CN102573899A - 降低pcv-2组合物杀病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供降低包含PCV-2抗原之组合物之杀病毒活性的方法，以及包含PCV-2抗原之抗原性制剂及免疫原性组合物，其杀病毒活性已降低。此外，本发明亦关于一种提高包含PCV-2抗原之免疫原性组合物之免疫原性的方法，以及具有提高免疫原性之免疫原性组合物。

Description

降低PCV-2组合物杀病毒活性之方法及具有改良免疫原性之PCV-2组合物

本申请涉及并要求2010年3月1日提交的美国临时专利申请No.61/309,408和2009年9月2日提交的美国临时专利申请No.61/239,192的优先权。通过述及将它们都完整收入本文。所有申请是共同拥有的。

序列表

依照37 C.F.R.1.821-1.825，本申请包括序列表。在此通过述及完整收录伴随本申请的序列表。

发明领域

本发明系关于用于降低通常会具有一定程度之杀病毒活性的组合物之杀病毒活性的方法及组合物。藉由使用本发明方法可使该等组合物之杀病毒活性与不包括本发明步骤的组合物之杀病毒活性相比降低。更特定言之，本发明系关于制备抗原性II型猪环状病毒(PCV-2)组合物之方法，特征在于使用当前检测方法，该等组合物与在此项技术中已知之组合物相比，尤其与并非藉由本发明方法制备之组合物相比不具有或具有较低杀病毒活性。本发明进一步系关于一种新颖免疫原性组合物，较佳为根据本专利申请案提供之方法制备的含有PCV-2之组合物，其较佳特征在于相对于此项技术中已知之可比组合物，具有降低的或不具有杀病毒活性。根据另一方面，本发明亦提供包含纯化PCV-2抗原(较佳具有改良免疫原性之纯化PCV-2抗原)的免疫原性组合物。

先前技术

2型猪环状病毒(PCV-2)为小型(直径为17-22nm)二十面体无包膜DNA病毒，其含有单链圆形基因组。PCV-2与1型猪环状病毒(PCV-1)具有约80％序列同一性。然而，与通常无毒力之PCV-1相比，感染有PCV-2之猪展现通常称为断乳后多系统消耗性症候群(PMWS)之症候群。PMWS之临床特征为消瘦、皮肤苍白、身体憔悴、呼吸窘迫、腹泻及黄疸(icterus/jaundice)。在一些受感染之猪中，所有症状之组合将显而易见而其它猪将仅仅具有此等症状中之一或两者。在尸检期间，显微镜可见及肉眼可见之病损亦出现于多个组织及器官上，淋巴器官为最常见之病损部位。已观测到PCV-2核酸或抗原之量与显微镜可见淋巴病损的严重性之间强相关。感染有PCV-2之猪之死亡率可达80％。除PMWS外，PCV-2与包括以下之若干其它感染相关：假性狂犬病、猪生殖及呼吸症候群(PRRS)、格拉塞氏病(Glasser′s disease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断乳后大肠杆菌病、饮食性肝障碍及化脓性支气管肺炎。

可利用若干疫苗来减少PCV-2感染对猪之影响。美国专利第6,703,023号提供用于预防猪之PMWS的基于DNA之疫苗。在WO 03/049703中，描述活嵌合疫苗之制备，该疫苗包含非病原性PCV1病毒，但其中ORF2蛋白经病原性PCV-2之ORF2蛋白置换。WO 99/18214及WO 99/29717已提供制备PVC2死疫苗之程序及若干PCV-2株。WO 99/18214及WO 99/29717亦已描述亚单位疫苗之制备。WO 06/072065已报导基于ORF2之有效亚单位疫苗。WO 07/28823亦描述另一基于ORF-2之亚单位疫苗。然而，先前技术中所述之疫苗均不包括非杀病毒及/或纯化的PCV-2抗原，较佳高度纯化之PCV-2 ORF2抗原。

针对PCV-2之免疫原性组合物及针对其它病原体之各种免疫原性组合物常常对其他抗原具有杀病毒效应。当前管理标准(9 CFR 113.35)允许多价组合物中有一些杀病毒活性，但在与免疫原性组合物之其它组份组合时，此杀病毒活性不能造成超过0.7log/ml之活病毒或小于0.7log/ml CFU之活细菌的损失。杀病毒活性高于所允许者之组合物不能与其它抗原组合来形成多价疫苗。

PCV-2之可读框2(ORF2)蛋白当在SDS-PAGE凝胶上跑行时具有30kDa之近似分子量，其在以往用作PCV-2之疫苗及免疫原性组合物中之抗原组份。获得适用于该等疫苗及组合物中的ORF2之典型方法一般由以下步骤组成：扩增编码ORF2之PCV-2 DNA、在宿主细胞内表达ORF2蛋白及经由细胞溶解自宿主细胞提取ORF2蛋白。接着将回收的ORF2细胞溶解物用作免疫原性组合物或疫苗之抗原部分。在一些情况下，将含有ORF2之细胞溶解物与细胞碎片分离。

需要一种降低含有PCV-2之免疫原性组合物及其中之抗原的杀病毒活性的方法，以便满足管理要求且施用有效的多价组合物。另外需要减小或降低含有PCV-2之组合物对猪生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)之杀病毒活性及效应的方法。另外需要彼等免疫原性组合物，其已经历本发明方法使得其杀病毒活性已降低至可接受标准且可与其它抗原组合以形成多价免疫原性组合物。

发明概述

除非另有所述，否则本发明之实施将采用此项技术技能范围内之分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学常规技术。文献中充分解释了该等技术。参见，例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第I，II及III卷，第二版(1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins编，1984)；Animal CellCulture(R.K.Freshney编，1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press，1986)；Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；Protein purification methods-a practical approach (E.L.V.Harris及S.Angal编，IRL Press at Oxford University Press)；及Handbook of ExperimentalImmunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编，1986，BlackwellScientific Publications)。

在详细描述本发明之前，应了解本发明不限于特定DNA、多肽序列或过程参数，其当然可变化。亦应了解本文中所使用之术语仅为了达成描述本发明之特定实施方案之目的且并非意欲限制本发明。应注意，除非文中明确另外指示，否则如本说明书及随附权利要求所用之单数形式“一”及“该”包括复数个指示物。因此，举例而言，“一抗原”包括两种或两种以上抗原之混合物，“一赋形剂”包括两种或两种以上赋形剂之混合物，诸如此类。

本发明解决先前技术中所固有之问题且相对于当前技术有明显进步。一般而言，本发明提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，并ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。该PCV-2抗原较佳用作PCV-2抗原性组合物或用于PCV-2抗原性组合物中。

出于本发明之目的，“第一液体”系指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗等等组合使用的液体、水性或流体培养基。第一液体较佳包含抗原性组合物之培养基，第一液体更佳包含用于在培养宿主细胞中产生重组蛋白的细胞培养基或较佳由其组成。该等培养宿主细胞可为细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞及哺乳动物细胞，以昆虫及哺乳动物细胞尤佳。因此，第一流体可包含用于培养细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或哺乳动物细胞之培养基或由其组成。当使用昆虫细胞时，细胞培养基较佳为不含血清之细胞培养基，且该培养基最佳为EX-CELL

420不含血清培养基。EX-CELL

420是一种完全培养基，其不含蛋白质且含有L-谷氨酰胺，而且是为Sf9和Sf21昆虫细胞系的无血清生长而开发并优化的。

出于本发明之目的，“第二液体”系指通常与细胞、抗原、免疫原性组合物、疫苗等等组合使用的任何液体，其不同于第一液体。第二液体较佳为水溶液，甚至更佳为医药学上可接受之溶液，且甚至更佳为缓冲液，诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等。最佳，第二流体之特征在于当活病毒或活细菌在该流体中培养或储存时，其不对任何活病毒或任何活细菌有杀病毒作用(在本文中，除非明确说明或根据上下位显而易见，术语“杀病毒”包括杀细菌活性)。

出于本发明之目的，“部分”系指不包涵完整量之任何量。举例而言，一部分液体将为小于100％液体之体积，诸如90％液体、80％液体、70％液体之任何物且所有量均介于超过0％与小于100％之间。

“PCV-2抗原”系指包含至少一种当施用动物(较佳猪)时可诱导、刺激或增强针对PCV-2感染之免疫反应的抗原的任何物质组合物。该PCV-2抗原较佳为全PCV-2病毒(较佳呈灭活形式)、经修饰或减毒之PCV-2活病毒、包含至少一个PCV-2免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒、包含至少一个PCV-2免疫原性氨基酸序列(较佳ORF2)的任何其它多肽或组份。如本文中所用之术语“免疫原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”系指引发宿主中针对PCV-2之免疫反应的任何PCV-2氨基酸序列。该PCV-2免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸较佳为国际专利申请案WO2006/072065(其教示内容以引用的方式并入本文中)中所揭示或提供之任一者，或为在此项技术中已知之任何其它PCV-2多肽。举例而言，PCV-2 ORF2DNA之代表性序列包含核苷酸序列Genbank寄存编号AF086834(SEQ ID NO：3)及SEQ ID NO：4。

然而，熟习此项技术者应了解此序列在序列同源性方面可变化高达1％-10％且仍保持使其适用于免疫原性组合物中之抗原特征。免疫学组合物之抗原特征可例如藉由WO06/072065之实施例4所提供之攻毒实验来评估。此外，当经修饰抗原与由如WO 06/072065中提供之SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4之多核苷酸序列编码的PCV-2 ORF2蛋白相比赋予至少70％，较佳80％，更佳90％或更多之保护性免疫力时，仍保留经修饰抗原之抗原特征。其它较佳PCV-2 ORF2抗原为下文描述者：

i)包含WO 06/07065之SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11序列的多肽；

ii)与i)之多肽有至少80％同源性及/或同一性之任何多肽；

iii)i)及/或ii)之多肽之任何免疫原性部分；

iv)iii)之免疫原性部分，包含至少5个，较佳8个，更佳10个于WO 06/072065之SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11序列任一中之邻接氨基酸；

v)由包含WO 06/072065之SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列之DNA编码的多肽；

vi)由与v)之多核苷酸有至少80％同源性及/或同一性的多核苷酸编码之任何多肽；

vii)由v)及/或vi)之多核苷酸编码的多肽之任何免疫原性部分；

viii)vii)之免疫原性部分，其中编码该免疫原性部分之多核苷酸包含至少30个包括于WO 06/072065之SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列中的邻接核苷酸。

WO 06/072065之序列表与本申请案随附之序列表相同。

上述任一免疫原性部分较佳具有由WO 06/07065之SEQ ID NO：3或SEQID NO：4之序列编码的PCV-2 ORF2抗原之抗原特征。

如此项技术中已知，“序列同一性”系指两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列(亦即参考序列与有待与参考序列比较之指定序列)之间的关系。序列同一性系藉由在指定序列与参考序列经最佳比对以产生最高序列相似度后，将其比较而测定，如由此等序列串之间的匹配度所测定。在此比对后，逐个位置测定序列同一性，例如，若在一特定位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则该等序列在彼位置处“相同”。随后，此等位置同一性之总数除以参考序列中核苷酸或残基之总数得到序列同一性百分比。举例而言，核苷酸序列与参考核苷酸序列之“序列同一性”为至少(例如)85％，较佳90％，甚至更佳95％的多核苷酸意谓除参考核苷酸序列之每100个核苷酸，指定多核苷酸序列可能包括至多15个，较佳至多10个，甚至更佳至多5个点突变外，指定多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换言之，在核苷酸序列相对于参考核苷酸序列具有至少85％，较佳90％，甚至更佳95％之同一性的多核苷酸中，参考序列中至多15％，较佳10％，甚至更佳5％之核苷酸可删除或经另一核苷酸替代，或可将参考序列中数目为至多15％，较佳10％，甚至更佳5％核苷酸总数之核苷酸插入参考序列中。参考序列之此等突变可发生在参考核苷酸序列之5′末端位置或3′末端位置处或彼等末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列中之核苷酸间或参考序列内之一或多个邻接组中。类似地，指定氨基酸序列具有与参考氨基酸序列之至少(例如)85％，较佳90％，甚至更佳95％序列同一性的多肽意谓除参考氨基酸序列之每100个氨基酸，指定多肽序列可能包括至多15个，较佳至多10个，甚至更佳至多5个氨基酸改变外，该多肽之指定氨基酸序列与参考序列相同。换言之，为获得具有与参考氨基酸序列之至少85％，较佳90％，甚至更佳95％序列同一性之指定多肽序列，参考序列中至多15％，较佳至多10％，甚至更佳至多5％之氨基酸残基可删除或经另一氨基酸替代，或可将参考序列中数目为至多15％，较佳至多10％，甚至更佳至多5％氨基酸残基总数之氨基酸插入参考序列中。参考序列之此等改变可发生于参考氨基酸序列之氨基末端或羧基末端位置处或彼等末端位置之间的任何地方，个别地散布于参考序列之残基间或参考序列内之一或多个邻接组中。较佳地，不相同的残基位置的不同之处为保守性氨基酸替代。然而，测定序列同一性时不包括保守替代作为匹配。

出于本发明之目的，“活”病毒或细菌系指能够在宿主中复制之病毒或细菌。本发明之较佳活病毒及较佳活细菌分别为PRRS病毒及猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia)细菌。然而，术语活病毒或活细菌分别不限于PRRS病毒及猪肺炎支原体。

可藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体，其中该第二液体不同于该第一液体(参见第二流体之定义)。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由以第二液体交换该部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分该第一液体，且其中该第二液体不同于该第一液体。较佳地，以该第二液体交换部分该第一液体之操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)藉由以第二液体交换至少一部分第一液体自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。

可使用过滤器藉由过滤步骤自PCV-2抗原移除部分第一液体。然而，可使用熟习此项技术者已知之任何其它方法自PCV-2抗原移除部分任何流体，包括第一流体及(当适用时)一部分第二流体。举例而言，该方法包括(但不限于)离心及/或层析。然而，过滤最佳。移除该部分第一流体或(当适用时)任何其它流体之较佳过滤方法包含超滤及/或透滤。超滤及透滤为熟习此项技术者已知之标准方法，例如在以下文献中有详细描述：Protein Purification Methods-A Practical Approach-编者：E.L.V.Harris及S.Angel，OxfordUniversityPress 1995(其内容及教示以引用的方式并入本文中)。详言之，在彼教科书之第3章中，描述若干方法及设备类型，一般技术者可出于本发明之目的以例示性方式使用所有该等方法及设备。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由过滤(较佳藉由透滤或超滤)自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳地，藉由以第二液体交换至少一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分该第一液体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。

如上所定义，欲用于所述任一方法中之较佳第二液体为缓冲液，较佳为生理学上可接受之缓冲液且以盐水尤佳。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)藉由用缓冲液，较佳生理学上可接受之缓冲液(诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等)交换自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。较佳地，藉由过滤，较佳藉由透滤及/或超滤自PCV-2抗原移除该部分第一液体。更佳地，以缓冲液，较佳生理学上可接受之缓冲液(诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等)交换至少一部分第一液体之操作包含以下步骤：a)将该缓冲液，较佳该生理学上可接受之缓冲液(诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等)添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)较佳藉由过滤，甚至更佳藉由透滤及/或超滤自PCV-2抗原移除一部分该第一液体及该流体来浓缩PCV-2抗原，该流体为缓冲液，较佳生理学上可接受之缓冲液，诸如盐水或磷酸盐缓冲液等等。

