KR20120104514A - Ｐｃｖ­２ 조성물에서 살바이러스 활성의 감소 방법 및 면역원성이 개선된 ｐｃｖ­２ 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PCV-2 항원을 포함하는 조성물의 살바이러스 활성을 감소시키는 방법, 및 살바이러스 활성이 감소된 PCV-2 항원을 포함하는 항원성 제제 및 면역원성 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역원성이 증가된 면역원성 조성물 뿐만 아니라 PCV-2 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 면역원성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＣＶ­２ 조성물에서 살바이러스 활성의 감소 방법 및 면역원성이 개선된 ＰＣＶ­２ 조성물{Methods of reducing virucidal activity in PCV-2 compositions and PCV-2 compositions with an improved immunogenicity}
본 출원은 2010년 3월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/309,408호 및 2009년 9월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61,239,192호에 관한 것이며, 이들 가특허 출원들에 대한 우선권을 주장한다. 이들 모두는 본원에서 이의 전문이 참조로 인용된다.
서열목록
본원은 37 C.F.R. 1.821-1.825에 따르는 서열목록을 포함한다. 본 출원에 첨부된 서열목록은 본원에서 이의 전문이 참조로 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 약간의 살바이러스 활성을 통상 나타낼 수 있는 조성물의 살바이러스 활성을 감소시키는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 사용함으로써, 이러한 조성물의 살바이러스 활성은 본 발명의 단계들을 포함하지 않는 조성물의 살바이러스 활성과 비교하여 감소될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 종래의 검출 방법을 사용하는 당해 기술분야에 공지된 조성물 및 특히 본 발명에 따르는 방법으로 제조되지 않은 조성물과 비교하여 비교적 적거나 없는 살바이러스 활성을 나타내는, 항원성 돼지 서코바이러스 유형 II(Porcine Circovirus Type II; PCV-2) 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 바람직하게는 당해 기술분야에 기재된 비교가능한 조성물과 비교하여 감소되거나 거의 없는 살바이러스 활성을 특징으로 하는, 본 특허 출원에 의해 제공된 방법에 따라 제조된 신규한 면역원성 조성물, 바람직하게는 PCV-2 함유 조성물에 관한 것이다. 추가의 측면에 따라, 본 발명은 또한 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 면역원성이 개선된 정제된 PCV-2 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
돼지 서코바이러스 유형 2(PCV-2)는 단일 가닥의 원형 게놈을 함유하는 작은(직경 17 내지 22nm) 정20면체(icosahedral)의 비외피보유(non-enveloped) DNA 바이러스이다. PCV-2는 돼지 서코바이러스 유형 1(PCV-1)과 대략 80%의 서열 동일성을 공유한다. 그러나, 일반적으로 비바이러스성인 PCV-1과는 대조적으로, PCV-2로 감염된 돼지는 이유후 전신성 소모성 증후군(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS)으로서 통상 지칭되는 증후군을 나타낸다. PMWS는 임상적으로 소모성, 피부의 창백, 수척, 호흡 곤란, 설사, 황화 및 황달을 특징으로 한다. 발병된 일부 돼지에서, 모든 증상들의 조합이 나타나는 반면, 다른 돼지는 이들 증상들 중의 하나 또는 두개만을 가질 것이다. 부검 동안, 현미경 및 육안 병변은 또한 다수 조직 및 기관 상에서 나타나며, 림프구 기관은 가장 일반적인 병변 부위이다. 강력한 상관관계는 PCV-2 핵산 또는 항원의 양과 현미경 림프구 병변의 중증도 사이에서 관찰되었다. PCV-2로 감염된 돼지의 사망율은 80%에 근접할 수 있다. PMWS 이외에, PCV-2는 위광견병, 돼지 생식 및 호흡 증후군(PRRS), 글레이저(Glasser) 질병, 연쇄구균 수막염, 살모넬라증, 이유후 대장균증, 영양성 간장증 및 화농성 기관지폐렴을 포함하는 몇몇 기타 감염과 관련되었다.
몇몇 백신이 돼지에서 PCV-2 감염의 영향을 감소시키기 위해 이용가능하다. 미국 특허 제6,703,023호는 PMWS로부터 돼지를 보호하기 위한 DNA 기반 백신을 제공한다. 국제 공개공보 제WO 03/049703호에는 ORF2 단백질이 병원성 PCV-2의 ORF2 단백질에 의해 대체되어 있는 비병원성 PCV1 바이러스를 포함하는 키메라 생백신의 제조방법이 기재되어 있다. 국제 공개공보 제WO 99/18214호 및 제WO 99/29717호는 PCV2 사백신을 제조하기 위한 몇몇 PCV-2 균주 및 방법을 제공했다. 아단위 백신의 제조는 또한 국제 공개공보 제WO 99/18214호 및 제WO 99/29717호에 기재되어 있다. 효과적인 ORF2 기반 아단위 백신은 국제 공개공보 제WO 06/072065호에 보고되어 있다. 추가의 ORF-2 기반 아단위 백신은 국제 공개공보 제WO 07/28823호에 기재되어 있다. 그러나, 종래 기술에 기재된 백신 중의 어느 것도 비-살바이러스성 및/또는 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 고도로 정제된 PCV-2 ORF2 항원을 포함하지 않는다.
PCV-2에 대한 면역원성 조성물 및 기타 병원체에 대한 다양한 면역원성 조성물은 종종 다른 항원에 대한 살바이러스 효과를 갖는다. 현재의 규제 기준(9 CFR 113.35)은 다가 조성물에서 일부 살바이러스 활성을 허용하지만, 이러한 살바이러스 활성은, 면역원성 조성물의 다른 성분들과 배합되는 경우, 0.7 log/생 바이러스 ml 초과 또는 0.7 log/생 박테리아 ml 미만의 CFU의 소실을 제공할 수 없다. 허용된 것보다 많은 살바이러스 활성을 갖는 조성물은 다가 백신을 생성하기 위해 다른 항원과 배합될 수 없다.
SDS-PAGE 겔 상에서 작동시킬 때에 대략 30 kDa의 분자량을 갖는 PCV-2의 개방 판독 프레임 2(ORF2) 단백질은 PCV-2에 대한 백신 및 면역원성 조성물에서 항원성 성분으로서 종래 사용되어 왔다. 이러한 백신 및 조성물에서 사용하기 위한 ORF2를 수득하는 통상의 방법은 일반적으로 ORF2를 코딩하는 PCV-2 DNA를 증폭시키는 단계, ORF2 단백질을 숙주 세포 내에서 발현시키는 단계 및 세포 용해에 의해 숙주 세포로부터 ORF2 단백질을 추출하는 단계로 이루어진다. 이어서, 회수된 ORF2 세포 용해물은 면역원성 조성물 또는 백신의 항원성 부분으로서 사용된다. 몇몇 경우, ORF2 함유 세포 용해물은 세포 파편으로부터 분리된다.
규제 요건을 충족시킬 수 있고 유효 다가 조성물을 투여할 수 있도록 PCV-2 함유 면역원성 조성물 및 항원의 살바이러스 활성을 감소시키는 방법이 요구되고 있다. 추가로, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스(PRRSV)에 대한 PCV-2 함유 조성물의 살바이러스 활성 및 효과를 저하 또는 감소시키는 방법이 요구되고 있다. 또한, 이들의 살바이러스 활성을 허용되는 기준까지 감소시키고 다른 항원과 배합하여 다가 면역원성 조성물을 형성할 수 있도록 본 발명의 방법을 견디는 면역원성 조성물이 요구되고 있다.
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 속하는, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 단백질 화학 및 면역학의 통상의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I- IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]에 충분히 설명되어 있다.
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 특정한 DNA, 폴리펩티드 서열 또는 공정 파라미터로 한정되지 않으며 이들은 물론 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 단지 본 발명의 특정한 양태를 기재하기 위한 것이며, 한정하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 기재된 단수형 "하나(a 또는 an)" 및 "당해(the)"는, 당해 내용이 달리 분명히 지시되지 않는 한, 복수의 대상을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 따라서, 예를 들면, "항원"이란 2개 이상의 항원들의 혼합물을 포함하고, "부형제"란 2개 이상의 부형제들의 혼합물 등을 포함한다.
본 발명은 종래 기술에서 고유한 문제를 해결하며, 당해 기술 상태의 명백한 개선을 제공한다. 일반적으로, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2 항원성 조성물로서 또는 PCV-2 항원성 조성물에서 사용된다.
본 발명의 목적을 위해, "제1 액체"는 세포, 항원, 면역원성 조성물, 백신 등과 배합하여 통상 사용되는 액체, 수성 또는 유체 배지를 지칭한다. 바람직하게는, 제1 액체는 항원성 조성물로부터의 배지를 포함하며, 보다 바람직하게는 제1 액체는 배양된 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생산에 사용된 세포 배양 배지를 포함하거나 바람직하게는 당해 세포 배양 배지로 구성된다. 배양된 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 및 포유동물 세포일 수 있고, 곤충 및 포유동물 세포가 특히 바람직하다. 따라서, 제1 유체는 박테리아, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 또는 포유동물 세포를 배양하기 위한 배지를 포함하거나 당해 배지로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 세포 배지는 혈청 부재 세포 배지이고, 가장 바람직하게는 배양 배지는, 곤충 세포가 사용되는 경우, EX-CELL? 420 혈청 부재 배지이다. EX-CELL? 420은 단백질을 함유하지 않고 L-글루타민을 함유하는 완전 배지이고, Sf9 및 Sf21 곤충 세포주의 혈청 부재 성장을 위해 개발 및 최적화되었다.
"제2 액체"는, 본 발명의 목적상, 제1 액체와 상이한, 세포, 항원, 면역원성 조성물, 백신 등과 배합하여 통상 사용되는 임의의 액체를 지칭한다. 바람직하게는, 제2 액체는 수용액, 보다 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 용액 및 보다 더 바람직하게는 완충제, 예를 들면, 염수 또는 인산염 완충제 등이다. 가장 바람직하게는, 제2 유체는, 생 바이러스 또는 생 박테리아가 이러한 유체 속에서 배양되거나 저장되는 경우, 임의의 생 바이러스 또는 임의의 생 박테리아(본원에서, 달리 명백하게 언급되거나 당해 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 용어 "살바이러스"는 살균 활성을 포괄한다)에 대한 살바이러스성이 아님을 특징으로 한다.
"일부분"은, 본 발명의 목적상, 전체 양을 포함하지 않는 임의의 양을 지칭한다. 예를 들면, 액체의 일부분은 액체 용적의 100% 미만의 임의의 양, 예를 들면, 액체의 90%, 액체의 80%, 액체의 70%, 및 0% 초과 100% 미만의 모든 양일 수 있다.
"PCV-2 항원"은, 동물, 바람직하게는 돼지에게 투여되는 경우, PCV-2 감염에 대한 면역 반응을 유도, 자극 또는 향상시킬 수 있는 하나 이상의 항원을 포함하는 물질의 임의의 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 바람직하게는 불활성화된 형태의 전체 PCV-2 바이러스, 변형되거나 약독화된 PCV-2 생 바이러스, PCV-2의 면역원성 아미노산 서열을 적어도 포함하는 키메라 바이러스, 또는 PCV-2의 면역원성 아미노산 서열을 적어도 포함하는 임의의 기타 폴리펩티드 또는 성분, 바람직하게는 ORF2이다. 본원에서 사용된 용어 "면역원성 단백질", "면역원성 폴리펩티드" 또는 "면역원성 아미노산 서열"은 PCV-2에 대한 숙주에서의 면역 반응을 유도하는 PCV-2의 임의의 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, PCV-2의 이러한 면역원성 단백질, 면역원성 폴리펩티드 또는 면역원성 아미노산은 국제 특허 출원 제WO 2006/072065호(이의 내용 및 교시는 본원에서 참조로 인용된다)에 개시 또는 제공된 것들 중의 어느 하나이거나, 당해 기술분야에 공지된 임의의 기타 PCV-2 폴리펩티드이다. 예를 들면, PCV-2 ORF2 DNA의 대표적인 서열은 뉴클레오티드 서열 진뱅크(Genbank) 수탁번호 AF086834(서열번호 3) 및 서열번호 4를 포함한다.
그러나, 이러한 서열이 서열 상동성에서 1 내지 10%까지 달라질 수 있고 여전히 면역원성 조성물에서 이들을 유용하게 하는 항원성 특성을 보유할 수 있음은 당해 분야의 당업자에게 이해된다. 면역학적 조성물의 항원성 특성은, 예를 들면, 국제공개공보 제WO06/072065호의 실시예 4에 제공된 유발 실험(challenge experiment)에 의해 평가될 수 있다. 더욱이, 변형된 항원의 항원성 특성은, 변형된 항원이 국제공개공보 제WO06/072065호에서 제공된 서열번호 3 또는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 PCV-2 ORF2 단백질과 비교하여 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 보호 면역성을 제공하는 경우, 여전히 보유된다. 추가로 바람직한 PCV-2 ORF2 항원은 다음과 같다:
(i) 국제공개공보 제WO06/072065호의 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(ii) 상기 폴리펩티드(i)에 80% 이상의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 임의의 폴리펩티드,
(iii) 상기 폴리펩티드(i) 및/또는 (ii)의 임의의 면역원성 부위,
(iv) 국제공개공보 제WO06/072065호의 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11의 임의 서열의 5개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상의 근접 아미노산을 포함하는 상기 (iii)의 면역원성 부위,
(v) 국제공개공보 제WO06/072065호의 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드,
(vi) 상기 폴리뉴클레오티드(v)에 80% 이상의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 임의의 폴리펩티드,
(vii) 상기 폴리뉴클레오티드(v) 및/또는 (vi)에 의해 암호화된 폴리펩티드의 임의의 면역원성 부위,
(viii) 면역원성 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 국제공개공보 제WO06/072065호의 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 포함된 30개 이상의 근접 뉴클레오티드를 포함하는 상기 (vii)의 면역원성 부위.
국제공개공보 제WO06/072065호의 서열목록은 본 출원에 첨부된 서열목록과 동일하다.
국제공개공보 제WO06/072065호의 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열에 의해 암호화된 PCV-2 ORF2 항원의 항원성 특성을 갖는 상기한 임의의 면역원성 부위가 바람직하다.
당해 기술분야에 공지된 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계, 즉 기준 서열 및 당해 기준 서열과 비교되는 소정의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 서열 동일성은, 일련의 이러한 서열들 사이의 정합(match)에 의해 측정되는 바와 같이, 당해 서열들을 최적으로 정렬하여 최고의 서열 유사성을 생성한 후에 소정 서열을 기준 서열과 비교함으로써 결정된다. 이러한 정렬시, 서열 동일성은 위치 대 위치 기준에 따라 확인되며, 예를 들면, 당해 서열들은, 특정 부위에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우, 당해 위치에서 "동일"하다. 이어서, 이러한 위치 동일성의 전체 수를 기준 서열 중의 뉴클레오티드 또는 잔기의 전체 수로 나누어 서열 동일성(%)을 수득한다. 실례로서, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해, 예를 들면, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, 소정 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은, 소정 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 기준 서열과 동일한 것으로 의도된다. 달리 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서, 기준 서열 중의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있고, 또는 기준 서열에서 전체 뉴클레오티드 중의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하의 뉴클레오티드 수가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 돌연변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 발생하거나, 기준 서열 또는 당해 기준 서열 내의 하나 이상의 근접 그룹의 뉴클레오티드들 중에 개별적으로 산재된 이들 말단 위치들 사이의 임의의 지점에서 발생할 수 있다. 유사하게는, 기준 아미노산 서열에 대해, 예를 들면, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 소정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 당해 폴리펩티드의 소정 아미노산 서열은, 소정 폴리펩티드 서열이 기준 아미노산 서열의 각 100개 아미노산당 15개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 기준 서열과 동일한 것으로 의도된다. 달리 말하면, 기준 아미노산 서열과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 소정 폴리펩티드 서열을 수득하기 위해, 기준 서열 중의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 잔기는 결실되거나 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 또는 기준 서열에서 아미노산 잔기의 전체 수 중의 15% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하의 아미노산 수가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변형은 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 발생하거나, 기준 서열 또는 당해 기준 서열 내의 하나 이상의 근접 그룹의 잔기들 중에 개별적으로 산재된 이들 말단 위치들 사이의 임의의 지점에서 발생할 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 달라진다. 그러나, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정할 때에 정합으로서 포함되지 않는다.
"생" 바이러스 또는 박테리아는, 본 발명의 목적상, 숙주에서 복제가능한 바이러스 또는 박테리아를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 생 바이러스 및 바람직한 생 박테리아는 각각 PRRS 바이러스 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumonia) 박테리아이다. 그러나, 용어 생 바이러스 또는 생 박테리아는 각각 PRRS 바이러스 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아로 한정되지 않는다.
제1 액체의 일부분은 제1 액체 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거될 수 있고, 이때 제2 액체는 제1 액체와 상이하다(제2 유체의 정의 참조). 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거되고, 제2 액체는 제1 액체와 상이하다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 액체 일부분을 제2 액체로 교환하는 것은 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 액체 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계를 포함한다. 따라서, 추가의 측면에 따라서, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 액체 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계를 포함하는 제1 액체의 적어도 일부분의 제2 액체로의 교환에 의해 PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함하는, PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다.
제1 액체 일부분은 필터를 사용하는 여과 단계에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법을 사용하여 PCV-2 항원으로부터 제1 및, 적용가능한 경우, 제2 유체 일부분을 포함하는 임의의 유체 일부분을 제거할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, 원심분리 및/또는 크로마토그래피를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 그러나, 여과가 가장 바람직하다. 제1 유체 일부분 또는, 적용가능한 경우, 임의의 기타 유체를 제거하기 위한 바람직한 여과 방법은 한외여과 및/또는 투석여과를 포함한다. 한외여과 및 투석여과는, 예를 들면, 문헌[참조: Protein Purification Methods - A Practical Approach - editors: E.L.V. Harris and S. Angel, Oxford University Press 1995 (이의 내용 및 교시는 본원에서 참조로 인용된다)]에 상세히 기재된 바와 같이 당해 분야의 당업자에게 공지된 표준 방법이다. 특히, 당해 문헌의 챕터 3에는 몇몇 방법 및 장치 유형이 기재되어 있고, 이들 모두는 본 발명의 목적상 예시적 방식으로 당해 분야의 당업자에 의해 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 제1 액체 일부분은 여과, 바람직하게는 투석여과 또는 한외여과에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거된다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 액체 일부분은 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 액체 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계를 포함하는 제1 액체의 적어도 일부분의 제2 액체로의 교환에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거된다.
상기 정의한 바와 같이, 기재된 임의의 방법에 사용되는 바람직한 제2 액체는 완충제, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충제이고, 염수가 특히 바람직하다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) 완충제, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 염수 또는 인산염 완충제 등의 교환에 의해 제1 액체의 적어도 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 액체 일부분은 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 보다 바람직하게는, 제1 액체의 적어도 일부분을 완충제, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 염수 또는 인산염 완충제 등으로 교환하는 것은 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 완충제, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 염수 또는 인산염 완충제 등을 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 바람직하게는 여과, 보다 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 완충제, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 염수 또는 인산염 완충제 등인 제1 및 제2 유체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 농축시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법의 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 실질적으로 동시에 또는 교대로 실시될 수 있고, 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 순차적으로 실시된다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, 및 (ii) (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계(여기서, 상기 액체 첨가 단계는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 실시된다)를 포함하는 제1 액체 일부분의 제2 액체로의 교환에 의해 PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함하는, PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분 및, 제2 액체의 첨가의 경우, 제1 및 제2 유체의 혼합물이 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거된다.
농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 단계의 순서는 중요하지 않다. 예를 들면, 추가의 측면에서는 액체 첨가 단계가 농축 단계 전에 일어나고, 또 다른 측면에서는 농축 단계가 액체 첨가 단계 전에 일어난다. 액체 첨가 단계 및 농축 단계는, 이들이 수행되는 순서에 상관 없이, 다수회 수행될 수 있다. 예를 들면, 이들 개개 단계 각각은, 필요한 경우, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 10회 이상 등의 다수회 수행될 수 있다. 한 가지 측면에서, 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 각각 2회 이상 수행된다. 또 다른 측면에서, 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 각각 3회 이상 수행된다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에 따라, (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 당해 교환은 다수회 수행된다)를 일반적으로 포함하는, PCV-2 항원성 조성물의 제조방법이 제공된다. 바람직하게는, 제1 유체의 일부분을 제2 유체의 일부분으로 교환하는 것은 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계(여기서, 상기 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 예를 들면, 2회, 3회, 5회, 10회 등으로 수행된다)를 포함한다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 2회, 가장 바람직하게는 3회 수행된다. 상기한 바와 같이, 여과는 제1 액체의 일부분을 제거하거나, 상기한 바와 같은 다수회 제거 단계의 경우, 제1 및 제2 유체 혼합물의 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거하기 위해 바람직한 방법이다.
필터는 당해 기술분야에서 임의의 통상적인 필터일 수 있다. 바람직하게는, 필터는 반투과성 막을 포함한다. 추가의 바람직한 형태에서, 반투과성 막은 평균 기공 크기가 PCV-2 항원보다 작고, 이에 의해 상기 반투과성 막 기공들을 통한 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과가 차단되어 필터 내에 상기 PCV-2 항원이 보유된다. 추가의 측면에서, 필터는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상의 통과를 차단하는 평균 기공 크기를 갖고, 보다 바람직하게는, 필터는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질의 90% 이상의 통과를 차단하는 평균 기공 크기를 갖고, 가장 바람직하게는 필터는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질의 90% 이상의 통과를 차단하는 평균 기공 크기를 갖는다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스(whole virus)로서 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 추가의 측면에서, 반투과성 막은 폴리설폰, 폴리에테르설폰 및 재생 셀룰로즈로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질을 포함한다. 그러나, PCV-2 항원으로부터 제1 유체의 일부분을 제거하고, 복수 공정 단계의 경우, 제1 및 제2 유체의 혼합물을 제거하는 임의의 기타 물질이 사용될 수 있다. 필터는 중공 섬유 막 한외여과 카트리지, 플랫 시트 또는 카세트로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 중공 섬유 막 한외여과 카트리지가 특히 바람직하다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따라, 상기한 바와 같은 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법이 제공된다. 당해 방법은 일반적으로 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, 및 (ii) 여과 단계에 의해 PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 필터는 바람직하게는 반투과성 막이거나 이를 포함한다)를 포함한다. 바람직하게는, 반투과성 막은 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단한다. 바람직하게는, 반투과성 막의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 상기한 바와 같이, 제거 단계는 일반적으로, (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계(여기서, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 예를 들면, 2회, 3회, 5회, 10회 등으로 수행된다)를 포함하는, 제1 유체 일부분의 제2 유체 일부분으로의 교환을 포함한다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 2회, 가장 바람직하게는 3회 수행된다.
