TWI780070B - 新穎之啟動子 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於(載體)疫苗領域，且尤其關於新穎之啟動子序列、表現卡匣及載體，其等適於表現所關注之基因，尤其抗原編碼序列。本發明之病毒載體可用於生產免疫原性組合物或疫苗。
Description
本發明係關於(載體)疫苗領域，且尤其關於新穎之啟動子序列、表現卡匣及載體，其等適於表現所關注之基因，尤其抗原編碼序列。本發明之病毒載體可用於生產免疫原性組合物或疫苗。
馬病原體馬α疱疹病毒1 (馬流產病毒，EHV-1)屬於疱疹病毒目(Herpesvirales
)疱疹病毒科(Herpesviridae
)中α疱疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae
)的水痘病毒屬(Varicellovirus
)。其為具有約150,000個鹼基對之雙股DNA基因組的大包膜病毒。水痘病毒亞屬的其他重要成員為人類α疱疹病毒3 (水痘帶狀疱疹病毒)、豬α疱疹病毒1 (偽狂犬病病毒)、牛α疱疹病毒1 (感染性支氣管炎病毒)及馬α疱疹病毒4 (馬鼻肺炎病毒，EHV-4) (http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, 2015年7月; Email ratification 2016 (MSL #30) EHV-1及EHV-4為地方病且侵襲全世界的馬。雖然EHV-4引起大多輕度的上呼吸道感染，但EHV-1可引起伴有自呼吸系統症狀至流產及致死性腦脊髓病之一系列疾病的全身性感染，視病毒株及宿主之免疫狀態而定。目前，在美國及歐洲分別可使用兩種經許可的針對EHV-1的改良式活毒疫苗(MLV) RhinomuneTM (Boehringer Ingelheim)及PrevaccinolTM (MSD)。兩者均含有傳統減毒的EHV-1 RacH病毒株，其在豬上皮細胞中繼代256次以便減毒(Ma等人 2013)。減毒機制已在分子水準上加以研究。Osterrieder等人(1996)展示RacH不具有orf67之兩個基因組複本且一個複本之恢復足以恢復毒性。另外，RacH攜帶1283 bp缺失，移除大於90%的編碼免疫抑制性病毒蛋白之orf1編碼序列。其他突變亦可影響減毒，但迄今為止尚未詳細研究。所有這一切使得RacH成為非常安全的疫苗株，因為(若可能)藉由在經疫苗接種之動物體內繼代回復毒性幾乎不可能。 含有馬α疱疹病毒1 (EHV-1)疫苗株RacH (pRacH-SE)之整個基因組的大腸桿菌細菌人工染色體(BAC)稱為用於載體疫苗開發之平台。已展示基於EHV-1 RacH之載體疫苗能夠在包括豬、牛及犬之數個哺乳動物物種中引發免疫(Rosas等人 2007，Rosas等人 2008，Trapp等人 2005，Said等人 2013)。編碼病原體之抗原蛋白的基因可由重組EHV-1 RacH表現。EHV-1-RacH基因組係以其BAC形式在大腸桿菌中進行操縱且經調整以通常藉由插入轉殖基因表現卡匣表現額外蛋白質(Tischer等人, 2010)。在pRacH-SE DNA轉染於培養的容許細胞後，藉由細胞轉錄因子開始EHV-1複製。病毒DNA聚合酶之活性使得所有BAC載體相關序列缺失及EHV-1 RacH基因組恢復至其原始狀態。生成無法與RacH區分之感染性病毒。 當在大腸桿菌中例如藉由插入轉殖基因表現卡匣操縱pRacH-SE時，在容許細胞中轉染後重建的病毒將攜帶修飾且將表現額外基因。重組EHV-1 RacH可用作載體疫苗。 然而，在無額外的外源啟動子之情況下表現的轉殖基因蛋白質之量通常相對較低。因此，對可用於自此類載體、尤其重組EHV-1 RacH表現轉殖基因蛋白質的額外啟動子的需要尚未滿足。 野生型EHV-1病毒株在其基因組之特有長區段(序列座標1298-3614；圖2)的一端具有稱為orf1、orf2及orf3的三個開放閱讀框架(orf)。Orf1及orf3串聯排列於DNA之一股上，而orf2由互補股編碼。疫苗株RacH在影響orf1及orf2之區域具有1283 bp缺失，表明此等基因對於病毒複製而言為非必需的。因此，該位點充當轉殖基因插入位點。已報導，使用人類細胞巨大病毒立即早期基因1啟動子-強化子(Boshart等人 1985)自orf1/3插入位點有效表現轉殖基因。在此類研究中，牛生長激素聚腺苷酸化信號(BGH)用於穩定轉錄物以便較佳表現(Ma等人 2012；Said等人 2013)。雖然不存在HCMV可誘發人類腫瘤的跡象，但無法排除理論風險。在描述HCMV-IE強化子(Boshart等人 1985)之前，在如猿猴病毒40、多瘤病毒或莫洛尼鼠肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus)的已知致癌病毒的基因組中發現大部分強勁的強化子。雖然極其強勁的非組織特異性HCMV及MCMV (小鼠細胞巨大病毒) IE啟動子-強化子非常適於多種研究活動，但其一般可能不代表轉殖基因載體疫苗之啟動子的第一選擇。具體而言，給動物接種疫苗之人員意外暴露的風險可被監管當局視為授予疫苗許可證的障礙。
為了避免任何此類障礙，本發明提供新穎之用於轉殖基因表現之調控核酸序列/啟動子序列，尤其在載體疫苗之情形內及尤其在EHV-1載體之情形內。 因此，上述技術問題之解決方案係藉由本說明書及在申請專利範圍中表徵之實施例來達成，且本發明在其不同態樣中係根據申請專利範圍來實施。 本發明提供新穎之用於轉殖基因表現之調控核酸序列/啟動子序列、克服此項技術中之缺陷的免疫原性組合物、疫苗及相關方法。 確定的廣泛用於在包括疱疹病毒之不同載體系統中驅動高水準的轉殖基因表現的啟動子序列為HCMV (Boshart等人 1985；Foecking及Hofstetter 1986)或小鼠細胞巨大病毒(MCMV；Dorsch-Häsler等人 1985)之立即早期基因的啟動子序列或如猿猴病毒40 (SV40)之致癌病毒的強啟動子，例如SV40大T抗原啟動子及更多(例如Kim等人 1990)。此類強啟動子為細胞生物學家偏好的，因為其自主地在不同細胞培養系統中起作用。在病毒複製之情形下，經感染細胞藉由病毒功能轉化成病毒複製機器。疱疹病毒複製及形態發生之生物學被充分理解。在感染後，僅極少基因(α-基因)經轉錄且轉譯成立即早期蛋白質(IEp)。此等IEp為編碼病毒酶(如DNA聚合酶及許多其他酶)之β-基因的轉錄活化因子。病毒基因組複製之起始標誌著轉錄編碼病毒結構蛋白之β-及γ-基因的病毒複製後期的開始(Fields, 2013)。然而，對於改良式載體疫苗，上述自主性強啟動子中無一者被視為選項，特別是來源於致癌病毒之啟動子具有不利的安全概況。因此，需要提供在病毒複製之情形下具有高活性的啟動子，如EHV-1 β-及γ-基因之彼等啟動子。由於不可能在一個載體分子中使用一致的DNA序列兩次而無進行內部同源重組且因此基因不穩定之風險，故本發明提供新穎之來源於EHV-4之公開基因組序列(馬α疱疹病毒4病毒株NS80567，完整基因組，寄存編號AF030027，版本AF030027.1 GI:2605950，日期1998年5月21日)的替代性啟動子序列。該等基因與EHV-1基因之序列一致性在55至84%範圍內。 本發明提供兩種新穎之啟動子：p430及p455，其在細胞培養物中以及在動物(豬及小鼠)體內rEHV1-RacH複製的背景下展示具有功能性。兩種新穎之啟動子在病毒複製週期期間的活性水準似乎與自活體外啟動子動力學實驗所推斷的極其類似。 此等特性允許形成以類似效率並行表現兩種不同抗原之基於EHV-1 RacH的重組載體疫苗。若疫苗靶標由兩種不同病原體組成，則兩種新穎之啟動子與兩個聚腺苷酸化序列組合應用在兩個插入位點中可顯著降低貨品的成本且呈現優於僅表現一種抗原成分之載體的明顯優勢。 本發明提供兩種新穎之啟動子：4pgG600及4pMCP600及其較短長度之衍生物，其在細胞培養物中瞬時轉染之後或在細胞培養物中rEHV1-RacH複製的背景下展示具有功能性。 另外，由本發明提供之新穎之啟動子序列亦在如犬腺病毒(CAdV)之其他載體背景下展示為高效的。 重要的是，當CAG或CMV5啟動子序列存在於位於E3區中之表現卡匣中時，未實現重組CAdV之救援。其似乎具有序列特異性，因為表現卡匣之尺寸尚未超過所觀察到實驗基因組尺寸限制。因此，本發明之新穎之源於EHV-4之啟動子序列(諸如p430及p455)不僅有助於轉殖基因表現，且亦支持病毒救援之關鍵步驟，因此，鑒於先前技術啟動子序列為有利的。
序列表 本申請案根據37 C.F.R. 1.821 - 1.825含有序列表。本申請案隨附的序列表以全文引用的方式併入本文中。 本發明解決了先前技術中固有的問題且提供目前先進技術中之明顯進步。 一般而言，本發明提供包含4pgG600 (SEQ ID No. 1)或4pMCP600 (SEQ ID No. 2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之啟動子序列/調控核酸序列，其中該啟動子序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現。 在一特定態樣中，功能片段或衍生物之長度為550個核苷酸，較佳500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430個核苷酸，最佳455或430個核苷酸。在另一態樣中，功能片段或衍生物之長度在430至550個核苷酸、430至500個核苷酸或430至480個核苷酸之間。較佳地，功能片段具有70%、80%、85%，較佳90%、91%、92%、93%、94%，更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%之序列一致性及/或同源性或序列一致性。在一特定態樣中，表現為增加的。 在一特定態樣中，功能片段為截短之4pgG600 (SEQ ID No. 1)或其互補核苷酸序列，相對於整個長度之序列一致性較佳為(至少) 72% (或更高)。較佳地，4pgG600 (SEQ ID No. 1)之功能片段為命名為p430 (SEQ ID NO:3)之片段。在另一態樣中，序列一致性為(至少) 70%、80%、85%，較佳90%、91%、92%、93%、94%，更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%。 在另一特定態樣中，功能片段為截短之4pMCP600 (SEQ ID No. 2)或其互補核苷酸序列，相對於整個長度之序列一致性較佳為(至少) 78% (或更高)。較佳地，4pMCP600 (SEQ ID No. 2)之功能片段為命名為p455 (SEQ ID NO:4)之片段。在另一態樣中，序列一致性為(至少) 70%、80%、85%，較佳90%、91%、92%、93%、94%，更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%。 本發明另外提供包含p430 (SEQ ID No. 3)或p455 (SEQ ID No. 4)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之啟動子序列/調控核酸序列，其中該啟動子序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現。較佳地，功能片段具有70%、80%、85%，較佳90%、91%、92%、93%、94%，更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%之序列同源性或序列一致性。在一特定態樣中，表現為增加的。 本發明另外關於包含選自由以下組成之群之啟動子序列/調控核酸序列的表現卡匣：4pgG600 (SEQ ID No. 1)及4pMCP600 (SEQ ID No. 2)及其互補核苷酸序列及其功能片段及功能衍生物及其互補核苷酸序列，及p430 (SEQ ID No. 3)及p455 (SEQ ID No. 4)及其互補核苷酸序列及其功能片段及其功能衍生物及其互補核苷酸序列， 其中該啟動子序列可操作地連接於所關注序列、較佳所關注基因或抗原編碼序列、更佳異源及/或外源所關注序列、所關注基因或抗原編碼序列， 其中該啟動子序列/調控核酸序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現， 由此該啟動子序列較佳為異源啟動子序列/調控核酸序列、更佳外源啟動子序列/調控核酸序列。在一特定態樣中，表現為增加的。 在一特定態樣中，表現卡匣為重組、異源及/或外源表現卡匣。在另一特定態樣中，啟動子序列/調控核酸序列為重組、異源及/或外源啟動子序列/調控核酸序列。 本發明另外關於包含根據本發明之表現卡匣的載體，諸如病毒載體或病毒構築體。較佳地，該載體可用於生產免疫原性組合物或疫苗。 在另一態樣中，本發明係關於包含具有選自由以下組成之群之啟動子序列/調控核酸序列之表現卡匣的載體(諸如病毒載體或病毒構築體)：4pgG600 (SEQ ID No. 1)及4pMCP600 (SEQ ID No. 2)及其互補核苷酸序列及其功能片段及功能衍生物及其互補核苷酸序列，及p430 (SEQ ID No. 3)及p455 (SEQ ID No. 4)及其互補核苷酸序列及其功能片段及其功能衍生物及其互補核苷酸序列， 其中該啟動子序列可操作地連接於所關注序列、較佳所關注基因或抗原編碼序列、更佳異源及/或外源所關注序列、所關注基因或抗原編碼序列， 其中該啟動子序列/調控核酸序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現， 由此該啟動子序列較佳為異源啟動子序列/調控核酸序列、更佳外源啟動子序列/調控核酸序列。在一特定態樣中，表現為增加的。較佳地，該載體可用於生產免疫原性組合物或疫苗。 本發明另外關於包含具有4pgG600 (SEQ ID No. 1)及/或4pMCP600 (SEQ ID No. 2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列，或p430 (SEQ ID No. 3)及/或p455 (SEQ ID No. 4)或其互補核苷酸序列或其功能片段或其功能衍生物或其互補核苷酸序列之調控核酸/啟動子序列的異源(表現)載體，諸如病毒載體或用於DNA疫苗接種之質體，其中該調控核酸/啟動子序列引起所關注序列、所關注基因或抗原編碼序列之轉錄或表現。在一特定態樣中，該所關注序列、所關注基因或抗原編碼序列之轉錄或表現增加。較佳地，該載體可用於生產免疫原性組合物或疫苗。 在一特定態樣中，載體為重組、異源及/或外源載體。在另一特定態樣中，啟動子序列/調控核酸序列為重組、異源及/或外源啟動子序列/調控核酸序列。 在根據本發明之表現卡匣及/或根據本發明之載體的一特定態樣中，(啟動子序列/調控核酸序列之)功能片段或衍生物具有70%、80%、85%，較佳90%、91%、92%、93%、94%，更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%之序列同源性或序列一致性。 在根據本發明之表現卡匣及/或根據本發明之載體的另一特定態樣中，(啟動子序列/調控核酸序列之)功能片段或衍生物的長度為550個核苷酸，較佳500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430個核苷酸，最佳455或430個核苷酸。在根據本發明之表現卡匣及/或根據本發明之載體的另一特定態樣中，(啟動子序列/調控核酸序列之)功能片段或衍生物的長度在430至550個核苷酸、430至500個核苷酸或430至480個核苷酸之間。在根據本發明之表現卡匣及/或根據本發明之載體的另一特定態樣中，(啟動子序列/調控核酸序列之)功能片段或衍生物具有70%、80%、85%，較佳90%、91%、92%、93%、94%，更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%之序列同源性或序列一致性。 在根據本發明之表現卡匣及/或根據本發明之載體的另一特定態樣中，(啟動子序列/調控核酸序列之)功能片段或衍生物為截短之4pgG600 (SEQ ID No. 1)或其互補核苷酸序列，相對於整個長度之序列一致性較佳為(至少) 72% (或更高)。較佳地，4pgG600 (SEQ ID No. 1)之該功能片段為命名為p430 (SEQ ID NO:3)之片段。 在根據本發明之表現卡匣及/或根據本發明之載體的另一特定態樣中，(啟動子序列/調控核酸序列之)功能片段或衍生物為截短之4pMCP600 (SEQ ID No. 2)或其互補核苷酸序列，相對於整個長度之序列一致性較佳為(至少) 78% (或更高)。較佳地，4pMCP600 (SEQ ID No. 2)之該功能片段為命名為p455 (SEQ ID NO:4)之片段。 在根據本發明之表現卡匣及/或根據本發明之載體的另一特定態樣中，其中該表現卡匣及/或該載體包含一或多個其他調控序列，諸如終止信號、聚腺苷酸化信號或如IRES及/或2a肽之調控元件。 在一特定態樣中，根據本發明之載體為異源及/或外源載體。 在本發明之另一特定態樣中，根據本發明之載體為病毒載體，較佳選自由以下組成之群：疱疹病毒科，諸如馬α疱疹病毒1 (EHV-1)、馬α疱疹病毒4 (EHV-4)及其他水痘病毒屬，如豬α疱疹病毒1 (偽狂犬病病毒，PrV)及牛α疱疹病毒1 (牛疱疹病毒1，BHV-1)；腺病毒科(Adenoviridae，AdV)，諸如CAdV (犬腺病毒)；腺相關病毒科；桿狀病毒科(Baculoviridae)；慢病毒科(Lentiviridae)，諸如反轉錄病毒；及痘病毒科(Poxviridae)。在一更特定態樣中，該病毒載體為疱疹病毒科、較佳α疱疹病毒屬、更佳水痘病毒亞屬之成員，該載體最佳為馬α疱疹病毒1 (EHV-1)。 本發明另外關於一種產生載體、較佳病毒載體之方法，其包含： a. 提供根據本發明之啟動子序列及/或調控核酸序列， b. 將來自步驟a)之該啟動子序列整合至來源於病毒之載體主鏈中，該病毒選自由以下組成之群：疱疹病毒科，諸如EHV-1、EHV-4、水痘病毒屬，如豬α疱疹病毒1 (偽狂犬病病毒，PrV)及牛α疱疹病毒1 (牛疱疹病毒1，BHV-1)；腺病毒科(AdV)，諸如CAdV (犬腺病毒)；細小病毒科(Parvoviridae)，如腺相關病毒；桿狀病毒科；反轉錄病毒科(Retroviridae
