CN117304338A - 一种融合蛋白抗原组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一组猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)与胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)融合蛋白抗原及其制备方法，属于生物技术制药领域。所述的一组猪圆环病毒和胸膜肺炎放线杆菌融合蛋白抗原Cap(PCV2a)‑OmlA、Cap(PCV2b)‑ApxⅠ、Cap(PCV2d)‑ApxⅡ和Cap(PCV3)‑ApxⅢ分别由编码PCV2a，PCV2b，PCV2d和PCV3的Cap蛋白的基因与编码APP的OmlA，ApxⅠ，ApxⅡ和ApxⅢ蛋白的基因融合并构建重组表达质粒，经大肠杆菌表达获得。将融合蛋白作为抗原制备疫苗，对小鼠、猪进行免疫攻毒实验，证实该组融合蛋白抗原具有很好的免疫效力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种融合蛋白抗原组合物及其制备方法和应用。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的高度传染性、致死性的呼吸道疾病。该病各年龄段猪只均可感染，感染且未死亡猪只呈生长缓慢或无症状带菌，成为主要传染源，给养猪业造成巨大的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌是革兰氏阴性菌，基于各个菌株脂多糖和荚膜多糖的抗原性差异，胸膜肺炎放线杆菌被分为18个血清型。各地流行的血清型有所差异，不同血清型之间的交叉保护力不高。胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子主要包括外毒素、脂多糖、荚膜多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶和菌毛等。其中外毒素是APP引起宿主肺部损伤最重要的毒力因子，也是猪传染性胸膜肺炎疫苗的重要抗原组分。目前国内市场上的疫苗为国产的猪胸膜肺炎放线杆菌全菌灭活疫苗和英特威公司的猪胸膜肺炎放线杆菌亚单位灭活疫苗。国产的猪胸膜肺炎放线杆菌全菌灭活疫苗成分较单一，一般只有2～3个保护性抗原，保护效果十分有限，而英特威公司以天然提取的放线杆菌毒力因子为组份的亚单位疫苗不存在上述缺点，且这种疫苗能诱导产生很好的免疫保护，但就其制备方法而言，存在着提取成本高、产量低，价格高昂等缺点。
猪圆环病毒病(PCVD/PCVAD)是由猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)引起的一种猪传染性疾病。PCV属于圆环病毒科，单链、环状DNA病毒，基因组长度约为1.7kb，是最小的动物DNA病毒之一。猪圆环病毒(PCV)主要包括四种基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，其中PCV2又分为多种基因亚型，包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。PCV2是引起PCVAD的主要病原体，也是引起断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)的主要病原体。近年来，PCV3在猪场的检出率逐年增加，常与PCV2混合感染，并引起全身系统性症状。
PCV基因组包含ORF1和ORF2两个主要的开放阅读框，分别编码非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap。Cap蛋白是PCV主要的衣壳蛋白，含有很多保护性抗原决定簇，是疫苗设计的靶标蛋白。目前国内市场上的疫苗主要为PCV2全病毒灭活疫苗和PCV2亚单位灭活疫苗，尚无PCV3疫苗。这些疫苗均存在成分单一，保护效果有限的缺点。
目前国内养殖场常出现多种疾病的混合感染，其中PCV和APP共感染时有发生，疫苗免疫是预防PCV和APP感染的主要手段，但目前国内PCV和APP疫苗存在无法针对多种流行菌、毒株提供全面有效保护的问题，无法保护猪免受其它基因型PCV和APP的感染。
发明内容
本发明的目的一是提供一组猪圆环病毒抗原与胸膜肺炎放线杆菌抗原的融合蛋白，制备的融合蛋白Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5、6、7、8所示。
本发明的目的二是提供上述融合蛋白的制备方法，该制备方法可以实现表达高质量的上述融合蛋白。
本发明的目的三在于提供了一种能够预防多种血清型猪圆环病毒和胸膜肺炎放线杆菌感染的猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗，包含上述融合蛋白，还包含佐剂，所述佐剂为ISA 15AVG佐剂。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所述的融合蛋白是将Cap(PCV2a)，Cap(PCV2b)，Cap(PCV2d)和Cap(PCV3)蛋白的氨基酸序列分别与APP的OmlA，ApxⅠ，ApxⅡ和ApxⅢ蛋白的部分氨基酸序列通过连接肽(Linker)连接形成。具有以下通式：PCV2aCap(PCV2a)-(Linker)n-OmlA；Cap(PCV2b)-(Linker)n-ApxⅠ；Cap(PCV2d)-(Linker)n–ApxⅡ；Cap(PCV3)-(Linker)n–ApxⅢ。
其中，所述Cap(PCV2a)-OmlA融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；Cap(PCV2b)-ApxⅠ融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；Cap(PCV2d)-ApxⅡ融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；Cap(PCV3)-ApxⅢ融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。所述连接肽序列为GGGGS，n为3。
