї259 чавасссобЗас ссбасссссс вассасссау часчасадуу чадсдачесс сассчесаєє 26о ассссачаєа асавссссяб ааслаачеасс аабуссостав сесаєчаєссс сівсасаває з137о сгасесессоес дссабассає апсссздоос веЕсссстаса зассЕсосав навадансаад 1385 сідазачасч зассзчавача счазвсучеро Чад 1313 «ЗІ» 9 «їі» 474 «йі2З ЖІЛОК «-813з Штучна послідовність «жайм «823з Об'єднана амінскиопоїйна воопідовність Р, ОБКЙ-киж з реув аа Кувх «по» 49
Сту дек піз біз о Аїа рае Авр о цео ТхроАва Сьйай був дів Був дів Сув
1 5 10 15 чаї цез Авр цей бує Авросіу Уві Аку бек бек дку Мес дек уаї Ар з 85 Зо ко Ата Тіе Аїа АвБ тах дви бі зів біу аж оцез Нів Туєх Бех Мес 35 40 45 чаі їси бій о1у біу Ав АвБр діа ем пув во Аза Тіе АвроАВа 81їа ва 55 | о
Ппем Бек Тде Так Ядек Ар осіу Бей Тит Тіє Акд Ццез сій бТу збу ад
БУ 79 75 за бі вхо вВБп ув рко чаї АкчотТух Бек Тух їТБЕ о АхЧ бів Аза Ага б1іу
Зо з5
Зх тр обех бе АвпоїТхр опеп Уві бо те бру мів сій був орко бех по 195 хо
АБ т1є Був Маї Епе їїе Нів бій Пен Авп одіа ЗіУ Ап обій пей ех 115 128 ха5
Нів' Меє Бех РКО тів Тук ТИжЖ ТВХ бій Мас біу Авр о чЧійш ем пе дії. 130 135 140
Пуш спец Аїа ВхчЧ о Авр и діа так РБе Ве уаї дкЯ Аза НівБ бій Бех Вей 145 159 а5 ТЕ) січ Меє сій Бкго так обецй йіа Ті6 Бех нів втіа сїіу Маї беж Хаї Уах ї1655 170 175
Мес АтТа Сіп ТЕ зіп Рхо вка Ах ота пув АхаЯ Ткр Бек бі тТкр Аза ї80 155 МО
Бекооту цпув Заї Хпем Сув їем ле) ВБроврКОо Бей двросіу Уві Тук АБ їз5 290 гаї тук ірги Аїіза бій сіп вху Сув деп рей дв АВротТіх ткр оба азІУу Був 210 215 йо тіє тук Аку Чаї цемз о Аіа Біу Ав овхо лів Був Вів'АвВр Бей днрохі1є 225 23а 235 240
БМдув рт Твк оуаї іє Беї Нія дкд Пе Нія РОє руб Зі ОзуУ оіу Чех аа 2вО ве їшіи: діа Аїа пей тп Ата нів зів о віа Су Нів Пем оБко Пейо Бім Тк
БО 25 27 рРпе ТЕБЕ Ажа Нів Аква бій рус Акад б1іу тТкросій бій пе) сій сої Сув їла 750 285 сСіу Тук Рхо Таї бів Ако їви Уаі віз Бей Тух рез Аїя А1в Ах Бей о »а5 зо
Яек тТкр АБ Сів Маї Аво бій уаі ті дку АвпоАТа Ппей вів БЕЖ рЕо 805 310 кис 320 шТу Бех піу 31 Двр цех біу сій Віа т16 Ах 5БІіІМ ій РКО БІВ біл 325 350 135
Аза Акч Бем Аїа Бецш Так рей Атїа із Алла сій Бек шій Ак Бде тіє 350 зав зо
Ак Зх Б1іуУ пе сту Ап одвробіз діа Зіу Аза тів Ав А15 Авр чаї
Ба зво 365
Заї Беж Сем Тк Суб сли Мей вБре ей рРуо го б1іУу зу біу Беж шех 370 375 389 вто тей Тик уді рЕОз РВе біц Тук тТук Акад Ї1е Акч о МПув Ууазї був Уві з5 уза 355 зо сі рРає Тхо Ркго Сув Бех ото Ті8 ТБкобіп 0тТУу Авр Айко бьуУ Уаї Бех аз 416 15
Беж тих Аїд Маї Т1іе Пе Авр Вер Ап Ре чні Тк Буа Аза доп оАта 270 425 239 їемн отих Тух Вер оБхо Тук Уаї Ав отух бах бек Аку Ні Тек тів тих 435 зай 45 бів хо Ре Бек Тух Був Пец Пе їув Був Лвросіч пев Ажу Авр ото