)及痘病毒科，該載體主鏈較佳來源於疱疹病毒，該載體主鏈更佳為EHV-1或EHV-4。 本發明另外關於一種真核生物宿主細胞株，其特徵在於容許根據本發明之載體複製，該宿主細胞株較佳為哺乳動物細胞株或昆蟲細胞株，其最佳為PK/WRL細胞株、RK13細胞株、MDBK細胞株、ST細胞株、AI-ST細胞株、VERO細胞株、Sf9細胞株、Sf21、Sf+細胞株、MDCK細胞株及/或其衍生物。 本發明另外關於一種製備宿主細胞之方法，其藉由以下步驟表徵： a. 用根據技術方案9至19之載體感染根據技術方案21之真核生物宿主細胞株， b. 在適合之條件下培養經感染細胞， c. 視情況收集該宿主細胞。 如上文所列之哺乳動物宿主細胞株一般在浸沒於用於哺乳動物細胞培養之培養基，諸如補充有厄爾氏鹽(Earle's salt)及胎牛血清之最低必需培養基(MEM)中之塑膠組織培養器皿中培養。哺乳動物細胞株在培育箱中保持在37℃下補充有5% CO2及約80%濕度之常規氛圍中。昆蟲細胞株培養在浸沒於昆蟲細胞培養基之塑膠組織培養器皿中且在培育箱中保持在27℃下之常規氛圍中。 本發明另外關於包含4pgG600 (SEQ ID No. 1)或4pMCP600 (SEQ ID No. 2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之核酸序列作為啟動子序列的用途，其中該核酸序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現。在一特定態樣中，表現為增加的。 本發明另外關於包含4pgG600 (SEQ ID No. 1)或4pMCP600 (SEQ ID No. 2)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之核酸序列作為調控核酸序列的用途，其中該核酸序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現。在一特定態樣中，表現為增加的。 本發明另外關於包含p430 (SEQ ID No. 3)或p455 (SEQ ID No. 4)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之核酸序列作為啟動子序列的用途，其中該核酸序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現。在一特定態樣中，表現為增加的。 本發明另外關於包含p430 (SEQ ID No. 3)或p455 (SEQ ID No. 4)或其互補核苷酸序列或其功能片段或功能衍生物或其互補核苷酸序列之核酸序列作為調控核酸序列的用途，其中該核酸序列引起所關注核苷酸序列、較佳所關注基因、更佳抗原編碼序列之表現。在一特定態樣中，表現為增加的。 本發明另外關於一種套組，其由根據本發明之載體、宿主細胞、視情況選用之轉染劑及說明書印刷品組成。 本發明另外關於根據本發明之載體或根據本發明之真核生物宿主細胞株或根據本發明之真核生物宿主細胞的用途，其用於製造視情況使用M.O.I.為0.01至0.001之免疫原性組合物或疫苗。 尤其對於病毒載體之用途，哺乳動物宿主細胞株一般培養及生長至匯合或亞匯合，視細胞株而定。病毒載體與適量的新鮮培養基混合且稀釋以產生0.001至0.01之感染倍率(m.o.i.)。自宿主細胞移除細胞培養基且用含有經稀釋之病毒載體的培養基更換。如此接種的細胞培養物在37℃/5% CO2
下培育約2至4天，視細胞株而定。病毒載體在細胞中複製引起細胞病變效應(CPE)且最終細胞破壞及死亡。採集物質且儲存在-80℃下。測定病毒效價。 本發明另外關於一種免疫原性組合物，其包含 a. 根據本發明之表現卡匣及/或 b. 根據本發明之載體，及/或 c. 由根據本發明之表現卡匣表現之多肽及/或由根據本發明之載體表現之多肽，諸如病毒、經修飾之活病毒、病毒樣顆粒(VLP)或其類似物，及 d. 視情況選用之醫藥學或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，該載劑較佳適於經口、皮內、肌肉內或鼻內施用。 在一特定態樣中，該免疫原性組合物包含病毒。在另一特定態樣中，該免疫原性組合物包含感染性病毒。 本發明另外關於一種疫苗或醫藥組合物，其包含 a. 根據本發明之表現卡匣及/或 b. 根據本發明之載體，及/或 c. 由根據本發明之表現卡匣表現之多肽及/或由根據本發明之載體表現之多肽，諸如經修飾之活病毒、病毒樣顆粒(VLP)或其類似物，及 d. 醫藥學或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，該載劑較佳適於經口、皮內、肌肉內或鼻內施用， e. 該疫苗視情況另外包含佐劑。 本發明此外關於一種製備用以降低與感染相關或由感染引起之一或多種臨床徵象之發生率或嚴重程度之免疫原性組合物或疫苗的方法，其包含以下步驟： a. 用根據本發明之載體感染根據本發明之真核生物宿主細胞株， b. 在適合之條件下培養經感染細胞， c. 收集經感染細胞及/或載體及/或病毒成分， d. 視情況純化步驟c)之收集物 e. 使該收集物與醫藥學上可接受之載劑混合。 治療方法 本發明另外關於根據本發明之免疫原性組合物或根據本發明之疫苗，其用於減少或預防由動物感染病原體引起之臨床徵象或疾病的方法或用於治療或預防動物感染病原體之方法中，該動物較佳為產食性動物，諸如豬或牛。 本發明另外提供一種用於使動物、諸如產食性動物免疫之方法，其包含向此類動物投與如本文所述之免疫原性組合物或疫苗。 本發明另外關於一種使動物、諸如包括豬之產食性動物免疫以對抗由該動物體內之病原體引起之臨床疾病的方法，該方法包含向該動物投與根據本發明之免疫原性組合物或根據本發明之疫苗的步驟，其中該免疫原性組合物或疫苗不會引起感染之臨床徵象，但能夠誘發使該動物免疫以對抗該病原體之致病性形式的免疫反應。 在一特定態樣中，免疫使得畜群中特定病毒感染之發生率降低或使得由特定病毒感染引起或與特定病毒感染相關之臨床徵象的嚴重程度減輕。 另外，用在此提供之免疫原性組合物使有需要之產食性動物免疫，由此預防產食性動物受病毒感染。甚至更佳地，免疫產生對抗該病毒感染之持久有效的免疫反應。應瞭解，該時間段將持續大於2個月、較佳大於3個月、更佳大於4個月、更佳大於5個月、更佳大於6個月。應瞭解，免疫可不在所有經免疫動物/個體中有效。然而，術語需要畜群之相當大一部分的動物/個體經有效免疫。 本發明提供一種用於治療或預防有需要之動物、諸如產食性動物之由病毒引起之臨床徵象的方法，該方法包含向該動物投與治療有效量之如本文所述之免疫原性組合物或疫苗。 較佳地，與未經處理(未經免疫)但隨後感染特定豬A型流感病毒之動物相比，臨床徵象減少至少50%、甚至更佳至少60%、再更佳至少70%、甚至更佳至少80%、甚至更佳至少90%、再更佳至少95%、最佳100%。 本發明另外關於一種用於給動物、較佳產食性動物、諸如豬或牛接種疫苗以對抗與動物體內之病原體相關之疾病及/或降低與動物體內之病原體相關或由動物體內之病原體引起之一或多種臨床徵象的發生率或嚴重程度的套組，其包含： a) 能夠向該動物投與疫苗之分配器；及 b) 根據本發明之免疫原性組合物或根據本發明之疫苗，及 c) 視情況選用之說明書印刷品。定義
除非另外定義，否則在申請時本文所用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同的含義。術語之含義及範疇應為清楚的；然而，在任何潛在不明確性之情況下，本文所提供之定義優先於任何字典或外部定義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。除非另外說明，否則本文中使用「或」意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)之使用不具限制性。本文所提及之所有專利及公開案以引用的方式併入本文中。 除非另外指示，否則本發明之實施將採用在此項技術內之病毒學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習知技術。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如Sambrook, Fritsch及Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第I卷、第II卷及第III卷, 第二版 (1989)；DNA Cloning, 第I卷及第II卷 (D. N. Glover編 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney編 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris及S. Angal, 編, IRL Press at Oxford University Press)；及Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV卷 (D. M. Weir及C. C. Blackwell編, 1986, Blackwell Scientific Publications)。 在詳細描述本發明之前，應瞭解本發明不限於特定DNA，因此多肽序列或方法參數當然可變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述本發明之具體實施例之目的，且不意欲為限制性的。必須注意的是，除非內容明確另外指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「抗原」包括兩種或更多種抗原之混合物，提及「賦形劑」包括兩種或更多種賦形劑之混合物，及其類似物。分子生物學定義
如此項技術中已知，術語「載體」係指用於傳輸遺傳物質至宿主細胞之聚核苷酸構築體，通常為質體或細菌人工染色體。載體可為例如細菌、病毒、噬菌體、細菌人工染色體、黏質體或質體。如本文所用，載體可由DNA或RNA構成或含有DNA或RNA。在一些實施例中，載體由DNA構成。在一些實施例中，載體為感染性病毒。此類病毒載體含有經一定方式操縱以攜帶外源基因之病毒基因組，該外源基因在細胞培養物及宿主動物中均不在病毒載體複製方面起作用。根據本發明之特定態樣，載體可用於各個態樣，諸如僅僅傳輸遺傳物質、用於轉染宿主細胞或生物體、用作疫苗(例如DNA疫苗)或用於基因表現目的。基因表現為描述細胞中由稱為基因之特異性聚核苷酸序列引導之蛋白質生物合成的術語。在一特定態樣中，載體可為「表現載體」，其為當存在於適當環境中時能夠引導由載體攜帶之一或多個基因所編碼的蛋白質表現的載體。 載體及用於製造及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法可利用或類似於以下所揭示之方法：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」, PNAS USA 93: 11349-11353, 1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety」, PNAS USA 93: 11341-11348, 1996年10月；Smith等人, 美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人, 「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology, 1983年12月, 第3卷, 第12期, 第 2156-2165頁；Pennock等人, 「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology 1984年3月, 第4卷, 第3期, 第406頁；EPA0 370 573；美國申請案第920,197號, 1986年10月16日申請；EP專利公開案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors」, PNAS USA 93:11307-11312, 1996年10月；Andreansky等人, 「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors」, PNAS USA 93: 11313-11318, 1996年10月；Robertson等人, 「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340, 1996年10月；Frolov等人, 「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications」, PNAS USA 93: 11371-11377, 1996年10月；Kitson等人, J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；許可的美國申請案序列號08/675,556及08/675,566, 均在1996年7月3日申請(重組腺病毒)；Grunhaus等人, 1992, 「Adenovirus as cloning vectors」, Seminars in Virology (第3卷) 第237-52頁, 1993；Ballay等人 EMBO Journal, 第4卷, 第3861-65頁, Graham, Tibtech 8, 85-87, 1990年4月；Prevec等人, J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人 (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人, 「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420, 1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人, Nature及Furth等人, Analytical Biochemistry，尤其與DNA表現載體相關。亦參見WO 98/33510；Ju等人, Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人, 美國專利第4,945,050號；Fischbach等人 (Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人, Seminars in Immunology 第9卷, 第271-283頁 (1997), (DNA載體系統)；Szoka等人, 美國專利第4,394,448號(將DNA插入至活細胞中之方法)；McCormick等人, 美國專利第5,677,178號(使用細胞病變病毒)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文中列舉之其他文獻。 術語「病毒載體」描述一種經遺傳修飾之病毒，其藉由重組DNA技術以一定方式操縱以使其進入宿主細胞，產生特異性生物活性，例如表現由載體攜帶之轉殖基因。在一特定態樣中，轉殖基因為抗原。病毒載體在靶細胞、組織或生物體中可為或可不為複製勝任型。 病毒載體之產生可使用此項技術中所熟知的任何適合之基因工程技術來實現，包括(但不限於)限制性核酸內切酶消化、連接、轉型、質體純化、DNA定序、在細胞培養物中轉染之標準技術，如Sambrook等人 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))或K. Maramorosch及H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))中所述。 病毒載體可併入來自任何已知生物體之基因組的序列。序列可以其天然形式併入或可以任何方式修飾以獲得所需活性。舉例而言，序列可包含插入、缺失或取代。 病毒載體可包括兩種或更多種所關注蛋白質之編碼區。舉例而言，病毒載體可包括第一所關注蛋白質之編碼區及第二所關注蛋白質之編碼區。第一所關注蛋白質及第二所關注蛋白質可為相同或不同的。在一些實施例中，病毒載體可包括第三或第四所關注蛋白質之編碼區。第三及第四所關注蛋白質可為相同或不同的。由一個病毒載體編碼之兩種或更多種所關注蛋白質的總長度可變化。舉例而言，兩種或更多種蛋白質之總長度可為至少約200個胺基酸、至少約250個胺基酸、至少約300個胺基酸、至少約350個胺基酸、至少約400個胺基酸、至少約450個胺基酸、至少約500個胺基酸、至少約550個胺基酸、至少約600個胺基酸、至少約650個胺基酸、至少約700個胺基酸、至少約750個胺基酸、至少約800個胺基酸或更長。 較佳病毒載體包括疱疹病毒載體，諸如來源於EHV-1或EHV-4或其他水痘病毒屬，如PrV (偽狂犬病病毒)或BHV-1 (牛疱疹病毒1)。 