CN100506980C

CN100506980C - 包含HCV的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的组合物,包括相应核酸序列的表达载体及它们的治疗应用

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Publication number: CN100506980C
Application number: CNB2004800222196A
Authority: CN
Inventors: 阿内·弗尔尼利耶; 热纳维耶芙·安绍斯普; 让-达尼埃尔·亚伯拉罕; 马里亚·季米特洛娃-乔马科夫; 玛丽·帕尔诺
Original assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Transgene SA
Current assignee: NATIONAL HEALTH AND MEDICINE INST; Transgene SA
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2024-06-04
Also published as: MXPA05013127A; KR20060030476A; SI1629091T1; PL1629091T3; WO2004111082A2; PT1629091E; BRPI0411011A; CA2528240A1; CA2528240C; FR2855758A1; EP1629091B1; AU2004247457A1; AU2004247457B2; ZA200509937B; US8541004B2; ATE508184T1; FR2855758B1; CN1833022A; JP2007527207A; JP4625803B2

Abstract

本发明涉及一种肽组合物，其含有丙型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4和丙型肝炎病毒的多肽NS5b。本发明还涉及插入了编码多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的核酸序列的表达载体如腺病毒和痘病毒。本发明的组合物可用于治疗用途。

Description

包含HCV的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的组合物，包括相应核酸序列的表达载体及它们的治疗应用

本发明涉及抗丙型肝炎病毒(HCV)的预防和治疗性接种领域。本发明特别涉及一种新组合物，其含有相应于两种共线性蛋白质NS3和NS4的一种多蛋白(后文称作多蛋白NS3/NS4)和由NS5b组成的一种多肽，能表达这种组合物的载体如腺病毒或痘病毒，以及它们作为疫苗的应用。

丙型肝炎是输血获得性肝炎的主要原因。丙型肝炎也可以通过其它经皮途径而传播，例如通过静脉内注射药物而传播。而且健康从业人员的感染危险也不可忽略。性传播也已经描述。

丙型肝炎与其它形式的病毒相关的肝脏疾病如甲型、乙型或丁型肝炎不同。丙型肝炎病毒(HCV)感染大多数是慢性的，在许多病例中(5—20％)导致肝脏疾病，如肝炎、肝硬化和肝癌，在发达国家导致30％的肝脏移植。

尽管通过输血引起病毒传播的危险由于在20世纪90年代进行筛查试验而降低，但是新的HCV感染频率仍较高。例如，近来的研究表明目前在法国每年仍有10000—15000个新感染病例发生(S.Deufficet al.，Hepatology 1999；29:1596-1601)。目前，世界范围内有大约1亿7千万人临床感染HCV(Hepatitis C:Global prevalence(update)，2000，Weekly Epidemiological Record，Vol75(3))。高危人群是医院工作人员和静脉内药物使用者，但是发现了不属于高危人群的但在其循环血中发现了抗HCV抗体的无症状的供血者。对于后者，感染途径还未鉴定。HCV感染因此存在(估计5—10％)散发感染，其病原学未知并且不可控制。

HCV是通过分子生物学技术分离的第一种嗜肝病毒。该病毒的基因组序列在观测到病毒颗粒之前克隆。

HCV属于黄病毒科(Flaviviriade)的一种新属hepaciviruses。其是一种9.5kb的正单链RNA病毒，通过互补RNA拷贝复制并且其翻译产物是一种大约3000个氨基酸的多蛋白前体。HCV基因组的5’末端相应于非翻译区，其邻近编码结构蛋白、核壳的核心蛋白、两种包膜糖蛋白E1和E2、及称为p7的小蛋白的基因。所述5’非翻译区和基因核心在不同的基因型中相对保守。包膜蛋白E1和E2由在分离株间更可变的区域编码。蛋白质p7是一种极端疏水的蛋白质，其可以形成离子通道。HCV基因组的3’末端含有编码非结构蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)及编码具有充分保守的结构域的3’非编码区的基因(Major ME，Feinstone SM，Hepatology，June 1997，25(6):1527-1538)。

目前，丙型肝炎最有效的治疗是组合PEG化干扰素和ribavin(Manns MP et al.，The Lancet，22^nd September 2001，Vol.358，958—965)。这种治疗在感染属于基因型2和3的毒株的患者中特别有效，而对基因型1a、1b和4的作用有限(Manns MP，如上)。50％以下的经治疗的患者成为“长期反应者”。另外，这种治疗是一种昂贵的干预工具(10000—15000欧元/患者/年)，并且具有毒性作用。事实上，5—10％的患者在结束之前被迫停止治疗。

因此需要揭示一种靶向所有基因型的疫苗组合物。

一些研究示出HCV所致感染的天然(自发解决(résolutionspontanée))或治疗后(治疗性解决)控制与涉及T-CD4⁺和T-CD8⁺淋巴细胞的细胞介导的免疫应答相关(例如LECHNER，F.et al.，Eur.J.Immunol.，30:2479—2487(2000)及Thimme R.et al.，2001，J.Exp.Med.，194(10)：1395—1406)。

主要组织相容性复合物分子(MHC，在人类中也称作HLA)是指I类或II类分子。I类分子在基本上所有有核的细胞上表达并且能将表位或肽呈递至CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。II类细胞能将表位呈递至CD4⁺T细胞，但其表达限于抗原呈递细胞。

目前研究的抗丙型肝炎病毒的疫苗基于使用佐剂重组蛋白、肽、表达载体，可以提及的是病毒或细菌来源的载体或裸DNA。在这种情况中，使用一或多种病毒蛋白或者编码这些病毒蛋白的一或多种基因。

当选择一些病毒蛋白或者编码这些病毒蛋白的一或多种基因时，后者通常由一些或所有结构蛋白组成(Makimura et al.，1996，Vaccine，14：28-34；Fournilier A.et al.，1999，J.Virology，73:7497-7504)，或者由各个非结构蛋白组成或者包含至少两种连续的蛋白质(Brinsteret al.，2001，Hepatology，34:1206—1217)，或者由结构蛋白和非结构蛋白的混合物组成(Pancholi et al.，2003，J.Virology，77：382—390)。

专利申请WO99/38880描述了分别编码三种蛋白质NS3/NS4和NS5(a和b)的三种基因在一种疫苗组合物中的应用，所述疫苗组合物包含分别表达这三种蛋白质的三种DNA疫苗。作者证明在小鼠中诱导了特异于这三种抗原的T淋巴细胞。只有表达NS5a和b的疫苗在体内进行了保护试验测试。

专利申请WO01/30812描述了由非结构蛋白NS3、NS4和NS5a组成的融合蛋白的应用，如果需要则组合非结构蛋白NS5b。作者表明这种组合使得可以激活HCV特异性T细胞。这个专利申请仅简单描述了表达融合蛋白NS3、NS4、NS5a或蛋白NS5a的疫苗配制品(裸DNA，重组腺病毒或重组痘苗病毒类型)在诱导特异性T淋巴细胞介导的特异性免疫应答中的作用。

相对于所有的预期，本申请人现证实非结构蛋白NS3、NS4和NS5b的特定组合(其中NS3和NS4共线性表达)具有更好的免疫原性能力和保护能力，优于除了这些非结构蛋白还包括蛋白NS5a和/或HCV的其它结构蛋白如核心蛋白、E1或E2的疫苗，并且对源自病毒毒株感染的患者的细胞诱导特异性免疫应答的能力有作用。

因此，本发明的一个目的是提供一种肽组合物，其包含丙型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4和丙型肝炎病毒的多肽NS5b。

本发明的另一目的是提供包括编码所述肽组合物的核苷酸序列的载体，如腺病毒和痘病毒载体，以及由这些载体转化的微生物或宿主细胞。

本发明的另一目的是提供抗本发明肽组合物的抗体，以及所述肽组合物、载体和抗体在制备用于抑制或控制丙型肝炎病毒所致感染的药物和疫苗组合物中的应用。

本发明因此提供了由HCV的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b组成的一种新肽组合物，所述组合物具有刺激细胞介导的特异于HCV的免疫应答的能力，由此可用于抗丙型肝炎病毒的预防性和治疗性免疫接种领域。