АБО ав за рей цув Ввробвім Бец о Ппем зі 4655 470
«2їдь 50 -211» 705 «ВІ» ДНЕ «ВТ» Цирковіруєс свиней «400. 50 асчдавсчЕдЕс савоовачод Єбасстоцазча ддвацаясасо осессусач ссовоссцає 6Бо сабаксексс ядссчссасес ссадчсбсубо сасссосусс ассдссаєсету ЕбуаздазуФ ьо аздавкчаза сссссаасає ссявсвевсс сассссссва сЕрасассяс баасессеса ї18а садачсєсас сасесістсЯа дусочесчас асчаєчачає ббвабаєсва ссляареЕєске 240 сессозачад чачасссаза сессстсасб зсассссссу азбастасач пасвачавач 00 чегазачечч аасесЕсЕде задасссессо зїсасссава Згозсасача адецаческас зво асЕдоєЧЕва сссєаваєцда бавстсбаса асбазадуссз садссекаас сбаєзаєссо 42 сакчсазасєсї астссуосся ссакассата асссвастст ссвсстасса стсссасеас а тсрасссеса авссеурсстї сзчабессасяї забсзЗаїсасе сссзассяай бдасзавацдя: БЯО ватсачосає ччасчачасе асавассасс дозавсдьач ассдаєчсачза ссссечасає біо
Чостсвсаза асачстасаза бдсосацчаасс васавсоссс Ясопавссає дтасзбсасав ой сссачвагає гтавсссєсва ачассосссса сесбаасссба ачсда 75 «аКох ві «811» 34 «Е18» БІЛОК «213з Мирковірус свиней «ай
Меє твж ТукоБко ака Ажа Ах Тук вка Аха Ахо вка НіБ АКкч Рко сао ї 5 30 15
Ббех Нів беч біу Нів ї1е цем Ако ха Аа РКО Тр їв Ма) Нів ро 0 25 за вка Нів Ак Тух Ак Тер Ахо Акго був Ав о сіу 1316 Ббе Ав АТа Ах
В чо 45
ІГец беє Аку Бек Ре Ууаі Тук Тк Уві Авп Аїва вес сія Уаї Бек овВко 5 а
Еко Бех Тхр аіа Маї Авр Мес мес АДку Ве Ав Іїе Авпобій Рпе бец 70 я во ко рРко біу піу біу Бех Авп обхо Пец Тк оМаї Вко Рпе Та ТУух Тух я За 55
Акта її вхо Пув Маї Пув Уві Зін Бре Рпе йїа дту Бек рко ті ТНЕ 109 105 її діп о сіу АвроАка біу Заї біу бех ТБ Віа Чаї Тіє бец Ави Авр о Авп 115 125 125
Бпе уаі Тпж Був Аза Тл віз тей Так о Тух АвроБго Тук Маії два отук 136 135 їі40
Бек Бех вх Ків ТБ ої1ве ТТН біп РК Бе бек Тух Ні Бех дЕЯ4 Тук 145 ї50 155 ха
Ре ТЕ Бго Пув бхо Уаі ем Авр Бех Тк Тіє ВБр тТук Рбе іп РКО 7уве то 175 депоАЕп гув АхЯ Ап осійп Пес Ттромеє Акт Бем бій ТОК КЕ су дей 189 тн 189 ча) Авр Нів Маї бїу ей з1у Нів дів Рпе бір да Бех Тйх АвВповіа вав 200 205 бупоАїа тТук Авт баї ВкЕчЯ уаї Тв Мек о тух ві сіп впе АкФ Сів бе 210 215 ва
Авипоїей був АвроБко рРкб Бей або о рЕо Був 525 23 «їй» ЗЕ к21їїз 708 «їз ВНК
«йі35 Цирковіруй свинай «ЦО» 5 вічассравс сааччечасу гсассзчада адвадасасс сссессасаЗ ссвусеуе. 