CN108601824A - M Hyo多价疫苗及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在动物中对抗猪肺炎支原体(M hyo)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染以及增强猪增重的能力和/或改善死亡损失的组合物或疫苗，对抗这些感染的疫苗接种方法，以及与这些方法和组合物一起使用的试剂盒。

Description

M Hyo多价疫苗及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年12月28日提交的美国临时申请62/272,017的优先权。

发明领域

本发明涉及用于在动物中对抗猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(Mhyo)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染，以及增强猪增重或改善死亡损失的能力的组合物或疫苗、对抗所述感染的疫苗接种方法，以及与此类方法和组合物一起使用的试剂盒。

发明背景

圆环病毒(在一系列植物和动物物种中发现的，名为圆环病毒科的病毒科的病毒的通用名)被表征为平均直径为17至23.5nm、含有环状单链脱氧核糖核酸(ssDNA)的圆形无包膜病毒体。圆环病毒的ssDNA基因组代表已知的最小病毒DNA复制子。

已在一系列动物物种中鉴定了多种圆环病毒(包括PCV)。PCV II型 (“PCVII”或“PCV2”)与PCV I型(“PCVI”或“PCV1”)相反，与断奶仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)密切相关(参见Allan等，Eur.J.Vet. Diagn.Investig.1998,10,3-10；Ellis等Can.Vet.J.1998,39,44-51和 Morozov等J.Clin.Microbiol.1998,36,2535-2541)。PCV2已被公认为 PMWS的主要致病因子，自该名称于2006年3月由美国猪兽医协会(AASV) 修改以来，现称为PCVAD(猪圆环病毒相关疾病)。具有天然获得性或实验诱导的PCV2感染的猪呈现进行性体重减轻、呼吸急促、呼吸困难和黄疸 (Allan等1998；Allan等1999；Ellis等1998；Ellis等1999)。与PCV2抗原直接相关的宏观病理学发现包括淋巴结病、间质性肺炎、肝炎和肾炎(Allan 等1998；Allan等1999；Ellis等1998；Ellis等1999)。

猪肺炎支原体(地方流行性肺炎的原因)仍然是养猪业的重要病原体。这种小而复杂的生物体定植于呼吸道的纤毛细胞，导致很少暴露于免疫系统。通常在幼猪中观察到的肺损伤的特征在于上皮细胞的增生和单个核细胞的血管周围和细支气管周围积聚的增加。在猪肺炎支原体感染后，观察到免疫反应并在猪中诱发抗性。(Thacker,Anim Health ResRev.2004 Dec；5(2):317-20和Kobisch&Friis,Rev Sci Tech.1996 Dec；15(4):1569-605)。临床症状和病变发展是猪肺炎支原体的致病能力和肺中的防御反应的结果。肺炎的经济相关性在很大程度上受到最初的猪肺炎支原体感染后的常见继发感染影响。对个体猪中和组中的肺炎诊断的不同测试是可获得的。治疗和控制并不简单，因为地方流行性肺炎是一种多因素疾病 (Maes等，Vet Q.1996,18(3)：104-9)。

猪肺炎支原体也与猪呼吸系统疾病综合症(PRDC)相关，这是一种多因素呼吸综合征，包括几种呼吸道病原体。最常见地从具有PRDC临床体征的猪分离的病原体感染免疫系统的细胞或诱发显著的免疫病理学。因此，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪肺炎支原体这两种与PRDC相关的最常见病原体改变了呼吸免疫系统对其存在和其他病原体存在的反应的能力。通过改变呼吸免疫系统，这两种常见病原体增加了对与PRDC相关的许多其他病原体的易感性(Thacker,Vet Clin North Am Food Anim Pract.2001, 17(3):551-65)。

大多数针对猪肺炎支原体的已知疫苗基于猪肺炎支原体的含佐剂的灭活全细胞制剂。商业来源包括RESPIFEND(Fort Dodge,American Home Products)、HYORESP(MerialLtd)或SPRINTVAC(MERIAL Ltd)、M+PAC (Schering Plough)、PROSYSTEM M(Intervet)、INGELVAC M (Boehringer)、RESPISURE(Pfizer Inc.)和STELLAMUNE MYCOPLASMA (PfizerInc.)。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) (也称为蓝耳猪病)的病毒。这种经济上重要的动物大流行病导致种畜的繁殖失败和幼猪的呼吸系统疾病。PRRS的临床体征包括母猪的繁殖失败，诸如流产和生下死产或干化胎儿，以及耳朵和外阴的紫绀。PRRSV是一种小的包膜RNA病毒。其包含单链正义RNA基因组，大小约为15千碱基。该基因组包含10个开放阅读框(Meulenberg等，Virology.1993,192(1):62-72, Lee和Yoo,J Gen Virol.2005,86(11):3091-6；Johnson等，J of Gen Virol. 2011,92(5)，第1107–1116页)。

美国专利申请US 20130266603涉及三价免疫原性组合物，其包括猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制剂的可溶部分、猪圆环病毒2型(PCV2)抗原和PRRS 病毒抗原。