本发明的肽组合物的多蛋白NS3/NS4由蛋白NS3及蛋白NS4a和b组成，在肽序列中无间断，与在天然多蛋白中一样。事实上，如前所述，HCV基因组含有一个被转录为多蛋白的单一可读框。这个HCV多蛋白可被切割产生至少10个分离的部分，顺序是NH2-核心-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH。

蛋白NS3是具有630个氨基酸的蛋白质，大约是从所述多蛋白的第1027位至1657位氨基酸。蛋白NS4是具有314个氨基酸的蛋白质，大约是从所述多蛋白的第1658位至第1972位氨基酸(根据HCV-1进行编号)(Choo et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.88：2451—2455)。多蛋白NS3/NS4因此大约是从第1027位至第1972位氨基酸。

也包含于本发明的组合物中的多肽NS5b由590个氨基酸组成，大约是从所述多蛋白的第2421位至第3011位氨基酸(Choo et al.，1991，如前)。

蛋白NS3包含两个分离的结构结构域，称为N末端结构域和C末端结构域，N末端结构域具有参与病毒多蛋白成熟的活性丝氨酸蛋白酶活性，C末端结构域包含在病毒基因组复制中起作用的与NTPase活性相关的解旋酶活性。

“多蛋白NS3/NS4”和“多肽NS5b”是指具有天然氨基酸序列，源自任何HCV毒株及分离株的多蛋白和多肽以及其类似物、突变蛋白和同源物。

所述多蛋白和多肽的“类似物”或“突变蛋白”是指具有希望活性、即具有上述刺激细胞介导的免疫应答能力的所述分子的生物学活性衍生物。

通常地，术语“类似物”是指相对于天然分子具有天然多肽序列和结构、又具有一或多个氨基酸添加、取代(通常为保守取代)和/或缺失的化合物，程度是所述修饰不破坏免疫原性。术语“突变蛋白”是指具有一或多个模拟所述肽的元件的肽(peptoids)，如专利申请PCT WO91/04282所述。优选地，类似物或突变蛋白与天然分子具有至少相同的免疫活性。制备多肽类似物和突变蛋白的方法为本领域技术人员所知并在下文描述。

特别优选的类似物包括天然保守取代，即所述取代在一个氨基酸家族内发生。特别地，氨基酸通常分为4个家族，即(1)酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸，(2)碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸，(3)非极性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸及(4)极性不带电氨基酸如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳族氨基酸。例如，因此可推定如下独立的置换对生物学活性无明显影响：亮氨酸由异亮氨酸或缬氨酸置换、天冬氨酸由谷氨酸置换、苏氨酸由丝氨酸置换，或者一个氨基酸由具有结构相关性的另一个氨基酸相似地保守置换。本领域技术人员通过本领域所熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle图易于确定感兴趣的肽分子中可耐受改变的区域。

“同源性”是指两个肽分子如多蛋白和多肽之间的相同性百分比。当两个氨基酸序列在指定肽分子长度上具有至少60％，优选至少75％，更优选至少80—85％，更优选至少90％，更优选至少98％或更多的序列相同性时，则这两个氨基酸序列是彼此“或多或少同源的”。

通常地，术语“相同性”是指两个肽序列的精确的氨基酸对氨基酸相应程度。相同性百分比可以通过直接对比两个分子的序列信息而确定，通过排列对比所述序列，计数两个对比序列之间错配的精确数目，除以较短序列的长度再将结果乘以100而确定。相同性百分比也可以使用计算机程序确定，如ALIGN，Dayhoff，M.O.in Atlas ofProtein Sequence and Structure M.O.Dayhoffed.，1981，5Suppl.，3：482—489。

已经确定了一些HCV毒株和分离株的特别是蛋白NS3、NS4和多肽NS5b的核酸和氨基酸序列。

例如，分离株HCV-J1在Okamoto H.et al.，1992，Nucleic AcidsRes.，20:6410—6410中描述。两个独立的HCV分离株即分离株HCV-J和HCV-BK的完整编码序列分别在Kato et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：9524—9528及在Takamizawa et al.，1991，J.Virol.，65：1105—1113中描述。分离株HCV-1在Choo et al.，1990，Brit.Med.Bull.，46：423—441及在Choo et al.，1991中描述。分离株HCV-H在Inchauspe G.et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.，88：10292—10296中描述。分离株HCV-G9在Okamoto H.，et al.，1994，J.Gen.Virol.，45:629—635中描述。分离株HCV-J6和HCV-J8分别在Okamoto H.，et al.，1991，J.Gen.Virol.，72：2697—2704和Okamoto H.，et al.，1992，Virology，188：331—341中描述。分离株HCV-BEBE1在Nako H.，et al.，1996，J.Gen.Virol.，141：701—704中描述，分离株HCV-NZL1在Sakamoto M.，et al.，1994，J.Gen.Virol.，75：1761—1768中描述。分离株HCV-Tr在Chayama K.，et al.，1994，J.Gen.Virol.，75：3623—3628中描述。分离株HCV-ED43和HCV-EUH1480分别在Chamberlain R.W.，et al.，1997，J.Gen.Virol.，78：1341—1347和Chamberlain R.W.，et al.，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.，236：44—49中描述。分离株HCV-EUHK2在AdamsA.，et al.，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.，234：393—396中描述。分离株HCV-VN235，HCV-VN405和HCV-VN004在Tokita H.，et al.，1998，J.Gen.Virol.，79：1847中描述。最后，分离株HCV-JK049和HCV-JK046在Tokita H.et al.，1996，J.Gen.Virol.，77：293—301中描述。

如上例证的HCV毒株和分离株可具有不同的基因型，即基因型1a(分离株HCV-1，HCV-J1，HCV-H)，1b(分离株HCV-J和HCV-BK)，1c(分离株HCV-G9)，2a(分离株HCV-J6)，2b(分离株HCV-J8)，2c(分离株HCV-BEBE1)，3a(分离株HCV-NZL1)，3b(分离株HCV-Tr)，4a(分离株HCV-ED3)，5a(分离株HCV-EUH1480)，6a(分离株HCV-EUHK2)，7b(分离株HCV-VN235)，8b(分离株HCV-VN405)，9a(分离株HCV-VN004)，10a(分离株HCV-JK049)和11a(HCV-JK046)。

根据本发明的一个实施方案，NS3和/或NS4和/或NS5b源自不同基因型的病毒。

根据本发明的另一个实施方案，NS3和/或NS4和/或NS5b源自相同基因型的病毒，优选基因型1b。

本发明的肽组合物中包含的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b可以是天然来源的或者是重组的。

天然来源的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b通过使用合成的寡核苷酸引物得自HCV毒株或分离株，所述引物可以从靶定的病毒基因型感染的患者血清、或者从源自例如患者的血液或肝的已经纯化的病毒RNA、或者从游离的或者预先克隆在表达载体中的互补DNA、或者从生物学样品或体外繁殖系统中纯化的病毒颗粒扩增天然病毒序列。

本发明的重组来源的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b也可以通过基因工程技术获得，所述技术包括如下步骤：

—培养用编码所述多蛋白NS3/NS4或所述多肽NS5b的核苷酸序列转化的微生物或真核细胞，

—回收由所述微生物或所述真核细胞产生的肽。

这一技术为本领域技术人员所熟知。为更详细了解这一技术，可参考如下文献：Recombinant DNA Technology 1，Editors Ales Prokop，Raskesh K Bajpai；Annals of the New-York Academy of Sciences，Volume 646，1991。

编码多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的核苷酸序列可以使用本领域技术人员熟知的并例如Sambrook J.et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，1989所述的技术，通过化学合成方法联合基因工程技术或者只通过基因工程方法而制备。

编码多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的核苷酸序列可以插入合适的表达系统内的表达载体中，以获得本发明的肽组合物。

当然，所述核苷酸序列可以插入单个的表达载体中或者插入两个不同的表达载体中。在后者的情况中，编码多蛋白NS3/NS4的序列插入所述两个载体之一中，编码多肽NS5b的序列插入另一个载体中，这两个载体是相同或不同的。

因此，本发明的另一个目的是提供表达载体，其包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列和编码多肽NS5b的核苷酸序列，以及其表达必需的工具(moyens)。

