CN104039814B - 猪第二型环状病毒次单位疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗猪第二型环状病毒(PCV2)免疫组合物，包含抗原肽，该抗原肽为PCV2第二开放阅读区(ORF2)非富含精氨酸肽(non‑Arginine‑rich peptide)和/或将该PCV2ORF2非富含精氨酸肽进一步与PE肽和KDEL肽构建形成的重组融合蛋白。

Description

猪第二型环状病毒次单位疫苗
技术领域
本发明系关于一种猪第二型环状病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)次单位疫苗，特别是指一种可以被大量表现的PCV2 ORF2蛋白质片段做为抗原蛋白质，以及加入适当的载剂或佐剂而形成的猪第二型环状病毒次单位疫苗。
背景技术
猪第二型环状病毒已知与离乳后多系统消耗性综合症(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome,PMWS)、猪皮肤炎肾病症候群(Porcine DermatitisAnd Nephropathy Syndrome,PDNS)有关。PMWS最早于1991在加拿大发现，且之后于全世界各地陆续有被报导。该病对于全球养猪业造成严重损失，其主要病征为患猪体重渐进性丧失(progressive weight loss)、急性呼吸症(tachypnea)、呼吸困难(dyspnea)、黄疸(jaundice)等。病理学上，肉眼及组织病变有淋巴球性肉芽肿性浸润(lymphocytic andgranulomatous infiltrate)、淋巴结病(lymphadenopathy)、淋巴球性肉芽肿性肝炎(lymphocytic and granulomatous hepatitis)及肾炎(nephritis)。
猪环狀病毒(porcine circovirus,PCV)最早于1982年在猪肾细胞株(PK-15,ATCCCCL31)中被发现，虽然会持续感染该细胞，但是并不产生细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)，另外该病毒虽会感染猪只，但是并不造成任何病变，该病毒株系命名为PCV1。PCV1病毒为一环狀单股、全长1759bp的正二十面体(icosahedron)病毒，在1995年被归類为环狀病毒科(Circoviridae)的一员。
自PK-15细胞中分离出的PCV1被认定是不具备病源性，而于1997年自罹患离乳后多系统消耗性综合症(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)猪只体内，分离出对猪只具有病原性的突变猪环状病毒，该病毒株命名为PCV2。离乳后多系统消耗性综合症(PMWS)是一种具有高度传染力的猪只疾病，该病主要感染幼猪及怀孕母猪，严重影响猪只健康。
PCV2病毒直径大小为17nm，具有环状单股DNA，DNA大小为1.76Kb，基因组序列经软体分析后发现顺时针加上逆时针共有11个开放阅读区(open reading frame,ORF)，其中ORF1、ORF2是2个最主要的基因。ORF1可转录出Rep及Rep’蛋白，和该病毒的复制有关(Mankertz et al.,2001)。已知ORF2本身是PCV2病毒的免疫性结构壳体蛋白(immunogenicstructure capsid protein)，用以诱导生物体产生免疫反应。
最常见的市售PCV2疫苗为PCV2死毒疫苗，然而死毒疫苗研发上需取得无其他病毒感染的细胞株，且其最大的缺点在于无法确保在制备死毒疫苗过程中，化学药剂是否完全不活化病毒株；而另一缺点在于以化学药剂来杀死病原菌很有可能会改变病原菌的抗原结构，使得所诱发出来的免疫反应无法中和病原菌的毒性，因此造成该死毒疫苗无法保护猪只避免感染此疾病；由此可知，死毒疫苗产品发展不易、成本高，且其安全性堪虑。
相对于死毒疫苗是以整株病毒作为疫苗的抗原，次单位疫苗则是取病原菌中一部分的蛋白质作为抗原蛋白质，并将该抗原蛋白质作为疫苗接种到动物或人体中，使接种后的动物或人体可产生免疫力。它的制备方式是先选殖病原菌中的抗原蛋白质的基因，然后以遗传工程的技术将此抗原蛋白质大量生产。其最大的优点是安全性高，因为它只是病原菌的一个部分，所以注射到猪只体内的并不是一个完整的病原菌，不会有病原菌不活化不完全的顾虑。习用PCV2次单位疫苗系使用ORF2蛋白片段作为抗原蛋白质；然而ORF2的全长蛋白质在原核生物表现系统中表现量很低，不符制备疫苗的需求。因此，研发可以在生物表现系统中表现量高的PCV2 ORF2疫苗抗原片段，将有助于PCV2次单位疫苗的商业应用。
发明内容
本发明提供一种PCV2病毒ORF2蛋白片段的DNA序列，该DNA序列可于生物表现系统中表现出大量的PCV2病毒ORF2蛋白片段。
本发明并提供一种PCV2次单位疫苗，系以可在生物表现系统中大量表现的PCV2病毒ORF2蛋白片段作为疫苗的抗原蛋白，使该疫苗在施打于动物体后，可以诱导动物体产生足以抵抗PCV2病毒感染的免疫力。
本发明并提供一种利用基因重组技术所研发的次单位疫苗，以生产制程简单、成本低、纯度高、安全性佳的PCV2次单位疫苗。
由于PCV2病毒ORF2蛋白全长片段难以在生物系统中大量表现，为达成上述发明目的，本案发明人利用基因重组技术，将PCV2病毒中编码ORF2全长蛋白(如SEQ ID NO:2所示)的DNA序列(如SEQ ID NO:1所示)，进行不同长度的切割，再将所形成的各DNA片段分别构筑至蛋白表达载体上，于生物系统中表现蛋白质，以决定于生物系统中可产生高量蛋白质的DNA片段。
经蛋白质序列分析以及蛋白表现量试验结果显示，PCV2病毒ORF2全长蛋白共有约30个精氨酸(Arginine)，其中三分之二以上的精氨酸集中于ORF2蛋白的氨基端(aminoterminal，N端)，当ORF2蛋白N端的精氨酸数目被去除的越多，ORF2蛋白片段在生物表现系统中的表现量就越多；而去除编码ORF2蛋白的DNA序列5’端234bp后所剩的DNA片段(即5’端235bp至终止密码子(stop codon)之间的片段)，可以在生物表现系统中大量表现。
是以，本发明所提供的PCV2次单位疫苗，包括一PCV2抗原蛋白质片段，以及适当的载剂或佐剂；该抗原蛋白质片段可于生物表现系统中大量表现，系为PCV2病毒的ORF2非富含精氨酸肽(non-Arginine-rich peptide)，该PCV2 ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸数量系为该PCV2 ORF2全长肽的N端富含精氨酸区域(Arginine-rich domian)的精氨酸数量的二分之一(1/2)以下；于一实施例中，当该PCV2 ORF2的N端富含精氨酸区域的精氨酸数量为20时，则于该PCV2 ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸数量等于0或1至10之间的正整数；于另一实施例中，当该PCV2 ORF2的N端富含精氨酸区域的精氨酸数量为21时，则于该PCV2 ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸数量等于0或1至10之间的正整数；于又一实施例中，当该PCV2 ORF2的N端富含精氨酸区域的精氨酸数量为22时，则于该PCV2 ORF2非富含精氨酸肽的精氨酸数量等于0或1至11之间的正整数。