在过去几年中，猪的几种传染病的流行使得有必要开发适应的多价疫苗和随附的疫苗接种时间表。这些时间表包括在成熟前接种猪，这会带来后勤困难，即接种疫苗的猪数量很高。另一个实际问题是当在动物中共同施用多种疫苗以治疗几种传染病时的干扰。在疫苗学和免疫学中，这是众所周知且不可预测的现象，称为“功效干扰”。在疫苗的共同施用中(例如，当将两种或更多种疫苗在同一制剂中混合在一起或以相继施用的方式诸如初免和加强施用(如在本发明中)一起施用时)，两种疫苗可产生干扰。这种现象首先在三价萨宾脊髓灰质炎疫苗中被注意到，其中必须将疫苗中血清型2病毒的量减少以阻止其干扰疫苗中血清型1和3病毒的“摄取”。

猪的传染因子，特别是病毒，不仅对农产品加工业产生深远的影响，而且对人构成潜在的公共卫生风险。因此，PMWS或PCVAD的预防和PCV 疫苗接种的开发是必不可少的。

还需要用于对抗PCV2、猪肺炎支原体(M hyo)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)多重感染的单一疫苗。此类疫苗将消除对多次给药的需要，从而显著降低与全世界大规模猪群接种相关的成本和劳动力。仍然需要高效且有效，易于向大量动物施用并且具有成本效益的多价疫苗。

发明概述

本发明提供了多价M hyo组合物或疫苗，其包含：i)M hyo抗原，和ii) PCV2抗原、PRRSV抗原或其组合中的至少一种。

本发明还提供了包含经修饰的活PRRSV抗原和灭活PRRSV抗原的组合物或疫苗。

本发明显示了用于多价疫苗的猪肺炎支原体疫苗接种保护动物免受各种猪病原体的侵害，增强猪增重和减少死亡损失的能力的令人惊讶的益处。本发明还令人惊讶地证明了，当将经修饰的活PRRSV抗原和灭活PRRSV抗原一起施用时，动物死亡率降低。

本发明涉及给动物接种疫苗或在动物中诱导免疫原性或保护性反应的方法，其包括至少一次施用本发明的组合物或载体。

本发明还提供了疫苗接种试剂盒或套组，其可包含一个或多个含有M hyo疫苗、PCV2疫苗和PRRS疫苗的疫苗小瓶。

附图简述

通过示例给出的并且不旨在将本发明限制于所描述的特定实施方案的以下详细描述，可以结合附图来理解，所述附图通过引用并入本文，其中：

图1描绘对在研究的第一天抽取的血清进行的qPCR。

图2描绘来自在第0天和第21天抽取的血清的FFN滴度。

图3描绘组间体重增加的平均速率。

图4描绘各组在研究的第0天和第61天的平均重量。

图5描绘基于支原体疫苗接种状态的成品重量(finishing weights)的比较。

图6是显示分配给每种DNA和蛋白质序列的SEQ ID NO的表。

图7A-7C描绘序列比对和系统发生树。

详细说明

应注意，在本公开中，特别是在权利要求中，术语诸如“包括(comprises)”、“包含(comprised)”、“含有(comprising)”等可具有美国专利法中赋予其的含义；例如，它们可表示“包括(includes)”、“包含(included)”、“具有 (including)”等；并且术语诸如“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“基本上由......组成(consistsessentially of)”具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未被明确提及的要素，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。

除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“该(the)”包括指示物的复数。类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。词语“或”意指特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任意组合。

术语“动物”在本文中用于包括所有哺乳动物、鸟类和鱼类。本文使用的动物可选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、郊狼、豺)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫科动物，以及其他猫科动物，包括猎豹和山猫)、牛族动物(例如，牛、水牛)、猪类(例如，猪)、羊(例如，绵羊)、山羊(例如，山羊)、骆驼科动物(例如，羊驼)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸和食火鸡)、灵长类动物(例如，原猴亚目的猴(prosimian)、眼镜猴、猴、长臂猿、猿)、人和鱼类。术语“动物”还包括处于所有发育阶段(包括胚胎和胎儿阶段)的个体动物。

如本文中所用，术语“猪”或“仔猪”是指猪来源的动物，而“母猪”是指达到育龄且具有生殖能力的雌性。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物。

术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指RNA、 DNA、cDNA或cRNA及其衍生物，诸如含有经修饰的骨架的那些。应当理解，本发明提供了包含与本文所述序列互补的序列的多核苷酸。本发明中考虑的“多核苷酸”包括正向链(5'至3')和反向互补链(3'至5')。根据本发明的多核苷酸可以以不同方式(例如通过化学合成，通过基因克隆等)制备，并且可采取各种形式(例如直链或支链的，单链或双链的，或其杂合体，引物，探针等)。