肽表达所必需的工具是指可以获得所述肽的任何工具，特别例如是启动子、转录终止子、复制起点，优选是选择标记，其中术语肽是指任何肽分子如蛋白质、多蛋白、多肽等。

肽表达必需的工具与编码感兴趣的肽的核酸序列可操纵地连接。“可操纵地连接”是指表达所需的元件与编码感兴趣的肽的基因的并列关系，这种关系可以使它们以期望的方式起作用。例如，在所述启动子与感兴趣的基因之间可以存在额外的碱基，程度是其功能关系得以保持。

肽表达必需的工具可以是同源的工具，即包括在所用载体的基因组中，或者是异源的。在后者的情况中，所述工具与要表达的感兴趣的肽一起克隆。

异源启动子例如包括(i)病毒启动子如SV40启动子(猿猴病毒40)，单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(TK-HSV-1)的启动子，Rous肉瘤病毒(RSV)的LTR，巨细胞病毒(CMV)的立即早期启动子和腺病毒主要晚期启动子(MLP)，以及(ii)在高等真核细胞中控制编码肽的基因转录的任何细胞启动子，如二磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的组成型启动子(Adra etal.，1987，Gene，60：65—74)，肝特异性α-1抗胰蛋白酶和FIX基因的启动子，及特异于平滑肌细胞的SM22启动子(Moessler et al.，1996，Development，122：2415—2425)。

根据本发明的一个实施方案，编码所述多蛋白NS3/NS4和所述多肽NS5b的核苷酸序列源自不同的基因型。

根据另一个实施方案，编码所述多蛋白和所述多肽的核苷酸序列源自相同基因型、优选基因型1b的病毒。

在这里“核苷酸序列”是指编码天然多蛋白NS3/NS4和天然多肽NS5b以及其如前所述的类似物、突变蛋白和同源物的所有序列。

所述表达载体中包含的所述序列可以在一个启动子和/或一个表达调节元件的控制下直接互连，或者它们是可以分离的，每个序列均依赖于独立地相同或不同的表达启动子和/或调节子。

适于本发明目的的表达载体可以是例如质粒、腺病毒型病毒载体、痘病毒、痘苗病毒、杆状病毒、沙门氏菌型细菌载体、BCG。

腺病毒已经在许多动物物种中检测到，其不整合并仅有轻微致病性。它们能感染各种类型的细胞，分化的细胞和静止期的细胞。它们对支气管上皮具有天然向性。另外，它们用作活的肠道疫苗已经有许多年，具有非常好的安全性。最后，它们可易于大量生长和纯化。这些特性意味着腺病毒特别适用作表达载体，特别是用作治疗目的的基因治疗载体及用作疫苗。

根据一个优选的实施方案，本发明的载体是腺病毒。

本发明使用的腺病毒实例可以衍生自人和动物的任何来源，特别是犬来源(例如CAV-1或CAV-2；分别参见Genbank CAV1GENOM和CAV77082)、禽来源(参见Genbank AAVEDSDNA)、牛来源(如BAV3，Seshidhar Reddy et al.，1998，J.Virol.，72：1394—1402)，绵羊、猫、猪来源，猿猴来源，或者源于它们的杂种。可以使用任何血清型。然而，优选人来源的腺病毒，特别是腺病毒5(AdIV)。

通常地，所述病毒得自ATCC，并且已经有许多关于其序列、其组构及其生物学的公开描述，使得本领域技术人员易于使用它们。例如，腺病毒5型的序列在Genbank数据库中描述(M73260和M29978)，在此并入参考。

腺病毒的基因组由大约36kb的双链线性DNA分子组成，携带终止病毒循环必需的大约30个以上的基因。主要的基因分成分散在腺病毒基因组中的4个区域(E1—E4)。E1、E2和E4区域是病毒复制必需的。基于观测到突变的病毒(天然缺失这个E3区域或者缺失这个E3区域的杂种病毒)在培养的细胞中与野生型病毒一样持续复制，认为E3区域是非必需区域(Kelly and Lewis，1973)，J.Virol.，12：643—652)。次要的基因(L1—L5)主要编码组成病毒壳体的结构蛋白。它们覆盖了至少部分第一链的转录单位并且是从一个启动子(主要晚期启动子，MLP)转录。另外，腺病毒基因组在其DNA复制必需的顺式作用区域的两个末端分别携带5’和3’反向末端重复(ITR)和一个包装序列。

目前基因治疗方案中使用的腺病毒是去除了大部分E1区域的腺病毒，这样使得病毒在其复制水平缺陷以避免其在环境和宿主生物体中传播。另外，大多数腺病毒也去除了E3区域以增加其克隆能力。在各种体内组织中已经证明了使用这些载体进行基因转移的可行性(见例如Yei et al.，1994，Hum.Gene Ther.，5：731—744；Dai etal.，1995，Proc.Natl.Acad Sci.USA，92：1401—1405；US6,099,831；及US6,013,638)。

优选地，在作为表达载体的腺病毒中使用的启动子是异源启动子如CMV和SV40启动子。

优选地，CMV启动子是多蛋白NS3/NS4的启动子，所述表达载体包含表达盒CMV-NS3-NS4作为编码所述多蛋白的核苷酸序列。

“表达盒”是指一种待被插入载体中的DNA序列，其含有一个启动子和一个表达感兴趣的肽的可读框。

优选地，SV40启动子是多肽NS5b的启动子，所述表达载体包含表达盒SV40-NS5b作为编码所述多肽的核苷酸序列。

根据本发明的一个实施方案，对腺病毒的基因组进行修饰以用表达盒CMV-NS3-NS4置换E1区域及用表达盒SV40-NS5b置换E3区域。

抑制方法及将DNA序列插入表达载体中的方法为本领域技术人员所熟知并特别由酶消化和连接步骤组成。

特别适合本发明目的的另一种表达载体是痘病毒，其组成了本发明的另一个实施方案。

痘病毒由一组有包膜复杂病毒组成，它们主要在独特形态学，大DNA基因组及胞质复制位点方面不同。对痘病毒科(poxviridae)的一些成员包括痘苗病毒(VV)的Copenhagen毒株(Goebel et al.，1990，Virol.179：247—266和517—563)和修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)毒株(Antoine et al.，1998，Virol.，244：635—396)的基因组已经作图并测序。VV毒株具有大约192kb的双链DNA基因组，编码大约200种蛋白质，所述蛋白质中有大约100种参与病毒的装配。MVA毒株是痘苗病毒的一种高度弱化的毒株，通过一系列痘苗病毒Ankara毒株(CVA)在鸡胚成纤维细胞中经过500次以上的传代而产生(Mayret al.，1975，Infection，3:6—16)。MVA病毒保藏在Collection Nationalede Cultures de Microorganismes(CNCM)，保藏号I-721。确定MVA基因组的完整序列并与VV的序列对比使得可以精确鉴别在病毒基因组中出现的改变及界定7个缺失(I—VII)和导致可读框片段化的众多突变(Antoine et al.，1998，Virology，244：365—396)。

适于本发明目的的痘病毒的其它实例包括鸭痘病毒、禽痘病毒、牛痘病毒、昆虫痘病毒、猴痘病毒、猪痘病毒和企鹅痘病毒。

发现痘病毒有两种独特的形态形式，称为胞内成熟病毒(IMV)和有包膜胞外病毒(EEV)。

用作本发明的表达载体的痘病毒单独或组合地具有至少一种如下特性：

(i)所述痘病毒是一种MVA病毒；

(ii)所述痘病毒是IMV形态形式；和

(iii)所述痘病毒的基因组被修饰以插入表达盒NS3/NS4及插入表达盒NS5b。

当对痘病毒的基因组进行修饰以插入两个感兴趣的表达盒时，这两个表达盒的表达必需的工具是同源的。因此，在使用MVA病毒的情况中，NS3/NS4的表达可例如是在启动子ph5r的控制下从而相应的表达盒是ph5r-NS3-NS4，NS5b的表达可例如在启动子p7.5的控制下从而相应的表达盒是p7.5-NS5b，反之亦然。

