CN110072546A - 新的猪流感疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括至少一个(至少两个)与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列的EHV载体，该外源性抗原编码序列插入插入位点(优选地ORF70)中且该外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列(启动子序列优选包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列)。另外，本发明涉及对产食动物实施免疫的方法，其包括向该产食动物施用本发明的免疫原性组合物。此外，本发明涉及治疗或预防有需要的产食动物由猪流感病毒引起的临床征象的方法。
Description
序列表
本申请案含有根据37 C.F.R.1.821-1.825的序列表。伴随此申请案的序列表的全部内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及(载体)疫苗领域，且尤其涉及适于表达来自所述载体疫苗的靶抗原的插入位点及启动子。另外，本发明涉及猪流感A病毒疫苗。
背景技术
EHV载体系统
马病原体马α疱疹病毒(Equid Alphaherpesvirus)1(马流产病毒，EHV-1)属疱疹病毒目(Herpesvirales)的疱疹病毒科(Herpesviridae)科中的α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)的水痘病毒(Varicellovirus)属。其是具有大约150,000碱基对的双链DNA基因组的较大包膜病毒。水痘病毒亚属的其他重要成员是人类疱疹病毒3(水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus))、猪疱疹病毒1(假性狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus))、牛疱疹病毒1(感染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus))及马疱疹病毒4(马鼻肺炎病毒(Equine Rhinopneumitis Virus)，EHV-4)(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy:2015Release EC 47,London,UK，2015年7月；Email ratification 2016(MSL 30号)。
EHV-1及EHV-4具有地方性且影响整个世界的马。尽管EHV-4主要引起上呼吸道的轻度感染，但EHV-1可引起全身性感染以及自呼吸症状至流产及致死性脑脊髓病的多种疾病(取决于毒株及宿主的免疫学状态)。当前在美国及欧洲分别可利用以下两种针对EHV-1的许可经修饰活疫苗(MLV)：Rhinomune(Boehringer Ingelheim)及Prevaccinol(MSD)。二者皆含有经典减毒EHV-1RacH株，该株在猪上皮细胞中传代256次以达成减毒(Ma等人，2013)。已在分子层面上探究减毒机制。Osterrieder等人(1996)展示，RacH缺乏orf67的两个基因组拷贝且恢复一个拷贝即足以恢复毒性。另外，RacH携载1283bp缺失，该缺失去除编码免疫阻抑性病毒蛋白的orf1的90％以上的编码序列。其他突变亦可影响减毒，但尚未详细探究。其皆使得RacH成为极安全疫苗株，此乃因极其不可能(几乎不可能)通过在经接种疫苗动物中传代来恢复毒性。
含有马疱疹病毒1(EHV-1)疫苗株RacH(pRacH-SE)的整个基因组的大肠杆菌(E.coli)细菌人工染色体(BAC)可视为用于载体疫苗研发的平台。已展示，基于EHV-1 RacH的载体疫苗能够在若干哺乳动物物种(包含猪、牛及狗)中诱发免疫性(Rosas等人，2007；Rosas等人，2008；Trapp等人，2005；Said等人，2013)。编码病原体的抗原性蛋白质的基因可由重组EHV-1 RacH表达。EHV-1-RacH基因组以其BAC形式处理于大肠杆菌中且经个性化以通常通过插入转基因表达盒来表达其他蛋白质(Tischer等人，2010)。在经培养允许细胞中转染pRacH-SE DNA后，通过细胞转录因子引发EHV-1复制。病毒DNA聚合酶的活性使得缺失所有BAC-载体相关序列且将EHV-1 RacH基因组恢复至其原始状态。生成与RacH不可区分的感染性病毒。
在(例如)通过插入转基因表达盒来将pRacH-SE处理于大肠杆菌中时，在允许细胞中转染之后重构的病毒将携载修饰且表达其他基因。可使用重组EHV-1RacH作为载体疫苗。
用于EHV载体系统的启动子
然而，不使用其他外源启动子表达的转基因蛋白的量通常相对较低。因此，未满足性地需要可用于自此一载体、尤其重组EHV-1 RacH表达转基因蛋白的其他启动子。
使用人类巨细胞病毒即刻早期基因1启动子-增强子(Boshart等人，1985)，已报导转基因可自orf1/3插入位点有效表达。在所述研究中，使用牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH)来稳定转录物以达成优选表达(Ma等人，2012；Said等人，2013)。尽管并无HCMV可诱导人类的肿瘤的证据，但不能排除理论风险。在阐述HCMV-IE增强子(Boshart等人，1985)之前，大部分强增强子发现于已知致癌病毒(如猿猴病毒40、多瘤病毒或莫罗尼鼠类肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus))的基因组中。尽管极强且非组织特异性的HCMV及MCMV(小鼠巨细胞病毒)IE启动子-增强子极适用于各种研究活动，但通常其不能代表用于转基因载体疫苗的启动子的第一选择。特定而言，对动物接种疫苗者意外暴露的风险可被管理机构视为许可疫苗的阻碍。
用于EHV载体系统的插入位点
野生型EHV-1株在其基因组的长独特区段的一端拥有三个开放阅读框(orf)(称为orf1、orf 2及orf3)(序列坐标1298-3614；图1a)。Orf1及orf3连续配置于DNA的一条链上，而orf 2是由互补链编码。疫苗株RacH在该区域中具有影响orf 1及2的1283bp缺失，从而指示所述基因并非为病毒复制必需。出于此原因，该位点用作转基因插入位点。此插入位点称为ORF1/3。
然而，可插入ORF1/3插入位点中的转基因的大小及数量通常受限。因此，为增大EHV-1载体的能力，未满足性地需要插入转基因且自EHV-1载体、尤其重组EHV-1 RacH载体表达转基因的新颖替代方式。
猪流感A病毒(SIAV)
猪流感是由正粘病毒科(Orthomyxovirus)的流感A病毒(IAV)引起的急性呼吸病毒疾病，其可降低猪的健康及幸福感。猪中的临床流感征象可显示多种严重程度，但通常发生为发病率较高且恢复快速的轻度呼吸疾病，且致命病例极少。然而，该疾病具有重大经济负荷，此乃因其产生体重减轻、体重增加降低且在一些情形下因高烧而导致母猪不能繁殖。SIAV是猪的最重要呼吸病原体的一且其在全世界猪畜群中的高盛行率与疾病的经济影响直接相关。在欧洲，当前存在4种循环于农场猪中且引起经济损失的主要流感A病毒亚型(Brown,2000)。自1980年代以来，H1N1(“禽类”亚型)及H3N2猪流感病毒已成为主要产猪国家的地方性疾病。H1N2病毒已在约20年以前引入欧洲猪中(Brown等人，1995)，且H1N1“广泛流行”亚型(H1pdmN1)已通过在2009人类H1N1广泛流行过程中自人类传播至猪而引入猪群体中且已在全球于猪群体中连续传播，其中在所有猪流感病毒感染中欧洲的平均盛行率估计为8％(Watson等人，2015)。另外，猪流感亦涉及人类健康，此乃因IVA因其人畜互通病潜力而众所周知(Thacker&Janke 2008)。
欧洲的4种最盛行流感A株是H1N2、H3N2及H1N1(H1N1禽类及H1N1广泛流行)亚型。因此，需要高度有效地用于H1N2、H3N2及H1N1(H1N1禽类及H1N1广泛流行)亚型且由此提供针对所述猪IAV野生株的极宽保护的疫苗。
另外，多价疫苗较为有利，此乃因多价疫苗通常较单价疫苗更加成本有效且更加时间有效。
然而，一般而言，疫苗效能可受不同疫苗株的干扰效应(例如病毒干扰)和/或一种疫苗组分的杀病毒效应影响。因此，需要高度有效且不受上文所提及的干扰影响的猪IAV组合疫苗。
另外，循环猪IAV株的广泛多价覆盖应亦有效防止疫苗株/抗原与野生病毒彼此仅远相关时可观察到的经接种疫苗动物感染野生病毒之后呼吸疾病的疫苗相关增强(VAERD)(Rajao等人，2016)。
并非经修饰活疫苗(MLV)，如本文所阐述基于EHV-载体的疫苗提供关于猪IAV的最终安全性，此乃因并不生成活IAV或给予动物活IAV，由此防止潜在恢复至疫苗株的毒性且防止野生株自猪或人类的基因重组或再分类。此外，与死疫苗(当前标准)不同，载体疫苗预计不仅诱导猪IAV中和抗体，且亦通过MHC种类I及II路径强烈刺激针对猪IAV的细胞免疫性。因此，需要通过载体的SIAV疫苗。
此外，经修饰活疫苗及灭活疫苗缺乏用于诊断鉴别经接种疫苗动物的感染(DIVA)的固有特征。因此，需要SIAV DIVA疫苗。可通过针对感染猪IAV野生株的动物中的猪IAV蛋白(例如NP(核蛋白)或NA(神经氨酸酶))检测抗体来达成DIVA。与的相比，仅使用如本文所阐述的疫苗接种疫苗的动物(且未感染野生型病毒或MLV，且未使用灭活疫苗接种疫苗)仅表达猪IAV HA蛋白，且在所述经接种疫苗动物中，不能检测到诸如NP或NA等蛋白质亦及由此的针对NP或NA的抗体。
可将灭活(死)疫苗在分娩之前施加至母猪以通过母源免疫性保护仔猪免于猪IAV(母猪疫苗)。另外，可将灭活疫苗直接施加至仔猪(仔猪疫苗)。然而，在作为仔猪疫苗施加时，灭活疫苗不能克服幼小仔猪中针对猪IAV的母源免疫性。因此，在始于约8周龄且诱导免疫性开始(自生命的约12周或之后)的时间点使用灭活疫苗对仔猪实施猪IAV接种疫苗，由此留有免疫学间隙，其中仔猪不再由针对猪IAV的母源免疫性保护且尚未达成自仔猪的接种疫苗来抵抗猪IAV，由此使得所述动物在此时间段期间易于发生猪IAV感染。不同于死疫苗，本文所阐述的疫苗容许使用一定浓度的母源抗鼠IAV抗体对仔猪接种疫苗且仍抵抗后期猪IAV感染。因此，需要高度有效且可生命早期施用(甚至在母源抗体存在下)的猪IAV疫苗。
发明内容
为避免任何所述障碍，本发明提供新颖插入位点、新颖启动子序列及SIAV疫苗。
因此，通过说明及申请专利范围中所描述的实施例来解决上述技术问题且根据申请专利范围来实施本发明的不同方面。
为增大EHV载体的能力，本发明提供插入转基因且自EHV载体主链表达转基因的新颖替代方式。
本发明涉及在如本文所定义的ORF70内具有新颖插入位点的EHV载体。
本发明提供一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入ORF70中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
本发明涉及一种新颖、替代插入位点ORF70，其可用于插入外源性抗原编码序列且自EHV载体、尤其重组EHV-1 RacH表达蛋白质。
EHV-1载体中的新“ORF70插入位点”的特征在于与ORF70相关的部分缺失、截短、取代、修饰或诸如此类。缺失完整ORF70预计不利于病毒复制且由此不利于疫苗制造及效能，此乃因完全缺失ORF70将影响编码gpII的ORF71的启动子。新ORF70插入位点和/或ORF70中的插入(表达盒)在功能上是以ORF71保留功能或完整的方式来定义。
在一具体方面中，ORF70插入位点涵盖缺失RacH的ORF70内的大约801bp部分(SEQID NO.:20)或其70％、80％、85％、90％、95％、99％同源序列。RacH基因组序列中的缺失部分展示为SEQ ID NO.:20(无可用核苷酸编号，此乃因完整RacH基因组序列未知)。在另一具体方面中，ORF70插入位点涵盖野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内的理论801bp缺失。缺失部分位于核苷酸127681与128482之间的野生型ab4(Genbank登录号AY665713.1)基因组序列中(SEQ ID NO.:19)。
在本发明中，“侧翼区”直接将包括外源性抗原编码序列的表达盒重组至EHV-1基因组中。所述侧翼区天然存在于EHV-1中。选择Up70侧翼区(417bp,SEQ ID NO.:13)及Up71侧翼区(431bp,SEQ ID NO.:14)来进行用于orf70位点的所有转移载体/质粒的经典同源重组。在野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)中，相应序列位于位于核苷酸127264-127680(侧翼区up orf70，SEQ ID NO.:15)及128483-128913(侧翼区up orf71，SEQID NO.:16)处。对于RED重组而言，因XbaI限制性消解，故截短侧翼区。所述截短侧翼区与上文所阐述的417bp“经典”侧翼区(Up70侧翼区，SEQ ID NO.:13)的3’283bp及431bp“经典”侧翼区(Up71侧翼区，SEQ ID NO.:14)的5’144bp相同。所述截短侧翼区称为Up70侧翼区(283bp，包含为SEQ ID NO.:17)及Up71侧翼区(144bp，包含为SEQ ID NO.:18)。所述各种侧翼区定义相同ORF70插入位点。侧翼区总是成对使用，一个是“左”侧翼区(例如SEQ ID NO.:13、15、17)且一个是“右”侧翼区(例如SEQ ID NO.:14、16、18)。
另外，本发明提供克服业内缺陷的用于转基因表达的新颖调节核酸序列/启动子序列、免疫原性组合物、疫苗及相关方法。
因此，本发明提供一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列的启动子序列。
因此，本发明涉及具有两种新颖启动子：4pgG600及4pMCP600及其较短长度的衍生物的EHV载体，所述启动子在瞬时转染于细胞培养液中或在细胞培养液中的rEHV1-RacH复制背景中之后展示为功能性。新颖启动子p430及p455在细胞培养液中的rEHV1-RacH复制背景中亦及在动物(猪及小鼠)中展示为功能性。两种新颖启动子在病毒复制周期期间的活性程度似乎极为类似，如自活体外启动子动力学实验所推论。
所述性质容许产生基于EHV-1 RacH且以类似效率同时表达两种不同抗原的重组载体疫苗。若疫苗靶是由两种不同病原体组成，则在与两个多腺苷酸化序列组合的两个插入位点中施加两种新颖启动子可显著减小生产成本且明显优于仅表达一种抗原性组分的载体。
本发明另外涉及一种EHV-1载体，其表达来自一种载体主链的两种不同转基因且并不通过RNA病毒源功能(2a肽，IRES位点)在一种启动子的控制下偶合两种转基因。
另外，本发明提供一种EHV载体，其包括
(i)至少两个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)所述外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)所述外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
另外，本发明提供包括如上文所阐述的EHV载体免疫原性组合物及DIVA疫苗。
所述性质容许产生基于EHV-1 RacH且以类似效率同时表达不同抗原的重组载体疫苗。若疫苗靶是由两种不同病原体组成，则在与两个多腺苷酸化序列组合的两个插入位点中施加两种新颖启动子可显著减小物品成本且明显优于仅表达一种抗原性组分的载体。
另外，本发明提供SIAV疫苗。本发明另外涉及具体血凝素序列(例如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29)及其同系物序列。另外，本发明提供安全且高度有效的单价及多价SIAV疫苗。
另外，本发明的基于载体的SIAV疫苗可用于区分感染猪流感A病毒的产食动物与使用如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗接种疫苗的产食动物。
此外，本发明涉及如本文所阐述包括EHV载体的免疫原性组合物及DIVA疫苗的用途。本发明是指对产食动物实施免疫的方法、产食动物中由猪IAV引起的临床征象的治疗或预防、减小产食动物中的肺中的病毒效价的方法及对具有抗猪流感A病毒抗体的有需要产食动物接种疫苗的方法。
发明详述
本发明解决先前技术中的固有问题且提供最新技术的显著改进。通常，本发明提供一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入ORF70中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
另外，本发明提供包括如本文所阐述的EHV载体及任选药学载剂的免疫原性组合物。
因此，本发明提供包括EHV载体的免疫原性组合物，该EHV载体包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入ORF70中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
有利的是，由本发明提供的实验数据揭示，已在EHV载体内提供可用于插入且表达抗原的新颖插入位点。另外，提供新颖插入位点现容许自不同插入位点插入抗原并加以表达且分别表达一种以上抗原。另外，实验数据展示，可使用具有新颖插入位点的EHV载体来分别用于提供具有一或两个位点的免疫原性组合物及用于DIVA疫苗。
另外，本发明提供一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列的启动子序列。
另外，本发明提供包括如本文所阐述的EHV载体及任选药学载剂的免疫原性组合物。
因此，本发明提供包括EHV载体的免疫原性组合物，该EHV载体包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列的启动子序列。
有利的是，由本发明提供的实验数据揭示，已提供可用于表达抗原的新颖启动子序列。另外，提供新颖启动子序列容许表达来自载体系统(例如EHV载体系统)的不同插入位点的抗原且分别表达一种以上抗原。另外，实验数据展示，可使用启动子序列来表达载体系统(例如EHV载体系统)中的抗原，从而用于分别提供具有一或两个位点且用于DIVA疫苗的免疫原性组合物。
另外，本发明提供一种EHV载体，其包括
(i)至少两个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)所述外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)所述外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
另外，本发明提供包括如本文所阐述的EHV载体及任选药学载剂的免疫原性组合物。
因此，本发明提供包括EHV载体的免疫原性组合物，该EHV载体包括
(i)至少两个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)所述外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)所述外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
另外，本发明提供包括如本文所阐述的两种或更多种EHV载体的免疫原性组合物。优选地，免疫原性组合物包括两种、三种或四种EHV载体。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物包括两种EHV载体。
在本发明的一方面中，两种或更多种EHV载体包括不同外源性抗原编码序列。优选地，两种或更多种EHV载体包括与猪流感A病毒相关的不同外源性抗原编码序列。更优选地，两种或更多种EHV载体包括不同血凝素编码序列。
另外，本发明提供包括一或多个如本文所阐述的EHV载体的DIVA疫苗。
在本发明的一方面中，EHV载体是重组体。
在本发明的一方面中，EHV载体是RacH或RacH SE。
在本发明的一方面中，EHV载体是选自由以下组成的群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。
在本发明的一方面中，EHV载体是EHV-1。
在本发明的一方面中，产食动物是猪。
在本发明的一方面中，感染产食动物的病原体是流感病毒、优选地猪流感A病毒。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感亚型是选自由以下组成的群：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及H18。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感亚型是H1和/或H3。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感A抗原具有猪起源。
在本发明的一方面中，EHV载体包括至少两个血凝素流感抗原编码序列。
在本发明的一方面中，EHV载体包括至少4个血凝素流感抗原编码序列。
在本发明的一方面中，EHV载体包括4个血凝素流感抗原编码序列。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感抗原编码序列是选自由以下组成的株群：A/猪/Italy/116114/2010(H1N2)、A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)、A/猪/Gent/132/2005(H1N1)、A/猪/Italy/4675/2003(H1N2)、A/猪/Italy/259543/2003(H1N2)、A/猪/Denmark/13772-1/2003(H1N1)、A/猪/England/MD0040352R/2009(H1N1)、A/猪/Hungary/13509/2007(H3N2)、A/猪/Italy/13962/95(H3N2)、A/猪/Cotesd'Armor/1121/00(H1N1)、A/猪/Colorado/1/77、A/猪/Colorado/23619/99、A/猪/Cote d'Armor/3633/84、A/猪/England/195852/92、A/猪/Finistere/2899/82、A/猪/Hong Kong/10/98、A/猪/Hong Kong/9/98、A/猪/Hong Kong/81/78、A/猪/Illinois/100084/01、A/猪/Illinois/100085A/01、A/猪/Illinois/21587/99、A/猪/Indiana/1726/88、A/猪/Indiana/9K035/99、A/猪/Indiana/P12439/00、A/猪/Iowa/30、A/猪/Iowa/15/30、A/猪/Iowa/533/99、A/猪/Iowa/569/99、A/猪/Iowa/3421/90、A/猪/Iowa/8548-1/98、A/猪/Iowa/930/01、A/猪/Iowa/17672/88、A/猪/Italy/1513-1/98、A/猪/Italy/1523/98、A/猪/Korea/CY02/02、A/猪/Minnesota/55551/00、A/猪/Minnesota/593/99、A/猪/Minnesota/9088-2/98、A/猪/Nebraska/1/92、A/猪/Nebraska/209/98、A/猪/Netherlands/12/85、A/猪/NorthCarolina/16497/99、A/猪/North Carolina/35922/98、A/猪/North Carolina/93523/01、A/猪/North Carolina/98225/01、A/猪/Oedenrode/7C/96、A/猪/Ohio/891/01、A/猪/Oklahoma/18717/99、A/猪/Oklahoma/18089/99、A/猪/Ontario/01911-1/99、A/猪/Ontario/01911-2/99、A/猪/Ontario/41848/97、A/猪/Ontario/97、A/猪/Quebec/192/81、A/猪/Quebec/192/91、A/猪/Quebec/5393/91、A/猪/Taiwan/7310/70、A/猪/Tennessee/24/77、A/猪/Texas/4199-2/98、A/猪/Wisconsin/125/97、A/猪/Wisconsin/136/97、A/猪/Wisconsin/163/97、A/猪/Wisconsin/164/97、A/猪/Wisconsin/166/97、A/猪/Wisconsin/168/97、A/猪/Wisconsin/235/97、A/猪/Wisconsin/238/97、A/猪/Wisconsin/457/985A/猪/Wisconsin/458/98、A/猪/Wisconsin/464/98及A/猪/Wisconsin/14094/99。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感抗原编码序列是选自由以下组成的株群：A/猪/Italy/116114/2010(H1N2)、A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)、A/猪/Gent/132/2005(H1N1)及A/猪/Italy/4675/2003(H1N2)。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感抗原编码序列编码选自由以下组成的群的氨基酸序列：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28及SEQ ID NO:29。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感抗原编码序列包括编码与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且血凝素流感抗原编码序列包括编码与如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，外源性抗原编码序列是流感A病毒N(神经氨酸酶)编码序列且N亚型是选自由以下组成的群：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及N10。
在本发明的一方面中，EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗不包括N(神经氨酸酶)流感抗原编码序列。
在本发明的一方面中，EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗不包括NP(核蛋白)流感抗原编码序列。
在本发明的一方面中，EHV载体包括其他调节序列，例如终止信号或多腺苷酸化序列。
插入位点：
在本发明的一方面中，该插入位点是ORF1/3。
在本发明的一方面中，该插入位点是ORF70。
在本发明的一方面中，将与感染产食动物的病原体相关的第一外源性抗原编码序列插入ORF70中。
在本发明的一方面中，将与感染产食动物的病原体相关的第二外源性抗原编码序列插入ORF1/3中。
在本发明的一方面中，ORF70中的插入的特征在于ORF70中的部分缺失、截短、取代、修饰或诸如此类，其中ORF71保留功能性。
在本发明的一方面中，ORF70中的插入的特征在于缺失RacH的ORF70内的大约801bp部分(SEQ ID NO:20)或其70％、80％、85％、90％、95％、99％同源和/或相同序列。
在本发明载体的另一特定方面中，ORF70中的插入的特征在于缺失RacH的ORF70内的大约801bp部分(SEQ ID NO.:20)或任一其他株中的其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列缺失。
在本发明载体的另一特定方面中，ORF70中的插入的特征在于缺失野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内的大约801bp部分，其中野生型ab4基因组序列中的缺失部分位于核苷酸127681与128482(SEQ ID NO.:19)之间或是其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
在本发明载体的另一特定方面中，ORF70中的插入的特征在于缺失野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内的大约801bp部分，其中野生型ab4基因组序列中的缺失部分位于核苷酸127681与128482之间(SEQ ID NO.:19)或任一其他株中的其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列缺失。
在本发明的一方面中，EHV-1载体包括至少一个选自由以下组成的群的侧翼区：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18及所述序列中的任一者的70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
在本发明的一方面中，EHV-1载体包括(i)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO.:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17；及(ii)至少一个选自由以下组成的群的右ORF70侧翼区：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18。
启动子：
在本发明的一方面中，启动子序列是选自由以下组成的群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子、4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段(优选地，该功能片段是p430(SEQ ID NO:3))、4pgG600(SEQ ID NO:1)的互补核苷酸序列的功能片段、4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段(优选地，该功能片段是p455(SEQ ID NO:4))、4pMCP600(SEQ ID NO:2)的互补核苷酸序列的功能片段。
在本发明的一方面中，启动子序列包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列的功能片段或衍生物具有80％、85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的同源性。
在本发明的一方面中，启动子序列的功能片段或衍生物具有550个核苷酸、优选地500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430个核苷酸、最优选地455或430个核苷酸的长度。
在本发明的一方面中，启动子序列的功能片段是4pgG600(SEQ ID NO:1)的截短物或其互补核苷酸序列，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)72％(或更高)。
在本发明的一方面中，4pgG600(SEQ ID NO:1)的启动子序列的功能片段是指定片段430p430(SEQ ID NO:3)。在另一方面中，序列相同性为(至少)70％、80％、85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％。
在本发明的一方面中，启动子序列的功能片段是4pMCP600(SEQ ID NO:2)的截短物或其互补核苷酸序列，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)78％(或更高)。
在本发明的一方面中，4pMCP600(SEQ ID NO:2)的启动子序列的功能片段是指定片段p455(SEQ ID NO:4)。在另一方面中，序列相同性为(至少)70％、80％、85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％。
在本发明的一方面中，EHV载体包括一或多个其他调节序列，例如终止信号、多腺苷酸化信号或调节组件(例如IRES和/或2a肽)。
启动子及抗原的特定组合：
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:28中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)。
在本发明的一方面中，启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:27中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:28中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，且
其中启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:27中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)，且其中启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗是二价的。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)。
在本发明的一方面中，启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:26中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，且其中启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ IDNO:26中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID No.1)的功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)且其中启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗是二价的。
在本发明的一方面中，该免疫原性组合物包括第一EHV载体，该第一EHV载体包括：启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:28中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列；及
启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:27中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，且
其中该免疫原性组合物包括第二EHV载体，该第二EHV载体包括：启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列；及
启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:26中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的一方面中，启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)且其中启动子序列4pMCP600(SEQ ID No.2)的功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗是四价的。
在本发明的一方面中，该免疫原性组合物或DIVA疫苗皆调配用于单一剂量施用。
优选地，单一剂量的总体积介于约0.2ml与2.5ml之间、更优选地介于约0.2ml与2.0ml之间、甚至更优选地介于约0.2ml与1.75ml之间、仍更优选地介于约0.2ml与1.5ml之间、甚至更优选地介于约0.4ml与1.25ml之间、甚至更优选地介于约0.4ml与1.0ml之间，其中单一0.5ml剂量或1.0ml剂量最优选。最优选地，单一剂量具有0.5ml、1ml、1.5ml或2ml的总体积。
另外已展示，在施用本发明的免疫原性组合物的一个剂量之后，该免疫原性组合物的该单一剂量较为有效。
在本发明的一方面中，经肌内或鼻内施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗对于前6周龄内、前两周龄内、第一周龄内或第一天龄内的猪是安全的。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗进一步包括医药上可接受的载剂。
在本发明的一方面中，该医药上可接受的载剂是注射用水、细胞培养基或再悬浮缓冲剂。
在本发明的一方面中，该再悬浮缓冲剂是磷酸盐缓冲盐水。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗包括1×104至1×109组织培养感染剂量50(TCID50)、优选地介于1×104至1×108TCID50之间、甚至更优选地1×104至1×107TCID50的EHV载体。
在本发明的一方面中，该免疫原性组合物是疫苗。
在本发明的一方面中，该免疫原性组合物或DIVA疫苗是多价疫苗。
在本发明的一方面中，该免疫原性组合物或DIVA疫苗是二价疫苗、四价疫苗、六价疫苗或七价疫苗。
在本发明的一方面中，该免疫原性组合物或DIVA疫苗是二价疫苗或四价疫苗。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗可有效治疗和/或预防有需要的产食动物中由猪流感A病毒引起的临床征象。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗抵抗猪流感A病毒的同源和/或异源性攻击。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1和/或H3的猪流感A病毒的攻击。
试剂盒
若期望，则可将组合物呈递于包装或分配器装置中，该包装或分配器装置可含有一或多个含有活性成分的单位剂型。包装可(例如)包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可带有用于施用、优选地施用产食动物、尤其猪的说明书。该(等)容器可附带有监管医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，该公告显示该机构已批准用于动物施用的制造、使用或销售。