术语“基因组DNA”或“基因组”可互换使用，是指宿主生物体的可遗传的遗传信息。基因组DNA包含细胞核的DNA(也称为染色体DNA)，而且还包括质体(例如，叶绿体)和其他细胞器(例如，线粒体)的DNA。本发明中考虑的基因组DNA或基因组也指病毒的RNA。RNA可以是正链或负链 RNA。本发明中考虑的术语“基因组DNA”包括含有与本文所述序列互补的序列的基因组DNA。术语“基因组DNA”还指信使RNA(mRNA)、互补 DNA(cDNA)和互补RNA(cRNA)。

术语“基因”广泛地用于指与生物学功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因或多核苷酸如基因组序列中一样包括内含子和外显子，或如在 cDNA中一样仅包括编码序列，诸如开放阅读框(ORF)，其始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)并终于终止信号(终止密码子)。基因和多核苷酸还可包括调节其表达诸如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还包括启动子和核糖体结合区(通常这些调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至 250个核苷酸处；转录终止子(通常终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，并且其包括调控序列。

如本文中所用，术语“异源DNA”是指来源于不同生物体(诸如与受体不同的细胞类型或与受体不同的物种)的DNA。该术语还指在宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中异源DNA被插入在基因组的不同于其原始位置的区域内。

如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱发特异性免疫反应的物质。抗原可包含杀死的、减毒的或活的完整生物体；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性特性的插入物的重组载体；能够在呈递给宿主动物时诱导免疫反应的DNA碎片或片段；多肽、抗原、表位、半抗原或其任何组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

如本文中所用，术语“免疫原性蛋白质或肽”包括在一旦向宿主施用，其能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上，具有免疫活性的多肽。优选地，蛋白质片段是其具有与总蛋白质基本相同的免疫活性的蛋白质片段。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文中所用，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指包含一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。可以使用本领域公知的许多表位作图技术来鉴定此类片段。例如，线性表位可以通过例如在固体载体上同时合成大量肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)并使所述肽与抗体反应(同时所述肽仍然附接于载体)来确定。类似地，构象表位可通过确定(诸如通过例如X射线晶体学和二维核磁共振)氨基酸的空间构象来容易地鉴定。

术语“免疫原性蛋白质或肽”还涵盖了对序列的缺失、添加和取代，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫反应的作用即可。术语“保守变化”表示一个氨基酸残基用另一种生物学上相似的残基替代，或替换核酸序列中的核苷酸使得所编码的氨基酸残基不改变或成为另一种生物学上相似的残基。在这方面，特别优选的取代在性质上通常是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；(4)不带电荷的极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变化的实例包括用一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，诸如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺等；或用结构相关的氨基酸对氨基酸的类似保守替代，所述替代对生物活性不会产生重大影响。因此，具有与参考分子基本相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质免疫原性的少量氨基酸取代的蛋白质在参考多肽的定义范围内。本文包括通过这些修饰产生的所有多肽。术语“保守变化”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，条件是针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。

对组合物或疫苗的“免疫反应”是在宿主中产生针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括但不限于以下的一种或多种作用：特异性地针对包含在目标组合物或疫苗中的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，使得增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。这种保护将通过由感染宿主通常所显示的症状减轻或缺乏、感染宿主的更快恢复时间和/或降低的病原体负荷来证明。

术语“多价疫苗或组合物”、“组合或组合的疫苗(combo vaccine)或组合物”和“多价疫苗或组合物”可互换使用，是指含有不止一种组合物或疫苗的组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可含有两种、三种、四种或更多种组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含重组病毒载体、活跃或减毒或杀死的野生型病毒、亚单位(蛋白质/抗原)、DNA质粒或其混合物。

如本文中所用，术语“灭活疫苗”是指含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体的疫苗组合物。病原体可源自细菌、病毒、原生动物或真菌。灭活可通过多种方法完成，所述方法包括冻融、化学处理(例如，用硫柳汞、福尔马林、(β-丙内酯)或BEI(二乙烯亚胺)处理)、超声处理、辐射、加热或任何其他足以防止生物体复制或生长同时保持其免疫原性的常规手段。

PCV2组合物或疫苗可包含全部或部分细胞制剂和/或上清液，诸如杀死的病毒体或经修饰的活制剂、亚单位疫苗诸如可包含一种或多种PCV2来源的多肽或蛋白质的亚单位疫苗。PCV2组合物或疫苗可包含灭活病毒。

该PCV2可以是在美国专利号6,368,601、6,391,314、6,660,272、7,122,192、 7,144,698、7,192,594、7,504,206、7,741,039、7,833,783、7,803,613、7,803,926、 7,211,379、6,517,843中公开的任何PCV2株。PCV2可以是US 7,211,379和 US 7,122,192中公开的株Imp.1008、Imp.1010、Imp999、Imp.1011-48285、 Imp.1011-48121、Imp.1103、Imp.1121。PCV2菌株可以是株Imp.1010 ()。