如本文所述之方法之浓缩步骤及液体添加步骤可实质上同时执行，或者该浓缩步骤与该液体添加步骤依次执行。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)藉由以第二液体交换一部分第一液体自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中实质上同时或依次执行液体添加步骤。较佳地，藉由过滤，较佳藉由透滤及/或超滤自PCV-2抗原移除该部分第一液体且在添加第二液体之情况下移除第一流体与第二流体之混合物。

当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。举例而言，在另一方面中，在该浓缩步骤之前进行该液体添加步骤且在一替代方面中，在该液体添加步骤之前进行该浓缩步骤。可多次执行该液体添加步骤及该浓缩步骤，不管执行该等步骤之顺序如何。举例而言，此等各别步骤之每一者可执行至少两次，至少三次，至少四次，至少五次，至少十次，直至所需之多次。在一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少两次。在另一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少三次。因此，根据本申请案之另一方面，提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其中该方法一般包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)藉由以第二液体交换至少一部分该第一液体自该PCV-2抗原移除该部分第一液体，其中多次执行该交换操作。较佳地，以一部分第二流体交换部分第一流体之操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中多次(例如两次、三次、五次、十次等)执行液体添加步骤及浓缩步骤。较佳地，两次，最佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。如上所述，过滤为自PCV-2抗原移除一部分该第一液体或在如上所述多个移除步骤之情况下，移除一部分第一与第二流体之混合物的较佳方法。

过滤器可为此项技术中之任何常规过滤器。较佳地，该过滤器包括半透膜。在另一较佳形式中，该半透膜具有小于PCV-2抗原之平均孔径，藉此防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且由过滤器截留PCV-2抗原。在另一方面中，该过滤器具有防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质通过的平均孔径，更佳地，该过滤器具有防止至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质通过的平均孔径，且最佳地，该过滤器具有防止至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过的平均孔径。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。在另一方面中，该半透膜包括选自由聚砜、聚醚砜及再生纤维素组成之群的材料。然而，可使用能够自PCV-2抗原移除一部分第一流体且在多个方法步骤之情况下移除第一与第二流体之混合物的任何其它材料。该过滤器可选自由中空纤维膜超滤筒、平板或过滤盒(cassette)组成之群，以中空纤维膜超滤筒尤佳。因此，根据本申请案之另一方面，如上所述提供制备PCV-2抗原性组合物之方法。该方法一般包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)藉由过滤步骤自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该过滤器较佳为半透膜或包含半透膜。较佳地，该半透膜具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔之平均孔径。较佳地，半透膜之平均孔径防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质通过，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质通过，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。如上所述，移除步骤一般包括以一部分第二流体交换部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体浓缩PCV-2抗原，其中多次(例如两次、三次、五次、十次等)执行液体添加步骤及浓缩步骤。较佳两次，最佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。

执行本文中所提供之方法之浓缩步骤，以便使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩3倍至50倍。更佳地，进行该浓缩步骤以便使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩4倍至20倍。最佳地，进行浓缩步骤以便使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩7倍至10倍。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中自PCV-2抗原移除部分该第一液体，且其中该PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩了3倍至50倍，较佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩3倍至50倍，较佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔之平均孔径。较佳地，半透膜之平均孔径防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

在另一方面中，藉由本文之方法制备的PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该液体相比降低至少10％。更佳地，PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该第一液体相比降低至少50％。更佳地，PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该第一液体相比降低至少70％。

出于本发明之目的，术语“杀病毒活性”意谓当流体、溶液或组合物与活病毒或活细菌混合时，该流体、溶液或组合物在某种程度上灭活或杀灭该活病毒或活细菌。因此，流体、溶液或组合物之杀病毒活性降低至少10％意谓活病毒或活细菌在经历本文所述之任一方法之流体、溶液或组合物中之存活率比在未经历本文所述之任一方法之流体、溶液或组合物中的存活率高90％。根据本发明，PRRS病毒(较佳具有ATCC寄存编号VR 2332之PRRS病毒)为用于测定杀病毒活性之参考病毒。为测定对于细菌之杀病毒活性，建议使用猪肺炎支原体细菌，较佳猪肺炎支原体之J株。

因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中在步骤ii)之后获得的PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性(较佳对于PRRS病毒)与第一液体之杀病毒活性相比降低至少10％，较佳至少50％，更佳至少70％，甚至更佳至少90％。较佳地，藉由以第二液体交换一部分具有杀病毒活性之第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，且甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

在另一方面中，该方法进一步包含收获在自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后所获得的PCV-2抗原之步骤。

如本文中所用，“收获(harvesting/harvest)”系指收集或回收PCV-2抗原。当制备为本申请案之方法及组合物使用的抗原时，或当PCV-2抗原经历本文所述之方法时，可使用此项技术中已知之任何常规方法来回收PCV-2抗原。在一尤佳收获方式中，经由过滤步骤自该PCV-2抗原移除部分该第一液体且自过滤器阻滞物回收或收获PCV-2抗原。在一更佳形式中，自具有本文所述之孔径的半透膜之阻滞物收获或收集或回收PCV-2抗原。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中收获在该步骤ii)之后获得的PCV-2抗原。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

将在经历本文所提供之方法之后(较佳在自过滤器阻滞物收获之后)剩余的PCV-2抗原与选自由医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成之群的另一组份混合。较佳地，该另一组份为佐剂，甚至更佳其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中该佐剂为卡波姆(Carbomer)(合成的高分子量的丙烯酸聚合物的通称)。

如本文中所用之“医药学上可接受之载剂”及“兽医学上可接受之载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂料、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂等等。

如本文所用之“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)之皂素、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。该乳液可尤其基于轻液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，诸如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(尤其异丁烯或癸烯)之低聚合产生的油；含有直链烃基/烷基之酸或醇之酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇之酯，尤其异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂较佳为非离子表面活性剂，尤其为视情况经乙氧基化之山梨聚糖酯、Mannide(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、异硬脂酸酯、蓖麻酸酯或羟基硬脂酸酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其为Pluronic产物，特别为L121)。参见Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Stewart-Tull，D.E.S.编)。JohnWiley and Sons，NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15：564-570(1997)。举例而言，可使用由M.Powell及M.Newman所编之“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”，PlenumPress，1995之第147页所述之SPT乳液及同一本书中第183页所述之乳液MF59。其他合适之佐剂包括(但不限于)RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)之热不稳定性肠毒素(重组或其他方式)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰基二肽等。在马来酸酐与烯基衍生物之共聚物中，包括共聚物EMA(Monsanto)，其为马来酸酐与乙烯之共聚物。此等聚合物在水中溶解产生酸性溶液，将其中和，较佳中和至生理pH值以产生佐剂溶液，将向该佐剂溶液中并入免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身。

佐剂之另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及马来酸酐与烯基衍生物之共聚物的化合物。有利之佐剂化合物为尤其与糖类或多元醇类之聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物以术语卡波姆来指称(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。熟习此项技术者亦可参考美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个羟基，较佳不超过8个羟基之多羟基化合物交联之丙烯酸聚合物，至少三个羟基之氢原子经具有至少2个碳原子之不饱和脂族根置换。较佳根为彼等含有2至4个碳原子之根，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不饱和根。该等不饱和基团本身可含有诸如甲基之其它取代基。以名称卡波莫

(Carbopol)出售之产品(BF Goodrich，Ohio，USA)特别适合。它们是与聚烯基醚或联乙烯基二醇交联或与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联的丙烯酸聚合物。其中，可提及卡波莫

974P、934P及971P。最佳使用卡波莫

971P。

较佳以每剂量约100μg至约10mg之量添加佐剂。更佳以每剂量约100μg至约10mg之量添加佐剂。更佳以每剂量约500μg至约5mg之量添加佐剂。更佳以每剂量约750μg至约2.5mg之量添加佐剂。最佳地，以每剂量约1mg之量添加佐剂。

“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等张剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖等。稳定剂包括清蛋白及乙二胺四乙酸之碱盐等。

如本文中所用之“防腐剂”系指抗微生物活性剂，诸如例如庆大霉素(Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)等等。详言之，添加防腐剂对于制备多剂量组合物而言最佳。以有效防止相关组合物受任何微生物污染或抑制相关组合物内的任何微生物生长之浓度添加彼等抗微生物活性剂。

因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，进一步包含以下步骤：将在步骤ii)之后剩余的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。较佳地，其中该另一组份为佐剂，甚至更佳其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中该佐剂为卡波姆。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，且甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

上述方法中所用之PCV-2抗原可为本文中所定义之任何PCV-2抗原。PCV-2抗原较佳包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳包含PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳包含ORF-2蛋白之病毒样粒子，且甚至更佳包含INGELVACCIRCOFLEX

中所包括之抗原。因此，根据本申请案之另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。

较佳地，执行液体添加步骤及浓缩步骤多次，较佳两次，甚至更佳三次。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原，且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收的平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备PCV-2抗原呈全病毒或病毒样粒子时，此孔径较佳。

所用含有PCV-2抗原之第一液体可由此项技术中已知之任何方法获得。较佳地，含有PCV-2抗原之该第一液体以及PCV-2抗原可由国际专利申请案WO 2006/072065(其内容及教示以引用的方式并入本文中)中所述之任何方法获得。特别地，当PCV-2抗原于宿主细胞中于活体外重组表达时，PCV-2抗原可经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体，较佳重组杆状病毒之病毒载体获得。

用于表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之载体及制造及/或使用该等载体(或重组体)之方法可藉由或类似于以下所揭示之方法实现：美国专利第4,603,112号；第4,769,330号；第5,174,993号；第5,505,941号；第5,338,683号；第5,494,807号；第4,722,848号；第5,942,235号；第5,364,773号；第5,762,938号；第5,770,212号；第5,942,235号；第382,425号；PCT公开案WO 94/16716；WO 96/39491；WO 95/30018；Paoletti，“Applications of pox virus vectors tovaccination：An update”，PNAS USA 93：11349-11353，1996年10月；Moss，“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety”，PNAS USA 93：11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编者)，Methods in MolecularBiology 39，“Baculovirus Expression Protocols”(1995，Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector”，Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and RegulatedExpression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirusvector”，Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，第399-406页；EPA 0 370 573；1986年10月16日申请之美国申请案第920,197号；EP专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman，“The function of herpes simplex virus genes：A primer for genetic engineering ofnovel vectors”，PNAS USA 93：11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineered herpes simplex viruses to thetreatment of experimental brain tumors”，PNAS USA 93：11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to Blymphocytes”，PNAS USA 93：11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors：Strategies and applications”，PNAS USA93：11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利第5,591,439号；第5,552,143号；WO 98/00166；已核准之美国申请案流水第08/675,556号及第08/675,566号，均申请于1996年7月3日(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992，“Adenovirus as cloning vectors”，Seminars in Virology(第3卷)第237-52页，1993；Ballay等人，EMBO Journal，第4卷，第3861-65页，Graham，Tibtech 8，85-87，1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70，42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science，259：1745-49，1993及McClements等人，“Immunization with DNAvaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B，alone or in combination，induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2disease”，PNAS USA 93：11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号；第5,589,466号及第5,580,859号；以及WO 90/11092；WO 93/19183；WO94/21797；WO 95/11307；WO 95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry，涉及DNA表达载体，等等。亦参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia，41：736-739，1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbach等人(Intracel)，WO 90/01543；Robinson等人，seminars in Immunology，第9卷，第271-283页(1997)，(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利第____________号(将DNA插入活细胞中的的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的用途)；及美国专利第5,928,913号(用于基因投递的载体)以及本文中所引用之其它文献。PCV-2 ORF2抗原在昆虫细胞中之表达描述于例如WO 06/072065中。本发明之纯化PCV-2 ORF2抗原可藉由此项技术中已知之若干方法获得。较佳方法为本文所述之彼等方法。PCV-2 ORF2抗原可藉由包含以下步骤之方法活体外重组制得：i)允许用含有PCV-2 ORF2编码序列之重组病毒载体感染于培养物中之易感细胞，其中由重组病毒载体表达PCV-2 ORF2蛋白，及ii)此后自细胞培养物回收PCV-2ORF2抗原。藉由收获表达PCV-2 ORF2抗原之全(亦即完整)SF+细胞来回收PCV-2 ORF2抗原。

因此，根据本申请案之另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。当使用含有及表达该PCV-2抗原之病毒载体(尤其重组杆状病毒)制备/获得PCV-2抗原时，上述方法进一步包含较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活该病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)之步骤。较佳在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更佳在收获PCV-2抗原之后执行灭活步骤。甚至更佳地，在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除部分第一液体之后执行灭活步骤。当藉由包含以下步骤之方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍，在该浓缩之后进行灭活步骤。当多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活步骤。当使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在较佳使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

出于本发明之目的，“DNA灭活剂”系指灭活DNA(较佳病原体之DNA)使得病原体不能引起主动感染或具有传染性或复制但仍能诱导受试者之免疫反应的任何化学试剂。DNA灭活剂较佳为福尔马林(formalin)。

因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得，其中该方法进一步包含较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活该病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)之步骤，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更佳在收获PCV-2抗原之后执行灭活步骤。甚至更佳在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除部分第一液体之后执行灭活步骤。当藉由包含以下步骤之方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至10倍，在该浓缩步骤之后进行灭活步骤。当多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活步骤。当使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在较佳使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

在本发明方法中使用DNA灭活剂之情况下，该方法进一步包含添加一定量之中和该DNA灭活剂之试剂的步骤，该量等于该DNA灭活剂之量，其中中和DNA灭活剂之试剂包含浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠且其中该DNA灭活剂为BEI。较佳地，在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后执行该灭活步骤。

如本文中所用“中和灭活剂之试剂”或“中和剂”系指能中和上列灭活剂使得灭活剂不能灭活DNA之任何试剂。中和灭活剂之试剂较佳为硫代硫酸钠。

因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得在第一液体中之PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量之中和该灭活剂之中和剂，该中和剂量等于灭活剂之量，其中中和剂较佳包含较佳浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂较佳包含BEI。较佳在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更佳在收获PCV-2抗原之后执行灭活及中和步骤。甚至更佳在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体之后执行灭活及中和步骤。当藉由包含以下步骤之方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍，在该浓缩步骤之后进行灭活及中和步骤。当多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活及中和步骤。当使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在较佳使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活及中和步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

在本申请案之另一方面中，上述方法进一步包含将在该灭活及中和步骤之后获得的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合之步骤：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得在第一液体中之PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量之中和该灭活剂之中和剂，该中和剂量较佳等于灭活剂之量，其中中和剂较佳包含较佳浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂较佳包含BEI；及v)将在步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。较佳该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳在步骤ii)中，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

根据另一方面，获得具有降低杀病毒活性之PCV-2抗原的上述任何方法可包括进一步纯化步骤以获得纯化PCV-2抗原。意外地发现包含纯化PCV-2抗原(较佳与佐剂组合)之抗原性或免疫原性组合物不仅展示如本文所述之降低杀病毒活性，而且展示与不包含纯化PCV-2抗原(意谓其包含非纯化或粗PCV-2抗原)之免疫原性组合物相比，提高的免疫原性。