本发明提供包括如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗的试剂盒。
在本发明的一方面中，试剂盒进一步包括用于治疗和/或预防猪流感A病毒的说明手册。
治疗方法
本发明提供对产食动物实施免疫的方法，其包括向该产食动物施用如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
优选地，免疫使得减小畜群中特定猪流感A病毒感染的发病率或减小由特定猪流感A病毒感染引起或与其有关的临床征象的严重程度。
另外，使用如本文所提供的免疫原性组合物对有需要的产食动物实施免疫使得产食动物可预防感染猪流感A病毒感染。甚至更优选地，免疫针对猪流感A病毒感染产生有效、长效、免疫学反应。应理解，该时间段将持续大于2个月、优选地大于3个月、更优选地大于4个月、更优选地大于5个月、更优选地大于6个月。必须理解，免疫不能在实施免疫的所有动物中皆有效。然而，该术语需要畜群的大部分动物有效免疫。
优选地，在此上下文中设计通常(亦即并无免疫)发生通常由猪流感A病毒感染引起或与其有关的临床征象的产食动物畜群。熟习此项技术者可易于测定畜群的产食动物是否有效免疫。优选地，若与未实施免疫或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物实施免疫但随后感染特定猪流感A病毒的产食动物相比，给定畜群中至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、仍更优选地至少95％及最优选地100％的动物的临床征象的发生率或严重程度减弱至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％、仍更优选地至少95％及最优选地100％，则免疫应是有效的。
本发明提供治疗或预防有需要的产食动物中由流感A病毒引起的临床征象的方法，该方法包括向产食动物施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
优选地，与未治疗(未实施免疫)但随后感染特定流感A病毒的产食动物相比，临床征象减轻至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、仍更优选地至少95％、最优选地100％。
本发明提供与相同种的未免疫对照组的产食动物相比减小有需要的产食动物中肺中的病毒效价的方法，该方法包括向产食动物施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗。然而，必须理解，该病毒是流感A病毒、优选地猪流感A病毒。
优选地，与相同种的未免疫对照组中随后感染特定流感A病毒的产食动物相比，肺中的病毒效价减小至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、仍更优选地至少95％、最优选地100％。
有利的是，由本发明提供的实验数据揭示本文所提供的免疫原性组合物在施用猪时的安全性及效能。实际上，与未接种疫苗的仔猪相比，在病毒感染攻击之后，使用本文所提供的免疫原性组合物接种疫苗的猪具有减少的与疾病有关的临床征象(例如减小的病毒肺效价)。
本发明提供对具有抗猪流感A病毒抗体的有需要的产食动物接种疫苗的方法，其包括向该产食动物施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗的步骤。
然而，抗猪流感A病毒抗体可存在于由仔猪因应于猪流感A病毒感染所产生的未接种疫苗仔猪中。或者，未接种疫苗仔猪中的抗猪流感A病毒抗体是因应于使用猪流感A病毒疫苗对母猪接种疫苗或因应于母猪的猪流感A病毒感染所产生的母源抗体。母源抗体经由初乳及乳液自所述母猪被动转移至仔猪中。
使用疫苗抗原干扰母源抗体可减小或甚至消除针对活疫苗以及灭活疫苗的免疫反应。已针对活疫苗以及非复制者(亦即灭活或亚单位疫苗)报导母源抗体对疫苗诱导的免疫反应的不同干扰程度。
因此，可在针对猪IAV的母源抗体存在下将本文所阐述的猪IAV疫苗成功施加至仔猪中且针对猪IAV感染提供保护。
另外，使用如本文所阐述的猪IAV疫苗对母猪接种疫苗会产生母猪免疫性且将母源抗体转移至仔猪。
因此，本发明提供在幼小产食动物中提供针对流感A病毒的母源免疫性的方法，其包括在该幼小产食动物的母亲怀有幼小产食动物的同时向该母亲施用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
因本文所阐述的猪IAV疫苗可在母源抗体存在下成功施加至仔猪，故该疫苗可用于母猪接种疫苗及由该母猪分娩的仔猪的后续接种疫苗。接种疫苗的母猪将包含抗体的母源免疫性转移至仔猪。然而，因如本文所阐述的猪IAV疫苗不干扰母源抗体，故可使用相同疫苗在生命早期对仔猪接种疫苗。另外，通过使用如本文所阐述的疫苗或任一其他猪IAV母猪疫苗对母猪以及由母猪分娩的幼小仔猪接种疫苗，可增加针对流感A病毒感染的保护。在生命之前几天至几周，仔猪由母源免疫性保护。另外，通过仔猪的早期接种疫苗，仔猪衍生出针对流感A病毒感染的免疫性并由此得以保护，且未在母源免疫性消失与接种疫苗开始之间出现免疫学间隙。
本发明提供提供增加有需要的幼小产食动物中针对流感A病毒感染的保护的方法，其中
a)在该幼小产食动物的母亲怀有该幼小产食动物的同时使用治疗有效量的如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗对该母亲接种疫苗和/或
b)使用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗在三周龄内对该幼小产食动物接种疫苗。
优选地，在分娩之前、优选地在已发生一个、更优选地两个接种疫苗(“重复剂量”)的基础免疫之后，将该免疫原性组合物或DIVA疫苗施用怀孕母猪至少一次。在将免疫原性组合物或DIVA疫苗施用母猪三次时，第一基础免疫应发生于在分娩之前116天与60天之间、优选地在分娩之前116天与58天之间及最优选地在分娩之前116天与56天之间。第二基础免疫应发生于在分娩之前95天与40天之间、优选地在分娩之前95天与38天之间及最优选地在分娩之前95天与35天之间。在分娩之前的最终加强施用应发生于在分娩之前10天与20天之间、优选地在分娩之前12天与18天之间及最优选地在分娩之前14天。
优选地在达到三周龄之前将免疫原性组合物或DIVA疫苗施用仔猪。优选地，在以下时间将免疫原性组合物或DIVA疫苗施用每一仔猪：1天龄至21天龄、更优选地在1天龄至10天龄之间、甚至更优选地在1天龄至9天龄之间、甚至更优选地在1天龄至8天龄之间、甚至更优选地在1天龄至7天龄之间、甚至更优选地在1天龄至6天龄之间、甚至更优选地在1天龄至5天龄之间、甚至更优选地在1天龄至4天龄之间、甚至更优选地在1天龄至3天龄之间、甚至更优选地在1天或2天龄及最优选地1天龄。
然而，可以两个或更多个剂量将免疫原性组合物施用仔猪，其中第一剂量是在施用第二(加强)剂量之前施用。优选地，第一剂量是在前两周龄内、更优选地在第一周龄内及甚至更优选地在第一天龄内施用。优选地，在第一剂量之后至少15天施用第二剂量。更优选地，在第一剂量之后15天与40天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少17天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后17天与30天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少19天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后19天与25天之间施用第二剂量。最优选地，在第一剂量之后至少21天施用第二剂量。在两次施用方案的一优选方面中，免疫原性组合物的第一剂量及第二剂量皆以相同量施用。优选地，每一剂量是以上文指定的优选量，其中1ml的第一剂量及第二剂量最优选。除第一剂量及第二剂量方案外，替代实施例包括其他后续剂量。举例而言，可在所述方面中施用第三、第四或第五剂量。优选地，以与第一剂量相同的量施用后续第三、第四及第五剂量方案，其中各剂量之间的时间范围与上文所提及第一及第二剂量之间的时间相同。因此，该方法是指对怀孕母猪以及所分娩仔猪接种疫苗。
在本发明的一方面中，产食动物是猪、仔猪或母猪。
在本发明的一方面中，流感A病毒是猪流感A病毒。
在本发明的一方面中，施用免疫原性组合物或DIVA疫苗一次。
应理解，单一剂量仅施用一次。如实施例中所展示，如本文所提供的免疫原性组合物已证实在施用单一剂量之后较为有效。
优选地，单一剂量的总体积介于约0.2ml与2.5ml之间、更优选地介于约0.2ml与2.0ml之间、甚至更优选地介于约0.2ml与1.75ml之间、仍更优选地介于约0.2ml与1.5ml之间、甚至更优选地介于约0.4ml与1.25ml之间、甚至更优选地介于约0.4ml与1.0ml之间，其中单一0.5ml剂量或1.0ml剂量最优选。最优选地，单一剂量具有0.5ml、1ml、1.5ml或2ml的总体积。
在本发明的一方面中，将免疫原性组合物或DIVA疫苗施用前6周龄内、前两周龄内、第一周龄内或第一天龄内的产食动物。
优选地，拟免疫产食动物介于1天龄至40天龄、1天龄至30天龄、1天龄至21天龄之间，更优选地，该拟免疫产食动物介于1天龄至10天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至9天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至8天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至7天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至6天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至5天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至4天龄之间、甚至更优选地介于1天龄至3天龄之间、甚至更优选地是1或2天年龄及最优选地1天龄或0天龄。
优选地，拟免疫产食动物是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天龄。更优选地，该拟免疫产食动物是1、2、3、4、5、6或7天龄。然而，必须理解，在对数天龄产食动物接种疫苗之后，产食动物的免疫系统需要数天来建立针对猪流感A病毒感染的免疫性。因此，优选地，在第一天龄内对产食动物实施免疫。
在本发明的一方面中，以两个剂量施用免疫原性组合物或DIVA疫苗。
如实施例中所展示，已证实，如本文所提供的免疫原性组合物在施用两个剂量之后较为有效。
然而，可以两个或更多个剂量施用免疫原性组合物，其中第一剂量是在施用第二(加强)剂量之前施用。优选地，第一剂量是在前两周龄内、更优选地在第一周龄内及甚至更优选地在第一天龄内施用。优选地，在第一剂量之后至少15天施用第二剂量。更优选地，在第一剂量之后15天与40天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少17天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后17天与30天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量之后至少19天施用第二剂量。仍更优选地，在第一剂量之后19天与25天之间施用第二剂量。最优选地，在第一剂量之后至少21天施用第二剂量。在两次施用方案的一优选方面中，免疫原性组合物的第一剂量及第二剂量皆以相同量施用。优选地，每一剂量是以上文指定的优选量，其中1ml的第一剂量及第二剂量最优选。除第一剂量及第二剂量方案外，替代实施例包括其他后续剂量。举例而言，可在所述方面中施用第三、第四或第五剂量。优选地，以与第一剂量相同的量施用后续第三、第四及第五剂量方案，其中各剂量之间的时间范围与上文所提及第一及第二剂量之间的时间相同。
在本发明的一方面中，在第一周龄内且然后在第二第、三或第四周龄内将免疫原性组合物或DIVA疫苗施用产食动物。
在本发明的一方面中，经肌内或鼻内施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
优选地，局部或全身性施用免疫原性组合物或DIVA疫苗。常用的适宜施用途径是经口或非经肠施用，例如鼻内、静脉内、肌内、腹膜腔内、皮下以及吸入。然而，端视化合物的性质及作用模式，亦可通过其他途径施用免疫原性组合物或DIVA疫苗。然而，最优选地，经肌内或经鼻内施用免疫原性组合物或DIVA疫苗。
在本发明的一方面中，产食动物是抗猪流感A病毒抗体阴性。
在本发明的一方面中，产食动物是抗猪流感A病毒抗体阳性。优选地，抗猪流感A病毒抗体效价是通过血凝素抑制测试和/或病毒中和测试来测定且分别介于1:2与1:2048之间、介于1:2与1:1024之间、介于1:2与1:512之间、介于1:2与1:256之间、介于1:2与1:128之间、介于1:2与1:64之间、介于1:2与1:32之间、介于1:2与1:16之间、介于1:64与1:2048之间、介于1:64与1:1024之间或介于1:64与1:512之间。或者或另外，通过ELISA分析来测定抗鼠流感A病毒抗体效价，此是通过分别使用抗猪流感A病毒抗体阳性及阴性试样的确立或推荐测试特异性临限值来进行评价。
熟习此项技术者熟知如何量测母源抗猪流感A病毒抗体。
优选地，免疫原性组合物或DIVA疫苗包括1×104至1×109TCID50、优选地介于1×104至1×108TCID50之间、甚至更优选地1×104至1×107TCID50的EHV载体。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗包括1×104至1×107TCID50的EHV载体。
在本发明的一方面中，所述方法产生与相同种的未免疫对照组的产食动物相比，选自由以下组成的群的效能参数改良：体重减轻降低、降低肺中的病毒负荷、减少肺病灶、减少和/或缩短病毒脱落、降低直肠温度、减少临床症状(尤其呼吸症状)、增加(中和)抗猪流感A病毒抗体的诱导、增加针对猪流感A病毒的T细胞刺激、增加针对猪流感A病毒的B细胞刺激及减少肺中的促炎细胞因子(例如IL1β)或其组合。
在本发明的一方面中，治疗或预防使得与相同种的非治疗对照组的产食动物相比病毒负荷期缩短。
优选地，与随后由特定猪流感A病毒感染的相同种的未治疗对照组的产食动物相比，治疗或预防使得将病毒负荷期缩短至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、仍更优选地至少95％、最优选地100％。
优选地，与相同种的非免疫对照组的产食动物相比，治疗或预防使得自使用猪流感A病毒攻击或感染之后第5天、更优选地自攻击或感染之后第4天、更优选地自攻击或感染之后第3天及最优选地自攻击或感染之后第1或2天猪流感A病毒的脱落有所减小。
在本发明的一方面中，治疗或预防使得自攻击(感染)之后第1天流感A的脱落有所减小。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗保护抵抗流感A病毒的同源和/或异源性攻击。
在本发明的一方面中，免疫原性组合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1和/或H3的流感A病毒的攻击。
本发明亦涉及用于治疗应用的如本文所阐述的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗。
本发明亦涉及用作免疫原或疫苗的如本文所阐述的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗。
本发明亦涉及用作药剂的如本文所阐述的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗。
本发明亦涉及如本文所阐述的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗的用途，其用于制造药剂。
本发明亦涉及如本文所阐述的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗的用途，其用于治疗和/或预防产食动物的猪流感A病毒感染。
DIVA
有效DIVA疫苗的主要优点在于，其容许在接种疫苗的动物群体中获取试样之前检测急性感染或感染一定时间(至少约3周)的产食动物(优选地猪)，且由此可监测病原体(优选地猪流感病毒)在动物群体中的传播或再引入。因此，可以一定可信程度声明，基于实验室测试结果，接种疫苗的猪群体不含猪流感A病毒。
标记物疫苗促进快速且有效地施用且容许区别感染野生病毒(疾病相关)的动物与接种疫苗的动物。
本发明的免疫原性组合物或DIVA疫苗不包括任一编码N(神经氨酸酶)流感抗原编码序列和/或NP(核蛋白)流感抗原编码序列的抗原编码序列。
与的相比，在使用野生型猪流感A病毒感染动物或使用改质活疫苗接种疫苗或使用灭活全病毒疫苗接种疫苗之后或对于具有残余母源抗体的动物，经感染/接种疫苗的动物产生/具有针对N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的特异性抗体。然而，在使用本发明的免疫原性组合物接种疫苗的动物中，不能检测针对N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的所述特异性抗体。
通过实例性免疫测试和/或基因组分析测试，可区分仅使用本发明的免疫原性组合物接种疫苗的动物与使用野生型猪流感病毒感染或使用改质活疫苗接种疫苗或使用灭活全病毒疫苗接种疫苗的动物或具有残余母源抗体的动物，其中仅使用本发明的免疫原性组合物接种疫苗的动物不具有任何针对N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)及任一分别编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的猪流感A病毒特异性序列的特异性抗体。
本发明提供区分感染猪流感A病毒的产食动物与使用如本文所阐述的免疫原性组合物或DIVA疫苗接种疫苗的产食动物的方法，其包括
a)自产食动物获得试样，及
b)在免疫测试和/或基因组分析测试中分析该试样。
在本发明的一方面中，免疫测试包括测试试样是否包括特异性识别猪流感的N(神经氨酸酶)蛋白或NP(核蛋白)蛋白的抗体。
在本发明的一方面中，若已检测出抗体特异性识别猪流感的N(神经氨酸酶)蛋白或NP(核蛋白)蛋白，则产食动物感染猪流感A病毒。
在本发明的一方面中，基因组分析测试包括测试试样是否包括编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的猪流感A病毒特异性序列。
在本发明的一方面中，若已检测出编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的猪流感A病毒特异性序列，则产食动物感染猪流感A病毒。
在本发明的一方面中，免疫测试是EIA(酶免疫分析)或ELISA(酶联免疫吸附分析)，或其中基因组分析测试是PCR(聚合酶链反应)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)或实时PCR(聚合酶链反应)。
在本发明的一方面中，产食动物是猪。
在本发明的一方面中，试样是血清试样。
优选地，使用野生型SIAV的N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的特异性抗体来检测来自怀疑感染SIAV或使用本发明疫苗接种疫苗的猪中呼吸道切片中的SIAV抗原。在此一情形下，仅经感染猪或使用改质活疫苗接种疫苗或使用灭活全病毒疫苗接种疫苗或具有残余母源抗体者的试样展示关于该N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)特异性抗体的阳性结果。与的相比，使用本发明疫苗接种疫苗的猪的试样并不展示关于该N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)特异性抗体的结果，此乃因在本发明疫苗中不存在所述抗原(仅血凝素)。
然而，N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的表位在进化中保守且对于SIAV及中和抗体的靶具有特异性。
因此，测试可(例如)包括含有交联至微孔分析板的野生型SIAV的N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位的孔。该交联优选地是经由锚蛋白(例如聚-L-赖氨酸)来实施。熟习此项技术者熟知用于获得野生型N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位的表达系统。或者，所述N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位可以化学方式合成。
仅使用本发明疫苗接种疫苗的动物尚未产生针对野生型N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位的抗体。然而，所述动物已产生针对本发明的HA(血凝素)表位的抗体。因此，并无抗体结合至经野生型N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)表位涂覆的孔。与的相比，若孔经本发明HA表位涂覆，则抗体结合至该经取代HA表位。
在本发明的一方面中，ELISA是间接ELISA、夹心式ELISA、竞争性ELISA或阻断性ELISA。
然而，熟习此项技术者熟知不同ELISA技术。ELlSA已由以下文献实例性阐述：Wensvoort G.等人，1988(Vet.Microbiol.17(2):129-140)、Robiolo B.等人，2010(J.Virol.Methods.166(1-2):21-27)及Colijn,E.O.等人，1997(Vet.Microbiology 59:15-25)。
优选地，通过以下方式来提供用于区分感染野生SIAV或使用改质活疫苗接种疫苗或使用灭活全病毒疫苗接种疫苗的动物或具有残余母源抗体者及仅使用本发明疫苗接种疫苗者的测试：RNA分离呼吸细胞及逆转录酶，随后扩增cDNA。使用N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的特定引物，可实施PCR。在此一情形下，若存在阳性PCR信号，则猪感染野生型SIAV。然而，若不可扩增N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)特异性序列，则动物已使用本发明疫苗接种疫苗。
另外，可使用实时性技术引物和/或探针来识别N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)和/或特定HA(血凝素)。然而，所述方法在业内已众所周知。
在本发明的另一方面中，基因组分析测试是PCR(聚合酶链反应)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)或实时PCR(聚合酶链反应)。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与归档时熟习本发明所属技术领域者通常所理解含义相同的含义。术语的含义及范围应较为明确；然而，倘若存在任何潜在歧义，则本文所提供的定义优先于任一字典或非固有定义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语包含复数形式且复数术语包含单数。在本文中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。另外，术语“包含(including)”以及其他形式(例如“包含(includes)”及“包含(included)”)的使用不具有限制性。本文所提及的所有专利及公开案皆以引用方式并入本文中。
除非另外指示，否则本发明实践将采用熟习此项技术者熟知的病毒学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学的习用技术。所述技术全面阐释于文献中。例如参见Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第I、II及III卷，第二版(1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑，1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press,1986)；Perbal,B.,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；the series,Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)；Protein purification methods-a practical approach(E.L.V.Harris及S.Angal编辑，IRL Press at Oxford University Press)；及Handbookof Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编辑，1986,Blackwell Scientific Publications)。
在详细阐述本发明之前，应理解，本发明并不限于特定DNA、多肽序列或制程参数，此乃因所述因素当然可有所变化。亦应理解，本文所用的术语仅是出于阐述本发明的特定实施例的目的，而并非意欲为限制性。必须指出，除非内容另外明确说明，否则如本说明书及随附申请专利范围中所用的单数形式“一(a、an)”及“该(the)”皆包含复数个指示物。因此，举例而言，所提及“抗原”包含两种或更多种抗原的混合物，所提及“赋形剂”包含两种或更多种赋形剂的混合物，及诸如此类。
分子生物学定义
业内已知的术语“载体”是指用于将基因材料传递至宿主细胞的多核苷酸构建体、通常质粒或细菌人工染色体。载体可为(例如)细菌、病毒、噬菌体、细菌人工染色体、粘粒或质粒。本文所用的载体可由DNA或RNA构成或含有DNA或RNA。在一些实施例中，载体是由DNA构成。在一些实施例中，载体是感染性病毒。此一病毒载体含有病毒基因组，该病毒基因组以以下方式处理：其携载外来基因，该外来基因在细胞培养或宿主动物中在该病毒载体的复制中皆无作用。根据本发明的具体方面，载体可用于各种方面，例如仅传递基因材料、用于转染宿主细胞或生物体、用作疫苗(例如DNA疫苗)或用于基因表达目的。基因表达是阐述蛋白质在细胞中的生物合成(如由称为基因的特定多核苷酸序列所引导)的术语。在一具体方面中，载体可为“表达载体”，其是在存在于适当环境中时能够引导表达由通过载体携载的一或多种基因编码的蛋白质的载体。
载体及制备载体和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可尤其由以下文献揭示或类似于以下文献中所揭示的方法：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开案WO 94/16716、WO96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virusvectors to vaccination:An update,“PNAS USA 93:11349-11353，1996年10月；Moss,“Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety,”PNAS USA 93:11341-11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编者),Methods in MolecularBiology 39,“Baculovirus Expression Protocols”(1995Humana Press Inc.)；Smith等人，“Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector”,Molecular and Cellular Biology，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，“Strong and Regulated Expression ofEscherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector”,Molecular and Cellular Biology March 1984，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；1986年10月16日提出申请的美国申请案第920,197号；欧洲专利公开案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“The function of herpes simplex virusgenes:A primer for genetic engineering of novel vectors,”PNAS USA 93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，“The application of genetically engineeredherpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,”PNASUSA 93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，“Epstein-Barr virus vectors forgene delivery to B lymphocytes”,PNAS USA 93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications,”PNAS USA93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；1996年7月3日提出申请的允许美国申请案第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirus ascloning vectors,”Seminars in Virology(第3卷)，第237-52页，1993；Ballay等人，EMBOJournal，第4卷，第3861-65页，Graham,Tibtech 8,85-87，1990年4月；Prevec等人，J.GenVirol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；及McClements等人，“Immunization with DNA vaccinesencoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,inducesprotective immunity in animal models of herpes simplex virus-2disease”,PNASUSA 93:11414-11420，1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature及Furth等人，Analytical Biochemistry,relating to DNA expression vectors。亦参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人，美国专利第4,945,050号；Fischbachet等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷，第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人，该专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞中的方法)；McCormick等人，美国专利第5,677,178号(致细胞病变病毒的使用)；及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文所引用的其他文件。
术语“病毒载体”阐述通过重组DNA技术以其进入宿主细胞中会产生特定生物活性(例如表达由载体携载的转基因)的方式处理的基因修饰病毒。在一具体方面中，转基因是抗原。病毒载体可或可不在靶细胞、组织或生物体中为可复制的。
可使用业内熟知的任何适宜基因改造技术来生成病毒载体，包含(但不限于)细胞培养液中的限制性内核酸酶消解、连接、转化、质粒纯化、DNA测序、转染的标准技术，例如如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.(1989))或K.Maramorosch及H.Koprowski(Methods in VirologyVolume VIII,Academic Press Inc.London,UK(2014))中所阐述。
病毒载体可纳入来自任一已知生物体的基因组的序列。所述序列可以其天然形式纳入或可以任一方式进行改质以获得期望活性。举例而言，所述序列可包括插入、缺失或取代。
病毒载体可包含用于所关注两种或更多种蛋白质的编码区。举例而言，病毒载体可包含用于第一关注蛋白的编码区及用于第二关注蛋白的编码区。第一关注蛋白及第二关注蛋白可相同或不同。在一些实施例中，病毒载体可包含用于所关注第三蛋白或第四蛋白的编码区。所关注第三蛋白及第四蛋白可相同或不同。由一种病毒载体编码的所关注两种或更多种蛋白质的总长度可有所变化。举例而言，两种或更多种蛋白质的总长度可为至少约200个氨基酸。至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸或更长。
优选病毒载体包含疱疹病毒载体，例如衍生自EHV-1或EHV-4。
根据本发明的具体方面，术语“病毒载体”或替代地“病毒构建体”是指衍生自病毒(其是选自疱疹病毒科的家族，例如EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)的重组病毒构建体。优选病毒载体包含(例如)衍生自EHV-1或EHV-4的疱疹病毒载体。
术语“病毒载体”及“病毒构建体”可互换使用。
本文所用的术语“构建体”是指重组核酸(例如质粒、BAC)或人工生成的重组病毒。
术语“质粒”是指独立于细菌宿主细胞内的细菌染色体复制的细胞质DNA。在本发明的一具体方面中，术语“质粒”和/或“转移质粒”是指可用于构建(例如)用于插入病毒载体中的表达盒的重组DNA技术的组件。在另一具体方面中，术语“质粒”可用于指示可用于DNA接种疫苗目的的质粒。
如本文中所使用，术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且是指任一核酸。
本文所用的术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“RNA序列”、cDNA序列或“DNA序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分且是指基因组或合成起源的DNA或RNA，其可为单链或双链且代表有义或反义链。序列可为非编码序列、编码序列或二者的混合物。本发明核酸序列可使用熟习此项技术者熟知的标准技术制得。
术语“核酸”及“多核苷酸”亦特定而言包含由除5种生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基构成的核酸。
术语“调节核酸”、“调节组件”及“表达控制组件”可互换使用且是指可影响可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达的核酸分子。所述术语可广泛使用且涵盖促进或调节转录的所有组件，包含启动子、启动子序列、RNA聚合酶与转录因子的碱性相互作用的核心组件、上游组件、增强子及反应组件。原核生物中的实例性调节组件包含启动子、处理子序列及核糖体结合位点。用于真核细胞中的调节组件可包含(但不限于)提供和/或调节宿主细胞中编码序列的表达和/或编码多肽的产生的转录及翻译控制序列，例如启动子、增强子、剪接信号、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号、内核糖体进入位点(IRES)、小核糖核酸病毒2A序列及诸如此类。
“内核糖体进入位点”或“IRES”阐述在功能上促进独立于IRES的基因5′进行翻译起始且容许两个顺反子(开放阅读框)自单一转录物翻译至动物细胞中的序列。IRES提供用于翻译紧接其下游的开放阅读框的独立核糖体进入位点。不同于可为多顺反子(亦即编码若干自mRNA依序翻译的不同多肽)的细菌mRNA，动物细胞的大部分mRNA是单顺反子且编码仅一种多肽的合成。在真核细胞中使用多顺反子转录物，自5′最开始翻译起始位点开始翻译，并终止于第一终止密码子，且自核糖体释放转录物，从而使得仅翻译mRNA中的第一编码多肽。在真核细胞中，具有可操作地连接至转录物中的第二或后续开放阅读框的IRES的多顺反子转录物容许依序翻译该下游开放阅读框以产生由相同转录物编码的两种或更多种多肽。IRES可具有不同长度且来自各种来源(例如脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus)(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)(FMDV)或小儿麻痹病毒(Polio virus)(PV)或C型肝炎病毒(HCV))。已阐述各种IRES序列及其在载体构建中的用途且在业内已众所周知。下游编码序列以任一并不不利地影响下游基因的表达的距离可操作地连接至IRES的3′端。可易于通过改变距离且量测随距离而变化的表达来测定IRES与下游基因的起始点之间的最优选或允许距离。
术语“2a”或“2a肽”意指阐述为2a及“2a样”的短寡肽序列，其用作能够通过定义为核糖体跳跃的过程来调介蛋白质之间的共翻译裂解的连接体。可使用所述2a及“2a样”序列(来自小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)及其他病毒或细胞序列)来将多个基因序列串联成单一基因，从而确保其共表达于相同细胞内(参见Luke及Ryan,2013)。