PCV2来源的多肽或蛋白质可以是PCV2ORF2的多肽或蛋白质。如本文中所用，术语“ORF2”是指从开放阅读框ORF2表达的圆环病毒抗原(如由Meehan等(1998)J.Gen.Virol.78:221-227指定的)。ORF2被认为是有助于病毒衣壳的多肽。已经在PCV2基因组中鉴定了13个开放阅读框(ORF)。 PCV2ORF2的进一步描述可见于美国专利号6,368,601、6,391,314、 6,660,272、7,122,192、7,144,698、7,192,594、7,504,206、7,741,039、7,833,783、 7,803,613、7,803,926、7,211,379、6,517,843、6,943,152、6217883、6,953,581、 6,497,883、7,109,025。

PCV2组合物或疫苗还可包含源自猪肺炎支原体(M hyo)或猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)或其组合的另外的抗原。源自M hyo或PRRSV的抗原可以是杀死的、减毒的或活的完整生物体；生物体的亚单位或部分；含有编码具有免疫原性特性的抗原的插入物的重组载体；嵌合重组载体；多肽、抗原或其任意组合。

灭活的病原体或生物体可以通过常规浓缩技术，特别是通过超滤来浓缩，和/或通过常规纯化方法，特别是使用色谱技术(包括但不限于凝胶过滤)或通过超滤来纯化。如本文中所用，术语“免疫原性”意指能够在宿主动物中产生针对一种或多种抗原的免疫反应。这种免疫反应形成了针对特定传染性生物体的疫苗引发的保护性免疫力的基础。

本发明的组合物或疫苗可包含具有纯化的PCV2、猪肺炎支原体或 PRRSV免疫原性蛋白质、多肽、抗原和此类蛋白质和多肽的免疫原性片段的亚单位疫苗。可使用本领域已知的技术制备此类蛋白质和多肽。例如，可在原核生物或真核生物中产生这样的抗原或蛋白质。本发明中考虑的原核生物可包括禽杆菌属(Avibacterium)、布鲁杆菌属(Brucella)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、嗜血菌属(Haemophilus)(例如，猪嗜血杆菌(Haemophilussuis))、沙门菌属(Salmonella)(例如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteridis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis))、志贺菌属(Shigella)、巴斯德菌属(Pasteurella)和Rimeirella。在原核系统中，可以选择许多表达载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆性和表达载体，诸如PBLUESCRIPT(Stratagene)；pET载体(Novagen)；piN载体 (Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chern.264:5503-5509(1989))；等等； PGEX载体(Promega,Madison,Wis.)；在真核系统中，细胞系可以是酵母(诸如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母)、杆状病毒细胞(诸如Sf9、Sf21、Tn5B1-4和 S2)、哺乳动物细胞、植物细胞(诸如浮萍和微藻)。真核系统的表达载体包括但不限于pVR1020或pVT1012载体(Vical Inc.，San Diego，CA)、PichiaPink 载体(Invitrogen,CA,USA)、pFasBac TOPO载体(Invitrogen)。

另外，本领域技术人员熟知的方法可用于测定蛋白质纯度或均一性，诸如样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在染色凝胶上显现单个多肽条带。可使用HPLC或本领域熟知的其他类似方法测定更高的分辨率。在一个具体的实施方案中，所述组合物或疫苗包含猪肺炎支原体的至少一种蛋白，诸如但不限于P46、P65、P97、P102、P70、P50和P44。对于猪肺炎支原体基因组的序列，参考Minion等，J Bacteriol.2004Nov；186(21):7123-33。在另一个具体实施方案中，所述组合物或疫苗包含PRRSV的至少一种蛋白质，诸如但不限于E、ORF3和M.

在其他实施方案中，本发明的组合物或疫苗包含猪肺炎支原体菌苗(灭活的完整或部分细胞)，或经修饰的活猪肺炎支原体，或猪肺炎支原体蛋白或多肽或其免疫原性片段。M hyo菌苗可以是(ProtaTek International,Inc.,Saint Paul,MN)中包含的灭活菌苗。M hyo菌苗可以是中包含的灭活菌苗。

M hyo组合物或疫苗还可包含源自PCV2或猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)或其组合的其他抗原。

在其他实施方案中，本发明的组合物或疫苗包含PRRSV(灭活的完整或部分细胞)，或经修饰的活PRRSV，或PRRSV蛋白或多肽，或其组合。本发明的组合物或疫苗可包含经修饰的活PRRSV和灭活PRRSV。PRRSV可以是任何北美PRRSV或欧洲PRRSV。北美PRRSV可包括但不限于ATCC VR-2332株(Collins等，1992,J Vet Diagn Invest 4:117-126)、807/94株(Canada)、MN-1b株(Kwang,J.等，1994,J,Vet.Diagn.Invest.6:293-296)、 VR 2385株(Meng,X.-J等，1994,J.Gen.Virol.75:1795-1801)、Quebec LAF-exp91株(Mardassi,H.等，1995,Arch.Virol.140:1405-1418)。欧洲 PRRSV可包括但不限于Olot株(Spain)、Lelystad和l10株(The Netherlands)、株(Merial Limited注册的产品)。PRRSV可以是INGELVAC MLV疫苗(Boehringer Ingelheim)中包含的经修饰的活PRRS株。 PRRSV还可包括在亚洲和南美洲分离的株。