本发明融合蛋白组合的制备及鉴定方法如下：
1.重组表达质粒构建：构建重组表达质粒pET28a-Cap(PCV2a)-OmlA、pET28a-Cap(PCV2b)-ApxⅠ、pET28a-Cap(PCV2d)-ApxⅡ和pET28a-Cap(PCV3)-ApxⅢ；
2.转化及阳性克隆的筛选：将步骤(1)中的表达载体转化至宿主菌BL21(DE3)，经诱导表达、SDS-PAGE鉴定得到能够表达目的蛋白的重组表达菌；
3.诱导表达：将步骤(2)中的阳性重组表达菌接种新鲜培养基生长至对数生长期，添加IPTG进行诱导表达；
4.蛋白变性复性：收集步骤(3)中的菌体，经超声破碎、包涵体洗涤及溶解、透析复性得到目的蛋白；
5.融合蛋白的鉴定：采用SDS-PAGE和Western blot对步骤(4)中获得的融合蛋白进行鉴定。
猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗疫苗制备方法如下：
将250μg/mL融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ按1：1：1：1的比例混合，将混合好的抗原水相与ISA 15AVG佐剂按照85：15的比例混合制备成猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗。
本发明相对于现有技术的有益效果在于：本发明的融合蛋白组合物包含多个血清型APP和PCV主要免疫原性蛋白，本发明通过将猪圆环病毒Cap蛋白用较长且柔软的柔性Linker(Gly4Ser)3与胸膜肺炎放线杆菌的抗原蛋白连接，在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻，从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠，并使得各个蛋白互不影响，均能保留各自的免疫原性。将该融合蛋白组合物制备疫苗免疫动物，可以预防多种血清型APP和PCV的感染，给动物提供足够的免疫保护。
附图说明
图1为本发明实施例中重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE检测；泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2a)-OmlA诱导表达前；泳道2：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2a)-OmlA诱导表达后；泳道3：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2b)-ApxⅠ诱导表达前；泳道4：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2b)-ApxⅠ诱导表达后；泳道5：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2d)-ApxⅡ诱导表达前；泳道6：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2d)-ApxⅡ诱导表达后；泳道7：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV3)-ApxⅢ诱导表达前；泳道8：原核表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV3)-ApxⅢ诱导表达后。
图2为本发明实施例中重组蛋白可溶性的SDS-PAGE检测；泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2a)-OmlA破碎后上清；泳道2：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2a)-OmlA破碎后沉淀；泳道3：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2b)-ApxⅠ破碎后上清；泳道4：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2b)-ApxⅠ破碎后沉淀；泳道5：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2d)-ApxⅡ破碎后上清；泳道6：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2d)-ApxⅡ破碎后沉淀；泳道7：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV3)-ApxⅢ破碎后上清；泳道8：重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV3)-ApxⅢ破碎后沉淀。
图3为本发明实施例中重组蛋白纯化结果；A：泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：Cap(PCV2a)-OmlA；泳道2：Cap(PCV2b)-ApxⅠ；泳道3：Cap(PCV2d)-ApxⅡ；B：泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：Cap(PCV3)-ApxⅢ。
图4为本发明实施例中利用6×His单克隆抗体对重组蛋白进行鉴定的Westernblot结果；泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA；泳道2：重组蛋白Cap(PCV2b)-ApxⅠ；泳道3：重组蛋白Cap(PCV2d)-ApxⅡ；泳道4：重组蛋白Cap(PCV3)-ApxⅢ。
图5为本发明实施例中利用PCV2单克隆抗体对细胞培养物的间接免疫荧光检测结果示例；a：PCV2阴性；b：PCV2阳性。
图6为PCV3阳性病料PCR鉴定结果；M：DL2000 Marker；1：病料2：阳性对照；3：阴性对照。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但发明的保护内容不局限于以下实施例。
1、重组表达质粒的构建与鉴定。