본원에 제공된 방법의 농축 단계는 PCV-2 항원이 제1 액체 용적과 비교하여 3배 내지 50배 농축되도록 수행된다. 보다 바람직하게는, 농축 단계는 PCV-2 항원이 제1 액체 용적과 비교하여 4배 내지 20배 농축되도록 수행된다. 가장 바람직하게는, 농축 단계는 PCV-2 항원이 제1 액체 용적과 비교하여 7배 내지 10배 농축되도록 수행된다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 제1 액체의 일부분은 PCV-2 항원으로부터 제거되고, PCV-2 항원은 제1 액체 용적과 비교하여 3배 내지 50배, 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 바람직하게는 7배 내지 10배 농축된다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 유체의 일부분은, (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 3배 내지 50배, 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 제1 액체 일부분의 제2 액체로의 교환에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각 액체 첨가 단계는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는, 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단한다. 바람직하게는, 반투과성 막의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
추가의 측면에서, 본원의 방법에 의해 생성된 PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성은 당해 방법을 수행하지 않은 액체와 비교하여 10% 이상 감소된다. 보다 바람직하게는, PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성은 당해 방법을 수행하지 않은 제1 액체와 비교하여 50% 이상 감소된다. 보다 바람직하게는, PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성은 당해 방법을 수행하지 않은 제1 액체와 비교하여 70% 이상 감소된다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "살바이러스 활성"은, 유체, 용액 또는 조성물이 생 바이러스 또는 생 박테리아와 혼합되는 경우, 상기 유체, 용액 또는 조성물이 생 바이러스 또는 생 박테리아를 특정한 정도까지 불활성화 또는 사멸시키는 것을 의미한다. 따라서, 유체, 용액 또는 조성물의 살바이러스 활성을 10% 이상 감소시키는 것은, 본원에 기재된 방법을 수행하지 않은 유체, 용액 또는 조성물과 비교하여, 본원에 기재된 방법을 수행하는 유체, 용액 또는 조성물에서 생 바이러스 또는 생 박테리아의 생존률이 90% 이상임을 의미한다. 본 발명에 따라, PRRS 바이러스, 바람직하게는 ATCC 수탁번호 VR 2332를 갖는 PRRS 바이러스는 살바이러스 활성을 측정하는 기준 바이러스이다. 박테리아와 관련하여 살바이러스 활성을 측정하기 위해, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아의 J-균주를 사용하는 것이 제안된다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 단계(ii) 후에 수득된 PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성, 바람직하게는 PRRS 바이러스에 대한 살바이러스 활성은 제1 액체의 활성과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상 감소된다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 살바이러스 활성을 갖는 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 액체 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체의 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 바람직하게는 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용된 기타 임의의 막의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
추가의 측면에서, 본 발명의 방법은 제1 액체의 적어도 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거한 후에 수득한 PCV-2 항원을 수거하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 "수거하는" 또는 "수거하다"는 PCV-2 항원을 수집 또는 회수하는 것을 지칭한다. 당해 기술분야에 공지된 임의의 통상의 방법을 사용하여, 항원이 본 출원의 방법 및 조성물에 사용되는 경우 또는 PCV-2 항원이 본원에 기재된 방법을 경험하는 경우, PCV-2 항원을 회수할 수 있다. 특히 바람직한 수거 방식에서, 제1 액체의 일부분은 여과 단계를 통해 PCV-2 항원으로부터 제거되고, PCV-2 항원은 필터 지체로부터 회수 또는 수거된다. 보다 바람직한 형태에서, PCV-2 항원은 본원에 기재된 기공 크기를 갖는 반투과성 막의 지체로부터 수거 또는 수집 또는 회수된다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 단계(ii) 후에 수득한 PCV-2 항원은 수거된다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체의 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는, 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여, 바람직하게는 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
본원에 제공된 방법을 수행한 후에, 바람직하게는 필터 체류로부터 수거된 후에 잔류하는 PCV-2 항원은 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합된다. 바람직하게는 추가의 성분은 보조제이고, 보다 바람직하게는 보조제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이고, 보다 바람직하게는 보조제는 카보머(아크릴산의 합성 고분자량 중합체에 대한 일반명)이다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체" 및 "수의학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다.
본원에 사용된 "보조제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예를 들면, Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 수중유중수(water-in-oil-in-water) 에멀젼을 포함할 수 있다. 에멀젼은 특히 경질 액체 파라핀 오일(유럽 약전 형태); 이소프레노이드 오일, 예를 들면, 스쿠알란 또는 스쿠알렌; 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 수득되는 오일; 산 또는 선형 알킬 그룹 함유 알코올의 에스테르, 보다 특히는 식물 오일, 에틸 올레에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지쇄 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르에 기반할 수 있다. 오일은 에멀젼을 형성하기 위해 유화제와 함께 사용된다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄, 만니드(예: 무수 만니톨 올레에이트), 글리콜, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르(이들은 임의로 에톡실화된다) 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 플루로닉 생성물, 특히 L121이다[참조: Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart- Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]. 예를 들면, 문헌[참조: page 147 of "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]에 기재된 SPT 에멀젼 및 문헌[참조: 상기 동일 문헌의 page 183]에 기재된 에멀젼 MF59를 사용할 수 있다. 추가로 적합한 보조제는 특히 RIBI 보조제 시스템(Ribi Inc.), 블록 공중합체(CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 보조제, 이. 콜라이(E. coli)(재조합체 등)로부터의 열-불안정성 장독소, 콜레라 독소, IMS 1314 또는 무라밀 디펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에는 말레산 무수물과 에틸렌과의 공중합체인 공중합체 EMA(Monsanto)가 포함된다. 수중에서 이들 중합체의 용해는 바람직하게는 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체가 도입될 보조제 용액을 제공하기 위해 생리학적 pH까지 중화될 산 용액을 유도한다.
보조제의 추가의 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체와의 공중합체로부터 선택된 화합물이다. 유리한 보조제 화합물은 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르와 가교결합되는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 용어 카보머(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996)에 의해 공지되어 있다. 당해 분야의 당업자는 또한 3개 이상, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실 그룹을 갖는 폴리하이드록실화된 화합물(즉, 3개 이상의 하이드록시 그룹 중의 수소원자가 탄소수 2 이상의 불포화 지방족 라디칼로 치환됨)과 가교결합된 아크릴 중합체를 기재하는 미국 특허 제2,909,462호를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼은 탄소수 2 내지 4의 것들, 예를 들면, 비닐, 알릴 및 기타 에틸렌계 불포화 그룹이다. 불포화 라디칼은 자체로 메틸 등의 다른 치환체를 함유할 수 있다. 상품명 CARBOPOL?(BF Goodrich, Ohio, USA)하에 시판되는 제품이 특히 적절하다. 이들은 폴리알케닐 에테르 또는 디비닐 글리콜과 가교결합되거나 알릴 수크로즈 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교결합된 아크릴산의 중합체이다. 이들 중에는 CARBOPOL? 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. CARBOPOL? 971P를 사용하는 것이 가장 바람직하다.
바람직하게는, 보조제는 용량당 약 100 ㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 100 ㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 보조제는 용량당 500 ㎍ 내지 약 5 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 1 mg의 양으로 첨가된다.
"희석제"는 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장제는 특히 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민, 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다.
본원에 사용된 "보존제"는 항미생물 활성제, 예를 들면, 젠타마이신, 메르티올레이트 등을 지칭한다. 특히, 보존제의 첨가는 다중 용량 조성물의 제조에 가장 바람직하다. 이들 항미생물 활성제는 목적하는 조성물을 임의의 미생물 오염으로부터 방지하거나 목적하는 조성물 내의 임의의 미생물의 성장을 억제하기에 효과적인 농도로 첨가된다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함하고 단계(ii) 후에 잔류하는 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는, PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 추가의 성분은 보조제이고, 보다 바람직하게는 보조제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이고, 보다 더 바람직하게는 보조제는 카보머이다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환함으로써 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 더 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
상기 기재된 방법에 사용되는 PCV-2 항원은 본원에 정의된 임의의 PVC-2 항원일 수 있다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자, 및 보다 더 바람직하게는 INGELVAC CIRCOFLEX?에 포함된 항원을 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 더 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환함으로써 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다.
바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회, 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
사용된 PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 수득될 수 있다. 바람직하게는, PCV-2 항원 뿐만 아니라 PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체는 국제 특허출원 제WO2006/072065호(이의 내용 및 교시는 본원에서 참조로 인용된다)에 기재된 임의의 방법으로 수득될 수 있다. 특히, PCV-2 항원은, 숙주 세포에서 재조합에 의해 시험관내 발현되는 경우, PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유 및 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득될 수 있다.
PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 발현시키는 벡터(또는 재조합체)를 제조 및/또는 사용하기 위한 벡터 및 방법은 문헌[참조: 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 제5,174,993호, 제5,505,941호, 제5,338,683호, 제5,494,807호, 제4,722,848호, 제5,942,235호, 제5,364,773호, 제5,762,938호, 제5,770,212호, 제5,942,235호, 제382,425호, PCT 공보 WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti," Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996, Smith et al., 미국 특허 제4,745,051호, (재조합 바쿨로바이러스), Richardson, CD. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, Dec, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector," Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, No. 3, p. 399-406; EPA0 370 573, 미국 출원 제920,197호, filed October 16,1986, EP 특허 공보 제265785호, 미국 특허 제4,769,331호 (재조합 헤르페스바이러스), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93: 11307-11312, October 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996, Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996, Kitson et al., J. Virol. 65,3068-3075,1991; 미국 특허 제5,591,439호, 제5,552,143호, WO 98/00166, 허여된 미국 출원 일련번호 제08/675,556호 및 제08/675,566호 (둘 다 1996년 7월 3일자 출원)(재조합 아데노바이러스), Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65,Graham, Tibtech 8,85-87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70,42434, PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science, 259: 1745-49,1993 and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996, 및 U.S. 특허 5,591,639, 5,589,466 및 5,580,859, 또한 WO 90/11092, W093/19183, W094/21797, WO95/11307, WO95/20660, Tang et al., Nature and Furth et al. Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia. WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41 : 736-739,1998 (렌티바이러스 발현 시스템); Sanford et al., 미국 특허 제4,945,050호; Fischbachet al. (Intracel), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA 벡터 시스템); Szoka et al., 미국 특허 (DNA의 살아있는 세포로의 삽입 방법); McCormick et al., 미국 특허 제5,677,178호 (세포변성 바이러스의 사용); 및 미국 특허 제5,928,913호 (유전자 전달용 벡터) 또한 참조.] 및 본원에 인용된 기타 문헌에 기재된 방법에 의해 또는 이와 유사하게 사용될 수 있다. 곤충 세포에서 PCV-2 ORF2 항원의 발현은, 예를 들면, 국제 공개공보 제WO 06/072065호에 기재되어 있다. 본 발명에 따르는 정제된 PCV-2 ORF2 항원은 당해 기술분야에 공지된 몇몇 방법으로 수득될 수 있다. 바람직한 방법은 본원에 기재된 것들이다. PCV-2 ORF2 항원은 (i) PCV-2 ORF2 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터로 배양물에서 감수성 세포를 감염시키는 단계(여기서, PCV-2 ORF2 단백질은 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현된다) 및 (ii) 이어서, 세포 배양물로부터 PCV-2 ORF2 항원을 회수하는 단계를 포함하는 방법으로 재조합에 의해 시험관내에서 제조될 수 있다. PCV-2 ORF2 항원은 PCV-2 ORF2 항원을 발현하는 완전(즉, 무손상) SF+ 세포를 수거함으로써 회수된다.
따라서, 본 출원의 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, PCV-2 항원은 PCv-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득되고, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 보다 더 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바이러스 벡터, 특히 PCV-2 항원을 함유하고 이를 발현시키는 재조합 바쿨로바이러스를 사용하여 PCV-2 항원을 생성/수득하는 경우, 상기 기재된 방법은 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 불활성화 단계는 제1 액체의 적어도 일부분이 PCV-2 항원으로부터 제거된 후에, 보다 바람직하게는 PCV-2 항원이 수거된 후에 수행된다. 보다 더 바람직하게는, 불활성화 단계는 당해 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 제1 액체의 일부분이 PCV-2 항원으로부터 제거된 후에 수행된다. 제1 액체 일부분을 제2 액체로 교환하는 것이 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 5배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행되는 경우, 불활성화 단계는 농축 단계 후에 수행된다. 액체 첨가 단계 및 농축 단계가 다수회, 바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 3회 수행되는 경우, 불활성화 단계는 최종 액체 첨가 단계 및 농축 단계 후에 수행된다. 농축 단계가 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행되는 경우, 불활성화 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 사용하여 상기한 바와 같은 여과 단계 후에 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
"DNA 불활성제"는, 본 발명의 목적상, DNA, 바람직하게는 병원체의 DNA를 불활성화시켜, 당해 병원체가 활성 감염을 유발하지 않거나 감염 또는 복제시킬 수 없지만 여전히 피검체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 화학 제제를 지칭한다. 바람직하게는, DNA 불활성제는 포르말린이다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, PCV-2 항원은 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득된다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 더 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바람직하게는, 불활성화 단계는 제1 액체의 적어도 일부분이 PCV-2 항원으로부터 제거된 후에, 보다 바람직하게는 PCV-2 항원이 수거된 후에 수행된다. 보다 더 바람직하게는, 불활성화 단계는 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 제1 액체의 일부분이 PCV-2 항원으로부터 제거된 후에 수행된다. 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하는 것이 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행되는 경우, 불활성 단계는 농축 단계 후에 수행된다. 액체 첨가 단계 및 농축 단계가 다수회, 바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 3회 수행되는 경우, 이러한 불활성화 단계는 최종 액체 첨가 단계 및 농축 단계 후에 수행된다. 농축 단계가 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하는 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행되는 경우, 불활성화 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 사용하는 상기한 바와 같은 여과 단계 후에 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 74 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
DNA 불활성화제가 본 발명에 따르는 방법에 사용되는 경우, 당해 방법은 DNA 불활성화제를 중화시키는 양의 제제를 첨가하는 단계(여기서, 당해 양은 DNA 불활성화제의 양에 상응하고, DNA 불활성화제를 중화시키는 제제는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하며, DNA 불활성화제는 BEI이다)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 불활성화 단계는 제1 액체의 적어도 일부분이 PCV-2 항원으로부터 제거된 후에 수행된다.
본원에 사용된 "불활성화제를 중화시키는 제제" 또는 "중화제"는 당해 불활성화제가 더이상 DNA를 불활성화시킬 없도록 상기 기재된 불활성화제를 중화시킬 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 불활성화제를 중화시키는 제제는 바람직하게는 티오황산나트륨이다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) 제1 액체에서 PCV-2 항원을 수득하는 단계(여기서, PCV-2 항원은 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 및 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득되고, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 더 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다), (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계, (iii) 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계, (iv) 불활성화제를 중화시키는 양의 중화제를 첨가하는 단계(여기서, 중화제의 양은 불활성화제의 양에 상응하고, 중화제는 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하고, 불활성화제는 바람직하게는 BEI를 포함한다)를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 불활성화 및 중화 단계는 제1 액체의 적어도 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거한 후에, 보다 바람직하게는 PCV-2 항원을 수거한 후에 수행된다. 보다 더 바람직하게는, 불활성화 및 중화 단계는 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 제1 액체의 일부분이 PCV-2 항원으로부터 제거된 후에 수행된다. 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하는 것이 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행되는 경우, 불활성화 및 중화 단계는 농축 단계 후에 수행된다. 액체 첨가 단계 및 농축 단계가 다수회, 바람직하게는 2회, 보다 더 바람직하게는 3회 수행되는 경우, 불활성화 및 중화 단계는 최종 액체 첨가 단계 및 농축 단계 후에 수행된다. 농축 단계가 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행되는 경우, 불활성화 및 중화 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 사용하는 상기한 여과 단계 후에 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 74 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
본 발명의 추가의 양태에서, 상기 기재된 방법은 불활성화 및 중화 단계 후에 수득한 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) 제1 액체에서 PCV-2 항원을 수득하는 단계(여기서, PCV-2 항원은 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득되고, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다), (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계, (iii) 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계, (iv) 불활성화제를 중화시키는 양의 중화제를 첨가하는 단계(여기서, 중화제의 양은 불활성화제의 양에 상응하고, 중화제는 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하며, 불활성화제는 바람직하게는 BEI를 포함한다), 및 (v) 단계(iv)에서 수득한 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 더 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바람직하게는, 단계(ii)에서, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 더 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 74 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
추가의 측면에 따라, 살바이러스 활성이 감소된 PCV-2 항원을 수득하는 상기한 방법 중의 하나는 정제된 PCV-2 항원을 수득하는 추가의 정제 단계를 포함할 수 있다. 놀랍게도, 바람직하게는 보조제와 배합된 정제된 PCV-2 항원을 포함하는 항원성 또는 면역원성 조성물은, 정제된 PCV-2 항원을 포함하지 않는(이는 정제되지 않거나 조 PCV-2 항원을 포함함을 의미한다) 면역원성 조성물과 비교하여, 본원에 기재된 바와 같이 감소된 살바이러스 활성을 나타낼 뿐만 아니라 증가된 면역원성을 나타낸다.
용어 "정제된 PCV-2 항원"은 PCV-2 항원이 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 50% (w/w) 초과, 바람직하게는 60% (w/w) 초과, 바람직하게는 70% (w/w) 초과, 바람직하게는 80% (w/w) 초과, 바람직하게는 85% (w/w) 초과, 보다 바람직하게는 90% (w/w) 초과, 보다 더 바람직하게는 95% (w/w) 초과 정도까지 제제에서 정제된다. 달리 말하면, 제제가 순도 등급 80% (w/w)로 PCV-2 항원을 포함하는 경우, 이러한 제제는 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 20% (w/w) 이하의 비 PCV-2 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 순도 등급은 보조제 또는 임의의 기타 부형제 또는 불활성화제와 혼합하기 전에 제제, 즉 면역원성 조성물에서 측정된다. 그러나, 최종 면역원성 조성물에 사용된 보조제가 비단백질 기반 보조제인 경우, 보조제의 첨가는 순도 값에 어떠한 영향도 갖지 않는다. PCV-2 항원의 순도 등급은 당해 분야의 당업자에게 공지된 표준 방법, 예를 들면, 임페리얼 단백질 스테인(Imperial Protein Stain)(Pierce)에 의해 SDS-PAGE 분리, 기체 크로마토그래피, HPLC 분석 등의 후에 평가될 수 있다. 제제, 즉 면역원성 조성물 중의 PCV-2 항원의 순도 또는 순도 등급을 평가하는 본 발명에 따르는 바람직한 방법은 다음과 같이 수행되는 임페리얼 단백질 스테인(Pierce) 염색이다: PCV-2 항원을 포함하는 제제는 NuPAGE MOPS 완충제 시스템(Invitrogen)을 사용하여 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 의해 분리된다. 겔은 변성(모든 완충제는 이들 내에 SDS를 함유한다) 및 환원 조건(부하 완충제는 2-머캅토메탄올을 함유한다)하에 작동시킨다. 겔에 샘플을 부하한 후, 겔을 55분 동안 200볼트에서 일정하게 작동시킨다. 작동이 완결되면, 겔을 임페리얼 단백질 스테인(Pierce)을 사용하여 염색하고, 제조업자의 지시에 따라 탈색시킨다.
대조적으로, 용어 "비정제된" 또는 "조" PCV-2 항원은 PCV-2 항원을 포함하는 조 제제를 지칭한다. PCV-2 항원은 통상 세포 배양물에서 시험관내 생성된다. 따라서, 조 PCV-2 항원은 PCV-2 항원과, PCV-2 항원의 생성에 사용된 세포 배양물 또는 세포 배양 물질의 혼합물을 지칭한다. 더욱이, 비정제된 PCV-2 항원은 또한 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 50% (w/w) 미만, 보다 바람직하게는 40% (w/w) 미만, 보다 더 바람직하게는 30% (w/w) 미만, 보다 더 바람직하게는 20% (w/w) 미만의 순도 등급을 갖는 부분 정제된 PCV-2 항원을 의미한다.
또한, 본원에 사용된 용어 "증가된 면역원성 또는 개선된 면역원성"은 목적하는 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 의해 유발된 면역 반응이, 면역 반응이 세포 매개된 면역 반응 및/또는 항체 매개된 면역 반응이든지 상관없이, 상이한 항원 또는 상이한 순도 등급의 항원을 포함하는 기준 면역원성 조성물과 비교하여 증가되는 것을 의미한다. 바람직한 양태에 따라, 용어 증가된 면역원성 또는 개선된 면역원성은, 목적하는 항원을 포함하는 면역원성 조성물에 의해 유도된 항체 매개된 면역 반응이 상이한 항원 또는 상이한 순도 등급의 항원을 포함하는 기준 면역원성 조성물과 비교하여 증가되는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 항체 매개된 면역 반응은 목적하는 항원에 특이적인 항체의 생성이 상이한 항원 또는 상이한 순도 등급의 항원을 포함하는 기준 면역원성 조성물에 의해 유도된 항체 생성과 비교하여 증가되는 것을 의미한다.
용어 "증가된"은 세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응이 상이한 항원 또는 상이한 순도 등급의 항원을 포함하는 기준 면역원성 조성물에 의해 유도된 세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상 증가되는 것을 의미한다.