根據本發明之特定態樣，術語「病毒載體」或「病毒構築體」係指來源於病毒之重組病毒構築體，該病毒係選自疱疹病毒科，諸如EHV-1、EHV-4或其他水痘病毒屬，如豬α疱疹病毒1 (偽狂犬病病毒，PrV)及牛α疱疹病毒1 (牛疱疹病毒1，BHV-1)；腺病毒科(AdV)，諸如CAdV (犬腺病毒，van Regenmortel等人)；細小病毒科，如腺相關病毒；桿狀病毒科；反轉錄病毒科或痘病毒科。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, 2015年7月; Email ratification 2016 (MSL #30)。較佳病毒載體包括疱疹病毒載體，諸如來源於EHV-1或EHV-4或其他水痘病毒屬，如PrV (偽狂犬病病毒)或BHV-1 (牛α疱疹病毒1)。 術語「病毒載體」及「病毒構築體」可互換使用。 如本文所用，術語「構築體」係指重組核酸，諸如質體、BAC或已人工產生之重組病毒。 術語「質體」係指獨立於細菌宿主細胞內之細菌染色體複製的細胞質DNA。在本發明之一特定態樣中，術語「質體」及/或「轉移質體」係指可用於構築例如插入至病毒載體中之表現卡匣的重組DNA技術元件。在另一特定態樣中，術語「質體」可用於限定可用於DNA疫苗接種目的之質體。 如本文所用，術語「核酸」及「聚核苷酸」可互換且係指任何核酸。 如本文所用，術語「核酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「聚核苷酸」、「聚核苷酸序列」、「RNA序列」或「DNA序列」係指寡核苷酸、核苷酸或聚核苷酸及其片段及部分且係指基因組或合成來源之DNA或RNA，其可為單股或雙股且代表有義股或反義股。序列可為非編碼序列、編碼序列或兩者之混合物。本發明之核酸序列可使用熟習此項技術者熟知的標準技術製備。 術語「核酸」及「聚核苷酸」亦特別包括由除五種生物學上存在之鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的鹼基構成之核酸。 術語「調控核酸」、「調控元件」及「表現控制元件」可互換使用且係指可影響可操作地連接之編碼序列在特定宿主生物體之表現的核酸分子。此等術語使用廣泛且涵蓋所有促進或調控轉錄之元件，包括啟動子、啟動子序列、RNA聚合酶及轉錄因子之鹼基相互作用所需的核心元件、上游元件、強化子及反應元件。原核生物中之例示性調控元件包括啟動子、操縱子序列及核糖體結合位點。用於真核細胞中之調控元件可包括(但不限於)轉錄及轉譯控制序列，諸如啟動子、強化子、剪接信號、聚腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號、內部核糖體進入位點(IRES)、小核糖核酸病毒科2A序列及其類似物，其提供及/或調控宿主細胞中編碼序列之表現及/或經編碼多肽之產生。 「內部核糖體進入位點」或「IRES」描述功能上促進獨立於IRES 5'之基因的轉譯開始且允許在動物細胞中由單個轉錄物轉譯兩個順反子(開放閱讀框架)的序列。IRES提供獨立的核糖體進入位點以轉譯緊接其下游的開放閱讀框架。與可為多順反子(亦即編碼由mRNA依序轉譯之數個不同多肽)的細菌mRNA不同，動物細胞之大多數mRNA為單順反子且編碼合成僅一個多肽。關於真核細胞中之多順反子轉錄物，轉譯將自最5'之轉譯起始位點開始，在第一終止密碼子處終止，且轉錄物將自核糖體釋放，使得mRNA僅轉譯第一經編碼多肽。在真核細胞中，具有可操作地連接於轉錄物中之第二或後續開放閱讀框架之IRES的多順反子轉錄物允許下游開放閱讀框架之依序轉譯，產生由同一轉錄物編碼之兩個或更多個多肽。IRES可具有不同長度且來自不同來源，例如腦心肌炎病毒(EMCV)、小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒、FMDV或脊髓灰質炎病毒(PV)或C型肝炎病毒(HCV)。此項技術中已描述且熟知各種IRES序列及其在載體構築中之用途。下游編碼序列在將不會負面影響下游基因表現之任何距離處可操作地連接於IRES之3'端。IRES與下游基因起點之間的最佳或可容許的距離可易於藉由改變距離且量測隨距離而變之表現來確定。 術語「2a」或「2a肽」意謂描述為2a及『2a樣』之短寡肽序列，其充當能夠藉由定義為核糖體跳躍之過程介導蛋白質間的共轉譯裂解的連接子。此類2a及『2a樣』序列(來自小核糖核酸病毒科及其他病毒或細胞序列)可用於將多個基因序列串接成單個基因，確保其在同一細胞內共表現(參見Luke及Ryan, 2013)。 如本文所用，術語「啟動子」或「啟動子序列」意謂允許RNA聚合酶結合且引導基因轉錄之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因之5'非編碼區，鄰近基因之轉錄起始位點。用於起始轉錄之啟動子內的序列元件常常藉由共同核苷酸序列表徵。啟動子之實例包括(但不限於)來自細菌、酵母、植物、病毒及動物，諸如哺乳動物(包括馬、豬、牛及人類)、鳥類或昆蟲之啟動子。啟動子可為誘導性、阻抑性及/或組成性。誘導性啟動子響應於培養條件之一些變化，諸如溫度變化，引發在其控制下的DNA的轉錄水準增加(Ptashne, 2014)。熟習此項技術者熟知的啟動子之實例為例如SV40大T、HCMV及MCMV立即早期基因1、人類延長因子α啟動子、桿狀病毒多角體蛋白啟動子。 如本文所用，在本發明之上下文中，術語啟動子尤其係指功能片段，例如截短之4pgG600 (SEQ ID No. 1)或其互補核苷酸序列，相對於整個長度之序列一致性較佳為(至少) 72% (或更高)。此外，如本文所用，在本發明之上下文中，術語啟動子尤其係指功能片段，例如截短之4pMCP600 (SEQ ID No. 2)或其互補核苷酸序列，相對於整個長度之序列一致性較佳為(至少) 78% (或更高)。最佳地，「啟動子」係指p430 (SEQ ID NO.:3)或p455 (SEQ ID NO.: 4)。如本文進一步所用，在本發明之上下文中，術語啟動子尤其係指p430 (SEQ ID NO.:3)或p455 (SEQ ID NO.: 4)或4pgG600 (SEQ ID No. 1)或4pMCP600 (SEQ ID No. 2)之功能衍生物，其具有例如少量取代、突變或反轉，以使得序列一致性為70%、80%、85%、90%、95%、99%一致或同源。 術語「p430」、「gG 430」及「430」貫穿本說明書、圖式、序列表等同義且可互換地使用。術語「p455」、「MCP 455」及「455」貫穿本說明書、圖式、序列表等同義且可互換地使用。 術語「強化子」表示在順式位置作用於啟動子之活性且因此刺激功能上連接至此啟動子之基因或編碼序列轉錄的聚核苷酸序列。與啟動子不同，強化子之作用與位置及取向無關，且其可因此位於轉錄單元前面或後面，位於內含子內或甚至位於編碼區內。強化子可緊鄰轉錄單元及在距啟動子相當大的距離處定位。亦可與啟動子具有實體及功能重疊。熟習此項技術者應瞭解來自各種來源之許多強化子(且寄存在諸如Genbank之資料庫中，例如SV40強化子、CMV強化子、多瘤病毒強化子、腺病毒強化子)，其以獨立元件或在聚核苷酸序列中選殖之元件形式得到(例如寄存在ATCC或來自商業及個體來源)。許多啟動子序列亦含有強化子序列，諸如經常使用的CMV啟動子。人類CMV強化子為迄今鑑別之最強的強化子之一。誘導性強化子之一個實例為金屬硫蛋白強化子，其可由糖皮質激素或重金屬刺激。 術語「互補核苷酸序列」描述諸如DNA或RNA之聚核苷酸之兩個成對股中之一股。互補股之核苷酸序列反映其成對股之核苷酸序列，使其含有相對於各腺嘌呤之胸腺嘧啶(或對於RNA而言，尿嘧啶)，相對於各鳥嘌呤之胞嘧啶，反之亦然。例如5'-GCATAC-3'之互補核苷酸序列為3'-CGTATG-5'或對於RNA而言，3'-CGUAUG-5'。 如本文所用，術語「基因」、「所關注基因」具有相同含義且係指編碼所關注產物之任何長度的聚核苷酸序列。基因可進一步包含在編碼序列之前(5'非編碼或非轉譯序列)及之後(3'非編碼或非轉譯序列)的調控序列。所選序列可為全長或截短的融合或加標籤基因，且可為cDNA、基因組DNA或DNA片段。大體上瞭解，編碼多肽或RNA之基因組DNA可包括自成熟信使RNA (mRNA)剪接之非編碼區(亦即內含子)且因此不存在於編碼相同多肽或RNA之cDNA中。其可為天然序列，亦即天然存在之形式，或可突變，或包含來源於不同來源之序列或視需要以其他方式修飾。此等修飾包括密碼子優化以使所選宿主細胞中之密碼子使用最佳化或加標籤。此外，其可包括移除或添加順式作用位點，諸如(隱蔽的)剪接供體、受體位點及分支點、聚腺苷酸化信號、TATA盒、chi位點、核糖體進入位點、重複序列、二級結構(例如莖環)、轉錄因子或其他調控因子之結合位點、限制酶位點等，僅給出若干但非限制性的實例。所選序列可編碼分泌性、細胞質、細胞核、膜結合或細胞表面多肽。 如本文所用，術語「所關注核苷酸序列」為比所關注基因更通用的術語，因為其未必包含基因，但可包含基因之元件或部分或其他基因資訊，例如ori
(複製起點)。所關注核苷酸序列可為任何DNA或RNA序列，與其是否包含編碼序列無關。 「開放閱讀框架」或「ORF」係指包含轉譯起始信號或起始密碼子(諸如ATG或AUG)及終止密碼子且可能轉譯成多肽序列之一段核酸序列(DNA或RNA)。 術語「轉錄」描述細胞中mRNA之生物合成。 如本文所用，術語「表現」係指宿主細胞內核酸序列之轉錄及/或轉譯。根據本發明之特定態樣，術語「表現」係指宿主細胞內異源及/或外源核酸序列之轉錄及/或轉譯。宿主細胞中所需產物之表現量可基於細胞中存在之對應RNA或mRNA之量或由所選序列編碼之所需多肽之量來確定。舉例而言，自所選序列轉錄之mRNA可藉由北方墨點雜交、核糖核酸酶RNA保護、與細胞RNA原位雜交或藉由RTqPCR (反轉錄後接定量PCR)來定量。自所選序列表現之蛋白質可藉由各種方法，例如藉由ELISA、藉由西方墨點法、藉由放射免疫分析、藉由免疫沈澱、藉由分析蛋白質之生物活性或藉由蛋白質免疫染色後接FACS分析來定量。 術語「表現卡匣」或「轉錄單元」或「表現單元」定義載體、構築體或聚核苷酸序列內含有一或多個有待轉錄之基因的區域，其中表現卡匣內所含之編碼經轉錄基因之核苷酸序列以及含有調控元件之聚核苷酸序列可操作地彼此連接。其自啟動子轉錄且藉由至少一個聚腺苷酸化信號終止轉錄。在一個特定態樣中，其自一個單一啟動子轉錄。因此，不同基因至少在轉錄上相連。可自各轉錄單元(多順反子轉錄單元)轉錄及表現大於一種蛋白質或產物。各轉錄單元將包含該單元內所含之任何所選序列之轉錄及轉譯必需的調控元件。且各轉錄單元可含有相同或不同的調控元件。舉例而言，各轉錄單元可含有同一終止子、IRES元件或可用於轉錄單元內基因之功能性連接的內含子。載體或聚核苷酸序列可含有大於一個轉錄單元。 術語「增加之表現」、「增加之效價或生產率」或「改良之表現或生產率」意謂引入至宿主細胞中之異源及/或外源序列、例如編碼治療性蛋白質之基因的表現、合成或分泌與適合之對照物相比(例如由cDNA編碼之蛋白質對比由含有內含子之基因編碼之蛋白質)增加。若根據本發明之細胞根據此處所描述之根據本發明之方法培養，及若此細胞之比生產率或效價具有至少1.2倍、1.5倍、兩倍、三倍、四倍或五倍增加，則存在增加之效價或生產率。若根據本發明之細胞根據此處所描述之根據本發明之方法培養，及若此細胞之比生產率或效價具有至少1.2倍或至少1.5倍或至少兩倍或至少三倍增加，則亦存在增加之效價或生產率。若根據本發明之細胞根據此處所描述之根據本發明之方法培養，及若此細胞之比生產率或效價具有至少1.2倍至五倍、較佳1.5倍至五倍、更佳兩倍至五倍、尤其較佳三倍至五倍增加，則亦尤其存在增加之效價或生產率。「增加之表現」亦可意謂更多細胞實際上表現所關注基因/序列。舉例而言，增加之表現可意味著本發明之新穎之啟動子在病毒複製週期期間的活性相對於其他啟動子持續較長時間段。 增加之表現、效價或生產率可藉由使用根據本發明之異源載體來獲得。此可與其他方法組合，諸如FACS輔助選擇含有一或多個螢光蛋白(例如GFP)或細胞表面標記作為額外可選標記之重組宿主細胞。亦可使用之其他獲得增加之表現的方法及不同方法之組合係基於例如使用順式作用元件操控染色質結構(例如LCR、UCOE、EASE、隔離子、S/MAR、STAR元件)、使用(人工)轉錄因子、用天然或合成試劑處理細胞以上調內源或異源及/或外源基因表現、改良mRNA或蛋白質之穩定性(半衰期)、改良mRNA轉譯之起始、藉由使用游離型質體增加基因劑量(基於使用病毒序列作為複製起點，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV)、使用擴增促進序列或基於DNA串聯體之活體外擴增系統。 量測「增加之表現」的分析為基於LC-MS/MS之蛋白質量測，諸如多反應監測(MRM)；基於抗體之偵測方法，諸如西方墨點法、點漬墨法或免疫擴散及流式細胞測量術；及藉由血球凝集分析量測生物活性。 「啟動子活性」係藉由定量在相應啟動子控制下轉錄之mRNA來間接量測。mRNA係藉由RTqPCR相對於內源性標準來定量。 術語「病毒效價」為每一體積病毒製劑之感染單位的量度。病毒效價為生物程序之端點且定義為並行進行之特定比例的測試顯示效應的稀釋度(Reed及Muench, 1938)。特定言之，每毫升組織培養物感染劑量五十(TCID50/ml)給出用稀釋液並行接種之多個細胞培養物的50%經感染的病毒製劑的稀釋度。 「轉錄調控元件」通常包含有待表現之基因序列上游的啟動子、轉錄起始及終止位點以及聚腺苷酸化信號。 術語「轉錄起始位點」係指構築體中對應於併入至初級轉錄物(亦即mRNA前驅體)中之第一核酸的核酸。轉錄起始位點可與啟動子序列重疊。 「終止信號」或「終止子」或「聚腺苷酸化信號」或「聚腺苷酸」或「轉錄終止位點」或「轉錄終止元件」為在真核mRNA之3'端的特定位點引起裂解及在裂解的3'端轉錄後併入約100-200個腺嘌呤核苷酸序列(聚腺苷酸尾部)且因此致使RNA聚合酶終止轉錄的信號序列。聚腺苷酸化信號包含在裂解位點上游約10-30個核苷酸處之序列AATAAA及位於下游之序列。已知多種聚腺苷酸化元件，諸如tk聚腺苷酸、SV40後期及早期聚腺苷酸、BGH聚腺苷酸(描述於例如美國專利第5,122,458號中)或倉鼠生長激素聚腺苷酸(WO2010010107)。 對於各有待表現之單個多肽，「轉譯調控元件」包含轉譯起始位點(AUG)、終止密碼子及聚腺苷酸信號。內部核糖體進入位點(IRES)可包括於一些構築體中。為了使表現最佳化，移除、添加或改變有待表現之核酸序列的5'-及/或3'-非轉譯區以消除任何可能附加的不當替代性轉譯起始密碼子或可能在轉錄或轉譯水準上干擾或減少表現之其他序列可為可取的。共同核糖體結合位點(Kozak序列)可緊接著插入起始密碼子上游以增強轉譯且因此增強表現。此核糖體結合位點周圍增加之A/U含量促進更高效的核糖體結合。 按照定義，插入於宿主細胞中之每一聚核苷酸序列或每一基因及由其編碼之相應蛋白質或RNA當來自不同(病毒)物種時，相對於宿主細胞稱為「外源」、「外源序列」、「外源基因」、「外源編碼序列」。因此，本發明之基於EHV-4之啟動子鑒於EHV-1病毒載體或CAdV病毒載體為外源的。如本文所用，相對於所關注序列或基因，諸如抗原，術語「外源」意謂該所關注序列或基因、特定言之該抗原係在其天然物種情形以外表現。因此，來自豬IAV之H3抗原為相對於EHV-1載體之外源抗原的一個實例(參見實例3)。所關注之任何非馬序列或基因、諸如非馬抗原因此為根據本發明之一特定態樣之所關注之外源序列或基因或抗原。 按照定義，插入於宿主細胞中之每一聚核苷酸序列或每一基因及由其編碼之相應蛋白質或RNA相對於宿主細胞稱為「異源」、「異源序列」、「異源基因」、「異源編碼序列」、「轉殖基因」或「異源蛋白質」。即使有待引入之序列或有待引入之基因與宿主細胞之內源序列或內源基因一致，其仍適用。舉例而言，與EHV-4野生型病毒相比在不同位點或以修飾形式引入至EHV-4病毒載體中之EHV-4啟動子序列按照定義為異源序列。如本文所用，相對於所關注序列或基因，諸如抗原，術語「異源」意謂該所關注序列或基因、特定言之該抗原係在其天然亞種情形以外表現。因此，所關注之任何非EHV-1特異性序列或基因，諸如抗原，例如來自除EHV-1之外的任何馬α疱疹病毒(例如EHV-3、EHV-8)之抗原因此為根據本發明之一特定態樣之所關注之異源序列或基因或抗原。 術語「非天然存在」意謂在此上下文中並非天然存在之任何所關注序列或基因(諸如抗原)，諸如雜交序列或來自不同物種之所關注序列或基因(諸如抗原)，或由於人工突變、插入、缺失或其類似物而並非天然產物之所關注序列或基因(諸如抗原)。 術語「重組」在本發明之說明書通篇與術語「非天然存在」、「異源」及「外源」可互換使用。因此，「重組」蛋白質為自異源或外源聚核苷酸序列表現之蛋白質。如關於病毒所用，術語重組意謂藉由人工操縱病毒基因組產生之病毒。包含異源或外源序列、諸如外源抗原編碼序列之病毒為重組病毒。術語重組病毒及術語非天然存在之病毒可互換使用。 因此，術語「異源載體」意謂包含異源或外源聚核苷酸序列之載體。術語「重組載體」意謂包含異源或重組聚核苷酸序列之載體。 如本文所用，術語「可操作地連接」用於描述調控元件與基因或其編碼區之間的連接。通常，基因表現在一或多個調控元件控制下，例如(但不限於)組成性或誘導性啟動子、組織特異性調控元件及強化子。基因或編碼區稱為「可操作地連接於」調控元件或與調控元件「可操作地相關」，意味著該基因或編碼區受調控元件控制或影響。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接於編碼序列。 此外，在本說明書之範疇內，術語「功能性連接」、「功能性地連接」或「可操作地連接」意謂兩個或更多個核酸序列或序列元件以允許其按預期方式起作用之方式定位。舉例而言，啟動子/強化子或終止子若能夠在順式位置控制或調節所連接之基因序列的轉錄，則功能性地連接於編碼基因序列。一般但非必須地，功能性地連接之DNA序列為連續的且必要時接合兩個多肽編碼區，或在分泌信號肽之情況下，為連續的且在閱讀框架中。