如本文中所使用，术语“启动子”或“启动子序列”意指允许结合RNA聚合酶且引导转录基因的核苷酸序列。通常，启动子位于基因中邻近基因的转录开始位点的5'非编码区中。启动子内用于引发转录的序列组件的特征通常在于共有核苷酸序列。启动子的实例包含(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及动物(例如哺乳动物(包含马、猪、牛及人类)、鸟或昆虫)的启动子。启动子可为可诱导、可抑制和/或组成型启动子。可诱导启动子引发在其控制下因应于培养条件的一定变化(例如温度变化)增加来自DNA的转录程度(Ptashne,2014)。熟习此项技术者熟知的启动子的实例是(例如)SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子。
如本发明的上下文中所使用，术语启动子尤其是指功能片段(例如4pgG600(SEQID NO:1)的截短物或其互补核苷酸序列)，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)72％(或更高)。另外，如本发明的上下文中所使用，术语启动子尤其是指功能片段(例如4pMCP600(SEQ ID NO:2)的截短物或其互补核苷酸序列)，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)78％(或更高)。最优选地，“启动子”是指p430(SEQ ID NO:3)或p455(SEQ ID NO:4)。术语“p430”、“gG 430”及“430”遍及说明书、图、序列表等同义且互换使用。术语“p455”、“MCP 455”及“455”遍及说明书、图、序列表等同义且互换使用。
术语“增强子”表示在顺位作用于启动子的活性且由此刺激转录在功能上链接至此启动子的基因或编码序列的多核苷酸序列。不同于启动子，增强子的效应与位置及定向无关且其可由此定位于转录单元之前面或后面、内含子内或甚至编码区内。增强子可位于紧邻转录单元处及距启动子较大距离。其亦可与启动子具有物理及功能重迭。熟习此项技术者将知晓诸多来自各种来源的增强子(且寄存于数据库(例如Genbank)中，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤增强子、腺病毒增强子)，所述增强子可用作独立组件或克隆于多核苷酸序列内的组件(例如沈积于ATCC或来自商业及个别来源)。诸多启动子序列亦含有增强子序列，例如常用CMV启动子。人类CMV增强子是迄今所鉴别的最强增强子的一。可诱导增强子的一种实例是金属硫蛋白增强子，其可由糖皮质激素或重金属刺激。
术语“互补核苷酸序列”阐述多核苷酸(例如DNA或RNA)的两条配对链的一条链。互补链的核苷酸序列映现其配对链的核苷酸序列，从而对于每一腺苷而言其含有胸腺嘧啶(或对于RNA而言含有尿嘧啶)，对于每一鸟嘌呤而言其含有胞嘧啶，且反的亦然。举例而言，5’-GCATAC-3’的互补核苷酸序列是3’-CGTATG-5’或对于RNA而言是3’-CGUAUG-5’。
本文所用的术语“基因”、“所关注基因”具有相同含义且是指编码所关注产物的任一长度的多核苷酸序列。基因可进一步包括位于编码序列之前(5′非编码或未翻译序列)及之后(3′非编码或未翻译序列)的调节序列。所选序列可为全长或截短、融合或加标签基因，且可为cDNA、基因组DNA或DNA片段。通常应理解，编码多肽或RNA的基因组DNA可包含自成熟信使RNA(mRNA)剪接且由此不存在于编码相同多肽或RNA的cDNA中的非编码区(亦即内含子)。其可为天然序列、亦即天然形式，或可经突变，或包括衍生自不同来源的序列或另外视需要经修饰。所述修饰包含密码子优化以优化在所选宿主细胞中的密码子使用或优化加标签。另外，其可包含去除或添加顺式作用位点(例如(隐性)剪接供体、受体位点及分支点、多腺苷酸化信号、TATA-盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、用于转录因子或其他调节因子的结合位点、限制酶位点等)以得到仅少数(但不限于)实例。所选序列可编码分泌、细胞质、细胞核、膜结合或细胞表面多肽。
本文所用的术语“所关注核苷酸序列”是较所关注基因更一般的术语，此乃因其未必包括基因，但可包括基因的要素或部分或其他基因信息(例如ori(复制起点))。所关注核苷酸序列可为任一DNA或RNA序列，不论其是否包括编码序列。
“开放阅读框”或“ORF”是指核酸序列(DNA或RNA)中包括翻译起始信号或起始密码子(例如ATG或AUG)及终止密码子且可潜在翻译成多肽序列的长度。
术语“转录”阐述mRNA在细胞中的生物合成。
本文所用的术语“表达”是指在宿主细胞内转录和/或翻译核酸序列。根据本发明的具体方面，术语“表达”是指在宿主细胞内转录和/或翻译异源性和/或外源性核酸序列。可基于存在于细胞中的相应RNA或mRNA的量或由所选序列所编码期望多肽的量来测定期望产物在宿主细胞中的表达程度。举例而言，可通过Northern印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、原位杂交至细胞RNA或通过RTqPCR(逆转录且随后定量PCR)来量化自所选序列转录的mRNA。可通过各种方法来量化自所选序列表达的蛋白质，例如通过ELISA、通过西方印迹、通过放射免疫分析、通过免疫沈淀、通过分析蛋白质的生物活性或通过免疫染色蛋白质且随后进行FACS分析。
术语“表达盒”或“转录单元”或“表达单元”定义载体、构建体或多核苷酸序列内含有一或多种拟转录基因的区域，其中含于表达盒内的编码转录基因的核苷酸序列以及含有调节组件的多核苷酸序列彼此可操作地连接。其是自激活子转录且通过至少一个多腺苷酸化信号终止转录。在一个特定方面中，其是自单一启动子转录。因此，不同基因至少以转录方式连接。一种以上蛋白质或产物可自各转录单元(多顺反子转录单元)转录及表达。各转录单元包括对于转录及翻译含于该单元内的任一所选序列所需的调节组件。而且，各转录单元可含有相同或不同的调节组件。举例而言，各转录单元可含有相同终止子，IRES组件或内含子可用于转录单元内基因的功能连接。载体或多核苷酸序列可含有一个以上的转录单元。
术语“增加的表达”、“增加的效价或生产力”或“改良的表达或生产力”意指与适宜对照相比(例如由cDNA编码的蛋白质相对于由含内含子基因编码的蛋白质)，引入宿主细胞中的异源性和/或外源性序列(例如编码治疗蛋白的基因)的表达、合成或分泌增加。若根据本文所阐述的本发明方法培养本发明细胞，且若此细胞的比生产力或效价增加至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍，则有增加的效价或生产力。若根据本文所阐述的本发明方法培养本发明细胞，且若此细胞的比生产力或效价增加至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少3倍，则亦有增加的效价或生产力。若根据本文所阐述的本发明方法培养本发明细胞，且若此细胞的比生产力或效价增加至少1.2倍至5倍、优选地1.5倍至5倍、更优选地2倍至5倍、尤佳地3倍至5倍，则亦尤其有增加的效价或生产力。“增加的表达”亦可意指更多细胞实际上表达所关注的基因/序列。举例而言，增加的表达可意指本发明的新颖启动子在病毒复制周期期间相对于其他启动子有活性较长时间段。
可通过使用本发明的异源性载体来获得增加的表达、效价或生产力。此可与其他方式加以组合，例如FACS辅助性选择含有一或多种荧光蛋白(例如GFP)或细胞表面标记物作为其他可选标记物的重组宿主细胞。亦可使用获得增加的表达的其他方法及不同方法的组合，所述方法是(例如)基于以下方式：使用用于处理染色质结构的顺式活性组件(例如LCR、UCOE、EASE、分离子、S/MAR、STAR组件)、使用(人工)转录因子、使用用于上调内源性或异源性和/或外源性基因表达的天然或合成药剂处理细胞、改良mRNA或蛋白质的稳定性(半衰期)、改良mRNA翻译的起始、通过使用游离型质粒来增加基因剂量(基于使用病毒序列作为复制起点，例如SV40、多瘤、腺病毒、EBV或BPV)、使用促进扩增的序列或基于DNA多联体的活体外扩增系统。
量测“增加的表达”的分析是基于LC-MS/MS的蛋白质量测，例如多反应监测(MRM)；基于抗体的检测方法，例如蛋白印迹、点印迹或免疫扩散及流式细胞术；及通过血球凝集分析量测生物活性。
通过量化mRNA转录在各别启动子控制下来间接量测“启动子活性”。通过RTqPCR相对于内源性标准来量化mRNA。
熟习此项技术者已熟知术语“病毒负荷”。术语病毒负荷在本文中可与术语病毒效价互换使用。病毒负荷或病毒效价是活动性病毒感染的严重程度的量度，且可通过熟习此项技术者已知的方法来测定。该测定可基于(例如)通过至病毒蛋白的抗体结合来检测病毒蛋白及另外或或者通过扩增方法(例如RT-PCR)来检测病毒核酸。通过核酸扩增方法监测血浆中的病毒体相关性病毒RNA是广泛用于评价逆转录病毒疾病的状态及进展及评估预防性及治疗性干预的有效性的参数。可通过估计所涉及体液中的活病毒量(例如RNA拷贝数/毫升血样血浆)来计算实例性病毒负荷或病毒效价。优选地，术语“病毒负荷”或“病毒效价”是每体积病毒制剂的感染性单位的量度。病毒效价是生物程序中的终点且定义为平行实施的某一比例测试展示效应的稀释度(Reed及Muench,1938)。具体而言，组织培养感染剂量50/毫升(TCID50/ml)给出病毒制剂的如下稀释度：以该稀释度平行接种的诸多细胞培养液中的50％发生感染。
“转录调节组件”通常包括拟表达基因序列上游的启动子、转录起始及终止位点及多腺苷酸化信号。
术语“转录起始位点”是指构建体中对应于纳入一级转录物(亦即mRNA前体)中的第一核酸的核酸。转录起始位点可与启动子序列重迭。
“终止信号”或“终止子”或“多腺苷酸化信号”或“聚A”或“转录终止位点”或“转录终止组件”是如下信号序列：其在真核mRNA的3'端的特定位点处引起裂解且在经裂解3'端转录后纳入约100-200个腺嘌呤核苷酸的序列(polyA尾部)，且由此使得RNA聚合酶终止转录。多腺苷酸化信号包括裂解位点上游的约10-30个核苷酸的序列AATAAA及位于下游的序列。已知各种多腺苷酸化组件，例如tk聚A、SV40晚期及早期聚A、BGH聚A(例如阐述于美国专利第5,122,458号中)或仓鼠生长激素聚A(WO2010010107)。
“翻译调节组件”包括用于每一拟表达个别多肽的翻译起始位点(AUG)、终止密码子及聚A信号。内核糖体进入位点(IRES)可包含于一些构建体中。为优化表达，可设计去除、添加或改变拟表达核酸序列的5'-和/或3'-未翻译区以消除任何潜在额外不适当替代翻译起始密码子或其他可在转录或翻译层面上干扰或减小表达的序列。可将共有核糖体结合位点(Kozak序列)插入紧邻起始密码子的上游处以增强翻译且由此增强表达。增加此核糖体结合位点周围的A/U含量可增进更有效的核糖体结合。
根据定义，在来自不同(病毒)物种时，插入宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由此编码的各别蛋白质或RNA关于宿主细胞称为“外源性”、“外源性序列”、“外源性基因”、“外源性编码序列”、“外源性抗原编码序列”。因此，本发明的基于EHV-4的启动子就EHV-1病毒载体而言是外源性。如本文针对所关注序列或基因(例如抗原)所使用，术语“外源性”或“外源性抗原编码序列”意指，该所关注序列或基因、具体而言该抗原表达于其天然物种背景之外。因此，来自猪IAV的H3抗原涉及EHV-1载体的外源性抗原的一个实例。所关注任一非马科动物序列或基因(例如非马科动物抗原)由此是所关注外源性序列或基因或根据本发明的一具体方面的抗原。
根据定义，插入宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由此编码的各别蛋白质或RNA关于宿主细胞称为“异源性”、“异源性序列”、“异源性基因”、“异源性编码序列”、“转基因”或“异源性蛋白”。即使拟引入序列或拟引入基因与宿主细胞的内源性序列或内源性基因相同，此定义亦适用。举例而言，根据定义，在不同位点引入EHV-4病毒载体中或相对于EHV-4野生型病毒中呈经修饰形式的EHV-4启动子序列是异源性序列。如本文针对所关注序列或基因(例如抗原)所使用，术语“异源性”意指，该所关注序列或基因、具体而言该抗原表达于其天然亚物种背景之外。因此，所关注任一非EHV-1特异性序列或基因(例如抗原，例如来自任一马α疱疹病毒的除EHV-1外的抗原，例如EHV-3、EHV-8)由此是所关注异源性序列或基因或根据本发明的一具体方面的抗原。
术语“非天然”意指并不天然出现于此背景中的任一所关注序列或基因(例如抗原)，例如来自不同物种的混合序列或所关注序列或基因(例如抗原)或因人工突变、插入、缺失或诸如此类而并非天然产物的所关注序列或基因(例如抗原)。
在本发明的整个说明书中，术语“重组”可与术语“非天然”、“异源性”及“外源性”互换使用。因此，“重组”蛋白是自异源性或外源性多核苷酸序列表达的蛋白质。如针对病毒所用的术语重组意指通过人工处理病毒基因组产生的病毒。包括异源性或外源性序列(例如外源性抗原编码序列)的病毒是重组病毒。术语重组病毒及术语非天然病毒可互换使用。
因此，术语“异源性载体”意指包括异源性或外源性多核苷酸序列的载体。术语“重组载体”意指包括异源性或重组多核苷酸序列的载体。
如本文中所使用，术语“可操作地连接”用于阐述调节组件与基因或其编码区之间的链接。通常，基因表达是在一或多种调节组件(例如(但不限于)组成型或可诱导启动子、组织特异性调节组件及增强子)的控制下进行。基因或编码区可视为与调节组件“可操作地连接”或“可操作地连接”或“可操作地缔合”，此意味着该基因或编码区由调节组件控制或影响。举例而言，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。
另外，在本说明范围内，术语“功能连接”、“在功能上连接”或“可操作地连接”意指，两个或更多个核酸序列或序列组件以允许其以其预期方式发挥作用的方式进行定位。举例而言，若启动子/增强子或终止子能够控制或调节所连接基因序列在顺位的转录，则其在功能上连接至编码基因序列。通常但未必，在功能上连接的DNA序列是邻接的且在需要时接合两个多肽编码区或在分泌信号肽的情形下邻接且位于阅读框中。然而，尽管可操作地连接的启动子通常位于编码序列的上游或可操作地连接的终止子通常位于编码序列的下游，但其未必邻接。增强子并不必须邻接，只要其增加编码序列的转录即可。为此，其可位于编码序列的上游或下游且甚至相距一定距离。若多腺苷酸化位点以经由编码序列转录至多腺苷酸化信号中的方式位于编码序列的3′端，则其可操作地连接至编码序列。通过业内已知的重组方法来达成连接，例如通过在适宜限制位点处或钝端连接或通过使用融合PCR方法。若不存在适宜限制位点，则可根据习用实践使用合成寡核苷酸连接体或适配体。
因此，术语启动子序列的“功能片段或衍生物”意指，片段或衍生物仍实现启动子活性。熟习此项技术者熟知如何评价启动子活性的功能分析(Bustin2000,Nolan等人，2006)。此一功能分析的一实例性实施例包含(例如)启动子动力学实验。将感染携载表达盒(其中启动子或其片段引导转录报告基因转基因)的载体病毒的细胞培育不同时间。自在感染之后于不同时间收集的试样制备总RNA。在通过DNAse I消解破坏污染DNA之后，RNA发生逆转录。在添加逆转录酶(RT)下处理一种复制试样，在不添加RT下处理第二复制物以证实污染DNA自RNA制剂的成功去除。纯化所得cDNA且用作习用PCR中的模板。仅在添加RT下处理的试样应产生PCR产物。然后可将所述cDNA用于使用报告基因转基因的引物的qPCR及使用病毒载体的必需基因(内部标准基因，其转录提供感染及复制的效率的内部标准)的引物的平行qPCR。使用内部标准基因的qPCR值归一化不同构建体与感染后时间之间的报告基因的qPCR值。此容许诠释不同启动子及其片段的启动子活性。
本文所用的“序列同源性”是指测定两个序列的相关性的方法。为测定序列同源性，最优选地比对两个或更多个序列，且视需要引入空位。然而，与“序列相同性”不同，在测定序列同源性时，保守氨基酸取代可视为匹配。换言的，为获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中的85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包括另一氨基酸或核苷酸的保守取代，或可将占参考序列中的总氨基酸残基或核苷酸(不包含保守取代)的最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的数量的氨基酸或核苷酸插入参考序列中。优选地，同是物序列包括至少50、甚至更优选地100、甚至更优选地250、甚至更优选地500个核苷酸的延伸体。
业内已知的“序列相同性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、亦即参考序列与拟与参考序列进行比较的给定序列之间的关是。通过在将序列最优选地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列相同性，如通过所述序列串之间的匹配所测定。在该比对时，基于逐个位置来确定序列相同性，举例而言，若在一个位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则所述序列在该位置处“相同”。然后将所述位置相同性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性％。序列相同性可易于通过已知方法来计算，包含(但不限于)阐述于以下文献中的方法：ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.N.编辑，Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.编辑，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教示内容以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列相同性的方法编成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。所述程序的实例包含(但不限于)GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)。BLASTX程序可自NCBI及其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教示内容以引用方式并入本文中)。所述程序最优选地使用默认空位权重比对序列以在给定序列与参考序列之间产生最高序列相同性程度。作为阐释，对于多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％“序列相同性”的核苷酸序列而言，预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，只是给定多核苷酸序列可包含最高15、优选地最高10、甚至更优选地最高5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸。换言的，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最高15％、优选地10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地5％、4％、3％、2％、1％、0.1％的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或参考序列中全部核苷酸中最高15％、优选地10％、9％、8％、7％、6％、甚至更优选地5％、4％、3％、2％、1％、0.1％数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的所述突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于多肽具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定氨基酸序列而言，预计多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同，只是给定多肽序列可包含最高15、优选地最高10、9、8、7、6、甚至更优选地最高5、4、3、2、1个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸。换言的，为获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、甚至更优选地95％、96％、97％、98％、99％序列相同性的给定多肽序列，参考序列中最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或可将占参考序列中的总氨基酸残基数的最高15％、优选地最高10％、9％、8％、7％、甚至更优选地最高5％、4％、3％、2％、1％的数量的氨基酸插入参考序列中。参考序列的所述改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列相同性时，并不包含保守取代作为匹配。
术语“序列相同性”或“相同性百分比”可在本文中互换使用。出于本发明目的，在本文中应明确，为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比相同性，出于最优选对比目的对比所述序列(举例而言，可将空位引入第一氨基酸或核酸的序列中以用于与第二氨基或核酸序列进行最优选对比)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。在第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据，则所述分子在该位置相同。两个序列之间的相同性％是所述序列所共享的相同位置数的函数(亦即，相同性％＝相同位置数/总位置(亦即重迭位置)数×100)。优选地，两个序列具有相同长度。
可在两个所比较序列的整个长度中或在两个序列的片段中实施序列对比。通常，在两个所比较序列的全长中实施对比。然而，可在(例如)20、50、100或更多个邻接氨基酸残基的区域中实施序列相同性测定。
熟习此项技术者应知晓，实际上，可利用若干不同计算机程序来测定两个序列之间的同源性。举例而言，两个序列之间的序列对比及相同性百分比的测定可使用数学算法来达成。在一优选实施例中，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法(其已纳入Accelrys GCG软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/处获得)中的GAP程序中)、使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6)来测定两个氨基酸或核酸序列之间的百分比相同性。熟习此项技术者应了解，所有所述不同参数将产生略微不同的结果，但在使用不同算法时两个序列的整体百分比相同性并不显著改变。
可进一步使用本发明的蛋白质序列及核酸序列作为“询问序列”来实施针对公共数据库的检索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN及BLASTP程序(2.0版)实施所述检索。可使用BLASTP程序、评分＝50、字长＝3实施BLAST蛋白质检索以获得本发明的蛋白质分子的同源氨基酸序列。为获得用于对比目的的空位对比，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所阐述来利用空位BLAST。在利用BLAST及空位BLAST程序时，可使用各别程序(例如BLASTP及BLASTN)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/处的主页。
EHV-1及EHV-4/重组载体技术定义
术语“马科动物”或“马”或“马的”意指马科家族或属马科(Equidae)，其包含马、驴及斑马、优选地马。另外，术语“马科动物”或“马”或“马的”亦涵盖马科成员的杂合体(例如骡子、駃騠等)。
“疱疹病毒”或“疱疹病毒载体”是指疱疹病毒目的疱疹病毒科中的物种。
术语“马疱疹病毒载体”或“马疱疹病毒”或“EHV”意指影响马的疱疹病毒科的成员。迄今为止，已经鉴别了八种不同物种的马疱疹病毒，其中五种属α疱疹病毒亚科(EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)且三种属丙型疱疹病毒亚科。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy:2015年发布，EC 47,London,UK，2015年7月；电子邮件批准2016(MSL 30号)。
术语“EHV-1”意指马α疱疹病毒1，其是疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科属中的水痘病毒亚属的成员。EHV-1的非限制性参考序列是(例如)野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)或RacH(Hübert 1996)。
术语EHV-4意指马α疱疹病毒4，其是疱疹病毒科的α疱疹病毒中的水痘病毒亚属的成员。
术语“两个或更多个EHV载体”涵盖2、3、4、5或6个EHV载体。
术语“插入ORF70中”或“ORF70中的插入位点”意指，在编码马疱疹病毒1开放阅读框70的位置将DNA片段插入基因组DNA中。所提及的插入使得缺失ORF70的801个5'碱基对，从而使得3'端的剩余423个bp完整，但消除了orf70基因产物糖蛋白G的表达。包含EHV-1的若干α疱疹病毒的糖蛋白G展示可自感染细胞分泌并通过结合促发炎细胞因子而用作免疫调节蛋白。与具有完整糖蛋白G表达的野生型EHV-1相比，消除其在病毒载体中的表达应增加病毒感染的免疫原性。
术语“插入ORF1/3中”及“ORF1/3中的插入位点”意指，在疫苗株EHV-1 RacH的减毒程序期间通过传代意外缺失使包括90％ORF1及整个ORF2的1283bp片段失去的位置将DNA片段插入病毒基因组中。选择此插入位点，此乃因自此位置的转基因的表达可能干扰病毒复制的可能性预计将极低。
疫苗定义
“免疫原性或免疫组合物”是指包括至少一种抗原或其免疫原性部分的物质的组合物，其在宿主中引发细胞或抗体调介的对组合物的免疫反应的免疫学反应。优选地，免疫原性组合物诱导免疫反应且更优选地赋予抵抗猪IAV感染的一或多种临床征象的保护免疫性。亦将宿主阐述为“产食动物”。若宿主显示保护免疫学反应以便对新感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重程度有所减小，则将免疫原性组合物阐述为“疫苗”。
本文使用的术语“抗原”在业内已众所周知，且包含具有免疫原性的物质(亦即免疫原)以及诱导免疫学不反应性或无反应性(亦即身体的防御机制对外来物质无反应)的物质。如本文中所使用，术语“抗原”欲指含有或包括表位的全长蛋白质以及其肽片段。另外，术语“抗原编码序列”涉及编码抗原的序列。优选地，抗原编码序列是核酸序列，例如cDNA序列。然而，术语“核酸序列”已定义于本文中其他处。
术语“至少一个外源性抗原编码序列”亦涵盖一个以上的外源性抗原编码序列。因此，必须理解，术语“至少一个外源性抗原编码序列”涵盖2、3、4、5或6个外源性抗原编码序列。因此，术语“至少两个外源性抗原编码序列”涵盖3、4、5或6个外源性抗原编码序列。
术语“不同外源性抗原编码序列”是序列彼此不同的序列。
本文所用的“免疫原性组合物”可是指多肽或蛋白质，例如引发如本文所阐述的免疫学反应的病毒表面蛋白。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”是指蛋白质或多肽的片段或截短和/或取代形式，其包含一或多个表位且由此引发本文所阐述的免疫学反应。一般而言，所述截短和/或取代的形式或片段将包括来自全长蛋白质的至少六个邻接氨基酸。所述片段可使用任一数量的业内熟知的表位定位技术来鉴别。例如参见Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris编辑，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。举例而言，线性表位可通过在固体载体上同时合成大量肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)且使肽与抗体反应同时肽仍附接至载体来测定。所述技术是业内已知且经阐述的，例如参见美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，举例而言，通过(例如)x射线结晶学及二维核磁共振且通过测定氨基酸的空间构象来容易地鉴别构象表位。参见Epitope Mapping Protocols(见上文)。该定义内亦包含合成抗原，例如多表位、侧翼表位及其他重组或合成源抗原。例如参见Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75:402-408；及Gardner等人，(1998)12thWorld AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日至7月3日。(其教示及内容皆以引用方式并入本文中。)
术语“免疫”涉及通过以下方式达成的主动免疫：向拟实施免疫的产食动物施用免疫原性组合物，由此引起针对该免疫原性组合物中所包含的抗原的免疫学反应。
本文所用的术语“有需要(in need或of need)”意指，施用/治疗涉及加强或改良健康或临床征象或对于接受本发明的免疫原性组合物的动物的健康的任一其他阳性医学效应。
本文所用的术语“疫苗”是指包括至少一种在动物中诱导免疫学反应的免疫活性组分且可能但不一定包括一或多种增强活性组分的免疫学活性的额外组分的医药组合物。疫苗可另外包括医药组合物的其他典型组分。通过区别，疫苗的免疫学活性组分可包括呈其原始形式的完整病毒颗粒或所谓经修饰活疫苗(MLV)中的减毒颗粒或通过适当方法在所谓死疫苗(KV)中不活化的颗粒。在另一形式中，疫苗的免疫学活性组分可包括生物体的适当组件(亚单位疫苗)，其中所述组件是通过以下方式生成：通过破坏整个颗粒或含有所述颗粒的生长培养液及任选随后的纯化步骤以产生期望结构，或通过合成方法，包含使用基于(例如)细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种的适宜系统的适当处理加上任选随后的分离及纯化程序，或通过使用适宜医药组合物直接纳入遗传物质来诱导需要疫苗的动物中的合成过程(多核苷酸接种疫苗)。疫苗可包括一种或同时一种以上的上述组件。如在本发明的具体方面中所使用，“疫苗”是指活疫苗或活病毒，亦称为重组疫苗。在本发明的另一具体方面中，“疫苗”是指包含病毒样颗粒(VLP)的灭活或死病毒。因此，疫苗可为亚单位疫苗或死(KV)或灭活疫苗。
术语“DNA疫苗接种”或“多核苷酸疫苗接种”意指使用适宜医药组合物直接接种遗传物质。
灭活的各种物理及化学方法为业内已知。术语“灭活”是指先前有毒或无毒的病毒经辐照(紫外线(UV)、X射线、电子束或γ辐射)、加热或化学处理使该病毒灭活或杀死该病毒，同时保留其免疫原性。适宜灭活剂包含β-丙内酯、二元或β-或乙酰基-次乙亚胺、戊二醛、臭氧及福尔马林(formalin)(甲醛)。
对于由福尔马林或甲醛灭活，通常将甲醛与水及甲醇混合以产生福尔马林。添加甲醇可防止灭活过程中的降解或交叉反应。一实施例使用约0.1％至1％的37％甲醛溶液来使病毒灭活。至关重要的是，调节福尔马林的量以确保材料灭活，但不会多至发生高剂量的副效应。
更特定而言，病毒背景中的术语“灭活”意指，病毒不能在活体内或在活体外复制。举例而言，术语“灭活”可是指已经在活体外繁殖且然后使用化学或物理方式使其灭活以使其不再能够复制的病毒。
如本文中所使用，术语“灭活”、“杀死”或“KV”可互换使用。
术语“活疫苗”是指包括活生物体或复制胜任病毒或病毒载体的疫苗。
“医药组合物”基本上由一或多种能够改变其所施用的生物体或生物体中或上面存活的生物体的生理学(例如免疫学)功能的成分组成。该术语包含(但不限于)抗生素或抗寄生虫剂以及通常用于实现某些其他目的(例如但不限于处理性状、不孕性、稳定性、经肠或非经肠途径(例如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、真皮内或其他适宜途径)施用组合物的可行性、施用后耐受性或受控释放性质)的其他成分。该医药组合物的一个非限制性实例仅仅是用于显示目的给出，可如下所述来制备：将经感染细胞培养液的细胞培养液上清液与稳定剂(例如亚精胺和/或牛血清白蛋白(BSA))混合且随后将混合物通过其他方法进行冻干或去水。在接种疫苗之前，然后将混合物在水溶液(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS))或非水溶液(例如油乳液、基于铝的佐剂)中再水化。
如本文中所使用，“医药上或兽医上可接受的载剂”包含任何及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂及诸如此类。在一些优选实施例及尤其包含冻干的免疫原性组合物的彼等中，用于本发明的稳定剂包含用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施例中，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。本文所用的“佐剂”可包含氢氧化铝及磷酸铝、皂素，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言，乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(EuropeanPharmacopea)型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特定而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油；酸或含有直链烷基的醇的酯，更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯；具支链脂肪酸或醇的酯，特定而言异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子表面活性剂，特定而言是以下的酯：山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其任选经乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言Pluronic产品，尤其L121。参见Hunter等人，The Theory andPractical Application of Adjuvants(Stewart-Tull编辑，D.E.S.),JohnWiley andSons,NY，第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。实例性佐剂是由M.Powell及M.Newman编辑的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”，Plenum Press,1995的第147页上阐述的SPT乳液及同一本书第183页上阐述的乳液MF59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。所述化合物以术语卡波姆(carbomer)为人所知(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟习此项技术者亦可参照美国专利第2,909,462号，其阐述与具有至少3个、优选地不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的所述丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团是含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯是不饱和基团。不饱和基团可自身含有其他取代基，例如甲基。以名称(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品尤其适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交联。其中，可提及Carbopol 974P、934P及971P。最优选是使用971P。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，尤其是共聚物EMA(Monsanto)，其是马来酸酐与乙烯的共聚物。所述聚合物在水中的溶解产生酸溶液，其将被中和、优选地中和至生理pH以产生将引入免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身的佐剂溶液。
其他适宜佐剂包含(但不限于)尤其RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽或其天然或重组细胞因子或其类似物或内源细胞因子释放的刺激剂等。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量、优选地以每剂量约100μg至约10mg的量、更优选地以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更优选地以每剂量约750μg至约2.5mg的剂量及最优选地以每剂量约1mg的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂可为约0.01％至50％的浓度，优选为约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，仍更优选为约7％至22％的浓度，且最优选为10％至20％的浓度。
“稀释剂”可包含水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包含氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包含白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
“分离”意指自其天然状态“由人手”改变，亦即若其在自然界中存在，则其已经改变或自其初始环境中取出，或两者兼而有的。举例而言，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽并非“分离的”，但自其天然状态的共存物质分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文所用的术语。