于一实施例中，该富含精氨酸区域为该PCV2 ORF2全长肽的氨基端(N端)第1-78个氨基酸的区域(相当于DNA序列的5端第1-234个核苷酸之间的区域)；于一实施例中，该非富含精氨酸肽为该PCV2 ORF2全长肽的氨基端(N端)第79个氨基酸至羧基端(C端)最后一个氨基酸间的肽(相当于DNA序列的5’端第235个核苷酸至3’端终止密码子之间的区域)。
该PCV2 ORF2全长肽与如SEQ ID No:2、SEQ ID No:16、SEQ ID No:20、SEQ ID No:51及SEQ ID No:53所示的序列其中之一具有至少80％序列同源性(homology)，较佳者，具有85％序列同源性，更佳者，具有90％序列同源性，甚至是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同源性。于一较佳实施例中，该PCV2 ORF2全长肽系为如SEQ IDNo:2、SEQ ID No:16、SEQ ID No:20、SEQ ID No:51及SEQ ID No:53所示的序列其中之一。
此外，本发明并利用绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(exotoxin A)的受体结合区(receptor binding domain I)及运输结构区(transmembrane targetingdomain II)的蛋白(即PE蛋白)以及内质网回收讯号(ER retention signal，即KDEL蛋白质讯号序列(signal peptide))的特性，提供一种PCV2 ORF2融合蛋白抗原片段。
绿脓杆菌PE蛋白系可作为目标蛋白的引导媒介，其作用的方式为：首先，绿脓杆菌外毒素A的受体结合区蛋白负责与目标细胞(CD8+T细胞)的细胞膜上的细胞受体(receptor)结合，经由细胞内噬作用(endocytosis)进入细胞的内膜体(endosome)中，当绿脓杆菌外毒素A被内膜体中的蛋白酶切割后，绿脓杆菌外毒素A的运输结构区蛋白会将剩余的蛋白片段(含运输结构区蛋白及其后所连接的目标蛋白)由内膜体位移至细胞质内，与高基氏体(Golgi body)及内质网(endoplasmic reticulum,ER)结合，进而将目标蛋白引导至目标细胞中。
另外，若一目标蛋白的C端具有一KDEL蛋白质讯号序列(signal peptide)，则在该KDEL蛋白质讯号序列的作用下，目标蛋白会被回收至内质网，进而进入内质网进行作用。
因此，本发明进一步利用PE蛋白及KDEL蛋白质讯号序列的特性，提供一种PCV2ORF2融合蛋白抗原片段，系于PCV2病毒ORF2蛋白片段的N端加上PE蛋白，且于该PCV2病毒ORF2蛋白片段的C端加上KDEL蛋白质讯号序列(signal peptide)，以产生抗原融合蛋白(PE-ORF2片段-KDEL)，使该疫苗在施打于动物体后，可以诱导动物体产生足以抵抗PCV2病毒感染的免疫力。
于部分实施态样中，本发明所用的抗原蛋白包含但不限于PCV2病毒ORF2蛋白片段，该ORF2蛋白片段系与如SEQ ID No:6、SEQ ID No:8、SEQ ID No:10、SEQ ID No:12、SEQID No:18、SEQ ID No:22、SEQ ID No:55及SEQ ID No:57所示的序列其中之一具有至少80％序列同源性，较佳者，具有85％序列同源性，更佳者，具有90％序列同源性，甚至是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同源性。于一较佳实施例中，该PCV2病毒ORF2蛋白片段系为如SEQ ID No:6、SEQ ID No:8、SEQ ID No:10、SEQ ID No:12、SEQ ID No:18、SEQ ID No:22、SEQ ID No:55及SEQ ID No:57所示的序列其中之一，该蛋白片段系藉由基因转殖方式而得；分别将编码PCV2病毒ORF2蛋白片段的DNA序列(SEQ ID NO:5,7,9,11,17,21,54,56)选殖到表现载体中，各形成含有编码抗原蛋白的DNA序列的质体，再将该质体转殖到生物表现宿主中，经蛋白质表现后而得到的抗原蛋白。
本发明所用的抗原融合蛋白(PE-ORF2片段-KDEL)系藉由基因转殖方式而得，系将上述编码PCV2 ORF2的DNA部分片段序列(SEQ ID NO:5,7,9,11,17,21,54,56)、编码PE蛋白质讯号序列的DNA片段序列(如SEQ No:34所示)，以及编码KDEL蛋白质讯号序列的DNA片段序列(如SEQ No:30所示)选殖到表现载体系统中，形成含有编码抗原融合蛋白的DNA序列的质体，再将该质体转殖到表现宿主中，经蛋白质表现后而得到的抗原融合蛋白。
该表现载体系统包含但不限于pET载体系统以及pGEX载体系统等；于一实施例中，该表现载体为pET24a；该生物表现系统(宿主)包含但不限于：原核表现系统(如：大肠杆菌(Escherichia coli))、真核表现系统(如：动物细胞(CHO cell)、植物细胞)，于一实施例中，该表现系统为大肠杆菌(E.coli)。
该佐剂包含但不限于水性氢氧化铝胶、明矾、Freund氏不完全佐剂、油质佐剂、水溶性佐剂、或水包油包水双相佐剂(water-in-oil-in-water,W/O/W)；于一实施例中，该佐剂为油质佐剂。
本发明所提供的免疫组合物，进一步可包含PCV2其他开放阅读区(open readingframe,ORF)的抗原蛋白，该PCV2其他ORF的抗原蛋白包含但不限于：ORF1、ORF3。此外，该免疫组合物可进一步包含一种病原抗原，该病原抗原系选自由下列群组所组成者：猪流感病毒(SIV)抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、猪霉浆菌(Mycoplasma)、猪小病毒(Parvovirus,PPV)、猪丹毒(Erysipelas)，以及伪狂犬病(Aujeszky's disease)。
另，本发明所提供的免疫组合物可进一步包含一或多种选自于下者：载剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、黏结剂、赋形剂、安定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂、界面活性剂、佐剂、生物型载体。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明系以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1为猪第二型环状病毒(PCV2)基因组序列的亲缘树分析图。
图2为PCV2 ORF2分段表现示意图，其中pF1、pF2、pF3、pF4、pR1、pR2、pR3为PCR引子。
图3为以SDS-PAGE分析以大肠杆菌分别表现PCV2 2a-ORF2各片段重组蛋白的结果；将大肠杆菌以IPTG诱导6小时后，收集全菌蛋白，以15％SDS-PAGE分析；其中第1道为标准分子量(molecular weight ladder)；第2道为pET24a载体(负对照组)；第3道为PCV2ORF2 2a-F1片段(12.7KDa)；第4道为PCV2 ORF2 2a-F2片段(11.6KDa)；第5道为PCV2 ORF22a-F3片段(12.1KDa)；第6道为PCV2 ORF2 2a-F4片段(16.5KDa)；第7道为PCV2 ORF2 2a-F5片段(21.4KDa)；第8道为PCV2 ORF2 2a-F6片段(20.8KDa)；第9道为PCV2 2a-ORF2全长片段(27.5KDa)。