5 сасабссбсо зЗзесуссаясес стдосссдес сассссозсс ассосрствесЯ скздазадуд за ваавасчуса сскрсавсач сечсесссос сдсассЕреся засаєвсває савадосасс 180 асачесясза сасссрзеср зЧсУдвосас вбЯссацвУах Єсаасабеча саассесссе дай сссссоуЗао дозадассаа сазавескок авБасссксву заБасрасву заїаачавау Зоо черсазачЕєца зактстачес: сЕчсссссса асСсвсссьцу чсзасацувча ззЗзссаЗзассс збо вогчссасаа Сесбацакча бзасесессс сокаацісса сачссекаво ссасчасссє 420 тасусвавсь асгсоскессют ссасСассаса соссзассеє шесссбаєса сесссзетає зо ксравссоса засскатсок савсктосасс ассозассвос бссавассаав гавсаавача БИ зассадскої зуасчачаає ссанассаце ззааасатач ассасочсача сосбсучсась «60 чеврссодаа асадтасаса счассааваєс басайсаєсс чедсвассає деасувасяа БВ рсадчацчаві ссвассстяа вчассоссоса сосвавоссв ав. то «МО 53 «211» 233 «вій БІНОЖХ «23» СЦиМрковівВує свиней «4002 па мес ТЕЖ Тух Бко Ако АкКч Аха тує Ду Ак аку Акч Нів дкч о бко АК ї 5 ї0 І
Бех Нів їз біу НіБв їіє Пец Аку Акч Ах Рко Ткр оцей Маї Ні рко зу 25 36 дкЗз ін Аку Ту Ак Ткр йкЯ Ач Був Ап З1іу Іі Бе АБй Бех лк
Зк ща ак
Пед; обех Ака ТпЕ Рце Зіу тТуж ТЕ Уві був АТа Тв Такоуаї ТЕ ОТНЦЕ 5О 55 ва
РкЕо бек Тхр Біз Уаї АБр Ме цей Ак Рпе АБО І31е Авр о дзоЮ Ре цей 55. то 75 в
Рко РЕ Зту щу бу Тик о двпо гу ті бек їі рРко ре іа Тук тТук
СЕ Зо За:
Атч її Вжа пув чаї пув уафоОМі РНе Тер рко Сув бек Рко їІ1е Тих 160 їо5 110 бій сіу барв о Аха 01іу уаї біу Беж бех Аза чаї тіє Гей Авр Авро АВий ті 120 175 вре вне БЕо був Беж Тих Від їс ТНу Тук дв о рко Тук уаї дво туг за 135 ії590
Бек бех Ака Нів ТЕ І1іе рБто іп рЕоО ре Бек Тух НіБ Бек Ах тує їав 5 155 І655
Бре Ту Вжхо ув ро ущі цем о Авро Бех Ту Ті Авр.тТує Ре бій. жа т65 ї7В ї75 ввиозвіа цу вч о вАеп обі цем тТжр Мес дкЯ гів Бі тТпї Беж Ппув АБИ 150 ін 199
Чаї Авр нів 'Уаі сіу ем йІіу Тв вій Ре сі) Аво ех Буш тТук Авр 195 вопй 295 бів дар о тТух Ави Ггіє ху уві Тих Меє ТУк Уа) зі РНе Ах біз вБе 7510 215 250
Авп опем Був Авро вхо Ро Пеа Був Бко 225 23 «2105 54 «хз ау «дій ДНК «Ті3» Цирковорус свиней «0053 54 їсесьсосос сзадозузчуч стбааассосо сбсастесас ссбрсцаава ссасадцдвака 50 вучназччска аачсучаанс ссстусваца їсссссвеса сбсавоазчеча саччачадчея ї59 ччектосасея сечесваїссї вавсдчасаве гесЧсавсаа задссасаде есбавсессає 159 зчзассессаву саваствсьс сесссуєсав ассабавсос дасосьсесе ссассастсс 26 састасьсса сососавассе баресссдає ссосазосасво асвасевЕсса ассавакаавс 300 вавачавайс ачзексоЧчет чаечассасаа ассастччеа авчсачасса сасадуссто зей ччасасассе сЕсаазасач сасазасчос сацзусстаса асресусях аассаєчкає 29
Чсасаасссов Яазавессав бсстазадає соесосаеста абеставчсу А 71 «Й» Б -йїїз ТБ «ВТ» БІЛОК «13 Мирковіврує свикай хайОх 55 пе Бей ко ро біу Чі біу Бек о два вко 0ез тах Уаї ро рпе 3 ї 5 19 ї5 тук тТух Ак ІТе Аа Був узі пуб Узі 015 Ре Вйе А)а Ако беж рко 20 25 з їїз Тпх бій сту БвроАка б1іу чаї ЗзТу Бех тах Аїа Ха) їїе Пей Ап зв 40 «з
Авр Авпобпе Маї Тух пу Аїіа тах Азія цей Трх ТухкоАвр о Бко Тує хаї 55 5 два оТук бек Бех ака Нів Ту 112 ТВкосСій Рко Ре бек Тук Нів Зк 5 та 75 ща дуб стук Вре Таж Ро Був рко Уаї їз Ар обек Та ї1є Авр» Тук РЕе
