JP2019531723A - 新規のブタインフルエンザワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、特に、食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの（少なくとも２つの）外来性抗原コード配列を含むＥＨＶベクターに関し、前記外来性抗原コード配列は挿入部位（好ましくはＯＲＦ７０）に挿入されており、前記外来性抗原コード配列はプロモーター配列（好ましくは、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含むプロモーター配列）に作動可能に連結している。さらに、本発明は、このような食物生産動物に本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、食物生産動物の免疫方法に関する。さらに、本発明は、それを必要とする食物生産動物におけるブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候の治療または予防のための方法に関する。

Description

配列表
本出願は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２１〜１．８２５に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．技術分野
本発明は、（ベクター）ワクチンの分野に関し、特にこのようなベクターワクチンの標的抗原を発現するのに適切な挿入部位およびプロモーターに関する。さらに、本発明は、ブタＡ型インフルエンザウイルスワクチンに関する。
Ｂ．関連技術の背景および説明
ＥＨＶベクター系
ウマの病原体、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ウマ流産ウイルス、ＥＨＶ−１）は、ヘルペスウイルス目の、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス亜科のバリセロウイルス属に属する。およそ１５０，０００塩基対の二本鎖ＤＮＡゲノムを有する大きなエンベロープウイルスである。バリセロウイルス亜属の他の重要なメンバーは、ヒトヘルペスウイルス３型（水痘帯状疱疹ウイルス）、ブタヘルペスウイルス１型（仮性狂犬病ウイルス）、ウシヘルペスウイルス１型（感染性気管支炎ウイルス）、およびウマヘルペスウイルス４型（ウマ鼻肺炎ウイルス、ＥＨＶ−４）（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)。
ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４は風土性であり、世界中のウマに影響を及ぼす。ＥＨＶ−４は、上気道に、大抵は軽度の感染を引き起こすが、ＥＨＶ−１は、株および宿主の免疫状態によって呼吸器症状から流産および致死性の脳脊髄障害の範囲の疾患を含む全身感染を引き起こし得る。ＥＨＶ−１に対して使用許諾を得た２つの改変生ワクチン（ＭＬＶ）がアメリカおよびヨーロッパで現在入手可能であり、それぞれＲｈｉｎｏｍｕｎｅ（商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＰｒｅｖａｃｃｉｎｏｌ（商標）（ＭＳＤ）である。両方とも、弱毒化のためにブタ上皮細胞において２５６回継代された、古典的に弱毒化したＥＨＶ−１ ＲａｃＨ株を含有する（Ma et al. 2013）。弱毒化のメカニズムは、分子レベルで調査されてきた。Osterrieder et al. (1996)は、ＲａｃＨがｏｒｆ６７の２つのゲノムコピーを欠如し、１つのコピーの回復が毒性を回復させるのに十分であったことを示した。さらに、免疫抑制ウイルスタンパク質をコードするｏｒｆ１のコード配列の９０％より多くを除去する１２８３ｂｐの欠損を持つ。他の変異もまた、弱毒化に影響するが、これまでのところ詳細には調査されていない。これら全てのことから、ＲａｃＨは非常に安全なワクチン株である。ワクチン接種動物における継代による毒性への復帰は、仮に可能だとしてもその可能性が極めて低いからである。
ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ワクチン株ＲａｃＨ（ｐＲａｃＨ−ＳＥ）の全ゲノムを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌人工染色体（ＢＡＣ）は、ベクターワクチン開発のプラットフォームとして公知である。ＥＨＶ−１ ＲａｃＨベースのベクターワクチンは、ブタ、ウシ、およびイヌを含むいくつかの哺乳動物種で免疫性を引き出すことができることが示された（Rosas et al. 2007, Rosas et al. 2008, Trapp et al. 2005, Said et al. 2013）。病原体の抗原タンパク質をコードする遺伝子は、組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨによって発現され得る。ＥＨＶ−１−ＲａｃＨゲノムは、大腸菌においてそのＢＡＣ形態で操作し、通常導入遺伝子発現カセットを挿入することによってさらなるタンパク質を発現するように調製することができる（Tischer et al., 2010）。培養した許容細胞においてｐＲａｃＨ−ＳＥ ＤＮＡをトランスフェクションすると、ＥＨＶ−１複製が細胞の転写因子によって開始される。ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性は、全てのＢＡＣベクター関連配列の欠損およびＥＨＶ−１ ＲａｃＨゲノムのその元々の状態への回復をもたらす。感染性ウイルスが生成され、それはＲａｃＨと区別がつかない。
ｐＲａｃＨ−ＳＥが、例えば導入遺伝子発現カセットの挿入によって、大腸菌中で操作される場合、許容細胞へのトランスフェクション後に再構築されたウイルスは改変を保持し、さらなる遺伝子を発現するであろう。組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨはベクターワクチンとして使用することができる。
ＥＨＶベクター系のプロモーター
しかしながら、さらなる外来性プロモーター無しで発現されるトランスジェニックタンパク質の量は、通常比較的少ない。したがって、そのようなベクター、特に組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨからトランスジェニックタンパク質を発現するために使用され得るさらなるプロモーターに対する、満たされていない要求がある。
ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子１プロモーター−エンハンサー（Boshart et al. 1985）を使用して、導入遺伝子がｏｒｆ１／３挿入部位から効率的に発現されることが報告されている。そのような研究では、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ）を使用して、よりよい発現のために転写を安定化させた（Ma et al. 2012; Said et al. 2013）。ＨＣＭＶがヒトにおいて腫瘍を誘発し得るという証拠はないが、理論上の危険性は除外することができない。ＨＣＭＶ−ＩＥエンハンサーが記載される前（Boshart et al. 1985）、強力なエンハンサーの大半は、サルウイルス４０、ポリオーマウイルス、またはモロニーマウス肉腫ウイルスのような公知の腫瘍ウイルスのゲノムで発見された。極めて強いならびに非組織特異性ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ（マウスサイトメガロウイルス）ＩＥプロモーター−エンハンサーは、様々な研究活動に非常によく適しているが、それらは一般にトランスジェニックベクターワクチンのプロモーターの第一選択とはならないであろう。特に、ワクチン接種動物へのヒトの偶発的暴露のリスクは、監督官庁によってワクチンの認可のハードルとみなされ得る。
ＥＨＶベクター系の挿入部位
野生型ＥＨＶ−１株は、それらのゲノムの長いユニーク断片の一端にｏｒｆ１、ｏｒｆ２、およびｏｒｆ３と呼ばれる３つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を保持する（配列座標 １２９８−３６１４；図１ａ）。Ｏｒｆ１およびｏｒｆ３は、ＤＮＡの１つの鎖に連続して配置されているが、ｏｒｆ２は相補鎖にコードされている。ワクチン株ＲａｃＨは、ｏｒｆ１および２に影響を及ぼす領域内に１２８３ｂｐの欠損があり、これは、これらの遺伝子はウイルス複製に必須ではないことを示している。このため、その部位は導入遺伝子挿入部位となる。この挿入部位はＯＲＦ１／３と呼ばれる。
しかし、ＯＲＦ１／３挿入部位に挿入され得る導入遺伝子のサイズおよび数には通常制限がある。したがって、ＥＨＶ−１ベクターの能力を増大させるために、ＥＨＶ−１ベクター、特に、組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨベクターに導入遺伝子を挿入し、発現する新たな、および代わりとなる方法に対する満たされていない要求がある。
ブタＡ型インフルエンザウイルス（ＳＩＡＶ）
ブタインフルエンザは、ブタの健康および福祉を低下させる、オルソミクソウイルス科のＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）によって引き起こされる急性ウイルス性呼吸器疾患である。ブタにおけるインフルエンザの臨床徴候は様々な重症度で表れ得るが、罹患率は高いが回復は速やかで致死例が稀な軽度の呼吸器疾患として生じることが多い。しかし、この疾患は、体重減少、体重増加の低下、場合によっては高熱による雌ブタの生殖障害を引き起こすので、経済的に大きな負担となる。ＳＩＡＶはブタの最も重要な呼吸器病原体の１つであり、世界中のブタの群れにおけるその高い有病率は疾患の経済的影響と直接相関する。欧州では現在、飼育されているブタにおいて循環し、経済的損失を引き起こしている４つの主要なＡ型インフルエンザウイルスサブタイプがある（Brown, 2000）。Ｈ１Ｎ１（「トリ型」サブタイプ）およびＨ３Ｎ２ブタインフルエンザウイルスは、１９８０年代から主要なブタ生産国において風土性となっている。Ｈ１Ｎ２ウイルスは、約２０年前に欧州のブタに持ち込まれ（Brown et al., 1995）、Ｈ１Ｎ１「大流行型」サブタイプ（Ｈ１ｐｄｍＮ１）は、２００９年のヒトＨ１Ｎ１大流行の最中にヒトからブタに伝染することによってブタ集団に持ち込まれ、ブタ集団において世界的に拡大し続け、欧州における平均有病率はブタインフルエンザウイルス感染全体の８％と推定される（Watson et al., 2015）。さらに、ＩＶＡは人畜共通感染症の可能性がよく知られているので、ブタインフルエンザはヒトの健康にも関わりがある（Thacker&Janke 2008）。
欧州において最も蔓延している４つのＡ型インフルエンザ株は、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１（Ｈ１Ｎ１トリ型およびＨ１Ｎ１大流行型）サブタイプである。したがって、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１（Ｈ１Ｎ１トリ型およびＨ１Ｎ１大流行型）サブタイプに対して効果が高く、したがって、これらのブタＩＡＶ野外株に対して非常に広い防御をもたらすワクチンが必要である。
さらに、一般的に多価ワクチンは一価ワクチンよりも費用対効果が高く、時間対効果も高いので、多価ワクチンが有利である。
しかし、一般的にワクチンの有効性は、別個のワクチン株のウイルス干渉および／またはワクチン成分の１つの殺ウイルス性効果などの干渉効果によって影響を受けることがある。したがって、効果が高く、前述した干渉によって影響を受けないブタＩＡＶ組み合わせワクチンが必要である。
さらに、循環しているブタＩＡＶ株に多価ワクチンで広範に適用することはまた、ワクチン株／抗原および野外ウイルスが互いに遠縁の場合のみに観察され得る、ワクチン接種した動物の野外ウイルス感染後のワクチン関連増強呼吸器疾患（ＶＡＥＲＤ）を効率的に予防するだろう（Rajao et al. 2016）。
本明細書で記載したＥＨＶ−ベクターベースワクチンは改変生ワクチン（ＭＬＶ）ではないことにより、生ＩＡＶが発生することも、動物に与えることもなく、したがって、ワクチン株の病原性が復帰する可能性およびブタもしくはヒトからの野外株との遺伝子組換えもしくは再集合を防ぐので、ブタＩＡＶに関して根本的に安全である。さらに、死菌ワクチン（現在の標準）とは対照的に、ベクターワクチンは、ブタＩＡＶ中和抗体を誘導するだけでなく、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路の両方によってブタＩＡＶに対する細胞性免疫を強く刺激することが予測される。したがって、ベクターベースＳＩＡＶワクチンが必要である。
さらに、改変生ワクチンおよび不活性化ワクチンはいずれも、ワクチン接種動物から感染動物を診断的に区別（ＤＩＶＡ）するための本質的特性が欠如している。したがって、ＳＩＡＶ ＤＩＶＡワクチンが必要である。ＤＩＶＡは、ブタＩＡＶ野外株に感染した動物においてＮＰ（核タンパク質）またはＮＡ（ノイラミニダーゼ）などのブタＩＡＶタンパク質に対する抗体を検出することによって実現することができる。対照的に、本明細書で記載したワクチンのみでワクチン接種した動物のみがブタＩＡＶ ＨＡタンパク質を発現し（野生型ウイルスまたはＭＬＶに感染した動物および不活性化ワクチンでワクチン接種した動物は発現しない）、このようなワクチン接種した動物では、ＮＰまたはＮＡなどのタンパク質を検出することはできず、したがってＮＰまたはＮＡに対する抗体も検出することはできない。
不活性化（死菌）ワクチンは、母系由来免疫によって子ブタのブタＩＡＶに対する防御を付与するために、分娩前の雌親ブタに適用することができる（雌ブタワクチン）。さらに、不活性化ワクチンは、子ブタに直接適用することができる（子ブタワクチン）。しかし、子ブタワクチンとして適用する場合、不活性化ワクチンは若いブタにおけるブタＩＡＶに対する母系由来免疫に打ち勝つことができない。したがって、子ブタにおける不活性化ワクチンを使用したブタＩＡＶワクチン接種は、約８週齢の開始時点で適用され、生後約１２週間以後からの免疫の発生を誘導するので、子ブタがブタＩＡＶに対して母系由来免疫によってもはや防御され得ず、子ブタのワクチン接種によってブタＩＡＶに対する防御がまだ実現していない免疫学的ギャップが生じ、したがって、このような動物はこの期間中にブタＩＡＶ感染に罹患しやすい。死菌ワクチンとは異なり、本明細書で記載したワクチンは、母系由来抗ブタＩＡＶ抗体レベルでの子ブタのワクチン接種を可能にし、引き続きその後のブタＩＡＶ感染に対する防御をもたらす。したがって、効果が高く、幼齢において母系由来抗体の存在下でも投与可能なブタＩＡＶワクチンが必要である。
任意のそのような障害を回避するために、本発明は新たな挿入部位、新たなプロモーター配列およびＳＩＡＶワクチンを提供する。
したがって、上記の技術的問題の解決策は請求項に特徴づけられる記載および実施形態によって達成され、その異なる態様内の本発明は請求項に従って実施される。
ＥＨＶベクターの能力を増大させるために、本発明はＥＨＶベクター骨格に導入遺伝子を挿入し、そこから発現させるための、新たな、および代わりとなる方法を提供する。
本発明は、本明細書で定義したＯＲＦ７０内に新たな挿入部位を有するＥＨＶベクターに関する。
本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶを提供する。
本発明は、ＥＨＶベクター、特に、組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨに外来性抗原コード配列を挿入し、そこからタンパク質を発現させるために使用することができる新たな、代わりとなる挿入部位ＯＲＦ７０に関する。
ＥＨＶ−１ベクター中における新規「ＯＲＦ７０挿入部位」は、ＯＲＦ７０に関連した部分的欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられる。完全なＯＲＦ７０の欠損はｇｐＩＩをコードするＯＲＦ７１のプロモーターに影響を及ぼすので、完全なＯＲＦ７０の欠損は、ウイルス複製、したがって、ワクチンの製造および有効性に不利であることが予測される。新規ＯＲＦ７０挿入部位および／または（発現カセットの）ＯＲＦ７０への挿入は、ＯＲＦ７１の機能が残存するか、または無傷であるように機能的に規定される。
特定の態様では、ＯＲＦ７０挿入部位はＲａｃＨのＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ部分（配列番号２０）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相同配列の欠損を包含する。ＲａｃＨゲノム配列中における欠損部分は、配列番号２０で示される（完全なＲａｃＨゲノム配列は公知ではないので、ヌクレオチド番号は利用できない）。別の特定の態様では、ＯＲＦ７０挿入部位は、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（ジェンバンク寄託番号ＡＹ６６５７１３．１）のＯＲＦ７０内の理論的８０１ｂｐ欠損を包含する。欠損部分は、野生型ａｂ４（ジェンバンク寄託番号ＡＹ６６５７１３．１）ゲノム配列のヌクレオチド１２７６８１と１２８４８２との間（配列番号１９）に位置する。
本発明では、「隣接領域」は、ＥＨＶ−１ゲノム中への外来性抗原コード配列を含む発現カセットの組換えを対象とする。これらの隣接領域は、ＥＨＶ−１中に天然に存在する。Ｕｐ７０隣接領域（４１７ｂｐ、配列番号１３）およびＵｐ７１隣接領域（４３１ｂｐ、配列番号１４）は、ｏｒｆ７０部位のために使用した全転移ベクター／プラスミドの古典的相同組換えのために選択する。野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（ジェンバンク寄託番号ＡＹ６６５７１３．１）では、対応する配列は、ヌクレオチド１２７２６４〜１２７６８０（隣接領域ｕｐ ｏｒｆ７０、配列番号１５）および１２８４８３〜１２８９１３（隣接領域ｕｐ ｏｒｆ７１、配列番号１６）に位置する。ＲＥＤ組換えでは、隣接領域は、ＸｂａＩ制限消化によってトランケートされる。これらのトランケートされた隣接領域は、いずれも前述した、４１７ｂｐ「古典的」隣接領域（Ｕｐ７０隣接領域、配列番号１３）の３’２８３ｂｐおよび４３１ｂｐ「古典的」隣接領域（Ｕｐ７１隣接領域、配列番号１４）の５’１４４ｂｐと同一である。これらのトランケートされた隣接領域は、Ｕｐ７０隣接領域（２８３ｂｐ）と呼ばれ、配列番号１７として含まれ、Ｕｐ７１隣接領域（１４４ｂｐ）は配列番号１８として含まれる。これらの様々な隣接領域は同じＯＲＦ７０挿入部位を規定する。隣接領域は常に対で使用され、１つは配列番号１３、１５、１７などの「左」隣接領域で、１つは配列番号１４、１６、１８などの「右」隣接領域である。
さらに、本発明は、導入遺伝子発現のための新しい制御核酸配列／プロモーター配列、免疫原性組成物、ワクチン、および当技術分野の欠点を克服する関連方法を提供する。
したがって、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含むプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを提供する。
したがって、本発明は、２つの新たなプロモーター：４ｐｇＧ６００および４ｐＭＣＰ６００、ならびにより短い長さのそれらの誘導体を有するＥＨＶベクターに関し、それらは細胞培養において、または細胞培養のｒＥＨＶ１−ＲａｃＨ複製の背景において、一過的なトランスフェクション後に機能的であることが示される。新たなプロモーターｐ４３０およびｐ４５５は、細胞培養において、および動物（ブタおよびマウス）においてもｒＥＨＶ１−ＲａｃＨ複製の背景で機能的であることが示される。ウイルス複製サイクル中の２つの新しいプロモーターの活性レベルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロモーター動態実験から推測されるように、非常に類似しているようである。
これらの特性は、類似の効率で並行して２つの異なる抗原を発現するＥＨＶ−１ ＲａｃＨに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチン標的が２つの異なる病原体からなる場合、２つのポリアデニル化配列と組合せた２つの挿入部位における２つの新しいプロモーターの適用は、グッズの費用を著しく削減でき、１つの抗原成分のみを発現するベクターよりもはっきりとした利点を示す。
本発明はさらに、１プロモーターの制御下でＲＮＡウイルス由来機能（２ａペプチド、ＩＲＥＳ部位）によって２つの導入遺伝子をカップリングすることなく、１つのベクター骨格から２つの異なる導入遺伝子を発現させるＥＨＶ−１ベクターに関する。
さらに、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも２つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを提供する。
さらに、本発明は、前述のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物およびＤＩＶＡワクチンを提供する。
これらの特性によって、同等の効率で並行して異なる抗原を発現させるＥＨＶ−１ ＲａｃＨをベースにした組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチン標的が２つの異なる病原体からなる場合、２つのポリアデニル化配列と組み合わせた２つの挿入部位における２つの新たなプロモーターの適用は、グッズの費用を著しく削減することができ、１つの抗原成分のみを発現させるベクターよりもはっきりとした利点を示す。
さらに、本発明はＳＩＡＶワクチンを提供する。本発明はさらに、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９およびそれらの相同配列などの特定のヘマグルチニン配列に関する。さらに、本発明は、安全で有効性の高い１価および多価ＳＩＡＶワクチンを提供する。
さらに、本発明のベクターベースＳＩＡＶワクチンは、本明細書で記載した免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンでワクチン接種した食物生産動物からブタＡ型インフルエンザウイルスに感染した食物生産動物を区別するために使用することができる。
さらに、本発明は、本明細書で記載したＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物およびＤＩＶＡワクチンの使用に関する。本発明は、食物生産動物の免疫方法、食物生産動物におけるブタＩＡＶによって引き起こされる臨床徴候の治療または予防、食物生産動物の肺においてウイルス力価を減少させる方法、および抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体を有するそれらを必要とする食物生産動物をワクチン接種する方法に関する。
野生型（ｗｔ）ＥＨＶ−１株ａｂ４と弱毒化ワクチン株ＥＨＶ−１ ＲａｃＨのｏｒｆ１／３領域を比較する概略図である。 ｏｒｆ７０挿入部位の概略図である。ＵＬ＝長いユニーク断片ＵＳ＝短いユニーク断片ＩＲ＝内部逆方向反復ＴＲ＝末端逆方向反復ｇＧ＝糖タンパク質ＧｇｐＩＩ＝糖タンパク質ＩＩｏｒｆ＝オープンリーディングフレームｂｐ＝塩基対 転移プラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列 プロモーター動態実験のｑＰＣＲ結果を示す図である。３．ａのグラフは、必須糖タンパク質Ｄをコードするｏｒｆ７２の転写の動態を示す。これらのデータはｍＣｈｅｒｒｙの転写動態のデータをノーマライズするために使用された（３．ｂのグラフ）。 ２つの独立したプロモーター動態実験のｑＰＣＲ結果を示す図である。転写活性と値の正の相関を示す。感染後異なる時間でのｍＣｈｅｒｒｙのｑＰＣＲ結果をノーマライズしたＣｔ値はｔ＝０での相当する平均Ｃｔ値から引かれた。２つの異なる細胞株での２つの実験が示される。 転移ベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列 発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１をＥＨＶ−１ ＲａｃＨのｏｒｆ７０に挿入するための、転移プラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列Ｈ３＝Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ３をコードするオープンリーディングフレーム７１ｐＡ＝本開示ＥＭＰ２０１６−０２２で記載した新たなポリＡ配列Ｉ−ＳｃｅＩ＝制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの切断部位プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性遺伝子３’末端ＯＲＦ７０＝挿入部位の下流の組換え領域ＯＲＩ＝プラスミドの複製開始点ＡＰr＝プラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上流ｏｒｆ７０＝挿入部位の上流の組換え領域ｐ４５５＝新たなプロモーターｐ４５５ｂｐ＝塩基対 ｏｒｆ７０挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のゲノムの概略図を示す図である。ｏｒｆ６９：ｏｒｆ７０の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９；ｐ４５５：本明細書に記載の新しいプロモーター、例えば例１を参照；Ｈ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列；Δｏｒｆ７０：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードするｏｒｆ７１のプロモーターを含有するｏｒｆ７０の残りの部分。 間接免疫蛍光法： ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させたＶＥＲＯ細胞の、間接免疫蛍光法を示す図である。感染後２４時間の細胞は、エタノールによって固定され、風乾された。一次抗体としてＨ３に対する市販のモノクローナル抗体および二次抗体としてＦＩＴＣコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧを使用して、Ｈ３は組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた細胞において蛍光顕微鏡によって示された。 ウェスタンブロット： ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３または対照ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥまたはモックを感染させた異なる継代の感染細胞のウェスタンブロットを示す図である。左のブロットは、ＥＨＶ−１のｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７とインキュベートされた。右のレプリカブロットは、Ａ型インフルエンザヘマグルチニンＨ３（ＰＡ５−３４９３０）に対する市販のウサギ高度免疫血清とインキュベートされた。１：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ５感染細胞、２：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ１０感染細胞、３：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ１５感染細胞、４：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ２０感染細胞、５：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ｍＣ７０感染細胞。 ウイルス力価： 個々の動物（ａ）または群平均（ｂ）のチャレンジ後１日および３日の群の平均肺力価。力価はそれぞれ、肺ホモジェネート１ｇ当たりのブタＩＡＶの組織培養感染量５０として示す。力価はそれぞれ、動物毎の左および右肺について判定された値の平均として判定し、それぞれ３つの肺試料のプールから得られた肺当たりのホモジェネートを調べた。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した（２×ＥＨＶ−１）または市販の不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した（２×Ｉｎａｃｔ．）動物。 転移ベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列 発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨをＥＨＶ−１ ＲａｃＨのｏｒｆ１／３に挿入するための、転移プラスミドｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列Ｈ１ａｖ＝Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ１をコードするオープンリーディングフレームＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリＡ配列プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性遺伝子Ｆｌａｎｋ Ｂ＝挿入部位の下流の組換え領域Ｆｌａｎｋ Ａ＝挿入部位の上流の組換え領域ｐ４３０＝新たなプロモーターｐ４３０ｂｐ＝塩基対 ｏｒｆ１／３挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖのゲノムの概略図である。Δｏｒｆ１：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム１の残りの部分；ｐ４３０：本明細書に記載の新しいプロモーター、例えば例１を参照；Ｈ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；ＢＧＨｐＡ：ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列；ｏｒｆ３：挿入部位の下流のオープンリーディングフレーム３ 導入遺伝子の発現を示す、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを感染させた細胞のウェスタンブロットおよび免疫蛍光法を示す図である。Ｈ１ａｖ＝ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖＳＥ＝ｒＥＨＶ−ＲａｃＨ−ＳＥ（対照）モック＝非感染細胞（対照） ２つの挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ｒＥＨＶ−１−ＲａｃＨ−ＳＥ Ｂ）のゲノムの概略図である。Δｏｒｆ１：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム１の残りの部分；ｐ４３０：新しいプロモーター；Ｈ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；ＢＧＨｐＡ：ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列；ｏｒｆ３：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム３。ｏｒｆ６９：ｏｒｆ７０の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム６９；ｐ４５５：新しいプロモーター；Ｈ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列；Δｏｒｆ７０：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードするｏｒｆ７１のプロモーターを含有するｏｒｆ７０の残りの部分。 ウェスタンブロット：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（Ｂ）、空ベクターｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ（ＳＥ）を感染させた細胞、またはモック感染（ｃｔｒｌ）のウェスタンブロットを示す図である。レプリカブロットは、Ｈ３に対する市販のウサギ高度免疫血清（Ｈ３）、Ｈ１に対する市販のウサギ高度免疫血清（ＰＡ３４９２９）（Ｈ１）、またはＥＨＶ−１ ｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ｇｐＩＩ）のいずれかとインキュベートされた。 チャレンジの前、ならびにチャレンジの１、２、および３日後の群の平均体温を示すグラフである。エラーバー、標準偏差。試験日当たり左から右へ：陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。 チャレンジ後１および３日の群の平均肺スコアを示すグラフである。エラーバー、標準偏差。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。 チャレンジの日に回収されたブタＩＡＶ Ｈ３チャレンジ株Ｒ４５２−１４に対する動物血清の血清中和（ＳＮ）力価の逆数を示すグラフである。２０、検出限界。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。 ブタＩＡＶチャレンジ適用後１日または２日で採取したＢＡＬＦからのＩＬ−１βの結果を示すグラフである。各ドットは、１匹の動物当たり決定された値を表す。陰性対照群（Ｎｅｇ．Ｃｔｒ．）、チャレンジ対照群（Ｃｈａｌｌ．Ｃｔｒ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。 ２回目のワクチン接種の７日後に再刺激されたＰＢＭＣのＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔｓの結果を示すグラフである。（Ａ）非ワクチン接種対照群；（Ｂ）不活性化ブタＩＡＶワクチンによる２回ワクチン接種；（Ｃ）ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による１回ワクチン接種；（Ｄ）ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による２回ワクチン接種。ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３再刺激により１回だけワクチン接種した動物は、１回目のワクチン接種後７日に相当する。各ドットは、所与の時点および特定の刺激による再刺激後に、１匹の動物当たりに決定された値を表す。再刺激のため、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＨＡ＿Ｖ）のＨ３ワクチン抗原に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ ＨＡ、チャレンジ株Ｒ４５２−１４（ＨＡ＿ＣＨ）のＨ３に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ ＨＡ、ＨＡ＿ＶおよびＨＡ＿ＣＨを希釈する培地（ＲＰＭＩ）、空ＥＨＶ−１ベクター ＲａｃＨ−ＳＥ（ＥＨＶ−１ ｅｍｐｔｙ）、ワクチンＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＥＨＶ−１−Ｈ３）、ブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４（Ｈ３Ｎ２）、Ｒ４５２−１４（ＭＤＣＫ）を増殖するために使用される非感染細胞由来の細胞上澄み液、または組換え発現されたブタＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）が使用された。 トランスファープラスミドｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨの概要マップである。 トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１の概要マップである。 ｏｒｆ１／３およびｏｒｆ７０挿入領域を拡大した、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ）の線状二本鎖ＤＮＡゲノムを示す図である。 ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂ、ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ、ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた、または非感染（ｃｔｒｌ）細胞のウェスタンブロットを示す図である。レプリカブロットは、Ｈ３に対するポリクローナルウサギ高度免疫血清（ＰＡ５−３４９３０）、Ｈ１に対するポリクローナルウサギ高度免疫血清（ＰＡ５−３４９２９）、またはＥＨＶ−１ 糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）に対するモノクローナル抗体（Ａｉ２Ｇ７）のいずれかとインキュベートされた。全ての抗体は、全ての感染細胞試料においてＥＨＶ−１ ｇｐＩＩの非常に類似した染色から判断した場合、所望の抗原Ｈ３およびＨ１の発現ならびに異なるウイルスの相当する複製効率を確認する、予測されるパターンを産生した。 Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ブタ／イタリア／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））または（Ａ／ブタ／ゲント／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））に対するマウス血清の平均中和能力を示した図である。中和能力は、血清希釈率の逆数とそれによって中和されるそれぞれの力価の掛け算によって算出された。３回の試験の平均は、次いで、１００で割られ、１００ ＴＣＩＤ５０の中和を反映した。エラーバーは標準偏差を示す。 チャレンジ後１日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。 チャレンジ後３日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。 チャレンジ後５日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。 ワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示すグラフである。試験のため、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現Ｈ３によってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は、グラフの右の凡例に示される。 ワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示すグラフである。試験のため、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現Ｈ３によってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は、グラフの右の凡例に示される。 インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）の結果を示すグラフである。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験２８日目（ＳＤ２８）に試験動物から採血された血液から精製された。ＰＢＭＣは、次いで、１（Ｈ３Ｎ２ ＭＯＩ １）の感染により複数回、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４でまたは１μｇ／ｍｌ（ｒＨ３ １μｇ／ｍｌ）の濃度でワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な組換え発現ブタＩＡＶ Ｈ３抗原でのいずれかで再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。 インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）の結果を示すグラフである。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験２８日目（ＳＤ２８）に試験動物から採血された血液から精製された。ＰＢＭＣは、次いで、１（Ｈ３Ｎ２ ＭＯＩ １）の感染により複数回、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４でまたは１μｇ／ｍｌ（ｒＨ３ １μｇ／ｍｌ）の濃度でワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な組換え発現ブタＩＡＶ Ｈ３抗原でのいずれかで再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。 組換え発現されたブタＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示した図である。試験のために、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現ＮＰによってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．、陽性対照群；ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．陰性対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１および筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、鼻腔内に２回ワクチン接種した群。エラーバーは標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は図の右の凡例に示される。
本発明は、先行技術につきものの問題を解決し、当技術の状態の明らかな進歩を提供する。全般的に、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを提供する。
さらに、本発明は、本明細書で記載したＥＨＶベクターを含み、医薬担体を含んでいてもよい免疫原性組成物を提供する。
したがって、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
有利には、本発明によって提供された実験データは、抗原を挿入し、発現させるために使用することができるＥＨＶベクター内の新たな挿入部位が提供されたことを開示する。さらに、新たな挿入部位の提供は、異なる挿入部位からの抗原の挿入および発現ならびに１つより多くの抗原の発現それぞれを可能にする。さらに、実験データは、新たな挿入部位を有するＥＨＶベクターは、１つまたは２つの部位から免疫原性組成物を提供するため、およびＤＩＶＡワクチンのためそれぞれに使用することができる。
さらに、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含むプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを提供する。
さらに、本発明は、本明細書で記載したＥＨＶベクターを含み、医薬担体を含んでいてもよい免疫原性組成物を提供する。
したがって、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくはその機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含むプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
有利には、本発明によって提供された実験データは、抗原を発現させるために使用することができる新たなプロモーター配列が提供されたことを開示する。さらに、新たなプロモーター配列の提供は、ＥＨＶベクター系などのベクター系の異なる挿入部位からの抗原の発現ならびに１つより多くの抗原の発現それぞれを可能にする。さらに、実験データは、プロモーター配列が、１つまたは２つの部位から免疫原性組成物を提供するためのＥＨＶベクター系などのベクター系において抗原を発現させるため、およびＤＩＶＡワクチンのためそれぞれに使用することができることを示している。
さらに、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも２つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを提供する。
さらに、本発明は、本明細書で記載したＥＨＶベクターを含み、医薬担体を含んでいてもよい免疫原性組成物を提供する。
したがって、本発明は、
（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも２つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
さらに、本発明は、本明細書で記載した２つまたはそれ以上のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物を提供する。好ましくは、免疫原性組成物は、２つ、３つまたは４つのＥＨＶベクターを含む。