术语“纯化PCV-2抗原”意谓PCV-2抗原在制剂中纯化至以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过50％(w/w)，较佳超过60％(w/w)，较佳超过70％(w/w)，较佳超过80％(w/w)，较佳超过85％(w/w)，更佳超过90％(w/w)，甚至更佳超过95％(w/w)之程度。换言之，若制剂包含具有80％(w/w)纯度等级之PCV-2抗原，则该制剂包含以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计不超过20％(w/w)之非PCV-2蛋白。较佳地，在制剂中，亦即在与佐剂或任何其它赋形剂或灭活剂混合之前的免疫原性组合物中测量纯度等级。然而，若用于最终免疫原性组合物中之佐剂为非蛋白基佐剂，则添加佐剂对纯度值无任何影响。可藉由熟习此项技术者已知之标准方法评估PCV-2抗原之纯度等级，例如藉由在SDS-PAGE分离之后的Imperial Protein Stain(Pierce)、气相层析、HPLC分析等。评估制剂(亦即免疫原性组合物)中的PCV-2抗原之纯度或纯度等级的本发明之较佳方法为Imperial Protein Stain(Pierce)染色，其如下进行：使用NuPAGE MOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)分离包含PCV-2抗原之制剂。在变性(所有缓冲液中均含有SDS)及还原条件(载入缓冲液含有2-巯基乙醇)下跑胶。在将样品载入凝胶之后，在200伏特恒定电压下跑胶55分钟。在跑胶完成之后，使用Imperial ProteinStain(Pierce)根据制造商说明书对凝胶进行染色且脱色。

相比而言，术语“非纯化”或“粗”PCV-2抗原系指包含PCV-2抗原之粗制剂。通常在细胞培养物中活体外制备PCV-2抗原。因此，粗PCV-2抗原系指PCV-2抗原与用于制备PCV-2抗原之细胞培养物或细胞培养材料之混合物。此外，非纯化PCV-2抗原亦意谓部分纯化之PCV-2抗原，其较佳具有以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计小于50％(w/w)，更佳小于40％(w/w)，甚至更佳小于30％(w/w)，甚至更佳小于20％(w/w)之纯度等级。

此外，如本文中所用术语“提高免疫原性或改良免疫原性”意谓与包含不同抗原或不同纯度等级之抗原的参考免疫原性组合物相比，由包含相关抗原之免疫原性组合物所引起的免疫反应增强，不管此免疫反应为细胞介导及/或抗体介导之免疫反应。根据一较佳实施方案，术语提高免疫原性或改良免疫原性意谓与包含不同抗原或不同纯度等级之抗原的参考免疫原性组合物相比，由包含相关抗原之免疫原性组合物所引发的抗体介导之免疫反应增强。就此而言，抗体介导之免疫反应意谓与由包含不同抗原或不同纯度等级之抗原的参考免疫原性组合物引发之抗体产生相比，对相关抗原有特异性之抗体产生增加。

术语“增强”意谓与由包含不同抗原或不同纯度等级之抗原的参考免疫原性组合物所引发之细胞及/或抗体介导之免疫反应相比，细胞及/或抗体介导之免疫反应增强至少10％，较佳至少20％，更佳至少30％，甚至更佳至少40％，甚至更佳至少50％，甚至更佳至少75％，最佳至少100％。

熟习此项技术者一般知晓如何测量细胞及/或抗体介导之免疫反应。详言之，熟习此项技术者很清楚要比较相关免疫原性组合物之细胞介导之免疫反应与参考组合物之细胞介导之免疫反应，或比较相关免疫原性组合物之抗体介导之免疫反应与参考组合物之抗体介导之免疫反应，而不比较相关免疫原性组合物之细胞介导之免疫反应与参考组合物之抗体介导之免疫反应或相关免疫原性组合物之抗体介导之免疫反应与参考组合物之细胞介导之免疫反应。此外，可例如藉由测量相关免疫原性组合物/抗原对细胞毒性T细胞之活化来测量细胞介导之免疫反应。可例如藉由测量由于向动物施用包含该抗原之免疫原性组合物而产生的抗原特异性抗体之量来测量抗体介导之免疫反应。可例如藉由使用小鼠模型来测量细胞及/或抗体介导之免疫反应。根据本发明，小鼠模型用作参考方法。

术语“免疫原性组合物”意谓(但不限于)包含至少一种在宿主中引发针对相关抗原之细胞及/或抗体介导之免疫反应的抗原之物质组合物。通常，“免疫反应”包括(但不限于)一或多种以下效应：产生或活化特异性针对在相关组合物或疫苗中所包括之抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞及/或细胞毒性T细胞及/或γ-δT细胞。宿主较佳将展现治疗或保护性免疫反应以便增强对新感染之抵抗力及/或降低疾病之临床严重性。在该情况下，免疫原性组合物为“疫苗”。该种保护将由通常受感染宿主所呈现之症状减轻或缺失、受感染宿主之恢复时间缩短及/或病毒滴度降低来证明。

可藉由层析程序(较佳两步层析程序)实现PCV-2抗原之进一步纯化。若PCV-2抗原装配至病毒样粒子(VLP)中，则一步(较佳第一步骤)较佳为大小排阻(凝胶过滤)层析，其可例如藉由使用Sephacryl S300基质进行。在实验室规模下，最佳使用HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而，可使用熟习此项技术者已知之任何其它大小排阻层析基质，其能够自培养滤液或上清液中分离出PCV-2 ORF2 VLP。合适之基质描述于例如E.L.V.Harris及S.Angel(编者)，Protein purification methods-a practical approach，IRL Press Oxford1995)中。可例如藉由以1.0mL/min之流动速率用包含PCV-2抗原之粗制剂装载管柱且以1.5个管柱体积的包含20mM Tris(pH 6.5)、5mM DTT之缓冲液洗脱管柱来进行凝胶过滤层析。然而，亦可藉由使用亲和性层析，例如，经由选择性结合至已固定PCV-2 ORF2特异性抗体或熟习此项技术者已知之任何其它方法纯化PCV-2 ORF2抗原。

因此，根据一较佳实施方案，本发明提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及iii)藉由层析程序纯化包含PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2)之步骤ii)收获物。较佳如本文所述，较佳如实施例3中所述执行大小排阻层析。较佳地，大小排阻产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过80％(w/w)，较佳超过90％(w/w)纯度等级之免疫原性组合物。可在使用NuPAGE MOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE 10％ Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDS PAGE之后，藉由ImperialProtein Stain(Pierce)染色来评估纯度等级。

因此，根据一较佳实施方案，本发明提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及iii)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)纯化包含PCV-2抗原之步骤ii)收获物。

为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一层析步骤之第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。较佳地，若纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)之第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，较佳阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之较佳阴离子交换层析基质为Q Sepharose。在约50ml之小规模中，最佳使用5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言之，可将来自大小排阻层析步骤之约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min之流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mM Tris(pH 6.5)、5mM DTT移除未结合材料之洗涤步骤之后，可以8个管柱体积之下列缓冲液(20mMTris(pH 6.5)、5mM DTT、1.0M NaCl)之单一步骤来洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱之流过物装载回Q Sepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继之以阴离子交换层析)将PCV-2 ORF2抗原与培养收获物之大部分其它蛋白组份有效地分离。

因此，根据一较佳实施方案，本发明提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及iii)藉由两步层析纯化包含PCV-2抗原之步骤ii)收获物。第一层析步骤较佳不同于第二步骤。若第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，较佳阴离子交换层析(AIEX)。较佳地，在包括一或多个进一步纯化步骤以获得纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2蛋白)的上述任何方法中，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，且甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。在较佳形式中，上述制备PCV-2抗原性组合物之方法进一步包含以下步骤：i)获得在第一液体中之PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量之中和该灭活剂之中和剂，该中和剂量等于灭活剂之量，其中中和剂较佳包含较佳浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂较佳包含BEI；及v)将在步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。进一步纯化(较佳包括预过滤步骤之两步纯化策略)产生具有以在与任何佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过80％(w/w)，较佳超过85％(w/w)，甚至更佳超过90％(w/w)，最佳超过95％(w/w)之纯度等级的免疫原性组合物。

当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，最佳2年以上时，藉由本文所述之方法制备的PCV-2抗原性组合物造成小于1log TCID₅₀活病毒或小于1log CFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，最佳2年以上时，藉由本文所述之方法制备的PCV-2抗原性组合物更佳造成小于0.9log TCID₅₀/毫升活病毒或小于0.9log CFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，最佳2年以上时，藉由本文所述之方法制备的PCV-2抗原性组合物甚至更佳造成小于0.7log TCID₅₀/毫升活病毒或小于0.7logCFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，最佳2年以上时，藉由本文所述之方法按步骤制备的PCV-2抗原性组合物更佳造成小于0.5log TCID₅₀/毫升活病毒或小于0.5log CFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，最佳2年以上时，藉由本文所述之方法制备的PCV-2抗原性组合物甚至更佳造成小于0.3log TCID₅₀/毫升活病毒或小于0.3log CFU/毫升活细菌之损失。活病毒可为任何活病毒，但活病毒较佳为PRRS病毒，较佳具有ATCC寄存编号VR 2332之PRRS病毒。活细菌可为任何细菌，但较佳为猪肺炎支原体细菌，较佳猪肺炎支原体之J株。可藉由能够评估活病毒之量的标准活体外滴定检定评估TCID₅₀/毫升。亦可藉由能够评估活细菌之量的标准活体外滴定检定测定CFU/毫升。术语“每毫升”较佳系指1毫升流体。该纯化PCV-2抗原不仅显示如本文所定义之降低杀病毒活性，而且亦显示与如本文所定义之非纯化PCV-2抗原相比提高的免疫原性，较佳该纯化PCV-2抗原使细胞及/或抗体介导之免疫反应与由包含非纯化PCV-2抗原之参考免疫原性组合物引发的细胞及/或抗体介导之免疫反应相比增强至少10％，较佳至少20％，更佳至少30％，甚至更佳至少40％，甚至更佳至少50％，甚至更佳至少75％，最佳至少100％。

因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中当活病毒(较佳PRRSV)或活细菌(较佳猪肺炎支原体)与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，最佳2年以上时，在步骤ii)之后获得的PCV-2抗原性组合物造成小于1logTCID₅₀(较佳/毫升)，较佳小于0.9log TCID₅₀(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.7log TCID₅₀(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.5log TCID₅₀(较佳/毫升)，最佳小于0.3log TCID₅₀(较佳/毫升)活病毒(较佳活PRRSV)或小于1log CFU(较佳/毫升)，较佳小于0.9log CFU(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.7log CFU(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.5log CFU(较佳/毫升)，最佳小于0.3log CFU(较佳/毫升)活细菌(较佳猪肺炎支原体)之损失。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。当该PCV-2抗原经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得时，该方法进一步包含iii)较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量之中和该灭活剂之中和剂，该中和剂量等于灭活剂之量，其中中和剂较佳包含较佳浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂较佳包含BEI。较佳在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后，更佳在收获PCV-2抗原之后执行灭活及中和步骤。甚至更佳在藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体之后执行灭活及中和步骤。当藉由包含以下步骤之方式以第二液体交换一部分第一液体时：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至10倍，在该浓缩步骤之后进行灭活及中和步骤。当多次，较佳两次且甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤时，在最后一次液体添加步骤及浓缩步骤之后执行该灭活及中和步骤。当使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤时，在较佳使用半透膜进行的上述该过滤步骤之后，执行该灭活及中和步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。较佳地，获得如本文所定义之纯化PCV-2抗原之进一步纯化可藉由执行包含以下步骤之进一步纯化步骤来实现：iii)藉由层析步骤纯化在移除一部分第一液体之后获得的包含PCV-2抗原之步骤ii)收获物。为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一步骤之第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。较佳地，若纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)之第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，较佳阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之较佳阴离子交换层析基质为Q Sepharose。在约50ml之小规模中，最佳使用5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言之，可将来自大小排阻层析步骤之约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min之流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mM Tris(pH6.5)、5mM DTT移除未结合材料之洗涤步骤之后，可以8个管柱体积之下列缓冲液(20mM Tris(pH 6.5)、5mM DTT、1.0M NaCl)之单一步骤洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱之流过物装载回Q Sepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继之以阴离子交换层析)将PCV-2 ORF2抗原与培养收获物之大部分其它蛋白组份有效地分离。

根据上述方法获得之PCV-2抗原性组合物或上述方法之步骤i)中所用之PCV-2抗原可与至少一种另外抗原(较佳病毒或细菌抗原，且甚至更佳来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原)组合。另外抗原可为国际专利申请案WO 2007/094893(其内容及教示以引用的方式并入本文中)中所揭示之任何彼等抗原。简言之，该另外抗原可为猪之任何其它致病有机体的抗原。猪之“另一致病有机体”较佳选自由以下组成之群：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)(1)；腺病毒(2)；α病毒，诸如东方马脑脊髓炎病毒(3)；支气管败血性博德氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)(4)；短螺旋体属(Brachyspira spp.)(5)，较佳猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae)(6)；结肠菌毛样短螺旋体(B.piosicoli)(7)；猪布氏杆菌(Brucellasuis)，较佳生物变种1、2及3(8)；经典猪瘟病毒(9)；芽胞梭菌属(Clostridium spp.)(10)，较佳难养芽胞梭菌(Cl.difficile)(11)，A型、B型及C型产气荚膜芽胞梭菌(Cl.perfringens)(12)，诺维氏芽胞梭菌(Cl.Novyi)(13)；败血芽胞梭菌(Cl.septicum)(14)，破伤风梭菌(Cl.tetani)(15)；冠状病毒(16)，较佳猪呼吸道冠状病毒(17)；猪附红血球体(Eperythrozoonosis suis)(18)；猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhsiopathiae)(19)；大肠杆菌(Escherichia coli)(20)；猪副嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，较佳亚型1、7及14(21)；血球凝集性脑脊髓炎(Hemagglutinating encephalomyelitis)病毒(22)；日本脑炎病毒(23)；胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)(24)；钩端螺旋体属(Leptospira spp.)(25)，较佳澳洲钩端螺旋体(Leptospira australis)(26)；犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)(27)；感冒伤寒性钩端螺旋体(Leptospiragrippotyphosa)(28)；出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagicae)(29)；及问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(30)；波莫那钩端螺旋体(Leptospira pomona)(31)；塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospiratarassovi)(32)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)(33)，较佳鸟分枝杆菌(M.avium)(34)，细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(35)及牛分枝杆菌(M.bovis)(36)；猪肺炎支原体(37)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)(38)；猪细胞巨大病毒(39)；猪小病毒(40)；猪生殖及呼吸症候群病毒(41)；假性狂犬病病毒(42)；轮状病毒(43)；沙门杆菌属(Salmonella spp.)(44)，较佳鼠伤寒沙门杆菌(S.thyhimurium)(45)及猪霍乱沙门杆菌(S.choleraesuis)(46)；猪葡萄球菌(Staph.hyicus)(47)；葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)(48)；较佳，链球菌属(Streptococcus spp.)(49)，较佳猪链球菌(50)；猪疱疹病毒(51)；猪流感病毒(52)；猪痘病毒(53)；猪痘病毒(54)；水泡性口炎病毒(55)；猪水疱疹病毒(56)；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjo)(57)；及/或猪关节滑膜支原体(58)。