“减毒”意指降低病原体的毒性。在本发明中，“减毒”与“无毒”同义。在本发明中，减毒病毒是毒性已降低从而不会引起感染的临床征象但能够在目标哺乳动物中诱导免疫反应者，但亦可意指与感染非减毒病毒或病原体且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比在感染减毒病毒、尤其所主张的EHV-1 RacH病毒载体的动物中临床征象的发生率或严重程度有所降低。在此上下文中，术语“减小(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的对照组相比减小至少10％、优选地25％、甚至更优选地50％、仍更优选地60％、甚至更优选地70％、仍更优选地80％、甚至更优选地90％及最优选地100％。因此，减毒的无毒病原体(例如所主张的减毒的病毒载体、尤其所主张的EHV-1(优选地RacH)病毒载体)适于产生经修饰的活疫苗(MLV)或经修饰的活免疫原性组合物。
术语“治疗和/或预防”是指减小畜群中特定猪流感A病毒感染的发病率或减小由特定猪流感A病毒感染引起或与其有关的临床征象的严重程度。因此，术语“治疗和/或预防”亦是指与动物尚未接受如本文所提供的免疫原性组合物的动物群相比，在动物已接受有效量的所述免疫原性组合物的动物群中，减小畜群中感染特定猪流感A病毒的动物数量(＝减小特定猪流感A病毒感染的发病率)或减小通常与猪流感A病毒感染有关或由其引起的临床征象的严重程度。
“治疗和/或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物施用需要此一治疗/预防或可自其受益的动物或动物畜群。术语“治疗”是指在动物或畜群的至少一些动物已感染该猪流感A病毒且其中所述动物已展示一些由该猪流感A病毒感染引起或与其有关的临床征象后，施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”是指在患有猪流感A病毒的该动物的任一感染或至少该动物或动物群中没有动物并不展示任一由该猪流感A病毒感染引起或与其有关的临床征象之前，施用动物。术语“预防(prophylaxis及preventing)”在本申请可互换使用。
本文所用的术语“临床征象”是指感染猪流感A病毒的动物的征象。感染的临床征象取决于所选病原体。所述临床征象的实例包含(但不限于)呼吸窘迫、耳炎、被毛粗乱、微热、抑郁症及食欲减小。然而，临床征象亦包含(但不限于)可自活动物直接观察到的临床征象。可自活动物直接观察到的临床征象的实例包含流鼻涕与眼泪、嗜睡、咳嗽、哮鸣、重击、高热、失重、去水、跛行、消瘦、皮肤苍白、羸弱及诸如此类。
优选地，治疗动物的发病率或严重程度的减弱的临床征象(与未治疗或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物治疗但随后感染特定猪流感A病毒的动物相比)是指体重减轻降低、降低肺中的病毒负荷、减小肺病灶、减小和/或缩短病毒的脱落、降低直肠温度、减少临床症状(尤其是呼吸症状)、增加(中和)抗猪流感A病毒抗体的诱导、增加针对猪流感A病毒的T细胞刺激、增加针对猪流感A病毒的B细胞刺激及减少肺中的促炎细胞因子(例如IL1β)或其组合。
在本文中，“有效剂量”意指(但不限于)引起或能够引发免疫反应且在施用抗原的动物中使得减少临床症状的量。
如本文中所使用，术语“有效量”在组合物的背景中意指能够诱导免疫反应且降低动物的疾病的感染或事件的严重程度的免疫原性组合物的量。该有效量能够减小畜群中特定猪流感A病毒感染的发病率或减小特定猪流感A病毒感染的临床征象的严重程度。特定而言，有效量是指每剂量的菌落形成单位(CFU)。或者，在疗法的背景中，术语“有效量”是指足以减轻或改善疾病或病症或其一或多种症状的严重程度或持续时间、防止疾病或病症进展、引起疾病或病症消退、防止与疾病或病症相关的一或多种症状的复发、发展、发作或进展或增强或改良另一疗法的预防或治疗的疗法的量。
“免疫反应”或“免疫学反应”意指(但不限于)对所关注的(免疫原性)组合物或疫苗发生细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，免疫或免疫学反应包含(但不限于)以下效应中的一或多者：产生或活化特异性针对所关注组合物中所包含的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、阻抑性T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，宿主将展示治疗性或保护性免疫(记忆)反应，从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度降低。该保护将通过症状数量的减少、症状严重程度的降低或无与病原体感染相关的一或多种症状、病毒血症发作的延迟、病毒持久性降低、整体病毒负荷的降低和/或病毒排泄的降低来展现。
“抵抗疾病”、“保护性免疫性”、“功能免疫性”、“临床症状的减少”、“中和抗体的诱导/产生和/或血清转化”及类似片语意指通过施用本发明的一或多种治疗性组合物或其组合而产生的针对疾病或病状的部分或完全反应，其导致比已暴露于疾病或感染的未经免疫个体所预计较不有害的效应。亦即，在接种疫苗的动物中，感染的有害效应的严重程度减轻。在接种疫苗的动物中，感染可经减轻、减缓或可能完全预防。在本文中，若意指完全预防感染，则对其进行具体陈述。若未陈述完全预防，则该术语包含部分预防。“保护性免疫学反应”或“保护性免疫性”显示为减少或缺乏通常由受感染宿主显示的临床征象、较快恢复时间和/或较低感染性持续时间或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的较低病原体效价。
在本文中，“临床征象的发生率和/或严重程度的降低”或“临床症状的减少”意指(但不限于)与野生型感染相比，减少组中感染动物的数量、减少或消除展现感染的临床征象的动物的数量或降低一或多个动物中存在的任何临床征象的严重程度。举例而言，其应是指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或疟疾的症状的任何临床征象减少。优选地，与未接受组合物且被感染的动物相比，接受本发明的治疗性组合物的一或多个动物的所述临床征象减少至少10％。更优选地，接受本发明组合物的动物的临床征象减少至少20％、优选地至少30％、更优选地至少40％及甚至更优选地至少50％。
术语“增加的保护”在本文中意指(但不限于)相对于未接种疫苗的动物对照组，经疫苗接种的动物组的一或多种与由传染原感染有关的临床症状在统计学上显著减轻。术语“临床症状的统计学显著减轻”意指(但不限于)经接种疫苗的动物组的至少一种临床症状的发病频率比在攻击传染原后未接种疫苗的对照组中低至少10％、优选地20％、更优选地30％、甚至更优选地50％及甚至更优选地70％。
术语“病原体”为熟习此项技术者所熟知。然而，术语“病原体”包括细菌及病毒。
术语“产食动物”意指用于人类消费的动物，例如猪、牛、家禽、鱼及诸如此类、优选地猪。术语“产食动物”不包含马科，例如马。
“持久保护”应是指持续至少3周、但更优选地至少3个月、仍更优选地至少6个月的改良的效能。在牲畜的情形下，最优选地，持久保护应持续直至动物出售用于肉类的平均年龄。
术语“脱落”是指诸如鼻涕等分泌物且另外是指通过咳嗽或喷嚏产生的浮质。因此，可通过检验鼻拭子中的病毒效价或通过肺中的病毒效价来测定脱落。术语“脱落”另外涵盖病毒转移至易感动物中(亦即哨点)。熟习此项技术者熟知如何量测病毒脱落。
术语“抗猪流感A病毒抗体”是指特异性指向猪流感A病毒的抗体。该抗猪流感A病毒抗体的实例包括(但不限于)通过使用猪流感A病毒疫苗对母猪接种疫苗所获得的母源抗体或通过母猪的猪流感A病毒感染所获得的母源抗体。另外，仔猪中的抗猪流感A病毒抗体可因应于仔猪的猪流感A病毒感染而产生。术语“抗-猪流感A病毒抗体”应另外已知(但不限于)，仔猪具有或暴露于(母源抗体的被动转移)可检测抗SIAV抗体效价、优选地至少1:10、更优选地大于1:20、甚至更优选地大于1:40、甚至更优选地大于1:80、甚至更优选地1:160、甚至更优选地大于1:320及最优选地大于1:640。优选地，可在特定抗猪流感A病毒免疫分析(例如血球凝集抑制分析、ELISA或血清中和测试)中检测及量化该抗猪流感A病毒抗体效价。
“安全性”是指在接种疫苗后，在经接种疫苗的动物中不存在不良后果，包含(但不限于)：基于细菌的疫苗潜在地逆转成有毒、临床上显著的副效应，例如持久性、全身性疾病或在疫苗施用位点不可接受的发炎。
本文所用的术语“疫苗接种(vaccination或vaccinating)”或其变化形式意指(但不限于)包含施用本发明的免疫原性组合物的过程，在施用动物时，其引发或能够引发(直接或间接)该动物的免疫反应。
在本发明的上下文中，“死亡率”是指由感染引起的死亡，且包含感染如此严重以致于将动物安乐死以防止痛苦并为其生命提供人道结局的情况。
调配物
本发明的调配物包括有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。疫苗包括有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。调配物应适用于施用方式。
免疫原性组合物(若需要)亦可含有极少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放调配物或粉剂。口服调配物可包含标准载剂，例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
优选施用途径包含(但不限于)鼻内、口服、真皮内及肌内。期望在饮用水中、最优选以单一剂量施用。熟习此项技术者将认识到，本发明组合物亦可以一个、两个或更多个剂量通过其他施用途径来施用。举例而言，所述其他途径包含皮下、皮内、腹膜内、皮内，且根据治疗的期望持续时间及有效性，本发明组合物可以(例如)每日计一次或若干次、亦间歇地以不同剂量(例如约1×104至1×109TCID50(参见上述病毒效价))施用若干天、若干周或若干月。在本发明的一具体方面中，剂量约为1×104至1×107TCID50。
抗原定义
熟习此项技术者已知术语“猪流感病毒”。术语猪流感病毒是指来自引起猪流感的正粘液病毒科的A型或C型流感病毒。尽管正粘液病毒具有三组：A型、B型及C型，但仅A型及C型流感病毒感染猪。优选地，猪流感病毒是猪流感A病毒。猪流感病毒的亚型包含H1N1、H1N2、H3N2及H3N1。H9N2及H5N1亦可发现于猪中。优选地，猪流感病毒是自猪分离的流感病毒。
熟习此项技术者已知术语“HA”或“H”、“NA”或“N”及“NP”。然而，一般而言，A型流感病毒细分成17H(血凝素)及10N(神经氨酸酶)亚型，其可产生许多可能组合(指定为H1N1、H1N2……、H2N1、H2N2……、H5N1、H5N2……等)。H(血凝素)及N(神经氨酸酶)是流感A病毒(例如SIAV)中的表面糖蛋白。另外，N是中和抗体的主要抗原性靶。另外，NP(核蛋白)形成核衣壳。
DIVA定义
术语“DIVA(区分经感染动物与经疫苗接种动物)“是指可使用疫苗来区分经疫苗接种动物与天然感染动物。
术语“试样”是指体液试样、经分离细胞试样或来自组织或器官的试样。可通过熟知技术来获得体液试样且优选地包含血液、血浆、血清或尿的试样、更优选地血液、血浆或血清的试样。可通过(例如生检)自任一组织或器官获得组织或器官试样。可通过分离技术(例如离心或细胞分选)自体液或组织或器官来获得经分离细胞。
术语“获得”可包括熟习此项技术者已知的分离和/或纯化步骤，优选地使用沈淀、管柱等。
术语“免疫测试”及“基因组分析测试”是区分使用本发明免疫原性组合物接种疫苗的动物与感染天然(疾病相关)猪流感病毒的动物的基础。免疫测试的实例包含任一酶-免疫学或免疫化学检测方法，例如ELISA(酶联吸附分析)、EIA(酶免疫分析)、RIA(放射免疫分析)、夹心式酶免疫测试、荧光抗体测试(FAT)、电化学发光夹心式免疫分析(ECLIA)、解离增强的镧是元素荧光免疫分析(DELFIA)或固相免疫测试、免疫荧光测试(IFT)、免疫组织学染色、蛋白印迹分析或熟习此项技术者可获得的任一其他适宜方法。端视所用分析，可通过酶、荧光团或放射性同位素标记抗原或抗体。例如参见Coligan等人，Current Protocolsin Immunology,John Wiley&Sons Inc.,New York,N.Y.(1994)；及Frye等人，Oncogen 4:1153-1157,1987。
术语“基因组分析测试”是指基于以下的基因组分析方法：聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时PCR(r-PCR)或实时逆转录PCR(rRT-PCR)、Templex-PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)及使用聚合酶及特定寡核苷酸作为引物的等温扩增方法。上文所提及的扩增方法在业内已众所周知。
条款
本文阐述下列条款：
本发明提供下列条款：
化合物
1.一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入ORF70中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
2.一种免疫原性组合物，其包括如条款1的EHV载体及任选的药学载剂。
3.一种包括EHV载体的免疫原性组合物，该EHV载体包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入ORF70中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
4.一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列的启动子序列。
5.一种免疫原性组合物，其包括如条款4的EHV载体及任选的药学载剂。
6.一种包括EHV载体的免疫原性组合物，该EHV载体包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列的启动子序列。
7.一种EHV载体，其包括
(i)至少两个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)所述外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)所述外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
8.一种免疫原性组合物，其包括如条款7的EHV载体及任选的药学载剂。
9.一种包括EHV载体的免疫原性组合物，该EHV载体包括
(i)至少两个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)所述外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)所述外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
10.一种免疫原性组合物，其包括两种或更多种如条款1至9中任一项的EHV载体。
11.如条款10的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包括两种EHV载体。
12.如条款10的免疫原性组合物，其中该两种或更多种EHV载体包括不同外源性抗原编码序列。
13.一种DIVA疫苗，其包括一或多种如条款1至12中任一项的EHV载体。
14.如条款1至13中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体是重组载体。
15.如条款1至14中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体是RacH或RacH SE。
16.如条款1至14中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体是选自由以下组成的群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。
17.如条款1至16中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体是EHV-1。
18.如条款1至17中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该产食动物是猪。
19.如条款1至18中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该感染产食动物的病原体是流感病毒、优选地猪流感A病毒。
20.如条款1至19中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列。
21.如条款1至20中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感亚型是选自由以下组成的群：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及H18。
22.如条款1至21中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感亚型是H1和/或H3。
23.如条款1至22中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感A抗原具有猪起源。
24.如条款1至23中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体包括至少两个血凝素流感抗原编码序列。
25.如条款1至24中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体包括至少4个血凝素流感抗原编码序列。
26.如条款1至25中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体包括4个血凝素流感抗原编码序列。
27.如条款1至26中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感抗原编码序列是选自由以下组成的株群：A/猪/Italy/116114/2010(H1N2)、A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)、A/猪/Gent/132/2005(H1N1)、A/猪/Italy/4675/2003(H1N2)、A/猪/Italy/259543/2003(H1N2)、A/猪/Denmark/13772-1/2003(H1N1)、A/猪/England/MD0040352R/2009(H1N1)、A/猪/Hungary/13509/2007(H3N2)、A/猪/Italy/13962/95(H3N2)、A/猪/Cotes d'Armor/1121/00(H1N1)、A/猪/Colorado/1/77、A/猪/Colorado/23619/99、A/猪/Cote d'Armor/3633/84、A/猪/England/195852/92、A/猪/Finistere/2899/82、A/猪/Hong Kong/10/98、A/猪/Hong Kong/9/98、A/猪/Hong Kong/81/78、A/猪/Illinois/100084/01、A/猪/Illinois/100085A/01、A/猪/Illinois/21587/99、A/猪/Indiana/1726/88、A/猪/Indiana/9K035/99、A/猪/Indiana/P12439/00、A/猪/Iowa/30、A/猪/Iowa/15/30、A/猪/Iowa/533/99、A/猪/Iowa/569/99、A/猪/Iowa/3421/90、A/猪/Iowa/8548-1/98、A/猪/Iowa/930/01、A/猪/Iowa/17672/88、A/猪/Italy/1513-1/98、A/猪/Italy/1523/98、A/猪/Korea/CY02/02、A/猪/Minnesota/55551/00、A/猪/Minnesota/593/99、A/猪/Minnesota/9088-2/98、A/猪/Nebraska/1/92、A/猪/Nebraska/209/98、A/猪/Netherlands/12/85、A/猪/North Carolina/16497/99、A/猪/North Carolina/35922/98、A/猪/North Carolina/93523/01、A/猪/North Carolina/98225/01、A/猪/Oedenrode/7C/96、A/猪/Ohio/891/01、A/猪/Oklahoma/18717/99、A/猪/Oklahoma/18089/99、A/猪/Ontario/01911-1/99、A/猪/Ontario/01911-2/99、A/猪/Ontario/41848/97、A/猪/Ontario/97、A/猪/Quebec/192/81、A/猪/Quebec/192/91、A/猪/Quebec/5393/91、A/猪/Taiwan/7310/70、A/猪/Tennessee/24/77、A/猪/Texas/4199-2/98、A/猪/Wisconsin/125/97、A/猪/Wisconsin/136/97、A/猪/Wisconsin/163/97、A/猪/Wisconsin/164/97、A/猪/Wisconsin/
166/97、A/猪/Wisconsin/168/97、A/猪/Wisconsin/235/97、A/猪/Wisconsin/238/97、A/猪/Wisconsin/457/985A/猪/Wisconsin/458/98、A/猪/Wisconsin/464/98及A/猪/Wisconsin/14094/99。
28.如条款1至27中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感抗原编码序列是选自由以下组成的株群：A/猪/Italy/116114/2010(H1N2)、A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)、A/猪/Gent/132/2005(H1N1)及A/猪/Italy/4675/2003(H1N2)。
29.如条款1至28中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感抗原编码序列编码选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29组成的群的氨基酸序列。
30.如条款1至29中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感抗原编码序列包括编码与如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
31.如条款1至30中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感抗原编码序列包括编码与如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
32.如条款1至31中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是N(神经氨酸酶)编码序列且该N亚型是选自由以下组成的群：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及N10。
33.如条款1至32中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体、该免疫原性组合物或该DIVA疫苗不包括N(神经氨酸酶)流感抗原编码序列。
34.如条款1至33中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体、该免疫原性组合物或该DIVA疫苗不包括NP(核蛋白)流感抗原编码序列。
35.如条款1至34中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体包括其他调节序列，例如终止信号或多腺苷酸化序列。
插入位点：
36.如条款4至34中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该插入位点是ORF1/3。
37.如条款4至34中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该插入位点是ORF70。
38.如条款1至37中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中将与感染产食动物的病原体相关的第一外源性抗原编码序列插入ORF70中。
39.如条款1至38中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中将与感染产食动物的病原体相关的第二外源性抗原编码序列插入ORF1/3中。
40.如条款1至39中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该ORF70中的插入特征在于ORF70中的部分缺失、截短、取代、修饰或诸如此类，其中ORF71保留功能性。
41.如条款1至40中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该ORF70中的插入特征在于：
i)缺失RacH的ORF70内的大约801bp部分(SEQ ID NO:20)或其70％、80％、85％、90％、95％、99％同源和/或相同序列，或
ii)该ORF70中的插入特征在于缺失RacH的ORF70内的大约801bp部分(SEQ IDNO.:20)或任一其他株中的其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列缺失，或
iii)该ORF70中的插入特征在于缺失野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内的大约801bp部分，其中该野生型ab4基因组序列中的该缺失部分位于核苷酸127681与128482(SEQ ID NO.:19)之间或是其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列，或
iv)该ORF70中的插入特征在于缺失野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)的ORF70内的大约801bp部分，其中该野生型ab4基因组序列中的该缺失部分位于核苷酸127681与128482(SEQ ID NO.:19)之间或任一其他株中的其70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列缺失。
42.如条款1至41中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV-1载体包括至少一个选自由以下组成的群的侧翼区：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18及所述序列中的任一者的70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
43.如条款1至42中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV-1载体包括(i)至少一个选自由以下组成的群的左ORF70侧翼区：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17；及(ii)至少一个选自由以下组成的群的右ORF70侧翼区：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18。
启动子：
44.如条款1至3及7至43中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列是选自由以下组成的群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子；4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段，优选地该功能片段是p430(SEQ ID NO:3)；4pgG600(SEQ ID NO:1)的互补核苷酸序列的功能片段；4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段，优选地该功能片段是p455(SEQ ID NO:4)；4pMCP600(SEQ IDNO:2)的互补核苷酸序列的功能片段。
45.如条款1至3及7至44中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列。
46.如条款4至6及45中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列的该功能片段或衍生物具有80％、85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的同源性。
47.如条款4至6及45或46中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列的该功能片段或衍生物具有550个核苷酸、优选地500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430个核苷酸、最优选地455或430个核苷酸的长度。
48.如条款4至6及45至47中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列的该功能片段是4pgG600(SEQ ID NO:1)的截短物或其互补核苷酸序列，优选地，该序列相同性为整个长度的(至少)72％(或更高)。
49.如条款4至6及45至48中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中4pgG600(SEQ ID NO:1)的该启动子序列的该功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)或与SEQ ID NO:3具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的序列。
50.如条款4至6及45至48中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列的该功能片段是4pMCP600(SEQ ID NO:2)的截短物或其互补核苷酸序列，优选地，该序列相同性为整个长度的(至少)78％(或更高)。
51.如条款4至6及45至48中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中4pMCP600(SEQ ID NO:2)的该启动子序列的该功能片段是指定片段p455(SEQ ID NO:4)或与SEQ ID NO:4具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的序列。
52.如条款1至51中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体包括一或多个其他调节序列，例如终止信号、多腺苷酸化信号或诸如IRES和/或2a肽等调节组件。
启动子及抗原的特定组合：
53.如条款1至52中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:28中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
54.如条款53的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)的该功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)。
55.如条款1至54中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:27中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
56.如条款55的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的该功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
57.如条款1至56中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:28中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，且
其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:27中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
58.如条款57的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID No.1)的该功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)，且其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的该功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
59.如条款57或58的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或该DIVA疫苗为二价的。
60.如条款1至59中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
61.如条款60的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)该的功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)。
62.如条款1至61中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:26中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
63.如条款62的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的该功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
64.如条款1至63中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，且
其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:26中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
65.如条款64的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID No.1)的该功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)且其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的该功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
66.如条款64或65的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或该DIVA疫苗为二价的。
67.如条款1至66中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物包括第一EHV载体，该第一EHV载体包括：启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:28中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，及
启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:27中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列，且其中该免疫原性组合物包括第二EHV载体，该第二EHV载体包括：
启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:29中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列；及
启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互补核苷酸序列，其可操作地连接至编码与如SEQ ID NO:26中所陈述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
68.如条款67的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列4pgG600(SEQ ID NO:1)的该功能片段是指定片段p430(SEQ ID NO:3)且其中该启动子序列4pMCP600(SEQ ID NO:2)的该功能片段是指定片段455p455(SEQ ID NO:4)。
69.如条款67或68的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗为四价的。
70.如条款1至69中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗经调配用于单一剂量施用。
71.如条款1至70中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中经肌内或经鼻内施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
72.如条款1至71中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗可安全用于前6周龄内、前两周龄内、第一周龄内或第一天龄内的猪。