图4为以西方墨渍法检测PCV2 2a-ORF2各片段重组蛋白表现的结果；其中第1道为标准分子量(molecular weight ladder)；第2道为pET24a载体(负对照组)；第3道为PCV2ORF2 2a-F1片段(12.7KDa)；第4道为PCV2 ORF2 2a-F2片段(11.6KDa)；第5道为PCV2 ORF22a-F3片段(12.1KDa)；第6道为PCV2 ORF2 2a-F4片段(16.5KDa)；第7道为PCV2 ORF2 2a-F5片段(21.4KDa)；第8道为PCV2 ORF2 2a-F6片段(20.8KDa)；第9道为PCV2 2a-ORF2全长片段(27.5KDa)。
图5为大鼠分别以各不同长度片段的2a-ORF2重组蛋白免疫后，不同时间采集的血液样本以PCV2ELISA测定抗体力价的结果，*表示p<0.05。
图6为小鼠分别以2a-F2重组蛋白以及PE-2a-F2-KDEL重组蛋白免疫后，不同时间采集的血液样本以PCV2ELISA测定抗体力价的结果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。
图7为小鼠分别以PE-2a-F2-KDEL重组蛋白以及PCV2全病毒疫苗免疫后，不同时间采集的血液样本以PCV2ELISA测定抗体力价的结果，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；#表示p<0.05，##表示p<0.01，###表示p<0.001。
具体实施方式
实施例一 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及决定
由于PCV2病毒ORF2蛋白全长片段难以在生物表现系统中大量生产，因此本案发明人将PCV2 ORF2蛋白的基因分成不同DNA片段，并将这些不同的DNA片段构筑至载体上，于生物表现系统中表现各DNA片段编码的蛋白质，并分析各DNA片段在生物表现系统中的蛋白质产量，以决定于生物表现系统中可产生高量蛋白质的较佳DNA片段。
以下，系以常用的原核生物表现系统(大肠杆菌)用以分析及说明。
1.增幅不同长度PCV2 ORF2基因片段
本实施例中所使用的PCV2 ORF2基因序列全长如SEQ ID No:1所示，根据Wang等人(Wang et al.,Virus Research 2009,Genetic variation analysis of Chinesestrains of porcine circovirus type 2)所提供的序列作为亲源关系树标准序列来分析SEQ ID No:1；结果显示该PCV2 ORF2序列(SEQ ID No:1)属于PCV2 2a亚群(subgroup)的一员(如图1所示)。针对上述PCV2 2a的ORF2(以下称为2a-ORF2)基因序列设计可增幅不同长度2a-ORF2基因片段的引子(如表一所示)，以进行聚合酶连锁反应(polymerase chainreaction,PCR)增幅各片段。
如图2所示，全长的2a-ORF2基因片段以专一性引子pF1(正向引子)及pR1(反向引子)进行PCR增幅，取得全长2a-ORF2基因片段的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，以下简称2a-ORF2；而不同长度的PCV2 2a-ORF2基因片段则分别命名为2a-F1、2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5及2a-F6。2a-F1片段位于PCV2 2a-ORF2的5’端第1至234个核苷酸的位置，2a-F1片段的DNA序列如SEQ ID NO:3所示。2a-F2片段位于PCV2 ORF2的5’端第235至468个核苷酸的位置，2a-F2片段的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。2a-F3片段位于PCV2 ORF2的5’端第469至699个核苷酸的位置，2a-F3片段的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。2a-F4片段位于PCV2 ORF2的5’端第349至699个核苷酸的位置，2a-F4片段的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。2a-F5片段位于PCV2 ORF2的5’端第235至699个核苷酸的位置，2a-F5片段的DNA序列如SEQ ID NO:11所示。2a-F6片段位于PCV2 ORF2的5’端第1至468个核苷酸的位置，2a-F6片段的DNA序列如SEQ IDNO:13所示。所有的正向引子(forward primer)均设计具Hind III的限制酶切位，而反向引子(reverse primer)均设计具Xho I的限制酶切位。
表一、用以增幅不同长度的PCV2 ORF2基因片段的引子序列表
注：序列下方以____标示者为酵素切位Hind III的序列(AAGCTT)，序列下方以标示者为酵素切位Xho I的序列(CTCGAG)。
PCR反应条件为：95℃反应5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共25个循环，最后以72℃反应5分钟以进行延伸反应(elongation)；所得的PCR产物大小分别为：2a-ORF2为699bp、2a-F1为234bp、2a-F2为234bp、2a-F3为231bp、2a-F4为351bp、2a-F5为465bp、2a-F6为468bp。并以2％洋菜胶电泳(agarose electrophoresis)鉴定各PCR产物片段大小。鉴定无误后，以PCR-M纯化套组(Viogene)纯化各PCR产物。
2.将不同长度PCV2 ORF2基因片段构筑于pET24a表现载体
分别将1μg PCR产物与1μg的pET24a表现载体(Novagen)，以1μl Hind III及1μlXho I(New England Biolabs)两种限制酶进行限制酶切割反应(Restriction EnzymeCleavage Reaction)，于37℃反应8小时。再以PCR-M Clean up System纯化套组(Viogene)纯化酶切后的PCR产物及pET24a表现载体，接着进行接合反应(ligation)。将各PCR产物选殖到pET24a载体以取得pET24a-2a-F1、pET24a-2a-F2、pET24a-2a-F3、pET24a-2a-F4、pET24a-2a-F5、pET24a-2a-F6及pET24a-2a-ORF2质体，并将上述质体分别利用转殖作用(transformation)送入表现宿主大肠杆菌(E.coli)中，经选殖挑选出菌株中带有PCR片段的质体后，进行定序确认增殖的PCR产物序列无误，以得到含有上述质体的菌株。
3.不同长度PCV2 ORF2基因片段的蛋白表达及确认
先将含有上述质体的菌株以2ml的LB培养基，于37℃培养16-18小时，再将菌液以1：50的比例接种至LB培养基中，培养基中含有25μg/ml kanamycin，置于37℃、200rpm的培养箱中培养，直到菌液浓度达O.D 600nm为0.6时，加入β-D-thiogalactoside(IPTG)使其最终浓度为1mM，再于37℃、200rpm的培养箱中培养6小时，吸取1ml菌液，经10,000×g离心后，取离心后的菌块以B-PERTM细菌蛋白质萃取试剂(B-PERTM Bacterial ProteinExtraction，购自PIERCE)来确认重组蛋白为可溶性蛋白或是包涵体(inclusion body)。确认方法为于菌块中加入40μl的反应试剂，剧烈震荡(vortex)1分钟后，10,000×g离心，离心后重组蛋白在上层部份为可溶性蛋白，在下层部份则为包涵体。将可溶性蛋白溶于SDS-PAGE用的1x sample buffer，下层的菌块则加入2x的SDS-PAGE sample buffer。以干浴槽100℃煮沸20分钟后离心之，吸取上层液体部份，以15％的SDS-PAGE确认重组蛋白表现的情况。