세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응을 측정하는 방법은 당해 분야의 당업자의 일반적인 지식에 포함된다. 특히, 목적하는 면역원성 조성물의 세포 매개된 면역 반응을 기준 조성물의 세포 매개된 면역 반응과 비교하거나 목적하는 면역원성 조성물의 항체 매개된 면역 반응을 기준 조성물의 것과 비교하는 것은 당해 분야의 당업자에게 명백하지만, 목적하는 면역원성 조성물의 세포 매개된 면역 반응을 기준 조성물의 항체 매개된 면역 반응과 비교하는 것 또는 이의 반대의 경우는 그렇지 않다. 더욱이, 세포 매개된 면역 반응은, 예를 들면, 목적하는 면역원성 조성물/항원에 의한 세포독성 T 세포의 활성화를 측정함으로써 측정될 수 있다. 항체 매개된 면역 반응은, 예를 들면, 이러한 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여하여 생성한 항원 특이적 항체의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응은, 예를 들면, 마우스 모델을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에 따라, 마우스 모델이 기준 방법으로서 사용된다.
용어 "면역원성 조성물"은 목적하는 항체 대해 숙주에서 세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 항원을 포함하는 물질의 조성물을 의미하지만 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로, "면역 반응"은 하기 효과들 중의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 목적하는 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증가되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되도록 치료적 또는 예방적 면역 반응을 나타낼 것이다. 이러한 경우, 면역원성 조성물은 "백신"이다. 이러한 예방은 감염된 숙주에 의해 통상 나타나는 징후의 감소 또는 결핍, 감염된 숙주에서 보다 빠른 회복 시간 및/또는 감소된 바이러스 역가에 의해 증명될 것이다.
PCV-2 항원의 추가의 정제는 크로마토그래피 공정, 바람직하게는 2단계 크로마토그래피 공정으로 달성될 수 있다. PCV-2 항원이 바이러스 유사 입자(VLP)로 조립되는 경우, 1단계, 바람직하게는 제1 단계는 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피이고, 이는, 예를 들면, Sephacryl S300 매트릭스을 사용하여 수행될 수 있다. 실험실 규모에서, HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR 컬럼의 사용이 가장 바람직하다. 그러나, 배양 여과액 또는 상청액으로부터 PCV-2 ORF2 VLP를 분리시키는, 당해 분야의 당업자에게 공지된 기타 임의의 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스가 사용될 수 있다. 적합한 매트릭스는, 예를 들면, 문헌[참조: E.L.V. Harris and S. Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL Press Oxford (1995)]에 기재되어 있다. 겔 여과 크로마토그래피는, 예를 들면, PCV-2 항원을 포함하는 조 제제를 컬럼에 1.0 ml/분의 유속으로 부하하고, 당해 컬럼을, 20 mM Tris(pH 6.5), 5 mM DTT를 포함하는 1.5 컬럼 용적의 완충제로 용출시킴으로써 수행될 수 있다. 그러나, PCV-2 ORF2 항원은 또한 친화성 크로마토그래피, 예를 들면, 고정된 PCV-2 ORF2 특이적 항체 대한 선택적 결합 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 기타 임의의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
따라서, 바람직한 양태에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계 및 (iii) PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 단계(ii)의 수거물을 크로마토그래피 공정에 의해 정제하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 크기 배제 크로마토그래피는 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행된다. 바람직하게는 크기 배제는 보조제와 혼합하기 전에 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 순도 등급 80% (w/w) 이상, 바람직하게는 90% (w/w) 초과의 면역원성 조성물을 제공한다. 순도 등급은 NuPAGE MOPS 완충제 시스템(Invitrogen)을 사용하는 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 의한 SDS PAGE 후에 임페리얼 단백질 스테인(Pierce) 염색법으로 평가될 수 있다.
따라서, 바람직한 양태에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계, 및 (iii) PCV-2 항원을 포함하는 단계(ii)의 수거물을 크기 배제 크로마토그래피(겔 여과)에 의해 정제하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다.
보다 높은 순도 등급을 수득하기 위해, 제1 크로마토그래피 단계와 상이한 제2 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 제1 정제 단계/크로마토그래피 단계가 크기 배제(겔 여과)인 경우, 제2 단계는, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같이 상기 단계와 상이해야 한다. 바람직하게는, PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하는 제1 단계가 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피인 경우, 제2 단계는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)일 수 있다. PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하기 위한 바람직한 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스는 Q Sepharose이다. 약 50 ml의 소규모에 있어서, 5 ml HiTrap Q Sepharose HP 컬럼의 사용이 가장 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피는, 예를 들면, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 요약하면, 크기 배제 크로마토그래피 단계로부터 약 50 ml의 공극 용적 분획 풀을 AIEX 컬럼에 3.0 ml/분의 유속으로 부하할 수 있다. 예를 들면, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 20 mM Tris(pH 6.5), 5 mM DTT를 사용하는 세척 단계 후, 단백질은 하기 완충제(20 mM Tris, pH 6.5, 5 mM DTT, 1.0 M NaCl)의 8 컬럼 용적의 단일 단계로 용출될 수 있다. AIEX 작동으로부터의 플로우스루(flow-through)는 Q Sepharose 컬럼으로 다시 부하되고, 수율을 증가시키기 위해 상기한 바와 같이 용출될 수 있다. 이러한 2단계 기술(크기 배제, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피)은 배양 수거물의 다른 단백질 성분들 대부분으로부터 PCV-2 ORF2 항원을 효과적으로 분리시킨다.
따라서, 바람직한 양태에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계 및 (iii) PCV-2 항원을 포함하는 단계(ii)의 수거물을 2단계 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 제1 크로마토그래피 단계는 제2 단계와 상이하다. 제1 단계가 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피인 경우, 제2 단계는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)일 수 있다. 바람직하게는, 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2 단백질을 수득하기 위해 하나 이상의 추가의 정제 단계를 포함하는 상기한 임의의 방법에서, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환함으로써 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용된 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 바람직한 형태에서, 상기한 PCV-2 항원성 조성물을 제조하는 방법은 (i) 제1 액체에서 PCV-2 항원을 수득하는 단계(여기서, PCV-2 항원은 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득되고, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다), (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계, (iii) 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계, (iv) 불활성화제를 중화시키는 양의 중화제를 첨가하는 단계(여기서, 중화제의 양은 불활성화제의 양에 상응하고, 중화제는 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하고, 불활성제는 바람직하게는 BEI를 포함한다) 및 (v) 단계(iv)에서 수득한 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 정제, 바람직하게는 예비 여과 단계를 포함하는 2단계 정제 방법은 임의의 보조제와의 혼합 전에 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 순도 등급 80% (w/w) 이상, 바람직하게는 85% (w/w) 이상, 보다 바람직하게는 90% (w/w) 이상, 가장 바람직하게는 95% (w/w) 이상의 면역원성 조성물을 생성한다.
본원에 기재된 방법으로 제조한 PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 1 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 1 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 보다 바람직하게는, 본원에 기재된 방법으로 제조한 PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 ml당 0.9 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 0.9 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, 본원에 기재된 방법으로 제조한 PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 ml당 0.7 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 0.7 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, 본원에 기재한 방법의 단계들로 제조한 PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 ml당 0.5 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 0.5 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, 본원에 기재된 방법으로 제조한 PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 ml당 0.3 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 0.3 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 생 바이러스는 임의의 생 바이러스일 수 있지만, 바람직하게는 생 바이러스는 PRRS 바이러스, 바람직하게는 ATCC 수탁번호 VR 2332의 PRRS 바이러스이다. 생 박테리아는 임의의 박테리아일 수 있지만, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아의 J-균주이다. ml당 TCID50은 생 바이러스의 양의 평가하는 시험관내 역가 분석의 표준에 의해 평가될 수 있다. ml당 CFU는 생 박테리아의 양을 평가하는 시험관내 역가 분석의 표준에 의해 평가될 수 있다. 용어 "ml당"은 바람직하게는 유체 1ml를 지칭한다. 이러한 정제된 PCV-2 항원은 본원에 정의된 바와 같이 감소된 살바이러스 활성을 나타낼 뿐만 아니라 본원에 정의된 비정제된 PCV-2 항원과 비교하여 증가된 면역원성을 나타내고, 바람직하게는 이러한 정제된 PCV-2 항원은, 비정제된 PCV-2 항원을 포함하는 기준 면역원성 조성물에 의해 유도된 세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응과 비교하여 세포 및/또는 항체 매개된 면역 반응을 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상 증가시킨다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공하고, 여기서, 단계(ii) 후에 수득한 PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스, 바람직하게는 PRRSV 또는 생 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스, 바람직하게는 생 PRRSV ml당 1 log TCID50 미만, 바람직하게는 0.9 log TCID50 미만, 보다 바람직하게는 0.7 log TCID50 미만, 보다 바람직하게는 0.5 log TCID50 미만, 가장 바람직하게는 0.3 log TCID50 미만 또는 생 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 ml당 1 log CFU 미만, 바람직하게는 0.9 log CFU 미만, 보다 바람직하게는 0.7 log CFU 미만, 보다 바람직하게는 0.5 log CFU 미만, 가장 바람직하게는 0.3 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 바람직하게는 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. PCV-2 항원은 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득되며, 당해 공정은 (iii) 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계, (iv) 불활성화제를 중화시키는 양의 중화제를 첨가하는 단계(여기서, 중화제의 양은 불활성화제의 양에 상응하고, 중화제는 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하며, 불활성화제는 바람직하게는 BEI를 포함한다)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 불활성화 및 중화 단계는 제1 액체의 적어도 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거한 후에, 보다 바람직하게는 PCV-2 항원을 수거한 후에 수행된다. 보다 바람직하게는 불활성화 및 중화 단계는 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 제1 액체의 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거한 후에 수행된다. 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하는 것이, (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행되는 경우, 불활성화 및 중화 단계는 농축 단계 후에 수행된다. 액체 첨가 단계 및 농축 단계가 다수회, 바람직하게는 2회, 및 보다 바람직하게는 3회 수행되는 경우, 이러한 불활성화 및 중화 단계는 최종 액체 첨가 단계 및 농축 단계 후에 수행된다. 농축 단계가 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행되는 경우, 불활성화 및 중화 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 사용하는 상기한 바와 같은 여과 단계 후에 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 바람직하게는, 본원에 정의된 바와 같은 정제된 PCV-항원을 수득하기 위한 추가의 정제는 제1 액체 일부분의 제거 후에 수득되는 PCV-2 항원을 포함하는 단계(ii)의 수거물을 크로마토그래피 단계에 의해 정제하는 단계(iii)를 포함하는 추가의 정제 단계를 수행함으로써 달성될 수 있다. 보다 고순도 등급을 수득하기 위해, 제1 단계와는 상이한 제2 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 제1 정제 단계/크로마토그래피 단계가 크기 배제(겔 여과)인 경우, 제2 단계는 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같이 상이하여야 한다. 바람직하게는, PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하기 위한 제1 단계가 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피인 경우, 제2 단계는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)일 수 있다. PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하기 위한 바람직한 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스는 Q Sepharose이다. 약 50 ml의 소규모에서, 5 ml HiTrap Q Sepharose HP 컬럼의 사용이 가장 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피는, 예를 들면, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 요약하면, 크기 배제 크로마토그래피 단계로부터 약 50 ml의 공극 용적 분획 풀을 AIEX 컬럼에 3.0 ml/분의 유속으로 부하할 수 있다. 예를 들면, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 20 mM Tris(pH 6.5), 5 mM DTT를 사용하는 세척 단계 후, 단백질은 하기 완충제(20 mM Tris, pH 6.5, 5 mM DTT, 1.0 M NaCl)의 8 컬럼 용적의 단일 단계로 용출시킬 수 있다. AIEX 작동으로부터의 플로우스루는 Q Sepharose 컬럼으로 다시 부하되고, 수율을 증가시키기 위해 상기한 바와 같이 용출시킬 수 있다. 이러한 2단계 기술(크기 배제, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피)은 배양 수거물의 다른 단백질 성분 대부분으로부터 PCV-2 ORF2항원을 효과적으로 분리시킨다.
상기 기재한 바와 같은 방법에 따라 수득한 PCV-2 항원성 조성물 또는 상기한 바와 같은 방법의 단계(i)에 사용된 PCV-2 항원은 하나 이상의 추가의 항원, 바람직하게는 바이러스 또는 박테리아 항원, 및 보다 바람직하게는 돼지에서 하나 이상의 기타 질병 유발균으로부터의 바이러스 또는 박테리아 항원과 배합될 수 있다. 추가의 항원은 국제 특허출원 제WO 2007/094893호(이의 내용 및 교시는 본원에서 참조로 인용된다)에 기재된 것들 중의 어느 하나일 수 있다. 요약하면, 추가의 항원은 돼지의 기타 임의의 질병 유발균의 항원일 수 있다. 바람직하게는 돼지의 "또 다른 질병 유발균"은 액티노바실루스 플레우로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumonia)(1); 아데노바이러스(Adenovirus)(2); 알파바이러스, 예를 들면, 이스턴 말 엔세팔로미엘리티스 바이러스(Eastern equine encephalomyelitis viruses)(3); 보르데텔라(Bordetella) 기관지패혈증균(4); 브라키스피라 종(Brachyspira spp.)(5), 바람직하게는 비. 하이오디엔테리아에(B. hyodyentheriae)(6); 비. 피오시콜라이(B. piosicoli)(7), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 바람직하게는 비오바르(biovar) 1, 2 및 3(8); 전형적 돼지 열병 바이러스(9); 클로스트리디움 종(Clostridium spp.)(10), 바람직하게는 Cl. 디피사일(Cl. difficile)(11), Cl. 퍼프린겐스(Cl. perfringens) 유형 A, B 및 C(12), Cl. 노비이(Cl. novyi)(13), Cl. 셉티쿰(Cl.septicum)(14), Cl. 테타니(Cl. tetani)(15); 코로나바이러스(Coronavirus)(16), 바람직하게는 돼지 호흡성 코로나 바이러스(17); 에페리트로주노시스 수이스(Eperythrozoonosis suis)(18); 에리시펠로트릭스 르시오패티아에(Erysipelothrix rhsiopathiae)(19), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)(20); 해모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 바람직하게는 아형 1, 7 및 14(21), 헤마글루티나팅 엔세팔로미엘리티스(Hemagglutinating encephalomyelitis) 바이러스(22); 제패니즈 엔세팔리티스 바이러스(Japanese Encephalitis Virus)(23); 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis)(24), 렙토스피라 종(Leptospira spp.)(25), 바람직하게는 렙토스피라 오스트랄리스(Leptospira australis)(26); 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola)(27); 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa)(28); 렙토스피라 익테로해모라지카에(Leptospira icterohaemorrhagicae)(29); 및 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)(30); 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona)(31); 렙토스피라 타라쏘비(Leptospira tarassovi)(32); 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp.)(33), 바람직하게는 엠. 아비움(M. avium)(34), 엠. 인트라셀룰라레(M. intracellulare)(35) 및 엠. 보비스(M.bovis)(36); 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae)(37); 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida)(38); 돼지 사이토메갈로바이러스(Porcine cytomegalovirus)(39); 돼지 파르보바이러스(Porcine Parvovirus)(40); 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)(41); 슈도라비즈 바이러스(Pseudorabies virus)(42); 로타바이러스(Rotavirus)(43); 살모넬라 종(Salmonella spp.)(44), 바람직하게는 에스. 티히무리움(S. thyhimurium)(45) 및 에스. 콜레라에수이스(S. choleraesuis)(46); 스타프. 히이쿠스(Staph. hyicus)(47); 스타필로코쿠스 종(Staphylococcus spp.)(48), 바람직하게는 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp.)(49), 바람직하게는 스트렙트. 수이스(Strep. suis)(50); 돼지 헤르페스 바이러스(Swine herpes virus)(51); 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine Influenza Virus)(52); 돼지 폭스 바이러스(Swine pox virus)(53); 돼지 폭스 바이러스(54); 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus)(55); 돼지의 수포성 발진의 바이러스(56); 렙토스피라 하르조(Leptospira Hardjo)(57) 및/또는 마이코플라즈마 하이오시노비아에(Mycoplasma hyosynoviae)(58)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) 제1 액체에서 PCV-2 항원을 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하고 PCV-2 항원을 하나 이상의 추가의 항원, 바람직하게는 바이러스 또는 박테리아 항원, 및 보다 바람직하게는 돼지에서 하나 이상의 기타 질병 유발균으로부터의 바이러스 또는 박테리아 항원과 배합하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 정제된 PCV-2 항원을 수득하기 위한 추가의 정제는 상기한 바와 같이 수행될 수 있다.
바람직한 형태에서, 상기한 바와 같은 PCV-2 항원성 조성물을 제조하는 방법은 (i) 제1 액체에서 PCV-2 항원을 수득하는 단계(여기서, PCV-2 항원은 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득되고, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다), (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계, (iii) 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계, (iv) 불활성화제를 중화시키는 양의 중화제를 첨가하는 단계(여기서, 중화제의 양은 불활성화제의 양에 상응하고, 중화제는 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하며, 불활성화제는 바람직하게는 BEI를 포함한다), 및 (v) 단계(iv)에서 수득한 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합하는 단계를 추가로 포함한다.
당해 방법의 추가의 측면에서, 하나 이상의 추가의 항원은 바이러스 항원, 바람직하게는 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스로부터의 항원이다. 보다 바람직하게는, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 생 바이러스, 및 보다 바람직하게는 변형된 생 바이러스, 보다 더 바람직하게는 변형된 생 약독화 바이러스를 포함한다. 보다 바람직하게는, 변형된 생 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 ATCC 수탁번호 VR 2332의 변형된 생 바이러스 균주, 및 보다 바람직하게는 INGELVAC? PRRS MLV를 포함한다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하고 PCV-2 항원을 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스로부터의 항원과 배합하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 생 바이러스, 바람직하게는 변형된 생 바이러스, 보다 바람직하게는 변형된 생 약독화 바이러스를 포함한다. 보다 바람직하게는 변형된 생 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 ATCC 수탄번호 VR 2332의 변형된 생 바이러스 균주를 포함하고, 보다 바람직하게는 INGELVAC? PRRS MLV를 포함한다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 정제된 PCV-2 항원을 수득하기 위한 추가의 정제는 상기한 바와 같이 수행될 수 있다.
본 출원의 추가의 측면에서, 하나 이상의 추가의 항원은 박테리아 항원, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에이다. 바람직하게는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원은 박테린이고, 보다 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린은 INGELVAC? MYCOFLEX이다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하고 PCV-2 항원을 박테리아 항원, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에와 배합하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원은 박테린이고, 보다 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린은 INGELVAC? MYCOFLEX이다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환함으로써 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각각의 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 정제된 PCV-2 항원을 수득하기 위한 추가의 정제는 상기한 바와 같이 수행될 수 있다.
본 출원의 추가의 측면에서, 하나 이상의 추가의 항원은 바이러스 항원, 바람직하게는 상기한 바와 같은 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원, 및 박테리아 항원, 바람직하게는 상기한 바와 같은 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함한다. 바람직하게는, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 생 바이러스, 보다 바람직하게는 변형된 생 바이러스를 포함하고, 보다 바람직하게는 ATCC 수탁번호 VR2332의 변형된 생 바이러스 균주를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 INGELVAC? PRRS MLV를 포함한다. 바람직하게는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원은 박테린이고, 보다 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린은 INGELVAC? MYCOFLEX이다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하고 PCV-2 항원을 바이러스 항원, 바람직하게는 상기한 바와 같은 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스의 항원, 및 박테리아 항원, 바람직하게는 상기한 바와 같은 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원과 배합하는 단계를 포함하는 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스는 생 바이러스, 바람직하게는 변형된 생 바이러스, 보다 바람직하게는 ATCC 수탁번호 VR 2332의 변형된 생 바이러스 균주를 포함하고, 보다 바람직하게는 INGELVAC? PRRS MLV를 포함한다. 바람직하게는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원은 박테린이고, 보다 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린은 INGELVAC? MYCOFLEX이다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 더 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환함으로써 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 정제된 PCV-2 항원을 수득하기 위한 추가의 정제는 상기한 바와 같이 수행될 수 있다.
본 출원은 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법을 제공할 뿐만 아니라, PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 특허출원은, PCV-2 항원성 조성물이 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 1 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 1 log CFU 미만의 손실을 유발하는 것을 특징으로 하는 PCV-2 항원성 조성물을 추가로 제공한다. 보다 바람직하게는, 본원에 기재된 방법으로 제조한 PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 또는 생 박테리아 ml당 0.9 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 ml당 0.7 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 0.7 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 ml당 0.5 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 0.5 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 보다 더 바람직하게는, PCV-2 항원성 조성물은, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스 ml당 0.3 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 0.3 log CFU 미만의 손실을 유발한다. 생 바이러스는 임의의 생 바이러스일 수 있지만, 바람직하게는 생 바이러스는 PRRS 바이러스, 바람직하게는 ATCC 수탁번호 VR 2332의 PRRS 바이러스이다. 생 박테리아는 임의의 박테리아일 수 있지만, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아의 J-균주이다. ml당 TCID50은 생 바이러스의 양을 평가하는 시험관내 역가 분석의 표준에 의해 평가될 수 있다. ml당 CFU는 생 박테리아의 양을 평가하는 시험관내 역가 분석의 표준에 의해 측정될 수 있다. 용어 "ml당"은 바람직하게는 유체 1ml를 지칭한다.
추가의 측면에서, 상기한 PCV-2 항원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분을 포함한다. 바람직하게는, 추가의 성분은 보조제이고, 보다 바람직하게는 보조제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이고, 보다 더 바람직하게는 보조제는 카보머이다. 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 100 ㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 100 ㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 보조제는 용량당 500 ㎍ 내지 약 5 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 1 mg의 양으로 첨가된다.
본 출원은 상기 정의한 바와 같이 PCV-2 항원성 조성물의 제조방법 및/또는 PCV-2 항원성 조성물을 제공할 뿐만 아니라, 본원에 기재된 임의의 방법으로 수득할 수 있는 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 수득되는 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2 항원성 조성물로서 또는 조성물에서 사용된다. 용어 "본원에 제공된 방법으로 수득되는 PCV-2 항원성 조성물"은 또한 PCV-2 항원성 조성물이 본원에 제공된 방법으로 수득될 수 있음을 의미한다. 추가의 측면에 따라, 본 출원은 또한 제1 액체의 일부분을 제1 액체와 상이한 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 일부분을 제거함으로써 수득되는 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거되고, 제2 액체는 제1 액체와 상이하다)를 포함하는 방법으로 수득된 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하는 것은 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계를 포함한다.