然而，雖然可操作地連接之啟動子一般位於編碼序列上游或可操作地連接之終止子一般位於編碼序列下游，但不必與其鄰接。強化子無須鄰接，只要其增加編碼序列之轉錄即可。為此，其可位於編碼序列上游或下游且甚至在一定距離處。聚腺苷酸化位點若以轉錄前進經過編碼序列至聚腺苷酸化信號之方式位於編碼序列之3'端，則可操作地連接於編碼序列。連接係藉由此項技術中已知之重組方法實現，例如藉由在適合之限制性位點或鈍端處連接或藉由使用融合PCR方法。若不存在適合之限制性位點，則可根據習知實踐使用合成寡核苷酸連接子或接頭。 因此，啟動子序列之術語「功能片段」或「功能衍生物」意謂該片段或衍生物仍影響啟動子活性。如何評定啟動子活性之功能分析為一般熟習此項技術者所熟知的(Bustin 2000, Nolan等人 2006)。此類功能分析之例示性實施例包括例如啟動子動力學實驗。培育感染有載體病毒之細胞持續不同時間，該等載體病毒攜帶表現卡匣，其中啟動子或其片段引導報導體轉殖基因之轉錄。總RNA係由在感染後之不同時間採集之樣品製備。在藉由DNA酶I消化破壞污染性DNA之後，使RNA反轉錄。一個複製樣品在添加反轉錄酶(RT)之情況下進行處理，第二複製樣品在不添加RT之情況下進行處理，以便證明污染性DNA自RNA製備物成功移除。將所得cDNA純化且用作習知PCR之模板。僅在添加RT之情況下處理的樣品將產生PCR產物。此等cDNA可隨後與報導體轉殖基因之引子以及病毒載體之必需基因(內標物基因)之引子一起用於qPCR，該內標物基因之轉錄提供感染及複製效率之內標物。使用內標物基因之qPCR值使報導體之qPCR值在不同構築體與感染後的時間之間標準化。此舉允許說明不同啟動子及其片段之啟動子活性。 如本文所用，「序列同源性」係指一種確定兩個序列相關性之方法。為確定序列同源性，將兩個或更多個序列進行最佳比對，且必要時引入間隙。然而，相比於「序列一致性」，當確定序列同源性時，將保守胺基酸取代視為匹配。換言之，為獲得與參考序列具有95%序列同源性之可比多肽或聚核苷酸，參考序列中85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.9%之胺基酸殘基或核苷酸必須匹配或包含經另一胺基酸或核苷酸保守取代。或者，可將參考序列中不包括保守取代之總胺基酸殘基或核苷酸之至多15%、較佳至多10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳至多5%、4%、3%、2%、1%、0.1%的多個胺基酸或核苷酸插入至參考序列中。較佳地，同源序列包含至少50、甚至更佳100、甚至更佳250、甚至更佳500個核苷酸之延伸。 如此項技術中已知，「序列一致性」係指兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個聚核苷酸序列，亦即參考序列及有待與參考序列比較之給定序列之間的關係。序列一致性係藉由在序列已最佳比對產生最高程度之序列相似性後比較給定序列與參考序列來確定，如藉由此類序列串之間的匹配所確定。在此類比對時，序列一致性係在逐個位置基礎上來確定，例如若在特定位置處之核苷酸或胺基酸殘基一致，則序列在該位置處「一致」。此類位置一致之總數隨後除以參考序列中核苷酸或殘基之總數，得到序列一致性%。序列一致性可易於藉由已知方法計算，包括(但不限於) Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., 編, Oxford University Press, New York (1988)，Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., 編, Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.及Griffin, H. G., 編, Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J., 編, M. Stockton Press, New York (1991)；及Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)中所述之方法，其教示內容以引用的方式併入本文中。確定序列一致性之較佳方法經設計以給出所測試序列之間的最大匹配。確定序列一致性之方法編碼在可公開獲得之確定給定序列之間的序列一致性的電腦程式中。此類程式之實例包括(但不限於) GCG程式包(Devereux, J., 等人, Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F. 等人, J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)。BLASTX程式可自NCBI及其他來源公開獲得(BLAST Manual, Altschul, S. 等人, NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. 等人, J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)，其教示內容以引用的方式併入本文中)。此等程式使用預設間隙權重最佳比對序列，以產生給定序列與參考序列之間的最高序列一致性水準。藉由核苷酸序列與參考核苷酸序列具有至少例如85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.9%「序列一致性」的聚核苷酸作為說明，意欲除給定聚核苷酸序列可包括參考核苷酸序列之每100個核苷酸至多15、較佳至多10、甚至更佳至多5個點突變之外，給定聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致。換言之，在核苷酸序列相對於參考核苷酸序列具有至少85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%、99.9%一致性的聚核苷酸中，參考序列中至多15%、較佳10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳5%、4%、3%、2%、1%、0.1%之核苷酸可缺失或經另一個核苷酸取代，或參考序列中總核苷酸之至多15%、較佳10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳5%、4%、3%、2%、1%、0.1%的多個核苷酸可插入至參考序列中。參考序列之此等突變可發生於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地散置於參考序列之核苷酸中或參考序列內的一或多個鄰接基團中。類似地，藉由給定胺基酸序列與參考胺基酸序列具有至少例如85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%序列一致性的多肽，意欲除給定多肽序列可包括參考胺基酸序列之每100個胺基酸至多15、較佳至多10、9、8、7、6、甚至更佳至多5、4、3、2、1個胺基酸變化之外，多肽之給定胺基酸序列與參考序列一致。換言之，為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%、較佳90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之給定多肽序列，參考序列中至多15%、較佳至多10%、9%、8%、7%、甚至更佳至多5%、4%、3%、2%、1%之胺基酸殘基可缺失或經另一個胺基酸取代，或參考序列中胺基酸殘基總數之至多15%、較佳至多10%、9%、8%、7%、甚至更佳至多5%、4%、3%、2%、1%的多個胺基酸可插入至參考序列中。參考序列之此等突變可發生於參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地散置於參考序列之殘基中或參考序列內的一或多個鄰接基團中。不一致殘基位置之差異較佳為保守胺基酸取代。然而，當確定序列一致性時，保守取代不包括為匹配。 術語「序列一致性」或「一致性百分比」在本文中可互換使用。出於本發明之目的，此處規定為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，出於最佳比較目的比對序列(例如可在第一胺基酸或核酸序列中引入間隙以便與第二胺基酸或核酸序列最佳比對)。接著比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸殘基。當第一序列中之位置與第二序列中之相應位置由相同胺基酸殘基或核苷酸殘基佔據時，則分子在該位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有的一致位置數的函數(亦即，一致性% = 一致位置數/位置總數(亦即重疊位置) × 100)。較佳地，兩個序列之長度相同。 可在所比較之兩個序列的整個長度上或在兩個序列之片段上進行序列比較。通常，將在所比較之兩個序列的全長上進行比較。然而，序列一致性可在例如二十個、五十個、一百個或更多個鄰接胺基酸殘基之區域上進行。 技術人員應瞭解數個不同電腦程式可用於確定兩個序列之間的同源性。舉例而言，可使用數學算法進行序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比。在一較佳實施例中，使用已併入Accelrys GCG套裝軟體中之GAP程式(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/獲得)中的Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))算法，使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重，確定兩個胺基酸或核酸序列之間的一致性百分比。技術人員應瞭解，所有此等不同參數將產生略微不同之結果，但兩個序列之總體一致性百分比在使用不同算法時不顯著改變。 本發明之蛋白質序列或核酸序列可進一步用作「查詢序列」，以針對公共資料庫進行搜尋，例如以鑑別其他家族成員或相關序列。此類搜尋可使用Altschul等人 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10之BLASTN及BLASTP程式(2.0版)進行。BLAST蛋白質搜尋可用BLASTP程式、得分=50、字長=3進行，從而獲得與本發明之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為實現間隙比對以達成比較目的，可如Altschul等人 (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402中所述使用間隙BLAST。當利用BLAST及間隙BLAST程式時，可使用相應程式(例如BLASTP及BLASTN)之預設參數。參見美國國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/之主頁。EHV-1 及 EHV-4/ 重組載體技術定義
術語「馬」意謂馬科的或屬於馬科，其包括馬、驢及斑馬，較佳為馬。另外，術語「馬」亦涵蓋馬科成員之雜種(例如騾等)。 「疱疹病毒」或「疱疹病毒載體」係指疱疹病毒目疱疹病毒科中的物種。 術語「馬疱疹病毒載體」或「馬疱疹病毒」或「EHV」意謂侵襲馬之疱疹病毒科成員。迄今已鑑別馬疱疹病毒之八種不同物種，五種屬於α疱疹病毒亞科(EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8及EHV-9)且三種屬於γ疱疹病毒科。(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, 2015年7月; Email ratification 2016 (MSL #30) 術語「EHV-1」意謂疱疹病毒科α疱疹病毒屬中水痘病毒亞屬之成員馬α疱疹病毒1。EHV-1之非限制性參考序列應為例如野生型EHV-1病毒株ab4 (GenBank寄存編號AY665713.1)或RacH (Hübert 1996)。 術語EHV-4意謂疱疹病毒科α疱疹病毒屬中水痘病毒亞屬之成員馬α疱疹病毒4。 術語「CAdV」或「CAV」或「CAV2」或「CAV-2」係指腺病毒科哺乳動物腺病毒屬之成員2型犬腺病毒。以前，術語犬腺病毒1 (CAV-1或CAV1)及犬腺病毒2 (CAV-2或CAV2)用於指定哺乳動物腺病毒之2個不同物種。然而，根據較新分類(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, 2015年7月; Email ratification 2016 (MSL #30)，術語犬腺病毒(CAdV)現在涵蓋物種CAV-2及CAV-1。 術語「插入至ORF70中」意謂DNA片段在編碼馬α疱疹病毒1開放閱讀框架70之位置處插入至基因組DNA中。在本發明之一特定態樣中，所提及之插入致使ORF70之801個5'鹼基對缺失，保留3'端之其餘423 bp不變，但消除orf70基因產物糖蛋白G之表現。已展示包括EHV-1之數個α疱疹病毒的糖蛋白G自經感染細胞分泌且藉由結合促炎性細胞介素充當免疫調節蛋白質。相比於具有完整糖蛋白G表現之野生型EHV-1，在病毒載體中消除糖蛋白G之表現應增加病毒感染之免疫原性。 術語「插入至ORF1/3中」意謂DNA片段在一位置處插入於病毒基因組中，該位置在疫苗株EHV-1 RacH之減毒程序期間，因繼代中之意外缺失而失去包含90% ORF1及整個ORF2之1283 bp片段。選擇此插入位點係因為預計來自此位置之轉殖基因的表現將干擾病毒複製的可能性極低。疫苗定義
「免疫原性或免疫組合物」係指包含至少一個抗原或其免疫原性部分之物質的組合物，該物質在宿主體內引發對該組合物之細胞免疫反應或抗體介導之免疫反應的免疫反應。 本文所用之術語「抗原」為此項技術中充分理解的且包括具有免疫原性之物質(亦即免疫原)以及誘發免疫無反應性或失能(亦即缺失身體防禦機制對外來物質之反應)之物質。如本文所用，術語「抗原」欲意謂含有或包含抗原決定基之全長蛋白質以及其肽片段。 術語「產食性動物
」意謂給人類食用消費之動物，諸如豬、牛、家禽、魚類及其類似物，產食性動物較佳意謂豬及牛，最佳為豬。術語「產食性動物
」不包括馬科動物，諸如馬。 如本文所用，「免疫原性組合物」係指引發如本文所述之免疫反應之多肽或蛋白質，諸如病毒表面蛋白質。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指包括一或多個抗原決定基且因此引發本文所述之免疫反應之蛋白質或多肽的片段或截短及/或取代形式。一般而言，此類截短及/或取代形式或片段包含來自全長蛋白質之至少六個鄰接胺基酸。此類片段可使用此項技術中熟知的多種抗原決定基定位技術鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷 (Glenn E. Morris編, 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。舉例而言，線性抗原決定基可如下測定：藉由在固體支撐物上並行合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子之部分，且在肽仍附接於支撐物時，使肽與抗體反應。此類技術為已知的且描述於此項技術中，參見例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；及Geysen等人 (1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類地似，可輕易地藉由諸如利用例如X射線結晶學及二維核磁共振判定胺基酸之空間構形來鑑別構形抗原決定基。參見Epitope Mapping Protocols, 見上文。合成抗原亦包括在該定義內，例如多抗原決定基、側接抗原決定基及其他重組或合成衍生抗原。參見例如Bergmann等人 (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann等人 (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；及Gardner等人, (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 1998年6月28日-7月3日。(其教示及內容全部以引用的方式併入本文中。) 如本文所用，術語「疫苗」係指一種醫藥組合物，該組合物包含至少一種可誘發動物體內免疫反應之免疫活性組分，及一或多種可能但不必然會增強活性組分之免疫活性的額外組分。疫苗可另外包含醫藥組合物典型之其他組分。作為區別，疫苗之免疫活性組分可包含完整病毒顆粒，其等為原始形式或為所謂改良式活毒疫苗(modified live vaccine；MLV)之減毒顆粒，或所謂死疫苗(killed vaccine；KV)中藉由適當方法之失活顆粒。在另一形式中，痘苗之免疫活性組分可包含生物體之適當要素(次單位疫苗)，其中此等要素藉由以下產生：破壞整個顆粒或含有此類顆粒之生長培養基且視情況隨後進行純化步驟，產生所需結構；或合成過程，包括藉由使用基於例如細菌、昆蟲、哺乳動物或其他物種之適合系統進行適當操作加上視情況存在之後續分離及純化程序；或使用適合醫藥組合物直接併入遺傳物質，在需要疫苗之動物中誘發合成過程(聚核苷酸疫苗接種)。疫苗可包含一種或同時超過一種上述要素。如在本發明之特定態樣內所用，「疫苗」係指活疫苗或活病毒，亦稱為重組疫苗。在本發明之另一特定態樣中，「疫苗」係指失活病毒或死病毒，包括病毒樣顆粒(VLP)。