本発明の一態様では、免疫原性組成物は２つのＥＨＶベクターを含む。
本発明の一態様では、２つまたはそれ以上のＥＨＶベクターは異なる外来性抗原コード配列を含む。好ましくは、２つまたはそれ以上のＥＨＶベクターは、ブタＡ型インフルエンザウイルスに関連する異なる外来性抗原コード配列を含む。より好ましくは、２つまたはそれ以上のＥＨＶベクターは異なるヘマグルチニンコード配列を含む。
さらに、本発明は、本明細書で記載した１つまたは複数のＥＨＶベクターを含むＤＩＶＡワクチンを提供する。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターは組換え体である。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターはＲａｃＨまたはＲａｃＨ ＳＥである。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターはＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９からなる群から選択される。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターはＥＨＶ−１である。
本発明の一態様では、食物生産動物はブタである。
本発明の一態様では、食物生産動物に感染する病原体はインフルエンザウイルス、好ましくはブタＡ型インフルエンザウイルスである。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列である。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザサブタイプは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群から選択される。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザサブタイプはＨ１および／またはＨ３である。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンＡ型インフルエンザ抗原はブタ由来である。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターは少なくとも２つのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターは少なくとも４つのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターは４つのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、Ａ／ブタ／イタリア／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／ゲント／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／イタリア／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／２５９５４３／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／デンマーク／１３７７２−１／２００３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／イングランド／ＭＤ００４０３５２Ｒ／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／ハンガリー／１３５０９／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／１３９６２／９５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／コートダルモール／１１２１／００（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／コロラド／１／７７、Ａ／ブタ／コロラド／２３６１９／９９、Ａ／ブタ／コートダルモール／３６３３／８４、Ａ／ブタ／イングランド／１９５８５２／９２、Ａ／ブタ／フィニステール／２８９９／８２、Ａ／ブタ／ホンコン／１０／９８、Ａ／ブタ／ホンコン／９／９８、Ａ／ブタ／ホンコン／８１／７８、Ａ／ブタ／イリノイ／１０００８４／０１、Ａ／ブタ／イリノイ／１０００８５Ａ／０１、Ａ／ブタ／イリノイ／２１５８７／９９、Ａ／ブタ／インディアナ／１７２６／８８、Ａ／ブタ／インディアナ／９Ｋ０３５／９９、Ａ／ブタ／インディアナ／Ｐ１２４３９／００、Ａ／ブタ／アイオワ／３０、Ａ／ブタ／アイオワ／１５／３０、Ａ／ブタ／アイオワ／５３３／９９、Ａ／ブタ／アイオワ／５６９／９９、Ａ／ブタ／アイオワ／３４２１／９０、Ａ／ブタ／アイオワ／８５４８−１／９８、Ａ／ブタ／アイオワ／９３０／０１、Ａ／ブタ／アイオワ／１７６７２／８８、Ａ／ブタ／イタリア／１５１３−１／９８、Ａ／ブタ／イタリア／１５２３／９８、Ａ／ブタ／朝鮮／ＣＹ０２／０２、Ａ／ブタ／ミネソタ／５５５５１／００、Ａ／ブタ／ミネソタ／５９３／９９、Ａ／ブタ／ミネソタ／９０８８−２／９８、Ａ／ブタ／ネブラスカ／１／９２、Ａ／ブタ／ネブラスカ／２０９／９８、Ａ／ブタ／オランダ／１２／８５、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／１６４９７／９９、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／３５９２２／９８、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／９３５２３／０１、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／９８２２５／０１、Ａ／ブタ／アウーデローデ／７Ｃ／９６、Ａ／ブタ／オハイオ／８９１／０１、Ａ／ブタ／オクラホマ／１８７１７／９９、Ａ／ブタ／オクラホマ／１８０８９／９９、Ａ／ブタ／オンタリオ／０１９１１−１／９９、Ａ／ブタ／オンタリオ／０１９１１−２／９９、Ａ／ブタ／オンタリオ／４１８４８／９７、Ａ／ブタ／オンタリオ／９７、Ａ／ブタ／ケベック／１９２／８１、Ａ／ブタ／ケベック／１９２／９１、Ａ／ブタ／ケベック／５３９３／９１、Ａ／ブタ／台湾／７３１０／７０、Ａ／ブタ／テネシー／２４／７７、Ａ／ブタ／テキサス／４１９９−２／９８、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１２５／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１３６／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６３／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６４／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６６／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６８／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／２３５／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／２３８／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／４５７／９８５、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／４５８／９８、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／４６４／９８およびＡ／ブタ／ウィスコンシン／１４０９４／９９からなる株の群から選択される。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、Ａ／ブタ／イタリア／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／ゲント／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ブタ／イタリア／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）からなる株の群から選択される。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
本発明の一態様では、外来性抗原コード配列はＡ型インフルエンザウイルスＮ（ノイラミニダーゼ）コード配列であり、ＮサブタイプはＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９およびＮ１０からなる群から選択される。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンはＮ（ノイラミニダーゼ）インフルエンザ抗原コード配列を含まない。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンはＮＰ（核タンパク質）インフルエンザ抗原コード配列を含まない。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターは終結シグナルまたはポリアデニル化配列などのさらなる制御配列を含む。
挿入部位：
本発明の一態様では、前記挿入部位はＯＲＦ１／３である。
本発明の一態様では、前記挿入部位はＯＲＦ７０である。
本発明の一態様では、食物生産動物に感染する病原体に関連する第１の外来性抗原コード配列はＯＲＦ７０に挿入されている。
本発明の一態様では、食物生産動物に感染する病原体に関連する第２の外来性抗原コード配列はＯＲＦ１／３に挿入されている。
本発明の一態様では、ＯＲＦ７０への挿入はＯＲＦ７０における部分的欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられ、それによってＯＲＦ７１の機能が残存している。
本発明の一態様では、ＯＲＦ７０への挿入は、ＲａｃＨのＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ部分（配列番号２０）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相同および／または同一な配列の欠損によって特徴づけられる。
本発明のベクターの別の特定の態様では、ＯＲＦ７０への挿入は、ＲａｃＨのＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ部分（配列番号２０）の欠損または任意のその他の株におけるその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列欠損によって特徴づけられる。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、ＯＲＦ７０への挿入は、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（ジェンバンク寄託番号ＡＹ６６５７１３．１）のＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ欠損の欠損によって特徴づけられ、それによって野生型ａｂ４ゲノム配列における欠損部分がヌクレオチド１２７６８１と１２８４８２の間（配列番号１９）に位置し、またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列によって特徴づけられる。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、ＯＲＦ７０への挿入は、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（ジェンバンク寄託番号ＡＹ６６５７１３．１）のＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ欠損の欠損によって特徴づけられ、それによって野生型ａｂ４ゲノム配列における欠損部分がヌクレオチド１２７６８１と１２８４８２の間（配列番号１９）に位置し、または任意のその他の株におけるその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列欠損によって特徴づけけられる。
本発明の一態様では、ＥＨＶ−１ベクターは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８ならびにこれらの配列のいずれか１つと７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む。
本発明の一態様では、ＥＨＶ−１ベクターは、（ｉ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７からなる群から選択される少なくとも１つの左ＯＲＦ７０隣接領域、ならびに（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの右ＯＲＦ７０隣接領域を含む。
プロモーター：
本発明の一態様では、プロモーター配列はＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片からなる群から選択され、好ましくは前記機能的断片がｐ４３０（配列番号３）、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片であり、好ましくは前記機能的断片がｐ４５５（配列番号４）、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片である。
本発明の一態様では、プロモーター配列は４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含む。
本発明の一態様では、プロモーター配列の機能的断片または誘導体は、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の相同性を有する。
本発明の一態様では、プロモーター配列の機能的断片または誘導体は、５５０ヌクレオチド、好ましくは、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有する。
本発明の一態様では、プロモーター配列の機能的断片は、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは、配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％（またはより高い）である。
本発明の一態様では、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のプロモーター配列の機能的断片は、４３０ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である。別の態様では、配列同一性は（少なくとも）７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。
本発明の一態様では、プロモーター配列の機能的断片は、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％である（またはより高い）。
本発明の一態様では、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のプロモーター配列の機能的断片は、ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。別の態様では、配列同一性は（少なくとも）７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。
本発明の一態様では、ＥＨＶベクターは、終結シグナル、ポリアデニル化シグナルまたはＩＲＥＳおよび／または２ａペプチドのような制御エレメントなどの１つまたは複数のさらなる制御配列を含む。
プロモーターおよび抗原の特定の組み合わせ：
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２８で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片は、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２７で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片は、４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２８で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、
プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２７で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片は、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片であり、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片は４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは２価である。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片は、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２６で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片は、４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２６で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片は、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片であり、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片は４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは２価である。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物は、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２８で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、
プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２７で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している第１のＥＨＶベクターを含み、
前記免疫原性組成物は、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、
プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２６で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している第２のＥＨＶベクターを含む。
本発明の一態様では、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片はｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片であり、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片は４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは４価である。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは単回用量投与のために製剤化されている。
好ましくは、単回用量の全量は、約０．２ｍｌと２．５ｍｌの間、より好ましくは約０．２ｍｌと２．０ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．２ｍｌと１．７５ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．２ｍｌと１．５ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．４ｍｌと１．２５ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．４ｍｌと１．０ｍｌの間で、１回の０．５ｍｌ用量または１．０ｍｌ用量が最も好ましい。最も好ましい単回用量の全量は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌまたは２ｍｌである。
本発明の免疫原性組成物の一用量は、このような免疫原性組成物のこのような単回用量の投与後に有効であることがさらに示された。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは筋肉内または鼻腔内に投与する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは６週齢以内、２週齢以内、１週齢以内または１日齢以内の子ブタにとって安全である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンはさらに薬学的に許容される担体を含む。
本発明の一態様では、前記薬学的に許容される担体は水添加注射液（ａｑｕａ ａｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｅｍ）、細胞培養培地または再懸濁緩衝液である。
本発明の一態様では、前記再懸濁緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは１×１０4から１×１０9の組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ50）、好ましくは１×１０4と１×１０8の間のＴＣＩＤ50、さらにより好ましくは１×１０4から１×１０7のＴＣＩＤ50のＥＨＶベクターを含む。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物はワクチンである。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは多価ワクチンである。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは２価ワクチン、４価ワクチン、６価ワクチンまたは７価ワクチンである。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは２価ワクチンまたは４価ワクチンである。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、それを必要とする食物生産動物におけるブタＡ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候の治療および／または予防において有効である。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンはブタＡ型インフルエンザウイルスによる同種および／または異種チャレンジに対して防御する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは血清型Ｈ１および／またはＨ３のブタＡ型インフルエンザウイルスによるチャレンジに対して防御する。
キット
組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在してよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与、好ましくは食物生産動物、特にブタへの投与のための指示が添付されていてもよい。そのような容器に関しては、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で通知され、その通知は、動物への投与のための製造、使用または販売機関による認可を反映している。
本発明は、本明細書で記載した免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを含むキットを提供する。
本発明の一態様では、キットはさらに、ブタＡ型インフルエンザウイルスの治療および／または予防のための指示書を含む。
処置の方法
本発明は、本明細書に記載のように免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを食物生産動物に投与するステップを含む、食物生産動物を免疫する方法を提供する。
好ましくは、免疫は、群れにおける特別なブタＡ型インフルエンザウイルス感染の発生率の低下または特別なブタＡ型インフルエンザウイルス感染によって引き起こされるか、または関連する臨床徴候の重症度の軽減を引き起こす。
さらに、本明細書で提供したように免疫原性組成物を必要とする食物生産動物の免疫は、ブタＡ型インフルエンザウイルス感染による食物生産動物の感染の予防をもたらす。さらにより好ましくは、免疫は、有効な、長期持続する、ブタＡ型インフルエンザウイルス感染に対する免疫学的応答をもたらす。前記期間は２カ月より長く、好ましくは３カ月より長く、より好ましくは４カ月より長く、より好ましくは５カ月より長く、より好ましくは６カ月より長く続くことが理解されるであろう。免疫は、免疫された全ての動物に有効ではない場合があることが理解される。しかしながら、家畜の大部分の動物が有効に免疫される期間が必要である。
好ましくは、食物生産動物の群れは、この文脈において、通常、すなわち、免疫されていなければ、ブタＡ型インフルエンザウイルス感染によって通常引き起こされるか、または関連する臨床徴候を発症すると考えられる。群れの食物生産動物が効率的に免疫されるかどうかは、当業者にとって難なく判定することができる。好ましくは、免疫は、所与の群れの動物の少なくとも３３％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％における臨床徴候が、免疫されていないか、または本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫されたが、その後特別なブタＡ型インフルエンザウイルスに感染した食物生産動物と比較して、発生率または重症度が少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％低下しているならば、有効である。
本発明は、それを必要とする食物生産動物において、Ａ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候の処置または予防の方法を提供し、方法は、本明細書に記載のように治療有効量の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを食物生産動物に投与するステップを含む。
好ましくは、臨床徴候は、処置していない（免疫していない）が、特別なＡ型インフルエンザウイルスに続いて感染した食物生産動物と比較して、少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％低減される。
本発明は、同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、それを必要とする食物生産動物の肺におけるウイルス力価を減少させる方法であって、食物生産動物に治療有効量の本明細書で記載した免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法を提供する。しかし、前記ウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、好ましくはブタＡ型インフルエンザウイルスであると理解されたい。
好ましくは、肺におけるウイルス力価は、その後特別なＡ型インフルエンザウイルスに感染する同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％減少する。
有利には、本発明によって提供された実験データは、ブタに投与したときの本明細書で提供した免疫原性組成物の安全性および有効性を開示する。実際に、本明細書で提供した免疫原性組成物でワクチン接種したブタは、非ワクチン接種子ブタと比較して、ウイルス感染チャレンジ後の肺ウイルス力価の減少など、疾患に関連する臨床徴候が軽減した。
本発明は、抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体を有するそれを必要とする食物生産動物をワクチン接種する方法であって、前記食物生産動物に治療有効量の本明細書で記載した免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与するステップを含む方法を提供する。
しかし、ブタＡ型インフルエンザウイルス感染に応答して子ブタによって作られる抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体は、非ワクチン接種子ブタに存在し得る。あるいは、非ワクチン接種子ブタにおける抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体は、ブタＡ型インフルエンザウイルスワクチンによる雌ブタのワクチン接種に応答して、または雌ブタのブタＡ型インフルエンザウイルス感染に応答して発生した母系由来抗体である。母系由来抗体は、初乳および母乳を介して雌ウシから子ブタに受動的に移行する。
母系由来抗体のワクチン抗原との干渉は、生ワクチンならびに不活性化ワクチンに対する免疫応答を低下させるか、または失わせることもある。母系由来抗体によってワクチン誘導免疫応答が様々な程度で干渉されることは、生ワクチン、ならびに非複製ワクチン（すなわち、不活性化ワクチンまたはサブユニットワクチン）で報告されたことがある。
したがって、本明細書で記載したブタＩＡＶワクチンは、ブタＩＡＶに対する母系由来抗体の存在下で子ブタにうまく適用することができ、ブタＩＡＶ感染に対する防御をもたらす。
さらに、本明細書で記載したブタＩＡＶワクチンによる雌ブタのワクチン接種は、雌ブタの免疫および母系由来抗体の子ブタへの移行を引き起こす。
したがって、本発明は、若い食物生産動物においてＡ型インフルエンザウイルスに対する母系由来免疫をもたらす方法であって、母親が前記若い食物生産動物を妊娠している間に、前記若い食物生産動物の前記母親に治療有効量の本明細書で記載した免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法を提供する。
本明細書で記載したブタＩＡＶワクチンは、母系由来抗体の存在下で子ブタにうまく適用することができるので、前記ワクチンは雌ブタワクチン接種および前記雌ブタが分娩した子ブタのその後のワクチン接種のために使用することができる。ワクチン接種した雌ブタは、抗体を含む母系由来免疫を子ブタに移行する。しかし、本明細書で記載したブタＩＡＶワクチンは母系由来抗体と干渉しないので、子ブタは幼齢において同ワクチンでワクチン接種することができる。さらに、本明細書で記載したワクチンまたは任意のその他のブタＩＡＶ雌ブタワクチンで雌ブタならびに雌ブタが分娩した若い子ブタをワクチン接種することによって、Ａ型インフルエンザウイルス感染に対する防御が増大する。生後数日から数週間、子ブタは母系由来免疫によって防御されている。さらに、子ブタの早期ワクチン接種によって、子ブタはＡ型インフルエンザウイルス感染に対する免疫を得、したがって、母系由来免疫の消失とワクチン接種の開始との間の免疫学的ギャップが生じることなく防御される。
本発明は、それを必要とする若い食物生産動物においてＡ型インフルエンザウイルス感染に対する防御の増大をもたらす方法であって、
ａ）前記若い食物生産動物の母親が前記若い食物生産動物を妊娠している間に、前記母親に治療有効量の本明細書で記載した免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンをワクチン接種し、および／または
ｂ）前記若い食物生産動物に３週齢以内に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンをワクチン接種する方法を提供する。
好ましくは、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、妊娠雌ブタが分娩する前に、好ましくは１回の基礎免疫の後に少なくとも１回投与し、より好ましくは２回のワクチン接種を行った（「反復投与」）。免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを雌ブタに３回投与する場合、最初の基礎免疫は分娩前１１６日から６０日の間、好ましくは分娩前１１６日から５８日の間、最も好ましくは分娩前１１６日から５６日の間に行うべきである。２回目の基礎免疫は分娩前９５日から４０日の間、好ましくは分娩前９５日から３８日の間、最も好ましくは分娩前９５日から３５日の間に行うべきである。分娩前の最後の追加投与は、分娩前１０日から２０日の間、好ましくは分娩前１２日から１８日の間、最も好ましくは分娩前１４日に行うべきである。
免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、好ましくは子ブタが３週齢に達する前に子ブタに投与する。好ましくは、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、子ブタそれぞれに１日齢から２１日齢、より好ましくは１日齢から１０日齢、さらにより好ましくは１日齢から９日齢、さらにより好ましくは１日齢から８日齢、さらにより好ましくは１日齢から７日齢、さらにより好ましくは１日齢から６日齢、さらにより好ましくは１日齢から５日齢、さらにより好ましくは１日齢から４日齢、さらにより好ましくは１日齢から３日齢、さらにより好ましくは１日齢から２日齢、最も好ましくは１日齢に投与する。
しかし、免疫原性組成物は、子ブタに２回またはそれ以上の用量で投与することができ、最初の用量は２回目（追加免疫）の用量の投与前に投与する。好ましくは、最初の用量は、２週齢以内に、より好ましくは１週齢以内に、さらにより好ましくは１日齢以内に投与する。好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の少なくとも１５日後に投与する。より好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の１５日後から４０日後の間に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の少なくとも１７日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の１７日後から３０日後の間に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は最初の用量の少なくとも１９日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の１９日後から２５日後の間に投与する。最も好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の少なくとも２１日後に投与する。２回投与計画の好ましい態様では、免疫原性組成物の１回目および２回目の用量はいずれも同じ量で投与する。好ましくは、各用量は上記で明記した好ましい量であり、１回目および２回目の用量については１ｍｌの用量が最も好ましい。１回および２回の用量計画に加えて、代替の実施形態にはさらにその後の用量が含まれる。例えば、３回目、４回目または５回目の用量をこれらの態様で投与することができる。好ましくは、その後の３回、４回および５回の用量計画は、１回目の用量と同じ量で投与し、投与間の時間枠は前述した１回目と２回目の用量の間のタイミングと一致する。したがって、前記方法は、妊娠雌ブタならびに分娩した子ブタのワクチン接種を意味する。
本発明の一態様では、食物生産動物は、ブタ、子ブタまたは雌ブタである。
本発明の一態様では、Ａ型インフルエンザウイルスはブタＡ型インフルエンザウイルスである。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは１回で投与する。
単回用量は１回のみで投与されるものと理解されたい。実施例で示したように、本明細書で提供した免疫原性組成物は、単回用量の投与後に効果的であることがわかった。
好ましくは、単回用量の全量は、約０．２ｍｌと２．５ｍｌの間、より好ましくは約０．２ｍｌと２．０ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．２ｍｌと１．７５ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．２ｍｌと１．５ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．４ｍｌと１．２５ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．４ｍｌと１．０ｍｌの間で、１回の０．５ｍｌ用量または１．０ｍｌ用量が最も好ましい。最も好ましい単回用量の全量は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌまたは２ｍｌである。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、食物生産動物に、６週齢以内、２週齢以内、１週齢以内または１日齢以内に投与する。
好ましくは、免疫する食物生産動物は、１日齢から４０日齢、１日齢から３０日齢、１日齢から２１日齢、より好ましくは、免疫する前記食物生産動物は１日齢から１０日齢、さらにより好ましくは１日齢から９日齢、さらにより好ましくは１日齢から８日齢、さらにより好ましくは１日齢から７日齢、さらにより好ましくは１日齢から６日齢、さらにより好ましくは１日齢から５日齢、さらにより好ましくは１日齢から４日齢、さらにより好ましくは１日齢から３日齢、さらにより好ましくは１日齢または２日齢、最も好ましくは１日齢または０日齢である。
好ましくは、免疫する食物生産動物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日齢である。より好ましくは、免疫する前記食物生産動物は、１、２、３、４、５、６または７日齢である。しかし、２、３日齢である食物生産動物をワクチン接種した後、食物生産動物の免疫系がブタＡ型インフルエンザウイルス感染に対する免疫を確立するために数日必要であることを理解されたい。したがって、好ましくは、食物生産動物は１日齢以内に免疫する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは２用量で投与する。
実施例で示したように、本明細書で提供した免疫原性組成物は、２用量の投与後に効果的であることがわかった。
しかし、免疫原性組成物は、２回またはそれ以上の用量で投与することができ、最初の用量は２回目（追加免疫）の用量の投与前に投与する。好ましくは、最初の用量は、２週齢以内に、より好ましくは１週齢以内に、さらにより好ましくは１日齢以内に投与する。好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の少なくとも１５日後に投与する。より好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の１５日後から４０日後の間に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の少なくとも１７日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の１７日後から３０日後の間に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は最初の用量の少なくとも１９日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の１９日後から２５日後の間に投与する。最も好ましくは、２回目の用量は、最初の用量の少なくとも２１日後に投与する。２回投与計画の好ましい態様では、免疫原性組成物の１回目および２回目の用量はいずれも同じ量で投与する。好ましくは、各用量は上記で明記した好ましい量であり、１回目および２回目の用量については１ｍｌの用量が最も好ましい。１回および２回の用量計画に加えて、代替の実施形態にはさらにその後の用量が含まれる。例えば、３回目、４回目または５回目の用量をこれらの態様で投与することができる。好ましくは、その後の３回、４回および５回の用量計画は、１回目の用量と同じ量で投与し、投与間の時間枠は前述した１回目と２回目の用量の間のタイミングと一致する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは食物生産動物に、１週齢以内に投与し、２回目を２週齢以内、３週齢以内または４週齢以内に投与する。
本発明の一態様では、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは筋肉内または鼻腔内に投与する。
免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、好ましくは、局所的または全身に投与する。従来使用されている適切な投与経路は、経口または非経口投与、例えば、鼻腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下ならびに吸入である。しかし、化合物の性質および作用様式に応じて、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、その他の経路によって同様に投与してもよい。しかし、最も好ましくは、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは筋肉内または鼻腔内に投与する。
本発明の一態様では、食物生産動物は、抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体陰性である。
本発明の一態様では、食物生産動物は、抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体陽性である。好ましくは、抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体力価は、ヘマグルチニン阻害試験および／またはウイルス中和試験によって判定し、それぞれ、１：２と１：２０４８との間、１：２と１：１０２４との間、１：２と１：５１２との間、１：２と１：２５６との間、１：２と１：１２８との間、１：２と１：６４との間、１：２と１：３２との間、１：２と１：１６との間、１：６４と１：２０４８との間、１：６４と１：１０２４との間または１：６４と１：５１２との間である。あるいは、またはさらに、抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体力価は、抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体陽性および陰性試料それぞれについて確立された、または推奨された試験特異的閾値を使用することによって評価されるＥＬＩＳＡ測定法によって判定する。
母系由来抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体を測定する方法は、当業者の一般知識の範囲内である。
好ましくは、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは１×１０4から１×１０9のＴＣＩＤ50、好ましくは１×１０4と１×１０8の間のＴＣＩＤ50、さらにより好ましくは１×１０4から１×１０7のＴＣＩＤ50のＥＨＶベクターを含む。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは１×１０4から１×１０7ＴＣＩＤ50のＥＨＶベクターを含む。
本発明の一態様では、前記方法は、同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、体重減少の低下、肺におけるウイルス負荷の減少、肺病変の減少、ウイルス排出の減少および／または短縮、直腸温度の低下、臨床症状（特に呼吸器症状）の減少、（中和）抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体の誘導増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＴ細胞刺激の増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＢ細胞刺激の増加および肺における炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ１βの減少またはそれらの組み合わせからなる群から選択される有効性パラメータの改善を引き起こす。
本発明の一態様では、治療または予防は、同種の非治療対照群の食物生産動物と比較してウイルス負荷期の短縮をもたらす。
好ましくは、治療または予防は、ウイルス負荷期の、その後特別なブタＡ型インフルエンザウイルスに感染する同種の非治療対照群の食物生産動物と比較して、少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％短縮を引き起こす。