ВЕ зо З5
Зів Вкб дп Авп опув Ахй Авп бій пес ТкроМеє Ак їєв сій Тих ТАКЕ 80 95 110
Зіу Авт Уаі дер Нів Уві Зіу їмо біу нів Аза Рце Чіп деп Бех тТдЕ 115 129 125
ЗвесАта сіп Ата Тухк два о Уа1ї вкч Заї Твжх Меє Тук о Уаї біп вне Ахд 130 її 140 сін вве Ав гео цу дкроруо рло Бемо Ави: Рко Гу 145 159 ї85 «із 56 «зії» ЗЕВ «аг дик «Аа? Мирковірусє свиней «вдо» ВЕБ їЕЕстбсорос сауцазасут чаєссавсава збсвогабсас собБетувова ссасзоваєа 50 ваизавочьса зачсідчайве ссдассссус Бососгаєсса сосазазедаа сачозачацек То шчабссастя сідсваєтсх адасуатаве БЕсссосесСа адсссасацє соскдаєстає а8о часссссаса бавассассс ссоссвссає всосасаєссся ачсесексосе бсвассасеьесе 240 гтсрассвєка сссотсаавсс бебссєруає гссасссаєкаЯа зсасвеЕсса ассазвтаве зо зазаччаасс ачссосацчає засавкссаяаа ассадіуваза асусвавссз сочсадасско 350 чзасассаеце ссцдвазасач базасасчає саяЗассаса агяссосуєде вассасусає 429 чсасваєсса дачазсссраа ссссаватчас сососасеба зассскав че «ЗВО: 57 «її» 155 8135 КІЛОК «213» ЦиВковірує свиней «4005 57
Бре цец рко Бо біу зіу біу Таж Ані був Ії бех ї16 ро Рпе бій ії 5 19 5 тук Тук Ап т1есАкЗ Був уві Гуз уві зі РБе Жхрорко Сув Бак рРко 28 зо ті То бій піу Авр о Акч біу уаї біу бек бек Аїа Чаї Іхіїє цей Ввр з5 40 45
Авр о бба Ре Ре Руоспув Беж тик Аіа Ппем ТК ОтТук Аврорко Тух Уві
Би 55 Бо
АпротТух бек бек Акч нів ТБк ї1іе с рко 510 Бко Бе бек Тук Ні Бек ва 70 75 88
Ака о Тук Ріе Тк БкЕс Пув орто Уаі цей о Авр о Зех ТБі о І1е Ар отуюк о Рне не Зо за
Шіп о рРро Азй Аа Тув о Аго дві біп цей Ттромеб Аку тїє сій ТЕ Бех 150 105 їхо пув Ав оуаі Авр Ніно уаї біу йез сіу тркодіа РБе бін Ав бек Був 115 125 155 тук Ввр Зіп Авр тує Авп о ї1є Акз Чаї ТЕ Мес Тух Уаї бів ре ку 13 135 149 діл оре Аєп ей Був Аврорко РЕбо Бей був РКО 145 ї5О0 ї5Б5

Claims (6)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (РСУ2), яка містить антигенний пептид, вибраний щонайменше з одного з: (а) пептиду відкритої рамки зчитування 2 (ОКЕ2) з РСМ2, вибраного з групи, що складається з ЗЕОІО МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 10, 5ЕО ІО МО: 12, 5ЕО ІО МО: 18, 5ЕО І МО: 22, ЗЕОІЮ МО: 55 і 5ЕО ІЮО МО: 57; та (5) рекомбінантного химерного білка, що включає від аміно-кінця до карбоксильного кінця рекомбінантного химерного білка: пептид РЕ, що характеризується послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 35; пептид з ОКЕ2 з РСУМ2 з (а) та сигнальний пептид КОЕЇ., що характеризується послідовністю ЗЕО ІО МО: 31.
2. Імуногенна композиція за п. 1, що додатково містить відкриті рамки зчитування (ОКЕ), відмінні від ОКЕ2 з РСМ2, де ОКР, відмінні від ОКЕ2, включають ОКЕ1 та ОКЕЗ.