因此，根据本发明之另一方面，本发明提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得在第一液体中之PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；及将该PCV-2抗原与至少一种另外抗原(较佳病毒或细菌抗原，且更佳来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原)组合。较佳该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，且甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

在较佳形式中，上述制备PCV-2抗原性组合物之方法进一步包含以下步骤：i)获得在第一液体中之PCV-2抗原，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量之中和该灭活剂之中和剂，该中和剂量等于灭活剂之量，其中中和剂较佳包含较佳浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中灭活剂较佳包含BEI；及v)将在步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。

在该方法之另一方面中，该至少一种另外抗原为病毒抗原，较佳来自猪生殖及呼吸症候群病毒之抗原。该猪生殖及呼吸症候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳经修饰之活病毒，甚至更佳经修饰之减毒活病毒。该经修饰之猪生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存编号VR 2332之经修饰之活病毒株，且更佳包含INGELVAC

PRRS MLV。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及将该PCV-2抗原与来自猪生殖及呼吸症候群病毒之抗原组合。该猪生殖及呼吸症候群病毒抗原较佳包含活病毒，更佳经修饰之活病毒，且甚至更佳经修饰之减毒活病毒。该经修饰之猪生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存编号VR 2332之经修饰之活病毒株，且更佳包含INGELVAC

PRRS MLV。该PCV-2抗原较佳包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在此情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

在本申请案之另一方面中，该至少一种另外抗原为细菌抗原，较佳为猪肺炎支原体。该猪肺炎支原体抗原较佳为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更佳为INGELVAC

MYCOFLEX。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及将该PCV-2抗原与细菌抗原(较佳猪肺炎支原体)组合。该猪肺炎支原体抗原较佳为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更佳为INGELVAC

MYCOFLEX。该PCV-2抗原较佳包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，且甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

在本申请案之另一方面中，该至少一种另外抗原包括病毒抗原，较佳如上所述之猪生殖及呼吸症候群病毒抗原；及细菌抗原，较佳如上所述之猪肺炎支原体抗原。该猪生殖及呼吸症候群病毒抗原较佳包含活病毒，更佳经修饰之活病毒，且更佳包含ATCC寄存编号VR 2332之经修饰之活病毒株，且更佳包含INGELVAC

PRRS MLV。该猪肺炎支原体抗原较佳为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更佳为INGELVAC

MYCOFLEX。因此，根据另一方面，本申请案提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，及将该PCV-2抗原与病毒抗原(较佳如上所述之猪生殖及呼吸症候群病毒抗原)及细菌抗原(较佳如上所述之猪肺炎支原体抗原)组合。该猪生殖及呼吸症候群病毒抗原较佳包含活病毒，更佳经修饰之活病毒，且更佳包含ATCC寄存编号VR 2332之经修饰之活病毒株，且更佳包含INGELVAC

PRRS MLV。该猪肺炎支原体抗原较佳为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更佳为INGELVAC

MYCOFLEX。该PCV-2抗原较佳包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩，较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，且甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行该液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化PCV-2抗原。

本申请案不仅提供制备PCV-2抗原性组合物之方法，而且系关于PCV-2抗原性组合物。因此，根据另一方面，本专利申请案进一步提供一种PCV-2抗原性组合物，其特征在于当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，且最佳2年以上时，该PCV-2抗原性组合物造成小于1log TCID₅₀/毫升活病毒或小于1log CFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，且最佳2年以上时，该PCV-2抗原性组合物更佳造成小于0.9log TCID₅₀/毫升活病毒或小于0.9log CFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，且最佳2年以上时，该PCV-2抗原性组合物甚至更佳造成小于0.7logTCID₅₀/毫升活病毒或小于0.7log CFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，且最佳2年以上时，该PCV-2抗原性组合物更佳造成小于0.5log TCID₅₀/毫升活病毒或小于0.5log CFU/毫升活细菌之损失。当活病毒或活细菌与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，且最佳2年以上时，该PCV-2抗原性组合物甚至更佳造成小于0.3log TCID₅₀/毫升活病毒或小于0.3log CFU/毫升活细菌之损失。活病毒可为任何活病毒，但活病毒较佳为PRRS病毒，较佳具有ATCC寄存编号VR 2332之PRRS病毒。活细菌可为任何细菌，但较佳为猪肺炎支原体细菌，较佳猪肺炎支原体之J株。可藉由能够评估活病毒之量的标准活体外滴定检定评估TCID₅₀/毫升。亦可藉由能够评估活细菌之量的标准活体外滴定检定测定CFU/毫升。术语“每毫升”较佳系指1毫升流体。

在另一方面中，上述PCV-2抗原性组合物包含选自由以下组成之群的另一组份：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。该另一组份较佳为佐剂，甚至更佳其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中该佐剂为卡波姆。较佳以每剂量约100μg至约10mg之量添加佐剂。甚至更佳以每剂量约100μg至约10mg之量添加佐剂。更佳以每剂量约500μg至约5mg之量添加佐剂。更佳以每剂量约750μg至约2.5mg之量添加佐剂。最佳以每剂量约1mg之量添加佐剂。

本申请案不仅提供制备PCV-2抗原性组合物之方法及/或如上文所定义之PCV-2抗原性组合物，其亦系关于可藉由本文所述之任何方法获得的PCV-2抗原性组合物。因此，在另一方面中，本申请案系关于藉由包含以下步骤之方法获得的PCV-2抗原性组合物：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。该PCV-2抗原较佳用作PCV-2抗原性组合物或用于该PCV-2抗原性组合物中。术语“藉由本文所提供之方法获得的PCV-2抗原性组合物”亦意谓该PCV-2抗原性组合物可藉由本文中所提供之方法获得。根据另一方面，本申请案亦系关于藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体获得的PCV-2抗原性组合物，其中该第二液体不同于该第一液体。因此，根据另一方面，本申请案系关于藉由包含以下步骤之方法获得的PCV-2抗原性组合物，i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体，其中该第二液体不同于该第一液体。较佳地，以该第二液体交换部分该第一液体之操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原。

根据另一方面，较佳藉由以下方法获得PCV-2抗原性组合物：其中使用过滤器藉由过滤步骤自PCV-2抗原移除部分该第一液体。然而，可使用熟习此项技术者已知之任何其它方法(例如，离心及/或层析)自PCV-2抗原移除部分第一及第二流体。然而，最佳为过滤。移除该部分第一流体之较佳过滤方法包含超滤及/或透滤。如本文所述之方法之浓缩步骤及液体添加步骤可实质上同时或另外执行，依次执行该浓缩步骤与该液体添加步骤。因此，根据另一方面，本申请案系关于藉由包含以下步骤之方法获得的PCV-2抗原性组合物，i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除部分该第一液体，其中该第二液体不同于该第一液体。较佳地，以该第二液体交换部分该第一液体之操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中实质上同时或依次执行液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。举例而言，在另一方面中，该液体添加步骤在该浓缩步骤之前进行且在一替代方面中，该浓缩步骤在该液体添加步骤之前进行。

在另一方面中，本申请案系关于可使用本文所述之方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中可多次执行该液体添加步骤及该浓缩步骤，不管执行该等步骤之顺序如何。举例而言，此等各别步骤之每一者可执行至少两次，至少三次，至少四次，至少五次，至少十次，直至所需之多次。在一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少两次。在另一方面中，该浓缩步骤与该液体添加步骤各自执行至少三次。

在本申请案之另一方面中，如上所述获得本发明之PCV-2抗原性组合物，其中过滤为自PCV-2抗原移除一部分该第一液体或在如上所述多个移除步骤之情况下，移除一部分第一流体与第二流体之混合物的较佳方法。过滤器可为此项技术中之任何常规过滤器。该过滤器较佳包括半透膜。在另一较佳形式中，该半透膜具有小于PCV-2抗原之平均孔径，藉此防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且由过滤器截留PCV-2抗原。在另一方面中，该过滤器具有防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质通过的平均孔径，更佳地，该过滤器具有防止至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质通过的平均孔径，且最佳地，该过滤器具有防止至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过的平均孔径。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。在另一方面中，该半透膜包括选自由聚砜、聚醚砜及再生纤维素组成之群的材料。然而，可使用能够自PCV-2抗原移除一部分第一流体且在多个方法步骤之情况下移除第一流体与第二流体之混合物的任何其它材料。在另一方面中，该过滤器系选自由中空纤维膜超滤滤筒、平板或过滤片组成之群，以中空纤维膜超滤滤筒尤佳。

因此，根据另一方面，本申请案系关于使用如上所述之方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中过滤器较佳为半透膜或包含半透膜。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔之平均孔径。半透膜之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。如上所述，移除步骤一般包括以一部分第二流体交换部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体来浓缩PCV-2抗原，其中多次(例如两次、三次、五次、十次等)执行液体添加步骤及浓缩步骤。较佳地，两次，最佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。

执行本文所提供之获得PCV-2抗原性组合物之方法之浓缩步骤，以便使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩3倍至50倍。更佳地，进行该浓缩步骤以便使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩4倍至20倍。最佳地，进行浓缩步骤以便使PCV-2抗原与第一液体之体积相比浓缩7倍至10倍。因此，根据另一方面，本申请案系关于藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中与该第一液体之体积相比，该PCV-2抗原浓缩了3倍至50倍，较佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，藉由以第二液体交换部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一流体，该交换操作包含以下步骤：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩3倍至50倍，较佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。液体添加步骤较佳与浓缩步骤实质上同时或依次执行。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔之平均孔径。半透膜之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

较佳地，获得如本文中所定义之包含纯化PCV-2抗原之PCV-2抗原性组合物的进一步纯化可藉由执行包含以下步骤之进一步纯化步骤来实现：iii)藉由层析步骤纯化在移除一部分第一液体之后获得的包含PCV-2抗原的步骤ii)收获物(本文所述任何方法)。为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一步骤之第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二纯化步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。较佳地，若纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)之第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，较佳阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之较佳阴离子交换层析基质为Q Sepharose。在约50ml之小规模中，最佳使用5ml HiTrap QSepharose HP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言之，可将来自大小排阻层析步骤之约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min之流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mM Tris(pH 6.5)、5mM DTT移除未结合材料之洗涤步骤之后，可以8个管柱体积之下列缓冲液(20mM Tris(pH6.5)、5mM DTT、1.0M NaCl)之单一步骤洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱之流过物装载回Q Sepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继之以阴离子交换层析)将PCV-2 ORF2抗原与培养收获物之大部分其它蛋白组份有效地分离。

在另一方面中，由本文所述方法制备的PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该液体相比降低至少10％。更佳地，该PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该第一液体相比降低至少50％。更佳地，该PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该第一液体相比降低至少70％。

因此，根据另一方面，本申请案系关于藉由一种包含以下步骤之方法获得的PCV-2抗原性组合物：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体，其中在步骤ii)之后获得的PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性(较佳针对PRRS病毒)与第一液体之杀病毒活性相比降低至少10％，较佳至少50％，更佳至少70％，甚至更佳至少90％。较佳地，藉由以第二液体交换第一液体之一部分而自PCV-2抗原移除具有杀病毒活性之第一液体部分。较佳以包含以下之步骤进行交换：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至10倍。如上所述，液体添加步骤较佳与浓缩步骤实质上同时或依次执行。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备PCV-2抗原呈全病毒或病毒样粒子时，此孔径较佳。可如上所述进行进一步纯化以获得纯化之PCV-2抗原。

根据另一方面，本申请案系关于藉由本文所述之方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中当活病毒(较佳PRRSV)或活细菌(较佳猪肺炎支原体)与PCV-2抗原性组合物混合且一起培育2小时或2小时以上，较佳4小时以上，甚至更佳12小时以上，甚至更佳24小时以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2个月以上，甚至更佳3个月以上，甚至更佳4个月以上，甚至更佳6个月以上，甚至更佳9个月以上，甚至更佳12个月以上，甚至更佳18个月以上，且最佳2年以上时，该PCV-2抗原性组合物造成小于1log TCID₅₀(较佳/毫升)，较佳小于0.9log TCID₅₀(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.7log TCID₅₀(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.5log TCID₅₀(较佳/毫升)，最佳小于0.3log TCID₅₀(较佳/毫升)活病毒(较佳活PRRSV)或小于1log CFU(较佳/毫升)，较佳小于0.9log CFU(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.7log CFU(较佳/毫升)，甚至更佳小于0.5log CFU(较佳/毫升)，最佳小于0.3log CFU(较佳/毫升)活细菌(较佳猪肺炎支原体)之损失。活病毒可为任何活病毒，但活病毒较佳为PRRS病毒，较佳具有ATCC寄存编号VR 2332之PRRS病毒。活细菌可为任何细菌，但较佳为猪肺炎支原体细菌，较佳猪肺炎支原体之J-菌株。可藉由能够评估活病毒之量的标准活体外滴定检定评估TCID₅₀/毫升。亦可藉由能够评估活细菌之量的标准活体外滴定检定测定CFU/毫升。术语“每毫升”或“/毫升”较佳系指1毫升流体。

在另一方面中，本专利申请案系关于藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，上述方法进一步包含收获步骤ii)之后剩余的PCV-2抗原之步骤。可以任何常规方式进行此收获操作。在一尤佳收获方式中，经由过滤步骤自该PCV-2抗原移除部分该第一液体且自过滤器阻滞物回收或收获PCV-2抗原。

在另一方面中，将藉由本文所述之任何方法获得的PCV-2抗原性组合物与选自由以下组成之群的另一组份混合：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。该另一组份较佳为佐剂，甚至更佳其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中该佐剂为卡波姆。

因此，根据另一方面，本申请案提供藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，该方法进一步包含以下步骤：将藉由本文所述之方法获得的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。该另一组份较佳为佐剂，甚至更佳其中该佐剂为丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中该佐剂为卡波姆。较佳以每剂量约100μg至约10mg之量添加佐剂。甚至更佳以每剂量约100μg至约10mg之量添加佐剂。更佳以每剂量约500μg至约5mg之量添加佐剂。更佳以每剂量约750μg至约2.5mg之量添加佐剂。最佳以每剂量约1mg之量添加佐剂。

在另一方面中，上述PCV-2抗原性组合物包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。因此，根据本申请案之另一方面，本申请案提供藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。

如上所述，本文所述之方法中使用的PCV-2抗原可藉由此项技术中已知之任何方法获得。较佳地，PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得。在较佳形式中，该PCV-2抗原系根据WO2006/072065(其教示及内容先前以引用的方式并入)中所述之程序获得。因此，根据本申请案之另一方面，本申请案提供藉由上述方法获得的PCV-2抗原性组合物，其中该PCV-2抗原系经由含有及表达PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF-2)之病毒载体(较佳重组杆状病毒病毒载体)获得，且其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。

在本申请案之另一方面中，PCV-2抗原性组合物系藉由上述方法获得且该方法进一步包含较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活该重组杆状病毒病毒载体之步骤。在较佳形式中，该方法进一步包含添加一定量之中和该DNA灭活剂之试剂，该量等于该DNA灭活剂之量，其中中和DNA灭活剂之试剂包含浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠溶液，且其中该DNA灭活剂为BEI。较佳在自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体之后执行该灭活步骤。