好ましくは、治療または予防は、ブタＡ型インフルエンザウイルスの排出を同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、ブタＡ型インフルエンザウイルスのチャレンジまたは感染の５日後から、より好ましくはチャレンジまたは感染の４日後から、より好ましくはチャレンジまたは感染の３日後から、最も好ましくはチャレンジまたは感染の１もしくは２日後からの減少を引き起こす。
本発明の一態様では、治療または予防は、チャレンジ（感染）１日後からのＡ型インフルエンザウイルスの排出の減少をもたらす。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンはＡ型インフルエンザウイルスによる同種および／または異種チャレンジに対して防御する。
本発明の一態様では、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは血清型Ｈ１および／またはＨ３のＡ型インフルエンザウイルスによるチャレンジに対して防御する。
本発明はまた、治療で使用するための本明細書で記載したＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンに関する。
本発明はまた、免疫原またはワクチンとして使用するための本明細書で記載したＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンに関する。
本発明はまた、医薬品として使用するための本明細書で記載したＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンに関する。
本発明はまた、医薬品の製造のための本明細書で記載したＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンの使用に関する。
本発明はまた、食物生産動物におけるブタＡ型インフルエンザウイルス感染の治療および／または予防のための本明細書で記載したＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンの使用に関する。
ＤＩＶＡ
効果的なＤＩＶＡワクチンの主要な利点は、急性的に感染した、またはワクチン接種した動物集団で試料を採取する前のいつか（少なくとも約３週間前）に感染した食物生産動物（好ましくはブタ）の検出を可能にし、したがって、動物集団における病原体（好ましくはブタインフルエンザウイルス）の拡散または再導入をモニターする可能性をもたらすことである。したがって、これによって、ワクチン接種したブタ集団には研究室試験結果に基づいて、一定レベルの信頼度で、ブタＡ型インフルエンザウイルスがないと断言することができる。
マーカーワクチンは、迅速で効果的な投与を容易にし、および野外ウイルス（疾患に関連した）に感染した動物とワクチン接種した動物との識別を可能にする。
本発明の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、Ｎ（ノイラミニダーゼ）インフルエンザ抗原コード配列および／またはＮＰ（核タンパク質）インフルエンザ抗原コード配列をコードする任意の抗原コード配列を含まない。
対照的に、野生型ブタＡ型インフルエンザウイルスで動物を感染させた後、または改変生ワクチンでワクチン接種するか、または不活性化全ウイルスワクチンでワクチン接種するか、または母系由来抗体が残存する場合、感染した／ワクチン接種した動物は、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に対する特異的抗体を産生／有する。しかし、本発明による免疫原性組成物でワクチン接種した動物では、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に対するこのような特異的抗体を検出することはできない。
例示した免疫試験および／またはゲノム分析試験によって、本発明の免疫原性組成物のみでワクチン接種した動物は、野生型ブタインフルエンザウイルスに感染した、または改変生ワクチンでワクチン接種した、または不活性化全ウイルスワクチンでワクチン接種した、または母系由来抗体が残存する動物と区別することができ、本発明の免疫原性組成物のみでワクチン接種した動物はＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に対するいかなる特異的抗体およびＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をコードするいかなるブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列もそれぞれ有さない。
本発明は、ブタＡ型インフルエンザウイルスで感染した食物生産動物を本明細書で記載した免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンでワクチン接種した食物生産動物から区別する方法であって、
ａ）食物生産動物から試料を入手すること、および
ｂ）前記試料を免疫試験および／またはゲノム分析試験で分析すること
を含む方法を提供する。
本発明の一態様では、免疫試験は、試料がブタインフルエンザのＮ（ノイラミニダーゼ）タンパク質またはＮＰ（核タンパク質）タンパク質を特異的に認識する抗体を含むかどうかを試験することを含む。
本発明の一態様では、ブタインフルエンザのＮ（ノイラミニダーゼ）タンパク質またはＮＰ（核タンパク質）タンパク質を特異的に認識する抗体が検出された場合、食物生産動物はブタＡ型インフルエンザウイルスに感染している。
本発明の一態様では、ゲノム分析試験は、試料がＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をコードするブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列を含むかどうかを試験することを含む。
本発明の一態様では、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をコードするブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列が検出された場合、食物生産動物はブタＡ型インフルエンザウイルスに感染している。
本発明の一態様では、免疫試験はＥＩＡ（酵素免疫測定法）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）であり、あるいはゲノム分析試験がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法）またはリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）である。
本発明の一態様では、食物生産動物はブタである。
本発明の一態様では、試料は血清試料である。
好ましくは、野生型ＳＩＡＶのＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に特異的な抗体は、ＳＩＡＶに感染したことが疑われるブタまたは本発明によるワクチンでワクチン接種したブタの呼吸器の切片におけるＳＩＡＶ抗原を検出するために使用される。このような場合、感染したブタまたは改変生ワクチンでワクチン接種したブタまたは不活性化全ウイルスワクチンでワクチン接種したブタまたは母系由来抗体が残存するブタの試料のみが、前記Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）特異的抗体によって陽性結果を示すだろう。対照的に、本発明のワクチンにはこのような抗原はないので（ヘマグルチニンのみ）、本発明のワクチンでワクチン接種したブタの試料は、前記Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）特異的抗体によっていかなる結果も示さないだろう。
しかし、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）のエピトープは、進化的に保存されており、ＳＩＡＶに特異的で、中和抗体の標的である。
したがって、試験は、例えば、マイクロウェルアッセイプレートに架橋結合させた野生型ＳＩＡＶのＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープを含むウェルを含む。前記架橋結合は、好ましくは、例えば、ポリ−Ｌ−リジンなどのアンカータンパク質によって実施される。野生型Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープを入手するための発現系は、当業者には周知である。あるいは、前記Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープは、化学的に合成することができた。
本発明によるワクチンのみでワクチン接種した動物では、野生型Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープに対する抗体は生じなかった。しかし、このような動物は、本発明によるＨＡ（ヘマグルチニン）エピトープに対する抗体を生じた。結果的に、抗体は野生型Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープでコーティングしたウェルには結合しない。対照的に、ウェルが本発明によるＨＡエピトープでコーティングされた場合、抗体は前記置換ＨＡエピトープに結合する。
本発明の一態様では、ＥＬＩＳＡは、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡまたはブロッキングＥＬＩＳＡである。
しかし、様々なＥＬＩＳＡ技術が当業者には周知である。ＥＬｌＳＡはWensvoort G. et al., 1988 (Vet. Microbiol. 17(2): 129-140)、Robiolo B. et al., 2010 (J. Virol. Methods. 166(1 -2): 21-27)およびColijn, E.O. et al., 1997 (Vet. Microbiology 59: 15-25)によって具体的に記載されている。
好ましくは、野外ＳＩＡＶに感染した、または改変生ワクチンでワクチン接種した、または不活性化全ウイルスワクチンでワクチン接種した、または母系由来抗体が残存する動物と本発明のワクチンでのみワクチン接種した動物とを区別する試験は、呼吸器細胞のＲＮＡ単離および逆転写酵素およびその後のｃＤＮＡの増幅によって実現する。Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）の特異的プライマーを使用して、ＰＣＲを実施することができる。このような場合、陽性ＰＣＲシグナルがあればブタは野生型ＳＩＡＶに感染している。しかし、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）特異的配列が増幅できない場合、動物は本発明のワクチンでワクチン接種されている。
さらに、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）および／または特異的ＨＡ（ヘマグルチニン）のいずれかを認識するリアルタイムベース技術のプライマーおよび／またはプローブを使用してもよい。しかし、このような方法は当業界では周知である。
本発明の別の態様では、ゲノム分析試験は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法）またはリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）である。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるはずであるが、あらゆる潜在的な多義性がある場合には、本明細書で提供した定義は、任意の辞書の定義または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書では、特に言及しない限り、「または（or）」の使用は「および／または（and/or）」を意味する。さらに、用語「含む（including）」ならびに「含む（includes）」および「含まれる（included）」など他の形態の使用は限定されない。本明細書で参照した全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定のＤＮＡ、ポリペプチド配列またはプロセスのパラメーターに限定されず、当然変化し得るものと理解される。本明細書で使用する用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が特に明確に規定しない限り、複数の参照を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（an antigen）」という言及は２つまたはそれ以上の抗原の混合物を含み、「賦形剤（an excipient）」という言及は２つまたはそれ以上の賦形剤の混合物を含むなどである。
分子生物学定義
用語「ベクター」は、当技術分野で公知のように、遺伝材料を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成されるまたはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養でも宿主動物でもウイルスベクターの複製に機能を持たない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の特定の態様に従って、ベクターは、遺伝材料の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクションのため、ワクチン、例えばＤＮＡワクチンとしての使用のため、または遺伝子発現目的のためなど、様々な態様のために使用され得る。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列によって導かれるように細胞におけるタンパク質の生合成を記載する用語である。特定の態様では、ベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである「発現ベクター」であってよい。
ベクターおよび発現のためにベクター（または組換え体）を作製および／または使用する方法は、特に、米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７号、第４，７２２，８４８号、第５，９４２，２３５号、第５，３６４，７７３号、第５，７６２，９３８号、第５，７７０，２１２号、第５，９４２，２３５号、第３８２，４２５号、ＰＣＴ国際公開第９４／１６７１６号、国際公開第９６／３９４９１号、国際公開第９５／３００１８号、Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al., U.S. Pat. No. 4,745,051(recombinant baculovirus)；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；ＥＰＡ０３７０５７３；米国特許出願第９２０，１９７号、１９８６年１０月１６日出願；欧州特許出願公開第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５，５９１，４３９号、第５，５５２，１４３号；国際公開第９８／００１６６号；両方とも１９９６年７月３日に出願された、許可された米国特許出願第０８／６７５，５５６号、および第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；および米国特許第５，５９１，６３９号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号、ならびに国際公開第９０／１１０９２号、国際公開第９３／１９１８３号、国際公開第９４／２１７９７号、国際公開第９５／１１３０７号、国際公開第９５／２０６６０号；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectorsに開示の方法によるまたは類似してよい。また、国際公開第９８／３３５１０号；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)；Sanford et al.,米国特許第４，９４５，０５０号；Fischbachet al. (Intracel)；国際公開第９０／０１５４３号；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)；Szoka et al.,米国特許第４，３９４，４４８号（生細胞にＤＮＡを挿入する方法）；McCormick et al.,米国特許第５，６７７，１７８号 （細胞変性ウイルスの使用）;および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）；ならびに本明細書で引用した他の文献も参照。
用語「ウイルスベクター」は宿主細胞にそれが入り込むと特定の生物活性、例えばベクターによって運ばれた導入遺伝子の発現をもたらすように、組換えＤＮＡ技術によって操作された遺伝子改変ウイルスを記載する。特定の態様では、導入遺伝子は抗原である。ウイルスベクターは標的細胞、組織、または生物において複製可能であってもなくてもよい。
ウイルスベクターの生成は、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) or K. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))に記載されるように、限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡシーケンシング、細胞培養へのトランスフェクションの標準的な技術を含む、当技術分野で周知の好適な遺伝子工学技術を使用して達成され得る。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムからの配列を組み込むことができる。配列は、それらの自然な形態に組み込まれることができ、または任意の方法で改変され、所望の活性を得ることができる。例えば、配列は、挿入、欠損または置換を含むことができる。
ウイルスベクターは２つまたはそれ以上の目的のタンパク質のコード領域を含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、目的の第１のタンパク質のコード領域および目的の第２のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第１のタンパク質および目的の第２のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、目的の第３または第４のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第３および第４のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。１つのウイルスベクターによってコードされる目的の２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は異なり得る。例えば、２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は、少なくとも約２００アミノ酸であってよい。少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、またはそれ以上。
好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４由来などのヘルペスウイルスベクターを含む。
本開示の特定の態様に従って、用語「ウイルスベクター」または代わりに「ウイルス構築物」は、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９などのヘルペスウイルス科から選択されるウイルス由来の組換えウイルス構築物を指す。好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４に由来するなど、ヘルペスウイルスベクターを含む。
用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は交換可能に使用することができる。
用語「構築物」は、本明細書で使用する場合、人工的に生成されたプラスミド、ＢＡＣ、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
用語「プラスミド」は、細菌宿主細胞内の細菌染色体とは独立して複製する細胞質のＤＮＡを指す。本発明の特定の態様では、用語「プラスミド」および／または「トランスファープラスミド」は、例えばウイルスベクターへの挿入のための発現カセットの構築に有用な組換えＤＮＡ技術のエレメントを指す。別の特定の態様では、用語「プラスミド」は、ＤＮＡワクチン接種目的のために有用なプラスミドを特定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能であり任意の核酸を指す。
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ＲＮＡ配列」、ｃＤＮＡ配列または「ＤＮＡ配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびその断片および部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それらは一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表してよい。配列は、非コード配列、コード配列、または両方の混合であってよい。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製され得る。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も特別に含む。
用語「制御核酸」、「制御エレメント」および「発現調節エレメント」は交換可能に使用され、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に影響し得る核酸分子を指す。これらの用語は、プロモーター、プロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む、転写を促進または制御する全てのエレメントに広く使用され、全てのエレメントをカバーする。原核生物における例示的な制御エレメントは、プロモーター、オペレーターシーケンスおよびリボソーム結合部位を含む。真核細胞において使用される制御エレメントは、限定はされないが、転写および翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ピコルナウイルス２Ａ配列等を含むことができ、コード配列の発現および／または宿主細胞におけるコードポリペプチドの産生を提供および／または制御する。
「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳの５’の遺伝子に非依存的に翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞において２つのシストロン（オープンリーディングフレーム）が単一の転写物から翻訳されるようにする配列を記載する。ＩＲＥＳは、そのすぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のための非依存的なリボソーム進入部位を提供する。ポリシストロニックであり得る、すなわちｍＲＮＡから順に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードする細菌ｍＲＮＡとは異なり、動物細胞のほとんどのｍＲＮＡは、モノシストロニックであり１つのポリペプチドのみの合成のためにコードする。真核細胞におけるポリシストロニック転写により、翻訳は翻訳開始部位の最も５’側から開始され、最初の終止コドンで終結され、転写物はリボソームから放出され、ｍＲＮＡにおいて最初にコードされたポリペプチドのみの翻訳をもたらす。真核細胞では、転写物の第２のまたは続くオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳを有するポリシストロニック転写は、その下流のオープンリーディングフレームの連続的な翻訳を可能にし、同じ転写物によってコードされた２つまたはそれ以上のポリペプチドを産生する。ＩＲＥＳは様々な長さであってよく、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ピコルナウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶまたはポリオウイルス（ＰＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）など、様々な起源由来であってよい。ベクター構築物における様々なＩＲＥＳ配列およびそれらの使用が記載され、当技術分野で周知されている。下流のコード配列は、下流の遺伝子の発現にネガティブに影響しないであろう任意の距離でＩＲＥＳの３’端に作動可能に連結されている。ＩＲＥＳと下流の遺伝子の始まりの間の最適なまたは許容的な距離は、距離を変化させ、距離の関数として発現を測定することによって容易に決定することができる。
用語「２ａ」または「２ａペプチド」は、短いオリゴペプチド配列を意味し、２ａおよび「２ａ様」と記載され、リボソームスキッピングとして定義されたプロセスによって、翻訳の際にタンパク質間の切断を媒介することができるリンカーとして機能する。そのような２ａおよび「２ａ様」配列（ピコナウイルス科および他のウイルスまたは細胞配列に由来する）は、複数の遺伝子配列を単一の遺伝子に鎖状につなぐために使用され、同じ細胞内でのそれらの共発現を確実にすることができる（Luke and Ryan, 2013参照）。
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許容し、遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列を意味する。典型的には、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域、遺伝子の転写開始部位の近位に位置する。転写の開始に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられることが多い。プロモーターの例としては、限定はされないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ウマ、ブタ、ウシおよびヒトを含む）などの動物、トリまたは昆虫由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑圧可能、および／または構成的であり得る。誘導性プロモーターは、温度の変化など、培養条件のいくつかの変化に応じてそれらの調節下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を開始する（Ptashne, 2014）。当業者に周知のプロモーターの例としては、例えば、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターが挙げられる。
本発明の文脈で、本明細書で使用する場合、用語プロモーターは、特に機能的断片、例えば、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列を指し、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％（またはより高い）である。さらに、本発明の文脈で、本明細書で使用する場合、用語プロモーターは、特に機能的断片、例えば、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列を指し、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％である（またはより高い）。最も好ましくは、「プロモーター」は、ｐ４３０（配列番号３）またはｐ４５５（配列番号４）を指す。用語「ｐ４３０」、「ｇＧ４３０」、および「４３０」は、明細書、図面、シーケンスリスト等を通して同義的および交換可能に使用される。用語「ｐ４５５」、「ＭＣＰ４５５」および「４５５」は、明細書、図面、シーケンスリスト等を通して同義的および交換可能に使用される。
用語「エンハンサー」は、ｃｉｓ位置にあるポリヌクレオチド配列を意味し、プロモーターの活性に作用し、したがって、このプロモーターに機能的に結合した遺伝子またはコード配列の転写を刺激する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの効果は位置および方向に非依存的であり、したがってそれらは、イントロン内またはコード領域内でさえも転写ユニットの前または後に位置することができる。エンハンサーは、転写ユニットのすぐ近くとプロモーターからかなり距離のある位置の両方に位置し得る。プロモーターと物理的および機能的なオーバーラップを有することもできる。当業者は、様々な起源由来の（およびＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに寄託された、例えばＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）多くのエンハンサーを把握しており、それらは非依存的なエレメントまたはポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメントとして利用可能である（例えば、ＡＴＣＣに寄託され、または市販され、および個々の起源）。多くのプロモーター配列はまた、頻繁に使用されるＣＭＶプロモーターなどのエンハンサー配列も含有する。ヒトＣＭＶエンハンサーは、これまでに同定された最も強いエンハンサーの１つである。誘導性エンハンサーの１つの例は、メタロチオネインエンハンサーであり、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得る。
用語「相補的ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの２対の鎖の１つの鎖を記載する。相補的な鎖のヌクレオチド配列は、各アデノシンはチミン（またはＲＮＡの場合はウラシル）、各グアニンはシトシン、逆もまた同様になるように、その対の鎖のヌクレオチド配列を写す。例えば、５’−ＧＣＡＴＡＣ−３’の相補的ヌクレオチド配列は３’−ＣＧＴＡＴＧ−５’、またはＲＮＡの場合は３’−ＣＧＵＡＵＧ−５’である。
用語「遺伝子」、「目的の遺伝子」は、本明細書で使用する場合、同じ意味を有し、目的の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コード配列の前（５’非コードまたは非翻訳配列）および後（３’非コードまたは非翻訳配列）に制御配列をさらに含んでよい。選択された配列は全長またはトランケート、融合、またはタグ化遺伝子であってよく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡ断片であってよい。ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡは、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からスプライシングされ、したがって、同じポリペプチドまたはＲＮＡをコードするｃＤＮＡには存在しない、非コード領域（すなわち、イントロン）を含み得ることが通常理解される。それは、天然配列、すなわち自然発生的な形態であってよく、または変異され、または異なる起源由来の配列を含んでもよく、そうでなければ所望のように改変されてもよい。これらの改変は、選択された宿主細胞またはタグ付けにおけるコドン利用を最適化するコドン最適化を含む。さらに、それらは、例えば（潜在性の）スプライスドナー、アクセプター部位および枝分かれ点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム進入部位、繰り返し配列、二次構造（例えば、ステムループ）、転写因子または他の制御因子の結合部位、制限酵素部位等のｃｉｓ作用性部位の除去または付加を含み、限定はされないが、わずかな例を挙げることができる。選択された配列は、分泌、細胞質、核、膜結合または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。
本明細書で使用する場合、用語「目的のヌクレオチド配列」は、それが必ずしも遺伝子を含まないが、遺伝子または他の遺伝情報のエレメントまたは部分、例えばｏｒｉ（複製オリジン）を含み得るため、目的の遺伝子よりも、より一般的な用語である。目的のヌクレオチド配列は、それがコード配列を含むかどうかに非依存的な任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得る。
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、翻訳開始シグナルまたはＡＴＧもしくはＡＵＧなどの開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列の長さを指す。
用語「転写」は、細胞でのｍＲＮＡの生合成を記載する。
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞内での核酸配列の転写および／または翻訳を指す。本発明の特定の態様に従って、用語「発現」は、宿主細胞内での異種および／または外来性核酸配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞における所望の産物の発現レベルは、細胞に存在する相当するＲＮＡまたはｍＲＮＡの量、または選択された配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡプロテクション、細胞内ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、またはＲＴｑＰＣＲ（逆転写後の定量的ＰＣＲ）によって定量され得る。選択された配列から発現されたタンパク質は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロットによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降によって、タンパク質の生物活性のアッセイによって、またはタンパク質の免疫染色後のＦＡＣＳ解析によって定量され得る。
用語「発現カセット」または「転写ユニット」または「発現ユニット」は、転写される１つまたは複数の遺伝子を含有するベクター、構築物またはポリヌクレオチド配列内の領域を定義し、転写される遺伝子をコードするヌクレオチド配列ならびに発現カセット内に含有される制御エレメントを含有するポリヌクレオチド配列が、互いに作動可能に連結されている。それらは、プロモーターから転写され、転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルによって終結される。１つの特定の態様では、それらは１つの単一のプロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子は少なくとも転写的に連結されている。１つより多くのタンパク質または産物は転写され、各転写ユニット（マルチシストロン転写ユニット）から発現される。各転写ユニットは、ユニット内に含有される任意の選択された配列の転写および翻訳に必要な制御エレメントを含むであろう。各転写ユニットは、同じまたは異なる制御エレメントを含有し得る。例えば、各転写ユニットは、同じターミネーターを含有してもよく、ＩＲＥＳエレメントまたはイントロンは、転写ユニット内での遺伝子の機能的な連結に使用され得る。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は１つより多くの転写ユニットを含有し得る。
用語「発現増加」、「力価または生産性増加」または「発現または生産性改善」により、好適な対照との比較、例えば、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質対イントロン含有遺伝子によってコードされるタンパク質による、宿主細胞に導入された異種および／または外来性配列、例えば治療タンパク質をコードする遺伝子の発現、合成または分泌の増加を意味する。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍または５倍増加した場合、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍または少なくとも１．５倍または少なくとも２倍または少なくとも３倍増加した場合も、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍〜５倍、好ましくは１．５倍〜５倍、より好ましくは２倍〜５倍、特に好ましくは３倍〜５倍増加した場合も、特別な力価または生産性増加がある。「発現増加」は、そのうえ、より多くの細胞が目的の遺伝子／配列を実際に発現することを意味し得る。例えば、発現増加は、本発明の新しいプロモーターが、他のプロモーターと比較して、ウイルス複製サイクル中により長い期間活性であることを意味し得る。
発現、力価または生産性増加は、本発明に記載の異種ベクターを使用することによって得ることができる。これは、追加の選択可能マーカーとして、１つまたは複数の蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）または細胞表面マーカーを含有する組換え宿主細胞のＦＡＣＳアシスト選択などの他の手法と組合せることができる。発現増加を得る他の方法、および使用することができる異なる方法の組合せも、例えばクロマチン構造（例えば、ＬＣＲ、ＵＣＯＥ、ＥＡＳＥ、アイソレーター、Ｓ／ＭＡＲｓ、ＳＴＡＲエレメント）の操作のためのｃｉｓ活性エレメントの使用、（人工）転写因子の使用、内在性または異種および／または外来性遺伝子発現を上方制御するための天然または合成剤による細胞の処置、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性（半減期）の改善、ｍＲＮＡ翻訳の開始の改善、エピソーム性プラスミドの使用による遺伝子用量の増加（複製オリジンとしてウイルス配列の使用に基づく、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＥＢＶ、またはＢＰＶ）、ＤＮＡコンカテマーに基づく増幅促進配列またはｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅システムの使用に基づく。
「発現増加」を測定するためのアッセイは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのタンパク質測定、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）；抗体ベースの検出方法、例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、または免疫拡散法、およびフローサイトメトリー；ならびに赤血球凝集反応アッセイによる生物活性の測定である。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの調節下で転写されるｍＲＮＡの定量によって間接的に測定される。ｍＲＮＡは、内因性の標準と比較して、ＲＴｑＰＣＲによって定量される。
用語「ウイルス負荷」は、当業者には周知である。用語ウイルス負荷は、本明細書では用語「ウイルス力価」と同義に使用される。ウイルス負荷またはウイルス力価は、活動性ウイルス感染の重症度の測定であり、当業者には公知の方法によって判定することができる。判定は、ウイルスタンパク質に結合する抗体などによるウイルスタンパク質の検出およびさらなる検出、あるいは、ＲＴ−ＰＣＲなどの増幅法によるウイルス核酸の検出に基づくことができる。核酸増幅法による血漿中におけるウイルス粒子関連ウイルスＲＮＡのモニタリングは、レトロウイルス疾患の状態および進行を評価するため、ならびに予防的および治療的介入の有効性を評価するために広く使用されているパラメータである。例として、ウイルス負荷またはウイルス力価は、血漿ミリリットル当たりのＲＮＡコピー数などの関与する体液中における生きたウイルスの量を推定することによって算出することができる。好ましくは、用語「ウイルス負荷」または「ウイルス力価」は、ウイルス調製物の量当たりの感染単位の測定である。ウイルス力価は、生物学的手順のエンドポイントであり、並行して行った試験の特定の割合で効果を示す希釈率として定義される（Reed and Muench, 1938）。特に、１ミリリットル当たりの組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、その希釈率で並行して接種された細胞培養の数の５０％が感染する、ウイルス調製物の希釈率を与える。
「転写制御エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、転写一次産物、すなわちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる最初の核酸に相当する構築物の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてよい。
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡ」または転写終結部位」または「転写終結エレメント」は、真核生物のｍＲＮＡの３’端の特異的部位での切断、および切断された３’端での約１００〜２００アデニンヌクレオチド（ポリＡテイル）の配列の転写後組込みを引き起こし、したがって、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは切断部位および下流に位置する配列の約１０〜３０ヌクレオチド上流に配列ＡＡＴＡＡＡを含む。ｔｋ ポリＡ、ＳＶ４０後期および初期ポリＡ、ＢＧＨ ポリＡ（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号に記載）またはハムスター増殖ホルモンポリＡ（国際公開第２０１００１０１０７号）など、様々なポリアデニル化エレメントが公知である。
「翻訳制御エレメント」は、発現される各個々のポリペプチドに翻訳開始部位（ＡＵＧ）、終止コドンおよびポリＡシグナルを含む。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、いくつかの構築物に含まれてよい。発現を最適化するため、発現される核酸配列の５’−および／または３’−非翻訳領域を除去、付加、または変更し、転写または翻訳のいずれかのレベルで、発現を干渉または減少させ得る、任意の潜在的に余分で不適切な代わりの翻訳開始コドンまたは他の配列を除外することが得策であり得る。コンセンサスリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列）は開始コドンのすぐ上流に挿入され、翻訳、したがって発現を増強することができる。このリボソーム結合部位周辺の増加Ａ／Ｕ含量は、さらにリボソーム結合により効果的である。
定義によって、宿主細胞中に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによってコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、異なる（ウイルス）種に由来する場合、宿主細胞に対して、「外来性」「外来性配列」、「外来性遺伝子」、「外来性コード配列」、「外来性抗原コード配列」と呼ばれる。したがって、本発明のＥＨＶ−４ベースのプロモーターは、ＥＨＶ−１ウイルスベクターを考慮して外来性である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「外来性」または「外来性抗生コード配列」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原はその天然種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、ブタＩＡＶ由来のＨ３抗原は、ＥＨＶ−１ベクターに関して外来性の抗原の１つの例である。ウマではない抗原など、目的の任意のウマではない配列または遺伝子は、したがって、目的の外来性配列もしくは遺伝子または本発明の特定の態様に記載の抗原である。
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、宿主細胞に対して、「異種、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種コード配列」、「導入遺伝子」または「異種タンパク質」と呼ばれる。これは、導入される配列または導入される遺伝子が、宿主細胞の内在性配列または内在性遺伝子と同一である場合でさえも適用する。例えば、異なる部位で、またはＥＨＶ−４野生型ウイルスにおいてよりも改変形態でＥＨＶ−４ウイルスベクターに導入されるＥＨＶ−４プロモーター配列は、定義により、異種配列である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「異種」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原は、その天然亜種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、抗原、例えばＥＨＶ−１を除く任意のウマアルファヘルペスウイルス、例えばＥＨＶ−３、ＥＨＶ−８由来の抗原など、目的の任意の非ＥＨＶ−１特異的配列または遺伝子は、したがって、目的の異種配列もしくは遺伝子または本発明の特定の態様に記載の抗原である。
用語「非天然型」は、この文脈において天然には生じない抗原などの目的の任意の配列または遺伝子、例えば異なる種由来の抗原などの目的のハイブリッド配列もしくは配列もしくは遺伝子、または人工的な変異、挿入、欠損等により天然の産物ではない、抗原などの目的の配列もしくは遺伝子を意味する。