3. Імуногенна композиція за п. 1, що додатково містить щонайменше один патогенний антиген, вибраний з групи, що включає антиген вірусу свинячого грипу (5ІМ), антиген вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (РККЗУ), антиген мікоплазми, антиген парвовірусу свиней (РРУ), антиген бешихи свиней і антиген вірусу псевдосказу.
4. Імуногенна композиція за п. 1, що додатково містить одне або декілька, вибраних з групи, що включає наповнювачі, розчинник, емульгатор, суспендуючі засоби, засіб для розкладання, зв'язувальні засоби, середовище для ліків, стабілізуючі засоби, хелатоутворюючі засоби, розріджувач, загусники, консерванти, засіб, що обумовлює плинність, поверхнево-активну речовину, ад'ювант і біологічні носії.
5. Спосіб отримання фрагмента антигену РСМ2, що включає розташування послідовності ДНК, що кодує пептид ОКРЕ2 з РСМ2, в біологічній системі експресії, де пептид ОКЕ2 з РСМ2 вибраний з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10, БЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮО МО: 18, 5ЕО ІЮО МО: 22, 5БЕО ІЮО МО: 55 і БЕО ІЮО МО: 57; і Зо експресію послідовності ДНК, що кодує пептид ОКЕ2 з РСМ2, з отриманням фрагмента антигену імуногенної композиції проти РСМ2.
6. Спосіб за п. 5, де послідовність ДНК, що кодує пептид ОКЕ2 з РСМ2, вибрана з групи, що складається з БЕО І МО: 5, 5ЕО ІО МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІО МО: 17, 5ЕО ІО МО: 21, БЕО ІЮ МО: 54 і БЕО ІЮ МО: 56.
птн дуття от нт етно нення ПКТОВОРМАМОКеє (ЗБОЮ Мо: 50) 2 ШШ- ІЕ:
Ї. дня ЗЕОМО Мо: 19 -- В ї 5385 Ще ши Що 28 11 їн я ЗЕД Мо: 15 ш нини сХОбОоз (50 Мо: 52) де однотонну сно, і ї млшенчіння ООП 1030 Е | 2а подннчіоніентннннннкнті УА І ВК: З феетнн БЕН
ФІГ. 1 Вт й хеленннччння Я , ! ди : вел САМУ. фуру ри пз Ма ша: ШШХ Бк? І с Зою земними зеженнх шк: М ря ве Ки жі ан 0 МНН, пе ! ще Ко, Ко шин 5 ВИНИ
ФІГ. 2
UAA201407508A 2011-12-06 2012-05-12 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2) UA113192C2 (xx)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161567248P 2011-12-06 2011-12-06
PCT/CN2012/085907 WO2013083036A1 (zh) 2011-12-06 2012-12-05 猪第二型环状病毒次单位疫苗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA113192C2 true UA113192C2 (xx) 2016-12-26

Family

ID=48573551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201407508A UA113192C2 (xx) 2011-12-06 2012-05-12 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9657063B2 (uk)
EP (1) EP2789627B1 (uk)
CN (1) CN104039814B (uk)
EA (1) EA029698B1 (uk)
ES (1) ES2661026T3 (uk)
TW (1) TWI473813B (uk)
UA (1) UA113192C2 (uk)
WO (1) WO2013083036A1 (uk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
TWI508974B (zh) * 2010-12-22 2015-11-21 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
EP2994162B1 (en) 2013-05-08 2021-04-07 Pharmgate Biologics Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
ES2790527T3 (es) * 2015-06-01 2020-10-28 Reber Genetics Co Ltd Composiciones de vacunas contra el síndrome reproductivo y respiratorio porcino y las enfermedades asociadas al circovirus porcino
EP3362467A4 (en) * 2015-10-16 2019-06-12 Kansas State University Research Foundation IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AGAINST PORCINIC CIRCOVIRUS TYPE 3 AND METHODS OF MAKING AND USING SAME
EP4082558B1 (en) 2018-03-08 2023-08-23 Applied Molecular Transport Inc. Toxin-derived delivery constructs for oral delivery
CN113347997A (zh) 2018-11-07 2021-09-03 应用分子运输公司 用于经口递送异源有效载荷的Cholix衍生的携带体
CN114341191A (zh) * 2019-08-20 2022-04-12 Km生物医药股份公司 猪圆环病毒2型vlp疫苗
CN112226408B (zh) * 2020-09-30 2024-04-02 西北农林科技大学 一种猪病原或外源性蛋白特异性抗原肽筛选和鉴定的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7595054B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion antigen used as vaccine
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
CN101104641B (zh) * 2006-07-11 2012-04-18 生宝生物科技股份有限公司 作为猪生殖和呼吸道征候群疫苗的prrs病毒的融合蛋白