因此，疫苗可為次單位疫苗或死疫苗(KV)或失活疫苗。 術語「感染倍率(M.O.I.)」描述每一細胞使用病毒製劑有多少感染單位(例如TCID50)可感染所培養細胞。舉例而言，0.01之M.O.I.意謂培養容器中每100個細胞接種一個感染單位。 術語「DNA疫苗接種」或「聚核苷酸疫苗接種」意謂使用適合之醫藥組合物直接接種遺傳物質。 此項技術中已知失活之各種物理及化學方法。術語「失活」係指先前毒性或非毒性病毒或細菌已經輻照(紫外(UV)、X射線、電子束或γ輻射)、加熱或化學處理以使此類病毒或細菌失活或殺死此類病毒或細菌，同時保留其免疫原性。適合之失活劑包括β-丙內酯、二或β-或乙醯基-伸乙基亞胺、戊二醛、臭氧及福馬林(formalin)(甲醛)。 對於藉由福馬林或甲醛失活而言，甲醛通常與水及甲醇混合，產生福馬林。添加甲醇防止在失活過程期間產生降解或交叉反應。一個實施例使用約0.1%至1%之37%甲醛溶液以使病毒或細菌失活。關鍵係調節福馬林之量以確保使物質失活，但不會達到因高劑量引起副作用之程度。 更特定言之，術語「失活」在病毒之情形下意謂病毒不能活體內或活體外複製，且對應地，術語「失活」在細菌之情形下意謂細菌不能活體內或活體外再生。舉例而言，術語「失活」可指病毒已活體外繁殖且隨後已使用化學或物理方式失活，從而使其不再能夠複製。在另一實例中，術語「失活」可指細菌已繁殖且隨後使用化學或物理方式失活，產生細菌、細菌之片段或組分之懸浮液，諸如產生可用作疫苗組分之菌苗。 如本文所用，術語「失活」、「死」或「KV」可互換使用。 術語「活疫苗」係指包含活有機體或複製勝任型病毒或病毒載體之疫苗。 「醫藥組合物」基本上由一或多種能夠改良其投與之生物體或存活在該生物體中或該生物體上之生物體之生理、例如免疫功能的成分組成。該術語包括(但不限於)抗生素或抗寄生蟲劑，以及常用以達成某些其他目標之其他成分，該等目標諸如(但不限於)加工性狀、無菌性、穩定性、經由經腸或非經腸途徑(諸如經口、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內或其他適合途徑)投與組合物之可行性、投與後耐受性或控制釋放特性。僅出於示範目的而給出的此類醫藥組合物之一個非限制性實例可如下製備：將經感染細胞培養物之細胞培養清液層與穩定劑(例如亞精胺及/或牛血清白蛋白(BSA))混合且隨後藉由其他方法將混合物凍乾或脫水。在疫苗接種前，混合物接著在水溶液(例如生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS))或非水溶液(例如油乳液、鋁類佐劑)中復原。 如本文所用，「醫藥學或獸醫學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑及其類似物。在一些較佳實施例及尤其包括凍乾免疫原性組合物之實施例中，用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。 在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。如本文所用，「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂苷，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可尤其基於輕液態石蠟油(歐洲藥典類型)；類異戊二烯油，諸如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴、尤其異丁烯或癸烯寡聚產生之油；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子界面活性劑，尤其脫水山梨糖醇、二縮甘露醇(例如無水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇、聚丙三醇、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯，其視情況經乙氧基化；及聚氧化丙烯-聚氧化乙烯共聚物嵌段、尤其普洛尼克(Pluronic)產品、尤其L121。參見Hunter等人, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, 第51-94頁 (1995)及Todd等人, Vaccine 15:564-570 (1997)。例示性佐劑為描述於「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」, M. Powell及M. Newman編, Plenum Press, 1995之第147頁上的SPT乳液及描述於此同一本書第183頁上之乳液MF59。 佐劑之另一實例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利的佐劑化合物為尤其與糖或多元醇之聚烯基醚交聯的丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物由術語卡波姆(carbomer)已知(Pharmeuropa, 第8卷, 第2期, 1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其描述與具有至少3個羥基、較佳不超過8個羥基之聚羥基化合物交聯之此類丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂族基團置換。較佳基團為含有2至4個碳原子之彼等基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團本身可含有其他取代基，諸如甲基。以CARBOPOL®為名銷售之產品(BF Goodrich, Ohio, USA)尤其適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基異戊四醇交聯。尤其可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳為使用CARBOPOL® 971P。在順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物中的為共聚物EMA (Monsanto)，其為順丁烯二酸酐與乙烯之共聚物。此等聚合物溶解於水中產生酸溶液，其將較佳中和至生理pH值，得到將併入免疫原性、免疫或疫苗組合物本身之佐劑溶液。 其他適合之佐劑尤其包括(但不限於) RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、阻斷共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌之熱不穩定腸毒素(重組或以其他方式)、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽、或天然存在或重組的細胞介素或其類似物或內源性細胞介素釋放之刺激劑。 預期佐劑可以每劑約100 µg至約10 mg之量、較佳以每劑約100 µg至約10 mg之量、更佳以每劑約500 µg至約5 mg之量、甚至更佳以每劑約750 µg至約2.5 mg之量且最佳以每劑約1 mg之量添加。或者，佐劑可以最終產物之體積計在約0.01%至50%之濃度下、較佳在約2%至30%之濃度下、更佳在約5%至25%之濃度下、再更佳在約7%至22%之濃度下且最佳在10%至20%之濃度下。 「稀釋劑」可包括水、生理食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸(EDTA)之鹼金屬鹽。 「經分離」意謂自其天然狀態「經人工」改變，亦即若其存在於自然界中，則其已變化或自其原始環境移出或兩者。舉例而言，天然存在於活生物體中之聚核苷酸或多肽未「經分離」，但與其天然狀態之共存物質分離的相同聚核苷酸或多肽「經分離」，如該術語在本文中所用。 「減毒」意謂降低病原體毒性。在本發明中，「減毒」與「無毒」同義。在本發明中，減毒病毒為毒性已降低以使其不引起感染臨床徵象，但能夠在目標動物體內誘發免疫反應之病毒，但亦可意謂與感染非減毒病毒或病原體且未接受減毒病毒之動物的「對照組」相比，臨床徵象在感染減毒病毒、尤其所主張之EHV-1 RacH病毒載體之動物中的發生率或嚴重程度降低。在此上下文中，術語「降低」意謂與如上文所定義之對照組相比，減少至少10%、較佳25%、甚至更佳50%、再更佳60%、甚至更佳70%、再更佳80%、甚至更佳90%且最佳100%。因此，減毒、無毒病原體，諸如所主張之減毒病毒載體、尤其所主張之EHV-1 (較佳地RacH)病毒載體適於產生改良式活毒疫苗(MLV)或改良式活免疫原性組合物。 在本文中，「有效劑量」意謂(但不限於)抗原在抗原投與之動物體內引發或能夠引發免疫反應，使得臨床症狀減少之量。 如本文所用，在組合物之情形下，術語「有效量」意謂免疫原性組合物在動物體內能夠誘發免疫反應，降低感染或發生疾病之發生率或減輕嚴重程度的量。特定言之，有效量係指每劑之菌落形成單位(CFU)。或者，在療法之情況下，術語「有效量」係指療法足以降低或減輕疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重程度或持續時間，阻止疾病或病症進展，引起疾病或病症消退，防止與疾病或病症相關之一或多種症狀復發、顯現、發作或進展，或增強或改善另一療法或治療劑之預防或治療的量。 「免疫反應」意謂(但不限於)出現針對所關注之(免疫原性)組合物或疫苗的細胞免疫反應及/或抗體介導之免疫反應。通常，免疫反應包括(但不限於)一或多個以下效應：產生或活化特異性針對所關注組合物或疫苗中所包括之抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞。較佳地，宿主將呈現治療性或保護性免疫(記憶)反應，從而對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度將降低。此類保護作用可藉由以下證實：症狀數目減少、症狀嚴重程度降低、或不存在與病原體感染相關之一或多種症狀、病毒血症發作延遲、病毒續存降低、整體病毒負荷降低及/或病毒排出減少。 「對抗疾病的保護」、「保護性免疫」、「功能性免疫」、「減少臨床症狀」、「誘導/產生中和抗體及/或血清轉換」及類似片語意謂藉由投與一或多種本發明之治療性組合物或其組合產生的對抗疾病或病況的部分或完全反應，使得有害效應與在已暴露於疾病或感染之未經免疫個體中所預期相比較少。亦即，在經疫苗接種之個體中感染之有害效應的嚴重程度減輕。在經疫苗接種之個體中感染可減少、減緩或可能完全預防。在本文中，在意謂完全預防感染之情況下，對其進行特別陳述。若未陳述完全預防，則該術語包括部分預防。 在本文中，「降低臨床徵象之發生率及/或嚴重程度」或「減少臨床症狀」意謂(但不限於)與野生型感染相比，減少一組中感染個體之數目、減少或消除展現感染臨床徵象之個體的數目、或降低一或多個個體中存在之任何臨床徵象的嚴重程度。舉例而言，其應係指病原體負荷、病原體排出之任何減少、病原體傳播減少或有瘧疾症狀的任何臨床徵象減少。較佳地，與未接受組合物且感染之個體相比，接受本發明之治療性組合物的一或多個個體中此等臨床徵象減少至少10%。更佳地，接受本發明之組合物之個體中臨床徵象減少至少20%，較佳至少30%，更佳至少40%，且甚至更佳至少50%。 術語「增加之保護」在本文中意謂(但不限於)相對於未經疫苗接種之個體對照組，在經疫苗接種之個體組中與受感染物感染相關之一或多種臨床症狀統計學上顯著減少。術語「臨床症狀統計學上顯著減少」意謂(但不限於)在經以感染物攻擊後，經疫苗接種之個體組中至少一種臨床症狀之發生頻率比未經疫苗接種之對照組中低至少10%、較佳20%、更佳30%、甚至更佳50%及甚至更佳70%。 「持久保護」應係指持續至少3週、但更佳至少3個月、再更佳至少6個月之「改良功效」。就家畜而言，最佳持久保護應持續直至動物以肉出售之平均年齡。 術語由病毒誘發之「病毒血症減少」意謂(但不限於)減少進入動物血流之病毒，其中與未接受組合物且可能感染之動物相比，接受本發明之組合物之動物的血清中病毒血症程度(亦即每毫升血清之病毒DNA或RNA複本數或每分升血清之空斑形成菌落數目)減少至少50%。更佳地，接受本發明之組合物之動物中病毒血症程度減少至少90%、較佳至少99.9%、更佳至少99.99%且甚至更佳至少99.999%。 如本文所用，術語「病毒血症」具體理解為病毒顆粒在動物(尤其哺乳動物、鳥或昆蟲)血流中再生及/或循環的病況。 「安全性」係指在疫苗接種後經疫苗接種之動物中無以下不良後果，包括(但不限於)：基於病毒之疫苗可能恢復至毒性、臨床上顯著之副作用，諸如持續全身疾病或疫苗投與部位不可接受之炎症。 如本文所用，術語「疫苗接種」或其變化形式意謂(但不限於)包括投與本發明之免疫原性組合物的過程，當向動物投與本發明之免疫原性組合物時直接或間接引發或能夠引發該動物之免疫反應。 在本發明之上下文中，「死亡率」係指由感染引起之死亡，且包括感染嚴重至使動物安樂死以防痛苦且人為終止其生命的情況。調配物
投與組合物之個體較佳為動物，包括(但不限於)牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如雞)、山羊、貓、犬、倉鼠、小鼠及大鼠，哺乳動物最佳為豬。 本發明之調配物包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理學上可接受之媒劑。疫苗包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理學上可接受之媒劑。調配物應適合投藥模式。 必要時，免疫原性組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末。經口調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。 治療方法 較佳投與途徑包括(但不限於)鼻內、經口、皮內及肌肉內。最佳以單次劑量在飲用水中投與為合乎需要的。熟習此項技術者應認識到，本發明之組合物亦可以一次、兩次或更多次劑量以及藉由其他投藥途徑投與。舉例而言，此類其他途徑包括皮下、皮內、腹膜內、皮內且視所需持續時間及治療有效性而定，根據本發明之組合物可投與一次或亦可間歇地投與數次、例如在每日基礎上投與數天、數週或數月及以不同劑量投與，諸如約103
至108
TCID50 (參見上文病毒效價)。在本發明之一特定態樣中，劑量為約103
至108
TCID50，尤其對於活病毒/活疫苗而言。 必要時，組合物可存在於包裝或分配器裝置中，該包裝或分配器裝置可含有一或多個含有活性成分之單位劑型。包裝可例如包含金屬或塑膠箔，諸如泡殼包裝。包裝或分配器裝置可附有較佳關於投與哺乳動物、尤其豬之投與說明書。與此類容器相關聯的可為由管理醫藥或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之注意事項，該注意事項反映由人類投藥之製造、使用或銷售機構之批准。序列概述 ：
以下序列特此詳述及揭示於本發明中： 引子： SEQ ID NO: 1 EHV-4 600bp去氧核醣核酸序列4pgG600 SEQ ID NO: 2 EHV-4 600bp去氧核醣核酸序列4pMCP600 SEQ ID NO: 3 EHV-4 430bp去氧核醣核酸序列pG430 SEQ ID NO: 4 EHV-4 449bp去氧核醣核酸序列p455 SEQ ID NO: 5 特異性針對orf72之第1130號引子 SEQ ID NO: 6 特異性針對orf72之第1131號引子 SEQ ID NO: 7 特異性針對mCherry之第1079號引子 SEQ ID NO: 8 特異性針對mCherry之第1080號引子 插入位點： SEQ ID NO: 9 orf70插入區之人工序列核酸PCR引子1017 SEQ ID NO: 10 orf70插入區之人工序列核酸PCR引子1018 SEQ ID NO: 11 orf1/3插入區之人工序列核酸PCR引子1007 SEQ ID NO: 12 orf1/3插入區之人工序列核酸PCR引子1008 SEQ ID NO: 13 左(Up70)側接區(417 bp) SEQ ID NO: 14 右(Up71)側接區(431 bp) SEQ ID NO: 15 野生型EHV-1病毒株ab4 (GenBank寄存編號AY665713.1)中位於核苷酸127264-127680處之左側接區(orf70上游) SEQ ID NO: 16 野生型EHV-1病毒株ab4 (GenBank寄存編號AY665713.1)中位於核苷酸128484-128913處之右側接區(orf71上游) SEQ ID NO: 17 RED系統中截短之側接區：左(Up70)側接區(283 bp) = 與417 bp「經典」側接區之3' 283 bp一致 SEQ ID NO: 18 RED系統中截短之側接區：右(Up71)側接區(144 bp) = 與431 bp「經典」側接區之5' 144 bp一致 SEQ ID NO: 19 野生型ab4 (GenBank寄存編號AY665713.1)基因組序列中之缺失部分，nt 127681-128482 SEQ ID NO: 20 RacH基因組序列中之缺失部分(因為尚未知曉完整基因組序列，所以無法獲得nt編號) 質體/載體序列： SEQ ID NO: 21 轉移質體pU-mC70-BGH之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 22 轉移載體pU70-p455-71K71之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 23 轉移質體pU70-p455-H3-71K71之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 24 轉移載體pU-1-3-p430-BGHKBGH之核苷酸序列 SEQ ID NO.: 25 轉移質體pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH之核苷酸序列 血球凝集素序列 SEQ ID NO:26 血球凝集素[A型流感病毒(A/豬/義大利/116114/2010(H1N2))] GenBank: ADR01746.1 H1pdm SEQ ID NO:27 血球凝集素[A型流感病毒(A/豬/義大利/7680/2001(H3N2))] GenBank: ABS50302.2 H3: SEQ ID NO:28 血球凝集素[A型流感病毒(A/豬/Gent/132/2005(H1N1))] GenBank: AFR76623.1 H1av: SEQ ID NO:29 血球凝集素[A型流感病毒(A/豬/義大利/4675/2003(H1N2))] GenBank: ADK98476.1* H1hu *請注意，胺基酸531 (X，終止密碼子由本發明人改為I)： SBV構築體序列 SEQ ID NO:30 GS連接子序列 SEQ ID NO: 31 包括用於次選殖的限制性位點的合成DNA序列 SEQ ID NO:32 用於RED重組產生pRacH-SE-70-455-SBVGc之DNA片段 SEQ ID NO:33 up70 F引子 SEQ ID NO:34 up71 R引子 SEQ ID NO:35 seq455-F1引子 SEQ ID NO:36 SBV Gc F1引子 SEQ ID NO:37 SBV Gc R1引子 實例 包括以下實例以說明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表本發明人發現在本發明實施中起良好作用之技術，且因此可視為構成其較佳實施方式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。 實例1：新穎之啟動子的鑑別及構築