用語「組換え」は、本発明の明細書を通して、用語「非天然型」、「異種」および「外来性」と交換可能に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列のいずれかから発現されるタンパク質である。ウイルスに関して使用される場合、用語組換えは、ウイルスゲノムの人工的な操作によって産生されるウイルスを意味する。外来性抗原コード配列など、異種または外来性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。用語組換えウイルスおよび用語非天然型ウイルスは、交換可能に使用される。
したがって、用語「異種ベクター」は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。用語「組換えベクター」は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」は、制御エレメントと遺伝子またはそのコード領域の間の接続を記載するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つまたは複数の制御エレメント、例えば、限定はされないが、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的制御エレメント、およびエンハンサーの調節下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、制御エレメントと「作動可能に連結される（operably linked to）」または「作動可能に連結される（operatively linked to）」または「作動可能に関連する（operably associated with）」と言われ、遺伝子またはコード領域が制御エレメントによって調節または影響されることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。
さらに、本明細書の範囲内で、用語「機能的連結」、「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらが意図した方法で機能するように配置されることを意味する。例えば、ｃｉｓ位置で連結された遺伝子配列の転写を調節または調整することができる場合、ポロモーター／エンハンサーまたはターミネーターは、コード遺伝子配列に機能的に連結される。通常、必ずしもそうではないが、機能的に連結されたＤＮＡ配列は隣接し、２つのポリペプチドコード領域を合わせる必要がある場合または分泌シグナルペプチドの場合、隣接し、リーディングフレームである。しかしながら、作動可能に連結されたプロモーターは、通常、上流に位置し、作動可能に連結されたターミネーターは、通常、コード配列の下流に位置するが、必ずしもそれと隣接していない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加する限り、必ずしも隣接していない。このため、それらはコード配列の上流に位置することも、下流に位置することもあり、幾らか距離を隔てていることもある。ポリアデニル化部位は、コード配列を通ってポリアデニル化シグナルまで転写が進行するようにコード配列の３’端に位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。連結は、例えば、好適な制限部位もしくは平滑末端でのライゲーションにより、または融合ＰＣＲ法を使用することにより、当技術分野で公知の組換え方法によって達成される。合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターは、好適な制限部位が存在しない場合、従来の実行と一致して使用され得る。
したがって、プロモーター配列の、用語「機能的断片または誘導体」は、断片または誘導体が依然としてプロモーター活性が有効であることを意味する。プロモーター活性を評価する方法の機能アッセイは当業者に周知である（Bustin 2000, Nolan et al. 2006）。そのような機能アッセイの例示的な実施形態としては、例えば、プロモーター動態実験が挙げられる。プロモーターまたはその断片がレポーター導入遺伝子の転写を導く発現カセットを有するベクターウイルスを感染させた細胞は、異なる時間インキュベートされる。全ＲＮＡは、感染後の異なる時間で回収された試料から調製される。ＤＮＡｓｅＩ消化によるコンタミネートしたＤＮＡの破壊後、ＲＮＡは逆転写される。ＲＮＡ調製物からのコンタミネートしたＤＮＡの除去の成功を実証するため、１つの複製試料が逆転写酵素（ＲＴ）の添加によって処理され、２つ目の複製はＲＴの添加無しで処理される。生じるｃＤＮＡは精製され、従来のＰＣＲの鋳型として使用される。ＲＴの添加によって処理された試料のみがＰＣＲ産物を産生するはずである。これらのｃＤＮＡは、次いで、レポーター導入遺伝子のプライマーによるｑＰＣＲに、ウイルスベクターの必須遺伝子（内部標準遺伝子）のプライマーによるものと並行して使用することができ、その転写は、感染および複製の効率のための内部標準を提供する。レポーターのｑＰＣＲ値は、内部標準遺伝子のｑＰＣＲ値を使用して、異なる構築物および感染後の時間の間でノーマライズされる。これは、異なるプロモーターおよびその断片のプロモーター活性の解釈を可能にする。
「配列相同性」は、本明細書で使用する場合、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するため、２つまたはそれ以上の配列が最適にアラインされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、配列相同性を決定する場合には、保存的なアミノ酸置換は一致としてカウントされる。言い換えると、参照配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るため、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の参照配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドが一致しなければならず、別のアミノ酸またはヌクレオチドとの保存的な置換を含まなければならない、あるいは、参照配列における、保存的な置換を含まない、全アミノ酸残基またはヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのアミノ酸またはヌクレオチドの数が、参照配列に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、少なくとも５０、さらにより好ましくは１００、さらにより好ましくは２５０、さらにより好ましくは５００ヌクレオチドのストレッチを含む。
当技術分野で公知のように、「配列同一性」は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち、参照配列と、参照配列と比較される所与の配列の間の関係を指す。配列同一性は、配列が最適にアラインされた後に所与の配列を参照配列と比較することによって決定され、そのような配列のストリング間の一致により決定されるように、最も高い程度の配列類似性を産生する。そのようなアライメントにより、配列同一性は、位置ごとに確認され、例えば配列は、その位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合、特定の位置で「同一」である。そのような位置同一性の総数は、次いで参照配列のヌクレオチドまたは残基の総数によって割られ、％配列同一性を与える。配列同一性は、限定はされないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものを含む公知の方法によって容易に算出することができ、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列間で最大の一致を与えるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する一般的に利用可能なコンピュータープログラムでコード化される。そのようなプログラムの例としては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に利用可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、その教示は参照により本明細書に組み込まれる）。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列の間に最高レベルの配列同一性を産生するため、デフォルトのギャップ重み付けを使用して配列を最適にアラインする。例として、参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチド当たり１５まで、好ましくは１０まで、さらにより好ましくは５までの点変異を含み得ることを除いて、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列のヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までが欠損または別のヌクレオチドによって置換され、参照配列の総ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのヌクレオチドの数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列、または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかのヌクレオチド中で個々に分散される。同様に、参照アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸当たり１５まで、好ましくは１０、９、８、７、６まで、さらにより好ましくは５、４、３、２、１までのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照アミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るため、参照配列のアミノ酸残基の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までが欠損または別のアミノ酸と置換され、参照配列のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までのアミノ酸の数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかの残基中で個々に分散される。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、配列同一性を決定する場合、保存的置換は一致として含まれない。
用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、本明細書において交換可能に使用される。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適な比較目的のためにアラインされることが本明細書において規定される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸または核酸の配列に導入され得る）。相当するアミノ酸またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸またはヌクレオチド残基が、次いで比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の相当する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置の総数（すなわちオーバーラップする位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって、または２つの配列の断片にわたって行われ得る。典型的には、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われる。しかしながら、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基の領域にわたって行われ得る。
当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータープログラムが利用可能であることを知っている。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数値計算用アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けならびに１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けのいずれかを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して決定される。当業者は、これら全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを使用する場合著しくは変更されないことを認識する。
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、「問い合わせ配列」としてさらに使用され、公共のデータベースに対して検索を実施し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され、本発明のタンパク質分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るため、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメーターが使用され得る。国立バイオテクノロジー情報センターのホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照。
ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４／組換えベクター技術の定義
用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ、ロバ、およびシマウマを含み、好ましくはウマである、ウマ科を意味するまたはウマ科に属する。さらに、用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ科のメンバーのハイブリッドも包含する（例えば、ラバ、ケツテイ等）。
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
用語「ウマヘルペスウイルスベクター」または「ウマヘルペスウイルス」または「ＥＨＶ」は、ウマに感染するヘルペスウイルス科のメンバーを意味する。これまでのところ、８つの異なる種のウマヘルペスウイルスが同定され、５つはアルファヘルペスウイルス亜科（ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９）に属し、３つはガンマヘルペスウイルス科に属する。（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)。
用語「ＥＨＶ−１」は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス１型を意味する。ＥＨＶ−１の非限定的な参照配列は、例えば野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）またはＲａｃＨ（Hubert 1996）。
用語ＥＨＶ−４は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス４型を意味する。
用語「２つまたはそれ以上のＥＨＶベクター」は、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＥＨＶベクターを包含する。
用語「ＯＲＦ７０に挿入された」および「挿入部位はＯＲＦ７０である」とは、ＤＮＡ断片がゲノムＤＮＡのウマヘルペスウイルス１オープンリーディングフレーム７０をコードする位置に挿入されたことを意味する。言及される挿入は、ＯＲＦ７０の５’の８０１塩基対の欠損をもたらし、３’端の残りの４２３ｂｐは無傷なままで残すが、ｏｒｆ７０遺伝子産物糖タンパク質Ｇの発現を無くす。ＥＨＶ−１を含むいくつかのアルファヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇは、感染細胞から分泌され、炎症促進性サイトカインの結合によって免疫調節性タンパク質として機能することが示された。ウイルスベクターでのその発現が無くなると、無傷な糖タンパク質Ｇを発現する野生型ＥＨＶ−１と比較した場合、ウイルス感染の免疫原性を増大させるはずである。
用語「ＯＲＦ１／３に挿入された」および「挿入部位がＯＲＦ１／３である」は、ワクチン株ＥＨＶ−１ ＲａｃＨの弱毒化手順中の継代での偶発的な欠損によって、ＯＲＦ１の９０％および全ＯＲＦ２を含む１２８３ｂｐの断片が欠失する位置で、ウイルスゲノムにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。この挿入部位は、この位置からの導入遺伝子の発現がウイルスの複製と干渉する可能性が極端に少ないと予測されたため、選択された。
ワクチンの定義
「免疫原性または免疫学的組成物」は、組成物に対する細胞または抗体媒介性免疫応答の宿主での免疫学的応答を引き出す少なくとも１つの抗原、またはその免疫原性部分を含む物質の組成物を指す。好ましくは、免疫原性組成物は、免疫応答を誘導し、より好ましくは、ブタＩＡＶ感染の臨床徴候の１つまたは複数に対する防御免疫を付与する。宿主はまた、「食物生産動物」と呼ばれる。宿主が防御的な免疫学的応答を示し、したがって、新たな感染に対する抵抗性が増強され、および／または疾患の臨床的な重症度が軽減する場合、免疫原性組成物は「ワクチン」と呼ばれる。
本明細書で使用する用語「抗原」は、当技術分野で周知であり、免疫原性、すなわち免疫原である物質、ならびに免疫学的不応性、または免疫不応答、すなわち外来物質に対する体の防御機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、エピトープを含有するまたは含む、全長タンパク質ならびにそのペプチド断片を意味することが意図される。さらに、用語「抗原コード配列」は、抗原をコードする配列に関する。好ましくは、抗原コード配列は、ｃＤＮＡ配列などの核酸配列である。しかし、用語「核酸配列」は、本明細書の他のところで定義した。
用語「少なくとも１つの外来性抗原コード配列」はまた、１つより多くの外来性抗原コード配列を包含する。したがって、用語「少なくとも１つの外来性抗原コード配列」は、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの外来性抗原コード配列を包含するものと理解されたい。したがって、用語「少なくとも２つの外来性抗原コード配列」は、３つ、４つ、５つまたは６つの外来性抗原コード配列を包含する。
用語「異なる外来性抗原コード配列」は、互いに配列が異なる配列である。
本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」は、例えば、本明細書に記載のように免疫学的応答を引き出すウイルス表面タンパク質など、ポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。用語「免疫原性断片」または「免疫原性部分」は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって、本明細書に記載の免疫学的応答を引き出すタンパク質またはポリペプチドの断片またはトランケートおよび／または置換形態を指す。一般に、そのようなトランケートおよび／または置換形態、または断片は、全長タンパク質からの少なくとも６個の隣接するアミノ酸を含む。そのような断片は、当技術分野で周知のいくつかのエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey参照。例えば、線状エピトープは、タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時合成し、ペプチドが依然として支持体に結合しているうちに、ペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。そのような技術は公知であり、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715参照。同様に、構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴によるなどアミノ酸の空間的な構造を決定することにより容易に同定される。上記のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照。合成抗原も、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原の定義内に含まれる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998参照。（その教示および内容は全て本明細書に参照により組み込まれる。）
用語「免疫する」とは、免疫原性組成物を免疫する食物生産動物に投与し、それによってこのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫応答を引き出す能動免疫に関する。
本明細書で使用した用語「必要とする」または「それを必要とする」とは、投与／治療が本発明に従って免疫原性組成物を与えられた動物の健康または臨床徴候または健康に対する任意のその他の良い医学的効果を高めるか、または改善することに関連する。
本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、動物の免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの免疫学的活性成分、および可能だが必ずではない活性成分の免疫学的活性を増強する１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物を指す。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。区別すると、ワクチンの免疫学的活性成分は、いわゆる改変生ワクチン（ＭＬＶ）でのその元々の形態または弱毒化粒子のいずれかの完全なウイルス粒子、またはいわゆる死菌ワクチン（ＫＶ）での適切な方法によって不活性化された粒子を含み得る。別の形態では、ワクチンの免疫学的活性成分は、生物の適切なエレメント（サブユニットワクチン）を含んでよく、これらのエレメントは、粒子全体を破壊すること、またはそのような粒子を含有する増殖培地のいずれか、および任意選択により所望の構造を産生する続く精製ステップによって、または例えば細菌、昆虫、哺乳動物、もしくは他の種に基づく好適なシステムの使用による適切な操作を含む合成プロセスによって、さらに任意選択により続く単離および精製手順、または好適な医薬組成物（ポリヌクレオチドワクチン接種）を使用する遺伝材料の直接組込みによるワクチンを必要とする動物における合成プロセスの誘導によって生成される。ワクチンは、１つのまたは同時に１つより多くの上記のエレメントを含み得る。本発明の特定の態様内で使用される場合、「ワクチン」は生ワクチンまたは生ウイルスを指し、組換えワクチンとも呼ばれる。本発明の別の特定の態様では、「ワクチン」は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む不活性化または死菌ウイルスを指す。したがって、ワクチンは、サブユニットワクチンまたは死菌（ＫＶ）または不活性化ワクチンであってよい。
用語「ＤＮＡワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」は、好適な医薬組成物を使用する遺伝材料の直接接種を意味する。
不活性化の様々な物理的および化学的方法が当技術分野で公知である。用語「不活性化」は、照射（紫外線（ＵＶ）、Ｘ線、電子ビームまたはガンマ照射）、加熱、または化学的に処置され、その免疫原性を保持しながらそのようなウイルスを不活性化または死滅させた、以前は毒性だったまたは非毒性ウイルスを指す。好適な不活性化剤としては、ベータ−プロピオラクトン、バイナリーまたはベータまたはアセチルエチレンイミン、グルテルアルデヒド（gluteraldehyde）、オゾン、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）が挙げられる。
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活性化のため、ホルムアルデヒドを、典型的には水およびメチルアルコールと混合して、ホルマリンを作製する。メチルアルコールの添加により、活性化プロセス中の分解または交差反応を防ぐ。一実施形態では、３７％ホルムアルデヒド溶液の約０．１〜１％を使用して、ウイルスを不活性化する。材料は不活性化されるが、高用量による副作用が起こるほど多くないことを確実にするように、ホルマリンの量を調節することが重要である。
より詳細には、ウイルスの文脈における用語「不活性化」は、ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでそれぞれ複製することができないことを意味する。例えば、用語「不活性化」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで繁殖し、次いでもはや複製できないように化学的または物理的な手段を使用して不活性化されたウイルスを指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「不活性化」、「死菌」または「ＫＶ」は交換可能に使用される。
用語「生ワクチン」は、生きた生物または複製可能なウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
「医薬組成物」は、それが投与される生物の、または住み着いている生物の、または生物上の生理学、例えば免疫学的機能を改変することができる１つまたは複数の成分から基本的になる。用語は、限定はされないが、抗生物質または駆虫薬、ならびに、例えば、限定はされないが、プロセシング特性、無菌性、安定性、経腸または非経口経路、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、または他の好適な経路を介して組成物を投与する可能性、投与後の耐性、または調節性放出特性などの特定の他の目的を達成するために一般に使用される他の構成成分を含む。そのような医薬組成物の１つの非限定的な例は、単に、実証目的のために挙げられ、以下のように調製され得る：感染細胞培養の細胞培養上澄み液は安定剤（例えば、スペルミジンおよび／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合され、混合物は続いて他の方法により凍結乾燥または脱水される。ワクチン接種の前に、混合物は次いで、水溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または非水性溶液（例えば、油エマルジョン、アルミニウムベースのアジュバント）中で再水和される。
本明細書で使用される場合、「薬学的にまたは獣医学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。いくつかの好ましい実施形態、特に本発明での使用のための凍結乾燥免疫原性組成物、安定化剤を含むものは、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含有する。本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイドオイル；アルケンのオリゴマー化から生じるオイル、特にイソブテンまたはデセン；線状アルキル基を含有する酸のまたはアルコールのエステル、より具体的には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ−（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ−（カプリル酸／カプリン酸）またはプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸のエステルに基づき得る。オイルは乳化剤と組合せて使用され、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニド（例えば、無水マンニトールオレエート）のエステル、グリコールのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸の、エトキシル化されていてもよいエステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)参照。例示的なアジュバントは、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書籍の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルと架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は用語カルボマーで公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋したそのようなアクリルポリマーについて記載している米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体がメチルなどの他の置換基を含有し得る。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の名称で販売されている製品（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋されている。それらとしては、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーは、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）であり、これらは無水マレイン酸とエチレンのコポリマーである。これらのポリマーを水に溶解させることにより酸性溶液が生じ、これを、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、好ましくは生理的なｐＨまで中和する。
さらに好適なアジュバントとしては、多くの他のものもあり、限定はされないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたは他の方法）、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４またはムラミルジペプチド、または天然に存在するもしくは組換えサイトカインもしくはその類似体または内在性サイトカイン放出の刺激薬が挙げられる。
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、好ましくは用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、より好ましくは用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量で、さらにより好ましくは用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加することができると予測される。あるいは、アジュバントは、最終製品の容積で約０．０１〜５０％の濃度、好ましくは約２％〜３０％の濃度、より好ましくは約５％〜２５％の濃度、なおさらに好ましくは約７％〜２２％の濃度、および最も好ましくは１０％〜２０％の濃度であってよい。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
「単離された」は、その天然の状態から「人間の手によって」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、その元々の環境から変更または取り出された、またはその両方であることを意味する。例えば、本明細書でその用語が用いられる場合、生きている生物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。
「弱毒化」は、病原体の毒性を低下させることを意味する。本発明では、「弱毒化」は「非病原性」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、感染の臨床徴候を引き起こさないが標的動物における免疫応答を誘導することはできるように毒性を低下させたものであるが、弱毒化ウイルス、特に請求項のようにＥＨＶ−１ ＲａｃＨウイルスベクターを感染させた動物における臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化していないウイルスまたは病原体を感染させ、弱毒化ウイルスを受けていない「対照群」の動物と比較して低下することも意味し得る。この場合、用語「低下する／低下した」は、上記で定義された対照群と比較して少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％、なおより好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、なおより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、および最も好ましくは１００％の低下を意味する。したがって、例えば請求項のように弱毒化ウイルスベクターなどの、弱毒化した非病原性病原体、特に請求項のようにＥＨＶ−１（好ましくはＲａｃＨ）ウイルスベクターが、改変生ワクチン（ＭＬＶ）または改変生免疫原性組成物の生成に好適である。
用語「治療および／または予防」とは、群れにおける特別なブタＡ型インフルエンザウイルス感染の発生率の低下または特別なブタＡ型インフルエンザウイルス感染によって引き起こされるか、または関連する臨床徴候の重症度の軽減を意味する。したがって、用語「治療および／または予防」はまた、群における特別なブタＡ型インフルエンザウイルスに感染するようになった動物数の減少（＝特別なブタＡ型インフルエンザウイルス感染の発生率の低下）、あるいは、このような免疫原性組成物を与えられなかった動物の群と比較して、動物が有効量の本明細書で提供した免疫原性組成物を与えられた動物の群におけるブタＡ型インフルエンザウイルス感染に通常関連するか、または引き起こされる臨床徴候の重症度の軽減を意味する。
「治療および／または予防」には一般的に、有効量の本発明の免疫原性組成物の、このような治療／予防を必要とするか、またはこのような治療／予防から利益を得ることができる動物または動物の群への投与が含まれる。用語「治療」とは、一旦、群の１動物または少なくとも数匹の動物が既にこのようなブタＡ型インフルエンザウイルスに感染し、このような動物が既にこのようなブタＡ型インフルエンザウイルス感染によって引き起こされるか、または関連するいくらかの臨床徴候を示しているならば、有効量の免疫原性組成物の投与を意味する。用語「予防」とは、このような動物のブタＡ型インフルエンザウイルスによる感染の前、または少なくともこのような動物もしくは動物の群における動物がこのようなブタＡ型インフルエンザウイルスによって引き起こされるか、または関連するいかなる臨床徴候も示していない場合の、動物への投与を意味する。用語「予防」および「予防する」は、本出願では同義に使用される。
本明細書で使用した用語「臨床徴候」とは、ブタＡ型インフルエンザウイルスによる動物の感染の徴候を意味する。感染の臨床徴候は選択した病原体に左右される。このような臨床徴候の例には、限定はされないが、呼吸困難、耳炎、被毛粗剛、微熱、鬱、および食欲不振が含まれる。しかし、臨床徴候にはまた、限定はされないが、生きた動物から直接観察することができる臨床徴候が含まれる。生きた動物から直接観察することができる臨床徴候の例には、鼻汁および目脂、嗜眠、咳、喘鳴、吃逆、発熱、体重減少、脱水症状、跛行、消耗、皮膚の蒼白、発育不全などが含まれる。
好ましくは、治療していないか、または本発明の前に利用可能だった免疫原性組成物で治療されたが、その後特別なブタＡ型インフルエンザウイルスに感染した動物と比較して、治療した動物において発生率または重症度が低下した臨床徴候とは、体重減少の低下、肺におけるウイルス負荷の減少、肺病変の減少、ウイルス排出の減少および／または短縮、直腸温度の低下、臨床症状（特に呼吸器症状）の減少、（中和）抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体の誘導増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＴ細胞刺激の増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＢ細胞刺激の増加および肺における炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ１βの減少、またはそれらの組み合わせを意味する。
本明細書では、「有効用量」は、限定はされないが、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、組成物の文脈では、動物において感染または付随する疾患の発生率を低下させるまたはその重症度を軽減する免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物の量を意味する。このような有効量は、群れにおける特別なブタＡ型インフルエンザウイルス感染の発生率を低下させるか、または特別なブタＡ型インフルエンザウイルス感染の臨床徴候の重症度を軽減することができる。特に、有効量は、用量当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を指す。あるいは、療法の文脈では、用語「有効量」は、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のその症状の重症度または持続時間を低下または好転させるため、疾患または障害の前進を予防するため、疾患または障害の後退を引き起こすため、疾患または障害に付随する１つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を予防するため、または、別の療法または治療剤による予防もしくは処置を増強もしくは改善するために十分である療法の量を指す。
「免疫応答」または「免疫学的応答」は、限定はされないが、目的の（免疫原性）組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体により媒介される免疫応答の発生を意味する。通常、免疫応答または免疫学的応答は、限定はされないが、以下の作用の１つまたは複数を含む：目的の組成物またはワクチンに含まれる１つまたは複数の抗原を特異的に対象とする抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は治療的または防御的な免疫学的（記憶）応答のいずれかを示し、したがって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、および／または疾患の臨床的な重症度が低下する。そのような防御は、症状の数、症状の重症度の低下、もしくは病原体の感染に伴う症状の１つまたは複数の欠如、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルスの持続性の低下、全ウイルス負荷量の減少および／またはウイルス排泄の減少のいずれかによって実証される。
「疾患に対する防御」、「防御免疫」、「機能免疫」、「臨床症状の減少」、「中和抗体および／または血清変換の誘導／産生」、および同様の句は、１つまたはそれ以上の本発明の治療用組成物、またはこれらの組合せの投与によって生じる、疾患または状態に対する部分的または完全な応答を意味し、その結果、疾患または感染に暴露された免疫されていない動物において予測されるものよりも生じる有害作用が少ないことを意味する。すなわち、ワクチン接種された動物では感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された動物では、感染が減少し得る、遅くなり得る、または場合により完全に予防され得る。本明細書では、感染の完全な予防を意味する場合には、明確に記載される。完全な予防と記載されていない場合、この用語は、部分的な予防を含む。「防御免疫応答」または「防御免疫」は、感染した宿主によって通常示される臨床徴候の減少もしくは欠如、迅速な回復時間および／または感染期間の短縮または感染宿主の組織もしくは体液もしくは排泄物中における病原体力価の低下のいずれかによって示される。
本明細書では、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低下」または「臨床症状の減少」は、限定はされないが、野生型感染と比較した、群内の感染した動物の数の減少、感染の臨床徴候を示す動物の数の減少もしくは排除、または１または複数の動物に存在する任意の臨床徴候の重症度の低下を意味する。例えば、病原体負荷量の減少、病原体の排出、病原体の伝染の減少、またはマラリアの任意の症候性の臨床徴候の減少のいずれかを指すべきである。好ましくは、本発明の治療用組成物を受けた１またはそれ以上の動物において、組成物を受けておらず感染する動物と比較して、これらの臨床徴候が少なくとも１０％減少する。より好ましくは、本発明の組成物を受けた動物において臨床徴候が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％減少する。
本明細書では、用語「防御の増大」は、限定はされないが、ワクチン接種された動物の群における感染因子による感染に付随する１つまたは複数の臨床症状が、ワクチン接種されていない動物の対照群に対して統計的に優位に減少することを意味する。用語「統計的に有意な臨床症状の減少」は、限定はされないが、感染因子によるチャレンジ後に、ワクチン接種された動物の群における少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、さらにより好ましくは５０％、およびさらにより好ましくは７０％低いことを意味する。
用語「病原体」は、当業者には周知である。しかし、用語「病原体」には、細菌およびウイルスが含まれる。
用語「食物生産動物」とは、ブタ、ウシ、家禽、魚などのヒトが消費するために使用される動物、好ましくはブタを意味する。用語「食物生産動物」は、ウマなどのウマ科は除外する。
「長期にわたる防御」は、少なくとも３週間、より好ましくは少なくとも３カ月、なおより好ましくは少なくとも６カ月にわたって持続する「改善された有効性」を指す。家畜の場合、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
用語「排出」とは、鼻汁などの分泌、さらに、咳またはくしゃみによるエアロゾルを意味する。したがって、排出は、鼻腔スワブ中におけるウイルス力価を調べることによって、または肺におけるウイルス力価によって判定してもよい。用語「排出」はさらに、ウイルスの感受性のある動物（すなわち、指標）への移行を包含する。ウイルス排出を測定する方法は、当業者の一般知識の範囲内である。
用語「抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体」とは、ブタＡ型インフルエンザウイルスに特異的な抗体を意味する。このような抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体の例には、限定はされないが、雌ブタのブタＡ型インフルエンザウイルスワクチンによるワクチン接種による母系由来抗体か、または雌ブタのブタＡ型インフルエンザウイルス感染による母系由来抗体が含まれる。さらに、子ブタにおける抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体は、子ブタのブタＡ型インフルエンザウイルス感染に応答して発生することがあり得る。用語「抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体」はさらに、限定はされないが、好ましくは、少なくとも１：１０、より好ましくは１：２０より多い、さらにより好ましくは１：４０より多い、さらにより好ましくは１：８０より多い、さらにより好ましくは１：１６０、さらにより好ましくは１：３２０より多い、最も好ましくは１：６４０より多い検出可能な抗ＳＩＡＶ抗体力価を有するか、または（母系抗体の受動的移行に）曝露された子ブタを意味する。好ましくは、この抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体力価は、赤血球凝集阻害測定法、ＥＬＩＳＡまたは血清中和試験などの特異的な抗ブタＡ型インフルエンザウイルス免疫測定法において検出可能であり、定量可能である。
「安全性」は、ワクチン接種された動物において、ワクチン接種後に、限定はされないが、細菌に基づくワクチンの毒性への潜在的な復帰、持続性の全身性疾病またはワクチン投与の部位における許容できない炎症などの臨床的に有意な副作用を含む、有害な結果が存在しないことを指す。
用語「ワクチン接種（vaccination）」または「ワクチン接種すること（vaccinating）」またはその変形は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、動物に投与されると、動物における免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
「死亡率」とは、本発明の文脈では、感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