在一个实施方案中，本发明包括减毒的活或灭活/杀死的PRRS组合物或疫苗。

在一个实施方案中，本发明包括新型灭活/杀死的PRRSV组合物或疫苗。 PRRSV株是在USA新鉴定的PRRSV血清型。灭活可以是化学灭活，其产生可列举的结构变化，包括例如通过化学交联形成新的化学键，核酸和蛋白质衣壳的不可逆的化学改变。

本发明的一个实施方案提供了PRRSV株的基因组DNA和基因序列，以及编码的蛋白质序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了PRRSV的ORF5(也称为糖蛋白 5-GP5)蛋白或抗原的序列。在该实施方案的一个方面，PRRSV的ORF5蛋白具有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9中所示的多肽序列。在另一个方面，ORF5蛋白与具有SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9中所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性。在另一个方面，ORF5蛋白由与具有SEQ ID NO：1 所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％,99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、 99.8％或99.9％序列同一性的多核苷酸编码。

本发明还包括重组PRRSV抗原。重组PRRSV抗原可包括但不限于重组PRRSV禽痘病毒载体(WO20030003112)、PRRSV质粒载体(US6,576,243)、经修饰的PRRSV(WO2006129139)、PRRSV的嵌合或重组蛋白(EP1882478， EP0952219)、嵌合PRRSV(WO2008153572；US7,666,585；CN101603035；Res Vet Sci.2013,95(2):742-51.)和经遗传修饰的PRRSV(US6,841,364)。

在另一个实施方案中，本发明涵盖了制备和分离PRRSV的子代或后代。因此，本发明扩展到通过以相同或不同形式的繁殖或增殖从PRRSV株衍生而来的PRRSV株，特别是具有保藏株的基本特征的后代。在继续繁殖后，所述株可以获得突变，其中大多数突变不会显著改变这些株的性质。子代或后代可包含编码与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9中所示序列具有至少91％的序列同一性的ORF5蛋白的多核苷酸，或编码具有SEQ ID NO： 1所示的序列的ORF5蛋白的多核苷酸。

本发明还包括载体分子或表达载体中包含的并且可操作地连接于启动子元件和任选地增强子的至少一种PCV2、猪肺炎支原体或PRRSV抗原。

“载体”是指重组DNA或RNA质粒或病毒(病毒载体)，其包含待在体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可包含用于治疗目的的目标序列，并且可以任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，载体不需要能够在最终靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆性载体和病毒载体。

本发明的多核苷酸可包含额外的序列，诸如同一转录单元内的其他编码序列、控制元件如启动子、核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、在相同或不同启动子控制下的另外的转录单元、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞的转化的序列，以及对于提供本发明的实施方案可能比较理想的任何此类构建体。

本发明包括表达PCV2、猪肺炎支原体或PRRSV抗原或变体或类似物或片段的载体。用于表达抗原的元件有利地存在于本发明的载体中。至少，其包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子以及任选地对于某些载体(诸如质粒)和某些病毒载体(例如除痘病毒外的病毒载体)还有多腺苷酸化序列，基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸在载体中编码多蛋白片段，例如 PCV2抗原或猪肺炎支原体抗原或PRRSV抗原时，ATG位于阅读框的5'，终止密码子位于3'。可以存在用于控制表达的其他元件，诸如增强子序列、稳定序列，诸如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗有效量的制剂或组合物的施用，用于在靶细胞中递送和表达PCV2、猪肺炎支原体或PRRSV抗原。对于本领域普通技术人员来说，确定治疗有效量是常规实验。

药学上或兽医学上可接受的载体、佐剂、媒介物或赋形剂是本领域技术人员熟知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其他药学上或兽医学上可接受的载体、佐剂、媒介物或赋形剂包括但不限于聚-(L- 谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体、佐剂、媒介物或赋形剂可以是促进载体(或在体外从本发明的载体表达的蛋白质)的施用的任何化合物或化合物的组合；载体、媒介物、佐剂或赋形剂可促进转染和/ 或改善载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文中在一般描述中进行了论述，并且也可以由本领域技术人员结合本领域的知识来确定，而无需任何过度的实验。

根据本发明的免疫原性组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由其组成。用于本发明的实践的合适佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、马来酸酐和链烯基衍生物聚合物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，诸如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等，1996； WO98/16247)，(3)水包油乳液，诸如由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147 页所述的SPT乳液，以及同一著作的第183页描述的乳液MF59，(4)含有季铵盐例如DDA的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)引用并通过引用并入本申请的任何文献中论述的其它佐剂，或(9)其任意组合或混合物。

水包油乳液(3)可以基于：轻质液体石蜡油(欧洲药典类型)、类异戊二烯油诸如角鲨烷、角鲨烯、由烯烃的寡聚化产生的油，例如异丁烯或癸烯，具有直链烷基的酸或醇的酯，诸如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支链脂肪醇或酸的酯，尤其是异硬脂酸酯。