鑑別適合之啟動子序列的策略如下：EHV-4序列中在兩個已知orf上游之600 bp片段首先藉由使其與EHV-1基因組之相應序列片段比對來進行分析。所選基因為編碼主要衣殼蛋白(MCP)之orf42及編碼糖蛋白G (gG)之orf70。主要衣殼蛋白為病毒粒子中最豐富的成分之一，且一旦新合成的病毒DNA準備進行包裝，就需要在細胞核中組裝衣殼。因此，預期其啟動子在病毒複製週期之早期及晚期具有活性。對於糖蛋白G，已知其基因(orf70)亦在複製週期之早期及晚期具有活性(Colle等人 1995，Drummer等人 1998)。假定的MCP啟動子之序列一致性為82.2%且假定的gG啟動子之序列一致性為82.3%。此等差異視為一方面足夠大以防止同源重組，且另一方面足夠小以允許在EHV-1複製期間轉錄活化。為測試啟動子活性，合成600 bp DNA片段4pgG600
及4pMCP600
且選殖於編碼自發螢光蛋白質mCherry之報導體基因的上游(Shaner等人, 2004)。作為轉錄終止信號及mRNA穩定作用，將牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGHpA；Goodwin及Rottman, 1992)直接選殖於報導體基因3'端下游。 為用作陽性對照，CMV啟動子自市售質體pcDNA3.1 (Invitrogen)擴增且選殖於mCherry報導體基因之上游，此處亦在報導體基因之3'端添加BGHpA。用三種質體(pBlu-4pgGmCherry、pBlu-4pMCPmCherry及pBlu-CMVmCherry)轉染細胞培養物且藉由螢光顯微鏡檢查mCherry螢光。在轉染後的不同時間，CMV啟動子之強活性為明顯的。4pgG600啟動子在轉染後亦具有活性，4pMCP600啟動子之活性亦可偵測，但與4pgG600啟動子相比較弱且甚至在轉染後三天當與CMV啟動子相比時甚至弱得多。 為研究病毒基因產物對啟動子活性之效應，經pBlu-4pgG600-mCherry或pBlu-4pMCP600-mCherry轉染之細胞培養物在轉染後一天用綠色螢光EHV-1 RacHI-EF重複感染。病毒基因產物明顯轉活化4pMCP600啟動子，與不存在EHV-1 RacHI-EF複製之情況相比，活性顯著較高。該效應亦存在於用pBlu-4pgG600-mCherry轉染且用EHV-1 RacHI-EF重複感染之細胞培養物中，但並不如此劇烈，因為在不存在病毒複製之情況下的初始活性高於針對pBlu-4pMCP600-mCherry所觀察到的活性。儘管如此，對於兩種600 bp啟動子，仍證明病毒複製對其在細胞培養物中之活性的轉活化效應。 若該等600 bp序列含有通常位於活化子元件上游之抑制子元件，則可解釋此效應。因此，在不存在病毒基因產物之情況下，較短啟動子可更具活性。為測試此種情況，將兩種EHV-4啟動子序列截短至其原始長度之約75%且再次測試。 具體而言，4pgG之600 bp啟動子截短至430 bp，新名稱：p430
：TCTATTTGAGGACCCGCCGAGTACCCCACAAGAGTATGTAAAAAGCTGTCATTCTCAACTACTGAGAATAATATCAAAGCTAAAGATAAACCCTGAGGAGTTTCCACGGGAACCAGAGTCTAGGCTCGTGCGCGGATACATCGAATACGCCAGCCTAGAGCGTAAGCCACATACGCGCTATCCTTGCTTCCAGCGCGTGAACCTACACATTGACGGGGAATTTTTGATCCATAAAATGCTAGCGTTCAATGCTGCGATGCGCCCATCCGCAGAAGAGTTGTTGTCCTACCCAATGTTTATGAATCTGTAGGATGACTAACAGATTTGGGGTGGAGACGGCGTGGGCGATACTGTATAAAGTTGTACTACTTACCAGCCCAGTCAGTGTGCTGTAGTGCCACCACCTGTAAAGCTGTGATAAGCTGCAGTT (SEQ ID NO:3) 4pMCP截短至449 bp，新名稱：p455
：TTGGTGGTAGCATATACTACCTTATTTATACGCTCCGAGCTGTTTTTCAGCATGCTAGCACCCAACGCCGAGCGAGAGTATATAACTCCCATCATTGCCCACAAGCTTATGCCACTTATTAGCGTCCGCTCTGCCGTTTGCTTAGTCATAATATCTACCGCCGTTTACGCAGCAGACGCTATCTGCGACACAATTGGATTTGCGATACCGCGCATGTGGATGTGTATTTTAATGAGATCAACCTCCATGAAGCGTAACTAGGGGGCCTCCCACTGAGGCACTACCGGCTTAGCAGCTGACTAACACAGTATAAAACGTGAGAAGAAATCAGTCTCATGCGCCATTAGCGCTAGGCTAGTTAGCGTGGAGGACCGGAGCGCTACCGCCAGCAGTTTCATCCGCCTGGTTACGGGTTTGTTAACACCTACCGGTGTTTTACCGCTACCATA (SEQ ID NO:4)。 將含有縮短之啟動子的mCherry報導體質體轉染於細胞培養物中且藉由螢光顯微鏡檢查。雖然p430活性與600 bp型式(4pgG600)相當，但p455之活性相比4pMCP600之活性顯著增加。此結果與使用兩種啟動子之600 bp型式之轉染/重複感染實驗的結果一致，即在同一細胞中EHV-1複製之存在提供4pMCP600啟動子轉活化之機制，強烈地增加其活性，而4pgG600啟動子之轉活化為可見的，但不太明顯。 除兩種新穎之啟動子之外，亦需要新穎之聚腺苷酸序列以便自新穎之orf70插入位點表現。該元件稱為71pA。將其核苷酸序列合成且選殖於含有靶向pRacH-SE中之orf70插入位點之p455的轉移質體中之mCherry orf的下游。 接著，生成rEHV-1 RacH-SE以分析啟動子在病毒複製背景中之活性(表1)。兩種EHV-4啟動子(p430及p455)、CMV啟動子及小鼠細胞巨大病毒IE1啟動子(MCMV)與BGH聚腺苷酸信號組合用於引導mCherry之表現以提高mRNA穩定性。將如由Dorsch-Häsler等人 (1985)所述之MCMV IE1啟動子(強化子)合成且選殖於質體載體中，由此將其次選殖於轉移質體中。另外，p455亦選殖於orf70中新穎之插入位點中，從而與新穎之聚腺苷酸信號71pA組合驅動mCherry表現。rEHV-1 RacHmC70作為另一個對照物包括於實驗中。經此重組病毒感染之細胞在內源性gG啟動子(egGp)控制下表現mCherry (表1)。 表1 
VERO或PK/WRL細胞經感染倍率為1之全部六種mCherry表現病毒感染。在感染後0、4、8及12小時採集經感染細胞且製備總RNA。藉由DNA酶I消化破壞污染RNA製備物之病毒及細胞基因組DNA。在添加及不添加反轉錄酶之情況下藉由反轉錄顯示RNA之完整性及病毒DNA之移除，隨後用特異性針對編碼EHV-1之必需結構性糖蛋白D之orf72的引子對(第1130/1131號引子，(TGTCTACCTTCAAGCTTATG (SEQ ID NO:5)/ CTAGCGCAGTCGCGTTG (SEQ ID NO:6))進行PCR。預期的196 bp PCR產物僅由已添加反轉錄酶之反轉錄樣品(cDNA)擴增，具體而言，在t1= 4h p.i.、t2= 8h p.i.及t3= 12h p.i.製備之樣品，而非在t0= 0 h p.i.製備之樣品。正如所預期，反轉錄酶尚未添加至反應中之所有樣品均未產生任何PCR產物。因此，顯示將用作qPCR模板之樣品(cDNA)不含病毒基因組DNA。 隨後，使用特異性針對mCherry之引子對(第1079/1080號引子，(GCGAGGAGGATAACATGG (SEQ ID NO:7)/ ACCCTTGGTCACCTTCAG (SEQ ID NO:8))及orf72引子對1130/1131 (TGTCTACCTTCAAGCTTATG (SEQ ID NO:5)/ CTAGCGCAGTCGCGTTG (SEQ ID NO:6))，藉由qPCR分析用所添加之酶自反轉錄獲得之cDNA。orf72 qPCR之Ct值用於評定並行運行不同病毒感染之可比性且使mCherry qPCR之Ct值標準化。因此，相對於感染後的時間及不同病毒定量mCherry之轉錄( 圖 3)
。 如圖 3
左圖所示，六種不同病毒之orf72轉錄物的Ct值在四個不同的感染後的時間幾乎一致。理想地，全部六種病毒將在所研究的時間產生一致值且將僅可見一條線。幾乎一致的線證實足夠的實驗品質，同樣12 h p.i.時間結果為有效的，因為與8 h p.i.相比降低指示轉錄物數量的進一步增加，其僅當複製尚未達到其最大值時才可能。計算各感染後時間之統計平均值。各病毒在特定時間之值除以該時間所計算的平均值且用作將mCherry qPCR之Ct值標準化以使其可直接比較的因子。mCherry qPCR之標準化Ct值圖解展示於圖 3
右圖中。線發散表明在不同的病毒感染細胞中產生的mCherry轉錄物數目的差異。 在不同類型的圖形中，組合兩個實驗，一個使用VERO-EU細胞(V)且一個使用PK/WRL細胞(P)( 圖 4)
。如上所述，藉由在反轉錄酶存在及不存在下反轉錄，隨後用orf72引子進行PCR來確認RNA製備物之品質及隨時間推移的病毒複製。如上所述，基於orf72之qPCR Ct值使所獲得之mCherry之qPCR Ct值標準化。t1=4h p.i.、t2=8h p.i.及t3=12h p.i.之標準化Ct值自t0之標準化Ct值減去(△標準化Ct)，使得與轉錄活性之正相關。 雖然在VERO (V)或PK/WRL (P)細胞中之兩個實驗無法直接比較，但PK/WRL細胞中之較高表現量最可能反映PK/WRL對EHV-1複製之優越的容許性，其通常使得感染性病毒之效價高十倍。 雖然源於EHV之啟動子p430、p455及egGp的活性在所用細胞株之相應感染後時間幾乎相同，與其插入位點或所用聚腺苷酸(BGH或71pA)無關，但CMV及MCMV啟動子在PK/WRL細胞中之活性較高。在VERO-EU細胞中，僅MCMV啟動子顯示具有較高活性，CMV啟動子不優於EHV啟動子。 由此等實驗得出結論，EHV-4啟動子p430及p455適用於EHV-1 RacH主鏈中以驅動自orf1/3及orf70插入位點插入之轉殖基因的表現。 實例2：在重組 EHV-1 載體疫苗中使用新穎之 p455 啟動子及構築重組病毒
p455啟動子： 對於第一動物實驗，使用來自豬源性A型流感病毒之流感血球凝集素亞型H3 (A/豬/義大利/7680/2001(H3N2)，Genbank寄存編號：ABS50302.2)。合成其編碼序列且次選殖以產生轉移載體pU70-p455-H3-71K71，將H3置於新穎之p455啟動子及新穎之71pA聚腺苷酸化信號控制下且使卡匣與插入至orf70中之重組區成框( 圖 5)
。 藉由使用RED重組系統順道誘變(Tischer等人 2006)，將表現卡匣p455-H3-71插入於pRacH-SE之orf70中以生成pRacH-SE70-p455-H3( 圖 6)
。 PK/WRL細胞用pRacH-SE70-p455-H3轉染，救援重組病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3且進行空斑純化兩次。表現卡匣之正確插入係藉由定序插入區之高保真度PCR產物來驗證。藉由間接免疫螢光分析(IFA，圖 7
)分析經感染細胞中轉殖基因之表現。 使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)藉由IFA (未展示)及西方墨點法( 圖 8)
確認編碼EHV-1 gpII之orf71的修復。經感染細胞之質膜上H3三聚體之出現係藉由使用雞紅血球之血球吸附測試(未展示)來分析。在PK/WRL細胞中以TCID50
/ml形式確定的峰效價與親本病毒rEHV-1 RacH-SE在相同的範圍內，其表明轉殖基因表現對病毒複製無不利效應(未展示)。此係藉由在救援後rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL細胞中繼代直至第20代(P20)來證實。在P5、P10、P15及P20藉由滴定、定序及西方墨點法( 圖 8)
，在P10及P20另外藉由IFA表徵病毒，且確認HA編碼插入物連同啟動子及聚腺苷酸序列之HA表現及基因穩定性。圖 8
中所示之兩種墨點為用特異性偵測EHV-1糖蛋白II (gpII)之單株抗體Ai2G7 (左)或用來自飼養兔之對抗流感血球凝集素亞型H3之商業多株抗體(PA5-34930) (右)培育的複本。正如所預期，在所有經重組EHV-1感染之細胞培養物中偵測到gpII。正如所預期，在所有經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之不同繼代感染之細胞中偵測到全長H3。H3抗血清之特異性展示於同一西方墨點中，參見條帶gG430mC。正如所預期，此處僅gpII mab產生反應，而抗H3抗體未結合於相應的複本條帶中。 藉由使用單株抗H3抗體及馬抗EHV抗血清在經P20感染之細胞中的病毒空斑雙重免疫螢光分析(dIFA)，證實幾乎所有誘生空斑之EHV-1亦表現H3 (未展示)。所有測試均證實重組EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之穩定性。 實例3：使用 p455 啟動子之概念驗證動物研究 (POC I) 及血清學反應之評定 ：
測試動物：納入準則及實驗設計： 如表2中所彙總，POC-I研究中包括五組由未處理之A型流感母豬生產的十隻豬崽。 表2 
1×107
TCID50感染劑量之rEHV-1 RacH-70-p455-H3 (EHV-1)在五週齡施用一次或在兩週齡及五週齡施用兩次。為進行比較，市售失活疫苗(Inact)在兩週齡及五週齡施用兩次。所有豬崽均不含母系來源的抗體，以免消除失活疫苗(Inact)之效應。兩組未經疫苗接種但接受氯化鈉生理溶液(NaCl)注射，以分別充當攻擊對照物或嚴格的陰性對照物。在第二次疫苗接種後21天，除嚴格的陰性對照組之外的所有組均用1×107
TCID50
異源A型流感(IVA)病毒株(來自豬之H3N2 A型流感病毒R452-14，由BI擁有之攻擊分離株)攻擊。雖然在未經疫苗接種之攻擊對照組(Chall ctrl)中，所有豬在攻擊感染後一天及三天均在其肺中具有高流感病毒效價，但嚴格的陰性對照組(neg ctrl)及已經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接種兩次之組(EHV 2×)中的所有豬在兩天均對IVA呈陰性。在經失活對照疫苗接種兩次之組(Inact 2×)中，五隻動物中之一者在攻擊後第三天具有低IVA效價。在攻擊前21天經rEHV-1 RacH-SE-70-455-H3接種一次之組(EHV 1×)中，五隻動物中之兩者在攻擊感染後一天且五隻中之一者在攻擊後三天在其肺中具有低IVA效價。( 圖 9)
。 經1× 107
TCID50 rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3接種兩次完全保護豬免受異源IAV亞型H3N2之攻擊感染。 已證明EHV-1載體RacH-SE適於豬接種且新穎之啟動子455在經疫苗接種之豬中具有驅動IAV血球凝集素之免疫原性表現的功能。 實例4：在重組 EHV-1 載體疫苗中使用新穎之 p430 啟動子及構築重組病毒