根据本发明的一个特殊的实施方案，当对痘病毒的基因组加以修饰以插入感兴趣的两个表达盒时，所述两个表达盒方向相同。

根据另一个特殊的实施方案，所述两个表达盒方向相反。

同样，所述表达盒以本领域技术人员已知的方式插入痘病毒的基因组中，如前所述。

本发明的载体也可包含将肽靶向特殊的细胞区室必需的序列。所述靶向例如可以是使用源自腺病毒E3蛋白的前导序列类型的寻址序列而靶向内质网(Ciernik I.E，et al.，The Journal of Immunology，1999，162，3915—3925)。

本发明的载体也可以包含靶向树突细胞及靶向细胞膜所必需的序列。

本发明的另一个目的是提供由本发明的表达载体转化的微生物和真核细胞。

适于本发明的微生物例如可以是酵母，例如优选的是如下的酵母：糖酵母(Saccharomyces)，Schizosaccharomyces，Kluveromyces，毕赤氏酵母(Pichia)，Hanseluna，Yarrowia，Schwantomyces，Zygosaccharomyces，啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Saccharomyces carlsbergensis和Kluveromyces lactis；可以是细菌，如大肠杆菌及如下的细菌：乳杆菌(Lactobacillus)，乳球菌(Lactococcus)，沙门氏菌(Salmonella)，链球菌(Streptococcus)，芽孢杆菌(Bacillus)和链霉菌(Streptomyces)。

真核细胞例如可以是源自动物如哺乳动物、爬行动物、昆虫及等价物的细胞。优选的真核细胞源自中国仓鼠(CHO细胞)、猴(COS和Vero细胞)、幼仓鼠肾(BHK细胞)、猪肾(PK15细胞)和兔肾(RK13细胞)、人骨肉瘤细胞系(143B)、HeLa人细胞系和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2型细胞)以及昆虫细胞系(例如Spodopterafrugiperda)。

所述宿主细胞可以以悬浮或培养瓶培养物、组织培养物、器官培养物及等价的培养物形式提供。所述宿主细胞也可以是转基因动物。

本发明还涉及抗本发明的肽组合物之一的抗体或者抗本发明的表达载体之一的抗体。

本发明的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

上述单克隆抗体的获得可以通过用本发明的肽组合物或本发明的载体作为“感兴趣的抗原”对动物进行免疫，随后回收纯化形式的抗体，纯化的抗体的回收是通过取样所述动物血清并且将所述抗体从血清的其它成分中分离，特别是在固定了由所述抗体特异性识别的抗原特别是感兴趣的病毒抗原的亲和层析柱上通过亲和层析而分离。

所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术获得，杂交瘤技术的一般原理如下复述。

第一步，将动物，一般是小鼠，(或者在体外免疫构架内培养的细胞)用本发明的肽组合物或者本发明的载体作为“感兴趣的抗原”进行免疫，然后动物的B淋巴细胞可以产生抗所述抗原的抗体。随后将这些产生抗体的淋巴细胞与“无限增殖的”骨髓瘤细胞(在实施例中为鼠骨髓瘤细胞)融合以产生杂交瘤。从由此获得的细胞异质混合物中，选择能产生特定抗体并无限增殖的细胞。每个杂交瘤均以克隆形式增殖，导致单克隆抗体产生，其对感兴趣的抗原的识别性质可以通过例如ELISA、一或二维免疫转移、免疫荧光或者使用biocapteur进行测试。由此选择的单克隆抗体随后特别通过上述亲和层析技术纯化。

本发明的肽组合物、表达载体、编码所述多蛋白NS3/NS4和所述多肽NS5b的核苷酸序列以及本发明的抗体对于抑制、预防和控制携带HCV病毒的患者的感染是特别有效的，由此它们制备药物的用途是本发明的另一个目的。

本发明还涉及一种药物组合物，特别是疫苗，其含有作为活性成分的本发明肽组合物、或本发明的表达载体、或包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体、或者包含编码所述多蛋白NS3/NS4和所述多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列相应于本发明的表达载体中包含的序列，置于肽的组成型表达和/或诱导型表达必需的元件控制下，或者至少一种本发明抗体。

肽的组成型表达必需的元件是指遍在启动子或特异于真核细胞的启动子。

肽的诱导型表达必需的元件可以是调节大肠杆菌四环素抗性操纵子的元件(Gossen M.et al.，Proc.Natl.Acad Sci USA，89：5547—5551(1992))。

根据本发明的一个特殊的实施方案，所述药物组合物还含有一种药物学合适的运载体。当然，本领域技术人员易于确定所述药物学合适的运载体的性质和多肽的数量，与药物组合物成分成比例。

所述药物学合适的运载体的数量和性质可易于被本领域技术人员确定。根据希望的药物形式和给予方法选择合适的药物运载体。

本发明的药物组合物适于经口、舌下、皮下、肌内、静脉内、局部、local、气管内、鼻内、经皮、直肠、眼内、耳内途径给予，所述活性成分以单位剂量形式给予。

给予的单位剂量形式可例如是片剂，明胶胶囊，颗粒，粉末，溶液，可注射的口服悬浮液，经皮贴剂，舌下、颊、气管内、眼内、鼻内、耳内剂型，或者吸入给药，局部、经皮、皮下、肌内或静脉内给药剂型，直肠给药剂型，或者植入体剂型。对于局部给药，可以是乳液、凝胶、软膏、洗剂或栓剂剂型。

这些剂型根据本领域常用方法制备。

所述单位剂量是根据剂型每日给予0.001—10mg活性成分/kg体重的剂量。

在特殊情况中可以给予更高或更低的剂量，本发明的范围是不超出这种剂量。根据使用实践，给予每个患者的合适剂量由医生根据给药方法、患者的体重和反应而确定。

根据本发明的另一个实施方案，本发明还涉及治疗与丙型肝炎病毒相关的病变的方法，包括给予患者有效量的本发明的药物。

本发明的药物组合物优选含有作为活性成分的本发明的载体之一或者包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体，由此用于预防和治疗性接种。

预防和治疗性接种可以通过注射基于本发明的一或多种表达载体的疫苗而进行，其程度是所述表达载体最终编码多蛋白NS3/NS4及编码多肽NS5b作为活性成分，所述注射随后进行加强或不加强免疫接种。也可以通过同时或在不同时间注射两种不同类型的本发明的表达载体而进行免疫接种，先注射腺病毒，随后注射痘病毒，反之亦然。

这些载体可以包含在一个药盒内。

本发明的另一个目的是提供药盒，特别是疫苗盒，其包括至少一种包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体及至少一种包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体。

本发明的另一目的是提供了药物盒，特别是疫苗盒，其包含至少一种如前述腺病毒类型的表达载体和/或至少一种如前述痘病毒类型的表达载体。

预防性和治疗性接种也可以通过注射一种疫苗而进行，所述疫苗基于至少一种本发明的表达载体，或者包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体，及至少一种由本发明的肽组合物或者本发明的抗体组成的本发明的药物组合物。也可以通过注射一种疫苗而进行，所述疫苗基于至少一种本发明的表达载体，或者包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体，及包含至少一个编码多蛋白NS3/NS4和编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体。

本发明的另一个目的是提供了药物盒，特别是疫苗盒，其包含至少一种本发明的表达载体，或者包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体，及至少一种本发明的药物组合物或者至少一种编码多蛋白NS3/NS4和编码多肽NS5b的核苷酸序列。

本发明通过如下实施例得以更好理解，所述实施例只是例证本发明而无限制之意。附图简述如下：

图1A—1K代表用于获得腺病毒AdNS3NS4NS5b的不同质粒的图谱，图中表明了不同限制酶的位点及编码NS3/NS4和编码NS5b的序列片段的位置。

图2A—2H代表用于获得痘病毒MAV NS3NS4NS5b的不同质粒的图谱，图中表明了不同限制酶的位点及编码NS3/NS4和编码NS5b的序列片段的位置。

图3示出了根据CTL测试(图3A)和ELISPOT测试(图3B)获得的腺病毒AdNS3NS4诱导的细胞应答，在CTL测试中表位GLL用于刺激培养的脾细胞并荷载CTL靶，结果以作为效应子/靶比率的函数的特异性溶解百分率表示，ELISPOT测试特异于靶GLL，结果以斑点数/106个细胞表示。