추가의 측면에 따라, PCV-2 항원성 조성물은 바람직하게는 필터를 사용하는 여과 단계에 의해 제1 액체의 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거하는 방법으로 수득된다. 그러나, 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법, 예를 들면, 원심분리 및/또는 크로마토그래피를 사용하여 PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 유체의 일부분을 제거할 수 있다. 그러나, 여과가 가장 바람직하다. 제1 유체의 일부분을 제거하는 바람직한 여과 방법은 한외여과 및/또는 투석여과를 포함한다. 본원에 기재된 방법의 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 실질적으로 동시에 또는 교대로 수행될 수 있고, 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 순차적으로 수행된다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환함으로써 PCV-2 항원으로부터 제거되고, 제2 액체는 제1 액체와 상이하다)를 포함하는 방법으로 수득된 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하는 것은 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) 제1 및 제2 액체의 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계(여기서, 액체 첨가 단계는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다)를 포함한다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 예를 들면, 추가의 측면에서, 액체 첨가 단계는 농축 단계 전에 수행되고, 또 다른 측면에서, 농축 단계는 액체 첨가 단계 전에 수행된다.
추가의 측면에서, 본 출원은, 이들이 수행되는 순서에 상관 없이, 액체 첨가 단계 및 농축 단계가 다수회 수행될 수 있는 본원에 기재된 방법을 사용하여 수득될 수 있는 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 각각의 이들 단계들은 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 10회 이상, 요구되는 다수회로 수행될 수 있다. 한 가지 측면에서, 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 각각 2회 이상 수행된다. 또 다른 측면에서, 농축 단계 및 액체 첨가 단계는 각각 3회 이상 수행된다.
본 출원의 추가의 측면에서, 본 발명의 PCV-2 항원성 조성물은 상기한 바와 수득되며, 여기서 여과는 제1 액체의 일부분 또는, 상기한 바와 같은 다수회 제거 단계의 경우, 제1 및 제2 유체의 혼합물의 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거하는 바람직한 방법이다. 필터는 당해 기술분야에서 임의의 통상적인 필터일 수 있다. 바람직하게는, 필터는 반투과성 막을 포함한다. 추가의 바람직한 형태에서, 반투과성 막은 평균 기공 크기가 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 갖고, 이에 의해 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 추가의 측면에서, 필터는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상의 통과를 차단하는 평균 기공 크기를 갖고, 보다 바람직하게는, 필터는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단하는 평균 기공 크기를 갖고, 가장 바람직하게는 필터는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단하는 평균 기공 크기를 갖는다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스로서 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 추가의 측면에서, 반투과성 막은 폴리설폰, 폴리에테르설폰 및 재생 셀룰로즈로 이루어진 그룹으로부터 선택된 물질을 포함한다. 그러나, PCV-2 항원으로부터 제1 유체의 일부분을 제거하고, 복수 공정 단계의 경우, 제1 및 제2 유체의 혼합물을 제거하는 임의의 기타 물질이 사용될 수도 있다. 추가의 측면에서, 필터는 중공 섬유 막 한외여과 카트리지, 플랫 시트 또는 카세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 중공 섬유 막 한외여과 카트리지가 특히 바람직하다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 필터가 바람직하게는 반투과성 막이거나 이를 포함하는, 상기한 바와 같은 방법을 사용하여 수득되는 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 반투과성 막은, PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단한다. 바람직하게는, 반투과성 막의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 상기한 바와 같이, 제거 단계는 일반적으로, (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 농축시키는 단계(여기서, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 예를 들면, 2회, 3회, 5회, 10회 등으로 수행된다)를 포함하는, 제1 유체 일부분의 제2 유체 일부분으로의 교환을 포함한다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 2회, 가장 바람직하게는 3회 수행된다.
PCV-2 항원성 조성물을 수득하기 위해 본원에 제공된 방법의 농축 단계는 PCV-2 항원이 제1 액체 용적과 비교하여 3배 내지 50배 농축되도록 수행된다. 보다 바람직하게는, 농축 단계는 PCV-2 항원이 제1 액체 용적과 비교하여 4배 내지 20배 농축되도록 수행된다. 가장 바람직하게는, 농축 단계는 PCV-2 항원이 제1 액체 용적과 비교하여 7배 내지 10배 농축되도록 수행된다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은, PCV-2 항원이 제1 액체 용적과 비교하여 3배 내지 50배, 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 바람직하게는 7배 내지 10배 농축되는, 상기한 바와 같은 방법으로 수득된 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 제1 유체의 일부분은, (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거하여 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 3배 내지 50배, 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 제1 액체 일부분의 제2 액체로의 교환에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계는 농축 단계와 함께 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는, 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단한다. 바람직하게는, 반투과성 막의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
바람직하게는, 본원에 정의된 정제된 PCV-2 항원을 포함하는 PCV-2 항원성 조성물을 수득되는 추가의 정제는, 제1 액체의 일부분의 제거 후에 수득되는 (본원에 기재된 임의의 방법의) PCV-2 항원을 포함하는 단계(ii)의 수거물을 크로마토그래피 단계에 의해 정제하는 단계(iii)를 포함하는 추가의 정제 단계를 수행함으로써 달성될 수 있다. 보다 높은 순도 등급을 수득하기 위해, 제1 크로마토그래피 단계와 상이한 제2 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 제1 정제 단계/크로마토그래피 단계가 크기 배제(겔 여과)인 경우, 제2 단계는 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같이 상이해야 한다. 바람직하게는, PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하는 제1 단계가 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피인 경우, 제2 단계는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)일 수 있다. PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하기 위한 바람직한 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스는 Q Sepharose이다. 약 50 ml의 소규모에 있어서, 5 ml HiTrap Q Sepharose HP 컬럼의 사용이 가장 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피는, 예를 들면, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 요약하면, 크기 배제 크로마토그래피 단계로부터 약 50 ml의 공극 용적 분획 풀을 AIEX 컬럼에 3.0 ml/분의 유속으로 부하할 수 있다. 예를 들면, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 20 mM Tris(pH 6.5), 5 mM DTT를 사용하는 세척 단계 후, 단백질은 하기 완충제(20 mM Tris, pH 6.5, 5 mM DTT, 1.0 M NaCl)의 8 컬럼 용적의 단일 단계로 용출될 수 있다. AIEX 작동으로부터의 플로우스루는 Q Sepharose 컬럼으로 다시 부하되고, 수율을 증가시키기 위해 상기한 바와 같이 용출시킬 수 있다. 이러한 2단계 기술(크기 배제, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피)은 배양 수거물의 다른 단백질 성분 대부분으로부터 PCV-2 ORF2 항원을 효과적으로 분리시킨다.
추가의 측면에서, 본원에 기재된 방법으로 생성된 PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성은 당해 방법을 수행하지 않은 액체와 비교하여 10% 이상 감소된다. 보다 바람직하게는, PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성은 당해 방법을 수행하지 않은 제1 액체와 비교하여 50% 이상 감소된다. 보다 더 바람직하게는, PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성은 당해 방법을 수행하지 않은 제1 액체와 비교하여 70% 이상 감소된다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 (i) PCV-2를 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계, 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계(여기서, 단계(ii) 후에 수득된 PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성, 바람직하게는 PRRS 바이러스에 대한 살바이러스 활성은 제1 액체의 활성과 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 90% 이상 감소된다)를 포함하는 방법에 의해 수득된 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 살바이러스 활성을 갖는 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3 배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 농축 단계와 함께 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 바람직하게는 여과, 바람직하게는 투석여과 및/또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용된 기타 임의의 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는, PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다. 정제된 PCV-2 항원을 수득하기 위해 추가의 정제가 상기와 같이 수행된다.
추가의 측면에 따라, 본 출원은, 생 바이러스, 바람직하게는 PRRSV 또는 생 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에를 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하고 2시간 이상, 바람직하게는 4시간 이상, 보다 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 2주 이상, 보다 바람직하게는 4주 이상, 보다 바람직하게는 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 4개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월 이상, 보다 바람직하게는 12개월 이상, 보다 바람직하게는 18개월 이상, 가장 바람직하게는 2년 이상 동안 배양하는 경우, 생 바이러스, 바람직하게는 생 PRRSV ml당 1 log TCID50 미만, 바람직하게는 0.9 log TCID50 미만, 보다 바람직하게는 0.7 log TCID50 미만, 보다 바람직하게는 0.5 log TCID50 미만, 가장 바람직하게는 0.3 log TCID50 미만 또는 생 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 ml당 1 log CFU 미만, 바람직하게는 0.9 log CFU 미만, 보다 바람직하게는 0.7 log CFU 미만, 보다 바람직하게는 0.5 log CFU 미만, 가장 바람직하게는 0.3 log CFU 미만의 손실을 유발하는, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 생 바이러스는 임의의 생 바이러스일 수 있지만, 바람직하게는 생 바이러스는 PRRS 바이러스, 바람직하게는 ATCC 수탁번호 VR 2332의 PRRS 바이러스이다. 생 박테리아는 임의의 박테리아일 수 있지만, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테리아, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에의 J-균주이다. ml당 TCID50은 생 바이러스의 양을 평가하는 시험관내 역가 분석의 표준에 의해 평가될 수 있다. ml당 CFU는 생 박테리아의 양을 평가하는 시험관내 역가 분석의 표준에 의해 측정될 수 있다. 용어 "ml당"은 바람직하게는 유체 1ml를 지칭한다.
추가의 측면에서, 본 특허 출원은, 단계(ii) 후에 잔류하는 PCV-2 항원을 수거하는 단계를 추가로 포함하는, 상기한 바와 같은 방법으로 수득되는 PCV-2 항원성 조성물에 관한 것이다. 이러한 수거는 임의의 통상의 방식으로 수행될 수 있다. 특히 바람직한 수거 방식에서, 제1 액체의 일부분은 여과 단계에 의해 PCV-2 항원으로부터 제거되고, PCV-2 항원은 필터 지체로부터 회수 또는 수거된다.
추가의 측면에서, 본원에 기재된 임의의 방법으로 수득한 PCV-2 항원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합된다. 바람직하게는, 추가의 성분은 보조제이고, 보다 바람직하게는 보조제는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이고, 보다 더 바람직하게는 보조제는 카보머이다.
따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은 본원에 기재된 방법으로 수득한 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 PCV-2 항원성 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 추가의 성분은 보조제이고, 보조제는 보다 바람직하게는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이고, 보조제는 보다 더 바람직하게는 카보머이다. 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 100 ㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 100 ㎍ 내지 약 10 mg의 양으로 첨가된다. 보다 바람직하게는, 보조제는 용량당 500 ㎍ 내지 약 5 mg의 양으로 첨가된다. 보다 더 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 750 ㎍ 내지 약 2.5 mg의 양으로 첨가된다. 가장 바람직하게는, 보조제는 용량당 약 1 mg의 양으로 첨가된다.
추가의 측면에서, 상기한 PCV-2 항원성 조성물은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에 따라, 본 출원은, PCV-2 항원이 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함하는, 상기한 방법에 의해 수득된 PCV-2 항원성 조성물을 제공한다.
상기 언급한 바와 같이, 본원에 기재된 방법에 사용된 PCV-2 항원은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 수득될 수 있다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득된다. 바람직한 형태에서, PCV-2 항원은 WO2006/072065호(이의 교시 및 내용은 본원에서 참조로 인용된다)에 기재된 공정에 따라 수득된다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에 따라, 본 출원은, PCV-2 항원이 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF-2를 함유하고 이를 발현시키는 바이러스 벡터, 바람직하게는 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터에 의해 수득되고 PCV-2 항원이 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함하는, 상기한 방법으로 수득된 PCV-2 항원성 조성물을 제공한다.
본 출원의 추가의 측면에서, PCV-2 항원성 조성물은 상기한 방법으로 수득되고, 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸렌이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 형태에서, 당해 방법은 DNA 불활성화제를 중화시키는 양의 제제를 첨가하는 단계(여기서, 당해 양은 DNA 불활성화제의 양에 상응하고, DNA 불활성화제를 중화시키는 제제는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하고, DNA 불활성화제는 BEI이다)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 불활성화 단계는 제1 액체의 적어도 일부분을 PCV-2 항원으로부터 제거한 후에 수행된다.
본 출원의 추가의 측면에서, PCV-2 항원성 조성물은 불활성화 및 중화 단계 후에 수득된 PCV-2 항원을 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 상기한 방법으로 수득된다. 따라서, 추가의 측면에 따라, 본 출원은, (i) 제1 액체에서 PCV-2 항원을 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계, (iii) 재조합 바쿨로바이러스 바이러스 벡터를 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 이원성 에틸이민의 존재하에 DNA 불활성화제로 불활성화시키는 단계, (iv) 불활성화제를 중화시키는 양의 중화제를 첨가하는 단계(여기서, 중화제의 양은 불활성화제의 양에 상응하고, 중화제는 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM의 최종 농도로 농축된 티오황산나트륨 용액을 포함하며, 불활성화제는 바람직하게는 BEI를 포함한다), 및 바람직하게는 (v) 단계(iv)에서 수득한 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가의 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 상기한 방법으로 수득한 PCV-2 항원성 조성물을 제공한다.
본 출원의 추가의 측면에서, 상기한, 바람직하게는 상기한 방법으로 수득한 PCV-2 항원성 조성물은 하나 이상의 추가의 항원, 바람직하게는 바이러스 또는 박테리아 항원, 및 보다 바람직하게는 돼지에서 하나 이상의 기타 질병 유발균으로부터의 바이러스 또는 박테리아 항원을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 하나 이상의 추가의 항원은 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스이다. 보다 바람직하게는, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 생 바이러스, 보다 더 바람직하게는 병형된 생 바이러스를 포함한다. 보다 바람직하게는, 변형된 생 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 ATCC 수탁번호 VR 2332의 변형된 생 바이러스 균주를 포함하고, 보다 바람직하게는 INGELVAC? PRRS MLV를 포함한다. 본 출원의 추가의 측면에서, 하나 이상의 추가의 항원은 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에이다. 바람직하게는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원은 박테린이고, 보다 바람직하게는 마이코프라즈마 하이오뉴모니아에 박테린은 INGELVAC? MYCOFLEX이다. 본 출원의 추가의 측면에서, 상기한, 바람직하게는 상기한 방법으로 수득한 PCV-2 항원성 조성물은 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원, 바람직하게는 변형된 생 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스, 보다 더 바람직하게는 ATCC 수탁번호 VR 2332의 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스, 또는 INGELVAC? PRRS MLV 또는 INGELVAC? PRRS ATP에 포함된 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스를 추가로 포함한다. 본 출원의 추가의 측면에서, 상기한, 바람직하게는 상기한 방법으로 수득한 PCV-2 항원성 조성물은 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에, 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린, 및 보다 바람직하게는 INGELVAC? MYCOFLEX 또는 INGELVAC? MYCOFLEX에 포함된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물은 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스, 바람직하게는 상기한 것들 중의 어느 하나 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에, 바람직하게는 상기한 것들 중의 어느 하나를 포함한다.
상기한 바와 같은 돼지에서 하나 이상의 기타 질병 유발균으로부터의 하나 이상의 추가의 항원, 바람직하게는 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 및/또는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함하는 PCV-2 항원성 조성물이 본원에 기재된 방법으로 수득되는 경우, 당해 방법은 (i) 제1 액체에서 PCV-2 항원을 수득하는 단계, (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하고 PCV-2 항원을 하나 이상의 추가의 항원, 바람직하게는 바이러스 또는 박테리아 항원, 및 보다 바람직하게는 돼지에서 하나 이상의 기타 질병 유발균으로부터의 바이러스 또는 박테리아 항원과 배합하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, PCV-2 항원은 PCV-2의 ORF-2 단백질, 보다 바람직하게는 PCV-2의 재조합 ORF-2 단백질, 및 보다 더 바람직하게는 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함한다. 바람직하게는, 제1 액체의 일부분은 제1 액체의 일부분을 제2 액체로 교환하여 PCV-2 항원으로부터 제거된다. 당해 교환은 바람직하게는 (a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 단계 및 (b) PCV-2 항원으로부터 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체 용적과 비교하여 바람직하게는 3배 내지 50배, 보다 바람직하게는 4배 내지 20배, 및 보다 더 바람직하게는 7배 내지 10배 농축시키는 단계를 포함하는 방식으로 수행된다. 바람직하게는, 액체 첨가 단계 및 농축 단계는 다수회, 바람직하게는 2회 및 보다 더 바람직하게는 3회 수행된다. 이러한 경우, 제1 액체가 제거될 뿐만 아니라, 제1 및 제2 액체의 혼합물도 제거된다. 바람직하게는, 각 액체 첨가 단계는 상기한 바와 같이 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 수행된다. 농축 단계 및 액체 첨가 단계가 순차적으로 수행되는 경우, 당해 단계들의 순서는 중요하지 않다. 더욱이, 농축 단계는 바람직하게는 반투과성 막을 함유하는 필터를 사용하여 여과, 바람직하게는 투석여과 또는 한외여과에 의해 수행된다. 반투과성 막은 바람직하게는 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 가져서 상기 반투과성 막 기공들을 통한 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 수거 또는 회수용 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유한다. 바람직하게는, 반투과성 막 또는 본원에 사용되는 임의의 기타 필터의 평균 기공 크기는 크기 50 kDa 내지 500 kDa의 단백질의 90% 이상, 보다 바람직하게는 크기 75 kDa 내지 400 kDa의 단백질 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 크기 100 kDa 내지 300 kDa의 단백질 90% 이상의 통과를 차단한다. 이러한 기공 크기는 PCV-2 항원이 전 바이러스 또는 바이러스 유사 입자로서 생성되는 경우에 바람직하다.
상기한 바와 같은 본 발명은 PCV-2 항원, 및 PCV-2 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 신규 방법을 제공하며, 여기서 PCV-2 항원은 감소된 살바이러스 활성 및/또는 증가된 면역원성을 나타내고(각각 본원에 정의된 바와 같음), 당해 방법은 (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계 및 (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 감소된 살바이러스 활성 및/또는 증가된 면역원성(각각 본원에 정의된 바와 같음)을 나타내는 이러한 PCV-2 항원을 포함하는 면역원성 조성물 뿐만 아니라 PCV-2 항원을 제공한다. 추가의 측면에 따라, 감소된 살바이러스 활성 및/또는 증가된 면역원성을 나타내는 정제된 PCV-2 항원을 포함하는 면역원성 조성물 뿐만 아니라 PCV-2 항원은 하기 방법(II)에 의해 대안적으로 수득될 수 있다. 본 발명에 따르는 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF2 항원은 PCV-2 바이러스 제제의 정제, 특히 전 바이러스의 정제에 의해 수득될 수 있다. 전 바이러스 제제는, 예를 들면, 국제공개공보 제WO 99/18214호 또는 제WO 03/049703호에 기재되어 있다. 더욱이, 정제된 PCV-2 항원은 또한 재조합 발현된 PCV-2 항원의 정제, 바람직하게는 재조합 PCV-2 ORF2 항원의 정제에 의해 수득될 수 있다. 재조합 PCV-2 항원, 바람직하게는 재조합 PCV-2 ORF2 항원을 생성하는 발현 시스템은 당해 기술분야에 익히 공지되어 있고, 박테리아 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 곤충 세포 또는 포유동물 발현 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. PCV-2 항원을 발현시키는 벡터 및 당해 벡터(또는 재조합체)를 제조 및/또는 사용하는 방법은 본 출원에서 다른 곳에 기재되어 있다.
바람직한 세포는 PCV-2 ORF2 DNA를 함유하고 PCV-2 ORF2 단백질을 발현시키는 적절한 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염에 감수성인 것들이다. 바람직하게는, 당해 세포는 곤충 세포이고, 보다 바람직하게는 이들은 상표명 SF+ 곤충 세포(Protein Sciences Corporation, Meriden, CT)하에 시판되는 곤충 세포를 포함한다. 바람직한 세포 배양물은 세포 계수가 약 0.3 내지 2.0 × 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 1.9 × 106 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 × 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 × 106 세포/mL, 및 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5 × 106 세포/mL이다.
바람직한 바이러스 벡터는 바쿨로바이러스, 예를 들면, BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)를 포함하고, 특히 생성 세포는 곤충 세포이다. 바쿨로바이러스 발현 시스템이 바람직하지만, 당해 분야의 당업자에게는 상기한 것들을 포함하는 기타 발현 시스템도 볼 발명의 목적, 즉 PCV-2 ORF2 항원의 발현을 위해 작동될 것으로 이해된다.
적절한 성장 배지는 당해 분야의 당업자가 결정할 것이고, 바람직한 성장 배지는 혈청 부재 곤충 세포 배지, 예를 들면, Excell 420(JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) 등이다.
PCV-2 ORF2 DNA 서열을 함유하는 재조합 바이러스 벡터의 바람직한 감염 다중도(multiplicity of infection; MOI)는, 감수성 세포의 감염에 사용되는 경우, 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0이다. 바람직하게는 상기 언급된 MOI는 세포 배양 유체 1 mL와 관련된다. 바람직하게는, 본원에 기재된 방법은 PCV-2 ORF2 DNA를 함유하고 MOI(감염 다중도)가 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0인 PCV-2 ORF2 항원 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 사용한 0.35 내지 1.9 × 106 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 × 106 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 × 106 세포/mL의 감염을 포함한다.
이어서, 감염된 세포는 10일 이하, 보다 바람직하게는 약 2일 내지 약 10일, 보다 더 바람직하게는 약 4일 내지 약 9일, 및 가장 바람직하게는 약 5일 내지 약 8일에 걸쳐 배양된다. 바람직한 배양 조건은 약 22 내지 32℃, 보다 바람직하게는 약 24 내지 30℃, 보다 바람직하게는 약 25 내지 29℃, 보다 더 바람직하게는 약 26 내지 28℃, 및 가장 바람직하게는 약 27℃의 온도를 포함한다. 바람직하게는, SF+ 세포는 특징적인 바쿨로바이러스 유도된 변화를 위해 접종 후에 관찰된다. 이러한 관찰은 감염후 기간 동안 세포 밀도 경향 및 생존력의 감소의 모니터링을 포함할 수 있다. 피크 바이러스 역가는 감염 3 내지 5일 후에 관찰되고 세포 내에서 피크 PCV-2 ORF2 항원 생성은 감염 5 내지 8일 후 및 세포 생존력이 10% 이하로 감소될 때에 수득되는 것으로 밝혀졌다.