以IPTG诱导含有上述质体的菌株产生重组蛋白，其中2a-ORF2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；2a-F1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，2a-F2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，2a-F3重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示，2a-F4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示，2a-F5重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo:12所示，2a-F6重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示。
以SDS-PAGE确认各片段重组蛋白表现的结果如图3所示，第1道为标准分子量梯度(Molecular weight ladder)，第2道为负对照组(pET24a)，第3道为2a-F1重组蛋白(12.7kDa)，第4道为2a-F2重组蛋白(11.6kDa)，第5道为2a-F3重组蛋白(12.1kDa)，第6道为2a-F4重组蛋白(16.5kDa)，第7道为2a-F5重组蛋白(21.4kDa)，第8道为2a-F6重组蛋白(20.8kDa)，第9道为2a-ORF2全长重组蛋白(27.5kDa)。于2a-ORF2的6个片段中，2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5片段都能大量表现(图3第4、5、6、7道)，其分子量位置与预测的11.6kDa、12.1kDa、16.5kDa、21.4kDa符合。
接着以西方墨渍分析法(Western Blot)确认表达重组蛋白是否为PCV2 2a-ORF2的片段。将SDS-PAGE电泳分析后的胶体转印到PVDF尼龙膜(Nylon membrane)上。转印后将尼龙膜置于填塞液(Blocking buffer：5％Skim milk,in TBST)于室温作用1小时，以去除非特异性反应。之后，加入第一级抗体：老鼠抗6x组织氨酸的单株抗体[标帜碱性磷酸酶(AP)]于室温作用1小时，再以TBST液(10mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,0.1％Tween20)清洗6次，每次各5分钟。洗涤后，加受质(NBT/BCIP,Bio-Rad)呈色约10分钟后，以清水水洗终止呈色反应。
西方墨渍分析法结果如图4所示，第1道为标准分子量梯度(Molecular weightladder)，第2道为负对照组(pET24a)，第3道为2a-F1重组蛋白(12.7kDa)，第4道为2a-F2重组蛋白(11.6kDa)，第5道为2a-F3重组蛋白(12.1kDa)，第6道为2a-F4重组蛋白(16.5kDa)，第7道为2a-F5重组蛋白(21.4kDa)，第8道为2a-F6重组蛋白(20.8kDa)，第9道为2a-ORF2全长重组蛋白(27.5kDa)。西方墨渍分析法结果与SDS-PAGE分析结果(如图3所示)相同。2a-ORF2全长重组蛋白(图4第9道)无法表现；2a-ORF2的6个片段中，2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5片段的蛋白都能被大量表现(图4第4、5、6、7道)，其分子量位置与预测的11.6kDa、12.1kDa、16.5kDa、21.4kDa符合。然而，2a-F1和2a-F6片段并没有重组蛋白的表现(图4第3、8道)，由于2a-F1和2a-F6片段都涵盖了从PCV2 2a-ORF2的5’端第1至234个核苷酸的基因片段(请参阅图2所示)，因此，造成ORF2基因无法大量表现的原因可能是该2a-F1片段内的某些序列，故针对2a-F1片段(PCV2 2a-ORF2的5’端第1至234个核苷酸，SEQ ID No:3)及2a-F2+2a-F3片段(PCV2 2a-ORF2的5’端第235至699个核苷酸(不含终止密码子)，SEQ ID No:11)的氨基酸序列分析后，发现2a-F1片段氨基酸序列(SEQ ID No:4)的精氨酸(Arginine)含量是2a-F2+2a-F3片段氨基酸序列(SEQ ID No:12)的2倍以上(如表二所示)；本案发明人进一步将该些精氨酸增加或删除后，去分析蛋白质表现，发现将该些过多的精氨酸减少后，确实可增加PCV2 ORF2的蛋白表现量。
表二、PCV2 2a-ORF2氨基酸序列中精氨酸的数量分析
实施例二 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的免疫原性(immunogenicity)的决定
1.大鼠免疫试验
将实施例一所得到的2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5重组蛋白以弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)制备为各种PCV2次单位疫苗，并进行大鼠(rats)免疫试验，以分析各重组蛋白的引发试验动物产生抗PCV2抗体的免疫原性。
取5～6周龄健康雌性清洁级大鼠15只作为试验动物，所有大鼠的猪第二型环状病毒(PCV2)酵素结合免疫吸附分析(ELISA)抗体皆呈阴性。将这15只大鼠随机分为5组，每组3只；第1～4组中，每只大鼠分别以皮下注射(subcutaneously,S.C.)注射200μg重组蛋白，注射疫苗总体积为300μL，其中重组蛋白与佐剂的体积比为1：1。第5组则注射300μL PBS作为负对照组。两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；各组隔离饲养观察，首次免疫后第0、2、4、8周分别采血分离血清，以酵素连结免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清内抗猪第二型环状病毒(PCV2)的抗体力价。
2.血清抗体的判定–以ELISA测定抗PCV2抗体力价
以含有PCV2病毒抗原(300ng/孔)的96孔抗原盘作为检测套组。以含有500μl/LTween-20的50mmol/L PBS(pH 7.2)(即PBST)洗涤抗原盘3次，每次3～5分钟；再于抗原盘中加入0.15％BSA填充液(blocking solution)(200μL/孔)，以填充(block)抗原盘，并于37℃下作用2小时后，以PBS洗涤。将待检测的大鼠血清以PBS缓冲液以1：50倍数稀释，然后再做倍比稀释；每个样品8重复，每孔加100μL稀释的大鼠血清，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；然后加入碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)标定的anti-mouse IgG抗体，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；接着加入磷酸对硝基苯酯(para-Nitrophenylphosphate,pNPP)溶液显色，最后用1M的NaOH终止反应后判定结果。读取各样本在405nm波长下的吸光值，每个样本读取两次，并取平均值进行分析。