73.如条款1至72中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗进一步包括医药上可接受的载剂。
74.如条款73的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该医药上可接受的载剂是注射用水、细胞培养基或再悬浮缓冲剂。
75.如条款74的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该再悬浮缓冲液是磷酸盐缓冲盐水。
76.如条款1至75中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗包括1×104至1×109TCID50、优选地介于1×104至1×108TCID50之间、甚至更优选地1×104至1×107TCID50的EHV载体。
77.如条款1至76中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物是疫苗。
78.如条款1至77中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗是多价疫苗。
79.如条款1至78中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗是二价疫苗、四价疫苗、六价疫苗或七价疫苗。
80.如条款1至79中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗是二价疫苗或四价疫苗。
81.如条款1至80中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗可有效治疗和/或预防有需要的产食动物中由猪流感A病毒引起的临床征象。
82.如条款1至81中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗抵抗猪流感A病毒的同源和/或异源性攻击。
83.如条款1至82中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1和/或H3的猪流感A病毒的攻击。
试剂盒
84.一种试剂盒，其包括如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
85.如条款84的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括用于治疗和/或预防猪流感A病毒的说明手册。
治疗方法
86.一种对产食动物实施免疫的方法，其包括向该产食动物施用如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
87.一种治疗或预防有需要的产食动物中由流感A病毒引起的临床征象的方法，该方法包括向该产食动物施用治疗有效量的如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
88.一种与相同种的未免疫对照组的产食动物相比减小有需要的产食动物中的肺中病毒效价的方法，该方法包括向该产食动物施用治疗有效量的如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
89.一种对具有抗猪流感A病毒抗体的有需要的产食动物接种疫苗的方法，其包括向该产食动物施用治疗有效量的如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗的步骤。
90.一种在幼小产食动物中提供针对流感A病毒的母源免疫性的方法，其包括在该幼小产食动物的母亲怀有该幼小产食动物的同时向该母亲施用治疗有效量的如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
91.一种在有需要的幼小产食动物中提供针对流感A病毒感染的增加保护的方法，其中
a)在该幼小产食动物的母亲怀有该幼小产食动物的同时使用治疗有效量的如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗对该母亲接种疫苗和/或
b)使用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗在三周龄内对该幼小产食动物接种疫苗。
92.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用于对产食动物实施免疫的方法中，该方法包括向该产食动物施用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
93.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用于治疗或预防有需要的产食动物中由流感A病毒引起的临床征象的方法中，该方法包括向该产食动物施用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
94.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用于与相同种的未免疫对照组的产食动物相比减小有需要的产食动物中的肺中病毒效价的方法中，该方法包括向该产食动物施用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
95.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用于对具有抗猪流感A病毒抗体的有需要的产食动物接种疫苗的方法中，该方法包括向该产食动物施用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
96.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用于在幼小产食动物中提供针对流感A病毒的母源免疫性的方法中，其包括在该幼小产食动物的母亲怀有该幼小产食动物的同时向该母亲施用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
97.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用于在有需要的幼小产食动物中提供针对流感A病毒感染的增加保护的方法中，其中
a)在该幼小产食动物的母亲怀有该幼小产食动物的同时使用治疗有效量的如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗对该母亲接种疫苗和/或
b)使用治疗有效量的该免疫原性组合物或DIVA疫苗在三周龄内对该幼小产食动物接种疫苗。
98.如条款86至97中任一项的方法或用途，其中该产食动物是猪、仔猪或母猪。
99.如条款86至98中任一项的方法或用途，其中该流感A病毒是猪流感A病毒。
100.如条款86至99中任一项的方法或用途，其中施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗一次。
101.如条款86至100中任一项的方法或用途，其中在前6周龄内、前两周龄内、第一周龄内或第一天龄内向该产食动物施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
102.如条款86至101中任一项的方法或用途，其中以两个剂量施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
103.如条款102的方法或用途，其中在第一周龄内及第二、第三或第四周龄内的第二时间向该产食动物施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
104.如条款86至103中任一项的方法或用途，其中经肌内或经鼻内施用该免疫原性组合物或DIVA疫苗。
105.如条款86至88及92至94及98至104中任一项的方法或用途，其中该产食动物是抗猪流感A病毒抗体阴性。
106.如条款86至104中任一项的方法或用途，其中该产食动物是抗猪流感A病毒抗体阳性。
107.如条款86至106中任一项的方法或用途，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗包括1×104至1×107TCID50的该EHV载体。
108.如条款86至107中任一项的方法或用途，其中该方法产生与相同种的未免疫对照组的产食动物相比，选自由以下组成的群的效能参数改良：体重减轻降低、降低肺中的病毒负荷、减少肺病灶、减少和/或缩短病毒脱落、降低直肠温度、减少临床症状(尤其呼吸症状)、增加抗猪流感A病毒抗体的诱导(中和)、增加针对猪流感A病毒的T细胞刺激、增加针对猪流感A病毒的B细胞刺激及减少肺中的促炎细胞因子(例如IL1β)或其组合。
109.如条款86至108中任一项的方法或用途，其中该治疗或预防使得与相同种的非治疗对照组的产食动物相比病毒负荷期缩短。
110.如条款86至109中任一项的方法或用途，其中该治疗或预防使得自在攻击(感染)之后1天减小该流感A病毒的脱落。
111.如条款86至110中任一项的方法或用途，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗抵抗流感A病毒的同源和/或异源性攻击。
112.如条款86至111中任一项的方法或用途，其中该免疫原性组合物或DIVA疫苗抵抗血清型H1和/或H3的流感A病毒的攻击。
Swiss类型及其他措辞
113.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用于治疗应用。
114.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用作免疫原或疫苗。
115.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其用作药剂。
116.一种如条款2、3、5、6及8至83中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗的用途，其用于制造药剂。
117.如条款2、3、5、6及8至83中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗的用途，其用于治疗和/或预防产食动物中的猪流感A病毒感染。
DIVA
118.一种区分感染猪流感A病毒的产食动物与使用如条款2、3、5、6及8至83中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗接种疫苗的产食动物的方法，其包括
a)自产食动物获得试样，及
b)在免疫测试和/或基因组分析测试中分析该试样。
119.如条款118的方法，其中该免疫测试包括测试该试样是否包括特异性识别猪流感的该N(神经氨酸酶)蛋白或NP(核蛋白)蛋白的抗体。
120.如条款118或119的方法，其中若已检测出抗体特异性识别猪流感的该N(神经氨酸酶)蛋白或NP(核蛋白)蛋白，则该产食动物感染猪流感A病毒。
121.如条款118的方法，其中该基因组分析测试包括测试该试样是否包括编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的猪流感A病毒特异性序列。
122.如条款118或121的方法，其中若已检测出编码N(神经氨酸酶)和/或NP(核蛋白)的猪流感A病毒特异性序列，则该产食动物感染猪流感A病毒。
123.如条款118至122中任一项的方法，其中该免疫测试是EIA(酶免疫分析)或ELISA(酶联吸附分析)，或其中该基因组分析测试是PCR(聚合酶链反应)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)或实时PCR(聚合酶链反应)。
124.如条款118至123中任一项的方法，其中该产食动物是猪。
125.如条款118至124中任一项的方法，其中该试样是血清试样。
126.如条款118至125中任一项的方法，其中该ELISA是间接ELISA、夹心式ELISA、竞争性ELISA或阻断性ELISA。
附图简述
下列图式形成本说明书的一部分且经包含以进一步显示本发明的某些方面。可通过参照所述图式中的一或多者与本文所呈现具体实施例的详述阐述的组合来更优选地理解本发明。
图1A比较野生型(wt)EHV-1株ab4及减毒疫苗株EHV-1 RacH的orf1/3区域的示意图式
图1B.orf70插入位点的示意图
UL＝长独特区段
US＝短独特区段
IR＝内部倒转重复单元
TR＝末端倒转重复单元
gG＝糖蛋白G
gpII＝糖蛋白II
orf＝开放阅读框
bp＝碱基对
图2.转移质粒pU-mC70-BGH的质粒图及核苷酸序列
图3.启动子动力学实验的qPCR结果。
3.a中的图形展示编码必需糖蛋白D的orf72的转录的动力学。使用所述数据来归一化mCherry的转录动力学的数据(3.b中的图形)。
图4.两个独立启动子动力学实验的qPCR结果：转录活性与所绘示值的正关联。自t＝0下的相应平均Ct值扣除在感染之后不同时间mCherry qPCR结果的归一化Ct值。展示两种不同细胞是中的两个实验。
图5.转移载体pU70-p455-71K71的质粒图及核苷酸序列
图6.用于将表达盒p455-H3-71插入EHV-1 RacH的orf70中的转移质粒pU70-p455-H3-71K71的质粒图及核苷酸序列。
H3＝编码流感A病毒血凝素H3的开放阅读框
71pA＝如本发明中所阐述的新颖聚A序列EM P2016-022I-SceI＝限制性内核酸酶I-SceI的裂解位点
启动子aph＝原核卡那霉素(Kanamycin)抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
3’端ORF70＝插入位点的重组区下游
ORI＝质粒的复制起点
APr＝质粒的氨苄西林(Ampicillin)抗性基因
上游orf70＝插入位点的重组区上游
p455＝新颖启动子p455
bp＝碱基对
图7.rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的基因组的示意图式，其中放大orf70插入区。orf69：orf70中的插入位点上游的69号开放阅读框；p455：本文所阐述的新颖启动子，例如参见实施例1；H3：转基因流感病毒血凝素；71pA：新颖多腺苷酸化序列；Δorf70：含有用于orf71(其编码结构病毒糖蛋白II(gpII))的启动子的orf70的剩余部分。
图8.间接免疫荧光分析：
使用乙醇固定感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 24h p.i.细胞的VERO细胞之间接免疫荧光分析物且风干。使用针对H3的商业单克隆抗体作为一级抗体且使用FITC偶联的兔-抗小鼠IgG作为二级抗体，通过荧光显微术在感染重组EHV-1 RacHSE-70-p455-H3的细胞中展示H3。
图9.蛋白印迹(Western blot)：
感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3或对照rEHV-1 RacH-SE的不同传代的细胞或模拟感染细胞的蛋白印迹。将左侧的印迹物与针对EHV-1的gpII的单克隆抗体Ai2G7一起培育。将右侧的重复印迹物与针对流感A血凝素H3(PA5-34930)的商业兔超免疫血清一起培育。1：rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P5感染细胞，2：rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P10感染细胞，3：rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P15感染细胞，4：rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P20感染细胞，5：rEHV-1 RacH-mC70感染细胞。
图10.病毒效价：
在攻击之后一天及三天各组的平均肺效价，个别动物平均值(a)或组平均值(b)。分别以每g肺均质物的猪IAV的组织培养感染剂量50的形式给出效价。将效价分别测定为针对每一动物的左肺及右肺所测得的平均值，且分别探究每一肺中源自三个肺试样的汇集物的均质物。阴性对照组(neg.ctrl.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗一次的动物(1×EHV-1)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次(2×EHV-1)或使用市售灭活猪IAV疫苗两次(2×Inact.)。
图11.转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH的质粒图及核苷酸序列
图12.用于将表达盒p430-H1av-BGH插入EHV-1 RacH的orf1/3中的转移质粒pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH的质粒图及核苷酸序列。
H1av＝编码流感A病毒血凝素H1的开放阅读框
BGHpA＝牛生长激素聚A序列启动子aph＝原核卡那霉素抗性基因启动子
Kana＝卡那霉素抗性基因
侧翼B＝插入位点下游的重组区
侧翼A＝插入位点上游的重组区
p430＝新颖启动子p430
bp＝碱基对
图13.rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av的基因组的示意图式，其中放大orf1/3插入区。
Δorf1：插入位点上游的开放阅读框1的剩余部分；p430：本文所阐述的新颖启动子，例如参见实施例1；H1av：转基因流感病毒血凝素；BGHpA：牛生长激素多腺苷酸化序列；orf3：插入位点下游的开放阅读框3。
图14.感染展示表达转基因的rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av的细胞的蛋白印迹及免疫荧光。
H1av＝rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av
SE＝rEHV-RacH-SE(对照)
模拟＝未感染细胞(对照)
图15.rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3(rEHV-1-RacH-SE B)的基因组的示意图式，其中放大两个插入区。
Δorf1：插入位点上游的开放阅读框1的剩余部分；p430：新颖启动子；H1av：转基因流感病毒血凝素；BGHpA：牛生长激素多腺苷酸化序列；orf3：插入位点下游的开放阅读框3。
orf69：orf70中的插入位点上游的开放阅读框69；p455：新颖启动子；H3：转基因流感病毒血凝素；71pA：新颖多腺苷酸化序列；orf70：含有orf71(其编码结构病毒糖蛋白II(gpII))的启动子的orf70的剩余部分。
图16.蛋白印迹：感染rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3(B)、空载体rEHV-1 RacH-SE(SE)的细胞或模拟感染细胞(ctrl)的蛋白印迹。将重复印迹物与针对H3的商业兔超免疫血清(H3)、针对H1的商业兔超免疫血清(PA 34929)(H1)或针对EHV-1gpII(gpII)的单克隆抗体Ai2G7一起培育。
图17.在攻击之前及在攻击之后1、2及3天各组的平均体温。误差杠：标准偏差。在每一研究的日自左至右为：阴性对照组(neg.ctrl.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗一次的动物(1×EHV-1)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次(2×EHV-1)或使用灭活猪IAV疫苗两次(2×死疫苗)。
图18.在攻击之后一天及三天各组的平均肺评分。误差杠：标准偏差。阴性对照组(neg.ctrl.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗一次的动物(1×EHV-1)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次(2×EHV-1)或使用灭活猪IAV疫苗两次(2×死疫苗)。
图19.在攻击的日收集的针对猪IAV H3攻击株R452-14的动物血清的血清中和(SN)效价倒数。20：检测限值。阴性对照组(neg.ctrl.)、攻击对照组(chall.ctrl.)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗一次的动物(1×EHV-1)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次(2×EHV-1)或使用灭活猪IAV疫苗两次(2×死疫苗)。
图20.自在施加猪IAV攻击之后一或两天获取的BALF的IL-1β的结果。每一点代表针对一个动物测得的值。阴性对照组(Neg.Ctr.)、攻击对照组(Chall.Ctr.)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗一次的动物(1×EHV-1)、使用RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次(2×EHV-1)或使用灭活猪IAV疫苗两次(2×死疫苗)。
图21.来自在第2接种疫苗之后7天再刺激的PBMC的IFNγ-ELISpot的结果。(A)未接种疫苗对照组；(B)使用灭活猪IAV疫苗接种疫苗两次；(C)使用rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗一次；(D)使用rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次。对于使用rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3仅接种疫苗一次的动物而言，再刺激对应于第1接种疫苗之后7天。每一点代表针对一个动物在给定时间点且在使用特定刺激再刺激之后测得的值。对于再刺激而言，使用对应于rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3中的H3疫苗抗原的重组表达的猪IAVHA(HA_V)、对应于攻击株R452-14的H3的重组表达的猪IAV HA(HA_CH)、稀释HA_V及HA_CH的培养基(RPMI)、空EHV-1载体RacH-SE(EHV-1空)、疫苗RacH-SE-70-p455-H3(EHV-1-H3)、猪IAV H3N2攻击株R452-14(H3N2)、用于生长R452-14的来自未感染细胞的细胞上清液(MDCK)或重组表达的猪IAV核蛋白(NP)。
图22.转移质粒pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH的示意图
图23：转移质粒pU70-p455-H1pdm-71K71的示意图
图24：rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm(rEHV-1RacH-SE_D)的线性双链DNA基因组，其中放大orf1/3及orf70插入区
图25：感染rEHV-1 RacH-SE_B、RacH-SE_D、RacH-SE的细胞或未感染细胞(ctrl)的蛋白印迹。将重复印迹物与直接ed针对H3的多克隆兔超免疫血清(PA5-34930)、针对H1的多克隆兔超免疫血清(PA5-34929)或针对EHV-1糖蛋白II(gpII)的单克隆抗体(Ai2G7)一起培育。所有抗体皆产生预计图案，从而证实表达期望抗原H3及H1且针对不同病毒具有相当的复制效率，如自所有经感染细胞试样中的EHV-1gpII的极类似染色所判断。
图26：针对流感A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))或(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))的小鼠血清的平均中和能力的代表图。通过将血清稀释度倒数乘以所中和各别效价来计算中和能力。然后将三个测试的平均值除以100以反映100TCID50的中和。误差杠指示标准偏差。
图27：将猪IAV肺效价测定为TCID50/g肺组织(对于在攻击之后一天杀死的动物)。eg.ctrl.：阴性对照组；chall.ctrl.：攻击对照组；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。数据点指示针对个别动物所获得的平均值。中间水平线分别指示组平均值。上水平线及下水平线分别指示标准偏差。下文给出各组的成对统计学对比的p值且是分别通过t-测试使用Mann-Whitney测试及Windows软件7.02,GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA 92037,USA的GraphPad且使用标准软件设置来计算。
图28：将猪IAV肺效价测定为TCID50/g肺组织(对于在攻击之后三天杀死的动物)。eg.ctrl.：阴性对照组；chall.ctrl.：攻击对照组；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。数据点指示针对个别动物所获得的平均值。中间水平线分别指示组平均值。上水平线及下水平线分别指示标准偏差。下文给出各组的成对统计学对比的p值且是分别通过t-测试使用Mann-Whitney测试及Windows软件7.02,GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA 92037,USA的GraphPad且使用标准软件设置来计算。
图29：将猪IAV肺效价测定为TCID50/g肺组织(对于在攻击之后5天杀死的动物)。eg.ctrl.：阴性对照组；chall.ctrl.：攻击对照组；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。数据点指示针对个别动物所获得的平均值。中间水平线分别指示组平均值。上水平线及下水平线分别指示标准偏差。下文给出各组的成对统计学对比的p值且是分别通过t-测试使用Mann-Whitney测试及Windows软件7.02,GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA 92037,USA的GraphPad且使用标准软件设置来计算。
图30：来自猪免疫球蛋白G(IgG)针对重组表达的猪IAV血凝素H3抗原(与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源)的特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果。对于测试而言，使用100ng重组表达的H3涂覆每一孔。成对量测试样，自成对量测计算试样平均值，且分别自试样平均值计算组值。chall.ctrl.：攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。误差杠指示标准偏差。研究天数(SD)指示于图形右侧的图例中。
图31：来自猪免疫球蛋白G(IgG)针对重组表达的猪IAV血凝素H3抗原(与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源)的特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果。对于测试而言，使用100ng重组表达的H3涂覆每一孔。成对量测试样，自成对量测计算试样平均值，且分别自试样平均值计算组值。chall.ctrl.：攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。误差杠指示标准偏差。研究天数(SD)指示于图形右侧的图例中。
图32：来自干扰素γ-特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)的结果。自在研究第28天(SD28)自研究动物获取的血液纯化末梢血单核细胞(PBMC)。然后使用感染复数为1的H3N2猪IAV攻击株R452-14(H3N2MOI 1)或使用重组表达的猪IAV H3抗原(与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源)在1μg/ml(1μg/ml rH3)的浓度下再刺激PBMC。使用再刺激PBMC，实施干扰素γ-特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，且将所获得值归一化至10^6个细胞且分别计算为每组的平均值。chall.ctrl.：攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。误差杠指示标准偏差。
图33：干扰素γ-特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)的结果。自在研究第28天(SD28)自研究动物获取的血液纯化末梢血单核细胞(PBMC)。然后使用感染复数为1的H3N2猪IAV攻击株R452-14(H3N2MOI 1)或使用重组表达的猪IAV H3抗原(与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源)在1μg/ml(1μg/ml rH3)的浓度下再刺激PBMC。使用再刺激PBMC，实施干扰素γ-特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，且将所获得值归一化至10^6个细胞且分别计算为每组的平均值。chall.ctrl.：攻击对照组(用作阴性对照)；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。误差杠指示标准偏差。
图34：来自针对重组表达的猪IAV核蛋白(NP)的猪免疫球蛋白G(IgG)的特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)的结果。对于测试而言，使用100ng重组表达的NP涂覆每一孔。成对量测试样，自成对量测计算试样平均值，且分别自试样平均值计算组值。pos.ctrl.：阳性对照组；neg.ctrl.：阴性对照组；2×IM：经肌内接种疫苗两次的组；IN+IM：首先经鼻内且然后经肌内接种疫苗的组；2×IN：经鼻内接种疫苗两次的组。误差杠指示标准偏差。研究天数(SD)指示于图形右侧的图例中。
序列概述：
详述下列序列并揭示于本发明中：
启动子：
SEQ ID NO:1 EHV-4 600bp脱氧核糖核酸序列4pgG600
SEQ ID NO:2 EHV-4 600bp脱氧核糖核酸序列4pMCP600
SEQ ID NO:3 EHV-4 430bp脱氧核糖核酸序列p430
SEQ ID NO:4 EHV-4 449bp脱氧核糖核酸序列p455
SEQ ID NO:5 orf72的特异性引物1130号
SEQ ID NO:6 orf72的特异性引物1131号
SEQ ID NO:7 mCherry的特异性引物1079号
SEQ ID NO:8 mCherry的特异性引物1080号
插入位点：
SEQ ID NO:9 orf70插入区的人工序列核酸PCR引物1017
SEQ ID NO:10 orf70插入区的人工序列核酸PCR引物1018
SEQ ID NO:11 orf1/3插入区的人工序列核酸PCR引物1007
SEQ ID NO:12 orf1/3插入区的人工序列核酸PCR引物1008
SEQ ID NO:13左(Up70)侧翼区(417bp)
SEQ ID NO:14右(Up71)侧翼区(431bp)
SEQ ID NO:15野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)中位于核苷酸127264-127680处的左侧翼区(上orf70)
SEQ ID NO:16野生型EHV-1株ab4(Genbank登录号AY665713.1)中位于核苷酸128484-128913处的右侧翼区(上orf71)
SEQ ID NO:17 RED系统中的截短的侧翼区：左(Up70)侧翼区(283bp)＝与417bp“经典”侧翼区的3’283bp相同
SEQ ID NO:18 RED系统中的截短的侧翼区：右(Up71)侧翼区(144bp)＝与431bp“经典”侧翼区的5’144bp相同
SEQ ID NO:19野生型ab4(Genbank登录号AY665713.1)基因组序列中的缺失部分，nt 127681-128482
SEQ ID NO:20 RacH基因组序列中的缺失部分(不可获得nt编号，此乃因完全基因组序列未知)
质粒/载体序列：
SEQ ID NO:21转移质粒pU-mC70-BGH的核苷酸序列
SEQ ID NO.:22转移载体pU70-p455-71K71的核苷酸序列
SEQ ID NO.:23转移质粒pU70-p455-H3-71K71的核苷酸序列
SEQ ID NO.:24转移载体pU-1-3-p430-BGHKBGH的核苷酸序列
SEQ ID NO.:25转移质粒pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH的核苷酸序列
血凝素序列
SEQ ID NO:26血凝素[流感A病毒(A/猪/Italy/116114/2010(H1N2))]
Genbank：ADR01746.1H1pdm
SEQ ID NO:27血凝素[流感A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))]
Genbank：ABS50302.2H3:
SEQ ID NO:28血凝素[流感A病毒(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))]
Genbank：AFR76623.1H1av:
SEQ ID NO:29血凝素[流感A病毒(A/猪/Italy/4675/2003(H1N2))]
Genbank：ADK98476.1*H1hu
*氨基酸531(X(终止密码子)变为I)：
实施例
本发明包含下列实施例以证明本发明的优选实施例。熟习此项技术者应了解，下列实施例中所揭示的技术代表本发明者所发现在实践本发明中运行良好的技术，且由此可认为构成其实践的优选方式。然而，熟习此项技术者由本揭示应了解，可对所揭示特定实施例作多种改变且仍获得相同或类似结果，并不背离本发明的精神及范围。
实施例1：新颖插入位点ORF70的确立
为增强EHV-1载体的能力，本发明者试图发现自一个载体主链表达两种不同转基因而不需要两种转基因通过RNA病毒衍生的功能偶联在一个启动子控制下的方式。本发明者假设疱疹病毒基因组可耐受平行使用两个独立的转基因插入位点。为确定EHV-1ORF70是否是适宜转基因插入位点，通过经典同源重组使用编码自身荧光性mCherry蛋白(Shaner等人，2004)的表达盒代替orf70(1236bp)的5'端的801个碱基对(图1B)。质粒pU-mC70-BGH的图在图2(SEQUENCE ID NO.21)中。使用XbaI自pU-mC70-BGH切除用于同源重组的DNA片段。将凝胶纯化的片段与EHV-1 RacH的病毒基因组DNA共转染至RK13细胞中。通过活荧光及病毒滴定(未展示)来展示重组载体病毒的有效复活及在所培养细胞中的有效复制。缺失三分的二orf70具有另外益处，亦即消除由orf70编码的糖蛋白G的表达。EHV-1的糖蛋白G显示为抵抗宿主的免疫反应的非结构性分泌的趋化因子结合蛋白(Drummer等人，1998；Bryant等人，2003)。因载体疫苗旨在刺激接种者的免疫反应，故去除病毒载体的此特定免疫抑制功能可能另外改良病毒载体平台EHV-1 RacH-SE的性能。
实施例2：新颖启动子的鉴别及构建
鉴别适宜启动子序列的策略如下：首先通过与EHV-1基因组的各别序列片段进行对比来分析两个已知orf上游的EHV-4序列的600bp片段。所选基因是编码主衣壳蛋白(MCP)的orf42及编码糖蛋白G(gG)的orf70。主衣壳蛋白是病毒体中的最丰富组分的一且是在新合成病毒DNA准备包装后立即在细胞核中组装衣壳所需。其启动子由此预计在病毒复制周期的早期及后期较为活跃。对于糖蛋白G而言，已知其基因(orf70)亦在复制周期的早期及后期较为活跃(Colle等人，1995；Drummer等人，1998)。序列相同性为82.2％(对于假定MCP启动子)及82.3％(对于假定gG启动子)。所述差异可一方面视为足够大以防止同源重组，且另一方面足够小以容许EHV-1复制期间的转录活化。为测试启动子活性，合成600bp DNA片段4pgG600
GCAGACTTTGGAGCAGCACAATTTCCGGTTGTGGACCCCATGGACCTTGGTTTGGCTGGTACCGTGGAAACTAACGCTCCGGAAGTTTTGGCCAGAGCAAAATACAATTCGAAGGTAGACATATGGAGCGCCGGAATAGTTCTGTTTGAAATGCTCGCATATCCATCAACTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT(SEQ ID NO:1)
及4pMCP600
AGCTGGGGGAGTTTGTACTATAGTGTATTACATGCGGCTTGCAATAACTGCCTGGTTTATGTTTCGCAACATTCAAGCAGACATGCTACCGCTAAACACTTTGCAACAATTTTTTATTGGGTGTTTGGCCTTTGGTAGAACTGTCGCGTTTTTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA(SEQ ID NO:2)
且克隆于编码自身荧光性蛋白mCherry的报告基因上游(Shaner等人，2004)。对于转录终止信号及mRNA稳定功能而言，将牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA；Goodwin&Rottman,1992)克隆于紧接报告基因的3’端下游处。
为用作阳性对照，自市售质粒pcDNA3.1(Invitrogen)扩增CMV启动子且克隆于mCherry报告基因上游，此处亦将BGHpA添加至报告基因的3’端。使用三个质粒(pBlu-4pgGmCherry、pBlu-4pMCPmCherry及pBlu-CMVmCherry)转染细胞培养液且通过荧光显微术检查mCherry荧光。在转染之后的不同时间，CMV启动子具有显著强烈活性。4pgG600启动子在转染之后亦较为活跃，亦可检测4pMCP600启动子的活性，但其弱于4pgG600启动子，且即使在转染之后三天与CMV启动子进行比较时更甚。