将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂可以是非离子表面活性剂，诸如：一方面是脱水山梨糖醇、甘露醇(例如，脱水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇的酯，另一方面是油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(所述酯任选地被乙氧基化)，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，诸如 Pluronic，例如L121。在US 7,608,279和US 7,371,395中描述了所述乳液中的一些乳液，诸如TS6、TS7、TS8和TS9乳液。

在一个实施方案中，佐剂可包括LR3和LR4(US7,691,368)、TSAP(US20110129494)、TRIGEN^TM(Newport Labs)、合成dsRNA(例如聚-IC,聚 -ICLC[])和MONTANIDE^TM佐剂(W/O,W/O/W,O/W,IMS和 Gel；全部由SEPPIC产生)。

在一个具体实施方案中，根据本发明的药物和/或治疗性组合物和/或制剂包含有效引发治疗反应的量的本文所论述的一种或多种抗原或基本上由其组成或由其组成；并且，可从本公开(包括本文所包含的文献和本领域的知识) 确定有效量，而无需过多的实验。

剂量可包括约10²至约10²⁰，约10³至约10¹⁸，约10⁴至约10¹⁶，约10⁵至约10¹²个VLP(病毒样颗粒)。可以基于任何病毒滴定方法计算病毒颗粒，包括但不限于FFA(灶形成测定(Focus Forming Assay))或FFU(灶形成单位 (Focus Forming Unit))、TCID₅₀(50％的组织培养物感染剂量)、PFU(噬斑形成单位)和FAID₅₀(50％的荧光抗体感染剂量)。剂量体积可以为约0.1至约 10ml，有利地为约0.2至约5ml。

在M hyo菌苗疫苗的情况下，组合物或疫苗可含有每剂量约1x 10⁶至约 5x 10¹⁰个集落形成单位(CFU)、约1x 10⁸至约5x 10¹⁰CFU/剂量，和约5x 10⁸至5x 10¹⁰CFU/剂量。

组合物或疫苗可含有约10^2.0至约10^10.0TCID₅₀或PFU/剂量，约10^2.0至约10^8.0TCID₅₀或PFU/剂量，以及约10^2.0至约10^6.5TCID₅₀或PFU/剂量。在灭活/杀死的组合物或疫苗的情况下，组合物或疫苗可含有相当量的TCID₅₀或PFU。

本领域技术人员应理解，本文的公开内容是以举例的方式提供的，并且本发明不限于此。根据本文的公开内容和本领域的知识，技术人员可以确定施用次数、施用途径和每种注射方案要使用的剂量，而无需任何过度的实验。

本发明考虑向动物施用至少一次有效量的根据本发明制备的治疗性组合物。动物可以是雄性、雌性、怀孕雌性和新生儿。该施用可通过各种途径进行，包括但不限于肌肉内(IM)、真皮内(ID)或皮下(SC)注射或通过鼻内或口服施用。根据本发明的治疗性组合物还可通过无针装置(如，例如用Pigjet、 Biojector或Vitajet装置(Bioject,Oreg.,USA))施用。

在本发明的一个实施方案中，可使用初免-加强方案，其包括使用至少一种共同多肽、抗原、表位或免疫原的至少一种初次施用和至少一次加强施用。初次给药中使用的免疫组合物或疫苗在性质上不同于用作加强剂的免疫组合物或疫苗。然而，应注意，相同的组合物可用作初次施用和加强。该施用方案称为“初免-加强”。初免施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。

向猪或断奶仔猪施用组合物或疫苗。如果需要，可在第一次施用后约2 至8周进行加强施用。在另一个实施方案中，向猪或母猪施用组合物或疫苗，使得仔猪从哺乳的初乳和乳汁获得针对PCV2、猪肺炎支原体和/或PRRSV 感染的被动免疫力。也可以每6个月或每年重复加强给药，特别是对于猪或母猪。

另一个目的是可操作地组装以对猪家族的动物施用疫苗的疫苗接种试剂盒或套组，其包含装有M hyo组合物或疫苗，或者M hyo多价组合物或疫苗，或者M hyo/PCV2组合物或疫苗，或者PRRS组合物或疫苗，或者其组合的至少一个疫苗小瓶。

这种疫苗接种试剂盒或套组能够引发针对PCV2、猪肺炎支原体和/或 PRRSV感染的安全和保护性免疫反应。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1.M hyo多价疫苗和PRRSV疫苗的功效研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪肺炎支原体是猪呼吸系统疾病综合征的最常见的分离病原体中的两种病原体。在其中存在这两种病原体的猪流中，感染猪肺炎支原体通常使猪易感染PRRSV。(1)在体外模型中，通过共感染诱导升高的炎性细胞因子水平，这可连续地将更多的巨噬细胞吸引到肺部的感染部位并延长感染。(2)如果这转换至田间(field)，由共感染引发的肺炎可导致PRRSV诱发的肺炎持续时间长于在由病毒自身加强感染时所观察到的肺炎持续时间。目前在田间循环的PRRSV株具有高水平的遗传异质性，使得商业疫苗通常不能提供针对异源病毒株的保护。(3)最近，一种表现出1-7-4RFLP模式的PRRSV新株在美国日益流行。(4)来自野外的初步报告描述了使用针对该毒力新株的商业疫苗不能获得保护。当猪肺炎支原体存在于农场时，该病毒感染的结果可能会恶化。需要可对抗与这两种病原体相关的组合病理学的新的疫苗接种策略，特别是在断奶后猪变得最容易受到感染时。