ELISA分析结果如图5所示。在实施例一所得到的2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5重组蛋白皆可诱发试验动物产生抗PCV2的血清抗体；其中又以2a-F2重组蛋白片段(SEQ ID No:6)可以引发试验动物产生最高量之抗PCV2血清抗体，且相较于注射PBS的负对照组，抗体产生量皆具有显著差异(p<0.05)。
本案发明人进一步亦将该2a-F2、2a-F3、2a-F4、2a-F5重组蛋白进行猪只免疫，结果发现该等重组蛋白皆可诱发猪只产生抗PCV2血清抗体。此外，亦藉由PCV2攻毒试验评估该等重组蛋白的免疫保护效力：将该等重组蛋白配制成次单位疫苗后，进行猪只免疫后，再以PCV2病毒株攻毒，结果发现经攻毒后，免疫组的保护率高于对照组(未施以疫苗者)；此处所指的保护率提高包含：病毒血症的降低、PCV2病征的减缓。因此，证实该等重组蛋白所制备的PCV2次单位疫苗可有效提供动物产生免疫力，以提高动物的存活率。
实施例三 PCV2 2a次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及表达
由实施例二的试验结果可知，PCV2 ORF2的F2蛋白片段可引发试验动物产生最高量之抗PCV2血清抗体；为了提高PCV2次单位疫苗的免疫原性，在本实施例中，将实施例一所得的2a-F2蛋白片段的N端加上绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(exotoxin A)的受体结合区(receptor binding domain I)及运输结构区(transmembrane targetingdomain II)的蛋白(即PE蛋白)，且于该2a-F2蛋白片段的C端加上内质网回收讯号(ERretention signal)–KDEL蛋白质讯号序列(signal peptide)，以产生抗原融合蛋白(PE-2a-F2-KDEL)，以期诱导生物体产生更佳的免疫反应。
该抗原融合蛋白(PE-2a-F2-KDEL)系透过基因转殖技术，将编码各蛋白的DNA序列转入表现载体中，形成一抗原融合蛋白表现载体(pET24a-PE-2a-F2-KDEL)，并诱导该抗原融合蛋白表现载体表现该抗原融合蛋白(PE-2a-F2-KDEL)。首先，取编码KDEL蛋白质讯号序列的DNA序列(SEQ ID No:30)，转殖到pET24a质体中，以形成pET24a-KDEL质体；然后，取实施例一所得的2a-F2片段DNA序列(SEQ ID No:5)，转殖到该pET24a-KDEL质体中，以形成pET24a-2a-F2-KDEL质体；最后，取编码PE蛋白的DNA序列(SEQ ID No:34)，转殖到该pET24a-2a-F2-KDEL质体中，以形成pET24a-PE-2a-F2-KDEL质体。
1.pET24a-KEDL质体的构筑
编码KDEL蛋白质讯号序列(SEQ ID No:31)的DNA序列如SEQ ID No:30所示，以PCR进行扩增，KEDL专一性引子(KEDL specificity primers)的序列如下所示：
正向引子(含有Hind III限制酶酶切位置)：
5’-CCCCTCAAAAAAGACGAACTGAGAGATGAACTGAAAGA-3’(SEQ ID No:32)
Hind III
反向引子(含有Xho I限制酶酶切位置)：
5’-GTGCAGTTCGTCTTTCAGTTCATCT-3’(SEQ ID No:33)
Xho I
PCR反应条件为：94℃反应3分钟后，进行95℃1分钟、55℃1分钟、72℃20秒，共5个循环，最后以72℃反应1分钟以进行延伸反应(elongation)；分别将PCR产物与pET24a载体进行双酶切(以Hind III及Xho I两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a载体进行纯化以及接合(ligation)作用，以将PCR产物选殖到pET24a载体形成pET24a-KEDL质体，并将pET24a-KEDL质体利用转殖作用(transformation)送入寄主细胞大肠杆菌(E.coli)中，以进行大量增殖，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。
2.pET24a-2a-F2-KDEL质体的构筑
以PCR增殖实施例一所得的2a-F2DNA片段(SEQ ID No:5)，PCR引子序列如下：正向引子pF2-1 (含有Sac I限制酶酶切位置)：
5’-CTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGG-3’(SEQ ID No:38)
Sac I
反向引子pR2-1(含有Hind III限制酶酶切位置)：
5’-CCCGTAGGAGAAGGGTTGGGGGATT-3’(SEQ ID No:39)
Hind III
PCR反应条件为：95℃反应5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共25个循环，最后以72℃反应5分钟以进行延伸反应(elongation)；分别将PCR产物与上述pET24a-KEDL质体进行双酶切(以Sac I及Hind III两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a-KEDL质体进行纯化以及接合作用，以将PCR产物选殖到pET24a-KEDL质体形成pET24a-2a-F2-KEDL质体，并将该质体利用转殖作用(transformation)送入寄主细胞大肠杆菌(E.coli)中，以进行大量增殖，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。
3.pET24a-PE-2a-F2-KDEL质体的构筑
编码PE蛋白(SEQ ID No:35)的DNA序列如SEQ ID No:34所示，以PCR进行扩增，PE专一性引子(PE specificity primers)的序列如下所示：
正向引子(含有BamH I限制酶酶切位置)：
5’-CGGAAGAAGCGTTCGAC-3’(SEQ ID No:36)
BamH I
反向引子(含有EcoRI及Sac I限制酶酶切位置)：
5’-CGGAATTC GCAGGTCAGGCTCACCAC-3’(SEQ ID No:37)
EcoR I Sac I
PCR反应条件为：94℃反应5分钟后，进行95℃1分钟、55℃1分钟、72℃1.5分钟，共30个循环，最后以72℃反应7分钟以进行延伸反应；分别将PCR产物与上述pET24a-2a-F2-KEDL质体进行双酶切(以BamH I及Sac I两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a-2a-F2-KEDL质体进行纯化以及接合作用，以将PCR产物选殖到pET24a-2a-F2-KDEL质体，形成pET24a-PE-2a-F2-KEDL质体，并将pET24a-PE-2a-F2-KEDL质体利用转殖作用(transformation)送入表现宿主大肠杆菌(E.coli)中，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。PE-2a-F2-KEDL抗原融合蛋白的DNA序列则如SEQ ID No:40所示，而其氨基酸序列则如SEQ ID No:41所示。
4.PE-2a-F2-KDEL抗原蛋白的表达