PCV-2 ORF2 항원은 당해 분야의 당업자에게 공지된 표준 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)에 기재된 것들에 의해 수거물로부터 정제될 수 있다. 이들 방법은 원심분리 및/또는 여과, 침전, 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 공유결합 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원의 회수 공정은 바람직하게는 분리 단계에 의해 발현된 PCV-2 ORF2 항원으로부터 세포 파편의 분리로 개시된다. 바람직한 분리 단계는 여과, 속도 약 20,000×g 이하에서의 원심분리, 연속 플로우 원심분리, 이온 교환 또는 겔 여과를 사용한 크로마토그래피 분리, 및 통상의 면역친화성 방법을 포함한다. 이들 방법은 문헌[참조: E.L.V. Harris and S. Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL Press Oxford 1995]에 의해 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 가장 바람직한 분리 방법은 속도 약 20,000×g 이하에서의 원심분리 및 여과를 포함한다. 바람직한 여과 방법은 중공 섬유 여과 데드-엔드(dead-end) 정밀여과를 포함하는 데드-엔드 정밀여과 및 접선 플로우(또는 교차 플로우) 여과를 포함한다. 이들 중에서, 데드-엔드 정밀여과가 바람직하다. 데드-엔드 정밀여과에 바람직한 기공 크기는 약 0.30 내지 1.35 ㎛, 보다 바람직하게는 약 0.35 내지 1.25 ㎛, 보다 더 바람직하게는 약 0.40 내지 1.1 ㎛, 및 가장 바람직하게는 약 0.45 내지 1.0 ㎛이다. 임의의 통상적인 여과 막이 본 발명의 목적을 위해 작동할 수 있고 폴리에테르설폰 막이 바람직한 것으로 여겨진다. 임의의 저분자량 핵산 종은 여과 단계 동안 제거된다.
PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원의 추가의 정제는 크로마토그래피 공정, 바람직하게는 2단계 크로마토그래피 공정으로 달성될 수 있다. 그러나, 부하 물질이 세포 파편을 포함하지 않는 경우에 크로마토그래피 공정으로 개시할 수도 있다.
PCV-2 항원이 바이러스 유사 입자(VLP)로 조립되는 경우, 제1 단계는 바람직하게는 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피이고, 이는, 예를 들면, Sephacryl S300 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다. 실험실 규모에서, HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR 컬럼의 사용이 가장 바람직하다. 그러나, 세포 배양 여액 또는 상청액으로부터 PCV-2 ORF2 VLP를 분리시키는, 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 기타 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스를 사용할 수 있다. 적합한 매트릭스는, 예를 들면, 문헌[참조: E.L.V. Harris and S. Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL Press Oxford 1995]에 기재되어 있다. 겔 여과 크로마토그래피는, 예를 들면, 컬럼에 PVC-2 항원을 포함하는 조 제제를 1.0 ml/분의 유속으로 부하하고 당해 컬럼을 20 mM Tris(pH 6.5), 5 mM DTT를 포함하는 완충제 1.5 컬럼 용적으로 용출시킴으로써 수행될 수 있다. 그러나, PCV-2 ORF2 항원은 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 예를 들면, 고정된 PCV-2 ORF2 특이적 항체에 대한 선택적 결합, 또는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법에 의해 정제될 수 있다.
따라서, 바람직한 양태에 따라, 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF2 항원 및 보조제를 포함하는 면역원성 조성물은
(a) PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계,
(b) 세포 배양물을 수거하여 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 수득하는 단계,
(c) PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 수거물을 크기 배제 크로마토그래피(겔 여과)에 의해 정제하는 단계, 및
(d) 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 보조제와 혼합하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다.
바람직한 양태에 따라, 크기 배제 크로마토그래피는 상기한 바와 같이, 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행된다. 바람직하게는, 크기 배제는 보조제와 혼합하기 전에 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 순도 등급 80% (w/w) 이상, 바람직하게는 90% (w/w) 이상의 면역원성 조성물을 생성한다. 순도 등급은 NuPAGE MOPS 완충제 시스템(Invitrogen)을 사용하여 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 의한 SDS PAGE 후에 임페리얼 단백질 스테인(Pierce) 염색법으로 평가될 수 있다.
보다 고순도 등급을 수득하기 위해, 제1 단계와 상이한 제2 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 제1 정제 단계/크로마토그래피 단계가 크기 배제(겔 여과)인 경우, 제2 단계는, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등과 같이 제1 단계와 상이해야 한다.
바람직하게는, PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하는 제1 단계가 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피인 경우, 제2 단계는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피(AIEX)일 수 있다. PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 정제하기에 바람직한 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스는 Q Sepharose이다. 약 50ml의 소규모에서, 5 ml HiTrap Q Sepharose HP 컬럼의 사용이 가장 바람직하다. 음이온 교환 크로마토그래피는, 예를 들면, 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 요약하면, 크기 배제 크로마토그래피 단계로부터 약 50 ml의 공극 용적 분획 풀을 AIEX 컬럼에 3.0 ml/분의 유속으로 부하할 수 있다. 예를 들면, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 20 mM Tris(pH 6.5), 5 mM DTT를 사용하는 세척 단계 후, 단백질은 하기 완충제(20 mM Tris, pH 6.5, 5 mM DTT, 1.0 M NaCl)의 8 컬럼 용적의 단일 단계로 용출될 수 있다. AIEX 작동으로부터의 플로우스루는 Q Sepharose 컬럼 상에 다시 부하되고, 수율을 증가시키기 위해 상기한 바와 같이 용출될 수 있다. 이러한 2단계 기술(크기 배제, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피)은 배양 수거물의 다른 단백질 성분 대부분으로부터 PCV-2 ORF2 항원을 효과적으로 분리시킨다.
따라서, 바람직한 양태에 따라, 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원 및 보조제를 포함하는 면역원성 조성물은
(a) PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계,
(b) 세포 배양물을 수거하여 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 수득하는 단계,
(c) PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 수거물을 크기 배제 크로마토그래피(겔 여과), 및 이어서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계, 및
(d) 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 보조제와 혼합하는 단계
를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다.
바람직한 양태에 따라, 크기 배제 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피는 상기한 바와 같이, 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행된다. 바람직하게는, 2단계 정제 전략은 보조제와 혼합하기 전에 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 순도 등급 90% (w/w) 이상, 바람직하게는 95% (w/w) 이상의 면역원성 조성물을 생성한다. 순도 등급은 NuPAGE MOPS 완충제 시스템(Invitrogen)을 사용하여 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 의한 SDS PAGE 후에 임페리얼 단백질 스테인(Pierce) 염색법으로 평가될 수 있다.
상기한 바와 같이, PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV" ORF2 항원의 회수 공정은 분리 단계에 의해 발현된 PCV-2 ORF2 항원으로부터 세포 파편의 분리로 개시한다. 바람직한 분리 단계는 약 0.6 ㎛ 내지 약 2 ㎛의 기공 크기, 바람직하게는 약 0.8 mm 내지 약 1.2 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통한 정밀여과를 포함한다.
따라서, 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원 및 보조제를 포함하는 면역원성 조성물은
(a) PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계,
(b) 세포 배양물을 수거하여 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 수득하는 단계,
(c) 기공 크기 0.6 내지 2.0 ㎛의 필터를 통해 단계(b)하에 수득된 수거물을 여과하는 단계,
(d) PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 포함하고 단계(c)하에 수득된 여액을 크기 배제 크로마토그래피(겔 여과), 및 이어서 임의로 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계, 및
(d) 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 보조제와 혼합하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다.
바람직한 양태에 따라, 정밀여과, 크기 배제 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피는 상기한 바와 같이, 바람직하게는 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행된다. 바람직하게는, 예비 여과 단계를 포함하는 2단계 정제 전략은 보조제와 혼합하기 전에 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 순도 등급 90% (w/w) 이상, 바람직하게는 95% (w/w) 이상의 면역원성 조성물을 생성한다. 순도 등급은 NuPAGE MOPS 완충제 시스템(Invitrogen)을 사용하여 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 의한 SDS PAGE 후에 임페리얼 단백질 스테인(Pierce) 염색법으로 평가될 수 있다.
본원에 기재된 정제된 PVC-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 바람직하게는 본원에 기재된 방법으로 수득할 수 있는 것들은 이러한 정제된 PCV-2 항원 또는 정제된 PCV-2 ORF2 항원을 포함하지 않는 면역원성 조성물과 비교하여 증가된 면역원성을 특징으로 한다.
재조합 폭스바이러스, 아데노바이러스 또는 바쿨로바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용하여 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 생성하는 경우, 바이러스 핵산을 적절한 불활성화 처리에 의해 불활성화시키는 것이 권장된다. 이러한 불활성화는 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원의 정제 동안 언제라도 수행될 수 있다. 따라서, 불활성화는 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 세포 배양 유체의 수거 직후, 또는 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원의 정밀여과 직후, 정밀여과가 수행되는 경우, 정제 단계 전후, 예를 들면, 겔 여과 전후, 및 수행되는 경우, 음이온 교환 크로마토그래피 전후에 수행될 수 있다.
임의의 통상적인 불활성화 방법을 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 따라서, 불활성화는 화학적 및/또는 물리적 처리에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 형태에서, 수거 유체의 용적을 측정하고, 온도를 약 32 내지 42℃, 보다 바람직하게는 약 34 내지 40℃, 및 가장 바람직하게는 약 35 내지 39℃로 되게 한다. 바람직한 불활성화 방법은 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 2 내지 약 10 mM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8 mM, 보다 바람직하게는 약 3 내지 약 7 mM, 가장 바람직하게는 약 5 mM의 농도로 부가 폐환된 이원성 에틸렌이민(BEI)를 포함한다. 예를 들면, 불활성화는 약 5 mM BEI의 최종 농도를 제공하기 위해 유체에 바람직하게는 약 0.4 M의 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드(BEA) 용액(이는 0.3 N NaOH 중의 0.2 M 이원성 에틸렌이민(BEI)으로 폐환된다)의 첨가를 포함한다. 바람직하게는, 유체는 이어서 2 내지 96시간 동안 연속 교반되고, 불활성화된 수거 유체를 -40℃ 또는 약 1 내지 7℃에서 동결 저장할 수 있다. 불활성화를 완결한 후, 티오황산나트륨 용액(바람직하게는 1.0M)을 첨가하여 임의의 잔류하는 BEI를 중화시킨다. 바람직하게는, 티오황산나트륨은 불활성화를 위해 사전에 첨가된 BEI와 비교하여 동등한 양으로 첨가된다. 예를 들면, BEI를 5 mM의 최종 농도로 첨가하는 경우, 1.0M 티오황산나트륨 용액을 첨가하여 5 mM의 최종 최소 농도를 제공함으로써 임의의 잔류 BEI를 중화시킨다.
정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 보조제와 혼합하기 전에, 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 인산염 완충된 염수(pH 7.4) 또는 임의의 기타 생리학적 완충제에 투석하는 것이 권장된다.
상기한 방법은, PCV-2 항원이 임의의 보조제와의 혼합 전에 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 순도 등급 50% (w/w) 이상, 바람직하게는 70% (w/w) 이상, 보다 바람직하게는 80% (w/w) 이상, 보다 더 바람직하게는 85% (w/w) 이상, 보다 더 바람직하게는 90% (w/w) 이상, 가장 바람직하게는 95% (w/w) 이상을 갖는 경우, 개선된 면역원성 뿐만 아니라 본원에 기재된 감소된 살바이러스 활성을 갖는 PCV-2 항원을 생성한다. 그러나, 당해 방법 II에 따라 수득할 수 있는 정제된 PCV-2 항원은 보조제, 바람직하게는 본원에 기재된 임의의 보조제와 혼합되고 이와 함께 사용될 수 있다. 바람직한 보조제는 최종 면역원성 조성물 중의 약 0.1 내지 10 mg/ml의 농도, 보다 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/ml의 농도, 가장 바람직하게는 약 1 mg/ml의 농도의 카보폴(Carbopol)이다.
또한, 본 발명은 대체 방법 II를 포함하는 본원에 기재된 임의의 방법을 제공할 뿐만 아니라 대체 방법 II를 포함하는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수득할 수 있는 PCV-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 항원, 가장 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF-2 단백질을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 대체 방법 II를 포함하는 본원에 기재된 임의의 방법으로 수득할 수 있는 PCV-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 항원, 가장 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF-2 단백질을 포함하는 PCV-2 항원성 조성물을 제공한다. 최종 면역원성 조성물 중의 PCV-2 항원, 특히 정제된 PCV-2 ORF2 항원의 양은 최종 면역원성 조성물을 기준으로 하여 용량당 약 0.25 내지 약 400 ㎍의 범위이어야 한다. 바람직하게는, 최종 면역원성 조성물은 약 2 내지 약 200 ㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 3 내지 약 150 ㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 4 내지 약 100 ㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 80 ㎍/용량, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 60 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 7 내지 약 50 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 8 내지 약 40 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 8 내지 약 32 ㎍/용량, 보다 더 바람직하게는 약 8 내지 약 24 ㎍/용량, 및 가장 바람직하게는 약 8 내지 약 16 ㎍/용량 범위로 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원의 양을 포함하여야 한다.
방법 II에 의해 수득할 수 있는 것들을 포함하여 본원에 제공된 면역원성 조성물은 또 다른 질병 유발균의 하나 이상의 추가의 항원을 포함한다. 이들 "또 다른 질병 유발균"은 상기 정의되어 있다. 바람직하게는, 추가의 항원은 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스이다. 보다 더 바람직하게는, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 생 바이러스, 및 보다 더 바람직하게는 변형된 생 바이러스를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 변형된 생 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원은 ATCC 수탁번호 VR 2332의 변형된 생 바이러스 균주를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 INGELVAC? PRRS MLV를 포함한다. 본 출원의 추가의 측면에서, 추가의 항원은 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에이다. 바람직하게는, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원은 박테린이고, 보다 바람직하게는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린은 INGELVAC? MYCOFLEX이다. 가장 바람직하게는 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에의 항원 둘다와의 배합물이다.
본원에 제공된 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 면역원성 조성물의 증가된 면역원성에 기인하여, 당해 면역원성 조성물은 당해 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 PCV-2 감염에 의해 유발되거나 이와 관련되는 임상 징후의 발병률 또는 중증도를 감소시키는데 사용될 수 있다.
용어 "임상 징후의 발병률 또는 중증도의 감소"는, 둘 다 백신 중의 면역학적 활성 성분(들)을 유도하는 병원체로 감염되거나 이에 의해 공격받고 대조군 그룹에는 백신 또는 면역원성 조성물의 투여를 제공하지 않은 경우, 동물의 "대조군 그룹"과 비교하여 백신 투여를 제공한 동물의 발병률 또는 중증도에서 이러한 임의의 징후가 감소됨을 의미할 것이다. 이와 관련하여, 용어 "감소" 또는 "저하"는 백신 처리하지 않은 대조군 그룹과 비교하여 백신 처리된 그룹에서 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 더 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이상의 감소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "임상적 증상" 또는 "임상적 징후"는 증상 등과 같이 살아 있는 동물로부터 직접 관찰할 수 있는 병원체로부터의 감염 징후를 지칭한다. 대표적인 예는 선택된 병원체에 따라 달라질 수 있지만, 콧물, 기면, 기침, 고열, 체중 증가 또는 손실, 탈수증, 설사, 부기, 파행 등의 것들을 포함할 수 있다. PCV-2 임상 징후는 쇠약, 피부 창백, 수척, 호흡 곤란, 설사, 황화 및 황달을 포함할 수 있다.
동물에서 PCV-2 감염에 의해 유발되거나 이와 관련되는 임상 징후의 발병률 또는 중증도의 감소는 이러한 치료를 필요로 하는 동물에게 이러한 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 본원에서 제공된 면역원성 조성물은 2회 이상의 용량으로 최초 용량과 임의의 후속 용량의 투여 사이에 2 내지 4주 간격으로 투여될 수 있다. 따라서, 추가의 양태에 따라, 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 본원에서 제공된 면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 동물에게 1회, 2회 또는 그 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
특히, 본 출원의 추가의 측면에서, 동물에게 투여되는 경우, 면역원성 조성물이 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 림프구 고갈 및 염증을 80% 이상 감소시키는, 상기한 바와 같은 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에서, 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여, 면역원성 조성물의 투여를 제공한 동물에서 림프구 고갈 및 염증을 80% 이상 감소시키는 상기한 바와 같은 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다.
본 출원의 추가의 측면에서, 동물에게 투여하는 경우, 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여, 당해 면역원성 조성물이 동물에서 폐 병변을 80% 이상 감소시키는, 상기한 바와 같은 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에서, 상기한 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 당해 면역원성 조성물은 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 면역원성 조성물의 투여를 제공한 동물에서 폐 병변을 80% 이상 감소시킨다.
본 발명의 추가의 측면에서, 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여 후에 당해 면역원성 조성물이 PCV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 상기한 바와 같은 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물은 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml 이상을 포함하는 임의의 용적일 수 있다. 바람직한 형태에서, 2 ml의 면역원성 조성물은 1회 용량의 PCV-2 항원을 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에서, 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여 후에, PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 PCV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 상기한 바와 같은 면역원성 조성물이 제공된다. 추가의 측면에서, 2 ml의 면역원성 조성물은 1회 용량의 PCV-2 항원을 포함한다.
본원에 사용된 "보호 면역 반응"은 목적하는 병원체로부터의 감염의 임상적, 병리학적 또는 조직병리학적 징후 또는 증상의 감소된 발병률 또는 감소된 중증도를 지칭하고 이러한 징후 또는 증상의 완전한 예방을 포함한다.
용어 "병리학적" 징후는, 현미경 또는 분자 수준에서, 생화학적 시험을 통해 또는 부검시 육안으로 관찰할 수 있는 감염의 징후를 지칭한다. PCV-2의 경우, 병리학적 징후는 다수의 조직 및 기관 상의 미시적 및 거시적 병변을 포함하고, 림프구 기관이 병변에 대한 가장 통상적인 부위이다.
용어 "조직병리학적" 징후는 감염으로부터 유발된 조직 변화의 징후를 지칭한다.
용어 "임상적 증상" 또는 "임상적 징후"는 상기 정의한 바와 같다.
본 발명의 추가의 측면에서, 면역원성 조성물의 1회 용량의 투여 후, 당해 면역원성 조성물이 PRRS 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, PCV-2 항원성 조성물 및 PRRS 항원, 바람직하게는 본원에 기재되고 상기 기재된 바와 같은 PRRS 항원들 중의 어느 하나를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 또한, 임의의 투여량의 용적이 생성될 수 있지만, 바람직한 형태에서 2 ml의 면역원성 조성물은 1회 용량의 PRRS 항원 및 1회 용량의 PCV-2 항원을 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에서, 1회 용량의 면원원성 조성물의 투여 후, 면역원성 조성물이 PRRS에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 본원에 기재된 PRRSV 및 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 상기한 바와 같은 면역원성 조성물이 제공된다. 추가의 측면에서, 2 ml의 면역원성 조성물은 1회 용량의 PRRS 항원 및 1회 용량의 PCV-2 항원을 포함한다.
본 발명의 추가의 측면에서, 1회 용량의 면역원성 조성물의 투여 후, 면역원성 조성물이 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 상기 기재된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 또한, 임의의 투여량 용적이 생성될 수 있지만, 바람직한 형태에서, 2 ml의 면역원성 조성물은 1회 용량의 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원 및 1회 용량의 PCV-2 항원을 포함한다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에서, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함하는 1회 용량의 면역원성 조성물의 투여 후, 당해 면역원성 조성물이 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 상기한 면역원성 조성물이 제공된다. 추가의 양태에서, 2 ml의 면역원성 조성물은 1회 용량의 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함한다.
본 출원의 추가의 측면에서, 상기한 바와 같은 면역원성 조성물은 용량당 2 ml의 투여용으로 제조된다.
본 출원의 추가의 측면에서, 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 하나 이상의 PCV-2 감염의 임상 증상을 감소시키는 방법이 제공된다. 일반적으로, 당해 방법은 상기한 바와 같은 PCV-2 항원 또는 조성물을 포함하는 임의의 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 PCV-2 감염의 임상 증상은 1회 용량의 면역원성 조성물의 투여 후에 감소된다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에 따라, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 하나 이상의 PCV-2 감염의 임상 증상을 감소시키는 방법이 제공된다. 일반적으로, 당해 방법은 상기한 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 임의의 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 1회 용량의 면역원성 조성물의 투여 후, 하나 이상의 PCV-2 감염의 임상 증상이 감소된다.