在本研究中，进行现场研究，其中测试了四种不同的疫苗接种策略，以确定它们是否能够从断奶到12周龄增强体重增加。

从来自显示PRRS的临床体征的感染幼儿室的28天猪血清中分离 PRRSV株。提取RNA并测序。使用BEI(二元乙烯亚胺)通过化学反应使传播的PRRS病毒失活。甲醛或BPL(β-丙内酯)也可用于灭活PRRS病毒。将160只PRRS阳性猪分成四组。猪是雄性和雌性的混合群体。这些猪大约 21日龄，平均体重约18磅。

表1治疗组

商业PRRSV MLV疫苗¹： MLV疫苗(BoehringerIngelheim)，标记剂量。

Circovac PCV2疫苗²：PCV2疫苗(由Merial Limited商业化的灭活疫苗)，其含有PCV2株Imp.1010,2ml/剂。

灭活的自体PRRSV疫苗³：在TS6佐剂/乳剂中(66.66％TS6+33.33％ PRRSV收获液)(如US 7,608,279和US 7,371,395以及表3中所述的TS6)，1 cc剂量

猪肺炎支原体疫苗⁴：灭活的M hyo菌苗疫苗(ProtaTekInternational,Inc.,Saint Paul,MN)，1ml/剂。

表2治疗方案

表3TS6乳液(US 7,608,279和US 7,371,395中描述的预乳液 (premulsion))

跟踪动物61天，并在第0天和第61天称重。还在两个时间点抽取血清样品，并通过qPCR评估PRRSV的存在情况(图1)，并使用荧光聚焦中和测定法(FFN)评估中和抗体滴度。针对接种处理中使用的两种株以及异源株 NADC20测量中和抗体滴度(图2)。使用两因素ANOVA(α＝0.05)评估所有组之间的体重增加，以确定起始体重和治疗组这些因素是否对结果变量即最终体重具有统计学显著的影响(图3)。然后使用Student t检验(α＝0.05)对组进行分级，以便可视化组间的统计学显著的差异(图4)。对猪进行类似评估以确定接种猪肺炎支原体是否对最终体重具有统计学上显著的影响，而与给定的治疗的其他组分无关(图5)。

在研究开始时，治疗组A和B中的动物明显轻于组C和组D动物，这一事实使研究结果复杂化。基于研究开始时抽取的血清的qPCR结果，似乎这种差异可能是由A组和B组中更严重的PRRSV感染造成的。我们的FFN 测试结果进一步支持了这一证据，所述FFN测试结果证明了研究结束时A 组中猪的针对1-7-4RFLP病毒的中和抗体滴度有统计学显著的差异。在接种疫苗之前，这些猪似乎经历了这种病毒的更严重攻击。在第0天递送的灭活疫苗可能在该攻击后发挥了加强免疫接种的作用。这可能导致了与未接种疫苗或在研究开始时未受严重感染的其他组相比，研究结束时中和抗体滴度增强。

进行另一项研究以评估灭活的自体PRRSV疫苗在与PRRSV MLV同时使用时的效果。结果显示，当将杀死的PRRS与MLV一起使用时，死亡损失得到2-5％的改善(表4)。

表4灭活PRRS疫苗的效果

当比较导致研究结束时获得的体重显著增加的治疗时，猪肺炎支原体疫苗接种显然是增强猪增重的能力的突出因素。接受猪肺炎支原体疫苗接种的猪完成了研究，平均比未接受该治疗的猪重11磅，猪肺炎支原体疫苗接种组的死亡损失改善为3.7％。因此，可将显著的经济有利方面赋予猪肺炎支原体疫苗接种。结果表明接受猪肺炎支原体疫苗接种的动物具有显著的体重有利方面。

数据表明，猪肺炎支原体疫苗接种的益处目前在该领域被低估。数据还表明，将灭活PRRSV疫苗与PRRSV MLV一起施用降低了死亡率。另外，结果显示当将M hyo疫苗与PCV2和PRRSV疫苗混合时未观察到干扰。

***

在已经详细描述了本发明的优选实施方案后，应该理解，由上述段落确定的本发明不限于上述描述中阐述的特定细节，因为在不脱离本发明的精神或范围的情况下可以有许多明显的变化。

本文引用或引述的所有文献(“本文引用的文献”)，以及本文引用的文献中引用或引述的所有文献，以及本文中提及的任何产品或通过引用并入本文中的任何文件中的任何制造商的说明、描述、产品规格和产品说明书由此通过引用并入本文，并且可用于本发明的实践中。

序列表

<110> Merial, Inc.