将上述含有pET24a-PE-2a-F2-KEDL质体的大肠杆菌(E.coli)以LB培养基培养，并以IPTG诱导PE-2a-F2-KEDL抗原融合蛋白(SEQ ID No:41)表达，蛋白表达及萃取方法如实施例一所述。
实施例四 不同亚群(subgroup)的PCV2 ORF2序列的分析
除了2a亚群(subgroup)之外，猪第二型环状病毒(PCV2)还有其他亚群的病毒株，以下分别针对一2b亚群PCV2病毒株、2c亚群PCV2病毒株、2d亚群PCV2病毒株、及2e亚群PCV2病毒株的PCV2 ORF2序列，分析其ORF2的5’端第1至234个核苷酸以及第235至最后一个核苷酸之间片段的精氨酸(Arginine)含量。
首先，根据Wang等人(Wang et al.,Virus Research 2009,Genetic variationanalysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2)所提供的序列作为亲源关系树标准序列来分析SEQ ID No:15、SEQ ID No:19，结果显示该SEQ ID No:15属于PCV22b亚群(subgroup)的一员；该SEQ ID No:19属于PCV2 2d亚群(subgroup)的一员(如图1所示)；而SEQ ID No:50及SEQ ID No:52则分别为PCV2 2c亚群及PCV2 2e亚群的标准株。
PCV2 2b亚群株的序列分析结果如表三所示，该PCV2 2b亚群株的2b-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No:15所示，氨基酸序列如SEQ ID No:16所示；其中，2b-ORF2的5’端第1至234个核苷酸片段编码21个精氨酸，而2b-ORF2的5’端第235至699个核苷酸(不含终止密码子)序列如SEQ ID No:17所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:18所示，该片段编码10个精氨酸；PCV2 2b亚群株的序列分析结果与PCV2 2a亚群株的序列分析结果一致，两者ORF2蛋白N端序列的精氨酸含量皆为其他部份精氨酸含量的2倍以上(如表二及表三所示)。
表三、PCV2 2b-ORF2氨基酸序列中精氨酸的数量分析
PCV2 2c亚群株的序列分析结果如表四所示，该PCV2 2c亚群株的2c-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No:50所示，氨基酸序列如SEQ ID No:51所示；其中，2c-ORF2的5’端第1至234个核苷酸片段编码20个精氨酸，而2c-ORF2的5’端第235至702个核苷酸序列如SEQ IDNo:54所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:55所示，该片段编码10个精氨酸；PCV2 2c亚群株的序列分析结果与PCV2 2a及2b亚群株的序列分析结果一致，三者ORF2蛋白N端序列的精氨酸含量皆为其他部份精氨酸含量的2倍以上(如表二、表三、表四所示)。
表四、PCV2 2c-ORF2氨基酸序列中精氨酸的数量分析
PCV2 2d亚群株的序列分析结果如表五所示，该PCV2 2d亚群株的2d-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No:19所示，氨基酸序列如SEQ ID No:20所示；其中，2d-ORF2的5’端第1至234个核苷酸片段编码21个精氨酸，而2d-ORF2的5’端第235至702个核苷酸片段(不含终止密码子)序列如SEQ ID No:21所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:22所示，该片段编码10个精氨酸；PCV2 2d亚群株的序列分析结果与PCV2 2a、2b、及2c亚群株的序列分析结果一致，四者ORF2蛋白N端序列的精氨酸含量皆为其他部份精氨酸含量的2倍以上(如表二、表三、表四及表五所示)。
表五、PCV2 2d-ORF2氨基酸序列中精氨酸的数量分析
PCV2 2e亚群株的序列分析结果如表六所示，该PCV2 2e亚群株的2e-ORF2核苷酸序列如SEQ ID No:52所示，氨基酸序列如SEQ ID No:53所示；其中，2e-ORF2的5’端第1至234个核苷酸片段编码20个精氨酸，而2e-ORF2的5’端第235至699个核苷酸片段(不含终止密码子)序列如SEQ ID No:56所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:57所示，该片段编码9个精氨酸；PCV2 2e亚群株的序列分析结果与PCV2 2a、2b、2c及2d亚群株的序列分析结果一致，五者ORF2蛋白N端序列的精氨酸含量皆为其他部份精氨酸含量的2倍以上(如表二、表三、表四、表五及表六所示)。
表六、PCV2 2e-ORF2氨基酸序列中精氨酸的数量分析
与实施例一相同，本案亦分析了PCV2 2b亚群株、PCV2 2c亚群株、PCV2 2d亚群株及PCV2 2e亚群株的N端富含精氨酸区域(Arginine-rich domian)，及非富含精氨酸区域(non-Arginine-rich domain)的蛋白表现量，发现与实施例一结果相同，该N端富含精氨酸区域所编译的蛋白片段难以被表达；然而，该非富含精氨酸区域所编译的蛋白片段可易于生物表现系统中被表达；且进一步将该些精氨酸增加或删除后，并分析蛋白质表现后，亦发现结果与PCV2 2a亚群株一致，当该些过多的精氨酸数量减少后，发现确实可增加PCV2ORF2的蛋白表现量。
其中该富含精氨酸区域约在PCV2 ORF2全长肽的N端第1至78个氨基酸之间的区域；该非富含精氨酸区域约在PCV2 ORF2的N端第79个氨基酸至C端最后一个氨基酸之间的区域。
实施例五 PCV2 2b次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及表达
1.pET24a-2b-F2质体的构筑及表达
本实施例针对实施例四的PCV2 2b亚群株的ORF2基因进行次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑。同实施例一及三，选用F2片段(PCV2 2b的ORF2基因5’端第235-468个核苷酸，以下称为2b-F2片段)进行构筑。该PCV2 2b亚群株的2b-F2片段的核苷酸序列如SEQ ID No:17所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。以PCR扩增2b-F2片段核苷酸序列，PCR引子序列如下：
正向引子pF-2b(含有Sac I限制酶酶切位置)：
5’-CTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGC-3’(SEQ ID No:42)
Sac I
反向引子pR-2b(含有Hind III限制酶酶切位置)：
5’-CCCGTAGGAGAAGGGCTGGGTTAT-3’(SEQ ID No:43)
Hind III