본 출원의 추가의 측면에서, 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 하나 이상의 PRRS 감염의 임상 증상을 감소시키는 방법이 제공된다. 일반적으로, 당해 방법은 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 본원에 기재된 PRRS 바이러스를 포함하는 상기 기재된 임의의 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 본원에 기재된 PRRS 바이러스를 포함하는 1회 용량의 면역원성 조성물의 투여 후, 하나 이상의 PRRS 감염의 임상 증상이 감소된다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에 따라, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 본원에 기재된 PRRS 바이러스를 포함하는 면역학적 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 하나 이상의 PRRS 감염의 임상 증상을 감소시키는 방법이 제공된다. 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스(PRRSV)의 임상적 징후는 식욕부진, 고열, 유산, 일시 변색, 장기간 발정말기, 기침, 호흡 징후, 유방염, 무유, 기면, 건사 새끼돼지(mummified piglet), 사산, 출생시 약한 새끼돼지, 분만율 감소, 조산, 설사, 쇠약, 재채기, 눈 분비물, 창백한 피부, 사망 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 출원의 추가의 측면에서, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 본원에 기재된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여, 동물에서 하나 이상의 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 감염의 임상 증상을 감소시키는 방법이 제공된다. 일반적으로, 당해 방법은 상기 기재된 임의의 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 본원에 기재된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함하는 1회 용량의 면역원성 조성물의 투여 후, 하나 이상의 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 감염의 임상 증상이 감소된다. 따라서, 본 출원의 추가의 측면에 따라, 본원에 기재된 PCV-2 항원성 조성물 및 본원에 기재된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여, 동물에서 하나 이상의 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 감염의 임상 증상을 감소시키는 방법이 제공된다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에(M. hyo) 감염의 임상적 징후는 마른 기침, 손상된 수행능력 및 폐 병변을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 제공된 바와 같은 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원을 포함하는 면역원성 조성물은 개선된 면역원성을 갖는다. 따라서, 본원에 제공된 면역원성 조성물은 이러한 면역원성 조성물을 제공한 동물에서 면역 반응을 개선시키는데 적합하다. 따라서, 추가의 양태에 따라, 본 발명은, 본원에 제공된 정제된 PCV-2 항원, 바람직하게는 정제된 PCV-2 ORF-2 단백질을 갖는 본원에 기재된 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 PCV-2에 대한 동물의 면역 반응을 개선시키는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에 따라, 이러한 방법에 사용된 PCV-2 항원, 바람직하게는 PCV-2 ORF2 항원은 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 60% (w/w) 이상, 바람직하게는 60% (w/w) 이상, 보다 바람직하게는 70% (w/w) 이상, 보다 바람직하게는 80% (w/w) 이상, 보다 더 바람직하게는 90% (w/w) 이상, 가장 바람직하게는 95% (w/w) 이상의 정도로 정제된다. 순도 등급은 NuPAGE MOPS 완충제 시스템(Invitrogen)을 사용하여 NuPAGE 10% Bis-Tris 겔(Invitrogen)에 의한 SDS PAGE 후에 임페리얼 단백질 스테인(Pierce) 염색법으로 측정될 수 있다. PCV-2, 및 바람직하게는 PCV-2 ORF2는 당해 분야의 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 측면을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중의 하나 이상을 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1은 여과 공정 후 ORF 2의 존재를 나타내는 10% Bis-Tris/MOPS 겔을 사용하는 한외여과 배치 파일럿 규모(pilot scale)의 결과를 나타낸다. 레인에 다음과 같이 부하한다: (1) 마커; (2) n/a; (3) n/a; (4) 24 - 180/181 pre conc - 20㎕; (5) 25 - 180/181 1x 항원 - 20㎕; (6) 26 - 180/181 필터 세척액 - 20㎕; (7) 27 - PCV 504 Preconc - 8㎕; (8) 28 - PCV 504 Perm - 20㎕; (9) 29 - PCV 504 1X - 20㎕; (10) 092704PD - 20㎕; (11) 마커.
다음 실시예는 본 발명에 따르는 바람직한 물질 및 과정을 나타낸다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시로 제공되고, 본원에서 어떤 것도 본 발명의 전체 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 하는 것으로 이해된다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 단계들을 포함하지 않는 제조 공정과 비교하여 살바이러스 활성이 감소된 농축 PCV-2 ORF2 항원을 제조하기 위한 실험실 규모 및 파일럿 규모 공정을 기술한다. 구체적으로, 본 발명이 PRRS 바이러스에 대한 PCV-2 ORF2 항원의 살바이러스 활성을 갖는 효과가 측정될 것이다.
물질 및 방법
생산 항원:
실험실 규모:
PCV SUB037 H1-F, 18.94 kg
PCV 1025, 20.6 kg
PCV 180/181, 20.0 kg
PCV SUB 504PD, 40kg
파일럿 규모:
PCV SUB 506PD, 362 kg
PCV SUB 507PD, 384 kg
PCV SUB512PD, 430 kg
PCV SUB 513PD, 405 kg
한외 여과 카트리지: GE Healthcare, 스팀-인-플레이스(Steam-In-Place)(SIP), 중공 섬유 막 카트리지
UFP-100-E-55-STM: 100,000 NMWC, 1mm 직경 세관; X109 중의 UF-002에 사용됨, 실험실 규모.
UFP-300-E-55-STM: 300,000 NMWC, 1mm 직경 세관; X109 중의 UF-002에 사용됨, 실험실 규모.
UFP-100-E-65-MSM: 100,000 NMWC, 1mm 직경 세관; APU-1 중의 UF-B2614에 사용됨, 파일럿 규모.
UFP-300-E55-SMO: 300,000 NMWC, 1mm 직경 세관; VP-1 중의 UF-2713에 사용됨, 파일럿 규모.
다음 한외여과 장치를 실현 가능성 평가 및 초기 공정 개발에 사용했다.
Figure pct00001
제조 공정:
한외여과(UF) 배치: 실험실 규모
빌딩 P에서 생성된 여과된, 불활성화된, 중화된 PCV-2 ORF2 물질을 함유하는 50ℓ 카보이를 GE Healthcare(Amersham) Flex Stand 30L 사이즈 UF skid #002를 사용하는 농축 공정에 사용했다.
초기 농축 공정은 "배치" 투석여과 계획(scheme)을 사용하고, 이에 의해 약 20kg의 항원 물질을 UF skid로 옮기고, 100,000 NMWC 중공 섬유 카트리지(UFP-100-E-55-STM)를 통해 농축시켰다. 100,000 NMWC 농축 공정은 각각 PD 및 매뉴팩쳐링으로부터 PCV-2 ORF2 lots SUB037PD 및 PCV1025 물질을 사용하였다.
이러한 두 개의 초기 작동은 원래 용적의 약 4배로 농축시키고, 원래의 전달 용적으로 반환된 급수조(feed tank)에서 Q.S.'d(입증된 양)이었다. 농축된 물질은 제품번호당 총 2회의 농축에 대해 이러한 방식으로 처리하고, 제3 및 최종 농축은 원래 용적의 1배로의 농축물 및 일부 Q.S.'d로서 수거했다. 샘플은 각 농축 단계 및 각 Q.S. 단계에서 예비 농축물을 취출했다. 침투 샘플은 각 농축 단계 동안 취출했다.
다음 2개의 연속 작동은 염수 세척 없이 PCV-2 ORF2 항원을 농축시켰다. 농축된 물질을 약 4배에서 샘플링한 다음, 최종 농도에서 샘플링했다. 약 20kg의 항원 물질을 UF skid 유지 탱크로 옮기고, 300,000 NMWC 중공 섬유 카트리지(UFP-300-E-55-STM)를 통해 농축시켰다. 제2의 20L 용적을 제1의 20L로부터의 농축물과 함께 유지 탱크에 첨가했다. 이를 최종 용적으로 농축시켰다. 300,000 NMWC 농축 과정은 각각 메뉴팩쳐링(Manufacturing) 및 PD에 의해 생산된 PCV-2 ORF2 lots PCV 180/181 풀 및 SUB504PD를 사용했다. 샘플은 각각의 농축 단계에서 예비 농축물을 취출했다. 침투 샘플을 각각의 농축 단계 동안 취출했다.
한외여과 배치: 파일럿 규모
파일럿 규모 공정은 SUB lots 506PD, 512PD 및 513PD를 사용했다. 항원 예비 농축물 용적은 약 350L 내지 430L이다. Lots SUB506PD 및 SUB513PD를 DSP(다운-스트림 공정) 2602로 옮기고, 표면적 4.2m2인 100,000 NMWC 필터(UFP-100-65-E-MSM)를 사용하여 APU-1 중의 UF-B2614로 농축시켰다. SUB512PD를 DSP 2701로 옮기고, 표면적 2.1m2인 300,000 NMWC 필터(UFP-300-E-SMO)를 사용하여 UF-2713으로 농축시켰다. 최종 농축 물질을 각 로트(lot)를 위해 수거하고, 분석을 위해 4℃에서 저장했다.
결과 및 결론
한외여과(UF) 배치: 실험실 규모
100,000 NMWC (lOOkDa) 대 300,000 NMWC (300kDa) 필터에 의한 여과는 농축 시간에서 비교가능하고, 전체 규모 공정을 고려할 경우 실행가능하다. 약 18L 내지 26L로 4배 농축된 lOOkDa 필터에 대한 여과 시간은 14분 내지 32분이고, 보다 더 짧은 시간이 염수 세척 단계로부터 초래된다(표 2). 2개의 연속 20L 용적에서 농축된 약 40mL의 물질로 PCV180/181에 대해 3.2배, 7배 및 SUB504PD에 대해 21.5배로 농축된 300kDa 필터에 대한 여과 시간은 25분에서 3.2배, 23분에서 7배 및 32분에서 21.5배의 농축을 수득한다. 농축 공정을 목표 막간 정수압(trans-membrane pressure; TMP) 10.25psi에 달하도록 하는데 소요되는 시간에 기인하여 약간의 시간 편차가 예상된다.
공정 유동 값은 PCV180/181 lot에 대해 27.43 lmh 내지 32.00 lmh이고, 32.00 lmh 값은 농축 공정의 말단을 향한 스파이크(spike)로부터 초래된다. SUB 504PD 물질에 대한 유동 값은 제1-20L 농축 동안 28.57 lmh이고, 제2-20L 농축 동안 35.71 lmh였다(표 3 및 4).
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여과 후 효능의 변화는 농축 물질이 1배 용적으로 반환된 Q.S.'d일 경우에 SUB 037 재구성 물질 및 PCV 1025 재구성 물질에 의한 경우처럼 변하지 않는 것으로 밝혀졌다. 농축 항원 함량 값은 항원 함량이 예상된 산출량과 비교되는 표 5 내지 8의 값에 제시된 바와 같이, 인가된 약 64㎍ 한계를 초과하는 분석 한계를 추진한다. SUB 037, PCV 180/181 및 SUB 504PD 항원을 사용하여 수행된 농축물로부터의 침투 값은 여과에 기인하는 물질의 뚜렷한 손실을 나타내지 않는다. 모든 침투 항원 함량은 검출될 수 없는 분석 범위 내에 있다. PCV 1025 항원 침투 항원 함량은 수집되지 않았다.
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SDS-PAGE 겔은 R&D 중의 PCV 180/181 및 SUB 504PD로부터의 물질로 수행했다. 도 1에서 약 27kDa에 존재하는 ORF2 밴드는 레인 10의 기준 밴딩 패턴과 일치했다. 이 밴드 크기는 이미 ORF2로 결정되었다. SUB 504PD, 300kDa 여과 농도로부터의 침투 물질은 27kDa 위치에서 밴딩의 부재를 나타냈다. 어떤 ORF2 단백질도 이 기공 크기 필터로 명백하게 소실되지 않았다. 겔은 감소 조건하에 수행되었다.
예비 농축 항원, 농축된 항원, 재구성된 항원 및 여과 침투액의 살바이러스 활성을 PRRS 바이러스 백신에 대해 시험했다. SUB 037에 대한 품질 관리(QC)로부터의 초기 결과는 염수에 의해 1배로 다시 재구성된 예비 농축 물질 및 농축된(lOOkDa 필터) 물질에 대해 불만족스러웠다. 그러나, 농축된 물질이 백신으로 제형화될 경우, 백신 중에 포함된 80% 이하의 농도는 PRRS 바이러스 역가의 0.7 log/ml 손실의 허용 한계 이하로 충분히 만족스러운 수준으로 살바이러스 활성을 감소시킨다. SUB 037로부터의 침투 물질은 불만족스러운 수준의 살바이러스 활성으로 통과하는 경계선을 나타낸다. 표 9를 참조한다.
PCV 1025 예비농축된 물질은 1.5 log/ml 손실에서 PRRS 역가의 손실을 갖는 PRRS에 대한 살바이러스 활성이 불만족스러운 것으로 밝혀졌다. 3개의 염수 재구성된 농축(lOOkDa 필터) 물질은 0.5 log/ml 손실 및 0.6 log/ml 손실에서 통과했고, 재구성된 농축물 중의 하나는 PRRS 역가에서 "변화 없음"으로 만족스럽다. 침투 샘플은 이 로트에 대해 시험하지 않았다. 표 10을 참조한다.
PCV 180/181 예비농축된 백신 물질은 제조된 3개의 백신 중의 2개에 대해 PRRS에 대한 살바이러스 활성이 불만족스러웠다. 항원 포함율(%) 수준은 37.0% 내지 55.5%였다. 최고 예비농축 백신 포함율(%)은 만족스러운 것으로 밝혀졌다.
1배로부터 제조된 백신(염수를 사용하여 1배로 재구성된 농축물) 물질은 PRRS 바이러스에 대한 살바이러스 활성에 대해 만족스러운 것으로 밝혀졌다. 항원 포함율(%) 수준은 44% 내지 66%였다. 표 11을 참조한다.
79.5% 백신 포함율의 예비농축 항원으로부터 제조된 SUB 504PD 백신은 PRRS 바이러스에 대한 살바이러스 활성에 대해 만족스러웠다. 23.5-35% 백신 포함율의 4.3배 농축 항원 및 3.5-5.5% 백신 포함율의 21.5배 농축 항원으로부터 제조된 백신들도 또한 만족스러웠다. 최종적으로, 72% 포함율 수준으로 제조된 필터 세척 항원은 PRRS 바이러스에 대한 살바이러스 활성이 만족스러운 것으로 밝혀졌다.
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논의
돼지 서코바이러스 백신, 타입 2, 죽은 바쿨로바이러스 바이러스 벡터는 미조리주 요셉가의 베링거 잉겔하임 베트메디카, 인코포레이티드(Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.)로부터 제조된 세계적인 제품이고, INGELVAC CIRCOFLEX? 제품에 사용된다. 수거시, 바이러스 유체를 하나 이상의 2 내지 15㎛ 예비필터에 이어, 최종 여과를 위해 0.8 내지 1.0㎛ 필터를 통해 무균 여과한다. BEI(이원성 에틸렌이민) 저장 용액을 수거된 유체에 최종 농도 5mM BEI로 첨가한다. 유체를 최소 72시간, 최대 96시간 동안 계속 교반시키고, 40℃ 이하에서 또는 4℃±3℃에서 동결 저장할 수 있다. 1.0M 티오황산나트륨 용액을 최종 농도 5mM로 첨가하여 임의의 잔류성 BEI를 중화시킨다.
중화된 항원을 상대적 효능의 최소 방출 요건 1.0 이상을 충족시키기 위해 염수를 첨가하여 조정된 최종 생성물 중의 PCV-2 ORF2 단백질 함량과 함께 20% v/v로 되도록 0.5% 카보폴 용액과 블렌딩한다. 벌크화 후, 연속물은 4℃에서 저장되거나 충전될 수 있다.
PCV-2 ORF2 물질은 중공 섬유 카트리지 한외여과에 의해 농축 후중화시켰다. 농축된 물질을 염수 용액의 2개의 투석여과 용적으로 추가로 처리했다. 바람직한 한외여과 공칭 분자량 컷-오프(NMWC) 기공 크기는 각각 1.0mm 세관 루멘 직경을 갖는 100,000 NMWC 및 300,000 NMWC를 포함하는 것으로 측정되었다. 두 기공 크기는 제조업자에 의해 필터 카트리지의 중단 공급의 경우에 제조시 유연성을 제공하기 위해 포함되었다. 나트튬 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE) 겔 및 효능 데이터는 두 필터 기공 크기 간의 항원 단백질 또는 효능 차이를 나타내지 않았다.
실시예 2
본 실시예는 본 발명의 방법을 사용하는 ORF2의 상대적 수율을 종래 기술 분야에 공지된 방법과 비교한다. 본 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하기 위한 PCV-2 ORF2를 수득하기 위한 많은 가능한 방법들 중의 하나를 나타낸다는 것을 이해한다.
물질 및 방법
4개의 lOOOmL 스피너 플라스크에 300mL 곤충 혈청 부재 배지, Excell 420(JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) 중의 약 1.O × 1O6 Sf+ 세포/ml를 각각 씨딩했다. 마스터 세포 배양액은 SF+ (스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)) 마스터 세포 스톡, 계대 19, Lot#N 112-095 W로서 동정되었다. SF+ 마스터 세포 스톡을 생성하는데 사용된 세포는 코넥티컷주 메리덴의 프로테인 사이언시즈 코포레이션, 인코포레이티드(Protein Sciences Corporation, Inc.)로부터 수득되었다. 본 실시예용 SF+ 세포주는 계대 19와 59 사이로 제한되었다. 기타 계대는 본 발명의 목적을 위해 사용되지만, 대규모 생산을 위한 공정을 확대하기 위해, 적어도 19 계대가 아마도 필요하고, 59 초과의 계대는 발현에 효과를 가질 수 있지만, 이는 조사되지 않았다. 보다 상세하게, 액체 질소 저장으로부터 초기 SF+ 세포 배양액을 일정하게 진탕시키면서 멸균 스피너 플라스크 중의 현탁액 중의 Excell 420 배지 중에서 성장시켰다. 배양물을 100mL 내지 250mL 스피너 플라스크 중에서 25 내지 150mL의 Excell 420 혈청 부재 배지와 함께 성장시켰다. 세포를 세포 밀도 1.0 내지 8.0 × 106 세포/mL로 증식시킬 경우, 이들은 이식 밀도 0.5 내지 1.5 × 106세포/mL로 새로운 용기에 분할시켰다. 후속적 증식 배양물은 크기 36ℓ 이하의 스피너 플라스크에서 또는 300ℓ 이하의 스테인레스 강 바이오반응기에서 2 내지 7일 동안 25 내지 29℃에서 성장시켰다.
씨딩 후, 플라스크를 27℃에서 4시간 동안 배양했다. 이어서, 각 플라스크에 PCV-2 ORF2 유전자(서열번호 4)를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스를 씨딩했다. PCV-2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스는 다음과 같이 생성했다: PCV-2의 노스 아메리칸 균주로부터의 PCV-2 ORF2 유전자는 5' Kozak's 서열(서열번호 1) 및 3' EcoRl 부위(서열번호 2)를 함유하도록 PCR 증폭하고, pGEM-T-Easy 벡터(Promega, Madison, WI) 내로 클로닝했다. 이어서, 이를 절단하고, 전송 벡터 pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) 내로 서브클로닝했다. 서브클로닝 부위는 본원에서 서열번호 7로서 제시된다. PCV-2 ORF2 유전자를 함유하는 pVL1392 플라스미드는 N47-064Y라고 지정된 후, PCV-2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스를 생성하기 위해 Sf+ 곤충 세포(Protein Sciences, Meriden, CT) 내로 BaculoGold?(BD Biosciences Pharmingen) 바쿨로바이러스 DNA로 공-형질감염시켰다. 새로운 작제물은 본원에서 서열번호 8로서 제공된다. PCV-2 ORF2 유전자를 함유하는 재조합 바쿨로바이러스는 플라크-정제되고, 마스터 씨드 바이러스(MSV)를 SF+ 세포주 상에서 번식시키고, 분획화하고, -70℃에서 저장했다. MSV는 바쿨로바이러스 특이적 프라이머를 사용하는 PCR-RFLP에 의해 PCV-2 ORF2 바쿨로바이러스로서 명백하게 확인되었다. MSV 또는 작용 씨드 바이러스를 생성하기 위해 PCV-2 ORF2 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포는 간접 형광 항체 분석으로 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날 항체에 의해 검출된 PCV-2 ORF2 항원을 발현시킨다. 추가로, PCV-2 ORF2 바쿨로바이러스의 동일성은 N-말단 아미노산 서열분석으로 확인되었다. PCV-2 ORF2 바쿨로바이러스 MSV는 또한 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28, 및 113.55에 따라 순도에 대해 시험했다. 스피너 플라스크 내에 씨딩된 각각의 재조합 바쿨로바이러스는 가변적인 감염 다중도(MOI)를 가졌다. 플라스크 1에 7.52mL의 .088 MOI 씨드를 씨딩하고; 플라스크 2에 3.01mL의 0.36MOI 씨드를 씨딩하고; 플라스크 3에 1.5mL의 0.18MOI 씨드를 씨딩하고; 플라스크 4에 0.75mL의 0.09MOI 씨드를 씨딩했다.
바쿨로바이러스로 씨딩 후, 플라스크를 7일 동안 27 ± 2℃에서 배양하고, 그 시간 동안 100rpm에서 또한 진탕시켰다. 플라스크는 기류를 허용하기 위해 환기된 캡을 사용한다. 각각의 플라스크로부터의 샘플을 다음 7일 동안 24시간 마다 취했다. 추출 후, 각각의 샘플을 원심분리하고, 펠릿 및 상청액 모두를 분리한 다음, 0.45-1.0㎛ 기공 크기 막을 통해 정밀여과시켰다.