TWI314559B (en) * 2006-07-14 2009-09-11 Animal Technology Inst Taiwan Fusion protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as prrs vaccine
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US8343505B2 (en) 2007-12-04 2013-01-01 Schweitzer Co., Ltd. Subunit vaccine for aquaculture
CN101884787A (zh) 2010-07-22 2010-11-17 洛阳普莱柯生物工程有限公司 猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法
CN101936993A (zh) * 2010-07-24 2011-01-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于orf2抗原功能区的检测猪圆环病的方法
CN101948849A (zh) * 2010-09-02 2011-01-19 洛阳普莱柯生物工程有限公司 猪圆环病毒2型截短型Cap蛋白的制备与应用
TWI508974B (zh) 2010-12-22 2015-11-21 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒(Porcine Circovirus Type 2)、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
CN102127533B (zh) * 2010-12-31 2012-07-18 华南农业大学 重组猪圆环病毒2型Cap抗原的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
TW201323437A (zh) 2013-06-16
EP2789627A4 (en) 2016-03-09
ES2661026T3 (es) 2018-03-27
EP2789627B1 (en) 2017-09-27
EA029698B1 (ru) 2018-05-31
EP2789627A1 (en) 2014-10-15
EA201491123A1 (ru) 2014-12-30
US20140348864A1 (en) 2014-11-27
CN104039814A (zh) 2014-09-10
TWI473813B (zh) 2015-02-21
CN104039814B (zh) 2017-09-01
WO2013083036A1 (zh) 2013-06-13
US9657063B2 (en) 2017-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA113192C2 (xx) Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)
CN100506980C (zh) 包含HCV的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的组合物,包括相应核酸序列的表达载体及它们的治疗应用
Beard et al. Development of DNA vaccines for foot-and-mouth disease, evaluation of vaccines encoding replicating and non-replicating nucleic acids in swine
CN107223130A (zh) 作为疫苗载体的三片段沙粒病毒
Wang et al. Expression of the capsid protein of porcine circovirus type 2 in Lactococcus lactis for oral vaccination
WO2010088552A1 (en) Immunogenic compositions, vaccines and diagnostics based on canine distemper viruses circulating in north american dogs
EP2959915A1 (en) A dengue virus chimeric polyepitope composed of fragments of non-structural proteins and its use in an immunogenic composition against dengue virus infection
Huang et al. Construction and biological characterisation of recombinant porcine circovirus type 2 expressing the V5 epitope tag
Oka et al. Development of a novel single step reverse genetics system for feline calicivirus
Walsh et al. Development of a genetically marked recombinant rinderpest vaccine expressing green fluorescent protein
CN111741766A (zh) 用于诱导针对乙型肝炎病毒(hbv)的免疫应答的方法和组合物
Kuznetsova et al. Adaptive mutation in nuclear export protein allows stable transgene expression in a chimaeric influenza A virus vector
Baron et al. Expression in cattle of epitopes of a heterologous virus using a recombinant rinderpest virus
Fu et al. Co-expression of Ubiquitin gene and capsid protein gene enhances the potency of DNA immunization of PCV2 in mice
CN111683679A (zh) 具有异源抗原的活的减毒黄病毒
Takenaka-Uema et al. Development of an improved reverse genetics system for Akabane bunyavirus
Jeoung et al. Immune responses and expression of the virus-like particle antigen of the porcine encephalomyocarditis virus
Shao et al. Immune potential of a novel multiple-epitope vaccine to FMDV type Asia 1 in guinea pigs and sheep
Rodríguez et al. A porcine CD8+ T cell clone with heterotypic specificity for foot-and-mouth disease virus
Guo et al. Recombinant adenovirus expression of FMDV P1-2A and 3C protein and its immune response in mice
Balamurugan et al. Biotechnology in the production of recombinant vaccine or antigen for animal health
WO2013030608A1 (en) Nanoparticle-based veterinary vaccine
TWI328039B (uk)
CN101768575A (zh) 双表达g基因的重组狂犬病病毒的构建及其生物学特性分析
Bidokhti et al. Establishment of stably transfected cells constitutively expressing the full-length and truncated antigenic proteins of two genetically distinct mink astroviruses