PCR反应条件为：95℃反应5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共25个循环，最后以72℃反应5分钟以进行延伸反应(elongation)；分别将PCR产物与pET24a表现载体(Novagen)进行双酶切(以Sac I及Hind III两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a表现载体进行纯化以及接合作用，以将PCR产物选殖到pET24a表现载体形成pET24a-2b-F2质体，并将该质体利用转殖作用(transformation)送入寄主细胞大肠杆菌(E.coli)中，以进行大量增殖，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。接着将上述含有pET24a-2b-F2质体的大肠杆菌(E.coli)以LB培养基培养，并以IPTG诱导2b-F2抗原蛋白(SEQ ID No:18)表达，蛋白表达及萃取方法如实施例一所述。
2.pET24a-PE-2b-F2-KDEL质体的构筑及表达
在本实施例中，除了以2b-F2氨基酸片段作为PCV2次单位疫苗的抗原片段之外，也在2b-F2氨基酸片段的N端及C端分别加上PE蛋白及KDEL蛋白质讯号序列，形成抗原融合蛋白PE-2b-F2-KDEL，以期诱导生物体产生更佳的免疫反应。
抗原融合蛋白PE-2b-F2-KDEL的DNA序列如SEQ ID No:44所示，而其氨基酸序列如SEQ ID No:45所示。表达该抗原融合蛋白PE-2b-F2-KDEL的质体(pET24a-PE-2b-F2-KDEL)的构筑策略同实施例三。首先，取编码KDEL蛋白质讯号序列的DNA序列(SEQ ID No:30)，转殖到pET24a质体中，以形成pET24a-KDEL质体，pET24a-KDEL质体的构筑方式如实施例三所述。然后，取上述PCR增殖的2b-F2片段DNA序列(SEQ ID No:17)，转殖到该pET24a-KDEL质体中，以形成pET24a-2b-F2-KDEL质体。最后，取编码PE蛋白的DNA序列(SEQ ID No:34)，转殖到该pET24a-2b-F2-KDEL质体中，以形成pET24a-PE-2b-F2-KDEL质体，pET24a-PE-2b-F2-KDEL质体的构筑方式亦如实施例三所述。接着将上述含有pET24a-PE-2b-F2-KEDL质体的大肠杆菌(E.coli)以LB培养基培养，并以IPTG诱导PE-2b-F2-KEDL抗原融合蛋白(SEQ ID No:45)表达，蛋白表达及萃取方法如实施例一所述。
实施例六 PCV2 2d次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑及表达
1.pET24a-2d-F2质体的构筑及表达
本实施例针对实施例四的PCV2 2d亚群株的ORF2基因进行次单位疫苗抗原蛋白片段的构筑。同实施例一及三，选用F2片段(PCV2 2d的ORF2基因5’端第235-468个核苷酸，以下称为2d-F2片段)进行构筑。该PCV2 2d亚群株的2d-F2片段的核苷酸序列如SEQ ID No:21所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:22所示。以PCR扩增2b-F2片段核苷酸序列，PCR引子序列如下：
正向引子pF-2d(含有Sac I限制酶酶切位置)：
5’-CTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGC-3’(SEQ ID No:46)
Sac I
反向引子pR-2d(含有Hind III限制酶酶切位置)：
5’-CCCGTAGGAGAAGGGCTGGGTTAT-3’(SEQ ID No:47)
Hind III
PCR反应条件为：95℃反应5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共25个循环，最后以72℃反应5分钟以进行延伸反应(elongation)；分别将PCR产物与pET24a表现载体(Novagen)进行双酶切(以Sac I及Hind III两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a表现载体进行纯化以及接合作用，以将PCR产物选殖到pET24a表现载体形成pET24a-2d-F2质体，并将该质体利用转殖作用(transformation)送入寄主细胞大肠杆菌(E.coli)中，以进行大量增殖，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。接着将上述含有pET24a-2d-F2质体的大肠杆菌(E.coli)以LB培养基培养，并以IPTG诱导2d-F2抗原融合蛋白(SEQ ID No:22)表达，蛋白表达及萃取方法如实施例一所述。
2.pET24a-PE-2d-F2-KDEL质体的构筑及表达
在本实施例中，除了以2d-F2氨基酸片段作为PCV2次单位疫苗的抗原片段之外，也在2d-F2氨基酸片段的N端及C端分别加上PE蛋白及KDEL蛋白质讯号序列，形成抗原融合蛋白PE-2d-F2-KDEL，以期诱导生物体产生更佳的免疫反应。
抗原融合蛋白PE-2d-F2-KDEL的DNA序列如SEQ ID No:48所示，而其氨基酸序列如SEQ ID No:49所示。表达该抗原融合蛋白PE-2d-F2-KDEL的质体(pET24a-PE-2d-F2-KDEL)的构筑策略同实施例三。首先，取编码KDEL蛋白质讯号序列的DNA序列(SEQ ID No:30)，转殖到pET24a质体中，以形成pET24a-KDEL质体，pET24a-KDEL质体的构筑方式如实施例三所述。然后，取上述PCR增殖的2d-F2片段DNA序列(SEQ ID No:21)，转殖到该pET24a-KDEL质体中，以形成pET24a-2d-F2-KDEL质体。最后，取编码PE蛋白的DNA序列(SEQ ID No:34)，转殖到该pET24a-2d-F2-KDEL质体中，以形成pET24a-PE-2d-F2-KDEL质体，pET24a-PE-2d-F2-KDEL质体的构筑方式亦如实施例三所述。接着将上述含有pET24a-PE-2d-F2-KEDL质体的大肠杆菌(E.coli)以LB培养基培养，并以IPTG诱导PE-2d-F2-KEDL抗原融合蛋白(SEQ ID No:49)表达，蛋白表达及萃取方法如实施例一所述。
实施例七 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的免疫原性(immunogenicity)的分析-1
1.小鼠免疫试验
将实施例一所得到的2a-F2重组蛋白(SEQ ID No:6)以及实施例三所得到的PE-2a-F2-KDEL重组蛋白(SEQ ID No:41)分别以弗氏完全佐剂制备为PCV2次单位疫苗，并进行小鼠(mice)免疫试验，以比较这两种重组蛋白引发试验动物产生抗PCV2抗体的免疫原性。
取5～6周龄健康雌性清洁级Balb/c小鼠9只作为试验动物，所有小鼠的猪第二型环状病毒(PCV2)ELISA抗体皆呈阴性。将这9只小鼠随机分为3组，每组3只；第1、2组中，每只小鼠分别以腹腔注射(intraperitoneally,I.P.)注射100μg重组蛋白2a-F2及PE-2a-F2-KDEL。第3组则注射PBS作为负对照组。两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；各组隔离饲养观察，首次免疫后第2、4、5、6周分别采血分离血清，以ELISA测定血清内抗PCV2的抗体力价。
2.血清抗体的判定–以ELISA测定抗PCV2抗体力价