在本申请案之另一方面中，PCV-2抗原性组合物系藉由上述方法获得，该方法进一步包含混合在灭活及中和步骤之后获得的PCV-2抗原之步骤。因此，根据另一方面，本申请案提供藉由包含以下步骤之上述方法获得的PCV-2抗原性组合物：i)获得在第一液体中之PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；iii)较佳在约1至约20mM二元乙撑亚胺存在下以DNA灭活剂灭活重组杆状病毒病毒载体；iv)添加一定量之中和该灭活剂之中和剂，该中和剂量等于灭活剂之量，其中中和剂较佳包含较佳浓缩至约1至约20mM之最终浓度的硫代硫酸钠溶液且其中灭活剂较佳包含BEI；及(较佳)步骤v)，包含将步骤iv)中获得的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。

在本申请案之另一方面中，较佳藉由上述方法获得的上述PCV-2抗原性组合物进一步包含至少一种另外抗原，较佳病毒或细菌抗原，且更佳来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原。在另一方面中，该至少一种另外抗原为猪生殖及呼吸症候群病毒。该猪生殖及呼吸症候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳包含经修饰之活病毒。该经修饰之猪生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存编号VR 2332之经修饰之活病毒株，且更佳包含INGELVAC

PRRS MLV。在本申请案之另一方面中，该至少一种另外抗原为猪肺炎支原体。该猪肺炎支原体抗原较佳为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更佳为INGELVAC

MYCOFLEX。在本申请案之另一方面中，较佳藉由上述方法获得的上述PCV-2抗原性组合物进一步包含猪生殖及呼吸症候群病毒抗原，较佳经修饰之猪生殖及呼吸症候群活病毒，更佳具有ATCC寄存编号VR 2332之猪生殖及呼吸症候群病毒，或在INGELVAC

PRRS MLV或INGELVACPRRS ATP中所包括的猪生殖及呼吸症候群病毒。在本申请案之另一方面中，较佳藉由上述方法获得的上述PCV-2抗原性组合物进一步包含猪肺炎支原体，较佳猪肺炎支原体菌苗，且更佳INGELVAC

MYCOFLEX或INGELVAC

MYCOFLEX中所包括的猪肺炎支原体菌苗。在另一方面中，本文所述之PCV-2抗原性组合物包含猪生殖及呼吸症候群病毒，较佳上述彼等任一者；及猪肺炎支原体，较佳上述彼等任一者。

当包含至少一种来自如上所述猪中至少一种其它致病有机体的另外抗原(较佳猪生殖及呼吸症候群病毒及/或猪肺炎支原体抗原)之PCV-2抗原性组合物藉由本文所述之方法获得时，该方法包含以下步骤：i)获得在第一液体中之PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体；及将该PCV-2抗原与至少一种另外抗原，较佳病毒或细菌抗原，且更佳来自猪中至少一种其它致病有机体的病毒或细菌抗原混合。较佳该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白，更佳PCV-2之重组ORF-2蛋白，且更佳ORF-2蛋白之病毒样粒子。较佳地，藉由以第二液体交换一部分第一液体自PCV-2抗原移除该部分第一液体。较佳以包含以下步骤之方式进行交换操作：a)将该第二液体添加至含有PCV-2抗原之该第一液体中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分该第一及第二液体，使PCV-2抗原与该第一液体之体积相比浓缩较佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。较佳地，多次，较佳两次，甚至更佳三次执行液体添加步骤及浓缩步骤。在该等情况下，不仅移除第一液体，而且移除第一液体与第二液体之混合物。较佳地，如上所述，实质上同时或依次执行各液体添加步骤。当依次执行浓缩步骤及液体添加步骤时，步骤之顺序无关紧要。此外，较佳使用过滤器(其较佳含有半透膜)，藉由过滤(较佳藉由透滤及/或超滤)进行浓缩步骤。该半透膜较佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将PCV-2抗原截留在过滤器内以便收获或回收之平均孔径。半透膜或本文中所用任何其它过滤器之平均孔径较佳防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质，更佳至少90％大小为75kDa至400kDa之蛋白质，且最佳至少90％大小为100kDa至300kDa之蛋白质通过。当制备呈全病毒或病毒样粒子之PCV-2抗原时，此孔径较佳。

如上文所定义之本发明提供制备PCV-2抗原及包含PCV-2抗原之免疫原性组合物的新方法，其中PCV-2抗原展示降低杀病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定义)，其中该方法包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体，ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。此外，本发明亦提供PCV-2抗原以及包含该PCV-2抗原之免疫原性组合物，该PCV-2抗原展示降低杀病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定义)。根据另一方面，PCV-2抗原以及包含展示降低杀病毒活性及/或提高免疫原性之纯化PCV-2抗原之免疫原性组合物可另外藉由下列方法(II)获得。本发明之纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)可藉由纯化PCV-2病毒制剂，尤其藉由纯化全病毒获得。全病毒制剂描述于例如WO 99/18214或WO 03/049703中。此外，纯化PCV-2抗原亦可藉由纯化重组表达之PCV-2抗原，较佳藉由纯化重组PCV-2ORF2抗原获得。制备重组PCV-2抗原(较佳制备重组PCV-2 ORF2抗原)之表达系统在此项技术中熟知且包括(但不限于)细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞或哺乳动物表达系统。表达PCV-2抗原之载体及制造及/或使用该等载体(或重组体)之方法在本申请案中别处描述。

较佳细胞为彼等易受含有PCV-2 ORF2 DNA且表达PCV-2 ORF2蛋白的适当重组病毒载体感染之细胞。细胞较佳为昆虫细胞，且其更佳包括以商标SF+昆虫细胞(Protein Sciences Corporation，Meriden，CT)出售之昆虫细胞。较佳细胞培养物具有介于约0.3-2.0×10⁶个细胞/毫升，更佳约0.35-1.9×10⁶个细胞/毫升，更佳约0.4-1.8×10⁶个细胞/毫升，甚至更佳约0.45-1.7×10⁶个细胞/毫升，且最佳约0.5-1.5×10⁶个细胞/毫升之间的细胞计数。

较佳之病毒载体包括杆状病毒，诸如BaculoGold(BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA)，尤其只要该等生产细胞为昆虫细胞。虽然杆状病毒表达系统较佳，但熟习此项技术者应了解其它表达系统(包括上述彼等)将用于本发明之目的，亦即用于表达PCV-2 ORF2抗原。

适当生长培养基亦将由熟习此项技术者确定，较佳之生长培养基为不含血清之昆虫细胞培养基，诸如Excell 420(JRH Biosciences，Inc.，Lenexa，KS)等等。

含有PCV-2 ORF2 DNA序列之重组病毒载体当用于感染易感细胞时具有介于约0.03-1.5，更佳约0.05-1.3，更佳约0.09-1.1，且最佳约0.1-1.0之间的较佳感染倍率(MOI)。上述MOI较佳系指1毫升细胞培养流体。本文所述之方法较佳包含以含有PCV-2 ORF2 DNA且表达PCV-2 ORF2抗原蛋白之重组病毒载体感染0.35-1.9×10⁶个细胞/毫升，更佳约0.4-1.8×10⁶个细胞/毫升，甚至更佳约0.45-1.7×10⁶个细胞/毫升且最佳约0.5-1.5×10⁶个细胞/毫升，该重组病毒载体之MOI(感染倍率)介于约0.03-1.5，更佳约0.05-1.3，更佳约0.09-1.1，且最佳约0.1-1.0之间。

接着培育受感染细胞至多10天时间，更佳约2天至约10天，更佳约4天至约9天，且最佳约5天至约8天。较佳培育条件包括约22-32℃，更佳约24-30℃，更佳约25-29℃，甚至更佳约26-28℃，且最佳约27℃之温度。较佳地，在接种之后观察SF+细胞之特征性杆状病毒诱导之变化。该观察可包括监测感染后期间细胞密度趋势及生存率降低。发现在感染之后3-5天观察到病毒滴度峰值且在感染后5至8天及/或当细胞生存率降低至小于10％时细胞中PCV-2 ORF2抗原产生达到峰值。

可藉由熟习此项技术者已知之标准方法，例如藉由Protein purificationmethods-a practical approach (E.L.V.Harris及S.Angal，编者，IRL Press atOxford University Press)中所述之彼等方法由收获物纯化PCV-2 ORF2抗原。彼等方法包括(但不限于)藉由离心及/或过滤进行分离、沉淀、大小排阻(凝胶过滤)层析、亲和性层析、金属螯合物层析、离子交换层析、共价层析、疏水性相互作用层析等。

PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之回收方法较佳以经由分离步骤将细胞碎片与已表达之PCV-2 ORF2抗原分离开始。较佳分离步骤包括过滤、在至多约20,000×g之速度下离心、连续流动离心、使用离子交换或凝胶过滤进行层析分离及常规免疫亲和方法。熟习此项技术者由例如(E.L.V.Harris及S.Angel(编者)，Protein purification methods-a practical approach，IRL PressOxford 1995)已知彼等方法。最佳分离方法包括在至多约20,000×g之速度下离心及过滤。较佳过滤方法包括死端型微过滤及切向流动(或交叉流动)过滤，包括中空纤维过滤死端型微过滤。在此等过滤方法中，死端型微过滤较佳。死端型微过滤之较佳孔径介于约0.30-1.35μm之间，更佳介于约0.35-1.25μm之间，更佳介于约0.40-1.1μm之间，且最佳介于约0.45-1.0μm之间。咸信任何常规滤膜将用于本发明之目的且聚醚砜膜较佳。在过滤步骤期间移除任何低分子量核酸物质。

PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之进一步纯化可藉由层析程序(较佳两步层析程序)实现。然而，若装载材料不包含细胞碎片，则亦可以层析程序起始。

若PCV-2抗原装配至病毒样粒子(VLP)中，则第一步骤较佳为大小排阻(凝胶过滤)层析，其可例如藉由使用Sephacryl S300基质进行。在实验室规模下，最佳使用HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而，可使用熟习此项技术者已知之任何其它大小排阻层析基质，其能够自培养滤液或上清液中分离出PCV-2 ORF2 VLP。合适之基质描述于例如E.L.V.Harris及S.Angel(编者)，Protein purification methods-a practical approach，IRL Press Oxford 1995)中。可例如藉由以1.0mL/min之流动速率用包含PCV-2抗原之粗制剂装载管柱且以1.5个管柱体积的包含20mMTris(pH 6.5)、5mM DTT之缓冲液洗脱管柱来进行凝胶过滤层析。然而，亦可藉由使用亲和性层析，例如，经由选择性结合至已固定化PCV-2 ORF2特异性抗体或熟习此项技术者已知之任何其它方法纯化PCV-2 ORF2抗原。

因此，根据一较佳实施方案，包含纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)及佐剂之免疫原性组合物可藉由包含以下步骤之方法获得：

a)在宿主细胞中表达PCV-2抗原，较佳PCV-2 ORF2抗原；

b)收获获得PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之细胞培养物；

c)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)纯化包含PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之收获物；

d)将纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)与佐剂混合。

根据一较佳实施方案，如本文所述，较佳如实施例3中所述执行大小排阻层析。较佳地，大小排阻产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过80％(w/w)，较佳超过90％(w/w)纯度等级之免疫原性组合物。可在使用NuPAGE MOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDS PAGE之后，藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色来评估纯度等级。

为了获得更高纯度等级，可进行不同于第一步骤之第二层析步骤。举例而言，若第一纯化步骤/层析步骤为大小排阻(凝胶过滤)，则第二步骤应不同于其，为例如亲和性层析、离子交换层析等。

较佳地，若纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)之第一步骤为大小排阻(凝胶过滤)层析，则第二步骤可为离子交换层析，较佳阴离子交换层析(AIEX)。用于纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之较佳阴离子交换层析基质为Q Sepharose。在约50ml之小规模中，最佳使用5ml HiTrap QSepharose HP管柱。可例如如实施例3中所述进行阴离子交换层析。简言之，可将来自大小排阻层析步骤之约50ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min之流动速率装载于AIEX管柱上。在使用例如20mM Tris(pH 6.5)、5mM DTT移除未结合材料之洗涤步骤之后，可以8个管柱体积之下列缓冲液(20mM Tris(pH6.5)、5mM DTT、1.0M NaCl)之单一步骤洗脱蛋白质。可将来自AIEX跑柱之流过物装载回Q Sepharose管柱上且如上所述进行洗脱以提高产率。此两步技术(大小排阻继之以阴离子交换层析)将PCV-2 ORF2抗原与培养收获物之大部分其它蛋白组份有效地分离。

因此，根据一较佳实施方案，包含纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)及佐剂之免疫原性组合物可藉由包含以下步骤之方法获得：

a)在宿主细胞中表达PCV-2抗原，较佳PCV-2 ORF2抗原；

b)收获获得PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之细胞培养物；

c)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)，继之以阴离子交换层析纯化包含PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之收获物；

d)将纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)与佐剂混合。

根据一较佳实施方案，如本文所述，较佳如实施例3中所述执行大小排阻层析及阴离子交换层析。较佳地，两步纯化策略产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过90％(w/w)，较佳超过95％(w/w)纯度等级之免疫原性组合物。可在使用NuPAGE MOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDS PAGE之后，藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色来评估纯度等级。

如上所述，PCV-2抗原(较佳PCV ORF2抗原)之回收方法以经由分离步骤将细胞碎片与已表达之PCV-2 ORF2抗原分离开始。较佳分离步骤包括经由具有约0.6μm至约2μm之孔径，较佳具有约0.8mm至约1.2μm之孔径的过滤器进行微过滤。

因此，包含纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)及佐剂之免疫原性组合物可藉由包含以下步骤之方法获得：

a)在宿主细胞中表达PCV-2抗原，较佳PCV-2 ORF2抗原；

b)收获获得PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之细胞培养物；

c)经由具有0.6至2.0μm之孔径的过滤器过滤在步骤b)获得的收获物；

d)藉由大小排阻层析(凝胶过滤)，视情况继之以阴离子交换层析纯化包含PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)且在步骤c)获得之滤液；并

e)将纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)与佐剂混合。

根据一较佳实施方案，如本文所述，较佳如实施例3中所述执行微过滤、大小排阻层析及阴离子交换层析。较佳地，包括预过滤步骤的两步纯化策略产生具有以在与佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过90％(w/w)，较佳超过95％(w/w)纯度等级之免疫原性组合物。可在使用NuPAGE MOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDS PAGE之后，藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色来评估纯度等级。

包含纯化PCV-2抗原(较佳本文所述之纯化PCV-2 ORF2抗原)之免疫原性组合物(较佳可藉由本文所述之方法获得者)之特征在于与不包含该纯化PCV-2抗原或纯化PCV-2 ORF2抗原之免疫原性组合物相比提高的免疫原性。

若使用诸如重组痘病毒、腺病毒或杆状病毒之病毒载体制备PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)，则建议藉由适当灭活处理来灭活病毒核酸。该灭活可在纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)期间的任何时间进行。因此，灭活可在收获包含PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之细胞培养流体之后，或在微过滤PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之后(若进行微过滤)，在纯化步骤之前或之后，例如在凝胶过滤之前或之后，且在阴离子交换层析之前或之后(若进行此操作)进行。