将PCV2a Cap(蛋白ID：MK347405.1)的氨基酸序列与APP OmlA(蛋白ID：EU251513.1)的氨基酸序列通过(GGGGS)3柔性Linker串联，PCV2b Cap(蛋白ID：JX679498.1)的氨基酸序列与APPApxⅠ(蛋白ID：AF363361.1)的C端氨基酸序列通过(GGGGS)3柔性Linker串联，PCV2d Cap(蛋白ID：MZ954925.1)的氨基酸序列与APPApxⅡ(蛋白ID：AF363362.1)的C端氨基酸序列通过(GGGGS)3柔性Linker串联，PCV3 Cap(蛋白ID：MW767462.1)的氨基酸序列与APPApxⅢ(蛋白ID：AF363363.1)的C端氨基酸序列通过(GGGGS)3柔性Linker串联。
将串联后的氨基酸序列按照大肠杆菌的密码子偏好转换为基因序列，并在其5＇端和3＇端分别引入特异性酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，委托上海生工生物科技有限公司合成，并将其克隆到pET-28a(+)表达载体上，分别命名为pET28a-Cap(PCV2a)-OmlA、pET28a-Cap(PCV2b)-ApxⅠ、pET28a-Cap(PCV2d)-ApxⅡ和pET28a-Cap(PCV3)-ApxⅢ。将构建好的质粒进行测序，测序结果显示，重组基因与设计目的基因的同源性为100％，读码框完全正确。
2、重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ的诱导表达及初步纯化。
将鉴定好的重组质粒pET28a-Cap(PCV2a)-OmlA、pET28a-Cap(PCV2b)-ApxⅠ、pET28a-Cap(PCV2d)-ApxⅡ和pET28a-Cap(PCV3)-ApxⅢ分别转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后得到重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2a)-OmlA、BL21(DE3)-Cap(PCV2b)-ApxⅠ、BL21(DE3)-Cap(PCV2d)-ApxⅡ和BL21(DE3)-Cap(PCV3)-ApxⅢ，保存甘油菌备用。
重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2a)-OmlA，已于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏中心，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.27331。
重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2b)-ApxⅠ，已于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏中心，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.27332。
重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2d)-ApxⅡ，已于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏中心，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.27333。
重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV3)-ApxⅢ，已于2023年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏中心，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.27334。
取10μL甘油菌加入5mL卡那抗性LB培养基中，37℃200rpm过夜培养。取2mL过夜培养的菌液加入200mL卡那抗性LB培养基中，37℃200rpm培养，待菌液的OD600达到0.4～0.6之间时，留取1mL菌液制备蛋白样品，剩余菌液加入终浓度为1mM IPTG进行诱导，37℃200rpm诱导4h，收集菌液制备蛋白样品。对收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE检测。结果显示重组表达菌BL21(DE3)-Cap(PCV2a)-OmlA、BL21(DE3)-Cap(PCV2b)-ApxⅠ、BL21(DE3)-Cap(PCV2d)-ApxⅡ和BL21(DE3)-Cap(PCV3)-ApxⅢ诱导后分别在75kDa、65kDa、90kDa和100kDa左右处出现明显条带，与重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ预期大小相符(见图1)。
将留取的甘油菌复苏后，按1:100接种到1L含卡那抗性的LB培养基中，37℃200rpm培养。待菌液的OD600达到0.4～0.6之间时，加入终浓度为1mM IPTG进行诱导，37℃200rpm诱导4h。7000rpm离心30min收集菌体，加入50mLPBS缓冲液重悬菌体，进行超声裂解30min，经8000rpm离心30min，分别收集沉淀和上清，并进行SDS-PAGE检测。结果如图2所示，重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA主要在上清中，重组蛋白Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ主要在沉淀中，表面重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA可溶性表达，重组蛋白Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ以包涵体形式表达。
利用镍柱(Ni2+)亲和层析方法对蛋白进行纯化。将纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，分别在75kDa、65kDa、90kDa和100kDa左右处存在明显条带，与目的蛋白条带大小一致。