결과 및 결론
이어서, 생성되는 샘플은 이들 내부에 존재하는 ORF2의 양을 ELISA 분석을 통해 정량화했다. ELISA 분석은 포획 항체 돼지 항-PCV-2 Pab IgG Prot로 수행했다. 정제된 G(PBS 중에서 1:250 희석됨)를 0.05M 카보네이트 완충제(pH 9.6) 중에서 1:6000으로 희석시켰다. 이어서, 100㎕의 항체를 미세역가 플레이트의 웰에 위치시키고, 밀봉하고, 37℃에서 밤새 배양했다. 이어서, 플레이트를 0.5mL의 Tween 20(Sigma, St. Louis, MO), lOOmL의 10배 D-PBS (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 899.5mL의 증류수를 포함하는 세척 용액으로 3회 세척했다. 이어서, 250㎕의 블록킹 용액(10ml의 D-PBS QS 중의 5g 카네이션 무지방 무수 분유(Nestle, Glendale, CA)를 증류수로 100mL까지 채운 용액)을 각각의 웰에 첨가했다. 다음 단계는 시험 플레이트를 세척한 다음, 예비희석된 항원을 첨가하는 것이었다. 예비희석된 항원은 희석 플레이트 상에서 각각의 웰에 200㎕의 희석 용액(999.5mL D-PBS 중의 0.5mL Tween 20)을 첨가하여 생성했다. 이어서, 샘플을 1:240 비 및 1:480 비로 희석시킨 다음, 이러한 희석된 샘플 각각 100μL를 희석 플레이트 상의 상부 웰들 중의 하나에 첨가했다(즉, 하나의 상부 웰은 100μL의 1:240 희석물을 수용하고, 나머지는 100μL의 1:480 희석물을 수용한다). 이어서, 나머지 플레이트를 위해 각각의 연속 웰로부터 100μL를 제거하고, 이를 플레이트 상의 다음 웰로 옮겨 일련의 희석을 수행했다. 다음 전달을 수행하기 전에 각각의 웰을 혼합했다. 시험 플레이트 세척은 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척함을 포함했다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고, 세척 완충제로 3회 더 세척하기 전에 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 사용된 검출 항체는 PCV ORF2에 대한 모노클로날 항체였다. 이를 희석 용액 중에 1:300으로 희석시킨 다음, 100μL의 희석된 검출 항체를 웰에 첨가했다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고, 세척 완충제로 3회 세척하기 전에 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 이어서, 접합 희석제는 표준 래빗 혈청(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)을 희석제 용액에 1% 농도로 첨가하여 제조했다. 접합 항체 염소 항-마우스(H+1)-HRP(Jackson Immunoresearch)를 접합 희석제 중에 1:10,000으로 희석시켰다. 이어서, 100μL의 희석된 접합 항체를 각각의 웰에 첨가했다. 이어서, 플레이트를 밀봉시키고, 세척 완충제로 3회 세척하기 전에 37℃에서 45분 동안 배양했다. 동일 용적의 퍼옥시다제 기질 B(Kirkgaard and Perry Laboratories(KPL))과 혼합된 100μL의 기질(TMB 퍼옥시다제 기질, KPL, Gaithersberg, MD)을 각각의 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양했다. 이어서, 100μL의 1N HCL 용액을 모든 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이어서, 플레이트를 ELISA 판독기를 통해 작동시켰다.
이 분석의 결과는 이하 표 17에 제공된다:
Figure pct00016
이들 결과는 배양 시간이 연장될 경우, 원심분리된 세포 및 배지의 상청액 내의 ORF2의 발현이 원심분리된 세포 및 배지의 펠릿 중에서의 발현을 초과한다는 것을 나타낸다. 따라서, ORF2 발현을 5일 미만 동안 진행시키고 세포로부터 ORF2를 회수하는 것보다 5일 이상 동안 ORF2 발현을 진행시키고, 이를 상청액 중에서 회수하는 것이 ORF2 수율에서의 큰 증가를 제공하고, 종래의 방법에 비해 현저한 향상을 제공한다.
실시예 3
ORF2의 정제는 2-단계의 크로마토그래피 계획이 후속되는 정밀여과 공정에 의해 달성되었다. 실시예 1에서 수득된 수거물은 기공 크기 1.2㎛의 미세필터 막을 통해 여과시켰다. 이어서, 정밀여과물을 HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR 컬럼을 사용하는 크기 배제(겔 여과)로 정제했다. PCV-2 ORF2를 포함하는 20ml의 여과물의 출발 샘플을 HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR 컬럼 상에 1.0ml/분의 유속으로 부하하고, 완충제 A(20mM Tris, pH 6.5, 5mM DTT)의 1.5 컬럼 용적으로 용출시켰다. 8ml 분획물을 용출 단계 동안 수집했다. 크기 배제 크로마토그래피로부터 분획물 번호 10 내지 16(용출액 중의 10 내지 16 ml)을 풀링하고, 음이온 교환(AIEX) 크로마토그래피용 출발 샘플로서 사용했다. 이러한 분획물은 사이징 컬럼의 공극 용적을 나타내고, 이는 PCV-2 ORF2가 고분자량의 PCV-2 ORF2 단백질에 기인하여 용출되는 경우이다. 이 기술은 ORF2를 항원 샘플의 대부분의 기타 단백질 성분으로부터 효과적으로 분리한다.
AIEX는 5ml HiTrap Q Sepharose HP 컬럼을 사용하여 수행했다. 크기 배제 실험으로부터 약 48ml의 공극 용적 분획 풀을 AIEX HiTrap Q Sepharose HP 컬럼 상에 3.0ml/분의 유속으로 부하했다. 비결합된 물질을 제거하기 위해 완충제 A(20mM Tris, pH 6.5, 5mM DTT)의 부하와 함께 세척 단계 후, 단백질을 완충제 B(20mM Tris, pH 6.5, 5mM DTT, 1.0M NaCl)의 8컬럼 용적의 단일 단계로 용출시키고, 5ml 분획물을 수집했다. 피크 분획물 번호 8 및 9를 수집하고, 풀링했다. AIEX 작동으로부터의 플로우스루를 Q Sepharose 컬럼 상에 다시 부하하고, 상기한 바와 같이 용출시켰다. 제2 유출로부터, 분획물 번호 7, 8 및 9를 제1 유출로부터의 분획물과 함께 풀링했다. 플로우스루 물질의 제3 유출은 용출액 중의 현저한 피크 분획물을 유도하지 않았고, 따라서 어떤 분획도 그 유출로부터 저장되지 않았다.
약 25ml의 분획 풀을 2 L의 인산염 완충된 염수, pH 7.4 (Gibco)에서 4℃에서 밤새 투석했다. 투석 후, ORF2는 SDS-PAGE 분석에 기초하여 95% 초과 순도였다.
실시예 4
2-브로모에틸아민 하이드로브로마이드(BEA), 수산화나트륨(NaOH) 및 티오황산나트륨(Na2S203)의 용액을 제조했다. BEA 용액은 1.63g의 BEA(Sigma, B65705, lot 05316EE)를 칭량하고, 20ml의 정제수(dH20, aqua dest, 본원: '물')에 용해시켜 제조했다. 이 용액의 최종 농도는 0.4M BEA였다. NaOH 용액은 0.33g의 NaOH(JTBaker, 3722-01, lot E01470)를 칭량하고 20ml의 물에 용해시켜 제조했다. 이 용액의 최종 농도는 0.41M NaOH였다. 티오황산나트륨(Na2S203) 용액은 25g의 Na2S203(Sigma S7026, lot 106K0178)을 칭량하고 100ml의 물에 용해시켜 제조했다. 일단 용해되면, 용액을 0.2㎛ 보틀-상부 필터를 통해 여과시켜 멸균시켰다. 이 용액의 최종 농도는 1.0M Na2S203이었다.
이원성 에틸렌이민(BEI)을 제조하기 위해, 20ml의 0.4M BEA 용액을 20ml의 0.41M NaOH와 혼합하고, 초기 pH가 약 12.5 내지 14.0인 것으로 측정되었다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하고, pH를 다시 체크했다. 배양 후 pH는 약 7.0 내지 7.5였고, 이는 BEA의 BEI로의 성공적인 폐환 반응을 나타냈다. BEI의 최종 농도는 40ml 용적 중에서 약 0.2M(과량의 염기(0.41M)로 폐환된 0.4M BEA 20ml)인 것으로 산출되었다.
불활성화 반응은 다음과 같다(불활성화될 물질 100ml 당): 불활성화될 물질을 2.5ml의 새로 제조된 BEI와 혼합했다. 불활성화 반응물을, 용액을 계속 혼합하기 위해 교반시키면서 37℃에서 72시간 동안 배양했다. 72시간 후, 반응물을 0.5ml의 1.0M 티오황산나트륨을 첨가하여 중화시켰다. 티오황산염이 용액 내에 완전히 혼합되도록 한 후(약 15분 혼합), 불활성화되고 중화된 물질을 보조제와 제형화 전에 4℃에서 저장했다.
실시예 5
시험 샘플의 제조:
정제되지 않거나 덜 정제된 ORF2 항원과 비교하여 고도로 정제된 ORF2 항원(순도 등급 90% 이상)의 면역원성을 평가하기 위해, 몇몇 시험 샘플의 5ml 배치를 제조했다:
Figure pct00017
시험 샘플 #1은 다음과 같이 제조했다: PCV-2 ORF2 항원을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 고도로 정제했다. 고도로 정제된 PCV-2 ORF 2 항원은 실시예 4에 기술된 바와 같이 BEI로 불활성화시켰다. BEI 불활성화 후, PCV-2 ORF2 항원은 함량을 시험 샘플 1ml당 약 32 내지 32.5㎍의 양으로 조정하고, 시험 샘플 1ml당 1mg Carbopol 971P (BF Goodrich, Ohio, USA)와 혼합했다.
시험 샘플 #2는 다음과 같이 제조했다: PCV-2 ORF2 항원을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 고도로 정제했다. 고도로 정제된 PCV-2 ORF 2 항원은 실시예 4에 기술된 바와 같이 BEI로 불활성화시켰다. BEI 불활성화 후, PCV-2 ORF2 항원은 곤충 세포 파편 및 카보폴과 혼합했다. 최종 시험 샘플은 시험 샘플 1ml당 약 2.06 × 106 곤충 세포, 약 32 내지 32.5㎍ 및 1mg 카보폴 971P를 포함했다.
시험 샘플 #3은 약 2.06 × 106 곤충 세포를 시험 샘플 1ml당 1mg의 카보폴 971P와 혼합하여 제조했다. 혼합 전에, 곤충 세포를 실시예 3에 기술된 바와 같이 BEI로 불활성화시켰다.
시험 샘플 #4는 다음과 같이 제조했다: PCV-2 ORF2 항원을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 상청액 중의 PCV-2 ORF2 항원 함량을 시험 샘플 1ml당 약 32 내지 32.5㎍의 양으로 조정하고, 시험 샘플 1ml당 1mg 카보폴 971P와 혼합했다.
시험 샘플 #5는 다음과 같이 제조했다: PCV-2 ORF2 항원은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 이어서, 상청액을 실시예 3에 기술된 바와 같이 BEI 불활성화에 사용했다. BEI 불활성화 후, PCV-2 ORF2 항원을 곤충 세포 파편 및 카보폴과 혼합했다. 최종 시험 샘플은 시험 샘플 1ml당 약 2.06 × 106 곤충 세포, 약 32 내지 32.5㎍ 및 1mg 카보폴 971P를 포함했다.
시험 샘플 #6은 다음과 같이 제조했다: PCV-2 ORF2 항원을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 제조했다. 이어서, 실시예 1의 상청액을 1.2㎛ 실험실 규모 필터를 통해 여과했다. 이 필터 크기는 본래의 곤충 세포 및 파괴된 곤충 세포를 여과하면서 PCV-2 ORF2 항원이 필터를 통해 통과하도록 하기에 충분한 것으로 이미 결정되었다. 이후, 여과물을 실시예 3에서 기술된 바와 같이 BEI 불활성화시켰다. BEI 불활성화 후, PCV-2 ORF2 항원은 함량을 시험 샘플 1ml당 약 32 내지 32.5㎍의 양으로 조정하고, 1mg 카보폴 971P와 혼합했다.
시험 샘플 각각의 면역원성 시험
임상 단계:
150마리의 암컷 Balb/C 마우스는 잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories)(미국)으로부터 공급받고, 7일 동안 순응시켰다. 총 26개 샘플에 대해 0일째에 혈액 수집을 위해 각각의 케이지로부터 하나의 마우스를 무작위 선택했다. 총 10마리 마우스를 피하 경로로 0.1 내지 0.2mL의 둘베코 인산염 완충제로 각각 접종했다.
총 20마리 마우스에 각 시험 샘플(시험 샘플 #1 내지 #6) 0.1 내지 0.2mL를 피하 경로로 접종했다. 각각의 케이지는 5마리 마우스를 함유하고, 각각의 케이지 중의 모든 마우스는 동일 치료 그룹으로 두었다. 21일째에, 모든 마우스를 말단 출혈시켰다. 각 혈액 샘플이 응고되도록 하고, 혈청을 원심분리로 수집했다. 모든 샘플을 개별 튜브에서 정치시키고, 시험때까지 -80℃±10℃에서 저장했다. 마우스는 소각에 의해 처분했다.
샘플 시험:
각 시험 샘플의 면역원성은 조직내(in-house) PCV-2 특이적 ELISA를 사용하여 각 시험 샘플의 PCV-2 특이적 항체 반응을 측정함으로써 평가되었다. 각 시험 샘플의 면역원성 값은 표 2에 상대적 면역원성(RI) 값으로서 제시된다. 이 상대적 면역원성 값은 면역화에 사용된 ORF2 항원의 표준화된 양당 면역화된 동물 중에서 수득된 ORF2 특이적 항체 역가의 척도이다.
조직내 ELISA를 사용하는 대신, PCV-2 특이적 항체의 양은 또한 교시 및 내용이 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Nawagitgul, P., et al. in Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9:33-40 (2002)]에 기술된 ELISA 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 분석에서 측정된 값을 상대적 면역원성 값을 산출하는데 사용될 수 있다(이하 참조).
각 마우스로부터 혈청의 분획은 21일 동안 총 26개 샘플에 대해 케이지 짝과 함께 풀링했다. 모든 0일째 혈청 샘플의 분획을 한 샘플 내로 풀링했다. 기준은 1:2로 출발하여 2배로 희석하고, 각각의 상응하는 웰에 3회 첨가했다. 양성 및 음성 대조군을 3회 첨가했다. 각 샘플을 연속으로 2배 희석시키고, 1:200에서 출발하여 플레이트에 3회 첨가했다. 450nm에서의 최종 흡광도는 매달 교정된 SoftMax™ 플레이트 판독기를 사용하여 판독했고, 모든 원래의 OD 값은 전자적으로 포획되고, Statlia(Brendan Scientific)로 분석하여 상대적 면역원성(RI) 값을 산출했다.
결과:
면역화 후 제조된 항체의 양에 대해 산출된 RI 값은 정제된 PCV-2 ORF2 제형이 고도로 정제된 PCV-2 ORF2 항원에 대해 최고의 혈청학적 (항체) 반응을 야기한다는 것을 나타냈다. 곤충 세포 파편과 함께 정제된 PCV-2 ORF2의 제형은 고도로 정제된 PCV-2 ORF2 단독에 비해 ORF2의 상대적 면역원성(즉, 면역원성)의 감소를 유도한다. 곤충 세포 단독은 PCV-2 ORF2 항원에 대한 항체 반응을 전혀 생성하지 않았다. 또한 고도로 정제된 PCV-2 ORF2 항원을 함유하지 않는 시험 샘플 4 내지 6도 또한 고도로 정제된 PCV-2 ORF2 단독에 비해 감소된 상대적 면역원성을 나타냈다.
<110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA INC <120> METHODS OF REDUCING VIRICIDAL ACTIVITY IN PCV-2 COMPOSITIONS AND PCV-2 COMPOSITIONS WITH AN IMPROVED IMMUNOGENICITY <130> P10-0121 <150> US 61/239,192 <151> 2009-09-02 <150> US 61/309,408 <151> 2010-03-01 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a modified Kozak's sequence. <400> 1 ccgccatg 8 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a recombinant Eco R1 sequence. <400> 2 gaattc 6 <210> 3 <211> 713 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 3 cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga 180 aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttaa accctaaatg aat 713 <210> 4 <211> 713 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 4 ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180 ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 5 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 6 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230 <210> 7 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This sequence is from porcine circovirus type 2, open reading frame 2, together with a portion from the pGEM T-easy vector. <400> 7 gcggccgcgg gaattcgatc cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga 60 caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc 120 cgccaccgct accgttggag aaggaaaaat ggcatcttca acacccgcct ctcccgcacc 180 ttcggatata ctgtcaaggc taccacagtc acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg 240 agatttaata ttgacgactt tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc 300 tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattct ggccctgctc ccccatcacc 360 cagggtgata ggggagtggg ctccactgct gttattctag atgataactt tgtaacaaag 420 gccacagccc taacctatga cccatatgta aactactcct cccgccatac aatcccccaa 480 cccttctcct accactcccg ttacttcaca cccaaacctg ttcttgactc cactattgat 540 tacttccaac caaataacaa aaggaatcag ctttggctga ggctacaaac ctctagaaat 600 gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat 660 atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttgaa 720 ccctaagaat tctatcacta gtgaattcgc ggccgc 756 <210> 8 <211> 10387 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is the porcine circovirus type 2, ORF-2construct, which includes baculovirus and pGEM T-easy coding sequences. <400> 8 aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60 gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120 ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180 gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240 ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300 gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360 gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420 ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480 cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540 aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600 tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660 tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720 gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780 ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840 cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900 ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960 tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020 tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080 actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140 tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200 gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260 gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320 cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380 cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440 tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500 ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560 cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620 tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680 tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740 ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800 tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860 atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920 cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980 cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040 ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100 cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160 tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220 atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280 gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340 aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400 acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460 atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520 tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580 atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640 tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700 agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760 aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820 ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880 aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940 aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000 aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060 aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120 gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180 atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240 ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300 aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360 catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420 aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt 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ctctcccgca 4320 ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga 4380 tgagatttaa tattgacgac tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac 4440 cctttgaata ctacagaata agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca 4500 cccagggtga taggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa 4560 aggccacagc cctaacctat gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc 4620 aacccttctc ctaccactcc cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg 4680 attacttcca accaaataac aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa 4740 atgtggacca cgtaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca 4800 atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccacttg 4860 aaccctaaga attctatcac tagtgaattc gcggccgccg gccgctccag aattctagaa 4920 ggtacccggg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa 4980 atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc 5040 tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa 5100 gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa 5160 ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg 5220 atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag 5280 ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc 5340 atcgatcgtg tcatctggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct 5400 gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca 5460 ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac 5520 atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt 5580 aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt 5640 tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt 5700 cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt 5760 tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc 5820 gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta 5880 tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct 5940 tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa 6000 ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta 6060 attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct 6120 gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac 6180 acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc 6240 ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc 6300 ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct 6360 ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg 6420 accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg 6480 tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca 6540 gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt 6600 ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc 6660 accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg 6720 ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt 6780 gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta 6840 ttgtaaagag attgtctcaa gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta 6900 cagcattgta gtggcgagac acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa 6960 aaacgtcgtt ggcaagcttt aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt 7020 tgtcgtaaat gttgtttttg ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt 7080 gatgcgcatc aattttgttg ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc 7140 tacgattcgt catggccacc acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa 7200 actgcaaaaa cgtcaaaact cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta 7260 ttttatcgca caagcccact agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt 7320 ttaacgctga cgaaataaaa gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa 7380 tctattttaa tcacggttcc atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc 7440 ccgatttatt tgaaacacta caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata 7500 ttattagaca gctgtgtgaa gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg 7560 acataaaact cgaaaatgtc ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt 7620 acggattgtg caaacacgaa aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta 7680 gtccggaaaa aattcgacac acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt 7740 aacatacaag ttgctaacgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 7800 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 7860 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 7920 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 7980 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 8040 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 8100 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 8160 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 8220 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 8280 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 8340 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 8400 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 8460 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 8520 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 8580 gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 8640 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 8700 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 8760 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 8820 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 8880 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 8940 aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 9000 ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 9060 gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 9120 aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 9180 ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 9240 tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 9300 ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 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Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230

Claims (46)

  1. (i) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체를 수득하는 단계; 및
    (ii) PCV-2 항원으로부터 제1 액체의 적어도 일부분을 제거하는 단계를 포함하는, PCV-2 항원성 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 액체의 일부분이, 상기 제1 액체의 일부분을 상기 제1 액체와는 상이한 제2 액체로 교환함으로써, PCV-2 항원으로부터 제거되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 액체의 일부분의 상기 제2 액체로의 교환이
    (a) 상기 PCV-2 항원을 함유하는 상기 제1 액체에 상기 제2 액체를 첨가하는 액체 첨가 단계; 및
    (b) 상기 제1 및 제2 액체의 일부분을 제거함으로써 PCV-2 항원을 농축시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 액체의 일부분이 필터를 사용한 여과 단계에 의해 상기 PCV-2 항원으로부터 제거되는, 방법.
  5. 제3항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 단계 및 상기 액체 첨가 단계가 실질적으로 동시에 수행되는, 방법.
  6. 제3항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 단계 및 상기 액체 첨가 단계가 2회 이상 수행되는, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 필터가 반투과성 막을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 반투과성 막이 상기 PCV-2 항원보다 작은 평균 기공 크기를 갖고, 이에 의해 상기 반투과성 막 기공들을 통한 상기 PCV-2 항원의 90% 이상의 통과를 차단하여 상기 필터 내에 상기 PCV-2 항원을 보유하는, 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 필터가 크키 50 kDa 내지 500 kDa인 단백질의 90% 이상의 통과를 차단하는 평균 기공 크기를 갖는, 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 단계가 상기 제1 액체의 용적과 비교하여 항원을 3배 내지 50배 농축시키는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, PCV-2 항원성 조성물의 살바이러스 활성이, 상기 방법을 수행하지 않은 액체와 비교하여 10% 이상 감소되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 내지 (ii)에 의해 제조된 PCV-2 항원성 조성물이, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 2시간 이상 동안 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하는 경우, 상기 생바이러스 ml당 1 log TCID50 미만 또는 상기 생 박테리아 ml당 1 log CFU 미만의 손실을 유발하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (i) 내지 (ii)에 의해 제조된 PCV-2 항원성 조성물이, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 2시간 이상 동안 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하는 경우, 상기 생바이러스 ml당 0.7 log TCID50 미만 또는 상기 생 박테리아 ml당 0.7 log CFU 미만의 손실을 유발하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(ii) 후에 잔류하는 PCV-2 항원을 수거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 PCV-2 항원을 포함하는 단계(ii)의 수거물을 크로마토그래피 공정에 의해 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 PCV-2 항원이 단백질 총량을 기준으로 하여 50%(w/w) 초과의 상기 PCV-2 항원의 순도 등급으로 정제되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계(ii) 후에 잔류하는 PCV-2 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 추가 성분과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 추가 성분이 보조제인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 보조제가 카보머(Carbomer)인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PCV-2 항원이 PCV-2의 ORF-2 단백질을 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PCV-2 항원이 ORF-2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PCV-2 항원성 조성물을 하나 이상의 추가의 항원과 배합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 항원이 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 항원 및/또는 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae) 항원을 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따르는 방법으로 수득할 수 있는 PCV-2 항원성 조성물.