製剤
本発明の製剤は、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は投与の形式に適したものであるべきである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
投与の好ましい経路としては、限定はされないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲料水での投与、最も好ましくは単回用量が望ましい。当業者は、本発明の組成物が、１用量、２用量、またはそれ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることを理解するであろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、所望の処置の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物は、１回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数カ月にわたって毎日、異なる投与量、例えば、約１×１０4〜１×１０9（上記のウイルス力価を参照）で投与することができる。本発明の特定の態様では、投与量は約１×１０4〜１×１０7ＴＣＩＤ50である。
抗原の定義
用語「ブタインフルエンザウイルス」は、当業者には公知である。用語ブタインフルエンザとは、ブタインフルエンザを引き起こすオルソミクソウイルス科のＡ型またはＣ型インフルエンザウイルスを意味する。オルソミクソウイルスには３つの群、Ａ型、Ｂ型およびＣ型があるが、Ａ型およびＣ型インフルエンザウイルスのみがブタに感染する。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、ブタＡ型インフルエンザウイルスである。ブタインフルエンザウイルスのサブタイプには、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ３Ｎ１が含まれる。Ｈ９Ｎ２およびＨ５Ｎ１もブタにおいて見いだすことができる。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、ブタから単離されたインフルエンザウイルスである。
用語「ＨＡ」または「Ｈ」、「ＮＡ」または「Ｎ」および「ＮＰ」は、当業者には公知である。しかし、一般的に、Ａ型インフルエンザウイルスは、１７Ｈ（ヘマグルチニン）および１０Ｎ（ノイラミニダーゼ）サブタイプに分類され、（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２…、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２…、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２…などと名付けられた）多くの可能性のある組み合わせが生じ得る。Ｈ（ヘマグルチニン）およびＮ（ノイラミニダーゼ）は、ＳＩＡＶなどのＡ型インフルエンザウイルスにおける表面糖タンパク質である。さらに、Ｎは、中和抗体の主要な抗原標的である。さらに、ＮＰ（核タンパク質）はヌクレオカプシドを形成する。
ＤＩＶＡの定義
用語「ＤＩＶＡ（感染した動物とワクチン接種した動物の区別）」とは、天然に感染した動物からワクチン接種した動物を区別するために使用することができるワクチンを意味する。
用語「試料」とは、体液の試料、分離した細胞の試料または組織もしくは器官の試料を意味する。体液の試料は、周知の技術によって入手することができ、好ましくは、血液、血漿、血清または尿の試料、より好ましくは血液、血漿または血清の試料を含む。組織または器官の試料は、例えば、生検によって任意の組織または器官から入手してもよい。分離した細胞は、遠心分離またはセルソーティングなどの分離技術によって体液または組織または器官から入手してもよい。
用語「入手した」は、好ましくは沈殿、カラムなどを使用する、当業者に公知の単離および／または精製ステップは含んでいてもよい。
用語「免疫試験」および「ゲノム分析試験」は、本発明による免疫原性組成物でワクチン接種した動物と天然に生じる（疾患に関連した）ブタインフルエンザウイルスに感染した動物とを区別する基盤である。免疫試験の例には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）、サンドイッチ酵素免疫試験、蛍光抗体試験（ＦＡＴ）電気化学発光サンドイッチ免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、解離増強ランタニド蛍光免疫測定法（ＤＥＬＦＩＡ）もしくは固相免疫試験、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）、免疫組織学的染色、ウェスタンブロット分析または当業者が利用可能な任意のその他の適切な方法などの任意の酵素免疫学的または免疫化学的検出方法が含まれる。使用する測定法に応じて、抗原または抗体は、酵素、蛍光色素または放射性同位元素によって標識することができる。例えば、Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994); and Frye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987を参照のこと。
用語「ゲノム分析試験」とは、ポリメラーゼおよびプライマーとして特異的オリゴヌクレオチドを使用する、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｒ−ＰＣＲ）またはリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｒＲＴ−ＰＣＲ）、Ｔｅｍｐｌｅｘ−ＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）および等温増幅法をベースにしたゲノム分析法を意味する。前述の増幅法は当業界では周知である。
項
以下の項を本明細書で記載する。
本発明は以下の項を提供する。
化合物
１．（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクター。
２．項１に記載のＥＨＶベクターを含み、医薬担体を含んでいてもよい免疫原性組成物。
３．（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物。
４．（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくはその機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含むプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクター。
５．項４に記載のＥＨＶベクターを含み、医薬担体を含んでいてもよい免疫原性組成物。
６．（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくはその機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含むプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物。
７．（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも２つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクター。
８．項７に記載のＥＨＶベクターを含み、医薬担体を含んでいてもよい免疫原性組成物。
９．（ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも２つの外来性抗原コード配列を含み、
（ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
（ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物。
１０．項１から９のいずれか１項に記載の２つまたはそれ以上のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物。
１１．免疫原性組成物が２つのＥＨＶベクターを含む、項１０に記載の免疫原性組成物。
１２．２つまたはそれ以上のＥＨＶベクターが異なる外来性抗原コード配列を含む、項１０に記載の免疫原性組成物。
１３．項１から１２のいずれか１項に記載の１つまたは複数のＥＨＶベクターを含むＤＩＶＡワクチン。
１４．ＥＨＶベクターが組換え体である、項１から１３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１５．ＥＨＶベクターがＲａｃＨまたはＲａｃＨ ＳＥである、項１から１４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１６．ＥＨＶベクターがＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９からなる群から選択される、項１から１４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１７．ＥＨＶベクターがＥＨＶ−１である、項１から１６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１８．食物生産動物がブタである、項１から１７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１９．食物生産動物に感染する病原体がインフルエンザウイルス、好ましくはブタＡ型インフルエンザウイルスである、項１から１８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２０．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列である、項１から１９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２１．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザサブタイプが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群から選択される、項１から２０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２２．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザサブタイプがＨ１および／またはＨ３である、項１から２１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２３．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンＡ型インフルエンザ抗原がブタ由来である、項１から２２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２４．ＥＨＶベクターが少なくとも２つのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む、項１から２３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２５．ＥＨＶベクターが少なくとも４つのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む、項１から２４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２６．ＥＨＶベクターが４つのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む、項１から２５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２７．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、Ａ／ブタ／イタリア／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／ゲント／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／イタリア／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／２５９５４３／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／デンマーク／１３７７２−１／２００３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／イングランド／ＭＤ００４０３５２Ｒ／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／ハンガリー／１３５０９／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／１３９６２／９５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／コートダルモール／１１２１／００（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブタ／コロラド／１／７７、Ａ／ブタ／コロラド／２３６１９／９９、Ａ／ブタ／コートダルモール／３６３３／８４、Ａ／ブタ／イングランド／１９５８５２／９２、Ａ／ブタ／フィニステール／２８９９／８２、Ａ／ブタ／ホンコン／１０／９８、Ａ／ブタ／ホンコン／９／９８、Ａ／ブタ／ホンコン／８１／７８、Ａ／ブタ／イリノイ／１０００８４／０１、Ａ／ブタ／イリノイ／１０００８５Ａ／０１、Ａ／ブタ／イリノイ／２１５８７／９９、Ａ／ブタ／インディアナ／１７２６／８８、Ａ／ブタ／インディアナ／９Ｋ０３５／９９、Ａ／ブタ／インディアナ／Ｐ１２４３９／００、Ａ／ブタ／アイオワ／３０、Ａ／ブタ／アイオワ／１５／３０、Ａ／ブタ／アイオワ／５３３／９９、Ａ／ブタ／アイオワ／５６９／９９、Ａ／ブタ／アイオワ／３４２１／９０、Ａ／ブタ／アイオワ／８５４８−１／９８、Ａ／ブタ／アイオワ／９３０／０１、Ａ／ブタ／アイオワ／１７６７２／８８、Ａ／ブタ／イタリア／１５１３−１／９８、Ａ／ブタ／イタリア／１５２３／９８、Ａ／ブタ／朝鮮／ＣＹ０２／０２、Ａ／ブタ／ミネソタ／５５５５１／００、Ａ／ブタ／ミネソタ／５９３／９９、Ａ／ブタ／ミネソタ／９０８８−２／９８、Ａ／ブタ／ネブラスカ／１／９２、Ａ／ブタ／ネブラスカ／２０９／９８、Ａ／ブタ／オランダ／１２／８５、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／１６４９７／９９、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／３５９２２／９８、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／９３５２３／０１、Ａ／ブタ／ノースカロライナ／９８２２５／０１、Ａ／ブタ／アウーデローデ／７Ｃ／９６、Ａ／ブタ／オハイオ／８９１／０１、Ａ／ブタ／オクラホマ／１８７１７／９９、Ａ／ブタ／オクラホマ／１８０８９／９９、Ａ／ブタ／オンタリオ／０１９１１−１／９９、Ａ／ブタ／オンタリオ／０１９１１−２／９９、Ａ／ブタ／オンタリオ／４１８４８／９７、Ａ／ブタ／オンタリオ／９７、Ａ／ブタ／ケベック／１９２／８１、Ａ／ブタ／ケベック／１９２／９１、Ａ／ブタ／ケベック／５３９３／９１、Ａ／ブタ／台湾／７３１０／７０、Ａ／ブタ／テネシー／２４／７７、Ａ／ブタ／テキサス／４１９９−２／９８、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１２５／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１３６／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６３／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６４／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６６／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／１６８／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／２３５／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／２３８／９７、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／４５７／９８５、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／４５８／９８、Ａ／ブタ／ウィスコンシン／４６４／９８およびＡ／ブタ／ウィスコンシン／１４０９４／９９からなる株の群から選択される、項１から２６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２８．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、Ａ／ブタ／イタリア／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ブタ／イタリア／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブタ／ゲント／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ブタ／イタリア／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）からなる株の群から選択される、項１から２７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
２９．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、項１から２８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３０．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項１から２９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３１．外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項１から３０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３２．外来性抗原コード配列がＮ（ノイラミニダーゼ）コード配列であり、Ｎサブタイプが、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９およびＮ１０からなる群から選択される、項１から３１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３３．ＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンがＮ（ノイラミニダーゼ）インフルエンザ抗原コード配列を含まない、項１から３２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３４．ＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンがＮＰ（核タンパク質）インフルエンザ抗原コード配列を含まない、項１から３３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３５．ＥＨＶベクターが終結シグナルまたはポリアデニル化配列などのさらなる制御配列を含む、項１から３４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
挿入部位：
３６．前記挿入部位がＯＲＦ１／３である、項４から３４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３７．前記挿入部位がＯＲＦ７０である、項４から３４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３８．食物生産動物に感染する病原体に関連する第１の外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されている、項１から３７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
３９．食物生産動物に感染する病原体に関連する第２の外来性抗原コード配列がＯＲＦ１／３に挿入されている、項１から３８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４０．ＯＲＦ７０への挿入がＯＲＦ７０中における部分的欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられ、それによってＯＲＦ７１の機能が残存している、項１から３９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４１．ｉ）ＯＲＦ７０への挿入が、ＲａｃＨのＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ部分（配列番号２０）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相同および／または同一な配列の欠損によって特徴づけられるか、あるいは
ｉｉ）ＯＲＦ７０への挿入が、ＲａｃＨのＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ部分（配列番号２０）の欠損または任意のその他の株におけるその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列欠損によって特徴づけられるか、あるいは
ｉｉｉ）ＯＲＦ７０への挿入が、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（ジェンバンク寄託番号ＡＹ６６５７１３．１）のＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ欠損の欠損によって特徴づけられ、それによって野生型ａｂ４ゲノム配列の欠損部分がヌクレオチド１２７６８１と１２８４８２との間（配列番号１９）に位置し、またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列の欠損によって特徴づけられるか、あるいは
ｉｖ）ＯＲＦ７０への挿入が、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（ジェンバンク寄託番号ＡＹ６６５７１３．１）のＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ欠損の欠損によって特徴づけられ、それによって野生型ａｂ４ゲノム配列の欠損部分がヌクレオチド１２７６８１と１２８４８２との間（配列番号１９）に位置し、または任意のその他の株におけるその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列の欠損によって特徴づけられる、項１から４０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４２．ＥＨＶ−１ベクターが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８ならびにこれらの配列のいずれか１つと７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む、項１から４１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４３．ＥＨＶ−１ベクターが、（ｉ）配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７からなる群から選択される少なくとも１つの左ＯＲＦ７０隣接領域、ならびに（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの右ＯＲＦ７０隣接領域を含む、項１から４２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
プロモーター：
４４．プロモーター配列がＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片からなる群から選択され、好ましくは前記機能的断片がｐ４３０（配列番号３）、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片であり、好ましくは前記機能的断片がｐ４５５（配列番号４）、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片である、項１から３および項７から４３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４５．プロモーター配列が４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列を含む、項１から３および項７から４４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４６．プロモーター配列の機能的断片または誘導体が、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の相同性を有する、項４から６および４５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４７．プロモーター配列の機能的断片または誘導体が５５０ヌクレオチド、好ましくは５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有する、項４から６および４５または４６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４８．プロモーター配列の機能的断片が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）のトランケーションまたはその相補的ヌクレオチド配列であり、好ましくは、配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％（またはより高い）である、項４から６および４５から４７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
４９．４ｐｇＧ６００（配列番号１）のプロモーター配列の機能的断片がｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片、または配列番号３と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の同一性を有する配列である、項４から６および４５から４８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５０．プロモーター配列の機能的断片が、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のトランケーションまたはその相補的ヌクレオチド配列であり、好ましくは、配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％（またはより高い）である、項４から６および４５から４８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５１．４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のプロモーター配列の機能的断片がｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片、または配列番号４と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の同一性を有する配列である、項４から６および４５から４８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５２．ＥＨＶベクターが終結シグナル、ポリアデニル化シグナルまたはＩＲＥＳおよび／または２ａペプチドのような制御エレメントなどの１つまたは複数のさらなる制御配列を含む、項１から５１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
プロモーターおよび抗原の特定の組み合わせ：
５３．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２８で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している、項１から５２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５４．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片が、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である、項５３に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５５．プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２７で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している、項１から５４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５６．プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片が、４５５ｐ４４５５（配列番号４）と名付けられた断片である、項５５に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５７．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２８で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、
プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２７で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している、項１から５６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５８．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片がｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片であり、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片が４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である、項５７に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
５９．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが２価である、項５７または５８に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６０．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している、項１から５９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６１．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片が、ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片である、項６０に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６２．プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２６で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している、項１から６１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６３．プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片が、４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である、項６２に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６４．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、
プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２６で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している、項１から６３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン）。
６５．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片がｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片であり、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片が４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である、項６４に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６６．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが２価である、項６４または６５に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６７．前記免疫原性組成物が、プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２８で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、
プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２７で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している第１のＥＨＶベクターを含み、前記免疫原性組成物が、
プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結しており、
プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはその相補的ヌクレオチド配列が、配列番号２６で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している第２のＥＨＶベクターを含む、項１から６６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６８．プロモーター配列４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片がｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片であり、プロモーター配列４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片が４５５ｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片である、項６７に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
６９．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが４価である、項６７または６８に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７０．前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが単回用量投与のために製剤化されている、項１から６９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７１．前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが筋肉内または鼻腔内に投与される、項１から７０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７２．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが６週齢以内、２週齢以内、１週齢以内または１日齢以内の子ブタにとって安全である、項１から７１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７３．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンがさらに薬学的に許容される担体を含む、項１から７２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７４．前記薬学的に許容される担体が水添加注射液（ａｑｕａ ａｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｅｍ）、細胞培養培地または再懸濁緩衝液である、項７３に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７５．前記再懸濁緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水である、項７４に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７６．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが１×１０4から１×１０9のＴＣＩＤ50、好ましくは１×１０4と１×１０8の間のＴＣＩＤ50、さらにより好ましくは１×１０4から１×１０7のＴＣＩＤ50のＥＨＶベクターを含む、項１から７５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７７．前記免疫原性組成物がワクチンである、項１から７６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７８．前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが多価ワクチンである、項１から７７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
７９．前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが２価ワクチン、４価ワクチン、６価ワクチンまたは７価ワクチンである、項１から７８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
８０．前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが２価ワクチンまたは４価ワクチンである、項１から７９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
８１．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが、それを必要とする食物生産動物におけるブタＡ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候の治療および／または予防において有効である、項１から８０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
８２．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンがブタＡ型インフルエンザウイルスによる同種および／または異種チャレンジに対して防御する、項１から８１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
８３．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが血清型Ｈ１および／またはＨ３のブタＡ型インフルエンザウイルスによるチャレンジに対して防御する、項１から８２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
キット
８４．項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを含むキット。
８５．キットがさらにブタＡ型インフルエンザウイルスの治療および／または予防のための指示書を含む、項８４に記載のキット。
治療方法
８６．食物生産動物に項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む、食物生産動物の免疫方法。
８７．それを必要とする食物生産動物におけるＡ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候の治療または予防のための方法であって、食物生産動物に治療有効量の項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法。
８８．同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、それを必要とする食物生産動物の肺におけるウイルス力価を減少させる方法であって、食物生産動物に治療有効量の項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法。
８９．抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体を有するそれを必要とする食物生産動物をワクチン接種する方法であって、前記食物生産動物に治療有効量の項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与するステップを含む方法。
９０．若い食物生産動物においてＡ型インフルエンザウイルスに対する母系由来免疫をもたらす方法であって、前記若い食物生産動物の母親が前記若い食物生産動物を妊娠している間に、前記若い食物生産動物の母親に治療有効量の項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法。
９１．それを必要とする若い食物生産動物においてＡ型インフルエンザウイルス感染に対する防御の増大をもたらす方法であって、
ａ）前記若い食物生産動物の母親が前記若い食物生産動物を妊娠している間に、前記母親に治療有効量の項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンをワクチン接種し、および／または
ｂ）前記若い食物生産動物に３週齢以内に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンをワクチン接種する方法。
９２．食物生産動物を免疫する方法であって、食物生産動物に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法で使用するための、項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
９３．それを必要とする食物生産動物においてＡ型インフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を治療または予防するための方法であって、食物生産動物に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法で使用するための、項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
９４．同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、それを必要とする食物生産動物の肺におけるウイルス力価を減少させる方法であって、食物生産動物に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法で使用するための、項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
９５．抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体を有するそれを必要とする食物生産動物をワクチン接種する方法であって、食物生産動物に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法で使用するための、項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