以含有PCV2病毒抗原(300ng/孔)的96孔抗原盘作为检测套组。以含有500μl/LTween-20的50mmol/L PBS(pH 7.2)(即PBST)洗涤抗原盘3次，每次3～5分钟；再于抗原盘中加入0.15％BSA填充液(blocking solution)(200μL/孔)，以填充(block)抗原盘，并于37℃下作用2小时后，以PBS洗涤。将待检测的小鼠血清以PBS缓冲液以1：50倍数稀释，然后再做倍比稀释；每个样品8重复，每孔加100μL稀释的小鼠血清，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；然后加入碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)标定的anti-mouse IgG抗体，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；接着加入磷酸对硝基苯酯(para-Nitrophenylphosphate,pNPP)溶液显色，最后用1M的NaOH终止反应后判定结果。读取各样本在405nm波长下的吸光值，每个样本读取两次，并取平均值进行分析。
ELISA分析结果如图6所示。相较于2a-F2重组蛋白片段(SEQ ID No:6)，PE-2a-F2-KDEL重组蛋白(SEQ ID No:41)可以引发试验动物产生较高量的抗PCV2血清抗体，且于首次免疫第4周后，第1组及第2组小鼠产生的血清抗体量开始具有显著差异(p<0.05)；到了首次免疫后第6周，两组产生的血清抗体量差异更大(p<0.001)。另外，相较于注射PBS的负对照组，第1组及第2组小鼠的抗体产生量皆具有显著差异(p<0.01)。
实施例八 PCV2次单位疫苗抗原蛋白片段的免疫原性(immunogenicity)的分析-2
1.小鼠免疫试验
在本实施例中，比较本发明PE-2a-F2-KDEL重组蛋白次单位疫苗以及PCV2全病毒疫苗引发试验动物产生抗PCV2抗体的免疫原性。
将实施例三所得到的PE-2a-F2-KDEL重组蛋白(SEQ ID No:41)以油质佐剂Montanide ISA206 (Seppic,France)制备为PCV2次单位疫苗。另外，取不活化的PCV2全病毒(106TCID50/ml)，以油质佐剂Montanide ISA206 (Seppic,France)制备为PCV2全病毒疫苗，每一剂量的PCV2全病毒疫苗含有100μl不活化的PCV2全病毒以及250μl佐剂。接着进行小鼠免疫试验。
取5～6周龄健康雌性清洁级Balb/c小鼠15只作为试验动物，所有小鼠的猪第二型环状病毒(PCV2)ELISA抗体皆呈阴性。将这15只小鼠随机分为3组，每组5只；第1组中的每只小鼠分别以腹腔注射(I.P.)注射100μg重组蛋白。第2组中的每只小鼠分别以腹腔注射(I.P.)注射一剂量的PCV2全病毒疫苗。第3组则注射油质佐剂Montanide ISA206作为负对照组。三周后用相同免疫剂量加强免疫一次；各组隔离饲养观察，首次免疫后第0、1、2、3、4、5周分别采血分离血清，以ELISA测定血清内抗PCV2的抗体力价。
2.血清抗体的判定–以ELISA测定抗PCV2抗体力价
同实施例七所述的”以ELISA测定抗PCV2抗体力价”的方法。ELISA分析结果如图7所示。相较于PCV2全病毒疫苗，PE-2a-F2-KDEL重组蛋白(SEQ ID No:41)可以引发试验动物产生较高量的抗PCV2血清抗体，且于首次免疫1周后，第1组及第2组小鼠产生的血清抗体量便具有显著差异(p<0.001)；且相较于注射油质佐剂的负对照组，注射PE-2a-F2-KDEL重组蛋白的小鼠的抗体产生量，在首次免疫1周后便具有显著差异(p<0.001)。
此外，将前述的2a-F2重组蛋白、PE-2a-F2-KDEL重组蛋白进行猪只免疫，结果发现该等重组蛋白皆可诱发猪只产生抗PCV2血清抗体。此外，亦藉由PCV2攻毒试验评估该等重组蛋白的免疫保护效力：将该等重组蛋白配制成次单位疫苗后，进行猪只免疫后，再以PCV2病毒株攻毒，结果发现经攻毒后，免疫组的保护率高于对照组(未施以疫苗者)；此处所指的保护率提高包含：病毒血症的降低、PCV2病征的减缓。因此，证实该等重组蛋白所制备的PCV2次单位疫苗可有效提供动物产生免疫力，以提高动物的存活率。
相同地，本案进一步将PCV2 2b亚群株、PCV2 2c亚群株、PCV2 2d亚群株、及PCV22e亚群株的ORF2以实施例一至三的构筑方式构筑，进而以实施例七、八所述的免疫原性分析进行分析，结果发现，该等亚群株的ORF2片段(如：F2片段)及其融合蛋白(如：PE-F2-KDEL)所制备的PCV2次单位疫苗皆可诱发动物(如：猪只)产生抗PCV2抗体，进而保护动物免于被PCV2病毒感染。
本发明所提供的PCV2次单位疫苗，与其他习用技术相互比较时，更具有下列的优点：
本发明所提供的PCV2次单位疫苗系利用基因重组技术，从PCV2病毒ORF2蛋白全长片段中选殖出于生物表现系统中可表现大量蛋白质的片段，利用该ORF2蛋白片段所制备的PCV2次单位疫苗，不但可以引发动物产生抗PCV2病毒的免疫力，且该ORF2蛋白片段可以基因重组技术大量生产，亦可降低制造疫苗的成本。
本发明所提供的另一PCV2次单位疫苗，系以PCV2病毒ORF2的F2蛋白片段与PE蛋白及KDEL蛋白质讯号序列形成PE-F2-KDEL抗原融合蛋白，经试验结果显示，此一次单位疫苗更可提高动物对抗PCV2病毒的免疫性及效率。
本发明所提供的PCV2次单位疫苗系利用基因重组技术所研发的次单位疫苗，其具备有生产制备简单、成本低、纯度高、产量高及安全性佳等优点。
上列详细说明系针对本发明的一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (6)

1.一种抗猪第二型环状病毒免疫组合物，包含一抗原肽，该抗原肽选自由(a)及(b)所组成的群组：
(a)PCV2第二开放阅读区非富含精氨酸肽PCV2 2a ORF2，所述的PCV2 2a ORF2的氨基酸序列如SEQ ID No:6、SEQ ID No:8、SEQ ID No:10或SEQ ID No:12所示；及
(b)重组融合蛋白，该重组融合蛋白自氨基端到羧基端为：
PE肽，其氨基酸序列如SEQ ID No:35所示；
(a)项所述的PCV2 2a ORF2非富含精氨酸肽；以及
KDEL肽，其氨基酸序列如SEQ ID No:31所示。
2.如权利要求1所述的免疫组合物，进一步包含PCV2其他开放阅读区的抗原蛋白，该PCV2其他ORF的抗原蛋白为ORF1和/或ORF3。
3.如权利要求1所述的免疫组合物，进一步包含至少一种病原抗原，该病原抗原选自由下列群组所组成者：猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒抗原、猪霉浆菌、猪小病毒、猪丹毒，以及伪狂犬病。
4.如权利要求1所述的免疫组合物，进一步包含一或多种选自于下者：载剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、黏结剂、赋形剂、安定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂、界面活性剂、及佐剂。
5.如权利要求1所述的免疫组合物，其中该第(b)项的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:41所示。
6.一种制备权利要求1至5任一项所述抗猪第二型环状病毒免疫组合物中涉及的抗原肽片段的方法，包含：
去除PCV2ORF2DNA序列中编码N端富含精胺酸区域的DNA序列，得到一编码一PCV2ORF2非富含精氨酸区域的DNA序列，其序列如SEQ ID No:5、SEQ ID No:7、SEQ ID No:9或SEQ IDNo:11所示；以及
将该DNA序列置于大肠杆菌中表现，得到抗猪第二型环状病毒的免疫组合物中的抗原肽片段。
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