任何常规灭活方法可用于本发明之目的。因此，可藉由化学及/或物理处理执行灭活。在较佳形式中，测定收获流体之体积且使温度介于约32℃-42℃，更佳约34℃-40℃，且最佳约35℃-39℃之间。较佳灭活方法包括添加较佳浓度为约1至约20mM，较佳约2至约10mM，更佳约2至约8mM，更佳约3至约7mM，最佳约5mM之环化二元乙撑亚胺(BEI)。举例而言，灭活包括向流体中添加较佳约0.4M之2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(其已环化为0.2M二元乙撑亚胺(BEI))于0.3N NaOH中之溶液以得到约5mM BEI之最终浓度。较佳接着连续搅拌流体2-96小时且可将灭活收获流体冷冻储存于-40℃或-40℃以下或约1℃-7℃之间。在完成灭活之后，添加较佳1.0M之硫代硫酸钠溶液以中和任何剩余BEI。较佳添加与在灭活之前添加的BEI相比等量的硫代硫酸钠。举例而言，若添加BEI至5mM之最终浓度，则添加1.0M硫代硫酸钠溶液以得到5mM之最终最小浓度，以中和任何剩余BEI。

在将纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)与佐剂混合之前，亦建议使纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)相对于磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)或任何其它生理缓冲液透析。

上述方法产生具有如本文中所定义之降低杀病毒活性以及改良免疫原性之PCV-2抗原，倘若该PCV-2抗原具有以在与任何佐剂混合之前免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过50％(w/w)，较佳超过70％(w/w)，甚至更佳超过80％(w/w)，甚至更佳超过85％(w/w)，甚至更佳超过90％(w/w)，最佳超过95％(w/w)之纯度等级。然而，可根据方法II获得的纯化PCV-2抗原亦可与佐剂(较佳与本文所述之任何佐剂)混合且一起使用。较佳佐剂为卡波莫，其较佳浓度为约0.1至10mg/mL，更佳浓度为0.5至5mg/mL，最佳为约1mg/mL最终免疫原性组合物。

再者，本发明不仅提供本文所述之任何方法(包括替代性方法II)，其亦提供可藉由本文所述之任何方法(包括替代性方法II)获得的PCV-2抗原，较佳纯化PCV-2抗原，最佳纯化PCV-2 ORF-2蛋白。此外，本发明亦提供可藉由本文所述之任何方法(包括替代性方法II)获得的包含PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2抗原，最佳纯化PCV-2 ORF-2蛋白)之PCV-2抗原性组合物。在最终免疫原性组合物中的PCV-2抗原(详言之纯化PCV-2 ORF2抗原)之量以最终免疫原性组合物计应在每剂量约0.25至约400μg之范围内。较佳地，最终免疫原性组合物应包括含量在每剂量约2至约200μg，甚至更佳每剂量约3至约150μg，更佳每剂量约4至约100μg，更佳每剂量约5至约80μg，更佳每剂量约6至约60μg，甚至更佳每剂量约7至约50μg，甚至更佳每剂量约8至约40μg，更佳每剂量约8至约32μg，甚至更佳每剂量约8至约24μg且最佳每剂量约8至约16μg范围内之PCV-2抗原，较佳PCV-2 ORF2抗原。

本文所提供之免疫原性组合物(包括彼等可藉由方法II获得者)包含一或多种来自另一致病有机体的另外抗原。上文定义彼等“另一致病有机体”。该另外抗原较佳为猪生殖及呼吸症候群病毒。该猪生殖及呼吸症候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳包含经修饰之活病毒。该经修饰之猪生殖及呼吸症候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存编号VR 2332之经修饰之活病毒株，且更佳包含INGELVAC

PRRS MLV。在本申请案之另一方面中，该另外抗原为猪肺炎支原体。该猪肺炎支原体抗原较佳为菌苗，且该猪肺炎支原体菌苗更佳为INGELVAC

MYCOFLEX。最佳为猪生殖及呼吸症候群病毒与猪肺炎支原体两种抗原的组合。

由于包括本文所提供之纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)之免疫原性组合物的免疫原性提高，所以与不接受该免疫原性组合物之动物相比，该免疫原性组合物可用于降低或减轻由PCV-2感染所引起或与PCV-2感染相关的临床征象之发生率或严重程度。

术语“临床征象之发生率降低或严重程度减轻”应意谓接受疫苗投药之动物与动物“对照组”相比，该等征象中之任一者的发生率降低或严重程度减轻，两种动物均已受产生免疫活性组份的病原体感染或攻毒且其中对照组并未接受疫苗或免疫原性组合物之投药。在此情况下，术语“减轻”或“降低”意谓与不接种疫苗之对照组相比，已接种疫苗组有至少10％，较佳25％，甚至更佳50％，最佳超过100％的降低。

如本文中所用，“临床症状”或“临床征象”系指可由活动物直接观察到的病原体感染之征象，诸如症状。代表性实例将视所选病原体而定，可包括诸如流涕、嗜睡、咳嗽、发烧、体重增加或减轻、脱水、腹泻、肿胀、跛行等等。PCV-2临床征象可包括消瘦、皮肤苍白、身体憔悴、呼吸窘迫、腹泻、黄疸及脓病。

动物由PCV-2感染引起或与PCV-2感染相关的临床征象之发生率降低或严重程度减轻可藉由向需要该处理之动物仅施用单剂量之该免疫原性组合物而实现。然而，本文所提供之免疫原性组合物亦可以两个或两个以上剂量施用，首次剂量与任何后续剂量之施用间隔时间为2至4周。因此，根据另一实施方案，可向有需要之动物以一个、两个或两个以上剂量施用本文所提供之包括纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF2抗原)的免疫原性组合物。

详言之，在本申请案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物当向动物施用时使动物之淋巴流失及炎症与不接受该免疫原性组合物之动物相比减轻至少80％。因此，在本申请案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物且该免疫原性组合物使已接受该免疫原性组合物投药之动物的淋巴流失及炎症与不接受该免疫原性组合物之动物相比减轻至少80％。

在本申请案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物当向动物施用时使动物之肺病变与不接受该免疫原性组合物之动物相比减轻至少80％。因此，在本申请案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物且该免疫原性组合物使已接受该免疫原性组合物投药之动物的肺病变与不接受该免疫原性组合物之动物相比减轻至少80％。

在本发明之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性组合物之免疫原性组合物，其中在施用一个剂量之该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PCV-2之保护性免疫反应。包含PCV-2抗原性组合物之免疫原性组合物可为任何体积，包括1ml、2ml、3ml、4ml、5ml及5ml以上。在较佳形式中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量之该PCV-2抗原。因此，在本发明之另一方面中，提供如上所述之免疫原性组合物，其中在施用一个剂量之该免疫原性组合物之后，包含PCV-2抗原性组合物之该免疫原性组合物诱导针对PCV-2之保护性免疫反应。在另一方面中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量之该PCV-2抗原。

如本文中所用，“保护性免疫反应”系指相关病原体感染之临床、病理学或组织病理学征象或症状的发生率降低或严重程度减轻，直至且包括完全预防该等征象或症状。

术语“病理学”征象系指在显微镜或分子层面上经由生物化学试验，或尸检时肉眼可观察之感染征象。对于PCV-2而言，病理学征象将包括多个组织及器官上显微镜及肉眼可见的病变，淋巴器官为最常见之病变部位。

术语“病理组织学”征象系指由感染引起的组织变化之征象。

术语“临床症状”或“临床征象”由上文定义。

在本发明之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性组合物及PRRRS抗原(较佳本文所述之任一PRRS抗原)的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量之该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒之保护性免疫反应。再者，可制备任何剂量体积，但在较佳形式中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量之该PRRS抗原及一个剂量之该PCV-2抗原。因此，在本发明之另一方面中，提供如上所述之包含PRRSV及如本文所述之PCV-2抗原性组合物的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量之该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PRRS之保护性免疫反应。在另一方面中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量之该PRRS抗原及一个剂量之该PCV-2抗原。

在本发明之另一方面中，提供包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及如上所述之猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物，其中在施用一个剂量之该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对猪肺炎支原体之保护性免疫反应。再者，可制备任何剂量体积，但在较佳形式中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量之该猪肺炎支原体抗原及一个剂量之PCV-2抗原。因此，在本发明之另一方面中，提供如上所述之免疫原性组合物，其中在施用一个剂量之包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及猪肺炎支原体抗原之该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对猪肺炎支原体之保护性免疫反应。在另一方面中，2ml该免疫原性组合物包含一个剂量之该猪肺炎支原体抗原。

在本申请案之另一方面中，如上所述之免疫原性组合物制备成每剂量施用2毫升。

在本申请案之另一方面中，提供一种使动物PCV-2感染之一或多种临床症状与不接受该免疫原性组合物之动物相比减轻的方法。一般而言，该方法包含向动物施用任一包含如上所述之PCV-2抗原性组合物之该免疫原性组合物的步骤。较佳地，在施用单剂量之该免疫原性组合物之后PCV-2感染之一或多种临床症状减轻。因此，根据本申请案之另一方面，提供一种使动物PCV-2感染之一或多种临床症状与不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物之该免疫原性组合物之动物相比减轻的方法。一般而言，该方法包含向动物施用任一包含上述PCV-2抗原性组合物之该免疫原性组合物的步骤，其中较佳在施用单剂量之包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物的该免疫原性组合物之后PCV-2感染之一或多种临床症状减轻。

在本申请案之另一方面中，提供一种使动物PRRS感染之一或多种临床症状与不接受该免疫原性组合物之动物相比减轻的方法。一般而言，该方法包含向动物施用任一上述包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及如本文所述之PRRS病毒的该免疫原性组合物的步骤。较佳地，在施用单剂量之包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及如本文所述之PRRS病毒的该免疫原性组合物之后PRRS感染之一或多种临床症状减轻。因此，根据本申请案之另一方面，提供一种使动物PRRS感染之一或多种临床症状与不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及如本文所述之PRRS病毒的该免疫原性组合物之动物相比减轻的方法。猪生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)之临床征象包括(但不限于)食欲不振、发热、流产、短暂变色、乏情期延长、咳嗽、呼吸征象、乳房炎、无乳、嗜睡、木乃伊化仔猪、死产、新生仔猪虚弱、母猪产仔率减少、早产、腹泻、消瘦、打喷嚏、眼分泌物、皮肤苍白、死亡及其组合。

在本申请案之另一方面中，提供一种使动物猪肺炎支原体感染之一或多种临床症状与不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及如本文所述之猪肺炎支原体抗原的该免疫原性组合物之动物相比减轻的方法。一般而言，该方法包含向动物施用任一上述该免疫原性组合物的步骤。较佳地，在施用单剂量之包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及如本文所述之猪肺炎支原体抗原之该免疫原性组合物之后猪肺炎支原体感染之一或多种临床症状减轻。因此，根据本申请案之另一方面，提供一种使动物猪肺炎支原体感染之一或多种临床症状与不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性组合物及如本文所述之猪肺炎支原体抗原的该免疫原性组合物之动物相比减轻的方法。猪肺炎支原体(M.hyo)感染之临床症状包括(但不限于)干咳、动作障碍(impairedperformance)及肺病变。

包含如本文所提供之纯化PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)之免疫原性组合物具有改良免疫原性。因此，本文所提供之免疫原性组合物适用于改良接受该免疫原性组合物之动物的免疫反应。因此，根据另一实施方案，本发明提供一种改良动物针对PCV-2之免疫反应的方法，其包含以下步骤：向有需要之动物施用如本文所述具有本文所提供之纯化PCV-2抗原(较佳纯化PCV-2 ORF-2蛋白)的免疫原性组合物。根据一较佳方面，将用于该方法中之PCV-2抗原(较佳PCV-2 ORF2抗原)纯化至以免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计超过60％(w/w)，较佳超过60％(w/w)，甚至更佳超过70％(w/w)，甚至更佳超过80％(w/w)，甚至更佳超过90％(w/w)，最佳超过95％(w/w)之程度。可在使用NuPAGE MOPS缓冲系统(Invitrogen)，经由NuPAGE 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行SDS PAGE之后，藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色来评估纯度等级。可使用熟习此项技术者所熟知之常规方法纯化PCV-2，且较佳PCV-2 ORF2。

附图说明

下面的附图构成本说明书的一部分，而且被包括用来进一步演示本发明的某些方面。通过参照一或多幅这些附图，结合本文所示具体实施方案的详述，可以更好地理解本发明。

图1显示使用10％Bis-Tris/MOPS凝胶的超滤组态中试规模的结果，展示过滤方法之后ORF2的存在。如下装载各道：(1)标志物；(2)n/a；(3)n/a；(4)24-180/181浓缩前-20μl；(5)25-180/181 1倍抗原-20μl；(6)26-180/181过滤器洗涤液-20μl；(7)27-PCV 504浓缩前-8μl；(8)28-PCV 504透过物-20μl；(9)29-PCV 504 1倍-20μl；(10)092704PD-20μl；(11)标志物。

详述

以下实施例阐述根据本发明之较佳材料及程序。然而，应了解仅仅经由说明提供此等实施例且不应认为其中之实施例限制本发明之总范畴。

实施例1

此实施例描述制造具有降低杀病毒活性之浓缩PCV-2ORF2抗原之实验室规模及中试规模方法与不包括本发明步骤之制造方法的比较。特定言之，将确定本发明对PCV-2 ORF2抗原对PRRS病毒之杀病毒活性之作用。

材料及方法

生产抗原：

实验室规模：

PCV SUB037 H1-F，18.94kg

PCV 1025，20.6kg

PCV 180/181，20.0kg

PCV SUB 504PD，40kg

中试规模：

PCV SUB 506PD，362kg

PCV SUB 507PD，384kg

PCV SUB 512PD，430kg

PCV SUB 513PD，405kg

超滤滤筒：GE Healthcare，Steam-In-Place(SIP)，中空纤维膜滤筒

UFP-100-E-55-STM：100,000NMWC，1mm直径之小管；用于X109中之UF-002中，实验室规模。

UFP-300-E-55-STM：300,000NMWC，1mm直径之小管；用于X109中之UF-002中，实验室规模。

UFP-100-E-65-MSM：100,000NMWC，1mm直径之小管；用于APU-1中之UF-B2614中，中试规模。

UFP-300-E55-SMO：300,000NMWC，1mm直径之小管；用于VP-1中之UF-2713中，中试规模。

下列超滤设备系用于可行性评估及初始方法开发中：

表1.设备

制造方法：

超滤(UF)组态：实验室规模

以GE Healthcare(Amersham)Flex Stand 30L容量之UFskid #002进行的浓缩方法中使用含有在构筑(building)P中产生的经过滤、灭活、中和之PCV-2ORF2材料之50公升藤护坛。

初始浓缩制程使用“成批”透滤流程，藉以将约20kg抗原材料转移至UF skid中且经由100,000NMWC中空纤维滤筒(UFP-100-E-55-STM)浓缩。100,000NMWC浓缩制程使用分别来自PD及制造之PCV-2 ORF2批次SUB037PD及PCV1025材料。

初始两轮浓缩原始体积约4倍且在进料槽中具体量化(Q.S.′d，quantitysubstantiated)回原始转移体积。以此方式处理浓缩材料，每批号总共进行2次浓缩，第三次及最后一次浓缩收获作为浓缩物且一部分具体量化为1倍原始体积。在浓缩前、每次浓缩步骤及每次具体量化步骤时抽取样品。在每次浓缩步骤期间抽取透过样品。