９６．若い食物生産動物においてＡ型インフルエンザウイルスに対する母系由来免疫をもたらす方法であって、前記若い食物生産動物の母親が前記若い食物生産動物を妊娠している間に、前記若い食物生産動物の母親に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法で使用するための、項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
９７．それを必要とする若い食物生産動物においてＡ型インフルエンザウイルス感染に対する防御の増大をもたらす方法であって、
ａ）前記若い食物生産動物の母親が前記若い食物生産動物を妊娠している間に、前記若い食物生産動物の母親に治療有効量の項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンをワクチン接種し、および／または
ｂ）前記若い食物生産動物に３週齢以内に治療有効量の前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンをワクチン接種する方法で使用するための、項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
９８．食物生産動物がブタ、子ブタまたは雌ブタである、項８６から９７のいずれか１項の方法または使用。
９９．Ａ型インフルエンザウイルスがブタＡ型インフルエンザウイルスである、項８６から９８のいずれか１項の方法または使用。
１００．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを１回で投与する、項８６から９９のいずれか１項の方法または使用。
１０１．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを、食物生産動物に、６週齢以内、２週齢以内、１週齢以内または１日齢以内に投与する、項８６から１００のいずれか１項の方法または使用。
１０２．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを２用量で投与する、項８６から１０１のいずれか１項の方法または使用。
１０３．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを食物生産動物に、１週齢以内に投与し、２回目を２週齢以内、３週齢以内または４週齢以内に投与する、項１０２の方法または使用。
１０４．前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを筋肉内または鼻腔内に投与する、項８６から１０３のいずれか１項の方法または使用。
１０５．食物生産動物が抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体陰性である、項８６から８８および９２から９４および９８から１０４のいずれか１項の方法または使用。
１０６．食物生産動物が抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体陽性である、項８６から１０４のいずれか１項の方法または使用。
１０７．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが１×１０4から１×１０7ＴＣＩＤ50のＥＨＶベクターを含む、項８６から１０６のいずれか１項の方法または使用。
１０８．同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、体重減少の低下、肺におけるウイルス負荷の減少、肺病変の減少、ウイルス排出の減少および／または短縮、直腸温度の低下、臨床症状（特に呼吸器症状）の減少、（中和）抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体の誘導増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＴ細胞刺激の増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＢ細胞刺激の増加および肺における炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ１βの減少またはそれらの組み合わせからなる群から選択される有効性パラメータの改善を引き起こす、項８６から１０７のいずれか１項に記載の方法または使用。
１０９．治療または予防が、同種の非治療対照群の食物生産動物と比較してウイルス負荷期の短縮をもたらす、項８６から１０８のいずれか１項の方法または使用。
１１０．治療または予防が、チャレンジ（感染）１日後からのＡ型インフルエンザウイルスの排出の減少をもたらす、項８６から１０９のいずれか１項の方法または使用。
１１１．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンがＡ型インフルエンザウイルスによる同種および／または異種チャレンジに対して防御する、項８６から１１０のいずれか１項に記載の方法または使用。
１１２．免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンが血清型Ｈ１および／またはＨ３のＡ型インフルエンザウイルスによるチャレンジに対して防御する、項８６から１１１のいずれか１項に記載の方法または使用。
スイス型およびその他の表記
１１３．治療的使用のための項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１１４．免疫原またはワクチンとして使用するための項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１１５．医薬品として使用するための項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
１１６．医薬品の製造のための項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡの使用。
１１７．食物生産動物におけるブタＡ型インフルエンザウイルス感染の治療および／または予防のための項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡの使用。
ＤＩＶＡ
１１８．ブタＡ型インフルエンザウイルスで感染した食物生産動物を項２、３、５、６および８から８３のいずれか１項の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンでワクチン接種した食物生産動物から区別する方法であって、
ａ）食物生産動物から試料を入手すること、および
ｂ）前記試料を免疫試験および／またはゲノム分析試験で分析すること
を含む方法。
１１９．免疫試験が、試料がブタインフルエンザのＮ（ノイラミニダーゼ）タンパク質またはＮＰ（核タンパク質）タンパク質を特異的に認識する抗体を含むかどうかを試験することを含む、項１１８に記載の方法。
１２０．ブタインフルエンザのＮ（ノイラミニダーゼ）タンパク質またはＮＰ（核タンパク質）タンパク質を特異的に認識する抗体が検出された場合、食物生産動物がブタＡ型インフルエンザウイルスに感染している、項１１８または１１９に記載の方法。
１２１．ゲノム分析試験が、試料がＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をコードするブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列を含むかどうかを試験することを含む、項１１８に記載の方法。
１２２．Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をコードするブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列が検出された場合、食物生産動物がブタＡ型インフルエンザウイルスに感染している、項１１８または１２１に記載の方法。
１２３．免疫試験がＥＩＡ（酵素免疫測定法）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）であり、あるいはゲノム分析試験がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法）またはリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）である、項１１８から１２２のいずれか１項に記載の方法。
１２４．食物生産動物がブタである、項１１８から１２３のいずれか１項に記載の方法。
１２５．試料が血清試料である、項１１８から１２４のいずれか１項に記載の方法。
１２６．ＥＬＩＳＡが、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡまたはブロッキングＥＬＩＳＡである、項１１８から１２５のいずれか１項に記載の方法。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組合せて参照することによってよりよく理解することができる。
図１Ａは、野生型（ｗｔ）ＥＨＶ−１株ａｂ４と弱毒化ワクチン株ＥＨＶ−１ ＲａｃＨのｏｒｆ１／３領域を比較する概略図である。
図１Ｂは、ｏｒｆ７０挿入部位の概略図である。
ＵＬ＝長いユニーク断片
ＵＳ＝短いユニーク断片
ＩＲ＝内部逆方向反復
ＴＲ＝末端逆方向反復
ｇＧ＝糖タンパク質Ｇ
ｇｐＩＩ＝糖タンパク質ＩＩ
ｏｒｆ＝オープンリーディングフレーム
ｂｐ＝塩基対
図２は、転移プラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列である。
図３は、プロモーター動態実験のｑＰＣＲ結果を示す図である。３．ａのグラフは、必須糖タンパク質Ｄをコードするｏｒｆ７２の転写の動態を示す。これらのデータはｍＣｈｅｒｒｙの転写動態のデータをノーマライズするために使用された（３．ｂのグラフ）。
図４は、２つの独立したプロモーター動態実験のｑＰＣＲ結果を示す図である。転写活性と値の正の相関を示す。感染後異なる時間でのｍＣｈｅｒｒｙのｑＰＣＲ結果をノーマライズしたＣｔ値はｔ＝０での相当する平均Ｃｔ値から引かれた。２つの異なる細胞株での２つの実験が示される。
図５は、転移ベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列である。
図６は、発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１をＥＨＶ−１ ＲａｃＨのｏｒｆ７０に挿入するための、転移プラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列
Ｈ３＝Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ３をコードするオープンリーディングフレーム
７１ｐＡ＝本開示ＥＭＰ２０１６−０２２で記載した新たなポリＡ配列
Ｉ−ＳｃｅＩ＝制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの切断部位
プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーター
Ｋａｎａ＝カナマイシン耐性遺伝子
３’末端ＯＲＦ７０＝挿入部位の下流の組換え領域
ＯＲＩ＝プラスミドの複製開始点
ＡＰr＝プラスミドのアンピシリン耐性遺伝子
上流ｏｒｆ７０＝挿入部位の上流の組換え領域
ｐ４５５＝新たなプロモーターｐ４５５
ｂｐ＝塩基対
図７は、ｏｒｆ７０挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のゲノムの概略図を示す図である。
ｏｒｆ６９：ｏｒｆ７０の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９；ｐ４５５：本明細書に記載の新しいプロモーター、例えば例１を参照；Ｈ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列；Δｏｒｆ７０：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードするｏｒｆ７１のプロモーターを含有するｏｒｆ７０の残りの部分。
図８は、間接免疫蛍光法：
ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させたＶＥＲＯ細胞の、間接免疫蛍光法を示す図である。感染後２４時間の細胞は、エタノールによって固定され、風乾された。一次抗体としてＨ３に対する市販のモノクローナル抗体および二次抗体としてＦＩＴＣコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧを使用して、Ｈ３は組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた細胞において蛍光顕微鏡によって示された。
図９は、ウェスタンブロット：
ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３または対照ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥまたはモックを感染させた異なる継代の感染細胞のウェスタンブロットを示す図である。左のブロットは、ＥＨＶ−１のｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７とインキュベートされた。右のレプリカブロットは、Ａ型インフルエンザヘマグルチニンＨ３（ＰＡ５−３４９３０）に対する市販のウサギ高度免疫血清とインキュベートされた。１：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ５感染細胞、２：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ１０感染細胞、３：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ１５感染細胞、４：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ Ｐ２０感染細胞、５：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ｍＣ７０感染細胞。
図１０は、ウイルス力価：
個々の動物（ａ）または群平均（ｂ）のチャレンジ後１日および３日の群の平均肺力価。力価はそれぞれ、肺ホモジェネート１ｇ当たりのブタＩＡＶの組織培養感染量５０として示す。力価はそれぞれ、動物毎の左および右肺について判定された値の平均として判定し、それぞれ３つの肺試料のプールから得られた肺当たりのホモジェネートを調べた。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した（２×ＥＨＶ−１）または市販の不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した（２×Ｉｎａｃｔ．）動物。
図１１は、転移ベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列
図１２は、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨをＥＨＶ−１ ＲａｃＨのｏｒｆ１／３に挿入するための、転移プラスミドｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列
Ｈ１ａｖ＝Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ１をコードするオープンリーディングフレーム
ＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリＡ配列
プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーター
Ｋａｎａ＝カナマイシン耐性遺伝子
Ｆｌａｎｋ Ｂ＝挿入部位の下流の組換え領域
Ｆｌａｎｋ Ａ＝挿入部位の上流の組換え領域
ｐ４３０＝新たなプロモーターｐ４３０
ｂｐ＝塩基対
図１３は、ｏｒｆ１／３挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖのゲノムの概略図である。
Δｏｒｆ１：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム１の残りの部分；ｐ４３０：本明細書に記載の新しいプロモーター、例えば例１を参照；Ｈ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；ＢＧＨｐＡ：ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列；ｏｒｆ３：挿入部位の下流のオープンリーディングフレーム３
図１４は、導入遺伝子の発現を示す、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを感染させた細胞のウェスタンブロットおよび免疫蛍光法を示す図である。
Ｈ１ａｖ＝ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ
ＳＥ＝ｒＥＨＶ−ＲａｃＨ−ＳＥ（対照）
モック＝非感染細胞（対照）
図１５は、２つの挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ｒＥＨＶ−１−ＲａｃＨ−ＳＥ Ｂ）のゲノムの概略図である。
Δｏｒｆ１：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム１の残りの部分；ｐ４３０：新しいプロモーター；Ｈ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；ＢＧＨｐＡ：ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列；ｏｒｆ３：挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム３。
ｏｒｆ６９：ｏｒｆ７０の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム６９；ｐ４５５：新しいプロモーター；Ｈ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン；７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列；Δｏｒｆ７０：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードするｏｒｆ７１のプロモーターを含有するｏｒｆ７０の残りの部分。
図１６は、ウェスタンブロット：ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（Ｂ）、空ベクターｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ（ＳＥ）を感染させた細胞、またはモック感染（ｃｔｒｌ）のウェスタンブロットを示す図である。レプリカブロットは、Ｈ３に対する市販のウサギ高度免疫血清（Ｈ３）、Ｈ１に対する市販のウサギ高度免疫血清（ＰＡ３４９２９）（Ｈ１）、またはＥＨＶ−１ ｇｐＩＩに対するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ｇｐＩＩ）のいずれかとインキュベートされた。
図１７は、チャレンジの前、ならびにチャレンジの１、２、および３日後の群の平均体温を示すグラフである。エラーバー、標準偏差。試験日当たり左から右へ：陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
図１８は、チャレンジ後１および３日の群の平均肺スコアを示すグラフである。エラーバー、標準偏差。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
図１９は、チャレンジの日に回収されたブタＩＡＶ Ｈ３チャレンジ株Ｒ４５２−１４に対する動物血清の血清中和（ＳＮ）力価の逆数を示すグラフである。２０、検出限界。陰性対照群（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）、チャレンジ対照群（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
図２０は、ブタＩＡＶチャレンジ適用後１日または２日で採取したＢＡＬＦからのＩＬ−１βの結果を示すグラフである。各ドットは、１匹の動物当たり決定された値を表す。陰性対照群（Ｎｅｇ．Ｃｔｒ．）、チャレンジ対照群（Ｃｈａｌｌ．Ｃｔｒ．）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で１回ワクチン接種した動物（１×ＥＨＶ−１）、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種した動物（２×ＥＨＶ−１）、または不活性化ブタＩＡＶワクチンで２回ワクチン接種した動物（２×死菌）。
図２１は、２回目のワクチン接種の７日後に再刺激されたＰＢＭＣのＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔｓの結果を示すグラフである。（Ａ）非ワクチン接種対照群；（Ｂ）不活性化ブタＩＡＶワクチンによる２回ワクチン接種；（Ｃ）ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による１回ワクチン接種；（Ｄ）ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による２回ワクチン接種。ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３再刺激により１回だけワクチン接種した動物は、１回目のワクチン接種後７日に相当する。各ドットは、所与の時点および特定の刺激による再刺激後に、１匹の動物当たりに決定された値を表す。再刺激のため、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＨＡ＿Ｖ）のＨ３ワクチン抗原に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ ＨＡ、チャレンジ株Ｒ４５２−１４（ＨＡ＿ＣＨ）のＨ３に相当する組換え発現されたブタＩＡＶ ＨＡ、ＨＡ＿ＶおよびＨＡ＿ＣＨを希釈する培地（ＲＰＭＩ）、空ＥＨＶ−１ベクター ＲａｃＨ−ＳＥ（ＥＨＶ−１ ｅｍｐｔｙ）、ワクチンＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＥＨＶ−１−Ｈ３）、ブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４（Ｈ３Ｎ２）、Ｒ４５２−１４（ＭＤＣＫ）を増殖するために使用される非感染細胞由来の細胞上澄み液、または組換え発現されたブタＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）が使用された。
図２２は、トランスファープラスミドｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨの概要マップである。
図２３は、トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１の概要マップである。
図２４は、ｏｒｆ１／３およびｏｒｆ７０挿入領域を拡大した、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ）の線状二本鎖ＤＮＡゲノムを示す図である。
図２５は、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂ、ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ、ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた、または非感染（ｃｔｒｌ）細胞のウェスタンブロットを示す図である。レプリカブロットは、Ｈ３に対するポリクローナルウサギ高度免疫血清（ＰＡ５−３４９３０）、Ｈ１に対するポリクローナルウサギ高度免疫血清（ＰＡ５−３４９２９）、またはＥＨＶ−１ 糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）に対するモノクローナル抗体（Ａｉ２Ｇ７）のいずれかとインキュベートされた。全ての抗体は、全ての感染細胞試料においてＥＨＶ−１ ｇｐＩＩの非常に類似した染色から判断した場合、所望の抗原Ｈ３およびＨ１の発現ならびに異なるウイルスの相当する複製効率を確認する、予測されるパターンを産生した。
図２６は、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ブタ／イタリア／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））または（Ａ／ブタ／ゲント／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））に対するマウス血清の平均中和能力を示した図である。中和能力は、血清希釈率の逆数とそれによって中和されるそれぞれの力価の掛け算によって算出された。３回の試験の平均は、次いで、１００で割られ、１００ ＴＣＩＤ５０の中和を反映した。エラーバーは標準偏差を示す。
図２７は、チャレンジ後１日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。
図２８は、チャレンジ後３日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。
図２９は、チャレンジ後５日で殺された動物のＴＣＩＤ５０／ｇ肺組織として決定されたブタＩＡＶ肺力価を示すグラフである。ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、陰性対照群；ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。データ点は、個々の動物で得られた平均を示す。中央の水平な線は、それぞれ群平均を示す。上と下の水平な線は、それぞれ標準偏差を示す。群の対での統計比較のｐ値は下に挙げられ、それぞれ標準的なソフトウェア設定を使用する、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験およびＷｉｎｄｏｗｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を使用してｔ検定によって算出された。
図３０は、ワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示すグラフである。試験のため、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現Ｈ３によってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は、グラフの右の凡例に示される。
図３１は、ワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示すグラフである。試験のため、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現Ｈ３によってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は、グラフの右の凡例に示される。
図３２は、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）の結果を示すグラフである。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験２８日目（ＳＤ２８）に試験動物から採血された血液から精製された。ＰＢＭＣは、次いで、１（Ｈ３Ｎ２ ＭＯＩ １）の感染により複数回、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４でまたは１μｇ／ｍｌ（ｒＨ３ １μｇ／ｍｌ）の濃度でワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な組換え発現ブタＩＡＶ Ｈ３抗原でのいずれかで再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。
図３３は、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）の結果を示すグラフである。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、試験２８日目（ＳＤ２８）に試験動物から採血された血液から精製された。ＰＢＭＣは、次いで、１（Ｈ３Ｎ２ ＭＯＩ １）の感染により複数回、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４でまたは１μｇ／ｍｌ（ｒＨ３ １μｇ／ｍｌ）の濃度でワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な組換え発現ブタＩＡＶ Ｈ３抗原でのいずれかで再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された。ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．、チャレンジ対照群（陰性対照として寄与する）；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１のおよび筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、２回鼻腔内にワクチン接種した群。エラーバーは、標準偏差を示す。
図３４は、組換え発現されたブタＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示した図である。試験のために、各ウェルは１００ｎｇの組換え発現ＮＰによってコートされた。それぞれ、試料は対で測定され、試料平均は対の測定から算出され、群の値は試料平均から算出された。ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．、陽性対照群；ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．陰性対照群；２×ＩＭ、筋肉内に２回ワクチン接種した群；ＩＮ＋ＩＭ、鼻腔内に第１および筋肉内に第２のワクチン接種を行った群；２×ＩＮ、鼻腔内に２回ワクチン接種した群。エラーバーは標準偏差を示す。試験日（ＳＤ）は図の右の凡例に示される。
シーケンス概要：
以下の配列は、本発明において本明細書に詳細に記載され、開示される。
プロモーター：
配列番号１ ＥＨＶ−４ ６００ｂｐ デオキシリボ核酸配列 ４ｐｇＧ６００
配列番号２ ＥＨＶ−４ ６００ｂｐ デオキシリボ核酸配列 ４ｐＭＣＰ６００
配列番号３ ＥＨＶ−４ ４３０ｂｐ デオキシリボ核酸配列 ｐ４３０
配列番号４ ＥＨＶ−４ ４４９ｂｐ デオキシリボ核酸配列 ｐ４５５
配列番号５ ｏｒｆ７２に特異的なプライマー番号１１３０
配列番号６ ｏｒｆ７２に特異的なプライマー番号１１３１
配列番号７ ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマー番号１０７９
配列番号８ ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマー番号１０８０
挿入部位：
配列番号９ ｏｒｆ７０挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１０１７
配列番号１０ ｏｒｆ７０挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１０１８
配列番号１１ ｏｒｆ１／３挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１００７
配列番号１２ ｏｒｆ１／３挿入領域の人工配列核酸ＰＣＲプライマー１００８
配列番号１３ 左（Ｕｐ７０）隣接領域（４１７ｂｐ）
配列番号１４ 右（Ｕｐ７１）隣接領域（４３１ｂｐ）
配列番号１５ ヌクレオチド１２７２６４〜１２７６８０に位置する、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）の隣接領域左（ｏｒｆ７０上流）
配列番号１６ ヌクレオチド１２８４８４〜１２８９１３に位置する、野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）の隣接領域右（ｏｒｆ７１上流）
配列番号１７ ＲＥＤシステムにおけるトランケートした隣接領域：左（Ｕｐ７０）隣接領域（２８３ｂｐ）＝４１７ｂｐの「クラシカルな」隣接領域の３’の２８３ｂｐと同一
配列番号１８ ＲＥＤシステムにおけるトランケートした隣接領域：右（Ｕｐ７１）隣接領域（１４４ｂｐ）＝４３１ｂｐの「クラシカルな」隣接領域の５’の１４４ｂｐと同一
配列番号１９ 野生型ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）ゲノム配列の欠損部分、ヌクレオチド１２７６８１〜１２８４８２
配列番号２０ ＲａｃＨゲノム配列の欠損部分（完全なゲノム配列が公知ではないため、ヌクレオチド番号が入手できない）
プラスミド／ベクター配列：
配列番号２１ トランスファープラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨのヌクレオチド配列
配列番号２２ トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
配列番号２３ トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
配列番号２４ トランスファーベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨのヌクレオチド配列
配列番号２５ トランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨのヌクレオチド配列
ヘマグルチニン配列
配列番号２６ ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２））］ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＲ０１７４６．１ Ｈ１ｐｄｍ
配列番号２７ ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））］ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＳ５０３０２．２ Ｈ３：
配列番号２８ ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））］ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＲ７６６２３．１ Ｈ１ａｖ：
配列番号２９ ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２））］ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＫ９８４７６．１* Ｈ１ｈｕ
*アミノ酸５３１（Ｘ、終止コドンは、Ｉに変更された）
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の例に開示されている技法は本発明の実施において十分に機能することを本発明者らが発見した代表的な技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
（例１）
新たな挿入部位ＯＲＦ７０の確立
ＥＨＶ−１ベクターの能力を増大させるために、本発明者らは、１プロモーターの制御下で、ＲＮＡウイルス由来機能によって２つの導入遺伝子をカップリングすることなく、１つのベクター骨格から２つの異なる導入遺伝子を発現させる方法を発見しようと試みた。本発明者らは、ヘルペスウイルスゲノムが２つの独立した導入遺伝子挿入部位の並行した使用を許容するだろうと仮定した。ＥＨＶ−１ ＯＲＦ７０が適切な導入遺伝子挿入部位であるかどうかを判定するために、ｏｒｆ７０（１２３６ｂｐ）の５’末端の８０１塩基対を、古典的相同組換えによって、自己蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質（Shaner et al. 2004）をコードする発現カセットと置換した（図１Ｂ）。プラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨのマップは図２（配列番号２１）である。相同組換えに使用したＤＮＡ断片は、ｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨからＸｂａＩで切除した。ゲル精製断片は、ＥＨＶ−１ ＲａｃＨのウイルスゲノムＤＮＡと共にＲＫ１３細胞にコトランスフェクトした。組換えベクターウイルスの効率的なレスキューおよび培養細胞中における効率的な複製は、生体蛍光およびウイルス滴定によって示された（示さず）。ｏｒｆ７０の３分の２の欠損は、ｏｒｆ７０によってコードされた糖タンパク質Ｇの発現を止めさせるというさらなる利点を有した。ＥＨＶ−１の糖タンパク質Ｇは、宿主の免疫応答を相殺する非構造的な分泌性のケモカイン結合タンパク質であることが示された（Drummer et al., 1998; Bryant et al., 2003）。ベクターワクチンは、ワクチンの免疫応答を刺激することが企図されているので、ウイルスベクターのこの特別な免疫抑制機能の除去はウイルスベクタープラットフォームＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥの性能をさらに高めるだろう。
（例２）
新しいプロモーターの同定および構築
好適なプロモーター配列を同定する戦略は以下の通りであった：２つの公知のｏｒｆの上流のＥＨＶ−４配列の６００ｂｐ断片が、それらをＥＨＶ−１ゲノムのそれぞれの配列断片とアラインすることによってまず分析された。選ばれた遺伝子は主キャプシドタンパク質（ＭＣＰ）をコードするｏｒｆ４２、糖タンパク質Ｇ（ｇＧ）をコードするｏｒｆ７０であった。主キャプシドタンパク質は、ビリオンの最も豊富な構成成分の１つであり、新しく合成されたウイルスＤＮＡのパッケージングの準備ができるとすぐに細胞核でのキャプシドのアセンブリーに必要とされる。したがって、そのプロモーターは、ウイルス複製サイクルの初期および後期に活性であると予測される。糖タンパク質Ｇに関して、その遺伝子（ｏｒｆ７０）も複製サイクルの初期および後期に活性であることが公知である（Colle et al. 1995, Drummer et al. 1998）。配列同一性は、推定のＭＣＰプロモーターでは８２．２％であり、推定のｇＧプロモーターでは８２．３％であった。これらの違いは、一方では相同組換えを防ぐのに十分大きく、他方ではＥＨＶ−１複製中に転写活性化を可能にするのに十分小さいと考えられた。プロモーター活性を試験するため、６００ｂｐのＤＮＡ断片４ｐｇＧ６００
GCAGACTTTGGAGCAGCACAATTTCCGGTTGTGGACCCCATGGACCTTGGTTTGGCTGGTACCGTGGAAACTAACGCTCCGGAAGTTTTGGCCAGAGCAAAATACAATTCGAAGGTAGACATATGGAGCGCCGGAATAGTTCTGTTTGAAATGCTCGCATATCCATCAACTCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT（配列番号１）
および４ｐＭＣＰ６００
AGCTGGGGGAGTTTGTACTATAGTGTATTACATGCGGCTTGCAATAACTGCCTGGTTTATGTTTCGCAACATTCAAGCAGACATGCTACCGCTAAACACTTTGCAACAATTTTTTATTGGGTGTTTGGCCTTTGGTAGAACTGTCGCGTTTTTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA（配列番号２）
が合成され、自己蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙをコードするレポーター遺伝子の上流にクローニングされた（Shaner et al., 2004）。転写終結シグナルおよびｍＲＮＡ安定化機能として、ウシ増殖ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ；Goodwin & Rottman, 1992）が、レポーター遺伝子の３’端のすぐ下流にクローニングされた。
陽性対照として使用されるように、ＣＭＶプロモーターは市販のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅され、ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子の上流にクローニングされ、ここでＢＧＨｐＡもレポーター遺伝子の３’端に付加された。細胞培養は、３つのプラスミド（ｐＢｌｕ−４ｐｇＧｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＢｌｕ−４ｐＭＣＰｍＣｈｅｒｒｙ、およびｐＢｌｕ−ＣＭＶｍＣｈｅｒｒｙ）をトランスフェクトされ、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が蛍光顕微鏡によって検査された。ＣＭＶプロモーターの強い活性は、トランフェクション後の異なる時間で明らかであった。４ｐｇＧ６００プロモーターはトランスフェクション後も活性であり、４ｐＭＣＰ６００プロモーターの活性も検出可能であったが、４ｐｇＧ６００プロモーターと比較して弱く、トランスフェクションの３日後のＣＭＶプロモーターと比較した場合でさえ、さらにより弱かった。
プロモーター活性へのウイルス遺伝子産物の効果を調べるため、ｐＢｌｕ−４ｐｇＧ６００−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｐＢｌｕ−４ｐＭＣＰ６００−ｍＣｈｅｒｒｙのいずれかをトランスフェクトされた細胞培養には、トランスフェクション１日後に緑色蛍光ＥＨＶ−１ ＲａｃＨＩ−ＥＦを重感染させた。ウイルス遺伝子産物は、ＥＨＶ−１ ＲａｃＨＩ−ＥＦ複製がないよりも著しく高い活性まで、４ｐＭＣＰ６００プロモーターを明らかにトランス活性化した。ウイルス複製がない最初の活性がｐＢｌｕ−４ｐＭＣＰ６００−ｍＣｈｅｒｒｙで観察されたよりも高かったためそれほど劇的ではないにしても、ｐＢｌｕ−４ｐｇＧ６００−ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトされ、ＥＨＶ−１ ＲａｃＨＩ−ＥＦを重感染させた細胞培養においても効果は存在した。さらに、両方の６００ｂｐのプロモーターについて、細胞培養のそれらの活性へのウイルス複製のトランス活性化効果が実証された。
この効果は、６００ｂｐの配列が、通常活性化エレメントの上流に位置する抑制エレメントを含有する場合に説明され得る。続いて、より短いプロモーターは、ウイルス遺伝子産物の非存在下でより活性であり得る。この両方のＥＨＶ−４プロモーターを試験するため、配列はそれらの元々の長さのおよそ７５％にトランケートされ、再び試験された。
特に、６００ｂｐのプロモーターは、４３０ｂｐの４ｐｇＧ、新しい名称：ｐ４３０：
TCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT（配列番号３）
および４４９ｂｐの４ｐＭＣＰ、新しい名称：ｐ４５５：
TTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA（配列番号４）
にトランケートされた。
短くなったプロモーターを含有するｍＣｈｅｒｒｙレポータープラスミドが細胞培養にトランスフェクトされ、蛍光顕微鏡によって調べられた。ｐ４３０活性は、６００ｂｐバージョン（４ｐｇＧ６００）のものに相当したが、ｐ４５５の活性は４ｐＭＣＰ６００の活性よりも著しく増大された。この結果は、２つのプロモーターの６００ｂｐバージョンを使用するトランスフェクション／重感染実験の結果と一致し、つまり、同じ細胞におけるＥＨＶ−１複製の存在が、４ｐＭＣＰ６００プロモーターのトランス活性化のメカニズムを提供し、その活性を強く増大させるが、４ｐｇＧ６００プロモーターのトランス活性化は見られたが明白ではなかった。
２つの新しいプロモーターに加えて、新しいポリＡ配列も新しいｏｒｆ７０挿入部位からの発現に必要とされた。エレメントは、７１ｐＡと呼ばれる。そのヌクレオチド配列は合成され、ｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ７０挿入部位を標的とするｐ４５５を含有するトランスファープラスミドのｍＣｈｅｒｒｙ ｏｒｆの下流にクローニングされた。
次いで、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥが生成され、ウイルス複製の背景でのプロモーター活性をアッセイした（表１）。２つのＥＨＶ−４プロモーター（ｐ４３０およびｐ４５５）、ＣＭＶプロモーター、ならびにマウスサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター（ＭＣＭＶ）が使用され、ＢＧＨポリＡシグナルと組合せてｍＣｈｅｒｒｙの発現を導き、ｍＲＮＡの安定性を増大させた。Dorsch-Hasler et al. (1985)に記載されるように、ＭＣＭＶ ＩＥ１プロモーター（エンハンサー）は合成され、プラスミドベクターにクローニングされ、そこからトランスファープラスミドにサブクローニングされた。さらに、ｐ４５５も、新しいポリＡシグナル７１ｐＡと組合せてｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動するｏｒｆ７０の新しい挿入部位にクローニングされた。別の対照として、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨｍＣ７０が実験に含まれた。この組換えウイルスを感染させた細胞は、内在性ｇＧプロモーター（ｅｇＧｐ）の制御下でｍＣｈｅｒｒｙを発現する（表１）。