3、重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ的Westernblot鉴定
对重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ进行SDS-PAGE(80V 0.5h，120V 1h)，然后电转印于硝酸纤维素膜(PVDF)上(200mA2 h)，加入适量含5％脱脂奶粉的PBST封闭液，室温封闭2h；用PBST中洗涤3次，每次10min；加入适量鼠抗6×His单克隆抗体(1:1000)，4℃过夜，然后用PBST洗涤3次，每次10min；加入过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1:1000)，室温孵育1h，后用PBST洗涤3次，每次10min；配制酶标底物显色液(DAB)，将其浸泡于DAB显色液中显色。
Westernblot鉴定重组蛋白结果如图4所示，重组蛋白Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ被His单克隆抗体识别，是本研究的目的蛋白。
4.免疫效力检验
4.1PCV免疫攻毒保护实验
4.1.1PCV2a、PCV2b和PCV2d免疫攻毒保护实验
猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗疫苗制备方法如下：
将250μg/mL融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ按1：1：1：1的比例混合，将混合好的抗原水相与ISA 15AVG佐剂按照85：15的比例混合制备成猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗。
6周龄雌性BALB/c小鼠分为2组进行免疫，每组30只，免疫分组和免疫程序如下：疫苗免疫组：每只小鼠免疫猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗0.2mL；空白对照组：每只小鼠免疫PBS 0.2mL。一免14天后二免，二免21天后进行攻毒。攻毒保护实验分组如下：将疫苗免疫组和空白对照组各分为3组，分别利用本公司保存的猪圆环病毒NJ株(PCV2a)、DBN-SX07株(PCV2b)和XZ株(PCV2d)进行攻毒保护实验。每个攻毒组分别包含10只疫苗免疫组小鼠和10只空白对照组小鼠。
NJ株攻毒组每只小鼠接种PCVNJ株(107.3TCID50/mL)0.25mL，DBN-SX07株攻毒组每只小鼠接种PCV DBN-SX07株(107.1TCID50/mL)0.25mL，XZ株攻毒组每只小鼠接种PCV XZ株(108.0TCID50/mL)0.25mL，攻毒后连续观察21日，扑杀剖检取脾分离病毒。
病毒分离
(1)每只小鼠取脾脏组织，按1mL/0.05g的比例加入无菌的MEM无血清培养基，置于匀浆机中研磨制备匀浆，以12000r/min离心10分钟，收集上清过滤除菌，-20℃保存备用。
(2)用0.02％EDTA-0.05％胰酶消化PK-15细胞单层，制备浓度为2×105个/mL细胞悬液，将组织悬液与细胞悬液按1:10比例混合后接种12孔细胞培养板，1.5mL/孔，置37℃、5％CO2培养箱培养72h。反复冻融3次，盲传2代，收集细胞培养物。随后对培养物进行间接免疫荧光检测。
间接免疫荧光检测
(1)向培养物中加入本实验室制备的1:1000稀释的鼠抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育90分钟。
(2)弃上清，用PBS缓冲液洗涤5次，甩干。向待检测板中加入1:200稀释的FITC标记羊抗鼠IgG，避光、37℃孵育60分钟。弃上清，用PBS洗涤5次，吸水纸拍干。每孔加入100μLPBS，在倒置荧光显微镜下观察，每个样品3个重复。有绿色荧光的细胞孔判为阳性，无绿色荧光的细胞孔判为阴性(见图5)。
结果如表1所示，小鼠经疫苗免疫后，对PCV2a、PCV2b和PCV2d均有80％以上的保护率，表明重组抗原免疫原性良好，可以给动物提供有效的免疫保护。
表1.PCV2a、PCV2b和PCV2d小鼠攻毒保护实验结果
4.1.2 PCV3免疫攻毒保护实验
6周龄雌性BALB/c小鼠分为2组进行免疫，每组10只，免疫分组和免疫程序同4.1.1。二免后21天进行攻毒：
(1)取PCV3核酸检测阳性的猪脾脏组织病料，按1mL/0.05g的比例加入无菌的PBS，置于匀浆机中研磨制备匀浆，以12000r/min离心10分钟，收集上清过滤除菌。-20℃保存备用。
(2)利用分离得到的组织毒进行攻毒，0.25mL/只。
(3)攻毒后连续观察21日，扑杀剖检取脾脏。
(4)将脾脏研磨制备组织毒，接种6周龄雌性BALB/c小鼠，0.25mL/只。观察2日后扑杀剖检取脾脏。
(5)重复上述步骤(4)，分别收集小鼠脾脏
(6)分别提取小鼠脾脏组织中病毒核酸，利用表2引物和表3的基因扩增体系和条件进行PCR检测，有条带判定PCV3感染阳性，无条带判定PCV3感染阴性(见图6)。
结果如表4所示，小鼠经疫苗免疫后，对PCV3感染有70％的保护率，表明重组抗原免疫原性良好，可以给动物提供有效的免疫保护
表2.扩增PCV3 Cap基因的引物
表3.基因的扩增体系和条件
表4.PCV3小鼠攻毒保护实验结果
4.2 APP免疫攻毒保护实验
4.2.1小鼠免疫攻毒保护实验
进行小鼠免疫实验，免疫程序同4.1.1。免疫后21日，将疫苗免疫组和对照组各分为3组，分别用本公司保存的YZ株APP(8型)，ZJ株APP(5型)和CZ株APP(15型)进行攻毒保护实验。每个攻毒组分别包含10只疫苗免疫组小鼠和10只对照组小鼠。
YZ株APP(8型)攻毒组每只小鼠腹腔接种致死菌量2.76×108.0CFU/200μLYZ株APP(8型)，ZJ株APP(5型)攻毒组每只小鼠腹腔接种致死菌量2.84×108.0CFU/200μLZJ株APP(5型)CZ株APP(15型)攻毒组每只小鼠腹腔接种致死菌量2.69×108.0CFU/200μL CZ株APP(15型)，攻毒结果分别如表5、6、7所示。