为探究病毒基因产物对启动子活性的效应，在使用绿色荧光EHV-1RacHI-EF转染之后一天重复感染经pBlu-4pgG600-mCherry或pBlu-4pMCP600-mCherry转染的细胞培养液。病毒基因产物明显转活化4pMCP600启动子以使活性显著较于不存在EHV-1 RacHI-EF复制下。该效应亦存在于经pBlu-4pgG600-mCherry转染且使用EHV-1 RacHI-EF重复感染的细胞培养液中，但并不如此显著，此乃因在不存在病毒复制下的初始活性高于针对pBlu-4pMCP600-mCherry所观察。另外，对于两种600bp启动子而言，已证实病毒复制对细胞培养液中的其活性的转活化效应。
若600bp序列含有抑制组件(其通常位于活化组件上游)，则可阐释此效应。因此，较短启动子可在不存在病毒基因产物下更具活性。为测试此结论，将两种EHV-4启动子序列截短至其原始长度的大约75％且再次测试。
特定而言，将600bp启动子截短至430bp(对于4pgG，新颖名称：p430:TCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT(SEQ ID NO:3))
及449bp(对于4pMCP，新名称：p455:TTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA(SEQ ID NO:4))。
在细胞培养液中转染含有缩短启动子的mCherry-报告基因质粒且通过荧光显微术检查。尽管p430活性与600bp形式(4pgG600)相当，但p455的活性显著大于4pMCP600的活性。此结果与使用600bp形式的两种启动子的转染/重复感染实验的结果相同，亦即，在相同细胞中存在EHV-1复制提供关于以下的机制：4pMCP600启动子的转活化强烈增加其活性，而可看到4pgG600启动子的转活化，但较不明显。
除两种新颖启动子外，亦需要新聚A序列以进行来自新颖orf70插入位点的表达。该组件称为71pA。合成其核苷酸序列且克隆于含有靶向pRacH-SE中的orf70插入位点的p455的转移质粒中的mCherry orf下游。
接下来，生成rEHV-1 RacH-SE以分析病毒复制背景中的启动子活性(表1)。使用两种EHV-4启动子(p430及p455)、CMV启动子及小鼠巨细胞病毒IE1启动子(MCMV)来引导表达mCherry与BGH聚A信号的组合以增加mRNA稳定性。合成如由Dorsch-等人(1985)所阐述的MCMV IE1启动子(增强子)且克隆于自其亚克隆至转移质粒中的质粒载体中。另外，亦将p455克隆至orf70中的新颖插入位点中，从而取得表达mCherry与新颖聚A信号71pA的组合。作为另一对照，将rEHV-1 RacHmC70包含于实验中。经此重组病毒感染的细胞在内源性gG启动子(egGp)的控制下表达mCherry(表1)
表1
以m.o.i.1(感染复数)使VERO或PK/WRL细胞感染所有6种表达mCherry的病毒。在注射后0、4、8及12小时收集经感染细胞且制备总RNA。通过DNAse I消解破坏污染RNA制剂的病毒及细胞基因组DNA。通过以下方式来展示RNA完整性及病毒DNA去除：在添加及不添加逆转录酶下实施逆转录，随后使用编码EHV-1的必需结构糖蛋白D的orf72的特异性引物对(引物编号1130/1131,(TGTCTACCTTCAAGCTTATG(SEQ ID NO:5)/CTAGCGCAGTCGCGTTG(SEQ IDNO:6))实施PCR。仅自已添加逆转录酶的逆转录试样(cDNA)(具体而言是在t1＝注射后4h、t2＝注射后8h及t3＝注射后12h制得的试样)扩增预期196bp PCR产物，且并不自在t0＝注射后0h制得的试样扩增。尚未向反应中添加逆转录酶的所有试样皆不产生任一预期PCR产物。因此，其展示，用作qPCR模板的试样(cDNA)不含病毒基因组DNA。
然后通过qPCR使用mCherry的特异性引物(引物编号1079/1080,(GCGAGGAGGATAACATGG(SEQ ID NO:7)/ACCCTTGGTCACCTTCAG(SEQ ID NO:8))及orf72引物对1130/1131(TGTCTACCTTCAAGCTTATG(SEQ ID NO:5)/CTAGCGCAGTCGCGTTG(SEQ ID NO:6))来分析使用所添加酶自逆转录所获得的cDNA。使用orf72qPCR的Ct(循环临限值)值来评价不同病毒感染平行试验的可比性且归一化用于mCherry qPCR的Ct值。因此，相对于感染后时间及不同病毒来量化mCherry的转录(图3)。
如图3a所展示，对于6种不同病毒而言，orf72转录物在感染之后4个不同时间的Ct值接近相同。理想地，所有6种病毒将在所探究时间下产生相同值且仅可看到一条线。接近相同的线证实实验的充分质量，另外，p.i.(注射后)12h时间的结果是有效的，此乃因与注射后8h相比的降低指示转录物数量的进一步增加，此仅可发生于复制尚未通过其最大值时。计算注射后每一时间的统计学平均值。将每一病毒在某一时间下的值除以针对该时间所计算的平均值且用作因子，使用该因子将mCherry qPCR的Ct值归一化以使其直接可比。mCherry qPCR的归一化Ct值以图形发生展示于图3b中的右图中。线分散指示在不同病毒感染细胞中产生的mCherry转录物的数量的差异。
在不同类型的图形中，组合两个实验(一个使用VERO-EU细胞(V)且一个使用PK/WRL细胞(P))(图4)。如上所述通过使用及不使用逆转录酶进行逆转录、随后使用orf72引物实施PCR来证实RNA制剂的质量及随时间而变化的病毒复制。如上所述基于orf72的qPCR Ct值将针对mCherry所获得的qPCR Ct值归一化。自t0的归一化Ct值扣除t1＝注射后4h、t2＝注射后8h及t3＝注射后12h的归一化Ct值(Δ归一化Ct)，从而得到与转录活性的正关联。
尽管不能直接比较VERO(V)或PK/WRL(P)细胞中的两个实验，但PK/WRL细胞中的较高表达程度最可能反映PK/WRL细胞对EHV-1复制的优良允许性，其通常产生10倍高的感染性病毒的效价。
尽管EHV源启动子p430、p455及egGp的活性针对所用细胞是在各别注射后时间几乎相同，且不论其插入位点或所用poly A(BGH或71pA)如何，CMV-及MCMV启动子在PK/WRL细胞中的活性较高。在VERO-EU细胞中，仅MCMV启动子展示具有较高活性，CMV启动子并不优于EHV启动子。
自所述实验可推断出，EHV-4启动子p430及p455适用于EHV-1 RacH主链中以驱使表达来自orf1/3及orf70插入位点的插入转基因。
实施例3：重组EHV-1载体疫苗中新颖p455启动子的使用及重组病毒的构建
p455启动子：
对于第一动物实验而言，使用来自猪源流感A病毒(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)，Genbank登录号ABS50302.2，SEQ ID NO:27)的流感血凝素亚型H3。合成其编码序列并亚克隆至转移载体pU70-p455-71K71(图5)中，从而生成转移载体pU70-p455-H3-71K71，其中将H3置于新颖p455启动子及新颖71pA多腺苷酸化信号的控制下且使用重组区构造盒以用于插入orf70中(图6)。
通过使用RED重组系统的进行中诱变(Tischer等人，2006)，将表达盒p455-H3-71插入pRacH-SE的orf70中以生成pRacH-SE70-p455-H3(图7)。
使用pRacH-SE70-p455-H3转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3复活且进行斑块纯化两次。通过对插入区的高保真度PCR产物的测序来验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA，图8)分析转基因在感染细胞中的表达。
使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未展示)及蛋白印迹(图9)证实编码EHV-1gpII的orf71的恢复。通过使用鸡红细胞(未展示)的血细胞吸附测试分析感染细胞的质膜上的H3的三聚体的外观。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒rEHV-1 RacH-SE的效价在相同范围内，此指示该转基因表达对病毒复制没有有害效应(未展示)。此是通过使rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL细胞中传代直至复活后第20代(P20)来证实。在P5、P10、P15及P20，通过滴定、测序及蛋白印迹(图9)表征病毒，在P10及P20，另外通过IFA表征病毒，且证实HA编码插入物以及启动子及聚A序列的HA表达及遗传稳定性。
图9中所展示的两个印迹是与具体而言检测EHV-1糖蛋白II(gpII)的单克隆抗体Ai2G7(左)或与抵抗流感血凝素亚型H3的兔(PA5-34930)的商业多克隆抗体(右)一起培育的复制物。如所预计，在经重组EHV-1感染的所有细胞培养液中皆检测到gpII。如所预计，在所有感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的不同传代的细胞中皆检测到全长H3。H3-抗血清的特异性展示于相同蛋白印迹中，参见泳道gG430mC。如所预计，此处仅gpII细胞产生反应，而抗H3抗体在各别复制泳道中并不结合。
通过使用单克隆抗H3抗体及马抗EHV抗血清的经P20感染的细胞中的病毒斑块的双重免疫荧光分析(dIFA)，可证实实际上所有EHV-1诱导的斑块皆亦表达H3(未展示)。所有测试皆证实重组EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的稳定性。
实施例4：使用p455启动子的概念验证动物研究(POC I)及血清学反应的评价：
测试动物：纳入准则及实验设计：
将10只天生流感A的仔猪(首次实验的母猪)的五组包含于POC-I研究中，如表2中所概述。
表2
将1×107TCID50的感染剂量的rEHV-1 RacH-70-p455-H3(EHV-1)在5周龄施加一次或在2周龄及5周龄施加两次。出于对比，将市售灭活疫苗(Inact)在2周龄及5周龄施加两次。为不消除灭活疫苗(Inact)的效应，所有仔猪皆不含母源抗体。两组未接种疫苗，但接受生理学氯化钠溶液(NaCl)的注射，其分别用作攻击对照或严格阴性对照。在第二接种疫苗之后21天，除严格阴性对照组外的所有组皆经1×107TCID50的异源性流感A(IAV)株(来自猪R452-14的H3N2流感A病毒，由BI拥有的攻击分离物)攻击。尽管在未接种疫苗的攻击对照组(Chall ctrl)中，所有猪在攻击感染之后1天及3天皆在其肺中具有高流感病毒效价，但严格阴性对照组(neg ctrl)及经rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次(EHV 2×)的组中的所有猪在此两天中皆对IAV呈阴性。在灭活对照疫苗(Inact 2×)接种疫苗两次的组中，五只动物中的一只在攻击之后第3天具有低IAV效价。在攻击之前21天经rEHV-1 RacH-SE-70-455-H3接种疫苗一次(EHV 1×)的组中，五只动物中的两只在攻击感染之后1天且五只中的一只在攻击之后3天在其肺中具有低IAV效价。(图10)。
使用1×107TCID50的rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接种疫苗两次可完全保护猪免于异源性IAV、亚型H3N2的攻击感染。其可证实EHV-1载体RacH-SE适于猪的疫苗接种，且新颖启动子455在驱动疫苗接种的猪中的IAV血凝素的免疫原性表达中发挥作用。
实施例5：重组EHV-1载体疫苗中新颖p430启动子的使用及重组病毒的构建
p430启动子：
使用新鉴别p430启动子来驱动表达来自H1N1病毒((A/猪/Gent/132/2005(H1N1)，Genbank登录号：AFR76623.1，SEQ ID NO:28)的另一流感血凝素。由于此病毒分离物中的血凝素基因是来自“禽类”型IAV的猪IAV，故其将称为H1av。合成H1av且亚克隆于orf1/3插入区的转移载体pU1/3-p430-BGH_K_BGH中(图11)以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH。将H1av的表达置于p430启动子及牛生长激素(BGH)聚A信号的控制下(图12)。
通过使用RED重组系统的进行中诱变(Tischer等人，2006)，将表达盒p430-H1av-BGH插入pRacH-SE的orf1/3中以生成pRacH-SE1/3-p430-H1av(图13)。
使用pRacH-SE1/3-p430-H1av转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1RacH-SE1/3-p430-H1av复活且进行斑块纯化两次。通过对插入区的高保真度PCR产物的测序来验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA)及蛋白印迹使用市售单克隆及多克隆抗体分析转基因在经感染细胞中的表达(图14)。
使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA及蛋白印迹证实编码EHV-1gpII的orf71的恢复(未展示)。通过使用鸡红细胞(未展示)的血细胞吸附测试分析H1av的正确处理及转运及经感染细胞的质膜中的定位。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒RacH-SE的效价在相同范围内，此指示该转基因表达对病毒复制没有有害效应(未展示)。
通过抗体PA-34929在75kDa迁移的宽带的特异性检测与自其序列预测的重组HA糖蛋白的预期外观相同。经单克隆抗体C102的细胞膜表观染色符合如所预计的亚细胞定位(图14)。
为测试经表达重组血凝素是否如预计经处理及转运，使用rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE(亲代)以0.01的m.o.i.感染VERO细胞，或未经感染。在培育之前24h，将活的经感染及未经感染的细胞与鸡红细胞于PBS中的悬浮液一起培育，使用PBS洗涤并使用荧光Hoechst 33342核染色剂染色。因禽类红细胞含有细胞核，故可经Hoechst33342染色且通过荧光显微术表达为微小蓝斑，与不表达血凝素的rEHV-1 RacH-SE感染的细胞相比，在rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1RacH-SE-70-p455-H3感染的细胞上，鸡红细胞的吸附显著增加(未展示)。自其可推断出，将血凝素以如同其是通过真正的流感病毒感染所产生一样的方式翻译、处理并转运至载体病毒感染细胞的质膜上。
感染细胞的血细胞吸附的清晰表型支持蛋白印迹及免疫荧光分析的发现，从而展示转基因蛋白的有效表达并表明在EHV-1载体感染细胞的细胞表面上形成功能性HA三聚体。
实施例6：两种新颖启动子p455及p430在重组EHV-1载体疫苗中于两个插入位点中的平行使用
为展示两种新颖启动子可平行使用，生成表达两种不同流感A病毒亚型的两种不同血凝素的重组EHV-1 RacH。
通过经单次插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染的感染细胞的蛋白印迹验证多克隆商业抗体对H3(PA5-34930)及H1(PA5-34929)的特异性及无交叉反应性(未展示)。
自重组BAC pRacH-SE-70-p455-H3开始，通过两步RED重组将组装于转移载体pU1/3-p430-H1av-BGHKBGH(图12)中的表达盒p430-H1av-BGH插入orf1/3插入位点中以生成pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。使用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3转染PK/WRL细胞，并使重组病毒rEHV-1RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3复活并进行斑块纯化两次(图15)。
此重组病毒的简称为rEHV-1 RacH-SE_B。通过对插入区的高保真PCR产物与侧翼序列一起测序来验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA，未展示)及蛋白印迹使用市售单克隆及多克隆抗体(图16)分析转基因在感染细胞中的表达。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未展示)及蛋白印迹(图16)证实编码EHV-1gpII的orf71的恢复。
如图16中所展示，两种转基因H3及H1av在经双重插入重组rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3感染的细胞培养液中平行表达。转基因表达是稳定的且不损害在PK/WRL细胞中直到第11代测试的病毒效价(未展示)。
两种新颖启动子p430及p455在细胞培养液中的rEHV1-RacH复制的背景中展示功能性。病毒复制周期期间的活性程度似乎与自活体外启动子动力学实验所推断非常相似。所述性质容许基于以类似效率平行表达两种不同抗原的EHV-1 RacH或其他载体平台来产生重组载体疫苗。若疫苗靶是由两种不同病原体组成，则在与两个多腺苷酸化序列组合的两个插入位点中施加两种新颖启动子可显著降低物品成本且明显优于仅表达一种抗原性组分的载体。
实施例7：用于猪的单价EHV-1载体装载的流感A病毒疫苗(H3疫苗)的生成、活体外表征及活体内测试
选择血清型H3的猪IAV流感病毒血凝素(SEQ ID NO 27)(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2)，Genbank登录号：ABS50302.2)作为拟测试的抗原用于猪中的接种疫苗研究。此针对猪IAV的新颖疫苗提供DIVA特征，例如通过在由猪IAV野生株感染的动物中、而非仅经本文所阐述疫苗接种疫苗的动物中检测到针对猪IAV蛋白NP或NA的抗体，此乃因其仅表达一种猪IAV HA蛋白。合成其编码序列并亚克隆，从而生成转移载体pU70-p455-H3-71K71，其中将H3置于新颖p455启动子及新颖71pA多腺苷酸化信号的控制下并使用重组区构造盒以用于插入orf70中(图1B)。
通过使用RED重组系统的进行中诱变，将表达盒p455-H3-71插入pRacH-SE的orf70中以生成pRacH-SE70-p455-H3。
使用pRacH-SE70-p455-H3转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3复活且进行斑块纯化两次(图7)。
通过对插入区的高保真度PCR产物的测序来验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA，图8)及蛋白印迹(图9)使用市售单克隆及多克隆抗体分析转基因在感染细胞中的表达。
使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未展示)及蛋白印迹(图9)证实编码EHV-1gpII的orf71的恢复。通过使用鸡红细胞(未展示)的血细胞吸附测试分析感染的质膜上的H3的三聚体的外观。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒RacH-SE的效价在相同范围内，此指示该转基因表达对病毒复制没有有害效应(未展示)。此是通过使rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL细胞中传代直至复活后第20代(P20)来证实。在P5、P10、P15及P20，通过滴定、测序及蛋白印迹(图9)表征病毒，在P10及P20，另外通过IFA表征病毒，且证实HA编码插入物以及启动子及聚A序列的HA表达及遗传稳定性。
图9中所展示的两个印迹是与具体而言检测EHV-1糖蛋白II(gpII)的单克隆抗体Ai2G7(左)或与抵抗流感血凝素亚型H3的兔(PA5-34930)的商业多克隆抗体(右)一起培育的复制物。如所预计，在经重组EHV-1感染的所有细胞培养液中皆检测到gpII。如所预计，在所有感染rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的不同传代的细胞中皆检测到全长H3。亦通过经表达H1亚型病毒的流感血凝素的其他重组EHV-1 RacH-SE感染的细胞的蛋白印迹展示H3-抗血清的特异性，参见下文(图16)。
通过使用单克隆抗H3抗体及马抗EHV抗血清的经P20感染的细胞中的病毒斑块的双重免疫荧光分析(dIFA)，可证实实际上所有EHV-1诱导的斑块皆亦表达H3(未展示)。所有测试皆证实重组EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3的稳定性。
为探究rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3在幼小仔猪中作为载体疫苗的性质，在接种疫苗-攻击研究中对其进行测试。详细而言，在2及5周龄时(双注射接种疫苗，2×EHV-1)或仅在5周龄时(单注射接种疫苗，1×EHV-1)使用含有1×10^7TCID50的剂量的RacH-SE-70-p455-H3的细胞培养上清液对针对猪IAV无母源免疫性(非母源抗体)的仔猪进行两次肌内接种疫苗。未接种疫苗的组用作阴性对照且在2及5周龄时根据制造商说明书(除接种疫苗的时间点)经市售灭活猪IAV疫苗接种的一组动物用作阳性对照(死)。在8周龄时，通过1×10^7TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击株(欧洲野生病毒分离物R452-14，其H3与RacH-SE-70-p455-H3中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未疫苗接种且未经攻击的动物用作阴性对照，而未疫苗接种但经攻击的动物用作攻击对照。在接种疫苗时及之后及在攻击之前及之后，量测体温并在不同时间点获取血样。在攻击之后一天，每组的一半动物被杀死且针对猪IAV感染典型病灶对肺进行评分，每只动物分别获取每个左肺及右肺的三个肺试样以测定肺均质物中的感染性猪IAV效价，且对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行采样。在攻击之后3天，对每组的其余一半动物实施相同程序。
在探究猪IAV攻击病毒施加之后的体温升高时，未疫苗接种的动物展示在攻击之后1天约1℃的体温升高。对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗两次的组，防止攻击后1天的此体温增加(图17)。
来自在猪IAV攻击病毒施加之后1或3天杀死的动物的肺评分的评价揭示，阴性对照不展示猪IAV感染的典型肺病灶，攻击对照展示在6-7％的平均范围内的肺病灶，且就组平均值而言，对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗两次的组而言，肺病灶评分显著降低至1％至小于4％(图18)。
来自在猪IAV攻击病毒施加之后1或3天杀死的动物的平均猪IAV肺效价展示阴性对照在肺试样中不展示猪IAV，而攻击对照展示每g肺组织的病毒效价在超过5log(第3天)至超过7log(第1天)范围内。形成鲜明对比的是，对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗一次的组，组平均值显著降低至约2log或更少，并且对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗两次的组而言降低至不可检测的含量(图10)。
在测试接种疫苗之后猪IAV中和抗体的诱导时，在首次疫苗接种之后3周，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗一次的动物的血清展示在约160范围内的中和效价倒数，且在第2次接种疫苗之后3周，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗两次的动物的血清展示约2560的中和效价，而未疫苗接种的组的血清具有不可检测的猪IAV中和抗体含量(图19)。
在猪IAV攻击之后1或3天测定来自动物的BALF中促炎细胞因子IL-1β的量时，在第1天测试的四只动物的三只中可检测到超过100pg/ml至高达900pg/ml的IL-1β含量，而对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗一次的动物的BALF而言，所述含量降低至100-300pg/ml IL-1β，且对于经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗两次的所有动物而言，甚至进一步降低至0pg/ml至小于100pg/ml IL-1β的含量(图20)。此展示在猪IAV感染之后，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗可有效防止促炎细胞因子IL-1β的诱导。
在测试在研究第28天采样并使用不同刺激的外周血单核细胞(PBMC)的再刺激时，未经接种疫苗的动物的PBMC的刺激在IFNγ-ELISpot中展示小于75/1×10^6计数，而与所用刺激无关(图21A)。已接受两次灭活疫苗(死)的动物的PBMC在经重组猪IAV核蛋白NP再刺激时展示约150/1×10^6计数，且在经猪IAV H3N2攻击株R452-14再刺激时在IFNγ-ELISpot中展示约3000/1×10^6计数，但在使用重组猪IAV HA或EHV-1病毒时不展示PBMC的再刺激(含量为75/1×10^6计数或更低)(图21B)。与的相比，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗一次或两次的动物在经猪IAV H3N2攻击株R452-14再刺激时亦在IFNγ-ELISpot中展示约200(1×EHV-1)至300(2×EHV-1)/1×10^6计数，但在使用重组猪IAV NP时不展示PBMC的再刺激(含量为75/1×10^6计数或更低)(图21C及D)。分别地，在使用EHV-1病毒进行再刺激时，经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗一次或两次的动物在经空EHV-1疫苗RacH-SE再刺激时在IFNγ-ELISpot中展示约300/1×10^6计数，且在使用表达猪IAV H3的RacH-SE-70-p455-H3疫苗时，此值进一步增加至超过400/1×10^6计数(图21C及D)。因此，在使用重组猪IAV HA进行再刺激时，仅经RacH-SE-70-p455-H3疫苗接种疫苗一次或两次的动物在IFNγ-ELISpot中展示约100-150(1×EHV-1)至150-200(2×EHV-1)/1×10^6计数(图21C及D)。
实施例8用于猪的四价EHV-1载体装载的流感A病毒疫苗的生成、活体外表征及活体内测试
如下文所述，在所阐述发明中，源自H1N2、H3N2、H1N1禽类及H1N1大流行猪IAV亚型/血清型的四种上述猪IAV血凝素(HA)抗原由两种重组EHV-1载体病毒表达。此针对猪IAV的新颖四价疫苗提供DIVA特征，例如通过在由猪IAV野生株感染的动物中、而非仅经本文所阐述疫苗接种疫苗的动物中检测到针对猪IAV蛋白NP或NA的抗体，此乃因其仅表达猪IAVHA蛋白。
在活体外表征新颖四价猪IAV疫苗且在活体内测试其针对猪IAV的效能。
使用新鉴别p430启动子来驱动猪IAV H1N1((A/猪/Gent/132/2005(H1N1)，Genbank登录号：AFR76623.1)的表达。由于此病毒分离物中的血凝素是源自禽类IAV，故其将称为H1av。合成H1av并将其亚克隆至转移载体中用于orf1/3插入区以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH。将H1av的表达置于p430启动子及牛生长激素(BGH)多A信号的控制下并使用重组区构造以用于插入orf1/3中(图12)。
通过使用RED重组系统的进行中诱变，将表达盒p430-H1av-BGH插入pRacH-SE的orf1/3中以生成pRacH-SE1/3-p430-H1av。使用pRacH-SE1/3-p430-H1av转染PK/WRL细胞，使重组病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av(图13)复活且进行斑块纯化两次。通过对插入区的高保真度PCR产物的测序来验证表达盒的正确插入。通过间接免疫荧光分析(IFA)及蛋白印迹使用市售单克隆及多克隆抗体分析转基因在经感染细胞中的表达(图14)。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA及蛋白印迹证实编码EHV-1gpII的orf71的恢复(未展示)。通过使用鸡红细胞(未展示)的血细胞吸附测试分析H1av的正确处理及转运及感染细胞的质膜中的定位。在PK/WRL细胞中以TCID50/ml测定的峰值效价与亲代病毒RacH-SE的效价在相同范围内，此指示该转基因表达对病毒复制没有有害效应(未展示)。
通过抗体PA-34929在75kDa迁移的宽带的特异性检测与自其序列预测的重组HA糖蛋白的预期外观相同。经单克隆抗体C102的细胞膜表观染色符合如所预计的亚细胞定位。
为测试经表达重组血凝素是否如预计经处理及转运，使用rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE(亲代)以0.01的m.o.i.感染VERO细胞，或未经感染。在培育之前24h，将活的经感染及未经感染的细胞与鸡红细胞于PBS中的悬浮液一起培育，使用PBS洗涤并使用荧光Hoechst 33342核染色剂染色。因禽类红细胞含有细胞核，故可经Hoechst 33342染色且通过荧光显微术表达为微小蓝斑，与不表达血凝素的rEHV-1 RacH-SE感染的细胞相比，在rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1RacH-SE-70-p455-H3感染的细胞上，鸡红细胞的吸附显著增加(未展示)。由此可推断出，将血凝素以如同其是通过真正流感病毒复制所产生一样的方式翻译、处理并转运至载体病毒感染细胞的质膜上。感染细胞的血细胞吸附的表型支持蛋白印迹及免疫荧光分析(对于H1av，图14)的发现，从而展示转基因蛋白的有效表达并表明在EHV-1载体感染细胞的细胞表面上形成功能性HA三聚体。
通过经单次插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染的感染细胞的蛋白印迹验证多克隆商业抗体对H3(PA5-34930)及H1(PA5-34929)的特异性及无交叉反应性(未展示)。
接下来，生成表达两种不同流感A病毒亚型/血清型的两种不同血凝素的重组EHV-1 RacH-SE。
以重组BAC pRacH-SE-70-p455-H3开始，通过两步RED重组将组装于转移载体pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH(图12)中的表达盒p430-H1av-BGH插入orf1/3插入位点中以生成pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。使用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3转染PK/WRL细胞，并使重组病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3复活并进行斑块纯化两次。此重组病毒的简称为rEHV-1 RacH-SE_B(图15)。通过对插入区的高保真PCR产物与侧翼序列一起测序来验证表达盒的正确插入。
通过间接免疫荧光分析(IFA，未展示)及蛋白印迹使用市售单克隆及多克隆抗体(图16)分析转基因在感染细胞中的表达。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未展示)及蛋白印迹(图16)证实编码EHV-1gpII的orf71的恢复。
两种转基因H3及H1av在经双重插入重组rEHV-1 RacH-SE_B感染的细胞培养液中平行表达。转基因表达是稳定的且不损害在PK/WRL细胞中直到第11代测试的病毒效价。
具有两个插入位点及两个新颖启动子的增强的EHV-1载体展示平行表达两种流感病毒血凝素。如通过IFA测定的亚细胞定位及如通过蛋白印迹测定的SDS-PAGE中的迁移率对应于自文献已知的流感A病毒感染细胞中表达的真正的血凝素。
接下来，生成表达血凝素H1hu(SEQ ID NO:29，A/猪/Italy/4675/2003(H1N2)；Genbank登录号ADK98476.1))及H1pdm(SEQ ID NO:26，A/猪/Italy/116114/2010(H1N2)；Genbank登录号ADR01746.1)的第二双重插入rEHV-1 RacH。
合成H1hu的编码序列并亚克隆至转移载体中用于orf1/3插入区以生成pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH。将H1hu的表达置于p430启动子及牛生长激素(BGH)聚A信号的控制下并使用重组区构造以用于插入orf1/3中(图22)。
合成H1pdm的编码序列并亚克隆，从而生成转移载体pU70-p455-H1pdm-71K71，其中将H1pdm置于新颖p455启动子及新颖71pA多腺苷酸化信号的控制下并使用重组区构造盒以用于插入orf70中(图23)。
随后，通过使用RED重组系统的进行中诱变将表达盒p430-H1av-BGH及p455-H1pdm-71插入pRacH-SE中，从而首先生成pRacH-SE-1/3-p430-H1hu。使用此经修饰的BAC作为靶，通过使用RED重组系统的进行中诱变插入p455-H1pdm-71，从而生成pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm。在PK/WRL细胞中转染pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm并使rEHV-1RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm复活并进行斑块纯化三次。新颖重组载体病毒的简称为rEHV-1 RacH-SE_D(图24)。
通过间接免疫荧光分析(IFA，未展示)及蛋白印迹使用市售单克隆及多克隆抗体(图25)分析转基因在感染细胞中的表达。使用单克隆抗体Ai2G7(由BI拥有)，通过IFA(未展示)及蛋白印迹(图25)证实编码EHV-1gpII的orf71的恢复。
通过在细胞培养液中传代、每5代测定病毒效价来展示重组rEHV-1的遗传及表型稳定性。每10代证实插入区的序列，且通过蛋白印迹法(未展示)证实转基因表达。通过在覆盖下斑块的双重IFA、对经抗EHV-抗体及转基因特异性抗体染色的斑块进行计数来评价表达保真度(未展示)。
为探究由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗在幼小仔猪中作为载体疫苗的性质，在疫苗接种-攻击研究中对其进行测试。详细而言，在1及4周龄时(双注射接种疫苗，2×EHV-1)或在仅4周龄时(单注射接种疫苗，1×EHV-1)使用每个疫苗株1×10^7TCID50的剂量的rEHV-1RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D对针对猪IAV具有母源免疫性(对母源抗体呈阳性)的仔猪进行两次肌内接种疫苗。未疫苗接种组用作阴性对照。在11周龄时，通过1×10^6TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击株(欧洲野生病毒分离株R452-14，其H3与rEHV-1 RacH-SE_B中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未疫苗接种且未经攻击的动物用作阴性对照，而未疫苗接种但经攻击的动物用作攻击对照。在接种疫苗时及之后及在攻击之前及之后，量测体温并在不同时间点获取血样。在攻击之后一天，每组的一半动物被杀死且针对猪IAV感染典型病灶对肺进行评分，每只动物分别获取每个左肺及右肺的三个肺试样以测定肺均质物中的感染性猪IAV效价，且对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行采样。在攻击之后3天，对每组的其余一半动物实施相同程序。分析试样物质及收集的数据以尤其测定攻击之后的体温变化、猪IAV感染之后的临床征象、肺评分、猪IAV肺效价、肺组织的组织学变化、猪IAV血清中和效价、BALF中的细胞因子含量、如通过IFNγ-ELISpot所量测的PBMCS的再刺激以及B细胞活化。
实施例9经二价rEHV-1 RacH载体疫苗接种疫苗的小鼠中针对两种抗原的中和抗体反应的诱导
使用rEHV-1 RacH SE B(rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-7-p455-H3，参见图15)来对Balb/c小鼠实施免疫以证实，经表达转基因在除猪外的另一物种中具有免疫原性且通过鼻内施加针对两种抗原中的一者诱导中和抗体。
详细而言，在研究第0及21天向三组3-5周龄的Balb/c小鼠(每组5只)分别经鼻内接种40μl rEHV-1 RacH SE B(rEHV-1 RacH-SE-1/3-430-H1av-7-455-H3，组1)或40μl空载体(rEHV-1 RacH-SE，组2，载体对照)或40μl组织培养基(组3，阴性对照)。对于组1及组2而言，感染性重组EHV-1剂量分别为1×10^5TCID50/40μl。在研究第0天(在首次接种之前)、第7、14、21天(在第2次接种之前)、第28天及第35天将小鼠放血。自血样制备血清并于-80℃下冷冻储存。
用于检测针对载体病毒的抗体的免疫荧光分析