ＶＥＲＯまたはＰＫ／ＷＲＬ細胞は、６つのｍＣｈｅｒｒｙ発現ウイルス全てをｍ．ｏ．ｉ．（多重感染度）１で感染させた。感染細胞は、感染後、０、４、８、および１２時間で回収され、全ＲＮＡが調製された。ＲＮＡ調製物にコンタミネートしているウイルスおよび細胞ゲノムＤＮＡはＤＮＡｓｅ Ｉ消化によって破壊された。ＲＮＡの完全性およびウイルスＤＮＡの除去は、逆転写酵素の添加有りおよび無しでの逆転写に続いてＥＨＶ−１の基本構造の糖タンパク質Ｄをコードするｏｒｆ７２に特異的なプライマー対（プライマー番号１１３０／１１３１、（ＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧ（配列番号５）／ＣＴＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＧＴＴＧ（配列番号６））によるＰＣＲによって示された。予測される１９６ｂｐのＰＣＲ産物は、逆転写酵素が添加された逆転写された試料（ｃＤＮＡ）、特にｔ１＝感染後４時間、ｔ２＝感染後８時間、およびｔ３＝感染後１２時間で調製された試料からのみ増幅され、ｔ０＝感染後０時間で調製された試料からは増幅されなかった。反応に逆転写酵素が添加されなかった全ての試料は、予測されるいずれのＰＣＲ産物も産生しなかった。したがって、ｑＰＣＲの鋳型として使用される試料（ｃＤＮＡ）はウイルスのゲノムＤＮＡを含有しなかったことが示された。
添加した酵素による逆転写から得られたｃＤＮＡは、次いで、ｍＣｈｅｒｒｙに特異的なプライマー対（プライマー番号１０７９／１０８０、（ＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＡＴＧＧ（配列番号７）／ＡＣＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧ（配列番号８））およびｏｒｆ７２プライマー対１１３０／１１３１（ＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧ（配列番号５）／ＣＴＡＧＣＧＣＡＧＴＣＧＣＧＴＴＧ（配列番号６））を使用するｑＰＣＲによって分析された。ｏｒｆ７２ ｑＰＣＲのＣｔ（サイクル閾値）値は、並行する異なるウイルス感染の比較性を評価し、ｍＣｈｅｒｒｙ ｑＰＣＲのＣｔ値をノーマライズするために使用された。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙの転写は感染後の時間および異なるウイルスに対して定量された（図３）。
図３ａに示すように、ｏｒｆ７２転写物のＣｔ値は、感染後４つの異なる時間での、６つの異なるウイルスでほぼ同一であった。理想的には、６つのウイルス全てが調べた時間で同一の値を出し、１つの線だけが見られる。線がほぼ同一であることから、実験の十分な質が確認され、また感染後１２時間の時点での結果は、感染後８時間と比較した場合の減少が、複製がその最大を通過していない場合にのみ可能である転写物の数のさらなる増加を示すため、妥当である。感染後の各時間の統計的な平均が算出された。特定の時間での各ウイルスの値はその時間で算出された平均によって割られ、ｍＣｈｅｒｒｙ ｑＰＣＲのＣｔ値がそれらを直接比較可能にするためにそれによってノーマライズされた因子として使用された。ｍＣｈｅｒｒｙ ｑＰＣＲのノーマライズされた視覚的にＣｔ値は図３ｂの右のグラフに示される。線の相違は、異なるウイルス感染細胞で産生されたｍＣｈｅｒｒｙ転写物の数の違いを示す。
異なる型のグラフに、１つはＶＥＲＯ−ＥＵ細胞（Ｖ）を使用し、１つはＰＫ／ＷＲＬ細胞（Ｐ）を使用する２つの実験を合わせた（図４）。ＲＮＡ調製物の質および経時的なウイルス複製は、上記のように、逆転写酵素有りまたは無しでの逆転写に続いてｏｒｆ７２プライマーによるＰＣＲによって確認された。ｍＣｈｅｒｒｙの得られたｑＰＣＲ Ｃｔ値は、ｏｒｆ７２のｑＰＣＲ Ｃｔ値に基づいて上記のようにノーマライズされた。ｔ１＝感染後４時間、ｔ２＝感染後８時間、およびｔ３＝感染後１２時間のノーマライズされたＣｔ値を、ｔ０でのノーマライズされたＣｔ値から引く（ΔノーマライズされたＣｔ）と、転写活性と正の相関を示した。
ＶＥＲＯ（Ｖ）またはＰＫ／ＷＲＬ（Ｐ）細胞での２つの実験は直接比較できないが、ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのより高い発現レベルは、通常感染性ウイルスの１０倍高い力価を生じるＥＨＶ−１複製のためのＰＫ／ＷＲＬ細胞の優れた許容度を最も反映するようである。
ＥＨＶ−由来プロモーターｐ４３０、ｐ４５５およびｅｇＧｐの活性は、使用した細胞株の感染後の各時間でほぼ同じであり、それらの挿入部位または使用したポリＡ（ＢＧＨまたは７１ｐＡ）とは無関係であり、ＣＭＶ−およびＭＣＭＶプロモーターの活性はＰＫ／ＷＲＬ細胞でより高い。ＶＥＲＯ−ＥＵ細胞では、ＭＣＭＶプロモーターのみがより高い活性を持つことが示され、ＣＭＶプロモーターはＥＨＶ−プロモーターよりも優れていなかった。
これらの実験から、ＥＨＶ−４プロモーターｐ４３０およびｐ４５５は、ＥＨＶ−１ ＲａｃＨ骨格で使用され、ｏｒｆ１／３およびｏｒｆ７０挿入部位の両方から、挿入された導入遺伝子の発現を駆動するのに適していたと結論づけられた。
（例３）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築における新しいｐ４５５プロモーターの使用
ｐ４５５プロモーター
最初の動物実験のため、ブタ起源Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＢＳ５０３０２．２）、配列番号２７由来のインフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型が使用された。そのコード配列は合成され、転移ベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１（図５）にサブクローニングされ転移ベクターｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１を作製し、新たなｐ４５５プロモーターおよび新たな７１ｐＡポリアデニル化シグナルの制御下にＨ３を配置し、ｏｒｆ７０への挿入のために組換え領域を備えたカセットを組み立てた（図６）。
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって（Tischer et al. 2006）、発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１がｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ７０に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３が生成された（図７）。
ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法によって分析された（ＩＦＡ、図８）。
ＥＨＶ−１ ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７０の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡ（データは示さない）およびウェスタンブロット（図９）によって確認された。感染した細胞の細胞膜でのＨ３の三量体の出現は、トリ赤血球を使用した赤血球吸着試験によって測定した（示さず）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのＴＣＩＤ50／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たないことを示している（データは示さない）。これは、ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３のレスキュー後２０回までの継代（Ｐ２０）によって確認された。Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１５、およびＰ２０で、ウイルスは、力価測定、シーケンシング、およびウェスタンブロット（図９）によって、Ｐ１０およびＰ２０で、さらにＩＦＡによって特徴づけられ、ＨＡ発現、ならびにＨＡをコードするインサート、およびプロモーターおよびポリＡ配列の遺伝的安定性が確認された。
図９に示した２つのブロットは、ＥＨＶ−１糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）を特異的に検出するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（左）またはインフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型に対するウサギ由来の市販のポリクローナル抗体（ＰＡ５−３４９３０）（右）のいずれかとインキュベートされたレプリカである。ｇｐＩＩは、予測されたように、組換えＥＨＶ−１を感染させた全ての細胞培養において検出された。全長Ｈ３は、予測されたように、異なる継代のｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた全ての細胞で検出された。Ｈ３−抗血清の特異性は、同じウェスタンブロットで示され、レーンｇＧ４３０ｍＣを参照。ここで、予測されたように、ｇｐＩＩ ｍａｂのみが反応を起こしたが、抗Ｈ３抗体はそれぞれのレプリカレーンでは結合しなかった。
モノクローナル抗Ｈ３抗体およびウマ抗ＥＨＶ抗血清を使用するＰ２０を感染させた細胞におけるウイルスプラークの二重免疫蛍光法（ｄＩＦＡ）によって、事実上全てのＥＨＶ−１誘導プラークがＨ３も発現することが確認された（データは示さない）。全ての試験により、組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３の安定性が確認された。
（例４）
ｐ４５５プロモーターおよび血清学的応答の評価を使用する動物実験の概念の証明（ＰＯＣ Ｉ）
試験動物：組入れ基準および実験デザイン
Ａ型インフルエンザ無感作の雌ブタから生まれた１０匹の子ブタの５つの群が、表２に要約したようにＰＯＣ−Ｉ実験に含まれた。
感染量１×１０7 ＴＣＩＤ５０のｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ＥＨＶ−１）が、５週齢で１回または２および５週齢で２回のいずれかで適用された。比較のため、市販の不活性化ワクチン（Ｉｎａｃｔ）は２および５週齢で２回適用された。全ての子ブタは、不活性化ワクチン（Ｉｎａｃｔ）の効果を消失させないため、母系由来抗体がなかった。２つの群はワクチン接種されないが、それぞれチャレンジ対照または厳密な陰性対照として寄与する生理的食塩水（ＮａＣｌ）の注入を受けた。２回目のワクチン接種の２１日後、厳密な陰性対照群を除く全ての群は、１×１０7 ＴＣＩＤ50の異種Ａ型インフルエンザ（ＩＡＶ）株（ブタ由来Ｈ３Ｎ２ Ａ型インフルエンザウイルス Ｒ４５２−１４、ＢＩに所有されるチャレンジ単離株）によってチャレンジされた。非ワクチン接種のチャレンジ対照群（Ｃｈａｌｌ ｃｔｒｌ）では、全てのブタは、チャレンジ感染後１および３日で肺に高いインフルエンザウイルス力価を有するが、厳密な陰性対照群（ｎｅｇ ｃｔｒｌ）およびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で２回ワクチン接種された群（ＥＨＶ ２×）の全てのブタは、両方の日にＩＡＶが陰性であった。不活性化対照ワクチンによって２回ワクチン接種された群（Ｉｎａｃｔ ２×）では、５匹中１匹の動物がチャレンジ３日後に低いＩＡＶ力価を有した。ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３によるチャレンジの２１日前に１回ワクチン接種された群（ＥＨＶ １×）では、５匹中２匹の動物が、チャレンジ感染の１日後に肺に低いＩＡＶ力価を有し、５匹中１匹がチャレンジの３日後に肺に低いＩＡＶ力価を有した（図１０）。
１×１０7 ＴＣＩＤ５０のｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３による２回のワクチン接種は、異種ＩＡＶ、Ｈ３Ｎ２亜型によるチャレンジ感染に対してブタを完全に保護した。ＥＨＶ−１ベクターＲａｃＨ−ＳＥがブタのワクチン接種に好適であり、新しいプロモーター４５５が、ワクチン接種したブタにおいてＩＡＶヘマグルチニンの免疫原性発現の駆動に機能的であることが実証された。
（例５）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築における新しいｐ４３０プロモーターの使用
ｐ４３０プロモーター
新しく同定されたｐ４３０プロモーターは、Ｈ１Ｎ１ウイルス（（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＲ７６６２３．１）、配列番号２８由来の別のインフルエンザヘマグルチニンの発現を駆動するために使用された。このウイルス単離株のヘマグルチニン遺伝子は「トリ」型ＩＡＶのブタＩＡＶに由来するため、Ｈ１ａｖと呼ばれる。Ｈ１ａｖは合成、およびトランスファーベクターのｏｒｆ１／３挿入領域、ｐＵ１／３−ｐ４３０−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨ（図１１）にサブクローニングされ、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨを生成した。Ｈ１ａｖの発現は、ｐ４３０プロモーターおよびウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの調節下に置かれた（図１２）。
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって（Tischer et al. 2006）、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨはｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ１／３に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖが生成された（図１３）。
ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖをトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖがレスキューされ、２回プラーク精製された。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用する間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）およびウェスタンブロットによって分析された（図１４）。
ＥＨＶ−１ ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡおよびウェスタンブロットによって確認された（データは示さない）。Ｈ１ａｖの正確なプロセシングおよび輸送、ならびに感染細胞の細胞膜上の局在は、トリの赤血球を使用する赤血球吸着試験によって評価された（データは示さない）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞においてＴＣＩＤ５０／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たなかったことを示している（データは示さない）。
抗体ＰＡ−３４９２９によって７５ｋＤａの広帯域の移動の特異的検出は、その配列から予測されるように、組換えＨＡ糖タンパク質の予測される出現と一致する。モノクローナル抗体Ｃ１０２による細胞膜の明らかな染色は、予測される細胞内局在に則している（図１４）。
発現された組換えヘマグルチニンが予測されるようにプロセシングおよび輸送されたかどうか試験するため、ＶＥＲＯ細胞は０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ（親）を感染させ、または非感染のままおいた。感染の２４時間後、生きた感染細胞および非感染細胞は、ＰＢＳ中のトリの赤血球の懸濁液とインキュベートされ、ＰＢＳで洗浄され、蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色によって染色された。トリの赤血球は細胞核を含有するため、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって染色することができ、蛍光顕微鏡によって小さな青いスペックとして現れる。ヘマグルチニンを発現しないｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞と比較して、トリの赤血球の吸着は、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖまたはｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のいずれかを感染させた細胞上で著しく増加した（データは示さない）。このことから、真正のインフルエンザウイルス感染によって産生されたかのような様式で、ヘマグルチニンが翻訳され、プロセシングされ、ベクターウイルス感染細胞の細胞膜に輸送されたと結論づけることができる。
感染細胞の赤血球吸着の明確な表現型は、導入遺伝子タンパク質の効果的な発現を示し、ＥＨＶ−１ベクター感染細胞の細胞表面上の機能的ＨＡ三量体の形成を示唆するウェスタンブロットおよび免疫蛍光法による知見を支持する。
（例６）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンにおける並行する２つの挿入部位での２つの新しいプロモーターｐ４５５およびｐ４３０の使用
２つの新しいプロモーターが並行して使用され得ることを示すため、組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨは２つの異なるＡ型インフルエンザウイルス亜型の２つの異なるヘマグルチニンを発現するように生成された。
Ｈ３（ＰＡ５−３４９３０）およびＨ１（ＰＡ５−３４９２９）に対する市販のポリクローナル抗体の交差反応性の特異性および欠如は、単一インサートウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３およびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを感染させた感染細胞のウェスタンブロットによって確かめられた（データは示さない）。
組換えＢＡＣ ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で開始して、トランスファーベクターｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨ（図１２）にアセンブルされた発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨは、２ステップＲＥＤ組換えによってｏｒｆ１／３挿入部位に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を生成した。ＰＫ／ＷＲＬ細胞はｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された（図１５）。
この組換えウイルスの略称は、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂである。発現カセットの正しい挿入は、隣接する配列とともに挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞における導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、データは示さない）ならびに市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図１６）によって分析された。ＥＨＶ−１ ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復はＩＦＡ（データは示さない）およびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するウェスタンブロット（図１６）によって確かめられた。
図１６に示されるように、導入遺伝子Ｈ３とＨ１ａｖの両方は、二重インサート組換えｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた細胞培養中で並行して発現された。導入遺伝子発現は安定であり、ＰＫ／ＷＲＬ細胞の継代１１回まで試験されたウイルス力価を損なわなかった（データは示さない）。
２つの新しいプロモーターｐ４３０およびｐ４５５は、細胞培養のｒＥＨＶ１−ＲａｃＨ複製に関しては機能的であることが示された。ウイルス複製サイクル中の活性レベルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロモーター動態実験から推測されたものと非常に類似しているようである。これらの特性は、類似の効率で並行して２つの異なる抗原を発現するＥＨＶ−１ ＲａｃＨまたは他のベクタープラットフォームに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチンの標的が２つの異なる病原体からなる場合、２つのポリアデニル化配列と組合せた２つの挿入部位における２つの新しいプロモーターの適用は、グッズの費用を著しく削減することができ、１つの抗原成分のみを発現するベクターに明らかな利点を提示する。
（例７）
ブタのための一価のＥＨＶ−１ベクターＡ型インフルエンザウイルスワクチン（Ｈ３ワクチン）の生成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性決定、およびｉｎ ｖｉｖｏ試験
血清型Ｈ３のブタＩＡＶインフルエンザウイルスヘマグルチニン（配列番号２７）（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＢＳ５０３０２．２）が、ブタのワクチン研究のために試験される抗原として選ばれた。ブタＩＡＶに対するこの新しいワクチンは、１つのブタＩＡＶ ＨＡタンパク質のみを発現するため、例えば、ブタＩＡＶ野外株に感染した動物ではブタＩＡＶタンパク質ＮＰまたはＮＡに対する抗体が検出されるが、本明細書に記載のワクチンによってのみワクチン接種された動物では検出されないことによってＤＩＶＡ特性を提供する。そのコード配列は、合成およびサブクローニングされ、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１を生成し、Ｈ３は新しいｐ４５５プロモーター、および新しい７１ｐＡポリアデニル化シグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ７０への挿入のための組換え領域によってカセットがフレームに合わされた（図１Ｂ）。
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１がｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ７０に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３が生成された。
ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された（図７）。
発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、図８）および市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図９）によって分析された。
ＥＨＶ−１ ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡ（データは示さない）およびウェスタンブロット（図９）によって確認された。感染細胞の細胞膜上のＨ３の三量体の出現は、トリの赤血球を使用する赤血球吸着試験によって評価された（データは示さない）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞においてＴＣＩＤ50／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たなかったことを示している（データは示さない）。これは、ＰＫ／ＷＲＬ細胞でのｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３のレスキュー後２０回までの継代（Ｐ２０）によって確認された。Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１５、およびＰ２０で、ウイルスは、力価測定、シーケンシング、およびウェスタンブロット（図９）によって、Ｐ１０およびＰ２０で、さらにＩＦＡによって特徴づけられ、ＨＡ発現、ならびにＨＡをコードするインサート、およびプロモーターおよびポリＡ配列の遺伝的安定性が確認された。
図９に示した２つのブロットは、ＥＨＶ−１糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）を特異的に検出するモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（左）またはインフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型に対するウサギ由来の市販のポリクローナル抗体（ＰＡ５−３４９３０）（右）のいずれかとインキュベートされたレプリカである。ｇｐＩＩは、予測されたように、組換えＥＨＶ−１を感染させた全ての細胞培養において検出された。全長Ｈ３は、予測されたように、異なる継代のｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を感染させた全ての細胞で検出された。Ｈ３−抗血清の特異性は、以下に示す、Ｈ１亜型ウイルス由来のインフルエンザヘマグルチニンを発現する他の組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞のウェスタンブロットによっても示された、図１６。
モノクローナル抗Ｈ３抗体およびウマ抗ＥＨＶ抗血清を使用するＰ２０を感染させた細胞におけるウイルスプラークの二重免疫蛍光法（ｄＩＦＡ）によって、事実上全てのＥＨＶ−１誘導プラークがＨ３も発現することが確認された（データは示さない）。全ての試験により、組換えＥＨＶ−１ Ｒａｃ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３の安定性を確認した。
若い子ブタにおいてベクターワクチンとしてのその特性を調べるため、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３は、ワクチン接種−チャレンジ試験で試験された。詳細には、ブタＩＡＶに対する母系由来免疫を有さない（母系抗体のない）子ブタは、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を含有する細胞培養上清を１×１０＾７ ＴＣＩＤ５０の用量で筋肉内に、２週齢および５週齢に２回（２回ワクチン接種、２×ＥＨＶ−１）、または５週齢のみ（１回ワクチン接種、１×ＥＨＶ−１）にワクチン接種した。非ワクチン接種群は陰性対照となり、製造業者の指示（ワクチン接種の時点以外）に従って市販の不活性化ブタＩＡＶワクチンによって２および５週齢でワクチン接種された動物の群は陽性対照となる（殺された）。８週齢では、陰性対照以外の全ての動物が、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（Ｈ３がＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で使用されるＨ３ワクチン抗原とは異種性である、ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４）の１×１０7 ＴＣＩＤ５０の投与量の気管内適用によってチャレンジされた。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照となったが、非ワクチン接種だがチャレンジされた動物はチャレンジ対照となった。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前およびチャレンジ後、体温が測定され、血液試料は異なる時点で採取された。チャレンジ１日後、群当たり半分の動物が殺され、肺のブタＩＡＶ感染に典型的な病変がスコア化され、それぞれ動物当たり左および右肺につき３つの肺試料が採取され、肺ホモジネートの感染性ブタＩＡＶ力価が決定され、気管支肺胞上皮の洗浄液（ＢＡＬＦ）が採取された。チャレンジ３日後の群当たり、動物の残り半分で同じ手順が実施された。
ブタＩＡＶチャレンジウイルス適用後の体温上昇を調べる場合、非ワクチン接種動物はチャレンジ１日後に約１℃の体温上昇を示した。ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンにより２回ワクチン接種した群では、チャレンジ１日後のこの体温上昇は防がれた（図１７）。
ブタＩＡＶチャレンジウイルス適用後１または３日で殺された動物からの肺スコアの評価により、陰性対照はブタＩＡＶ感染に典型的な肺の病変を示さず、チャレンジ対照は平均範囲６〜７％の肺の病変を示し、群平均値に関しては、肺病変スコアはＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンによって２回ワクチン接種された群では１〜４％より少なくなるまで強く減少した（図１８）。
ブタＩＡＶチャレンジウイルス適用後１または３日で殺された動物からの平均ブタＩＡＶ肺力価は、陰性対照は肺試料においてブタＩＡＶを示さないが、チャレンジ対照は５より多い（３日目）から７ｌｏｇより多い（１日目）範囲の肺組織１ｇ当たりのウイルス力価を示すことを示した。全く対照的に、群平均値は、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した群では、約２ｌｏｇまたはそれより少なくなるまで強く減少し、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した群では、検出できないレベルまで減少した（図１０）。
ワクチン接種後、ブタＩＡＶ中和抗体の誘導を試験する場合、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した動物からの血清は、最初のワクチン接種後３週間で約１６０の範囲の中和価の逆数を示し、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した動物からの血清は、２回目のワクチン接種後３週間で約２５６０の範囲の中和価を示したが、非ワクチン接種群からの血清は検出可能なブタＩＡＶ中和抗体レベルを有さなかった（図１９）。
ブタＩＡＶチャレンジ後１または３日の動物からのＢＡＬＦにおける炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの量を決定する場合、最大９００ｐｇ／ｍｌの１００ｐｇ／ｍｌより多くのＩＬ−１βレベルが、１日目に試験された４頭の動物のうち３頭で検出可能であったが、これらのレベルは、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回ワクチン接種した動物からのＢＡＬＦにおいて１００〜３００ｐｇ／ｍｌ ＩＬ−１βに減少し、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで２回ワクチン接種した全ての動物において、０〜１００ｐｇ／ｍｌ ＩＬ−１βより少ないレベルまでさらに減少した（図２０）。これは、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンによるワクチン接種が、ブタＩＡＶ感染後に炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの誘導を効果的に防いだことを示す。
試験２８日目に採取された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および異なる刺激を使用する再刺激を試験する場合、非ワクチン接種動物からのＰＢＭＣの刺激は、使用した刺激に関係なく、７５／１×１０6個より少ないＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示した（図２１Ａ）。不活性化ワクチン（死菌）を２回受けた動物のＰＢＭＣは、組換えブタＩＡＶ核タンパク質ＮＰによって再刺激された場合、約１５０／１×１０6個を示し、ブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４によって再刺激された場合には、約３０００／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示したが、組換えブタＩＡＶ ＨＡまたはＥＨＶ−１ウイルスが使用された場合にはＰＢＭＣの再刺激は示されなかった（７５／１×１０6個のレベルまたはそれ以下）（図２１Ｂ）。対照的に、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回または２回ワクチン接種した動物も、それらがブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２チャレンジ株Ｒ４５２−１４で再刺激された場合、約２００（１×ＥＨＶ−１）〜３００（２×ＥＨＶ−１）／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示したが、組換えブタＩＡＶ ＮＰが使用された場合、ＰＢＭＣの再刺激はない（７５／１×１０6個のレベルまたはそれ以下）（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）。ＥＨＶ−１ウイルスが再刺激に使用された場合、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回または２回ワクチン接種された動物は、それぞれ、空のＥＨＶ−１ワクチンＲａｃＨ−ＳＥで再刺激された場合、約３００／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示し、この値はブタＩＡＶ Ｈ３を発現するＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンが使用された場合、４００／１×１０6個より多くまでさらに増加した（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）。したがって、組換えブタＩＡＶ ＨＡが再刺激に使用された場合、ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３ワクチンで１回または２回ワクチン接種された動物のみが約１００〜１５０（１×ＥＨＶ−１）から１５０〜２００（２×ＥＨＶ−１）／１×１０6個のＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを示した（図２１Ｃおよび図２１Ｄ）。
（例８）
ブタのための四価のＥＨＶ−１ベクターＡ型インフルエンザウイルスワクチンの生成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性決定、およびｉｎ ｖｉｖｏ試験
以下に記載するように、記載した本発明では、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１トリ型から得られた前述の４つのブタＩＡＶヘマグルチニン（ＨＡ）抗原およびＨ１Ｎ１流行型ブタＩＡＶサブ／血清型は、２つの組換えＥＨＶ−１ベクターウイルスによって発現される。ブタＩＡＶに対するこの新しい四価のワクチンは、ブタＩＡＶ ＨＡタンパク質のみを発現するため、例えば、ブタＩＡＶ野外株に感染した動物ではブタＩＡＶタンパク質ＮＰまたはＮＡに対する抗体が検出されるが、本明細書に記載のワクチンによってのみワクチン接種された動物では検出されないことによってＤＩＶＡ特性を提供する。
新しい四価のブタＩＡＶワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特性決定され、ブタＩＡＶに対するその効果をｉｎ ｖｉｖｏで試験される。
新しく同定されたｐ４３０プロモーターは、ブタＩＡＶ Ｈ１Ｎ１（（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦＲ７６６２３．１）の発現を駆動するために使用された。このウイルス単離株のヘマグルチニン遺伝子はトリＩＡＶに由来するため、Ｈ１ａｖと呼ばれる。Ｈ１ａｖは合成され、トランスファーベクターのｏｒｆ１／３挿入領域にサブクローニングされ、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨを生成した。Ｈ１ａｖの発現は、ｐ４３０プロモーターおよびウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ１／３への挿入のための組換え領域によってフレームに合わされた（図１２）。
ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨがｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ１／３に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖが生成された。ＰＫ／ＷＲＬ細胞は、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖをトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ（図１３）がレスキューされ、２回プラーク精製された。発現カセットの正確な挿入は、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。感染細胞での導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）および市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロットによって分析された（図１４）。ＥＨＶ−１ ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復は、モノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するＩＦＡおよびウェスタンブロットによって確認された（データは示さない）。Ｈ１ａｖの正確なプロセシングおよび輸送、ならびに感染細胞の細胞膜上の局在は、トリの赤血球を使用する赤血球吸着試験によって評価された（データは示さない）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞においてＴＣＩＤ５０／ｍｌとして決定されたピーク力価は、親ウイルスＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たなかったことを示している（データは示さない）。
抗体ＰＡ−３４９２９によって７５ｋＤａの広帯域の移動の特異的検出は、その配列から予測されるように、組換えＨＡ糖タンパク質の予測される出現と一致する。モノクローナル抗体Ｃ１０２による細胞膜の明らかな染色は、予測される細胞内局在に則している。
発現された組換えヘマグルチニンが予測されるようにプロセシングおよび輸送されたかどうか試験するため、ＶＥＲＯ細胞は０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ（親）を感染させ、または非感染のままおいた。感染の２４時間後、生きた感染細胞および非感染細胞は、ＰＢＳ中のトリの赤血球の懸濁液とインキュベートされ、ＰＢＳで洗浄され、蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色によって染色された。トリの赤血球は細胞核を含有するため、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって染色することができ、蛍光顕微鏡によって小さな青いスペックとして現れ、ヘマグルチニンを発現しないｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞と比較して、トリの赤血球の吸着は、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖまたはｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のいずれかを感染させた細胞上で著しく増加した（データは示さない）。このことから、真正のインフルエンザウイルス複製によって産生されたかのような様式で、ヘマグルチニンが翻訳され、プロセシングされ、ベクターウイルス感染細胞の細胞膜に輸送されたと結論づけることができる。感染細胞の赤血球吸着の表現型は、導入遺伝子タンパク質の効果的な発現を示し、ＥＨＶ−１ベクター感染細胞の細胞表面上の機能的ＨＡ三量体の形成を示唆するウェスタンブロットおよび免疫蛍光法による知見を支持する（Ｈ１ａｖ、図１４）。
Ｈ３（ＰＡ５−３４９３０）およびＨ１（ＰＡ５−３４９２９）に対する市販のポリクローナル抗体の交差反応性の特異性および欠如は、単一インサートウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３およびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを感染させた感染細胞のウェスタンブロットによって確かめられた（データは示さない）。
次に、２つの異なるＡ型インフルエンザウイルスの亜型／血清型の２つの異なるヘマグルチニンを発現する組換えＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥが生成された。
組換えＢＡＣ ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で開始して、トランスファーベクターｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨ（図１２）にアセンブルされた発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨは、２ステップＲＥＤ組換えによってｏｒｆ１／３挿入部位に挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を生成した。ＰＫ／ＷＲＬ細胞はｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトされ、組換えウイルスｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３がレスキューされ、２回プラーク精製された。この組換えウイルスの略称はｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂである（図１５）。発現カセットの正しい挿入は、隣接する配列とともに挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングによって確かめられた。
感染細胞における導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、データは示さない）ならびに市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図１６）によって分析された。ＥＨＶ−ＩＩ ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復はＩＦＡ（データは示さない）およびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するウェスタンブロットによって確かめられた（図１６）。
導入遺伝子Ｈ３とＨ１ａｖの両方は、二重インサート組換えｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂを感染させた細胞培養中で並行して発現された。導入遺伝子発現は安定であり、ＰＫ／ＷＲＬ細胞の継代１１回まで試験されたウイルス力価を損なわなかった。
２つの挿入部位および２つの新しいプロモーターを有する増強されたＥＨＶ−１ベクターは、２つのインフルエンザウイルスヘマグルチニンを並行して発現することが示された。ＩＦＡによって決定された細胞内局在およびウェスタンブロットによって決定されたＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度は、文献から公知のＡ型インフルエンザウイルス感染細胞において発現された真正のヘマグルチニンに相当した。
次に、ヘマグルチニンＨ１ｈｕ、配列番号２９（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＤＫ９８４７６．１）およびＨ１ｐｄｍ、配列番号２６（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＤＲ０１７４６．１）を発現する、第２の二重インサートｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨが生成された。