  25. 생 바이러스 또는 생 박테리아를 2시간 이상 동안 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하는 경우, 생바이러스 ml당 1 log TCID50 미만 또는 생 박테리아 ml당 1 log CFU 미만의 손실을 유발하는, PCV-2 항원성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 생 바이러스 또는 생 박테리아를 2시간 이상 동안 상기 PCV-2 항원성 조성물과 혼합하는 경우, 상기 생바이러스 ml당 0.7 log TCID50 미만 또는 상기 생 박테리아 ml당 0.7 log CFU 미만의 손실을 유발하는, PCV-2 항원성 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 생 바이러스가 돼지 생식 및 호흡 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; PRRS) 바이러스인, PCV-2 항원성 조성물.
  28. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따르는 방법으로 수득할 수 있는 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물.
  29. 제24항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 따르는 PCV-2 항원성 조성물을 포함하는 면역원성 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 돼지에서 하나 이상의 기타 질병 유발균으로부터의 약독화 생 바이러스 또는 약독화 생 박테리아를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 약독화 생 바이러스가 돼지 생식 및 호흡 증후군(PRRS) 바이러스인, 면역원성 조성물.
  32. 제29항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 박테린을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  33. 제29항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 보조제가 카보머인, 면역원성 조성물.
  35. 정제된 PCV-2 항원 및 보조제를 포함하는 면역원성 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 PCV-2 항원의 순도 등급이 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 50%(w/w)를 초과하는, 면역원성 조성물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 PCV-2 항원이 동물 세포 또는 박테리아에서 발현된 재조합 돼지 서코바이러스 ORF2 단백질인, 면역원성 조성물.
  38. 제35항 내지 제37항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 돼지 서코바이러스 ORF2 단백질이,
    a. PCV-2 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계;
    b. 세포 배양물을 수거하여 PCV-2 항원을 수득하는 단계;
    c. PCV-2 항원을 포함하는 수거물을 겔 여과에 의해 정제하는 단계; 및
    d. 정제된 PCV-2 항원을 보조제와 혼합하는 단계
    를 포함하는 공정으로 수득할 수 있는, 면역원성 조성물.
  39. 제28항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 1회 용량의 상기 면역원성 조성물의 투여 후에 PCV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
  40. 제28항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물의 투여가, 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 림프구 고갈 및 염증을 80% 이상 감소시키는, 면역원성 조성물.
  41. 제31항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 1회 용량의 상기 면역원성 조성물의 투여 후에 PRRS 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
  42. 제32항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 1회 용량의 상기 면역원성 조성물의 투여 후에 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
  43. 제28항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 2ml의 상기 면역원성 조성물이 1회 용량의 PCV-2 항원을 포함하는, 면역원성 조성물.
  44. 제28항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 따르는 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 하나 이상의 PCV-2 감염의 임상 증상을 감소시키는 방법.
  45. 제28항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물을 제공하지 않은 동물과 비교하여 동물에서 하나 이상의 PCV-2 감염의 임상 증상을 감소시키기 위한, 면역원성 조성물.
  46. 돼지 서코바이러스에 대한 면역원성 조성물의 면역원성을 개선시키는 방법으로서,
    a. PCV-2 항원을 숙주 세포에서 발현시키는 단계;
    b. PCV-2 항원을 수거하는 단계;
    c. PCV-2 항원을, 상기 면역원성 조성물에 포함된 단백질의 총량을 기준으로 하여 50%(w/w) 초과의 순도 등급으로 정제하는 단계; 및
    d. 정제된 PCV-2 항원을 보조제와 혼합하는 단계
    를 포함하는, 돼지 서코바이러스에 대한 면역원성 조성물의 면역원성을 개선시키는 방법.

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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
HUE029552T2 (en) 2005-12-29 2017-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Use of PCV2 immunogenic composition to reduce clinical symptoms in piglets
PL1968630T3 (pl) 2005-12-29 2018-08-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multiwalentne immunogenne kompozycje PCV2
US20100129397A1 (en) 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
BRPI0721083A2 (pt) 2006-12-15 2014-02-25 Boehringer Ingelheim Vetmed Tratamento de porcos com antígeno de pcv2
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
US20090317423A1 (en) 2008-01-23 2009-12-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
CN103102397A (zh) * 2011-11-09 2013-05-15 韩健宝 预防和治疗pcv-2病毒的肽核酸及其制剂
WO2014179200A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Orf2 protein of pcv2 subtype a (pcv2a) for use in cross-protection
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
EP3052516B1 (en) 2013-10-02 2020-01-01 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof
RU2021112503A (ru) * 2015-12-28 2021-05-05 Мериал, Инк. Поливалентная вакцина против м. hyo и её применение
MY191895A (en) * 2016-11-03 2022-07-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof
CA3091982A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Method of producing an immunogenic composition
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
CN113957059B (zh) * 2021-11-26 2023-08-22 山东滨州沃华生物工程有限公司 一步柱层析工艺精纯猪蓝耳病毒的方法

Family Cites Families (213)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US3137631A (en) 1959-12-01 1964-06-16 Faberge Inc Encapsulation in natural products
US3080291A (en) 1960-06-10 1963-03-05 Jensen Salsberg Lab Inc Serial passage of distemper virus in tissue cultures of chick embryo and canine tissue and vaccine therefrom
US3959457A (en) 1970-06-05 1976-05-25 Temple University Microparticulate material and method of making such material
US4015100A (en) 1974-01-07 1977-03-29 Avco Everett Research Laboratory, Inc. Surface modification
US4122167A (en) 1977-02-09 1978-10-24 Merck & Co., Inc. Respiratory synctial vaccine
US4205060A (en) 1978-12-20 1980-05-27 Pennwalt Corporation Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use
US4224412A (en) 1979-05-01 1980-09-23 Dorofeev Viktor M Living virus culture vaccine against canine distemper and method of preparing same
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US4554159A (en) 1981-11-12 1985-11-19 Institute Merieux Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2)
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4452747A (en) 1982-03-22 1984-06-05 Klaus Gersonde Method of and arrangement for producing lipid vesicles
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4468346A (en) 1983-10-27 1984-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins
DE3405100A1 (de) 1984-02-14 1985-08-14 Drägerwerk AG, 2400 Lübeck Pt-katalysator auf einem traeger als luftreinigungsmittel
US4744933A (en) 1984-02-15 1988-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Process for encapsulation and encapsulated active material system
US5008050A (en) 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4921706A (en) 1984-11-20 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology Unilamellar lipid vesicles and method for their formation
US4606940A (en) 1984-12-21 1986-08-19 The Ohio State University Research Foundation Small particle formation and encapsulation
DE3687769T2 (de) 1985-07-08 1993-09-02 Wallone Region Vakzine und diagnostika, die vom bovine-diarrhea-virus stammen.
US5206163A (en) 1985-07-08 1993-04-27 Chiron Corporation DNA encoding bovine diarrhea virus protein
US4753884A (en) 1986-01-28 1988-06-28 Novagene, Inc. Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same
JPS62198626A (ja) 1986-02-26 1987-09-02 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 血球凝集性脳脊髄炎ウイルス感染症予防ワクチン
FR2602791B1 (fr) 1986-08-18 1988-11-10 Ministere Agri Direction Quali Procede de culture du virus de la rhinotracheite infectieuse de la dinde, et vaccin prepare a partir du virus ainsi obtenu
IL84154A0 (en) 1986-10-16 1988-03-31 Microgenesys Inc Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same
NZ222465A (en) 1986-11-07 1992-11-25 Pasteur Institut Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen
US5009956A (en) 1987-02-24 1991-04-23 Univ Minnesota Phospholipase A2-resistant liposomes
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5069901A (en) 1988-02-03 1991-12-03 Jones Elaine V Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection
DE3833925A1 (de) 1988-03-11 1989-09-21 Inst Angewandte Biotechnologie Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu
US5213759A (en) 1988-05-05 1993-05-25 Elopak Systems A.G. Sterilization
EP0386185A1 (fr) 1988-07-29 1990-09-12 IntraCel Corporation Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
US4927637A (en) 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
EP0454735B1 (en) 1989-01-23 1996-05-22 Auspharm International Limited Vaccine composition
US4944948A (en) 1989-02-24 1990-07-31 Liposome Technology, Inc. EGF/Liposome gel composition and method
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ES2200016T3 (es) 1989-03-21 2004-03-01 Vical Incorporated Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5552143A (en) 1989-03-24 1996-09-03 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5202130A (en) * 1989-08-31 1993-04-13 The Johns Hopkins University Suppression of eczematous dermatitis by calcium transport inhibition
US5132117A (en) 1990-01-11 1992-07-21 Temple University Aqueous core microcapsules and method for their preparation
US5202430A (en) 1990-01-16 1993-04-13 University Of Tennessee Transmissible gastroenteritis virus genes
GB9001766D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Univ Court Of The University O Vaccines
AU7007491A (en) 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
WO1991018627A1 (en) 1990-05-29 1991-12-12 Smithkline Beecham Corporation Swine pneumonia vaccine and method for the preparation thereof
US5565205A (en) 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
GB9023111D0 (en) 1990-10-24 1990-12-05 Wellcome Found Expression system
DK0555366T3 (da) 1990-11-01 2000-08-28 Univ Iowa State Res Found Inc Fremgangsmåde til bakteriel svækkelse og vaccine
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
EP0575491B1 (en) 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
DK0587780T4 (da) 1991-06-06 2008-10-13 Boehringer Ingelheim Vetmed Smitstof, som forårsager Mystery Swine Disease,vaccinepræparater og diagnostiske sæt
KR0138092B1 (ko) 1991-08-26 1998-04-30 제임스 씨. 데세사레 미확인(Mystery) 돼지 질병 관련 바이러스제
US6982160B2 (en) 1991-08-26 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions that include SIRS virus
US5846805A (en) 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
US6042830A (en) 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
EP0601062B2 (en) 1991-08-26 2000-12-13 Regents Of The University Of Minnesota Sirs vaccine and diagnosis method
US6080570A (en) 1991-08-26 2000-06-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome
WO1993006211A1 (en) 1991-09-16 1993-04-01 Collins James E Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
US5580557A (en) 1991-10-09 1996-12-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Live, avirulent salmonella choleraesuis vaccine used for inducing an immune response in animals
WO1993007898A1 (en) 1991-10-14 1993-04-29 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
US5382425A (en) 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
FR2686097B1 (fr) 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
US5338543A (en) 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
TW289731B (ko) 1992-07-09 1996-11-01 Akzo Nv
US6380376B1 (en) 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US5695766A (en) 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6251397B1 (en) 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US6773908B1 (en) 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US5419907A (en) 1992-11-10 1995-05-30 Iowa State University Research Foundation, Inc. Pathogenic porcine respiratory coronavirus
EP0683816B1 (en) 1993-02-08 2000-11-02 Bayer Corporation Process for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in vaccines
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
FR2711670B1 (fr) 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
EP0659885A1 (en) 1993-12-21 1995-06-28 Akzo Nobel N.V. Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity
ATE475668T1 (de) 1994-01-27 2010-08-15 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch impfung von dns transkriptionseinheit
DE4407489A1 (de) 1994-03-07 1995-09-14 Bayer Ag Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines
HRP950097A2 (en) 1994-03-08 1997-06-30 Merck & Co Inc Hepatitis a virus culture process
DK0676467T3 (da) 1994-04-11 2002-01-21 Akzo Nobel Nv Europæiske vaccinestammer af det porcine reproduktive respiratoriske syndromvirus (PRRSV)
EP0804283B1 (en) 1994-04-15 2003-04-02 Temple University Aqueous solvent encapsulation method and microcapsules
CA2188447C (en) 1994-04-29 2002-10-22 Falko-Gunter Falkner Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
EP0968722B1 (en) 1994-05-10 2007-06-20 Wyeth Improved modified live BRSV vaccine
GB2289279B (en) 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
ES2262142T3 (es) 1994-08-05 2006-11-16 Regents Of The University Of Minnesota Secuencia virica de nucleotidos de vr-2332 y metodos de uso.
EP0732340B1 (en) 1995-03-14 2004-06-09 Akzo Nobel N.V. Expression of porcine reproductive respiratory syndrome virus polypeptides in the same cell
EP0871755A1 (en) 1995-03-23 1998-10-21 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vectors for gene delivery
US5885823A (en) 1995-06-05 1999-03-23 Nobl Laboratories, Inc. Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
US5690940A (en) 1995-06-21 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof
KR19990036028A (ko) 1995-08-01 1999-05-25 다니엘 케르니 일본뇌염 백신의 공업적인 생산방법 및 이에 의한 백신
ES2102971B1 (es) 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
US6015663A (en) 1996-03-01 2000-01-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains
US5866401A (en) 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
CA2248182C (en) 1996-03-01 2004-04-20 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
US5976537A (en) 1996-07-02 1999-11-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
AU737243B2 (en) 1996-07-03 2001-08-16 Merial, Inc. Recombinant canine adenovirus (CAV) containing exogenous DNA
PT835930E (pt) 1996-10-09 2001-06-29 Akzo Nobel Nv Estirpes europeias de vacina do virus do sindroma reprodutivo e respiratorio porcino (prrsv)
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US20040224327A1 (en) 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
WO2000053787A1 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Dierg Ezondheid B.V. Prrsv vaccines
US6183752B1 (en) 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
WO1998035023A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Origen, Inc. Method for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus for use as vaccines and diagnostic assays
KR100388257B1 (ko) 1997-05-06 2003-06-19 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 백신 또는 진단방법에서 사용하기 위한 피알알에스 바이러스의 피알알에스브이 항원부위 인식성 펩타이드 서열
EP1003869A1 (en) 1997-06-04 2000-05-31 Calgene LLC Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
AU7960598A (en) 1997-06-05 1998-12-21 Origen, Inc. Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine
US20060029617A1 (en) 1997-10-03 2006-02-09 Charreyre Catherine E Porcine circovirus and Helicobacter combination vaccines and methods of use
US7192594B2 (en) 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
UA78180C2 (uk) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US7211379B2 (en) 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
CA2313806A1 (en) 1997-12-11 1999-06-17 University Of Saskatchewan Postweaning multisystemic wasting syndrome virus from pigs
WO1999045956A1 (en) 1998-03-13 1999-09-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Vaccines against circovirus infections
US6294176B1 (en) 1998-07-10 2001-09-25 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species
WO2000031275A1 (fr) 1998-11-19 2000-06-02 Azwell Inc. Phosphatase de recombinaison d'acide lysophosphatidique
US7618797B2 (en) 1998-12-22 2009-11-17 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7132106B2 (en) 1998-12-22 2006-11-07 Pfizer Inc. Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
NZ513289A (en) 1998-12-22 2003-04-29 Pfizer Prod Inc Infectious cDNA clone of north american procine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7691389B2 (en) 1998-12-22 2010-04-06 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
FR2789695B1 (fr) 1999-02-11 2003-03-07 Merial Sas Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs
CA2650236C (en) 1999-04-22 2016-01-12 United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate ja-142
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
WO2001017556A1 (fr) 1999-09-07 2001-03-15 Shionogi & Co., Ltd. Préparations vaccinales administrables par les muqueuses
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9921147D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US20040213805A1 (en) 1999-10-12 2004-10-28 Verheije Monique Helene Deletions in arterivirus replicons
US6656478B1 (en) 1999-11-12 2003-12-02 Samuel D. Charles Cross-protective salmonella vaccines
MXPA02006149A (es) 1999-12-21 2003-01-28 Merial Sas Composiciones y vacunas las cuales contienen antigenos de cryptosporidium parvum y de otro patogeno enterico.
US20020012670A1 (en) 2000-01-26 2002-01-31 Knut Elbers Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV)
DK1255815T3 (da) 2000-02-08 2006-10-30 Univ Minnesota Porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus til fremgangsmåder til anvendelse
EP1156111A1 (en) 2000-05-19 2001-11-21 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Chimeric arterivirus-like particles
AU2001266940A1 (en) 2000-06-15 2001-12-24 Purdue Research Foundation Vaccine for congenital tremors in pigs
US6808900B2 (en) 2000-06-15 2004-10-26 Manitoba, University Of Cryptosporidium parvum antigens, antibodies thereto and diagnostic and therapeutic compositions thereof
US7388087B2 (en) 2000-11-09 2008-06-17 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Enhancement of immune response to vaccine by interferon alpha
US7018638B2 (en) 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
MY129765A (en) 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
JP2002247979A (ja) 2001-02-23 2002-09-03 Nippon Biologicals Inc マレック病ワクチンおよびその製造方法
US6794163B2 (en) 2001-03-27 2004-09-21 University Of Saskatchewan Methods to culture circovirus
EP1397498A1 (en) 2001-05-21 2004-03-17 ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. Delections in arterivirus replicons
US20030096377A1 (en) 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
CN1551781B (zh) 2001-07-02 2013-01-02 辉瑞产品公司 单剂量猪肺炎支原体疫苗
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US6841364B2 (en) 2002-01-22 2005-01-11 Protatek International, Inc. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
AU2003220240A1 (en) 2002-03-13 2003-09-29 Biophysica, Inc. Boswellin compositions enhanced with 3-beta-acety1-11-keto-beta-boswellic acid (akba), industrial manufacture and their uses
ATE557082T1 (de) 2002-04-05 2012-05-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Sequenz positionen zur anpassung bei prrsv
US20030215455A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Bailey Reynolds Vaccine stabilizer and method of use
AU2002951692A0 (en) 2002-09-23 2002-10-17 Vital Biotech (Hong Kong) Limited Improvements in or relating to vaccines
MXPA05008252A (es) 2003-02-03 2006-05-22 Cerebus Biolog Inc Metodos para tratar, prevenir y detectar una infeccion con helicobacter.
US7563449B2 (en) 2003-04-21 2009-07-21 Pfizer Inc, Methods for reducing cattle reproductive diseases
CN1458167A (zh) 2003-06-02 2003-11-26 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 截短表达的猪圆环病毒ⅱ型衣壳蛋白抗原及其应用
US7335361B2 (en) 2003-06-09 2008-02-26 Animal Technology Institute Taiwan Fusion antigen used as vaccine
JP2006528647A (ja) 2003-07-24 2006-12-21 メリアル リミテッド 新規ワクチン製剤
ES2333334T5 (es) 2003-07-25 2018-08-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia intracellularis de origen europeo y vacunas, agentes de diagnóstico y métodos de uso de la misma
FR2861731B1 (fr) 2003-10-30 2006-02-24 Centre Nat Rech Scient Nouvelle proteine de fixation du phosphate, compositions pharmaceutiques la contenant et ses utilisations
WO2005112995A1 (en) 2004-04-26 2005-12-01 Choongang Vaccine Laboratory Co., Ltd. Inactivated mixed vaccine for porcine respiratory disease and the method of manufacturing thereof
CN1579553A (zh) 2004-05-18 2005-02-16 浙江大学 Ii型猪圆环病毒核酸疫苗的制备方法及其应用
US7722878B2 (en) 2004-06-17 2010-05-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PRRSV subunit vaccines
US7611717B2 (en) 2004-06-18 2009-11-03 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
WO2006068663A2 (en) 2004-06-30 2006-06-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine compositions for treating coronavirus infection
US20060063151A1 (en) 2004-09-21 2006-03-23 Michael Roof Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US7700285B1 (en) * 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
CN101189027A (zh) 2005-01-13 2008-05-28 贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司 改良的prrs疫苗
US7300785B2 (en) 2005-02-03 2007-11-27 Universiteit Ghent Culturing circular ssDNA viruses for the production of vaccines
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
ME02683B (me) 2005-04-13 2017-06-20 Postupak za proizvodnju cirkovirusa svinja
US7691368B2 (en) 2005-04-15 2010-04-06 Merial Limited Vaccine formulations
EP1904631B1 (en) 2005-06-24 2012-05-16 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
JP5106398B2 (ja) 2005-09-09 2012-12-26 インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー Ｐｃｖ−２ワクチン
CA2630648C (en) 2005-11-29 2016-01-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) and uses thereof
HUE029552T2 (en) 2005-12-29 2017-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc Use of PCV2 immunogenic composition to reduce clinical symptoms in piglets
PL1968630T3 (pl) * 2005-12-29 2018-08-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multiwalentne immunogenne kompozycje PCV2
US20100136060A1 (en) 2006-11-22 2010-06-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of reducing porcine circovirus-associated disease outbreaks
US20100129397A1 (en) 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
WO2008073490A1 (en) 2006-12-12 2008-06-19 Carrington Laboratories Inc., Purification of influenza viral antigens
BRPI0721083A2 (pt) 2006-12-15 2014-02-25 Boehringer Ingelheim Vetmed Tratamento de porcos com antígeno de pcv2
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
US8563313B2 (en) 2007-02-13 2013-10-22 Washington State University Research Foundation Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
WO2008121958A1 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Use of prrsv vaccines to reduce pcv2 viremia
GB0712160D0 (en) * 2007-06-22 2007-08-01 Univ Ghent Methods and compositions in the treatment of procine circoviral infection
US20090017064A1 (en) 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
CL2008003813A1 (es) 2007-12-21 2009-03-20 Zoetis W Llc Circovirus porcino; molecula de acido nucleico que lo codifica; composicion inmunogenica que lo comprende; metodo para inmunizar un cerdo contra la infeccion virica o para prevenir el sindrome postdestete de desgaste multi-sistemico (pmsw);y metodo para determinar si un mamifero tiene o esta en riesgo de desarrollar pmsw.
US20090317423A1 (en) 2008-01-23 2009-12-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US20110033495A1 (en) 2008-02-15 2011-02-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
NZ588639A (en) 2008-04-16 2012-10-26 Virginia Tech Intell Prop CHIMERIC PORCINE CIRCOVIRUS PCV2Gen-1Rep AND USES THEREOF
TWI449533B (zh) 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
US8444989B1 (en) 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
US20100003278A1 (en) 2008-07-03 2010-01-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof
RU2561595C2 (ru) 2008-08-25 2015-08-27 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs)
US20100129398A1 (en) 2008-11-26 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Materials and Methods for Control of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
EP2558118B1 (en) 2010-04-16 2019-06-05 Universiteit Gent Cross-protecting vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus
US8728487B2 (en) 2011-01-20 2014-05-20 Hua Wu Attenuated live vaccine for prevention of porcine reproductive and respiratory syndrome
US8906385B2 (en) 2011-12-01 2014-12-09 University Of Maryland, College Park Interferon-inducing porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate

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