将AI-ST细胞以0.001的感染复数(MOI)使用rEHV-1 RacH-SE1212(一种自空载体BAC pRacH-SE1.2复活的病毒)感染。在培育之前24小时，观察到特异性斑块且对细胞进行处理用于间接免疫荧光分析(IFA)。测试在PBS中1:50稀释的所有三组最终出血(在第二接种疫苗之后14天获得)的血清。作为阳性对照，经EHV-1接种疫苗的马的血清是以1:500的稀释度使用。二级抗体对于小鼠血清是市售FITC偶联的兔抗小鼠IgG且对于马血清是Cy5偶联的山羊-抗马IgG且是以1:200稀释度使用。通过荧光显微术评估抗体结合。所有经接种疫苗的小鼠皆在IFA中利用rEHV-1 RacH-SE感染的细胞发生抗体反应性。未感染细胞不由任何测试血清结合。来自小鼠的阴性对照组的血清不展示针对经感染细胞或未感染细胞的任何特异性结合。数据概述于下表中。
表3.抗EHV-1抗体的IFA的荧光显微术结果
自此可推断出，将rEHV-1接种至小鼠的鼻孔中导致感染及病毒复制，从而刺激小鼠免疫系统以产生抗EHV-1抗体。
病毒中和测试
为展示针对源自流感A病毒(IAV)(A/猪/Italy/7680/2001(H3N2))或(A/猪/Gent/132/2005(H1N1))的表达的转基因的保护性免疫性的诱导，测试小鼠血清针对各别病毒的中和活性(Allwinn等人，2010；Trombetta等人，2014)。用于中和测试的IAV是来自2014年德国的猪的分离物，具体而言是A/猪/Germany/AR452/2014(H3N2)及A/猪/Germany/AR1181/2014(H1N1)。因所述分离株与疫苗靶源自的株异源，故所述病毒由小鼠血清的任何中和将指示通过rEHV-1接种疫苗广泛且有效地诱导保护性免疫。作为阴性对照血清，使用已展示对流感病毒抗体呈阴性的猪的血清。
流感A病毒中和测试(VNT)：
在使用之前，将用于病毒中和以及反滴定的MDCK细胞在96孔板中于37℃/5％CO2下培育2天。将各别IAV储备液H3N2及H1avN1在冰上解冻并稀释于含有庆大霉素(Gentamycin)及双倍浓度的胰蛋白酶(MEM/Genta/2×胰蛋白酶)的MEM中。
所测试血清是来自组1(rEHV-1 RacH SE B)、组2(空载体)、阳性对照(经灭活多价IAV疫苗接种疫苗的猪的血清)及阴性对照的最终出血。
将血清热灭活，且分别在两个及三个独立试验中1:2连续稀释，以1:16开始直至1:4096。将IAV稀释至约100TCID50/中和反应。将中和反应液在37℃、5％CO2下培育2小时。所用病毒的反滴定是一式四份进行。去除生长培养基，且然后使用含有庆大霉素及胰蛋白酶的培养基洗涤MDCK细胞，然后添加中和反应液或反滴定的病毒稀释液。在分别向MDCK-细胞添加中和反应液或病毒稀释液之后，将VNT及滴定板在37℃/5％CO2下培育1h。然后，取出接种物并使用含有庆大霉素及胰蛋白酶的新鲜培养基覆盖细胞。在培育之后5天，监测并记载CPE。根据Reed及Münch将测试中实际使用的病毒效价计算为TCID50/ml，且报告测试血清防止流感病毒典型CPE的诱导的稀释度，参见下表。
表4：流感H1avN1VNT的结果
表5：流感H3N2VNT的结果
为比较独立测试的结果，通过将血清稀释度倒数乘以由其中和的各别效价来计算中和能力。然后将三个测试的平均值除以100以反映100TCID50的中和(表3、4及5)。数据概述且以图解方式展示于图26中。
所有经rEHV-1 RacH SE B接种疫苗的小鼠皆针对各别IAV(亦即亚型H3N2及H1avN1的异源性株)产生中和抗体。因此，在p455启动子(H3)控制下自orf70插入位点及在p430启动子(H1av)控制下自orf1/3插入位点平行表达IAV的血凝素的rEHV-1 RacH-SE的两倍鼻内施加成功地刺激BALB/c小鼠中的保护性免疫反应。
可推断出，载体rEHV-1 RacH-SE可用于两种不同转基因的平行表达以刺激鼻内接种疫苗后的免疫反应。
实施例10仔猪中针对猪IAV H3N2攻击的由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗的效能
为探究由rEHV-1 RacH-SE_B(rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3，参见图15)及rEHV-1 RacH-SE_D(rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm，参见图24)组成的四价猪IAV疫苗在幼小仔猪中作为载体疫苗的性质，在第二接种疫苗-攻击攻击研究中对其进行测试。
在此第二研究中，将来自未接种疫苗的母猪及在首次接种疫苗时通过使用H3特异性ELISA(图30)及通过病毒中和测试(数据未展示)经血清学测试对于猪IAV特异性抗体呈阴性的仔猪使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价疫苗接种疫苗两次。分别在生命的第一周(研究第0天，SD0)对动物进行首次接种疫苗且在其生命的第4周(研究第21天，SD21)进行第二次接种疫苗，其中以肌内方式且然后以肌内方式进行(2×IM)，或首先以鼻内方式且然后以肌内方式进行(IN+IM)，或以鼻内方式进行两次(2×IN)，剂量为1×10^7TCID50，每一疫苗株、动物及疫苗接种分别使用2ml剂量。一未接种疫苗的组用作阴性对照且另一未接种疫苗的组用作攻击对照。在生命的第7周(研究第69或70天，SD42/43)，通过2×10^7TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击株(欧洲野生病毒分离物R452-14，其H3与rEHV-1 RacH-SE_B中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未接种疫苗且未经攻击的动物用作阴性对照(neg.ctrl.)，而未接种疫苗但经攻击的动物用作攻击对照(chall.ctrl.)。在疫苗接种时及之后以及攻击之前，在不同时间点获取血样。
在攻击之后1天，将每组的一半动物杀死，且每只动物分别取每个左肺及每个右肺的三个肺试样。然后，以每一动物的左肺及右肺的平均值测定每一动物的每克肺均质物的感染性猪IAV效价，所述效价各自是自每一左肺或右肺的所汇集三个试样的均质物获得且分别针对左肺或右肺的三个试样的总重量归一化。在攻击之后3天，对每组的其余一半动物实施相同程序。对于所有接种疫苗的组而言，与攻击对照组相比，对于在攻击之后第1天(CH+1)获取的试样而言，自组中的个别动物获得的感染性猪IAV的效价的中值在统计学上显著降低，而来自阴性对照组的所有动物在其肺均质物中皆不展示感染性猪IAV病毒效价(图27)。此外，对于所有接种疫苗的组而言，与攻击对照组相比，对于在攻击之后第3天(CH+3)获取的试样而言，自组中的个别动物获得的感染性猪IAV的效价的中值在统计学上显著降低，而来自阴性对照组的所有动物在其肺均质物中皆不展示感染性猪IAV病毒效价(图28)。因此，分别在仔猪中经异源猪IAV H3N2株攻击之后1天及3天，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗接种疫苗在统计学上显著降低猪IAV肺负荷。因此，本文所阐述的疫苗针对猪中的猪IAV有效。
此外，通过针对与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAVH3抗原的猪免疫球蛋白G(IgG)特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)分析在研究第0天(SD0，在首次疫苗接种之前)、在研究第21天(SD21，在第二接种疫苗之前)及在研究第42或43天(SD42/43，在施加攻击材料之前)自研究动物获取的血清。尽管来自阴性对照组的血清的平均OD值于所有量测的时间点仅给出极低的值，但在两次肌内施加(2×IM；SD21及SD42/43)之后、首先鼻内施加且然后肌内施加(IN+IM；SD42/43)之后及两次鼻内施加(2×IN；SD42/43)之后，来自接种疫苗组的血清展现OD值强烈增加；图30。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗接种疫苗分别引发仔猪中针对由疫苗株rEHV-1RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3的血清学免疫反应。
另外，自研究第28天(SD28)开始自研究动物获取的血液纯化外周血单核细胞(PBMC)。然后使用H3N2猪IAV攻击株R452-14以1的感染复数(H3N2MOI1)再刺激PBMC，或使用与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原以1μg/ml(rH3 1μg/ml)的浓度再刺激。使用再刺激的PBMC，实施干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，且将所获得值分别归一化至10^6个细胞并计算为每组的平均值(图32)。尽管来自攻击对照组的再刺激的PBMC(用作此测试的阴性对照，动物未接种疫苗)展示在任一再刺激之后，每组的平均斑点低于45，但在任一再刺激之后，分别地，在两次肌内施加之后来自接种疫苗的动物的再刺激的PBMC展示每组的平均斑点高于85，首先鼻内施加且然后肌内施加(IN+IM)之后超过100个斑点，且在两次鼻内施加(2×IN)之后超过150个斑点(图32)。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗接种疫苗在仔猪中分别针对由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3及针对用于异源攻击病毒感染的猪IAV H3N2R452-14引发细胞免疫反应。
因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗对仔猪接种疫苗在仔猪中诱导可检测的血清学及细胞免疫反应，且通过在统计学上显著降低在异源猪IAV攻击之后1天及3天的肺均质物中的猪IAV负荷展现疫苗效能。
实施例11具有母源抗体的仔猪中针对猪IAV H3N2攻击的由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗的效能
为研究由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗在幼小仔猪中作为载体疫苗的性质，在第三疫苗接种-攻击研究中对其进行测试。
在此第三研究中，使用由母猪生产并由母猪初乳及乳液喂养的仔猪，所述母猪在怀孕期间使用针对猪IAV的市售灭活疫苗接种疫苗两次。在首次接种疫苗时，通过使用H3特异性ELISA(图31)及通过使用市售猪IAV特异性抗体ELISA(IDEXX Influenza A(VirusAntibody Test)IDEXX,Westbrook,Maine 04092,USA)遵循制造商的测试建议(数据未展示)，仔猪经血清学测试对于猪IAV特异性抗体呈阴性，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价疫苗对其接种疫苗两次。分别在生命的第一周(研究第0天，SD0)对动物进行首次接种疫苗且在其生命的第4周(研究第21天，SD21)进行第二次接种疫苗，其中以肌内方式且然后以肌内方式进行(2×IM)，或首先以鼻内方式且然后以肌内方式进行(IN+IM)，或以鼻内进行两次(2×IN)，剂量为1×10^7TCID50，每个疫苗株、动物及疫苗接种分别使用2ml剂量。未接种疫苗的组用作阴性对照且另一经接种疫苗的组用作攻击对照。在生命的第11周(研究第69或70天，SD69/70)，通过2×10^7TCID50的气管内施加剂量的H3N2猪IAV攻击株(欧洲野生病毒分离物R452-14，其H3与rEHV-1 RacH-SE_B中所用的H3疫苗抗原异源)攻击除阴性对照外的所有动物。未接种疫苗且未经攻击的动物用作阴性对照(neg.ctrl.)，而未接种疫苗但经攻击的动物用作攻击对照(chall.ctrl.)。在疫苗接种时及之后以及攻击之前，在不同时间点获取血样。
在攻击之后5天，杀死动物，且每只动物分别取每个左肺及每个右肺的三个肺试样。然后，以每只动物的左肺及右肺的平均值测定每一动物的每克肺均质物的感染性猪IAV效价，所述效价各自是自每个左肺或右肺的所汇集三个试样的均质物获得且分别针对左肺或右肺的三个试样的总重量归一化。对于所有接种疫苗的组而言，与攻击对照组相比，对于在攻击之后第5天(CH+5)获取的试样而言，自组中的个别动物获得的感染性猪IAV的效价的中值在统计学上显著降低，而来自阴性对照组的所有动物在其肺均质物中皆不展示感染性猪IAV病毒效价(图29)。因此，分别在仔猪中经异源猪IAV H3N2株攻击之后5天，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗接种疫苗在统计学上显著降低猪IAV肺负荷。因此，本文所阐述的疫苗针对猪中的猪IAV有效。
此外，通过针对与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAVH3抗原的猪免疫球蛋白G(IgG)特异性酶联免疫吸附分析(ELISA)分析在研究第0天(SD0，在首次疫苗接种之前)、在研究第21天(SD21，在第二疫苗接种之前)及在研究第35天(SD35，在第二疫苗接种之后2周)自研究动物获取的血清。尽管来自阴性对照组的血清的平均OD值对于SD21及SD35仅给出极低的值，但在两次肌内施加(2×IM；SD35)之后、首先鼻内施加且然后肌内施加(IN+IM；SD35)之后及两次鼻内施加(2×IN；SD35)之后，来自接种疫苗组的血清展现OD值强烈增加；图31。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗接种疫苗分别引发仔猪中针对由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3的血清学免疫反应。
另外，自研究第28天(SD28)开始自研究动物获取的血液纯化外周血单核细胞(PBMC)。然后使用H3N2猪IAV攻击株R452-14以1的感染复数(H3N2MOI1)再刺激PBMC，或使用与由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的H3同源的重组表达的猪IAV H3抗原以1μg/ml(rH3 1μg/ml)的浓度再刺激。使用再刺激的PBMC，实施干扰素γ特异性酶联免疫吸附斑点分析(IFNγELISpot)，且将所获得值分别归一化至10^6个细胞并计算为每组的平均值(图33)。尽管来自攻击对照组的再刺激的PBMC(用作此测试的阴性对照，动物未接种疫苗)展示在任一再刺激之后，每组的平均斑点低于15，但在任一再刺激之后，分别地，在两次肌内施加之后来自接种疫苗的动物的再刺激的PBMC展示每组的平均斑点高于30，首先鼻内施加且然后肌内施加(IN+IM)之后超过55个斑点，且在两次鼻内施加(2×IN)之后超过65个斑点(图33)。因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗接种疫苗在仔猪中分别针对由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表达的猪IAV血凝素H3及针对用于异源攻击病毒感染的猪IAV H3N2R452-14引发细胞免疫反应。
因此，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗对仔猪接种疫苗在仔猪中诱导可检测的血清学及细胞免疫反应，且通过在统计学上显著降低在异源猪IAV攻击之后5天的肺均质物中的猪IAV负荷展现疫苗效能。
实施例12由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗基于IAV核蛋白(NP)特异性抗体来诊断性区分经感染动物与经接种疫苗动物(DIVA)的特征
为评价由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗的血清学DIVA性质，使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价疫苗对由母猪(在怀孕期间使用针对猪IAV的市售灭活疫苗接种疫苗两次)生产并由母猪初乳及乳液喂养的仔猪接种疫苗两次。分别在生命的第一周对动物进行首次接种疫苗且在其生命的第4周进行第二次接种疫苗，其中以肌内方式且然后以肌内方式进行(2×IM)，或首先以鼻内方式且然后以肌内方式进行(IN+IM)，或以鼻内方式进行两次(2×IN)，剂量为1×10^7TCID50，每一疫苗株、动物及疫苗接种分别使用2ml剂量。未接种疫苗组用作阴性对照(neg.ctrl.)。对于2×IM、IN+IM、2×IN及neg.ctrl.组而言，每组使用5只动物且分别在第一接种疫苗之前(图34，在接种疫苗之前)及在第二接种疫苗之后14天(图34，在接种疫苗之后)获取血清试样。作为阳性对照，使用针对猪IAV的市售灭活含IAV疫苗(pos.ctrl.)对来自在第一接种疫苗时间点之前针对IAV特异性抗体测试为阴性(数据未展示及图34，在接种疫苗之前)的未接种疫苗母猪的两头仔猪接种疫苗两次。分别在生命的第二周首次对pos.ctrl.仔猪接种疫苗且在其生命的第五周第二次接种疫苗，且分别在第一接种疫苗之前(图34，在接种疫苗之前)及在第二接种疫苗之后22天(图34，在接种疫苗之后)获取血清试样。
在检测猪IAV核蛋白(NP)特异性IgG的ELISA中测试上述血清(图34)。来自经接种疫苗母猪(neg.ctrl.、2×IM、IN+IM、2×IN组)的仔猪的血清试样皆展示每组在接种疫苗之前的平均OD值为0.7或更高，由此证实在所述未接种疫苗的动物中存在母源IAV NP特异性抗体(图34)。与的相比，在接种疫苗之前来自pos.ctrl.组的仔猪血清的平均组值低于0.15在，从而不存在/存在极低浓度的IAV NP特异性抗体。在使用市售灭活含NP猪IAV疫苗进行第二接种疫苗之后22天(图34，在接种疫苗之后)，来自pos.ctrl.组的血清的平均组值增加至大于1.9，由此证实在仔猪中强烈诱导可检测猪IAV NP特异性IgG。与的相比，在使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗(其不含或不表达猪IAV NP)接种疫苗之后14天，来自2×IM、IN+IM、2×IN组亦及来自未接种疫苗neg.ctrl.组的仔猪的血清试样分别展示每组的平均OD值低于0.15，由此证实在接种疫苗之前存在的IAV NP特异性抗体浓度下降至极低浓度且接种疫苗并不使得在仔猪中强烈诱导可检测猪IAV NP特异性IgG。总而言的，尽管习用含NP灭活猪IAV疫苗使得在经接种疫苗的仔猪中强烈诱导可检测NP特异性抗体，但使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗接种疫苗并不诱导在经接种疫苗的仔猪中强烈诱导可检测NP特异性抗体。
由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗并不诱导在经接种疫苗仔猪中强烈诱导可检测NP特异性抗体的事实证实了容许区分经感染动物与经接种疫苗动物(DIVA)且区分经接种疫苗动物与使用习用含NP灭活猪IAV疫苗接种疫苗的动物的血清学诊断标记物。
此DIVA特征可用于伴随使用由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D组成的四价猪IAV疫苗的商业测试研发且用以支持针对猪IAV的根除措施。
根据本发明，本文中所揭示及所主张的所有组合物及方法皆可在无需过度实验的情形下进行及执行。尽管本发明的组合物及方法已根据优选实施例予以阐述，但熟习此项技术者应明了，可改变所述组合物及方法及本文所阐述方法的步骤或步骤顺序，此并不背离本发明的概念、精神及范围。更具体而言，应明了，某些在化学及生理上皆相关的试剂可代替本文所阐述试剂且同时可达成相同或类似结果。熟习此项技术者显而易见的所有所述类似代替物及修改皆被视为涵盖于由随附申请专利范围所界定的本发明精神、范围及概念内。
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就提供补充本文所陈述内容的实例性程序或其他细节而言，下列参考文献以引用方式具体并入本文中。
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tctatttgag gacccgccga gtaccccaca agagtatgta aaaagctgtc attctcaact 60
actgagaata atatcaaagc taaagataaa ccctgaggag tttccacggg aaccagagtc 120
taggctcgtg cgcggataca tcgaatacgc cagcctagag cgtaagccac atacgcgcta 180
tccttgcttc cagcgcgtga acctacacat tgacggggaa tttttgatcc ataaaatgct 240
agcgttcaat gctgcgatgc gcccatccgc agaagagttg ttgtcctacc caatgtttat 300
gaatctgtag gatgactaac agatttgggg tggagacggc gtgggcgata ctgtataaag 360
ttgtactact taccagccca gtcagtgtgc tgtagtgcca ccacctgtaa agctgtgata 420
agctgcagtt 430
<210> 4
<211> 449
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 4
<400> 4
ttggtggtag catatactac cttatttata cgctccgagc tgtttttcag catgctagca 60
cccaacgccg agcgagagta tataactccc atcattgccc acaagcttat gccacttatt 120
agcgtccgct ctgccgtttg cttagtcata atatctaccg ccgtttacgc agcagacgct 180
atctgcgaca caattggatt tgcgataccg cgcatgtgga tgtgtatttt aatgagatca 240
acctccatga agcgtaacta gggggcctcc cactgaggca ctaccggctt agcagctgac 300
taacacagta taaaacgtga gaagaaatca gtctcatgcg ccattagcgc taggctagtt 360
agcgtggagg accggagcgc taccgccagc agtttcatcc gcctggttac gggtttgtta 420
acacctaccg gtgttttacc gctaccata 449
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no 1130 specific for orf72
<400> 5
tgtctacctt caagcttatg 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no 1131 specific for orf72
<400> 6
ctagcgcagt cgcgttg 17
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no. 1079 specific for mCherry
<400> 7
gcgaggagga taacatgg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer no. 1080 specific for mCherry
<400> 8
acccttggtc accttcag 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1017 for the orf70
insertion region
<400> 9
aggctcgtgc gcggatacat cg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1018 for the orf70
insertion region
<400> 10
ttcggggctg ttagactcct cc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1007 for the orf1/3
insertion region
<400> 11
ccaactcgcc gccatgagac cc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence nucleic acid PCR primer 1008 for the orf1/3
insertion region
<400> 12
agcgcgcccc gtacccagtg gg 22
<210> 13
<211> 417
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 13
ctccgagtac cccagaggag tatgtgaaaa gctgccactc gcaactactg aagataattt 60
caacgctcaa gataaatccg gaggagtttc ctcgagaccc cgggtcgagg ctcgtgcgcg 120
gatacatcga gtattctaga ctcgagcgca agccctacac gcgctacccc tgctttcaac 180
gcgtcaacct gcacattgac ggggagtttc tggttcacaa gatgctagcg ttcaatgccg 240
cgatgcgccc atcggccgag gagctgctgt catacccaat gtttgctcaa ctttaggatg 300
actaacctgt ttctgggagg agacagcgtg ggcgacggtg tataaagttg gtctgctttc 360
aagccctgcc actgcgctac agtgccacca actgtaaagc ggtagtaagc tgcagtg 417
<210> 14
<211> 431
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 14
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag gaggagtcta acagccccga 180
agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca cacacggggg gtgcgtcgaa 240
cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat gcctgcttgg ctctaattgg 300
actcggcaca tgtgccatga tagggttgat agtttacatt tgtgtattaa ggtcaaaact 360
gtcctctcgg aatttttcgc gcgcgcaaaa tgtaaaacat agaaattacc agcgacttga 420
gtacgttgct t 431
<210> 15
<211> 417
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 15
ctccgagtac cccagaggag tatgtgaaaa gctgccactc gcaactactg aagataattt 60
caacgctcaa gataaatccg gaggagtttc ctcgagaccc cgggtcgagg ctcgtgcgcg 120
gatacatcga gtattctaga ctcgagcgca agccctacac gcgctacccc tgctttcaac 180
gcgtcaacct gcacattgac ggggagtttc tggttcacaa gatgctagcg ttcaatgccg 240
cgatgcgccc atcggccgag gagctgctgt catacccaat gtttgcacaa ctttaggatg 300
actaacctgt ttctgggagg agacagcgtg ggcgacggtg tataaagttg gtctgctttc 360
aagccctgcc actgcgctac agtgccacca actgtaaagc ggtagtaagc tgcagtg 417
<210> 16
<211> 431
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 16
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag gaggagtcta acagccccga 180
agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca cacacggggg gtgcgtcgaa 240
cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat gcctgcttgg ctctaattgg 300
actcggcaca tgtgccatga tagggttgat agtttacatt tgtgtattaa ggtcaaaact 360
gtcctctcgg aatttttcgc gcgcgcaaaa tgtaaaacat agaaattacc agcgacttga 420
gtacgttgct t 431
<210> 17
<211> 283
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 17
tctagactcg agcgcaagcc ctacacgcgc tacccctgct ttcaacgcgt caacctgcac 60
attgacgggg agtttctggt tcacaagatg ctagcgttca atgccgcgat gcgcccatcg 120
gccgaggagc tgctgtcata cccaatgttt gctcaacttt aggatgacta acctgtttct 180
gggaggagac agcgtgggcg acggtgtata aagttggtct gctttcaagc cctgccactg 240
cgctacagtg ccaccaactg taaagcggta gtaagctgca gtg 283
<210> 18
<211> 144
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 18
gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg caggcatgga agtttgtcgg 60
tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat ttagagaccc acgtaccctc 120
aagtgctgca gagtcgtctc taga 144
<210> 19
<211> 801
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 19
atgttgactg tcttagcagc cctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc c 801
<210> 20
<211> 801
<212> DNA
<213> Equine herpesvirus 1
<400> 20
atgttgactg tcttagcagc tctgagtctg ctcagcttgc ttacgagcgc aaccggacgg 60
ctcgccccag atgaactctg ttatgccgaa ccccgcagaa ctggcagccc accaaacacc 120
cagcccgaac gcccacccgt aatatttgag cccccaacaa ttgcgattaa agctgaatcc 180
aagggttgtg agctaatttt attagatcca cccatagatg taagctatcg cagagaagat 240
aaggtgaatg cgtccattgc ttggtttttt gactttggcg cttgccggat gcccatcgca 300
tacagagagt attacggttg tattggcaat gctgttccct ccccagagac ttgtgatgcg 360
tactcattta cccttattag gaccgagggt atcgtggagt ttaccatcgt aaacatgagc 420
ctcctgtttc agcctggaat atacgatagt ggcaatttta tctacagcgt tctcctggac 480
taccacatat ttacaggacg tgtaacgttg gaagtggaaa aggacacaaa ctatccctgt 540
ggcatgattc atggactcac tgcttacgga aacatcaacg tagatgaaac catggacaac 600
gccagcccac acccgcgtgc cgtggggtgc tttcccgagc ccatcgacaa cgaagcgtgg 660
gcaaacgtta catttactga attggggata ccagacccaa actcatttct cgatgacgag 720
ggtgattacc cgaatatatc agactgtcac tcgtgggagt catacaccta cccaaatacg 780
ctgaggcagg ccacaggacc c 801
<210> 21
<211> 4435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of transfer plasmid pU-mC70-BGH
<400> 21
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cctccgagta ccccagagga 420
gtatgtgaaa agctgccact cgcaactact gaagataatt tcaacgctca agataaatcc 480
ggaggagttt cctcgagacc ccgggtcgag gctcgtgcgc ggatacatcg agtattctag 540
actcgagcgc aagccctaca cgcgctaccc ctgctttcaa cgcgtcaacc tgcacattga 600
cggggagttt ctggttcaca agatgctagc gttcaatgcc gcgatgcgcc catcggccga 660
ggagctgctg tcatacccaa tgtttgctca actttaggat gactaacctg tttctgggag 720
gagacagcgt gggcgacggt gtataaagtt ggtctgcttt caagccctgc cactgcgcta 780
cagtgccacc aactgtaaag cggtagtaag ctgcagtggt cgacatggtg agcaagggcg 840
aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct 900
ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca 960
cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 1020
tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 1080
actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 1140
acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca 1200
aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca 1260
tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga 1320
tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct 1380
acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca 1440
tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc 1500
actccaccgg cggcatggac gagctgtaca agtaactgtg ccttctagtt gccagccatc 1560
tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 1620
ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 1680
gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 1740
ggatgcggtg ggctctatgg atccgaccct gttggtgggt gcggttggac tcagaatctt 1800
ggcgcaggca tggaagtttg tcggtgacga aacatacgac accatccgcg cagaagcaaa 1860
gaatttagag acccacgtac cctcaagtgc tgcagagtcg tctctagaaa accaatcgac 1920
acaggaggag tctaacagcc ccgaagttgc ccacctgcga agcgtcaaca gcgatgacag 1980
tacacacacg gggggtgcgt cgaacggcat ccaggactgt gacagtcagc tcaaaactgt 2040
gtatgcctgc ttggctctaa ttggactcgg cacatgtgcc atgatagggt tgatagttta 2100
catttgtgta ttaaggtcaa aactgtcctc tcggaatttt tcgcgcgcgc aaaatgtaaa 2160
acatagaaat taccagcgac ttgagtacgt tgcttaagct tggcgtaatc atggtcatag 2220