Ｈ１ｈｕのコード配列は合成、およびトランスファーベクターのｏｒｆ１／３挿入領域にサブクローニングされ、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨを生成した。Ｈ１ｈｕの発現は、ｐ４３０プロモーターおよびウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ１／３への挿入のための組換え領域によってフレームに合わされた（図２２）。
Ｈ１ｐｄｍのコード配列は合成およびサブクローニングされ、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１を生成し、Ｈ１ｐｄｍを新しいｐ４５５プロモーターおよび新しい７１ｐＡポリアデニル化シグナルの調節下に置かれ、ｏｒｆ７０への挿入のための組換え領域によってカセットがフレームに合わされた（図２３）。
続いて、ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨおよびｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１がｐＲａｃＨ−ＳＥに挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕがまず生成された。標的としてこの改変ＢＡＣを使用して、ＲＥＤ組換えシステムを使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異導入によって、ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１が挿入され、ｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍが生成された。ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍはＰＫ／ＷＲＬ細胞にトランスフェクトされ、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍがレスキューされ、３回プラーク精製された。新しい組換えベクターウイルスの略称はｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ（図２４）。
感染細胞における導入遺伝子の発現は、間接免疫蛍光法（ＩＦＡ、データは示さない）ならびに市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図２５）によって分析された。ＥＨＶ−１ ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復はＩＦＡ（データは示さない）およびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ所有）を使用するウェスタンブロットによって確かめられた（図２５）。
組換えｒＥＨＶ−１の遺伝的および表現型安定性は、細胞培養の継代によって示され、５回の継代ごとにウイルス力価を決定した。挿入領域の配列は１０回の継代ごとに、ならびに導入遺伝子の発現はウェスタンブロットによって確認された（データは示さない）。発現忠実度は、メトセル−オーバーレイ下のプラークの二重ＩＦＡによって評価され、抗ＥＨＶ抗体および導入遺伝子特異的抗体によって染色されたプラークがカウントされた（データは示さない）。
若い子ブタにおいてベクターワクチンとしてのその特性を調べるため、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンは、ワクチン接種−チャレンジ試験で試験される。詳細には、ブタＩＡＶに対する母系由来免疫がある（移行抗体が陽性）子ブタは、１および４週齢（２回ワクチン接種、２×ＥＨＶ−１）で、筋肉内に、ワクチン株当たり１×１０7 ＴＣＩＤ５０の用量でｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄによって２回ワクチン接種され、または４週齢のみ（１回ワクチン接種、１×ＥＨＶ−１）で接種される。非ワクチン接種群は陰性対照となる。１１週齢では、陰性対照以外の全ての動物が、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（Ｈ３がｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂで使用されるＨ３ワクチン抗原とは異種性である、ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４）の１×１０6 ＴＣＩＤ５０の投与量の気管内適用によってチャレンジされる。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照となるが、非ワクチン接種だがチャレンジされた動物はチャレンジ対照となる。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前およびチャレンジ後に、体温が測定され、血液試料は異なる時点で採取される。チャレンジの１日後、群当たり半分の動物が殺され、肺のブタＩＡＶ感染に典型的な病変がスコア化され、それぞれ動物当たり左および右肺につき３つの肺試料が採取され、肺ホモジネートの感染性ブタＩＡＶ力価が決定され、気管支肺胞上皮の洗浄液（ＢＡＬＦ）が採取される。チャレンジ３日後の群当たり、動物の残り半分で同じ手順が実施される。試料材料および回収されたデータは、中でも特に、チャレンジ後の体温変化、ブタＩＡＶ感染後の臨床徴候、肺スコア、ブタＩＡＶ肺力価、肺組織の組織学的変化、ブタＩＡＶ血清中和力価、ＢＡＬＦのサイトカインレベル、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔによって測定されるようにＰＢＭＣの再刺激、およびＢ細胞活性化を決定するために分析される。
（例９）
二価のｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨベクターワクチンによってワクチン接種されたマウスにおける２つの抗原に対する中和抗体応答の誘導
発現された導入遺伝子がブタ以外の別の種で免疫原性で有り、抗体の中和が鼻腔内適用による２つの抗原のうちのいずれか１つに対して誘導されることを実証するため、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ ＳＥ Ｂ（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７−ｐ４５５−Ｈ３、図１５参照）がＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化に使用された。
詳細には、３〜５週齢の、群当たり５匹のＢａｌｂ／ｃマウスの３つの群は、それぞれ、４０μｌのｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ ＳＥ Ｂ（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−４３０−Ｈ１ａｖ−７−４５５−Ｈ３、群１）、または４０μｌの空ベクター（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ、群２、ベクター対照）、または４０μｌの組織培養培地（群３、陰性対照）のいずれかを試験０日および２１日目に鼻腔内接種された。群１および２では、感染性組換えＥＨＶ−１投与量は、それぞれ１×１０5 ＴＣＩＤ５０／４０μｌであった。マウスは、試験０日（最初の接種前）、７日、１４日、２１日（２回目の接種前）、２８日、および３５日に出血された。血清は、血液試料から調製され、−８０℃で凍結保存された。
ベクターウイルスに対する抗体の検出のための免疫蛍光法
ＡＩ−ＳＴ細胞には、感染の２４時間後に空ベクターＢＡＣ ｐＲａｃＨ−ＳＥ１．２．からレスキューされたウイルスであるｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ１２１２を、０．００１の多重感染度（ＭＯＩ）で感染させ、特有のプラークが観察され、細胞は間接免疫蛍光法（ＩＦＡ）のために処理された。ＰＢＳ中で１：５０に希釈された最終的な血液の３つの群全ての血清（２回目のワクチン接種後１４日で得た）が試験された。陽性対照として、ＥＨＶ−１ワクチン接種したウマの血清が、１：５００希釈で使用された。二次抗体は、マウス血清には、市販のＦＩＴＣコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ、ウマ血清にはＣｙ５コンジュゲートヤギ抗ウマＩｇＧであり、１：２００希釈で使用された。抗体結合は蛍光顕微鏡によって評価された。全てのワクチン接種マウスは、ＩＦＡにおいて、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−感染細胞に反応性の抗体を発生した。非感染細胞には、試験した血清のいずれも結合しなかった。マウスの陰性対照群からの血清は、感染細胞にも非感染細胞にも、特異的な結合を示さなかった。データは以下の表に要約する。
表3.抗EHV-1抗体のIFAの蛍光顕微鏡結果

これから、マウスの鼻孔へのｒＥＨＶ−１の接種は感染およびウルス複製をもたらし、そのためマウス免疫系が刺激され抗ＥＨＶ−１抗体を産生したと結論づけることができる。
ウイルス中和試験
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））または（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））のいずれかに由来する発現された導入遺伝子に対する保護免疫の誘導を示すため、マウス血清は、それぞれのウイルスに対する中和活性について試験された（Allwinn et al. 2010; Trombetta et al. 2014）。中和試験に使用されるＩＡＶは、２０１４年からドイツでのブタからの単離株、特に、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＡＲ４５２／２０１４（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＡＲ１１８１／２０１４（Ｈ１Ｎ１）であった。これらは、ワクチン標的が由来する株とは異種であるため、マウス血清によるこれらのウイルスの任意の中和は、ｒＥＨＶ−１ワクチン接種による保護免疫の広く効果的な誘導を示す。陰性対照血清として、インフルエンザウイルス抗体に陰性であることが示されたブタ由来の血清が使用された。
Ａ型インフルエンザウイルス中和試験（ＶＮＴ）：
９６ウェルプレートでのウイルス中和ならびに逆滴定のためのＭＤＣＫ細胞は、使用前に、３７℃／５％ＣＯ2で２日間インキュベートされた。それぞれのＩＡＶストックＨ３Ｎ２およびＨ１ａｖＮ１は氷上で解凍され、ゲンタマイシンおよび２倍の濃度のトリプシンを含有するＭＥＭ（ＭＥＭ／Ｇｅｎｔａ／２×トリプシン）で希釈された。
試験した血清は、群１（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ ＳＥ Ｂ）、群２（空ベクター）、陽性対照（不活性化多価ＩＡＶワクチンによってワクチン接種されたブタ由来の血清および陰性対照の最終血液に由来した。
血清は熱失活され、それぞれ２回または３回の独立した試験で、１：１６で開始して１：４０９６まで１：２段階希釈された。ＩＡＶは、およそ１００ ＴＣＩＤ５０／中和反応に希釈された。中和反応は３７℃、５％ＣＯ2で２時間インキュベートされた。使用したウイルスの逆滴定は４つ組で行われた。増殖培地は除去され、中和反応または逆滴定のウイルス希釈を添加する前に、ＭＤＣＫ−細胞はゲンタマイシンおよびトリプシンを含有する培地で洗浄された。ＶＮＴおよび滴定プレートは、それぞれ中和反応またはウイルス希釈のＭＤＣＫ細胞への添加後、３７℃／５％ ＣＯ２で１時間インキュベートされた。その後、接種源が除去され、細胞は、ゲンタマイシンおよびトリプシンを含有する新鮮な培地で覆われた。感染５日後に、ＣＰＥはモニターされ、実証された。試験で実際に使用されたウイルス力価はＲｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｎｃｈに従ってＴＣＩＤ５０／ｍｌとして算出され、試験した血清がインフルエンザウイルスに典型的なＣＰＥの誘導を防ぐ希釈率が報告された、以下の表を参照。
表4:インフルエンザH1avN1 VNTの結果
表5:インフルエンザH3N2 VNTの結果
独立した試験の結果を比較するため、中和能力は血清希釈率の逆数とそれによって中和されるそれぞれの力価の掛け算によって算出された。３回の試験の平均は、次いで、１００で割られ、１００ ＴＣＩＤ５０の中和を反映した（表３、表４および表５）。データは要約し、図２６にグラフによって示す。
ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ ＳＥ Ｂによってワクチン接種された全てのマウスは、それぞれのＩＡＶ、亜型Ｈ３Ｎ２およびＨ１ａｖＮ１の異種株に対する中和抗体を発生した。したがって、ｐ４５５プロモーター（Ｈ３）の調節下のｏｒｆ７０挿入部位から、および並行してｐ４３０プロモーター（Ｈ１ａｖ）の調節下のｏｒｆ１／３挿入部位から、ＩＡＶのヘマグルチニンを発現するｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥの２倍の鼻孔内適用は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの保護免疫応答を成功裏に刺激した。
ベクターｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥは、２つの異なる導入遺伝子の並行発現のために使用され、鼻孔内ワクチン接種後に免疫応答を刺激することができると結論づけることができる。
（例１０）
子ブタでのブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２チャレンジに対するｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンの効果
若い子ブタでのベクターワクチンとしてのその特性を調べるため、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂ（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、図１５参照）およびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄ（ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ、図２４参照）からなる四価のブタＩＡＶワクチンが２回目のワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
この第２の試験では、非ワクチン接種の雌ブタ由来の、ならびにＨ３特異的ＥＬＩＳＡ（図３０）の使用によって、および最初のワクチン接種時にウイルス中和試験（データは示さない）によって、ブタＩＡＶ特異的抗体に血清学的に陰性の試験された子ブタは、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のワクチンによって２回ワクチン接種された。動物は、それぞれ生後１週間（試験日０、ＳＤ０）で初めて、生後４週間（試験日２１、ＳＤ２１）で２回目に、筋肉内、次いで筋肉内（２×ＩＭ）、または最初は鼻腔内、次いで筋肉内（ＩＮ＋ＩＭ）、または２回鼻腔内（２×ＩＮ）のいずれかで、それぞれワクチン株、動物、およびワクチン接種当たり２ｍｌの用量中１×１０7 ＴＣＩＤ５０の用量でワクチン接種された。非ワクチン接種群は陰性対照として寄与し、別の非ワクチン接種群はチャレンジ対照として寄与した。生後７週間（試験６９日目または７０日目、ＳＤ４２／４３）で、陰性対照以外の全動物はＨ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（Ｈ３がｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂで使用したＨ３ワクチン抗原に対して異種である、欧州野外ウイルス単離物Ｒ４５２−１４）の２×１０＾７ ＴＣＩＤ５０の投薬量を気管内適用することによってチャレンジされた。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）となるが、非ワクチン接種であるがチャレンジされた動物はチャレンジ対照（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）となった。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前に、血液試料は異なる時点で採取された。
チャレンジの１日後、群当たり半分の動物が殺され、動物当たり左および右肺につき３つの肺試料がそれぞれ採取された。次いで、肺ホモジネート１グラム当たりの感染性ブタＩＡＶ力価は、それぞれが、左または右肺につきプールされた３つの試料のホモジネートから得られ、それぞれ左または右肺の３つの試料の総質量にノーマライズされた、動物当たりの左および右肺の平均として各動物について決定された。同じ手順が、チャレンジの３日後に、群当たりの動物の残りの半分で実施された。全てのワクチン接種群に関して、群において個々の動物から得られた感染性ブタＩＡＶの力価の中央値は、チャレンジ対照群と比較した場合、チャレンジ後１日目（ＣＨ＋１）に採取された試料では統計的に著しく減少したが、陰性対照群からの全ての動物は、それらの肺ホモジネートにおいて感染性ブタＩＡＶウイルス力価を示さなかった（図２７）。さらに、全てのワクチン接種群に関して、群の個々の動物から得られた感染性ブタＩＡＶの力価の中央値は、チャレンジ対照群と比較した場合、チャレンジ後３日目（ＣＨ＋３）に採取された試料では統計的に著しく減少したが、陰性対照群からの全ての動物は、それらの肺ホモジネートにおいて感染性ブタＩＡＶウイルス力価を示さなかった（図２８）。したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれ子ブタにおける異種ブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２株によるチャレンジ後１日および３日でブタＩＡＶ肺負荷を統計的に著しく減少させた。結果として、本明細書に記載のワクチンは、ブタにおけるブタＩＡＶに対して有効である。
さらに、試験日０（ＳＤ０、最初のワクチン接種前）、試験日２１（ＳＤ２１、２回目のワクチン接種前）、および試験日４２または４３（ＳＤ４２／４３、チャレンジ材料の適用前）に試験動物から採取した血清は、ワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶＨ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析された。陰性対照群からの血清の平均ＯＤ値は、測定された全ての時点で非常に低い値のみを与えたが、ワクチン接種群からの血清は、２回の筋肉内適用後（２×ＩＭ；ＳＤ２１およびＳＤ４２／４３）、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用後（ＩＮ＋ＩＭ；ＳＤ４２／４３）、および２回の鼻腔内適用後（２×ＩＮ；ＳＤ４２／４３）に、ＯＤ値の強力な増加を実証した；図３０。したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する子ブタの血清学的な免疫応答を引き出した。
さらに、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、試験日２８（ＳＤ２８）に試験動物から採取された血液から精製された。次いで、ＰＢＭＣは、多重感染度１（Ｈ３Ｎ２ ＭＯＩ １）でＨ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４、または１μｇ／ｍｌの濃度のワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な、組換え発現されたブタＩＡＶ Ｈ３抗原（ｒＨ３ １μｇ／ｍｌ）のいずれかによって再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ、得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された（図３２）。チャレンジ対照群（本試験では陰性対照となり、動物はワクチン接種されなかった）からの再刺激されたＰＢＭＣは、いずれかの再刺激後４５より少ない群当たりの平均スポットを示し、ワクチン接種動物からの再刺激されたＰＢＭＣは、それぞれ、いずれかの再刺激後、２回の筋肉内適用後８５より多い、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用（ＩＮ＋ＩＭ）後に１００より多いスポット、および２回の鼻腔内適用（２×ＩＮ）後に１５０より多いスポットの、群当たりの平均スポットを示した（図３２）。したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する、および異種チャレンジウイルス感染に使用されるブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２ Ｒ４５２−１４に対する子ブタの細胞性免疫応答を引き出した。
したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによる子ブタのワクチン接種は、子ブタにおいて検出可能な血清学的および細胞性免疫応答を誘導し、異種ブタＩＡＶチャレンジ後１および３日で、肺ホモジネート中のブタＩＡＶ負荷を統計的に著しく減少させることによってワクチン効率を実証した。
（例１１）
母系由来抗体を有する子ブタにおけるブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２チャレンジに対するｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンの効果
若い子ブタにおけるベクターワクチンとしてのその特性を調べるために、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンは、第３のワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
この第３の試験では、ブタＩＡＶに対する市販の不活性化ワクチンによって妊娠中に２回ワクチン接種された雌ブタから生まれ、初乳および母乳を与えられた子ブタが使用された。子ブタは、最初のワクチン接種時にＨ３特異的ＥＬＩＳＡの使用によって（図３１）および製造業者の試験勧告に従って市販のブタＩＡＶ特異的抗体ＥＬＩＳＡの使用によって（ＩＤＥＸＸ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（ウイルス抗体試験）（登録商標）；ＩＤＥＸＸ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｍａｉｎｅ ０４０９２、ＵＳＡ）（データは示さない）、ブタＩＡＶ特異的抗体に血清学的に陽性であると試験され、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のワクチンによって２回ワクチン接種された。動物は、それぞれ生後１週間（試験日０、ＳＤ０）で最初に、生後４週間（試験日２１、ＳＤ２１）で２回目に、筋肉内、次いで筋肉内（２×ＩＭ）、または最初は鼻腔内、次いで筋肉内（ＩＮ＋ＩＭ）、または２回鼻腔内（２×ＩＮ）のいずれかで、それぞれワクチン株、動物、およびワクチン接種当たり２ｍｌ用量中１×１０7 ＴＣＩＤ５０の用量でワクチン接種された。１つの非ワクチン接種群は陰性対照となり、別の非ワクチン接種群はチャレンジ対照となった。生後１１週間（試験日６９または７０、ＳＤ６９／７０）で、陰性対照以外の全ての動物は、Ｈ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株（ヨーロッパ野外ウイルス単離株Ｒ４５２−１４のＨ３は、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂで使用されるＨ３ワクチン抗原と異種性である）の２×１０7 ＴＣＩＤ５０の気管内適用用量によってチャレンジされた。非ワクチン接種および非チャレンジ動物は陰性対照（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）となったが、非ワクチン接種であるがチャレンジされた動物はチャレンジ対照（ｃｈａｌｌ．ｃｔｒｌ．）となった。ワクチン接種時およびワクチン接種後、ならびにチャレンジ前に、血液試料は異なる時点で採取された。
チャレンジの５日後、動物は殺され、動物当たり左および右肺につき３つの肺試料がそれぞれ採取された。次いで、肺ホモジネート１グラム当たりの感染性ブタＩＡＶ力価は、それぞれが、左または右肺につきプールされた３つの試料のホモジネートから得られ、それぞれ左または右肺の３つの試料の総質量にノーマライズされた、動物当たりの左および右肺の平均として各動物について決定された。全てのワクチン接種群に関して、群において個々の動物から得られた感染性ブタＩＡＶの力価の中央値は、チャレンジ対照群と比較した場合、チャレンジ後５日目（ＣＨ＋５）に採取された試料では統計的に著しく減少したが、陰性対照群からの全ての動物は、それらの肺ホモジネートにおいて感染性ブタＩＡＶウイルス力価を示さなかった（図２９）。したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれ子ブタにおける異種ブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２株によるチャレンジ後５日でブタＩＡＶ肺負荷を統計的に著しく減少させた。結果として、本明細書に記載のワクチンは、ブタにおけるブタＩＡＶに対して有効である。
さらに、試験日０（ＳＤ０、最初のワクチン接種前）、試験日２１（ＳＤ２１、２回目のワクチン接種前）、および試験日３５（ＳＤ３５、２回目のワクチン接種後２週間）に試験動物から採取した血清は、ワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されるＨ３と相同である組換え発現されたブタＩＡＶ Ｈ３抗原に対するブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析された。陰性対照群からの血清の平均ＯＤ値は、ＳＤ２１およびＳＤ３５で非常に低い値のみを与えたが、ワクチン接種群からの血清は、２回の筋肉内適用後（２×ＩＭ；ＳＤ３５）、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用後（ＩＮ＋ＩＭ；ＳＤ３５）、および２回の鼻腔内適用後（２×ＩＮ；ＳＤ３５）に、ＯＤ値の強力な増加を実証した；図３１。したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する子ブタの血清学的な免疫応答を引き出した。
さらに、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、試験日２８（ＳＤ２８）に試験動物から採取された血液から精製された。次いで、ＰＢＭＣは、多重感染度１（Ｈ３Ｎ２ ＭＯＩ １）でＨ３Ｎ２ブタＩＡＶチャレンジ株Ｒ４５２−１４、または１μｇ／ｍｌの濃度のワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたＨ３に相同な、組換え発現されたブタＩＡＶ Ｈ３抗原（ｒＨ３ １μｇ／ｍｌ）のいずれかによって再刺激された。再刺激されたＰＢＭＣを使用して、インターフェロンガンマ特異的酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ）が実施され、それぞれ、得られた値は１０6個の細胞にノーマライズされ、群当たりの平均として算出された（図３３）。チャレンジ対照群（本試験では陰性対照となり、動物はワクチン接種されなかった）からの再刺激されたＰＢＭＣは、いずれかの再刺激後１５より少ない群当たりの平均スポットを示し、ワクチン接種動物からの再刺激されたＰＢＭＣは、それぞれ、いずれかの再刺激後、２回の筋肉内適用後３０より多い、最初は鼻腔内、次いで筋肉内適用（ＩＮ＋ＩＭ）後に５５より多いスポット、および２回の鼻腔内適用（２×ＩＮ）後に６５より多いスポットの群当たりの平均スポットを示した（図３３）。したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、それぞれワクチン株ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂによって発現されたブタＩＡＶヘマグルチニンＨ３に対する、および異種チャレンジウイルス感染に使用されるブタＩＡＶ Ｈ３Ｎ２ Ｒ４５２−１４に対する子ブタの細胞性免疫応答を引き出した。
したがって、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによる子ブタのワクチン接種は、子ブタにおいて検出可能な血清学的および細胞性免疫応答を誘導し、異種ブタＩＡＶチャレンジ後５日で、肺ホモジネート中のブタＩＡＶ負荷を統計的に著しく減少させることによってワクチン効率を実証した。
（例１２）
ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンは、ＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）特異的抗体をベースにして、ワクチン接種した動物から感染した動物を診断的に区別する（ＤＩＶＡ）特性を提供する。ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンの血清学的ＤＩＶＡ特性を評価するために、ブタＩＡＶに対する市販の不活性化ワクチンで妊娠中に２回ワクチン接種された雌ブタから生まれ、初乳および母乳を与えられた子ブタは、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のワクチンで２回ワクチン接種された。動物は、それぞれ生後１週間で最初に、生後４週間で２回目に、それぞれ筋肉内、次いで筋肉内（２×ＩＭ）、または最初に鼻腔内、次いで筋肉内（ＩＮ＋ＩＭ）、または鼻腔内に２回（２×ＩＮ）のいずれかで、ワクチン株、動物およびワクチン接種当たり２ｍｌ用量中１×１０＾７ ＴＣＩＤ５０の用量でワクチン接種された。非ワクチン接種群は陰性対照（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．）として寄与した。２×ＩＭ、ＩＮ＋ＩＭ、２×ＩＮおよびｎｅｇ．ｃｔｒｌ．群のために、群当たり５匹の動物を使用し、血清試料は最初のワクチン接種の前（図３４、ワクチン接種前）および２回目のワクチン接種後１４日（図３４、ワクチン接種後）にそれぞれに採血した。陽性対照として、最初のワクチン接種の時点の前にＩＡＶ特異的抗体で試験して陰性であった非ワクチン接種雌ブタの子ブタ２匹（データは示さず、図３４、ワクチン接種前）をブタＩＡＶに対する市販の不活性化ＩＡＶ含有ワクチンで２回ワクチン接種した（ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．）。ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．子ブタは、それぞれ生後２週間で最初に、生後５週間で２回目にワクチン接種され、血清試料はそれぞれ最初のワクチン接種の前（図３４、ワクチン接種前）および２回目のワクチン接種後２２日（図３４、ワクチン接種後）に採血した。
前述の血清は、ブタＩＡＶ核タンパク質（ＮＰ）特異的ＩｇＧを検出するＥＬＩＳＡで試験した（図３４）。ワクチン接種した雌ブタの子ブタ（ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．、２×ＩＭ、ＩＮ＋ＩＭ、２×ＩＮ群）の血清試料は全て、ワクチン接種前に群当たりの平均ＯＤ値が０．７またはそれ以上を示したので、これらの非ワクチン接種動物における母系由来のＩＡＶ ＮＰ特異的抗体の存在が示された（図３４）。対照的に、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．群の子ブタ血清の群平均値は、ワクチン接種前に０．１５未満であったので、ＩＡＶ ＮＰ特異的抗体は存在しないか、非常に低いレベルであることが示された。市販の不活性化ＮＰ含有ブタＩＡＶワクチンで２回目のワクチン接種後２２日（図３４、ワクチン接種後）に、ｐｏｓ．ｃｔｒｌ．群の血清の群平均値は１．９より多く増加したので、子ブタにおける検出可能なブタＩＡＶ ＮＰ特異的ＩｇＧの強い誘導が示された。対照的に、ブタＩＡＶ ＮＰを含有せず、発現もしない、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンでワクチン接種後１４日に、２×ＩＭ、ＩＮ＋ＩＭ、２×ＩＮ群の子ブタの血清試料および非ワクチン接種ｎｅｇ．ｃｔｒｌ．群の血清試料もそれぞれ、群当たりの平均ＯＤ値が０．１５未満を示したので、ワクチン接種前に存在するＩＡＶ ＮＰ特異的抗体レベルが非常に低いレベルまで低下し、ワクチン接種が子ブタにおいて検出可能なブタＩＡＶ ＮＰ特異的ＩｇＧの強い誘導を引き起こさなかったことを示した。考え合わせると、従来のＮＰ含有不活性化ブタＩＡＶワクチンはワクチン接種した子ブタにおいて検出可能なＮＰ特異的抗体の強い誘導を引き起こしたが、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンによるワクチン接種は、ワクチン接種した子ブタにおいて検出可能なＮＰ特異的抗体の強い誘導を誘導しなかった。
ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンは、ワクチン接種した子ブタにおいて検出可能なＮＰ特異的抗体の強い誘導を誘導しなかったという事実は、血清学的診断マーカーは感染した動物のワクチン接種した動物からの区別（ＤＩＶＡ）およびワクチン接種した動物の従来のＮＰ含有不活性化ブタＩＡＶワクチンでワクチン接種した動物からの区別を可能にすることを示した。
このＤＩＶＡ特性は、ｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿ＢおよびｒＥＨＶ−１ ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｄからなる四価のブタＩＡＶワクチンの使用を伴う市販試験の開発のため、およびブタＩＡＶに対する根絶対策を支持するために活用される。
本明細書において開示され、特許請求されている組成物および方法は全て、本開示に照らして、過度な実験を伴わずに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載の組成物および方法ならびに方法のステップまたは一連のステップに、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく変形を適用することができることが当業者には明らかになろう。より詳細には、化学的にかつ生理的に関連する特定の薬剤で本明細書に記載の薬剤を置換することができるが、同じまたは同様の結果が実現されることが明らかになろう。当業者に明らかであるそのような同様の置換および修飾は全て、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の中にあるとみなされる。
（参考文献）
以下の参考文献は、それにより本明細書に記載のものを補足する例示的な処置上のまたは他の詳細が提供される限りでは、明確に参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (24)

  1. （ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
    （ｉｉ）前記外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されており、
    （ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクター。
  2. （ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも１つの外来性抗原コード配列を含み、
    （ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
    （ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列が、４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその相補的ヌクレオチド配列を含むプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクター。
  3. （ｉ）食物生産動物に感染する病原体に関連する少なくとも２つの外来性抗原コード配列を含み、
    （ｉｉ）前記外来性抗原コード配列が挿入部位に挿入されており、
    （ｉｉｉ）前記外来性抗原コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結しているＥＨＶベクター。
  4. 請求項１から３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターを含み、医薬担体を含んでいてもよい免疫原性組成物。
  5. 請求項１から４のいずれか１項に記載の２つまたはそれ以上のＥＨＶベクターを含む免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  6. ＥＨＶベクターが組換え体である、請求項１から５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  7. ＥＨＶベクターがＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  8. 外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列である請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  9. 外来性抗原コード配列がヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で記載したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  10. 前記挿入部位がＯＲＦ１／３および／またはＯＲＦ７０である、請求項２から９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  11. 食物生産動物に感染する病原体に関連する第１の外来性抗原コード配列がＯＲＦ７０に挿入されており、および／または食物生産動物に感染する病原体に関連する第２の外来性抗原コード配列がＯＲＦ１／３に挿入されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  12. ＯＲＦ７０への挿入がＯＲＦ７０における部分的欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられ、それによってＯＲＦ７１の機能が残存している、請求項１から１１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  13. ＯＲＦ７０への挿入がＲａｃＨのＯＲＦ７０内での約８０１ｂｐ部分（配列番号２０）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列の欠損を特徴とする、請求項１から１２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  14. ＥＨＶ−１ベクターが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８ならびにこれらの配列のいずれか１つと７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一な配列からなる群から選択される少なくとも１つの隣接領域を含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  15. プロモーター配列がＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片からなる群から選択され、好ましくは前記機能的断片がｐ４３０（配列番号３）、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片であり、好ましくは前記機能的断片がｐ４５５（配列番号４）、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片である、請求項１および３から１４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  16. プロモーター配列が４ｐｇＧ６００（配列番号１）もしくは４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその相補的ヌクレオチド配列を含む、請求項１および３から１５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  17. プロモーター配列の機能的断片または誘導体が８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の相同性を有し、および／またはプロモーター配列の機能的断片が５５０ヌクレオチド、好ましくは５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５５、４５０、４４５、４４０、４３５、４３４、４３３、４３２、４３１、４３０ヌクレオチド、最も好ましくは４５５または４３０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１６に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  18. プロモーター配列の機能的断片が４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列のトランケーションであり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７２％であり（またはより高い）、および／または４ｐｇＧ６００（配列番号１）のプロモーター配列の機能的断片が４３０ｐ４３０（配列番号３）と名付けられた断片、または配列番号３と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の同一性を有する配列である、請求項１６または１７に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  19. プロモーター配列の機能的断片が４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列のトランケーションであり、好ましくは配列同一性が全長にわたって（少なくとも）７８％であり（またはより高い）、および／または４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）のプロモーター配列の機能的断片がｐ４５５（配列番号４）と名付けられた断片、または配列番号４と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の同一性を有する配列である、請求項１６または１７に記載のＥＨＶベクター、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチン。
  20. 食物生産動物に請求項４から１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む、食物生産動物の免疫方法。
  21. それを必要とする食物生産動物におけるブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候の治療または予防のための方法であって、食物生産動物に治療有効量の請求項４から１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法。
  22. 同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、それを必要とする食物生産動物の肺におけるウイルス力価を減少させる方法であって、食物生産動物に治療有効量の請求項４から１９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを投与することを含む方法。
  23. 食物生産動物がブタである、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 同種の非免疫対照群の食物生産動物と比較して、体重減少の低下、肺におけるウイルス負荷の減少、肺病変の減少、ウイルス排出の減少および／または短縮、直腸温度の低下、臨床症状（特に呼吸器症状）の減少、（中和）抗ブタＡ型インフルエンザウイルス抗体の誘導増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＴ細胞刺激の増加、ブタＡ型インフルエンザウイルスに対するＢ細胞刺激の増加および肺における炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ１βの減少またはそれらの組み合わせからなる群から選択される有効性パラメータの改善を引き起こす、請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法。
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