图4示出ELISPOT测试中腺病毒AdNS5b诱导的特异于表位ALY和KLP的细胞应答。

图5示出CTL测试中腺病毒AdCE1E2诱导的细胞应答，其中表位DLM用于刺激培养的脾细胞并用于荷载CTL靶，结果以作为效应子/靶比率的函数的特异性溶解百分率表示。

图6示出得自用腺病毒的不同组合免疫接种的4组(每组8只)小鼠的试验的重组痘苗病毒的效价，以pfu/ml/mg卵巢表示，所用腺病毒组合为：AdNS3NS4+AdNS5b(第1组)，腺病毒AdNS3NS4+AdNS5b+AdNS5a(第2组)，腺病毒AdNS3NS4+AdNS5b+AdCE1E2(第3组)及腺病毒AdβGal(第4组)。

图7示出得自用腺病毒的不同组合免疫接种的3组(每组8只)小鼠的试验的重组痘苗病毒的效价，以pfu/ml/mg卵巢表示，所用腺病毒组合为：AdNS3NS4NS5b(第1组)，AdNS3NS4+AdNS5b(第2组)，及AdβGal(第3组)。

实施例1：本发明的表达蛋白质NS3/NS4和NS5b的腺病毒的制备

1.腺病毒

在经Pacl对基因组线性化后通过互补细胞系293(Graham，Smiley，et al.1997)的转染(CaPO₃)而产生重组腺病毒。在此同一细胞系上增殖并扩增所述重组病毒，并从感染的细胞中纯化重组病毒。细胞通过离心(1500rpm，10分钟)回收并通过3次冷冻/解冻循环而溶解。将细胞溶解物通过两次离心澄清(2000rpm，10分钟；8000rpm，15分钟)，然后通过两次连续的超离心而纯化。第1次超离心在氯化铯梯度(密度为1.4和1.25)上以30000rpm进行1小时。第2次在氯化铯梯度(密度为1.34)上以35000rpm进行18小时。取出含有病毒粒的相并在60％蔗糖缓冲液中1:1稀释，然后将病毒悬浮液对配制缓冲液(10升中含：3423g蔗糖，12.11g Tris，2.033g MgCl₂，87.7g NaCl)透析，然后分成等份。在用不同的病毒稀释液感染的并由特异于腺病毒DNA结合蛋白(α72K B6-8)的抗体标记(Rein，Sarnow，et al.1983)的293细胞上通过间接免疫荧光进行滴定。

2.腺病毒AdNS3NS4的制备

这种腺病毒使得编码多蛋白NS3/NS4(SEQ ID NO:1和2)的基因在CMV启动子的控制下表达。

2.1编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的PCR扩增

为进行扩增，使用如下寡核苷酸序列：

oIV166：5’-GGG GGG GCT ATG GCG CCT ATC ACG GCCTA-3’(SEQ ID NO:9)

oIV171：5’-GGG GGG ACG CGT TTA GCA TGG CGT GGA GCAGCA GT-3’(SEQ ID NO:10)

以及使用如下试剂：

Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl₂ 1.5mM及dNTP 10mM(Invitrogen)。

PCR条件如下：

5分钟，94℃，然后

30个循环：94℃、45秒；62℃、45秒；72℃、1分钟，然后72℃、10分钟。

2.2 PCR片段NS3/NS4插入转移质粒pTG13387中

进行如下步骤：

—用NheI/MluI(NheI，于React 4 Buffer中，Invitrogen；Mlul，于React 3Buffer中，Invitrogen)对质粒pTG13387进行酶解消化；

—用NheI/MluI对片段NS3/NS4进行酶解消化；

—连接(在反应缓冲液(Invitrogen)中通过T4DNA连接酶(Invitrogen)连接)；

—细菌转化(菌株5K，Transgene)

—在LB培养基(Difco)+氨苄青霉素(100μg/ml，Duchefa)上选择细菌克隆；

—在限制分析后进行阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen，根据厂商指导进行)；

—限制分析：用SmaI(于React4Buffer中，Invitrogen)消化，获得5450、2164、909、214和180bp的片段；

—获得缺失E1区域并含有在CMV启动子控制下的序列NS3/NS4的质粒pIV315(图1B)。

2.3 与质粒DTG6624中包含的缺失E3区域的完整腺病毒基因组的同源重组

进行如下步骤：

—用PacI/PvuI对上述获得的质粒pIV315进行酶解消化(于NEB1缓冲液中的PacI，Biolabs；PvuI，于React7Buffer中，Invitrogen)；在琼脂糖凝胶上分离含有表达盒pCMV-NS3-NS4的片段；

—用ClaI(于React1Buffer中，Invitrogen)对质粒pTG6624(图1C)进行酶解消化；

—细菌转化(菌株BJ，Transgene)以进行两个质粒片段之间的同源重组；

—在LB培养基+氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—限制分析：用SmaI消化，获得2263、621、3814、214、2164、909、180、2463、6480、1398、4456、1455、3540、3386、230和3685bp的片段；

—获得缺失E3和E1区域的完整腺病毒基因组腺病毒AdNS3NS4，E1区域由表达盒pcMV-NS3-NS4(pIV317，图1D)置换。

3.腺病毒AdNS3NS4NS5b的制备

这种腺病毒使得编码多蛋白NS3/NS4的基因在CMV控制下表达，及使得编码多肽NS5b的基因在SV40启动子的控制下表达。

3.1构建转移质粒使得在CMV启动子控制下的编码序列克隆在腺病毒E3区域中

进行如下步骤：

—用BglII(于React 3 Buffer中，Invitrogen)对质粒pTG4664(图1E，Transgene)进行酶解消化；

—用BamHI/BglII(于React 3 Buffer中，Invitrogen)对质粒pTG3074(图1F，Transgene)进行酶解消化；

—连接(T4DNA连接酶)，细菌转化(菌株5K)；

—在LB培养基+氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析后进行阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen)；

—限制分析：用SmaI消化，获得4940、1305和230bp的片段；

—获得质粒pIV267(图1G)；

—用ClaI/MunI(于React 1 Buffer中，Invitrogen)对由此获得的质粒pIV267进行消化；

—通过DNA聚合酶大(Klenow)片段(于React 2 Buffer中，Invitrogen)处理；

—连接(T4DNA连接酶)；

—细菌转化(菌株5K)；

—在LB培养基+氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—质粒大量制备(Qiagen)；

—限制分析：用SmaI消化，获得4692、1305和230bp的片段；

—获得质粒pIV270，其为使得在CMV启动子控制下的编码序列克隆在腺病毒的E3区域中的转移质粒(图1H)。

3.2 在pIV270中用SV40启动子置换CMV启动子

进行如下步骤：

—使用如下寡核苷酸从商购质粒pcDNAHygro(Clonetech)PCR扩增相应于SV40启动子的核苷酸片段：

oIV232：5’-GGG GGG AGA TCT CCA GCA GGC AGA AGTATG-3’(SEQ ID NO:11)

oIV233：5’-GGG GGG GTC GAC CGA AAA TGG ATA TAC AAGCTC-3’(SEQ ID NO:12)

根据上述2.1的程序进行PCR，除了使用58℃温度代替62℃；

—用BglII/SalI(于React 10 Buffer中，Invitrogen)对质粒pIV270进行酶解消化；

—用BglII/SalI对PCR片段进行酶解消化

—连接(T4DNA连接酶)，细菌转化(菌株5K)；

—在LB培养基+氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析后进行阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen)；

—限制分析：用SmaI消化，获得4692、719、80和230bp的片段；

—获得质粒pIV330，其为使得在SV40启动子控制下的编码序列克隆在腺病毒的E3区域中的转移质粒(图11)。

3.3：将PCR片段NS5b插入转移质粒pIV330中

进行如下步骤：

—使用如下寡核苷酸对编码蛋白质NS5b(SEQ ID NO:3和4)的核苷酸序列进行PCR扩增

oIV212:5’-GGG GGG TCT AGA ATG TCA ATG TCC TAC ACATGG AC-3’(SEQ ID NO:13)

oIV218:5’-GGG GGG TCT AGA TTA CCG GTT GGG GAG CAGGT-3’(SEQ ID NO:14)