YZ株APP(8型)攻毒组结果显示：感染YZ株APP(8型)的对照组小鼠在36h内全部死亡，存活率为0；免疫组小鼠在攻毒48h有两只小鼠死亡，获得80％的保护力。ZJ株APP(5型)攻毒组结果显示：感染ZJ株APP(5型)的对照组小鼠在24h内全部死亡，存活率为0；疫苗免疫组小鼠在攻毒48h内有三只死亡，获得70％的保护力。CZ株APP(15型)攻毒组结果显示：感染CZ株APP(15型)的对照组小鼠在24h内全部死亡，存活率为0；免疫组小鼠在攻毒48h内有一只死亡，获得90％的保护力。分析认为，重组蛋白刺激机体产生的抗体能够在App感染急性期提供一定免疫保护。
表5.YZ株APP(8型)小鼠攻毒保护实验结果
表6.ZJ株APP(5型)小鼠攻毒保护实验结果
表7.CZ株APP(15型)小鼠攻毒保护实验结果
4.2.1猪免疫攻毒保护实验
8周龄健康仔猪(种猪场无APP流行且母猪未接种APP疫苗)分为2组进行免疫，每组15只。试验分组如下：疫苗免疫组：每只猪肌肉注射接种猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗2mL；空白对照组：每只猪肌肉注射接种PBS2mL。免疫攻毒保护试验：一免28天后二免，二免21天后进行攻毒。将疫苗免疫组和对照组平均分为三组，分别采用YZ株APP(8型)、ZJ株APP(5型)和CZ株APP(15型)进行滴鼻攻毒，攻毒剂量均为1×108.0CFU，攻毒后持续观察两周，看是否出现高热、呼吸困难、口腔和鼻腔内流出或存有带血泡沫样分泌物等症状。免疫攻毒保护情况见表8。结果显示，免疫组猪只发病率不超过20％，存活率为100％，表明本发明的四组份重组亚单位疫苗免疫保护效果良好。
表8猪免疫攻毒保护实验结果
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Claims (9)
1.一种融合蛋白组合物，其特征在于，所述融合蛋白组合物包括融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2b)-ApxⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2b)-ApxⅠ的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述融合蛋白抗原Cap(PCV3)-ApxⅢ的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白组合物，其特征在于，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ的重组表达菌的菌种保藏号分别为：CGMCC No.27331、CGMCCNo.27332、CGMCC No.27333、CGMCC No.27334。
3.权利要求1所述融合蛋白抗原组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)全基因组合成所述融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ、Cap(PCV3)-ApxⅢ的基因序列，将所述基因序列插入原核表达载体pET-28a构建重组质粒pET28a-Cap(PCV2a)-OmlA、pET28a-Cap(PCV2b)-ApxⅠ、pET28a-Cap(PCV2d)-ApxⅡ和pET28a-Cap(PCV3)-ApxⅢ；
(2)将所述重组质粒pET28a-Cap(PCV2a)-OmlA、pET28a-Cap(PCV2b)-ApxⅠ、pET28a-Cap(PCV2d)-ApxⅡ和pET28a-Cap(PCV3)-ApxⅢ分别转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行扩增，经过诱导表达、变性、复性、纯化后获得所述融合蛋白组合物。
4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白组合物，其特征在于，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA的编码碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2b)-ApxⅠ的编码碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2d)-ApxⅡ的编码碱基序列如SEQ ID NO:3所示，所述融合蛋白抗原Cap(PCV3)-ApxⅢ的编码碱基序列如SEQ ID NO:4所示。
5.含有权利要求1所述的融合蛋白组合物的猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联亚单位疫苗由所述融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ制成。
6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗，其特征在于，所述融合蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ的浓度均为50～55μg/mL。
7.根据权利要求5或6所述的猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗，其特征在于，所述二联亚单位疫苗还包括药学上可接受的佐剂。
8.根据权利要求7所述的猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗，其特征在于，所述的佐剂为ISA 15AVG佐剂。
9.权利要求5所述的猪圆环病毒病和猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗的制备方法,其特征在于，将重组蛋白抗原Cap(PCV2a)-OmlA、Cap(PCV2b)-ApxⅠ、Cap(PCV2d)-ApxⅡ和Cap(PCV3)-ApxⅢ按比例混合，将混合好的抗原水相与佐剂按比例混合即得。
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