Wilson, Keith

Lawrence, Paulraj

<120> M Hyo多价疫苗及其用途

<130> MER 15-288

<150> 62/272,017

<151> 2015-12-28

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 PRRSV的DNA序列

<400> 1

atgttgggga aatgcttgac cgcgggctgc tgctcgcaat tgcctttttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct gttttgttgc gctcgtcaac gccaacaaca gcagcagctc ccatttacag 120

ttgatttata acctgacgat atgtgagctg aatggcacag attggctaaa caaaagtttt 180

gattgggcgg tggagacctt tgttattttt cctgtgttga ctcatattgt ctcctatggc 240

gccctcacca ccagccattt ccttgacaca gtcggcctga tcaccgtgtc tgccgccgga 300

tattaccacg ggcggtatgt cttgagtagc atttatgccg tctgcgccct ggctgcgtta 360

acttgcttcg tcatcaggct aacaaaaaat tgtatgtcct ggcgttactc atgcaccaga 420

tatactaatt ttcttctgga caccaagggc aaactctatc gttggcggtc tcctgtcatc 480

atagagaaag ggggtaaaat tgaggtcgaa ggtcacctga tcgacctcaa gagagttgtg 540

cttgacggtt ccgcggcaac ccctgtaacc aaagtttcag cggaacaatg gggccgtcct 600

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 PRRSV分离株14-02227-1

<400> 2

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115 120 125

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<210> 3

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 PRRSV分离株14-02094-1

<400> 3

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<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 PRRSV分离株S11-1118-1

<400> 4

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<210> 5

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 PRRSV参考分离株

<400> 5

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<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 PRRSV参考分离株 Fostera

<400> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> ORF5 RespPRRS-BI Ingelvac MLV

<400> 7

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<211> 200

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<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 PRRS-BI Ingelvac ATP

<400> 8

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1 5 10 15

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<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ORF5 EURO PRRS株Lelystad株

<400> 9

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1 5 10 15

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20 25 30

Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr

35 40 45

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50 55 60

Ala Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser

65 70 75 80

Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly

85 90 95

Ala Val Ser Thr Ala Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Cys Ser

100 105 110

Val Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg

115 120 125

Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr

130 135 140

Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro

145 150 155 160

Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Asp Gly Asn Leu Val

165 170 175

Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr

180 185 190

Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu

195 200

Claims (20)

1.一种组合物或疫苗，其包含：i)M hyo抗原，和ii)猪圆环病毒2型(PCV2)抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原或其组合。

2.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述疫苗组合物包含M hyo抗原和PCV2抗原。

3.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述疫苗组合物包含M hyo抗原和PRRSV抗原。

4.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述疫苗组合物包含M hyo抗原、PCV2抗原和PRRSV抗原。

5.权利要求1-4中任一项的组合物或疫苗，其中所述M hyo抗原是灭活M hyo。

6.权利要求1-5中任一项的组合物或疫苗，其中所述PRRSV抗原是经修饰的活和/或灭活PRRSV。

7.权利要求1-6中任一项的组合物或疫苗，其中所述PCV2抗原是灭活PCV2。

8.权利要求1-7中任一项的组合物或疫苗，其中所述PRRSV抗原包含含有编码ORF5蛋白的多核苷酸的灭活PRRSV，所述ORF5蛋白与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9所示的序列具有至少91％的序列同一性。

9.一种包含一种或多种PRRSV抗原的组合物或疫苗，其中所述PRRSV是经修饰的活的PRRSV和/或灭活的PRRSV。

10.权利要求9的组合物或疫苗，其中所述PRRSV抗原包含含有编码ORF5蛋白的多核苷酸的灭活PRRSV，所述ORF5蛋白与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8或9中所示的序列具有至少91％的序列同一性。

11.权利要求9的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗包含经修饰的活的PRRSV抗原和灭活的PRRSV抗原。

12.权利要求1-11中任一项的组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗增强猪增重或改善死亡损失的能力。

13.权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中所述组合物还包含一种或多种药学上或兽医学上可接受的载体、佐剂、媒介物或赋形剂。

14.一种给动物接种疫苗或在动物中诱发针对一种或多种猪病原体的免疫原性或保护性反应，或增强猪增重或改善死亡损失的能力的方法，其包括施用权利要求1-13中任一项的组合物或疫苗至少一次。

15.权利要求14的方法，其中所述方法包括初免-加强施用方案。

16.权利要求15的方法，其中所述方法包括包含M hyo抗原、PCV2抗原和PRRSV抗原的组合物或疫苗的初步施用，以及包含PRRSV抗原的组合物或疫苗的加强施用。

17.权利要求16的方法，其中所述初次施用的PRRSV抗原是经修饰的活的PRRSV，并且其中所述增强施用的PRRSV抗原是灭活的PRRSV。

18.一种给动物接种疫苗或在动物中诱发针对一种或多种猪病原体的免疫原性或保护性反应，或改善死亡损失的方法，其包括施用经修饰的活的PRRSV和灭活的PRRSV的组合物或疫苗至少一次。

19.权利要求14-18中任一项的方法，其中所述动物是猪。

20.一种疫苗接种试剂盒或套组，其包含装有权利要求1-13中任一项的组合物或疫苗的一个或多个疫苗小瓶。