根据上述2.1的程序进行PCR，除了用温度60℃代替62℃；

—用XbaI(于React 2 Buffer中，Invitrogen)对质粒pIV330进行酶解消化；

—用XbaI对PCR片段进行酶解消化

—连接(T4DNA连接酶)，细菌转化(菌株5K)；

—在LB培养基+氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析后进行阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen)；

—限制分析：用SmaI消化，获得4692、1505、760、719和230bp的片段；

—获得质粒pIV336，其为E3缺失中含有在SV40启动子控制下的序列NS5b的转移质粒(图1J)。

3.4：于重组腺病毒基因组pIV317同源重组以获得腺病毒 AdNS3NS4NS5b

进行如下步骤：

—用SrfI(于Universal缓冲液中，Stratagene)对上述2.3中获得的质粒pIV317进行消化；

—用NheI/SaclI(于缓冲液T中，Amersham Pharmacia Biotech)对上述3.3中获得的质粒pIV336进行消化，并在琼脂糖凝胶上分离含有表达盒pSV40-NS5b的片段；

—细菌转化(菌株BJ)以进行两个质粒片段之间的同源重组；

—在LB培养基+氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析后进行阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen)；

—限制分析：用SmaI消化，获得6480、4456、3814、3540、3386、2739、2463、2263、2164、1455、1398、1105、909、760、719、621、230、214和180bp的片段；

—获得希望的完整腺病毒基因组，其缺失E1区域，E1区域由表达盒pcMV-NS3-NS4置换，其缺失E3区域，E3区域由表达盒pSV40-NS5b置换(质粒pIV342，图1K)。

4：证实插入不同腺病毒中的抗原的表达

由腺病毒AdNS3NS4，AdNS5b和AdNS3NS4NS5b编码的HCV抗原的表达在感染Huh7细胞后通过Western印迹证实。

正如所预期的，所有抗原均表达。

实施例2：本发明的表达蛋白质NS3/NS4和NS5b的痘病毒的制备

1.MVA痘病毒

修饰的病毒Ankara MVATG N33毒株由TRANSGENE S.A.(Strasbourg，France)提供。

2.使得基因NS3/NS4在ph5r启动子控制下表达的转移质粒的制备

2.1 pIV250载体的构建，其含有MVA的重组臂BRG2和BRD2、在启动子ph5r(MVA)控制下的选择基因GPT、以及随后的第二个启动子ph5r以使得感兴趣的基因表达

为此目的，将片段ph5r-GPT-BRG3-ph5r(源自质粒pTG9997，Transgene)插入含有重组臂BRG2和BRD2的质粒pTG6018(Transgene)中。

为此，进行如下步骤：

—用BamHI/SalI(于React 2 Buffer中，Invitrogen)对载体pTG6018(图2A)进行酶解消化；

—用BamHI消化质粒pTG9997，随后用SalI部分消化质粒pTG9997(图2B)；

—根据QIAGEN方案纯化含有编码ph5r-GPT-BRG3-ph5r的序列的1047bp的限制片段；

—连接(T4DNA连接酶)，细菌转化(菌株TG1，Statagene)；

—在氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析(EcoRV+HindIII(于React2Buffer中，Invitrogen)：246、439、476、826和2789bp的片段；SacI：915和3861bp的片段)后进行阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen)；

—获得目的质粒(pIV250，图2C)。

2.2 编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的PCR扩增

使用如下寡核苷酸：

oIV225:5’-GGG GGG CTG CAG ATG GCG CCT ATC ACG GCCTA-3’(SEQ ID NO:15)

oIV226:5’-GGG GGG TCT AGA TTA GCA TGG CGT GGA GCAGT-3’(SEQ ID NO:16)

根据实施例1的第2.1点所述程序进行扩增，除了用52℃代替62℃。

2.3 NS3-NS4的PCR片段插入质粒pIV250中

为此，进行如下步骤：

—用PstI(于React 2 Buffer中，Invitrogen)/XbaI对在上述2.1中获得的质粒pIV250进行酶解消化；

—用PstI/XbaI对PCR片段NS3/NS4进行酶解消化；

—连接(T4DNA连接酶)，细菌转化(菌株TG1)；

—在氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析(HindIII(于React 2 Buffer中，Invitrogen)：4763和2789bp的片段；SphI(于React 6 Buffer中，Invitrogen)：1534和5991bp的片段；NcoI(于React 3 Buffer中，Invitrogen)：2764和4761bp的片段)后进行阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen)；

—获得含有在启动子ph5r控制下的编码多蛋白NS3/NS4的序列的转移质粒(pIV327，图2D)。

3.在D7.5启动子控制下使得蛋白质NS5b表达的质粒pIV328 的制备

3.1 编码蛋白质NS5b的核苷酸序列的PCR扩增

使用如下寡核苷酸：

oIV227：5’-GGG GGG GTC GAC ATG TCA ATG TCC TAC ACA TGGAC-3’(SEQ ID NO:17)

oIV228：5’-GGG GGG GCA TGC TTA CCG GTT GGG GAG CAGGT-3’(SEQ ID NO:17)

3.2获得质粒

进行如下步骤：

—用SalI/SphI对编码NS5b的PCR片段进行酶解消化；

—用SalI/SphI对pTG186(图2E，Transgene)进行酶解消化；

—载体pTG186的去磷酸化(ROCHE碱性磷酸酶)；

—连接(T4DNA连接酶)，细菌转化(菌株TG1)；

—在氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析后进行阳性克隆的质粒大量制备：(HindIII：1984、2627和4437bp的片段；BglII：321、557、1361、1451、2237和3121bp的片段；KpnI(于React 4 Buffer中，Invitrogen)：2787和6261bp的片段)；

—获得含有在p7.5启动子控制下的编码多肽NS5b的序列的转移质粒(pIV328，图2F)。

4.制备转移质粒pIV329和pIV344，使得编码多蛋白NS3/NS4 的基因在ph5r启动子的控制下表达及编码多蛋白NS3/NS4的基因在 p7.5启动子控制下表达

为此，进行如下步骤：

—使用如下寡核苷酸从上述3.2中获得的质粒pIV328中对编码蛋白质NS5b的核苷酸序列进行PCR扩增：

oIV229:5’-GGG GGG TCT AGA CCG GTA GTT CGC ATA TACATA-3’(SEQ ID NO:19)

oIV218:5’-GGG GGG TCT AGA TTA CCG GTT GGG GAG CAGGT-3’(SEQ ID NO:14)

根据实施例1的第2.1点所述程序进行PCR，除了用52℃代替62℃。

—用XbaI对PCR片段进行酶解消化；

—用XbaI对上述2.3中获得的质粒pIV327进行酶解消化；

—连接(T4DNA连接酶)，细菌转化(菌株TG1)；

—在氨苄青霉素(100μg/ml)上选择细菌克隆；

—在限制分析(PstI：pIV329：3033和6466bp的片段，pIV344：4641和4858bp的片段；ApaI(于React4Buffer中，Invitrogen)：pIV329：454、960和8085bp的片段，pIV344：454、1418和7627bp的片段；NcoI：pIV329：4269、469和4761bp的片段，pIV344：3053、1685和4761bp的片段；SmaI：pIV329：214、2164、1444和5677bp的片段，pIV344：214、2164、928和6193bp的片段)后进行2个阳性克隆的质粒大量制备(Qiagen)；

—获得这样的转移质粒，其使得多蛋白NS3/NS4在ph5r启动子控制下表达及蛋白质NS5b在p7.5启动子控制下表达，两个表达盒方向相同(pIV329，图2G)，或者获得这样的转移质粒，其使得多蛋白NS3/NS4在ph5r启动子控制下表达及蛋白质NS5b在p7.5启动子控制下表达，两个表达盒方向相反(pIV344，图2H)。

5.证实插入不同痘病毒中的抗原的表达

通过Western印迹证实，在用相关痘病毒感染Huh7细胞后，含有编码多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的序列的痘病毒pIV329和pIV344表达所述HCV抗原。