p430啟動子： 新鑑別之p430啟動子用於驅動來自H1N1病毒之另一流感血球凝集素((A/豬/Gent/132/2005(H1N1)，Genbank寄存編號：AFR76623.1)之表現。由於此病毒分離株中之血球凝集素基因來源於禽類IAV，故其將稱為H1av。合成H1av且次選殖於orf1/3插入區之轉移載體中以生成pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH。H1av之表現在p430啟動子及牛生長激素(BGH)聚腺苷酸信號控制下( 圖 10)
。 藉由使用RED重組系統順道誘變(Tischer等人 2006)，將表現卡匣p430-H1av-BGH插入於pRacH-SE之orf1/3中以生成pRacH-SE1/3-p430-H1av( 圖 11)
。 PK/WRL細胞用pRacH-SE1/3-p430-H1av轉染，救援重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av且進行空斑純化兩次。表現卡匣之正確插入係藉由定序插入區之高保真度PCR產物來驗證。轉殖基因在經感染細胞中之表現係使用市售單株及多株抗體藉由間接免疫螢光分析(IFA)及西方墨點法來分析(圖12)。 使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)藉由IFA及西方墨點法確認編碼EHV-1 gpII之orf71的修復(未展示)。藉由使用雞紅血球之血球吸附測試(未展示)分析H1av之正確加工及轉運以及在經感染細胞之質膜中的定位。在PK/WRL細胞中以TCID50
/ml形式確定的峰效價與親本病毒RacH-SE在相同的範圍內，其表明轉殖基因表現對病毒複製無不利效應(未展示)。 由抗體PA-34929在75 kDa遷移之寬帶的特異性偵測與由序列所預測之重組HA糖蛋白的預期外觀一致。細胞膜用單株抗體C102之表觀染色與所預期之亞細胞定位一致(圖12)。 為測試所表現之重組血球凝集素是否如所預期般的加工及轉運，VERO細胞經感染倍率為0.01之rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE (親本)感染或保持未感染。24 h p.i.經感染及未感染之活細胞用雞紅血球於PBS中之懸浮液培育，用PBS洗滌且用螢光Hoechst 33342細胞核染色劑染色。由於鳥類紅血球含有細胞核，故其可用Hoechst33342染色且藉由螢光顯微鏡呈現為微小藍色斑點，與經不表現血球凝集素之rEHV-1 RacH-SE感染的細胞相比，經rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染之細胞上雞紅血球的吸附量顯著增加(未展示)。由此可推斷，血球凝集素以如同其係由真正的流感病毒感染產生般的方式轉譯、加工及轉運至經載體病毒感染之細胞的質膜。 經感染細胞之血球吸附的明顯表型支持西方墨點法及免疫螢光分析之發現，顯示轉殖基因蛋白質之高效表現且表明在經EHV-1載體感染之細胞的細胞表面上形成功能性HA三聚體。 實例5：在重組 EHV-1 載體疫苗中在兩個插入位點並行使用兩種新穎之啟動子 p455 及 p430
為展示兩種新穎之啟動子可並行使用，產生表現兩種不同A型流感病毒亞型之兩種不同血球凝集素的重組EHV-1 RacH。 藉由用單插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染之經感染細胞的西方墨點驗證多株商業抗體對H3 (PA5-34930)及H1 (PA5-34929)之特異性及缺乏交叉反應性(未展示)。 以重組BAC pRacH-SE-70-p455-H3起始，藉由兩步RED重組將在轉移載體pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH( 圖 10)
中組裝之表現卡匣p430-H1av-BGH插入至orf1/3插入位點中以產生pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。PK/WRL細胞用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3轉染，救援重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3且進行空斑純化兩次( 圖 13)
。 此重組病毒之簡稱為rEHV-1 RacH-SE_B。表現卡匣之正確插入係藉由定序插入區連同側接序列之高保真度PCR產物來驗證。轉殖基因在經感染細胞中之表現係使用市售單株及多株抗體藉由間接免疫螢光分析(IFA，未展示)及西方墨點法來分析(圖14)。編碼EHV-1 gpII之orf71的修復係使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)藉由IFA (未展示)及西方墨點法來確認(圖14)。 如圖14中所示，轉殖基因H3及H1av在經雙插入重組rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3 (B)感染之細胞培養物中並行表現。轉殖基因表現為穩定的且未削弱測試的病毒效價，直至PK/WRL細胞中之第11代(未展示)。 兩種新穎之啟動子p430及p455經展示在細胞培養物中之rEHV1-RacH複製之情形下具有功能性。在病毒複製週期期間之活性水準似乎與由活體外啟動子動力學實驗所推斷的非常相似。此等特性允許基於EHV-1 RacH或以相似效率並行表現兩種不同抗原之其他載體平台形成重組載體疫苗。若疫苗靶標由兩種不同病原體組成，則兩種新穎之啟動子與兩個聚腺苷酸化序列組合應用在兩個插入位點中可顯著降低貨品的成本且呈現優於僅表現一種抗原成分之載體的明顯優勢。 實例6：使用新穎之 p455 及 p430 啟動子之 rCAV-2 載體疫苗 方法 AI-ST 2015 細胞用以下 rCAV-2 感染 ：
1.CAV-2 CMVie BRSV (抗CAV2之陽性對照物；抗VP2之陰性對照物) 2.CAV-2 p430 CPV VP2 (Despliced A1-2-1) 3.CAV-2 p430 CPV VP2 (Gen 0.95 D1-5-1) 4.CAV-2 p455 CPV VP2 (Gen0.95 E1-8-1) 5.CAV-2 p430 RabG (n) 6.CAV-2 p455 RabG (n)免疫螢光分析 (IFA)
AI-ST 2015細胞在感染後72小時用Cytofix/Cytoperm固定且用抗CPV VP2-FITC (mAb)、抗RabG-FITC (mAb)及抗CAV-2-FITC (豬抗血清) (VMRD)染色。流式細胞測量術 (FC)
AI-ST 2015細胞在感染後48及72小時用Cytofix/Cytoperm固定且細胞用抗CAV-2-FITC、抗CPV VP2-FITC (VMRD)、對抗CPV之豬高免疫血清(Benchmark)及抗RabG-FITC (Novus)染色。CPV VP2 之 點漬墨法
來自經感染之E1B MDCK (針對rCAV-2)細胞之澄清(6000 × g，5 min)組織培養物清液層/溶解物(冷凍/融化)用PBS連續稀釋，隨後添加至設備中且經由抽吸吸附至PVDF。後續步驟為暴露於含5.0% BioRad墨點級阻斷劑之TBST 30分鐘，暴露於1°抗體1.0小時，三次TBST洗滌及暴露於過氧化物酶結合之2°抗體(抗小鼠及抗豬，Jackson ImmunoResearch) 1.0小時且經由TMB觀測。對於定量，使用ImageJ軟體(Burger, W., Burge, M.J. (編), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York)分析點漬墨。將圖像顏色反轉以減去所記錄之各點的背景及積分密度。值如下分配+及-標示：「++++」 = ＞800000，「+++」 = 500000至800000，「++」 = 300000至499999，「+」 = 120000至299999，「+/-」 = 80000至119999及「-」 = ＜80000。CAV-2 VP2 構築體 ：
藉由經rCAV-2疫苗病毒感染之細胞產生病毒樣顆粒(VLP)可為犬腺病毒(CAV-2)疫苗功效之關鍵因素。雖然可救援含有CMVie驅動之CPV VP2表現卡匣的rCAV-2，但使用習知CMVie啟動子無法在經rCAV-2 CMVie CPV VP2感染之細胞中實現大量VP2表現(用於產生VLP)。無法救援含有CMV5啟動子之rCAV-2 VP2病毒。 採用IFA、流式細胞測量術及點漬墨法評定經rCAV-2感染之AI-ST 2015細胞中EHV-4啟動子驅動之CPV VP2表現。用與CAV-2 FITC結合之豬多株抗體(VMRD)探測CAV-2蛋白質表現。用小鼠單株(VMRD)及豬高免疫血清(Benchmark)探測CPV VP2蛋白質表現。CAV-2及CPV VP2蛋白質易於藉由IFA觀測且藉由FC在相當大比例的經攜帶CPV VP2之兩種不同核苷酸變體(Despl及Gen0.95，在感染後48及72小時)之rCAV-2感染之AI-ST 2015細胞中偵測到。藉由點漬墨法在組織培養物清液層/溶解物(在冷凍/融化後)中鑑別出大量CPV VP2蛋白質(且極有可能反映組裝的VLP的存在)。 在經感染之AI-ST 2015細胞中易於藉由IFA偵測到CPV VP2表現(參見圖19A)。在小於3%之經原始rCAV-2 CMVie CPV VP2感染之細胞中偵測到CPV VP2表現(參見圖15)。因此，救援攜帶由新穎之源於EHV4之啟動子p430及p455驅動的CPV VP2表現卡匣的rCAV-2且測試以確定其是否可能有效驅動CPV VP2在經感染細胞中之表現。出人意料地，在14%至36%之經感染細胞中偵測到CPV VP2表現(參見圖16)。另外，與原始rCAV-2 CMVie CPV VP2 (其中點漬墨法分析展示CMVie驅動之CPV VP2信號處於或低於背景水準 - 與來自經CAV-2、rCAV-2 CMVie BRSV F感染之細胞的清液層/溶解物及來自未感染細胞之細胞培養物清液層/溶解物相當 - 資料未展示)相比，在來自經感染之AI-ST 2015細胞之清液層/溶解物中偵測到大量CPV VP2 (參見圖17)。圖17展示VP2蛋白質可在清液層中識別到且因此預期呈所需構形(VLP)以具有免疫原性。重要的是，當CAG或CMV5啟動子序列存在於位於E3區中之表現卡匣中時，未實現重組CAV-2之救援。其似乎具有序列特異性，因為表現卡匣之尺寸尚未超過所觀察到實驗基因組尺寸限制。因此，本發明之新穎之源於EHV-4之啟動子序列，諸如p430及p455，不僅有助於轉殖基因表現，且亦支持病毒救援之關鍵步驟。 總之，IFA、FC及點漬墨法證明在經感染之AI ST 2015細胞中，穩固EHV-4啟動子驅動由rCAV-2表現CPV VP2轉殖基因。此等結果證實EHV-4啟動子在除EHV-1以外之載體中的效用。rCAV-2 RabG (n) 構築體：
使用本發明之新穎之源於EHV-4之p455啟動子生成第二CAV-2構築體。選擇rCAV-2 RabG(n)是因為使用習知CMVie啟動子未觀察到經感染細胞之表現。 此實驗之目標為藉由量測經rCAV-2 p455 RabG (n)感染之AI-ST 2015細胞中EHV-4啟動子驅動之RabG蛋白質表現來證實在rCAV-2具有第二轉殖基因RabG (膜蛋白)之情形下新穎之EHV-4啟動子的活性。 採用IFA及流式細胞測量術評定經rCAV-2感染之AI-ST 2015細胞中EHV-4啟動子驅動之RabG表現。用與CAV-2 FITC結合之豬多株抗體(VMRD)探測CAV-2蛋白質表現。用小鼠單株抗體(Novus)探測RabG蛋白質表現。CAV-2及RabG蛋白質易於藉由IFA觀測且藉由FC在經攜帶RabG (n)之rCAV-2感染之AI-ST 2015細胞中偵測到(在感染後72小時)。 因此：雖然RabG易於在經rCAV-2 p455 RabG感染之細胞中偵測到(參見圖19B及C)，但在＜2.0%之經原始rCAV-2 CMVie RabG感染之細胞中偵測到表現(參見圖18)。在經具有不相關轉殖基因之rCAV-2感染之細胞中發現極少乃至無信號(參見圖19B，CPV VP2，其與抗RabG抗體不相關)。如雙重染色之圖19C中所見，許多CAV-2陽性細胞亦為RabG陽性。 總之，IFA及FC資料證明EHV-4啟動子驅動經感染之AI ST細胞藉由rCAV-2表現RabG轉殖基因。此等結果進一步證實本發明之EHV-4啟動子在除EHV-1以外之載體中的效用。 實例7：豬之單價 EHV-1 載體 A 型流感病毒疫苗 (H3 疫苗 ) 之產生、活體外表徵及活體內測試
選擇血清型H3之豬IAV流感病毒血球凝集素(SEQ ID NO 27) (A/豬/義大利/7680/2001(H3N2)，Genbank寄存編號：ABS50302.2)作為待測試抗原用於豬之疫苗接種研究。此種對抗豬IAV之新疫苗提供DIVA特徵，例如藉由在經豬IAV野毒株感染之動物中而非在僅經本文所述之疫苗接種之動物中偵測對抗豬IAV蛋白質NP或NA之抗體，因為其僅表現一種豬IAV HA蛋白質。合成其編碼序列且次選殖以產生轉移載體pU70-p455-H3-71K71，將H3置於新穎之p455啟動子及新穎之71pA聚腺苷酸化信號控制下且使卡匣與插入至orf70中之重組區成框(圖1及5)。 藉由使用RED重組系統順道誘變，將表現卡匣p455-H3-71插入於pRacH-SE之orf70中以產生pRacH-SE70-p455-H3。 PK/WRL細胞用pRacH-SE70-p455-H3轉染，救援重組病毒rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3且進行空斑純化兩次。(圖6)。 表現卡匣之正確插入係藉由定序插入區之高保真度PCR產物來驗證。轉殖基因在經感染細胞中之表現係使用市售單株及多株抗體藉由間接免疫螢光分析(IFA，圖7)及西方墨點法(圖8)來分析。 使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)藉由IFA (未展示)及西方墨點法(圖8)確認編碼EHV-1 gpII之orf71的修復。經感染細胞之質膜上H3三聚體之出現係藉由使用雞紅血球之血球吸附測試(未展示)來分析。在PK/WRL細胞中以TCID50
/ml形式確定的峰效價與親本病毒RacH-SE在相同的範圍內，其表明轉殖基因表現對病毒複製無不利效應(未展示)。此係藉由在救援後rEHV-1 RacH-SE70-p455-H3在PK/WRL細胞中繼代直至第20代(P20)來證實。在P5、P10、P15及P20藉由滴定、定序及西方墨點法(圖8)，在P10及P20另外藉由IFA表徵病毒，且確認HA編碼插入物連同啟動子及聚腺苷酸序列之HA表現及基因穩定性。 圖8中所示之兩種墨點為用特異性偵測EHV-1糖蛋白II (gpII)之單株抗體Ai2G7 (左)或用來自飼養兔之對抗流感血球凝集素亞型H3之商業多株抗體(PA5-34930) (右)培育的複本。正如所預期，在所有經重組EHV-1感染之細胞培養物中偵測到gpII。正如所預期，在所有經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之不同繼代感染之細胞中偵測到全長H3。H3抗血清之特異性亦藉由用其他表現來自H1亞型病毒之流感血球凝集素之重組EHV-1 RacH-SE感染之細胞的西方墨點來展示，圖14。 藉由使用單株抗H3抗體及馬抗EHV抗血清在經P20感染之細胞中的病毒空斑雙重免疫螢光分析(dIFA)，證實幾乎所有誘生空斑之EHV-1亦表現H3 (未展示)。所有測試均證實重組EHV-1 RacH-SE-70-p455-H3之穩定性。 為研究作為載體疫苗在豬崽中之特性，在疫苗接種-攻擊研究中測試rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3。詳言之，無對抗豬IAV之母系來源免疫性(無母本抗體)之豬崽在兩週齡及五週齡(二次注射接種，2× EHV-1)或僅在五週齡(一次注射接種，1× EHV-1)肌肉內經劑量為1×10^7 TCID50之RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次。未經疫苗接種之組充當陰性對照物且根據製造商說明書(除疫苗接種時間點之外)在兩週齡及五週齡經市售失活豬IAV疫苗疫苗接種之一組動物充當陽性對照物(殺死)。在8週齡，除陰性對照物外之所有動物受氣管內施用之1×10^7 TCID50劑量之H3N2豬IAV攻擊病毒株(歐洲野生病毒分離株R452-14，其H3與RacH-SE-70-p455-H3中所用之H3疫苗抗原異源)攻擊。未經疫苗接種且未經攻擊之動物充當陰性對照物，而未經疫苗接種但經攻擊之動物充當攻擊對照物。在疫苗接種時及疫苗接種後以及在攻擊之前及之後，測量體溫且在不同時間點獲取血液樣品。在攻擊後一天，殺死每組一半的動物且針對豬IAV感染之典型病變對肺進行評分，每隻動物分別取出每一左肺及右肺三個肺樣品以確定肺勻漿中之感染性豬IAV效價，且對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行取樣。在攻擊後三天對每組剩餘的一半動物執行相同程序。 當研究豬IAV攻擊病毒施用後之體溫升高時，未經疫苗接種之動物在攻擊後1天顯示體溫升高約1℃。對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之組，在攻擊後1天之此體溫升高得以避免(圖20)。 