接下来的连续两轮在不用盐水洗涤之情况下浓缩PCV-2 ORF2抗原。在约4倍及接着最后一次浓缩时对浓缩材料取样。将约20kg抗原材料转移至UFskid储料槽中且经由300,000NMWC中空纤维滤筒(UFP-300-E-55-STM)浓缩。将第二个20L体积添加至含有来自首个20L之浓缩物的储料槽中。将其浓缩至最终体积。300,000NMWC浓缩制程使用分别由Manufacturing及PD生产的PCV-2 ORF2批次PCV 180/181汇集物及SUB504PD。在浓缩前及每次浓缩步骤时抽取样品。在每次浓缩步骤期间抽取透过样品。

超滤组态：中试规模

中试规模方法使用SUB批次506PD、512PD及513PD。浓缩前之抗原体积在约350L至430L范围内。将SUB506PD及SUB513PD批次转移至DSP(下游处理)2602且使用表面积为4.2m²之100,000NMWC过滤器(UFP-100-65-E-MSM)，在APU-1中以UF-B2614进行浓缩。将SUB512PD转移至DSP2701且使用表面积为2.1m²之300,000NMWC过滤器(UFP-300-E-SMO)，以UF-2713进行浓缩。对于每个批次，收获最终浓缩材料且在4℃下储存以供分析。

结果及结论

超滤(UF)组态：实验室规模

以100,000NMWC(100kDa)对比300,000NMWC(300kDa)过滤器进行之过滤在浓缩时间上相当且当考虑到全规模方法时系可行的。100kDa过滤器之过滤时间在浓缩4倍时(约18L至26L)在14分钟至32分钟之范围内，盐水洗涤步骤产生较短时间(表2)。300kDa过滤器之过滤时间(在浓缩3.2倍、7倍(对于PCV180/181)及21.5倍(对于SUB504PD)时)为在25分钟时得到3.2倍，在23分钟时得到7倍且在32分钟时得到21.5倍，其中约40L材料以两个连续20L体积浓缩。由于需要时间使浓缩制程达到10.25psi之目标跨膜压力(TMP)，因此预见到有一些时间变化。

制程通量值对于PCV180/181批次而言在27.43lmh至32.00lmh之范围内，由朝向浓缩制程终点之尖峰(spike)产生32.00lmh的值。SUB 504PD材料之通量值在首个20L浓缩期间为28.57lmh且在第二个20L浓缩期间为35.71lmh。(表3及4)

表2.制程数据

表3.制程数据

表4.制程数据

当浓缩材料具体量化回1倍体积时，发现过滤后无效能变化，SUB 037复原材料及PCV 1025复原材料亦如此。浓缩抗原含量值使得检定之限值超过约64μg之验证限值，如在表5至8中之值所见，其中抗原含量与预期计算量相比。来自使用SUB 037、PCV 180/181及SUB 504PD抗原执行的浓缩之透过值展示过滤不造成显著材料损失。所有透过抗原含量均在检定之不可检测范围内。未收集PCV 1025抗原之透过抗原含量。

表5.SUB 037之PCV-2抗原含量变化(以μg计)

表6.PCV 1025之PCV-2抗原含量变化(以μg计)

表7.PCV-2抗原含量之变化(以μg计)

表8.PCV-2抗原含量之变化(以μg计)

以来自R&D之PCV 180/181及SUB 504PD材料进行SDSPAGE凝胶跑胶。图1中位于约27kDa处之ORF2纹带与道10中的参考物之带型一致。早先已确定此纹带大小为ORF2。来自SUB 504PD(300kDa过滤浓缩)之透过材料显示删除在27kDa位置处之纹带。在此孔径过滤器处显然无ORF2蛋白损失。在还原条件下进行跑胶。

测试浓缩前抗原、浓缩抗原、复原抗原及过滤透过物针对PRRS病毒疫苗之杀病毒活性。SUB 037浓缩前及浓缩(100kDa过滤器)材料(已用盐水复原回1倍)之品质控制(QC)初始结果不符合要求。然而，当将浓缩材料调配至疫苗中时，疫苗中至多80％内含物之浓度降低此杀病毒活性至符合要求之水平，完全在0.7log/ml PRRS病毒滴度损失之接受限值之下。来自SUB 037之透过材料展示接近不符合要求之杀病毒活性水平的界线。参见表9。

发现PCV 1025浓缩前材料对PRRS之杀病毒活性不符合要求，PRRS滴度损失为1.5log/ml。三种用盐水复原之浓缩(100kDa过滤器)材料具有0.5log/ml损失及0.6log/ml损失，一种复原浓缩物因PRRS滴度“无变化”而符合要求。不测试此批次之透过样品。参见表10。

PCV 180/181浓缩前疫苗材料在所制备的3种疫苗中有2种对PRRS之杀病毒活性不符合要求。抗原内含物百分比水平在37.0％至55.5％之范围内。发现最高内含物％的浓缩前疫苗符合要求。

发现自1倍(以盐水复原至1倍之浓缩物)材料制备之疫苗对PRRS病毒之杀病毒活性符合要求。抗原内含物百分比水平在44％至66％之范围内。参见表11。

自浓缩前抗原所制备的具有79.5％疫苗内含物之SUB504PD疫苗对PRRS病毒之杀病毒活性符合要求。自4.3倍浓缩抗原制备的具有23.5-35％疫苗内含物之疫苗及自21.5倍浓缩抗原制备的具有3.5-5.5％疫苗内含物之疫苗亦符合要求。最后，发现所制备的具有72％内含物水平之过滤器洗涤液抗原对PRRS病毒之杀病毒活性符合要求。

表9.SUB 037杀病毒活性

表10.PCV 1025杀病毒活性

表11.PCV 180/181杀病毒活性

表12.SUB 504PD杀病毒活性

表13.制程数据

表14.制程数据

表15.制程数据

讨论

2型猪环状病毒疫苗杀灭杆状病毒载体为由Boehringer IngelheimVetmedica，Inc.(St.Joseph，Missouri)制造的全球性产品且用于INGELVACCIRCOFLEX产品中。在收获时，将病毒流体以无菌方式经由一或多个2-15μm预过滤器过滤随后经由0.8-1.0μm过滤器进行最终过滤。将BEI(二元乙撑亚胺)储备溶液添加至收获流体中至5mM BEI之最终浓度。连续搅拌流体最少72小时且最多96小时且可在≤40℃或在4℃±3℃下冷冻储存。添加1.0M硫代硫酸钠溶液至5mM之最终浓度以中和任何剩余BEI。

将中和抗原与0.5％卡波莫溶液掺和至20％v/v，藉由添加盐水调整最终产物中之PCV-2 ORF2蛋白含量以满足大于或等于1.0之相对效能的最小释放需要。在混合在一起(bulking)之后，可将系列液在4℃储存或填充。

在中和后，藉由中空纤维滤筒超滤浓缩PCV-2 ORF2材料。以两个透滤体积之盐水溶液进一步处理浓缩材料。测定出较佳超滤标称分子量截断(NMWC)孔径包括100,000NMWC及300,000NMWC，其中各者具有1.0mm管腔直径。两种孔径均包括在内以便在制造商中断供应过滤器滤筒时提供制造灵活性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)凝胶及效能数据指示两个过滤器孔径之间的抗原蛋白或效能无差异。

实施例2

此实施例比较使用本发明方法与使用先前技术中已知方法的ORF2相对产率。应了解此实施例表示用于获得为本发明方法及组合物使用的PCV-2ORF2之许多可能方法中的一种。

材料及方法

将四个1000mL旋转烧瓶各自以大约1.0×10⁶个Sf+细胞/毫升接种于300mL无血清昆虫培养基Excell 420(JRH Biosciences，Inc.，Lenexa，KS)中。将母细胞培养物标识为SF+(草地黏虫(Spodoptera frugiperda))母细胞储备物(Master Cell Stock)，第19代，批号N112-095W。由Protein Sciences Corporation，Inc.，Meriden，CT获得用于产生SF+母细胞储备物之细胞。将此实施例之SF+细胞系限制在第19代与第59代之间。其它继代可用于本发明之目的，然而为了将方法规模扩大至大规模生产，至少19代将为必需的且超过59之继代可能对表达有影响，但此未作研究。更详言之，在恒定搅动下，使来自液氮贮槽之初始SF+细胞培养物悬浮生长于无菌旋转烧瓶中的Excell 420培养基中。使培养物生长于含有25mL至150mL Excell 420无血清培养基之100mL至250mL旋转烧瓶中。当细胞繁殖至1.0-8.0×10⁶个细胞/毫升之细胞密度时，将其以0.5-1.5×10⁶细胞/毫升之种植密度分至新容器中。使后续扩增培养物于高达36公升容量之旋转烧瓶中或高达300公升容量之不锈钢生物反应器中在25℃-29℃生长2-7天。

接种后，将烧瓶在27℃培养四小时。随后，用含有PCV-2 ORF-2基因(SEQID NO：4)之重组杆状病毒接种各烧瓶。如下产生含有PCV-2 ORF2基因之重组杆状病毒：将来自PCV-2北美株的PCV-2 ORF2基因PCR扩增以含有5′Kozak序列(SEQ ID NO：1)及3′EcoR1位点(SEQ ID NO：2)，克隆至pGEM-T-Easy载体(Promega，Madison，WI)中。随后，将其切出且亚克隆至转移载体pVL1392(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)中。亚克隆部分在本文中以SEQ ID NO：7表示。含有PCV-2 ORF2基因之pVL1392质粒称为N47-064Y且随后将其与BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen)杆状病毒DNA一起共转染至Sf+昆虫细胞(Protein Sciences，Meriden，CT)中以产生含有PCV-2 ORF2基因之重组杆状病毒。新构建体在本文中以SEQ ID NO：8提供。将含有PCV-2 ORF2基因之重组杆状病毒空斑纯化且将母种病毒(MSV)在SF+细胞系上增殖，制成等分试样且在-70℃储存。藉由PCR-RFLP使用杆状病毒特异性引物将MSV正性鉴别为PCV-2 ORF2杆状病毒。如在间接荧光抗体检定中由多克隆血清或单克隆抗体所检测，感染有PCV-2 ORF2杆状病毒以产生MSV或工作病毒种株之昆虫细胞表达PCV-2 ORF2抗原。另外，藉由N-末端氨基酸测序确证PCV-2 ORF2杆状病毒之身分。亦根据9 C.F.R.113.27(c)，113.28及113.55测试PCV-2 ORF2杆状病毒MSV之纯度。接种至旋转烧瓶中之每一重组杆状病毒具有不同感染倍率(MOI)。烧瓶1用7.52mL之.088MOI种株接种；烧瓶2用3.01mL之0.36MOI种株接种；烧瓶3用1.5mL之0.18MOI种株接种；且烧瓶4用0.75mL之0.09MOI种株接种。

用杆状病毒接种后，随后将烧瓶在27℃±2℃培养7天且在彼时间期间，亦以100rpm搅动。该等烧瓶使用通风盖以允许空气流动。在接下来之7天，每24小时自每一烧瓶取样。取出后，将每一样品离心且将团粒及上清液两者分离且随后经由0.45μm-1.0μm孔径之薄膜微过滤。

结果及结论

随后，经由ELISA检定，定量所得样品中存在之ORF2之量。以在0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中1∶6000稀释之蛋白G纯化(在PBS中1∶250稀释)之捕捉抗体猪抗PCV-2 Pab IgG进行ELISA检定。接着将100μL抗体置于微量滴定盘之孔中，密封且在37℃培育隔夜。接着以包含0.5mL Tween 20(Sigma，St.Louis，MO)、100mL 10X D-PBS(Gibco Invitrogen，Carlsbad，CA)及899.5mL蒸馏水之洗涤溶液洗涤该盘三次。随后，将250μL封闭溶液(于10mL D-PBS中之5g Carnation脱脂奶粉(Nestle，Glendale，CA)，用蒸馏水补足至100mL)添加至每一孔中。下一步为洗涤测试盘且随后添加预先稀释之抗原。藉由将200μL稀释剂溶液(于999.5mL D-PBS中之0.5mL Tween 20)添加至稀释盘上之每一孔中产生预先稀释之抗原。随后，将样品以1∶240之比率及1∶480之比率稀释，随后将100μL此等稀释样品之每一者添加至稀释盘上之一个顶部孔中(亦即，一个顶部孔容纳100μL之1∶240稀释物且另一者容纳100μL之1∶480稀释物)。随后，藉由自每一连续孔移出100μL且将其转移至盘上之下一个孔中来对盘中剩余者进行连续稀释。将每一孔混合，然后进行下一次转移。测试盘之洗涤包括用洗涤缓冲液洗涤该盘三次。随后，将该盘密封且在37℃培养一小时，然后用洗涤缓冲液再洗涤三次。所使用之检测抗体为PCV ORF2之单克隆抗体。将检测抗体以稀释剂溶液1∶300稀释，随后将100μL经稀释检测抗体添加至孔中。随后，将该盘密封且在37℃培养一小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。随后，藉由将正常家兔血清(Jackson Immunoresearch，WestGrove，PA)添加至稀释剂溶液中至1％浓度来制备缀合稀释剂。将缀合抗体山羊抗小鼠(H+1)-HRP(Jackson Immunoresearch)在缀合稀释剂中1∶10,000稀释。接着将100μL经稀释缀合抗体添加至每一孔中。随后，将该盘密封且在37℃培养45分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。将与等体积过氧化物酶底物B(KPL)混合之100μL底物(TMB过氧化物酶底物，Kirkgaard and PerryLaboratories(KPL)，Gaithersberg，MD)添加至每一孔中。将该盘在室温下培养15分钟。随后，将100μL之1N HCl溶液添加至所有孔中以终止反应。随后，使该盘通过ELISA读取器。

此检定之结果提供于下表17中：

表17

天数	烧瓶	团粒中之ORF2(μg)	上清液中之ORF2(μg)
				3	1	47.53	12
3	2	57.46	22
				3	3	53.44	14
3	4	58.64	12
				4	1	43.01	44
4	2	65.61	62
				4	3	70.56	32
4	4	64.97	24
				5	1	31.74	100
5	2	34.93	142
				5	3	47.84	90
5	4	55.14	86
				6	1	14.7	158
6	2	18.13	182
				6	3	34.78	140
6	4	36.88	146
				7	1	6.54	176
7	2	12.09	190
				7	3	15.84	158
7	4	15.19	152

此等结果表明当培育时间延长时，表达至离心细胞及培养基之上清液中的ORF2多于表达至离心细胞及培养基之团粒中的ORF2。因此，使ORF2表达进行至少5天且在上清液中回收而非使表达进行少于5天且自细胞回收ORF2提供ORF2产率之极大提高及优于先前方法之显著改良。

实施例3

藉由微过滤方法继之以两步层析流程实现ORF2之纯化。经由孔径为1.2μm之微过滤膜过滤实施例1中获得的收获物。接着藉由大小排阻(凝胶过滤)使用HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱纯化微过滤物。将20ml包含PCV-2ORF2之滤液的起始样品以1.0ml/min之流动速率装载至HiPrep 26/60Sephacryl S300HR管柱上且以1.5个管柱体积之缓冲液A(20mM Tris(pH 6.5)，5mM DTT)洗脱。在洗脱步骤期间收集8毫升级分。汇集来自大小排阻层析之第10-16号级分(微量滴定盘(milititer)10至16洗脱液)且将其用作阴离子交换(AIEX)层析之起始样品。此等级分表示大小分级管柱(sizing column)之空隙体积，其中PCV-2 ORF2因PCV-2 ORF2蛋白之较大分子量而洗脱出。此项技术将ORF2与抗原样品之大部分其它蛋白组份有效地分离。