实施例3：证实NS3/NS4和NS5b组合的免疫原性

1.小鼠的免疫

将HLA-A2.1转基因小鼠通过肌内注射选自如下的至少一种腺病毒免疫一次：

—实施例1(第2.3点)中制备的AdNS3NS4

—实施例1(第3.3点)中制备的AdNS5

—根据实施例1的第2点制备的AdNS5a，例外之处是使用如下引物扩增编码多肽NS5a的核苷酸序列(SEQ ID NO:5和6)：

oIV172：5’-GGG GGG GGT ACC ATG TCC GGC TCG TGG CTAAGG-3’(SEQ ID NO:20)

oIV173：5’-GGG GGG TCT AGA TTA GCA GCA GAC GAT GTCGTC-3’(SEQ ID NO:21)

在PCR中，62℃温度用56℃代替，用KpnI/XbaI酶解消化pTG13387和片段NS5a，SmaI消化pTG13387的限制性分析产生180和7251bp的片段，SmaI对pTG6624的消化产生2263、621、5615、180、2463、6480、1398、4456、1455、3540、3386、230和3685bp的片段；

—根据实施例1的第2点制备的AdCE1E2，例外之处是使用如下引物扩增编码核心-E1-E2多蛋白(也称作CE1E2)的核苷酸序列(SEQ ID NO:7和8)：

oIV62：5’-GGG GGG GCT AGC ATG AGC ACA AAT CCT AAACCT-3’(SEQ ID NO:22)

oIV68：5’-GGG GGG TCT AGA TCA GGC CTC AGC CTG GGCTAT-3’(SEQ ID NO:23)

在PCR中，温度62℃用56℃代替，用NheI/XbaI酶解消化pTG13387和片段CE1E2，SmaI消化pTG13387的限制性分析产生163、435、2270、180和5254bp的片段，SmaI对pTG6624的消化产生2263、621、3618、163、435、2270、180、2463、6480、1398、4456、1455、3540、3386、230和3685bp的片段；

—在实施例1(第3点)中制备的AdNS3NS4NS5b；及

—AdβGal(Transgene)

根据如下方案进行免疫：

—10⁹pfu的AdNS3NS4，或者

—10⁹pfu的AdNS5b，或者

—10⁹pfu的AdCE1E2，或者

—10⁹pfu的AdNS3NS4和10⁹pfu的AdNS5b，或者

—10⁹pfu的AdNS3NS4，10⁹pfu的AdNS5b和10⁹pfu的AdNS5a，

—10⁹pfu的AdNS3NS4，10⁹pfu的AdNS5b和10⁹pfu的AdCE1E2，

—10⁹pfu的AdNS3NS4 NS5b，或者

—10⁹pfu的Adβ-Gal作为对照。

在免疫之前，用于免疫的不同腺病毒对HCV和β-Gal抗原的表达通过Western印迹证实。

2.CTL和ELISPOT试验

在注射15天后，细胞应答通过分离小鼠脾细胞并进行如下CTL和ELISPOT试验而分析。

为进行CTL试验，将脾细胞在存在如下物质的24孔平板上培养5天：

—在脾细胞源自接受AdNS3NS4的小鼠的情况中，5μM表位GLL(GLLGCIITSL，SEQ ID NO:24)；在脾细胞源自接受AdNS5b的小鼠的情况中，5μM表位ALY(ALYDVVSTL，SEQ ID NO:25)或者5μM表位KLQ(KLQDCTMLV，SEQ ID NO:26)；或者在脾细胞源自接受AdCE1E2的小鼠的情况中，5μM表位DLM(DLMGYIPLV，SEQ ID NO:27)，所述这些表位是合成肽形式(Eurogentex)，和

—10U鼠重组白细胞介素2(Brinster et al.，Hepatology 2001)/mlα极限必需培养基(αMEM)。在第5天，进行再刺激，包括在存在所述表位的情况下向培养的脾细胞中加入未免疫原初(

)小鼠脾细胞，培养2天。在第7天，进行CTL试验，包括将培养7天后的免疫小鼠的脾细胞(效应细胞)与荷载10μM所述表位并用Cr⁵¹标记的EL4 S3-Rob HDD细胞(靶细胞)接触。效应细胞的特异性细胞毒性活性在与靶细胞一起保温4小时后使用γ-Cobra II计数装置(Packard，Rungis，France)测定靶细胞溶解后释放的Cr⁵¹而确定。确定来自只含有培养基或者细胞溶解缓冲液(HCI IN)的孔中的最大自发释放。细胞毒性的特异性百分比如下式计算：

(测试中的释放—自发释放)/(最大释放—自发释放)×100。表位特异性溶解通过在有或无所述表位的情况中获得的特异性溶解百分比之差而确定。

通过将脾细胞在预先用抗干扰素γ抗体(IFNγ)(10μg/ml)包被的Multiscreen 96孔平板(Millipore)中培养48小时进行ELISPOT试验。将脾细胞如上述在存在10μM合适表位和10U鼠重组白细胞介素2/mlαMEM的情况下培养。为进行阳性对照，将脾细胞在伴刀豆球蛋白A(5μg/ml)存在下培养。为进行阴性对照，将脾细胞在存在序列为DLMGYIPLV的属于HCV的衣壳蛋白的非特异性肽(也称为无关肽)的情况下培养，或者在没有表位的培养基中培养。将孔用0.05％的PBS-Tween洗涤3次，随后用PBS洗涤3次，然后与生物素酰化的小鼠抗IFNγ抗体一起保温2小时。洗涤后，将孔与链亲和素-辣根过氧化物酶缀合物一起保温1小时，通过AEC(氨乙基咔唑)底物的降解显示酶活性。使用Zeiss ELISpot读数器(Zeiss显微镜与KS-ELISpot软件联合使用)计数获得的斑点。

结果示于图3—5，其中M相当于小鼠，Neg.小鼠相当于对照小鼠。

这些结果表明：

—通过检测特异于NS3中包含的表位GLL的T淋巴细胞，表明AdNS3NS4明显诱导特异于表达的抗原的细胞介导的应答，如图3A和3B所例证。

—通过检测特异于NS5b中包含的表位ALY和KLQ的T淋巴细胞，表明AdNS5b明显诱导特异于表达的抗原的细胞介导的应答，如图4所例证。

一通过检测特异于核心蛋白中包含的表位DLM的T淋巴细胞，表明AdCE1E2明显诱导特异于表达的抗原的细胞介导的应答，如图5所例证。

3.使用重组痘苗病毒进行体内试验

为了评价由不同的腺病毒诱导的特异性免疫应答是否能诱导对抗感染性疾病的保护作用(体内保护作用)，对接种的小鼠进行试验。

小鼠不可由HCV直接感染，为了将特异性免疫应答的诱导与感染抗性联系起来，使用编码HCV的非结构蛋白(NS2—NS5b)的重组痘苗病毒(WR毒株)进行这一试验。在为小鼠腹膜内注射107pfu重组痘苗病毒之后，该病毒在小鼠中复制。该病毒的复制诱导特异于痘苗病毒抗原及特异于HCV抗原的免疫应答，因为其也表达HCV的NS蛋白。这种对HCV抗原的特异性应答是更有效和更强的，因为小鼠已经接受了表达HCV抗原的疫苗。换句话说，免疫接种(在本例中用重组腺病毒接种)越有效(即小鼠的免疫系统由所述疫苗有效引发)，则在重组痘苗病毒试验之后产生的抗HCV应答越强，因此小鼠更被保护而抗此试验。实际上，在小鼠中残余痘苗病毒计数越低，则由于接种所致的保护或中和作用更有效。

痘苗病毒的中和作用反映了由HCV蛋白诱导的细胞应答及由痘苗病毒蛋白诱导的细胞应答。所述中和作用如下通过动物卵巢中残余痘苗病毒的效价而评价：在试验后4天切下卵巢，超声处理，冷冻/解冻3次然后离心，将连续稀释的上清根据溶解噬斑技术(Murara etal.，PNAS，vol.100，p6753—6758)在Hutk细胞上滴定。病毒效价以pfu/ml/mg卵巢确定。