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 2280
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 2340
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 2400
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 2460
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 2520
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 2580
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 2640
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 2700
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 2760
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 2820
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2880
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2940
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 3000
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 3060
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 3120
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 3180
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 3240
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 3300
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 3360
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 3420
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 3480
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 3540
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 3600
tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 3660
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 3720
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 3780
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 3840
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 3900
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 3960
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 4020
actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 4080
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 4140
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 4200
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 4260
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 4320
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 4380
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 4435
<210> 22
<211> 5191
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of transfer vector pU70-p455-71K71
<400> 22
caataaacgc ggtatgtcta ccttcaagcc tatgatgaac ggatgtttgg tgtttgcggc 60
tattataacg ctcttgagtt ttatgctatc tctgggaaca tgcgaaaatt acaggcgtgt 120
ggttcgggat cctagggata acagggtaat cgatttattc aacaaagcca cgttgtgtct 180
caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac aataaaactg 240
tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtct 300
tgctcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct 360
cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg 420
ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg 480
gtcagactaa actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt 540
actcctgatg atgcatggtt actcaccact gcgatccccg ggaaaacagc attccaggta 600
ttagaagaat atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc 660
cggttgcatt cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc 720
gctcaggcgc aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag 780
cgtaatggct ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt gccattctca 840
ccggattcag tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg 900
aaattaatag gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt 960
gccatcctat ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa 1020
aaatatggta ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag 1080
tttttctaaa ataaacgcgg tatgtctacc ttcaagccta tgatgaacgg atgtttggtg 1140
tttgcggcta ttataacgct cttgagtttt atgctatctc tgggaacatg cgaaaattac 1200
aggcgtgtgg ttcgggatcc gaccctgttg gtgggtgcgg ttggactcag aatcttggcg 1260
caggcatgga agtttgtcgg tgacgaaaca tacgacacca tccgcgcaga agcaaagaat 1320
ttagagaccc acgtaccctc aagtgctgca gagtcgtctc tagaaaacca atcgacacag 1380
gaggagtcta acagccccga agttgcccac ctgcgaagcg tcaacagcga tgacagtaca 1440
cacacggggg gtgcgtcgaa cggcatccag gactgtgaca gtcagctcaa aactgtgtat 1500
gcctgcttgg ctctaattgg actcggcaca tgtgccatga tagggttgat agtttacatt 1560
tgtgtattaa ggtcaaaact gtcctctcgg aatttttcgc gcgcgcaaaa tgtaaaacat 1620
agaaattacc agcgacttga gtacgttgct taagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 1680
ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 1740
agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 1800
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 1860
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 1920
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 1980
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 2040
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 2100
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 2160
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 2220
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 2280
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 2340
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 2400
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 2460
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 2520
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 2580
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 2640
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 2700
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 2760
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 2820
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 2880
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 2940
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gcagaagagt tgttgtccta cccaatgttt atgaatctgt aggatgacta acagatttgg 4860
ggtggagacg gcgtgggcga tactgtataa agttgtacta cttaccagcc cagtcagtgt 4920
gctgtagtgc caccacctgt aaagctgtga taagctgcag ttgcggccgc cgggtac 4977
<210> 25
<211> 6678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of transfer plasmid pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH
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agggtaatcg atttattcaa caaagccacg ttgtgtctca aaatctctga tgttacattg 300
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cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 2460
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 2520
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cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 2700
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actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 3780
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ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa 3900
taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 3960
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 4020
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gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 4320
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tttccatctc ctctccaact cgccgccatg agacccgagg gagtttcgcg gggccgcgcc 4500
tcctctgtct ccatctccaa ctagtgtcga cctctatttg aggacccgcc gagtacccca 4560
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gaatggcgcc tgctatcctg gggagttcgc tgactacgag gagctgcgcg agcagttgtc 5340
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<210> 26
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 26
Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn
1 5 10 15
Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val
50 55 60
Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile
85 90 95
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Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
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130 135 140
Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser
145 150 155 160
Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val
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Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu
195 200 205
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210 215 220
Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln
225 230 235 240
Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe
260 265 270
Ala Met Glu Arg Lys Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro
275 280 285
Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly
340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
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370 375 380
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Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
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Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
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500 505 510
Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr
515 520 525
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Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu
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Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565
<210> 27
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 27
Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Phe Gly
1 5 10 15
Gln Asp Leu Pro Gly Lys Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Glu Tyr Thr Ser Leu Arg Ser Leu Ile
115 120 125
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130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Gly Ser Ser Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asn
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Asn Ser Phe Phe Ser Lys Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Asn Thr
165 170 175
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Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Arg Glu Gln Ile
195 200 205
Asn Leu Tyr Val Gln Ala Ser Gly Lys Ile Ile Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
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Gly Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp Ile Leu Ile Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys Met Gln Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
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Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Lys Tyr Ile Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
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355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Ala Val Trp Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile
545 550 555 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
<210> 28
<211> 566
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 28
Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Ala Phe Thr Ala Leu Lys
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Phe
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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210 215 220
Gln Arg Phe Thr Pro Glu Ile Val Ala Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln
225 230 235 240
Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Asp Gln Gly Asp Thr
245 250 255
Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp His Ala Phe
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser
370 375 380
Thr Gln Ile Ala Ile Asp Gly Ile Ser Asn Lys Val Asn Ser Val Ile
385 390 395 400
Glu Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ser Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn
405 410 415
Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile Leu Leu Glu Asn
435 440 445
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450 455 460
Lys Val Lys Ser Gln Leu Arg Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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<211> 564
<212> PRT
<213> Influenza A virus
<400> 29
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130 135 140
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Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Ile Arg Asn Gln Glu Gly
225 230 235 240
Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Lys Asp Thr Ile Ile
245 250 255
Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu
260 265 270
Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Val Ser Asn Ala Ser Met Asp
275 280 285
Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Lys Met Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile
325 330 335
Pro Ser Ile Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
340 345 350
Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
355 360 365
Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln
370 375 380
Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Asp Lys
385 390 395 400
Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu
405 410 415
Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp
420 425 430
Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg
435 440 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Ser Leu Tyr Glu Lys Val
450 455 460
Lys Gly Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe
465 470 475 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Asp Ser Val Lys Asn
485 490 495
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Arg Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg
500 505 510
Glu Lys Ile Asp Gly Val Glu Leu Lys Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile
515 520 525
Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser
530 535 540
Leu Gly Ala Thr Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545 550 555 560
Arg Ile Cys Ile
Claims (24)
1.一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入ORF70中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
2.一种EHV载体，其包括
(i)至少一个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)该外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)该外源性抗原编码序列可操作地连接至包括4pgG600(SEQ ID NO.1)或4pMCP600(SEQ ID NO.2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或其互补核苷酸序列的启动子序列。
3.一种EHV载体，其包括
(i)至少两个与感染产食动物的病原体相关的外源性抗原编码序列，
(ii)所述外源性抗原编码序列插入插入位点中，
(iii)所述外源性抗原编码序列可操作地连接至启动子序列。
4.一种免疫原性组合物，其包括如权利要求1至3中任一项的EHV载体及任选的药学载剂。
5.一种免疫原性组合物或DIVA疫苗，其包括两种或更多种如权利要求1至4中任一项的EHV载体。
6.如权利要求1至5中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体是重组的。
7.如权利要求1至6中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV载体选自由以下组成的群：EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9。
8.如权利要求1至7中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列。
9.如权利要求1至8中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该外源性抗原编码序列是血凝素编码序列且该血凝素流感抗原编码序列包括编码与如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:29中所述的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的核酸序列。
10.如权利要求2至9中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该插入位点是ORF1/3和/或ORF70。
11.如权利要求1至10中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中与感染产食动物的病原体相关的第一外源性抗原编码序列插入ORF70中和/或与感染产食动物的病原体相关的第二外源性抗原编码序列插入ORF1/3中。
12.如权利要求1至11中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该ORF70中的插入特征在于ORF70中的部分缺失、截短、取代、修饰或诸如此类，由此ORF71保留功能性。
13.如权利要求1至12中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该ORF70中的插入特征在于缺失RacH的ORF70内的大约801bp部分(SEQ ID NO:20)或其70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
14.如权利要求1至13中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该EHV-1载体包括至少一个选自由以下组成的群的侧翼区：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18及所述序列中任一者的70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源和/或相同序列。
15.如权利要求1和3至14中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列是选自由以下组成的群：SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子；4pgG600(SEQ ID NO:1)的功能片段，优选地，该功能片段是p430(SEQ ID NO:3)；4pgG600(SEQ ID NO:1)的互补核苷酸序列的功能片段；4pMCP600(SEQ ID NO:2)的功能片段，优选地，该功能片段是p455(SEQ ID NO:4)；4pMCP600(SEQ IDNO:2)的互补核苷酸序列的功能片段。
16.如权利要求1和3至15中任一项的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列包括4pgG600(SEQ ID NO:1)或4pMCP600(SEQ ID NO:2)或其互补核苷酸序列或其功能片段或其互补核苷酸序列。
17.如权利要求16的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列的功能片段或衍生物具有80％、85％、优选地90％、91％、92％、93％、94％、更优选地95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的同源性和/或该启动子序列的功能片段具有550个核苷酸、优选地500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430个核苷酸、最优选地455或430个核苷酸的长度。
18.如权利要求16或17的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列的功能片段是4pgG600(SEQ ID NO:1)的截短物或其互补核苷酸序列，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)72％(或更高)，和/或4pgG600(SEQ ID NO:1)的启动子序列的功能片段是称为430p430(SEQ ID NO:3)的片段或与SEQ ID NO:3具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的序列。
19.如权利要求16或17的EHV载体、免疫原性组合物或DIVA疫苗，其中该启动子序列的功能片段是4pMCP600(SEQ ID NO:2)的截短物或其互补核苷酸序列，优选地，序列相同性为整个长度的(至少)78％(或更高)，和/或4pMCP600(SEQ ID NO:2)的启动子序列的功能片段是称为p455(SEQ ID NO:4)的片段或与SEQ ID NO:4具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％相同性的序列。
20.一种免疫产食动物的方法，包括给该产食动物施用权利要求4至19中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
21.一种在有需要的产食动物中治疗或预防由猪流感病毒引起的临床征象的方法，所述方法包括给该产食动物施用治疗有效量的权利要求4至19中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
22.一种用于与相同物种的未免疫对照组的产食动物相比减小产食动物的肺中病毒效价的方法，所述方法包括给该产食动物施用治疗有效量的权利要求4至19中任一项的免疫原性组合物或DIVA疫苗。
23.权利要求20至22中任一项的方法，其中所述产食动物是猪。
24.权利要求20至23中任一项的方法，其中所述方法导致与相同物种的未免疫对照组的产食动物相比，选自由以下组成的群的效能参数改良：体重减轻降低、降低肺中病毒负荷、减少肺病灶、减少和/或缩短病毒脱落、降低直肠温度、减少临床症状(尤其呼吸症状)、增加抗猪流感A病毒抗体的诱导(中和)、增加针对猪流感A病毒的T细胞刺激、增加针对猪流感A病毒的B细胞刺激，及减少肺中促炎细胞因子(诸如IL1β)，或其组合。
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