使用5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱执行AIEX。将来自大小排阻实验之约48ml空隙体积级分汇集物以3.0ml/min之流动速率装载于AIEX HiTrap QSepharose HP管柱上。在以装载缓冲液A(20mM Tris(pH 6.5)，5mM DTT)进行洗涤步骤移除未结合材料之后，以8个管柱体积之缓冲液B(20mM Tris(pH6.5)、5mM DTT、1.0M NaCl)之单一步骤洗脱蛋白质且收集5ml级分。收集且汇集第8号及第9号级分峰。将来自AIEX跑柱之流过物装载回Q琼脂糖管柱上且如上所述进行洗脱。将来自第二轮的第7号、第8号及第9号级分与来自第一轮之级分汇集在一起。第三轮流过材料并未在洗脱液中产生显著级分峰，因此此轮未留下级分。

在4℃使约25ml之级分汇集物相对于2公升之磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4，Gibco)透析隔夜。在透析之后，基于SDS-PAGE分析，ORF2之纯度＞95％。

实施例4

制备2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)、氢氧化钠(NaOH)及硫代硫酸钠(Na2S2O3)之溶液。藉由称取1.63g BEA(Sigma，B65705，批号05316EE)且溶解于20ml纯水(dH2O，蒸馏水，此处：“水”)中制得BEA溶液。此溶液之最终浓度为0.4M BEA。藉由称取0.33g NaOH(JTBaker，3722-01，批号E01470)且溶解于20ml水中制得NaOH溶液。此溶液之最终浓度为0.41M NaOH。藉由称取25g Na2S2O3(Sigma S7026，批号106K0178)且溶解于100ml水中制备硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液。一旦溶解之后，使溶液经由0.2μm瓶顶过滤器过滤以除菌。此溶液之最终浓度为1.0M Na2S2O3。

为了制备二元乙撑亚胺(BEI)，将20ml 0.4M BEA溶液与20ml 0.41MNaOH混合且测定初始pH值为约12.5-14.0。在37℃培育混合物1小时且再次核查pH值。培育之后的pH值为约7.0-7.5，且此表明BEA成功地环化反应为BEI。BEI之最终浓度经计算为约0.2M(于40ml体积中，20ml 0.4M BEA经过量碱(0.41M)环化)。

如下进行灭活反应(每100ml待灭活材料)：将待灭活材料与2.5ml新鲜制备之BEI混合。在37℃且在搅拌(以持续混合溶液)下培育灭活反应物72小时。72小时之后，藉由添加0.5ml 1.0M硫代硫酸钠中和反应物。在使硫代硫酸盐充分混合至溶液中(混合约15分钟)之后，在4℃储存经灭活及中和之材料，之后与佐剂调配。

实施例5

制备测试样品：

为了评估高度纯化之ORF2抗原(纯度等级高于90％)与未纯化或较低程度纯化之ORF2抗原相比之免疫原性，制备若干批5ml测试样品：

表18：测试样品

如下制备测试样品1：如实施例1中所述制备PCV-2 ORF2抗原且如实施例3中所述进行高度纯化。如实施例4中所述以BEI灭活高度纯化之PCV-2ORF2抗原。在BEI灭活之后，将PCV-2 ORF2抗原含量调整为每毫升测试样品约32至32.5μg之量且每毫升测试样品与1mg卡波莫971P(BF Goodrich，Ohio，USA)混合。

如下制备测试样品2：如实施例1中所述制备PCV-2 ORF2抗原且如实施例3中所述进行高度纯化。如实施例4中所述以BEI灭活高度纯化之PCV-2ORF2抗原。在BEI灭活之后，将PCV-2 ORF2抗原与昆虫细胞碎片及卡波莫混合。最终测试样品包括每毫升测试样品约2.06×10⁶个昆虫细胞、约32至32.5μg及1mg卡波莫971P。

藉由将每毫升测试样品约2.06×10⁶个昆虫细胞与1mg卡波莫971P混合来制备测试样品3。在混合之前，如实施例3中所述藉由BEI灭活昆虫细胞。

如下制备测试样品4：如实施例1中所述制备PCV-2 ORF2抗原。将上清液中的PCV-2 ORF2抗原含量调整为每毫升测试样品约32至32.5μg之量且每毫升测试样品与1mg卡波莫971P混合。

如下制备测试样品5：如实施例1中所述制备PCV-2 ORF2抗原。接着如实施例3中所述将上清液用于BEI灭活。在BEI灭活之后，将PCV-2 ORF2抗原与昆虫细胞碎片及卡波莫混合。最终测试样品包括每毫升测试样品约2.06×10⁶个昆虫细胞、约32至32.5μg及1mg卡波莫971P。

如下制备测试样品6：如实施例1中所述制备PCV-2 ORF2抗原。接着使实施例1之上清液经由1.2μm实验室规模之过滤器过滤。此过滤器尺寸先前经测定足以过滤完整及破碎的昆虫细胞，同时允许PCV-2 ORF2抗原穿过过滤器。此后，如实施例3中所述以BEI灭活滤液。在BEI灭活之后，将PCV-2ORF2抗原含量调整为每毫升测试样品约32至32.5μg之量且与1mg卡波莫971P混合。

测试每一测试样品之免疫原性

临床期：

由杰克逊实验室(Jackson Laboratories，美国)获得150只雌性Balb/C小鼠且对其进行驯养7天。每笼任意选择一只小鼠在第0天采集血液，总共有26个样品。总共10只小鼠各自藉由皮下途径以0.1-0.2mL Dulbecco氏磷酸盐缓冲液接种。

总共二十只小鼠各自藉由皮下途径以0.1-0.2mL每一测试样品(测试样品1至6)接种。每一笼含有5只小鼠且在每一笼中之所有小鼠均在同一处理组中。在第21天，对所有小鼠进行最后一次采血。使每一血样凝结且藉由离心收集血清。将所有样品保存于单独的管中且在-80℃±10℃储存直至测试。藉由焚化处置小鼠。

样品测试

藉由使用自建(in-house)PCV-2特异性ELISA测量每一测试样品之PCV-2特异性抗体反应来评估每一测试样品之免疫原性。每一测试样品之免疫原性值在表2中以相对免疫原性(RI)值形式给出。此相对免疫原性值为每标准化量之用于免疫之ORF2抗原在受免疫动物中获得的ORF2特异性抗体滴度之量度。

除使用自建ELISA之外，PCV-2特异性抗体之量亦可藉由使用由Nawagitgul，P.，等人于Modified indirect porcine circovirus(PCV)type 2-basedand recombinant capsid protein(ORF2)-based ELISA for the detection ofantibodies to PCV Clin.Diagn.Lab.Immunol.9：33-40(2002)中所述之ELISA检定来测量，该文献之教示及内容以引用的方式并入本文中。该检定中所测量之值亦可用以计算相对免疫原性值(参见下文)。

对于第21天，总共26个样品，将每一小鼠之血清的等分试样同笼汇集在一起。将所有第0天之血清样品的等分试样汇集至一个样品中。将参考物稀释两倍，以1∶2开始且一式三份添加至每一相应孔中。一式三份添加阳性及阴性对照。将每一样品连续稀释两倍且添加至盘中，以1∶200开始，一式三份。使用每月校正之SoftMax^TM平板读取器读取在450nm之最终吸光度且用电子仪器捕获所有原始OD值且用Statlia(Brendan Scientific)分析以计算相对免疫原性(RI)值。

结果：

免疫之后产生抗体之量的RI计算值展示纯化PCV-2 ORF2调配物引起针对高度纯化PCV-2 ORF2抗原之最高血清(抗体)反应。纯化PCV-2 ORF2与昆虫细胞碎片一起调配导致与单独的高度纯化PCV-2 ORF2相比ORF2之相对免疫原性(亦即免疫原性)降低。单独昆虫细胞根本不产生针对PCV-2 ORF2抗原之抗体反应。亦不含有高度纯化PCV-2 ORF2抗原之测试样品4至6亦展示与单独的高度纯化PCV-2 ORF2相比相对免疫原性降低。

Claims (46)

1.一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：

i)获得含有PCV-2抗原之第一液体；及

ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。

2.如权利要求1之方法，其中藉由以第二液体交换该第一液体之该部分而自该PCV-2抗原移除该第一液体之该部分，其中该第二液体不同于该第一液体。

3.如权利要求2之方法，其中以该第二液体交换该第一液体之该部分包含以下步骤：

a)包含将该第二液体添加至含有该PCV-2抗原之该第一液体中的液体添加；及

b)藉由移除一部分该第一及第二液体浓缩该PCV-2抗原。

4.如权利要求1至3中任一项之方法，其中使用过滤器，藉由过滤步骤自该PCV-2抗原移除该第一液体之该部分。

5.如权利要求3至5中任一项之方法，其中实质上同时执行该浓缩步骤及该液体添加步骤。

6.如权利要求3至6中任一项之方法，其中至少两次执行该浓缩步骤及该液体添加步骤。

7.如权利要求4至6中任一项之方法，其中该过滤器包括半透膜。

8.如权利要求7之方法，其中该半透膜具有小于该PCV-2抗原之平均孔径，藉此防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将该PCV-2抗原截留在该过滤器内。

9.如权利要求4至8中任一项之方法，其中该过滤器具有防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质通过的平均孔径。

10.如权利要求3至9中任一项之方法，其中该浓缩步骤使该抗原与该第一液体之体积相比浓缩3倍至50倍。

11.如权利要求1至10中任一项之方法，其中该PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该液体相比降低至少10％。

12.如权利要求1至11中任一项之方法，其中当活病毒或活细菌与该PCV-2抗原性组合物混合2小时或2小时以上时，由步骤i)至ii)制备的PCV-2抗原性组合物造成小于1log TCID₅₀/ml该活病毒或小于1log CFU/ml该活细菌之损失。

13.如权利要求1至12中任一项之方法，其中当活病毒或活细菌与该PCV-2抗原性组合物混合2小时或2小时以上时，由步骤i)至ii)制备的PCV-2抗原性组合物造成小于0.7log TCID₅₀/ml该活病毒或小于0.7log CFU/ml该活细菌之损失。

14.如权利要求1至13中任一项之方法，其中该方法进一步包含收获在步骤ii)之后剩余PCV-2抗原之步骤。

15.如权利要求14之方法，其中该方法进一步包含藉由层析程序纯化包含该PCV-2抗原之步骤ii)收获物的步骤。

16.如权利要求15之方法，其中该PCV-2抗原经纯化至以蛋白质总量计超过50％(w/w)之该PCV-2抗原之纯度等级。

17.如权利要求1至16中任一项之方法，进一步包含将步骤ii)后剩余的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合之步骤：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。

18.如权利要求17之方法，其中该另一组份为佐剂。

19.如权利要求18之方法，其中该佐剂为卡波姆(Carbomer)。

20.如权利要求1至19中任一项之方法，其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白。

21.如权利要求1至20中任一项之方法，其中该PCV-2抗原包含ORF-2蛋白之病毒样粒子。

22.如权利要求1至21中任一项之方法，其中该方法进一步包含将该PCV-2抗原性组合物与至少一种其它抗原组合之步骤。

23.如权利要求22之方法，其中该至少一种其它抗原包括猪生殖及呼吸症候群病毒抗原及/或猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原。

24.一种PCV-2抗原性组合物，其可藉由如权利要求1至23中任一项之方法获得。

25.一种PCV-2抗原性组合物，其中当活病毒或活细菌与该PCV-2抗原性组合物混合至少2小时时，该PCV-2抗原性组合物造成小于1log TCID₅₀/ml该活病毒或小于1log CFU/ml该活细菌之损失。

26.如权利要求25之PCV-2抗原性组合物，其中当活病毒或活细菌与该PCV-2抗原性组合物混合至少2小时时，该PCV-2抗原性组合物造成小于0.7log TCID₅₀/ml该活病毒或小于0.7log CFU/ml该活细菌之损失。

27.如权利要求25或26之PCV-2抗原性组合物，其中该活病毒为猪生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒。

28.一种免疫原性组合物，其包含可由如权利要求1至23中任一项之方法获得的PCV-2抗原性组合物。

29.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求24至26中任一项之PCV-2抗原性组合物。

30.如权利要求29之免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含猪之至少一种其它致病有机体的减毒活病毒或减毒活细菌。

31.如权利要求30之免疫原性组合物，其中该减毒活病毒为猪生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒。

32.如权利要求29至31中任一项之免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含猪肺炎支原体菌苗(bacterin)。

33.如权利要求29至32中任一项之免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含佐剂。

34.如权利要求33之免疫原性组合物，其中该佐剂为卡波姆。

35.一种免疫原性组合物，其包含纯化PCV-2抗原及佐剂。

36.如权利要求35之免疫原性组合物，其中该PCV-2抗原之纯度等级以该免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计高于50％(w/w)。

37.如权利要求35或36之免疫原性组合物，其中该PCV-2抗原为动物细胞或细菌中表达的重组猪环状病毒ORF2蛋白。

38.如权利要求35至37中任一项之免疫原性组合物，其中该猪环状病毒ORF2蛋白可由包含以下步骤之方法获得：

a.在宿主细胞中表达该PCV-2抗原；

b.收获细胞培养物获得该PCV-2抗原；

c.藉由凝胶过滤纯化包含该PCV-2抗原之收获物；

d.将该纯化之PCV-2抗原与佐剂混合。

39.如权利要求28至38之免疫原性组合物，其中在施用一剂该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PCV-2之保护性免疫反应。

40.权利要求28至38之免疫原性组合物，其中施用该免疫原性组合物之动物之淋巴流失(lymphoid depletion)及炎症与未接受该免疫原性组合物之动物相比减轻至少80％。

41.如权利要求31至38之免疫原性组合物，其中在施用一剂该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对PRRS病毒之保护性免疫反应。

42.如权利要求32至38之免疫原性组合物，其中在施用一剂该免疫原性组合物之后，该免疫原性组合物诱导针对猪肺炎支原体之保护性免疫反应。

43.如权利要求28至38之免疫原性组合物，其中2ml该免疫原性组合物包含1个剂量之该PCV-2抗原。

44.一种使动物PCV-2感染之一或多种临床症状与未接受该免疫原性组合物之动物相比减轻的方法，其包含对动物施用如权利要求28至38中任一项之免疫原性组合物的步骤。

45.如权利要求28至38中任一项之免疫原性组合物，其系用于使动物PCV-2感染之一或多种临床症状与未接受该免疫原性组合物之动物相比减轻。

46.一种改良免疫原性组合物对猪环状病毒之免疫原性的方法，其包含以下步骤：

a.在宿主细胞中表达PCV-2抗原；

b.收获该PCV-2抗原；

c.纯化该PCV-2抗原至以该免疫原性组合物中所包括的蛋白质总量计高于50％(w/w)之纯度等级；

d.将该纯化之PCV-2抗原与佐剂混合。

Images