4.证实多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的组合接种的优异保护作用

疫苗的重组病毒效价在由如下腺病毒组合免疫的4组(每组8只)小鼠中确定：AdNS3NS4+AdNS5b(第1组)，AdNS3NS4+AdNS5b+AdNS5a(第2组)，AdNS3NS4+AdNS5b+AdCE1E2(第3组)，AdβGal(第4组)。

图6所示结果是基于Wilcoxon Mann-Whitney无参数检验(non-parametric test，Methodes Statistique a lusage des medecins et desbiologistes，Collection Statistique en Biologie et en Medecine，Flammarion Medecine Sciences，(D.Schwarz)，1997)进行统计学处理获得的，所述检验基于对比平均值，并使得可以对比两个独立样品x和y的值。

这个检验如下执行：将对比的x和y两组的所有值以递增方式分类。然后对每个值分阶，并计算阶总和。然后获得Wx和Wy。然后计算称为(Wx)t的参考值(无效假设中的理论值，其中Wx与Wy无不同)，并与n(N+1)/2比值相联系，其中n＝组x中测试的小鼠数，N＝组x和y中测试的小鼠数。

如果Wx低于(Wx)_t(小鼠中痘苗病毒残余水平低)，则可以推断得自接种的中和作用显著有效。

如果以AdNS3NS4NS5b组为x与AdβGal组为y进行对比，获得如下值：

Wx＝1+2+4+6+8+11+13+14＝59(8只测试被小鼠)

Wy＝3+5+7+9+10+12+15+16＝77(8只测试被小鼠)

在无效假设中，Wx与Wy无不同，期望值是(Wx)_t＝(1/2)*8*17＝68。

Wx<(Wx)_t，表示AdNS3NS4NSSb组中获得的值小于AdβGal组中获得的值，得自接种的中和作用显著有效。

其它各组小鼠的统计学值在下表1中表示。

表1

组/AdβGal	Wx	(Wx)<sub>t</sub>
组/AdβGal	Wx	(Wx)<sub>t</sub>	AdNS3NS4+NS5b	52	68
AdNS3NS4+NS5b+NS5a	68	68	AdNS3NS4+NS5b	52	68
AdNS3NS4+NS5b+NS5a	68	68	AdNS3NS4+NS5b+CE1E2	74	68

上表1所示值示出只有腺病毒NS3NS4和腺病毒NS5b组合接种的小鼠与AdβGal接种的对照小鼠相比能诱导对试验中使用的痘苗病毒复制的明显中和作用。使用(AdNS3NS4+NS5b+NS5a)或(AdNS3NS4+NS5b+CE1E2)组合与AdβGal免疫的对照小鼠相比不产生显著差异。

这些结果因此可表明多蛋白NS3NS4与多肽NS5b的组合接种产生的优异保护作用。

5.证实由同一载体共同表达的多蛋白NS3NS4和多肽NS5b的组合接种的保护作用

确定由如下腺病毒组合免疫的3组(每组8只)小鼠的重组痘苗病毒效价：AdNS3NS4AdNS5b(第1组)，AdNS3NS4+AdNS5b(第2组)，AdβGal(第3组)。

图7所示结果是基于前述实验中描述的Wilcoxon Mann-Whiteney无参数检验进行统计学处理获得的。

1组和2组与对照组AdβGal对比的统计学值示于下表2。

表2

组/AdβGal	Wx	(Wx)<sub>t</sub>
组/AdβGal	Wx	(Wx)<sub>t</sub>	AdNS3NS4NS5b	49	68
AdNS3NS4+NS5b	53	68	AdNS3NS4NS5b	49	68

表2所示数值示出用同时编码三种抗原NS3、NS4和NS5b的腺病毒接种的小鼠与接种腺病毒NS3NS4和腺病毒NS5b的组合一样，与AdenoβGal接种的对照小鼠相比能诱导对试验中使用的痘苗病毒复制的显著中和作用。这个结果证实由同一载体共同表达的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的组合接种的保护作用。

序列表

<110>特兰斯吉恩股份有限公司

国家健康与医学研究院

<120>包含HCV的多蛋白NS3/NS4和多肽NS5b的组合物，包括相应核酸序列的表达载体及它们的治疗应用

<130>ADENOVIR

<160>27

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2844

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>sequence coding for NS3NS4

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<223>sequence coding for NS3NS4

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<213>Artificial sequence

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<221>CDS

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<400>3

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<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

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<212>DNA

<213>Artificialse quence

<220>

<223>sequence codingfor NS5a

<220>

<221>CDS

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<223>

<400>5

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<212>PRT

<213>Artificialse quence

<220>

<223>sequence coding for NS5a

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<213>Artificial sequence

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<223>sequence coding for CE1E2

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<223>

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<213>Artificial se quence

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<211>30

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<211>33

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<213>Artificial sequence

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<213>Artificial sequence

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<213>Artificial sequence

<220>

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<213>Artificial sequence

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<213>Artificial sequence

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<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

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<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

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<400>20

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<212>DNA

<213>Artificial sequence

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<211>33

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<213>Artificial sequence

<220>

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<211>33

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<213>Artificial sequence

<220>

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<212>PRT

<213>Artificial sequence

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<223>epitope GLL

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<212>PRT

<213>Artificial sequence

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<223>epitope ALY

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<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

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<400>26

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>epitope DLM

<400>27

Claims

1.肽组合物，特征在于其由丙型肝炎病毒的多蛋白NS3/NS4以及丙型肝炎病毒的多肽NS5b组成。

2.权利要求1的肽组合物，特征在于NS3、NS4和NS5b源自两或三种不同基因型的病毒。

3.权利要求1的肽组合物，特征在于NS3、NS4和NS5b源自相同基因型的病毒。

4.权利要求3的肽组合物，其中NS3、NS4和NS5b源自基因型1b的病毒。

5.表达载体，特征在于其包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列和编码多肽NS5b的核苷酸序列，以及它们表达所必需的工具。

6.权利要求5的表达载体，特征在于所述核苷酸序列编码源自不同基因型的病毒的多蛋白和多肽。

7.权利要求5的表达载体，特征在于所述核苷酸序列编码源自相同基因型的病毒的多蛋白和多肽。

8.权利要求7的表达载体，其中所述相同基因型为基因型1b。

9.权利要求5—8任一项的表达载体，特征在于所述载体是腺病毒。

10.权利要求9的表达载体，特征在于腺病毒的基因组被修饰从而E1区域被表达盒CMV-NS3-NS4置换，E3区域被表达盒SV40-NS5b置换。

11.权利要求5—8任一项的表达载体，特征在于所述载体是痘病毒。

12.权利要求11的表达载体，特征在于所述痘病毒的基因组被修饰从而插入表达盒ph5r-NS3-NS4及插入表达盒p7.5-NS5b。

13.由权利要求5—12任一项的表达载体转化的微生物或宿主细胞。

14.如下物质在制备用于抑制、预防或控制动物中的丙型肝炎病毒所致感染的药物中的应用，所述物质为权利要求1—4任一项的肽组合物、或者权利要求5—12任一项的表达载体、或者包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列相应于权利要求5—12任一项的表达载体中包含的序列，其置于所述肽的组成型和/或诱导型表达必需的元件的控制下。

15.权利要求14的应用，其中所述动物是人。

16.药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1—4任一项的肽组合物，或者权利要求5—12任一项的表达载体，或者包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体及包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体。

17.权利要求16的药物组合物，其中所述药物组合物是疫苗。

18.权利要求16的药物组合物，特征在于其还包含一种药物学合适的运载体。

19.药物盒，特征在于其包含至少一种包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与至少一种包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体。

20.药物盒，特征在于其包含权利要求9或10的至少一种表达载体及权利要求11或12的至少一种表达载体。

21.药物盒，其包含权利要求5—12任一项的至少一种表达载体，或者至少一种包含编码多蛋白NS3/NS4的核苷酸序列的表达载体与包含编码多肽NS5b的核苷酸序列的表达载体，及

(i)权利要求1—4的至少一种肽组合物，或者

(ii)编码多蛋白NS3/NS4及编码多肽NS5b的至少一种核苷酸序列。

22.权利要求19-21任一项的药物盒，其中所述药物盒是疫苗盒。