在豬IAV攻擊病毒施用後1或3天殺死之動物之肺得分的評定揭露陰性對照物未顯示豬IAV感染之典型肺病變，攻擊對照物顯示在6-7%之平均範圍之肺病變，而關於組平均值，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之組的肺病變得分劇烈降低至1至小於4%(圖21)。 在豬IAV攻擊病毒施用後1或3天殺死之動物的平均豬IAV肺效價顯示陰性對照物在肺樣品中未顯示豬IAV，而攻擊對照物顯示每g肺組織之病毒效價在大於5 (第3天)至大於7 log (第1天)範圍內。形成鮮明對比的是，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之組的組平均值劇烈降低至約2 log或更小，且經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之組降低至不可偵測之水準(圖22)。 當在疫苗接種後測試豬IAV中和抗體之誘導時，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之動物的血清在第一次疫苗接種後三週顯示在約160範圍內之倒數中和效價，且經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之動物的血清在第2次疫苗接種後三週顯示約2560之中和效價，而未經疫苗接種之組的血清不具有可偵測之豬IAV中和抗體水準(圖22)。 當在豬IAV攻擊後1或3天測定動物之BALF中促炎性細胞介素IL-1β之量時，在第1天測試之四隻動物中之三隻可偵測到大於100 pg/ml直至900 pg/ml之IL-1β水準，而對於經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之動物的BALF，此等水準降低至100-300 pg/ml IL-1β，且所有經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之動物的水準甚至進一步降低至0至小於100 pg/ml IL-1β (圖23)。此顯示經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種已有效預防在豬IAV感染後誘導促炎性細胞介素IL-1β。 當測試在研究第28天取樣之外周血液單核細胞(PBMC)之再刺激且使用不同刺激物時，刺激來自未經疫苗接種之動物之PBMC在IFNγ-ELISpot中顯示小於75/1×10^6個計數，與所用刺激無關(圖24 A)。已接受失活疫苗兩次之動物(殺死)的PBMC在用重組豬IAV核蛋白NP再刺激時顯示約150/1×10^6個計數且在用豬IAV H3N2攻擊病毒株R452-14再刺激時在IFNγ-ELISpot中顯示約3000/1×10^6個計數，但當使用重組豬IAV HA或EHV-1病毒時不顯示PBMC之再刺激(75/1×10^6個計數或更低之水準)(圖24 B)。相比之下，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次或兩次之動物在用豬IAV H3N2攻擊病毒株R452-14再刺激時亦在IFNγ-ELISpot中顯示約200 (1× EHV-1)至300 (2× EHV-1)/1×10^6個計數，但當使用重組豬IAV NP時無PBMC再刺激(75/1×10^6個計數或更低之水準)(圖24 C及D)。當EHV-1病毒用於再刺激時，經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次或兩次之動物在用空EHV-1疫苗RacH-SE再刺激時在IFNγ-ELISpot中顯示約300/1×10^6個計數，且當分別使用表現豬IAV H3之RacH-SE-70-p455-H3疫苗時，此值進一步增加至大於400/1×10^6個計數(圖24 C及D)。因此，當重組豬IAV HA用於再刺激時，僅經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次或兩次之動物在IFNγ-ELISpot中顯示約100-150 (1×EHV-1)至150-200 (2× EHV-1)/1×10^6個計數(圖24 C及D)。 實例8豬之四價 EHV-1 載體 A 型流感病毒疫苗之產生、活體外表徵及活體內測試
如下所述，在所述發明中，如所述來源於H1N2、H3N2、H1N1禽類及H1N1流行性豬IAV亞型/血清型之四種豬IAV血球凝集素(HA)抗原係由兩種重組EHV-1載體病毒表現。此種對抗豬IAV之新四價疫苗提供DIVA特徵，例如藉由在經豬IAV野毒株感染之動物中而非在僅經本文所述之疫苗接種之動物中偵測對抗豬IAV蛋白質NP或NA之抗體，因為其僅表現豬IAV HA蛋白質。 新四價豬IAV疫苗活體外表徵且活體內測試其對抗豬IAV之功效。 新鑑別之p430啟動子用於驅動豬IAV H1N1 ((A/豬/Gent/132/2005(H1N1)，Genbank寄存編號AFR76623.1)之表現。由於此病毒分離株中之血球凝集素基因來源於禽類IAV，故其將稱為H1av。合成H1av且次選殖於orf1/3插入區之轉移載體中以生成pU1/3-p430-H1av-BGHKBGH。將H1av之表現置於p430啟動子及牛生長激素(BGH)聚腺苷酸信號之控制下且與插入至orf1/3中之重組區成框(圖10)。 藉由使用RED重組系統順道誘變，將表現卡匣p430-H1av-BGH插入於pRacH-SE之orf1/3中以產生pRacH-SE1/3-p430-H1av)。PK/WRL細胞用pRacH-SE1/3-p430-H1av轉染，救援重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av 圖11且進行空斑純化兩次。表現卡匣之正確插入係藉由定序插入區之高保真度PCR產物來驗證。轉殖基因在經感染細胞中之表現係使用市售單株及多株抗體藉由間接免疫螢光分析(IFA)及西方墨點法來分析(圖12)。使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)藉由IFA及西方墨點法確認編碼EHV-1 gpII之orf71的修復(未展示)。藉由使用雞紅血球之血球吸附測試(未展示)分析H1av之正確加工及轉運以及在經感染細胞之質膜中的定位。在PK/WRL細胞中以TCID50
/ml形式確定的峰效價與親本病毒RacH-SE在相同的範圍內，其表明轉殖基因表現對病毒複製無不利效應(未展示)。 由抗體PA-34929在75 kDa遷移之寬帶的特異性偵測與由序列所預測之重組HA糖蛋白的預期外觀一致。細胞膜用單株抗體C102之表觀染色與所預期之亞細胞定位一致。 為測試所表現之重組血球凝集素是否如所預期般的加工及轉運，VERO細胞經感染倍率為0.01之rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av、rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3、rEHV-1 RacH-SE (親本)感染或保持未感染。24 h p.i.經感染及未感染之活細胞用雞紅血球於PBS中之懸浮液培育，用PBS洗滌且用螢光Hoechst 33342細胞核染色劑染色。由於鳥類紅血球含有細胞核，故其可用Hoechst33342染色且藉由螢光顯微鏡呈現為微小藍色斑點，與經不表現血球凝集素之rEHV-1 RacH-SE感染的細胞相比，經rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av或rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染之細胞上雞紅血球的吸附量顯著增加(未展示)。由此可推斷，血球凝集素以如同其係由真正的流感病毒複製產生般的方式轉譯、加工及轉運至經載體病毒感染之細胞的質膜。經感染細胞之血球吸附的表型支持西方墨點法及免疫螢光分析之發現(關於H1av，圖12)，顯示轉殖基因蛋白質之高效表現且表明在經EHV-1載體感染之細胞的細胞表面上形成功能性HA三聚體。 藉由用單插入病毒rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3及rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染之經感染細胞的西方墨點驗證多株商業抗體對H3 (PA5-34930)及H1 (PA5-34929)之特異性及缺乏交叉反應性(未展示)。 接著，生成表現兩種不同A型流感病毒亞型/血清型之兩種不同血球凝集素的重組EHV-1 RacH-SE。 以重組BAC pRacH-SE-70-p455-H3起始，藉由兩步RED重組將在轉移載體pU1/3-p430-H1av-BGH_K_BGH (圖10)中組裝之表現卡匣p430-H1av-BGH插入至orf1/3插入位點中以產生pRacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3。PK/WRL細胞用pRacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3轉染，救援重組病毒rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av-70-p455-H3且進行空斑純化兩次。此重組病毒之簡稱為rEHV-1 RacH-SE_B
(圖13)。表現卡匣之正確插入係藉由定序插入區連同側接序列之高保真度PCR產物來驗證。 轉殖基因在經感染細胞中之表現係使用市售單株及多株抗體藉由間接免疫螢光分析(IFA，未展示)及西方墨點法來分析(圖14)。編碼EHV-1 gpII之orf71的修復係使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)藉由IFA (未展示)及西方墨點法來確認(圖14)。 轉殖基因H3及H1av在經雙插入重組rEHV-1 RacH-SE_B感染之細胞培養物中並行表現。轉殖基因表現為穩定的且未削弱測試的病毒效價，直至PK/WRL細胞中之第11代。 已顯示具有兩個插入位點及兩個新穎之啟動子的增強型EHV-1載體並行表現兩種流感病毒血球凝集素。如藉由IFA所測定之亞細胞定位及如藉由西方墨點法所測定之SDS-PAGE中的遷移率對應於自文獻已知的經A型流感病毒感染之細胞中表現的真正的血球凝集素。 接著，生成表現血球凝集素H1hu, SEQ ID NO:29, (A/豬/義大利/4675/2003(H1N2)；GenBank寄存編號ADK98476.1)及H1pdm, SEQ ID NO:26, (A/豬/義大利/116114/2010(H1N2)；GenBank寄存編號ADR01746.1)之第二雙插入rEHV-1 RacH。 合成H1hu之編碼序列且次選殖於orf1/3插入區之轉移載體中以產生pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH。將H1hu之表現置於p430啟動子及牛生長激素(BGH)聚腺苷酸信號之控制下且與插入至orf1/3中之重組區成框(圖25)。 合成H1pdm之編碼序列且次選殖以產生轉移載體pU70-p455-H1pdm-71K71，將H1pdm置於新穎之p455啟動子及新穎之71pA聚腺苷酸化信號控制下且使卡匣與插入至orf70中之重組區成框(圖26)。 隨後，藉由使用RED重組系統順道誘變將表現卡匣p430-H1av-BGH及p455-H1pdm-71插入至pRacH-SE中，首先生成pRacH-SE-1/3-p430-H1hu。使用此經修飾之BAC作為靶標，藉由使用RED重組系統順道誘變插入p455-H1pdm-71，生成pRacH-SE-1/3-p430- H1hu-70-p455-H1pdm。將pRacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm轉染於PK/WRL細胞中，救援rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu -70-p455-H1pdm且進行空斑純化三次。新穎之重組載體病毒之簡稱為rEHV-1 RacH-SE_D
(圖27)。 轉殖基因在經感染細胞中之表現係使用市售單株及多株抗體藉由間接免疫螢光分析(IFA，未示出)及西方墨點法來分析(圖25)。編碼EHV-1 gpII之orf71的修復係使用單株抗體Ai2G7 (由BI擁有)藉由IFA (未展示)及西方墨點法來確認(圖28)。 重組rEHV-1之基因穩定性及表型穩定性係藉由在細胞培養物中繼代，每5代確定病毒效價來展示。每十代確認插入區之序列以及藉由西方墨點法確認轉殖基因表現(未展示)。表現保真度係藉由在甲基纖維素覆蓋下空斑之雙重IFA，計數用抗EHV抗體及轉殖基因特異性抗體染色之空斑來評定(未展示)。 為研究作為載體疫苗在豬崽中之特性，在疫苗接種-攻擊研究中測試由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗。詳言之，具有對抗豬IAV之母系來源免疫性(母本抗體陽性)之豬崽在一週齡及四週齡(二次注射接種，2× EHV-1)或僅在四週齡(一次注射接種，1× EHV-1)肌肉內經劑量為每一疫苗病毒株1×10^7 TCID50之rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D疫苗接種兩次。未經疫苗接種之組充當陰性對照物。在11週齡，除陰性對照物外之所有動物受氣管內施用之1×10^6 TCID50劑量之H3N2豬IAV攻擊病毒株(歐洲野生病毒分離株R452-14，其H3與rEHV-1 RacH-SE_B中所用之H3疫苗抗原異源)攻擊。未經疫苗接種且未經攻擊之動物充當陰性對照物，而未經疫苗接種但經攻擊之動物充當攻擊對照物。在疫苗接種時及疫苗接種後以及在攻擊之前及之後，測量體溫且在不同時間點獲取血液樣品。在攻擊後一天，殺死每組一半的動物且針對豬IAV感染之典型病變對肺進行評分，每隻動物分別取出每一左肺及右肺三個肺樣品以確定肺勻漿中之感染性豬IAV效價，且對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行取樣。在攻擊後三天對每組剩餘的一半動物執行相同程序。分析樣品材料及收集的資料以尤其確定攻擊後的體溫變化、豬IAV感染後的臨床徵象、肺得分、豬IAV肺效價、肺組織的組織學變化、豬IAV血清中和效價、BALF中之細胞介素水準、如藉由IFNγ-ELISpot所量測之PBMC再刺激及B細胞活化。 實例9 在經二價rEHV-1 RacH疫苗接種之小鼠中誘導對抗兩種抗原之中和抗體反應 將rEHV-1 RacH SE B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-7-p455-H3，參見圖13)用於Balb/c小鼠之免疫以證明所表現之轉殖基因在除豬之外的另一物種中具有免疫原性，且藉由鼻內施用誘導對抗兩種抗原中之任一者的中和抗體。 詳言之，將三組每組五隻3-5週齡Balb/c小鼠在研究第0天及第21天分別鼻內接種以40 µl rEHV-1 RacH SE B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-430-H1av-7-455-H3，第1組)或40 µl空載體(rEHV-1 RacH-SE，第2組，載體對照物)或40 µl組織培養基(第3組陰性對照物)。對於第1組及第2組，感染性重組EHV-1劑量分別為1× 10^5 TCID50/40 µl。在研究第0天(在第1次接種前)、第7天、第14天、第21天(在第2次接種前)、第28天及第35天對小鼠進行抽血。由血液樣品製備血清且在-80℃下冷凍儲存。用於偵測對抗載體病毒之抗體的免疫螢光分析
在0.001之感染倍率(MOI)下，用自空載體BAC pRacH-SE1.2救援之病毒rEHV-1 RacH-SE1212感染AI-ST細胞。感染後24小時觀察到獨特空斑且加工細胞以用於間接免疫螢光分析(IFA)。測試以1:50稀釋於PBS中之全部三組最終血液(在第二次疫苗接種後14天獲得)之血清。作為陽性對照物，來自經EHV-1接種之馬的血清以1:500之稀釋度使用。二級抗體為市售FITC結合之兔抗小鼠IgG用於小鼠血清及Cy5結合之山羊抗馬IgG用於馬血清且以1:200稀釋度使用。藉由螢光顯微鏡評估抗體結合。所有經疫苗接種之小鼠已產生在IFA中與經rEHV-1 RacH-SE感染之細胞反應的抗體。未感染之細胞未與測試血清中之任一者結合。來自陰性對照組小鼠之血清既未對經感染之細胞亦未對未感染之細胞顯示任何特異性結合。資料彙總於下表中。 表3.關於抗EHV-1抗體之IFA的螢光顯微術結果 
由此可推斷，rEHV-1接種至小鼠鼻孔中引起感染及病毒複製，以便刺激小鼠免疫系統以產生抗EHV-1抗體。病毒中和測試 (VNT)
為顯示對抗所表現之來源於A型流感病毒(IAV) (A/豬/義大利/7680/2001(H3N2))或(A/豬/Gent/132/2005(H1N1))之轉殖基因之保護性免疫的誘導，測試小鼠血清對抗各個病毒之中和活性(Allwinn等人 2010；Trombetta等人 2014)。用於中和測試之IAV為2014年來自德國的豬的分離株，具體而言A/豬/德國/AR452/2014 (H3N2)及A/豬/德國/AR1181/2014 (H1N1)。由於此等病毒株與疫苗靶標所來源之病毒株為異源的，故此等病毒藉由小鼠血清之任何中和將表明藉由rEHV-1疫苗接種對保護性免疫之廣泛且有效的誘導。使用已顯示流感病毒抗體陰性之豬血清作為陰性對照血清。A 型流感病毒中和測試 ：
用於病毒中和以及在96孔培養盤中反滴定之MDCK細胞在使用之前在37℃/5% CO2
下培育兩天。將相應IAV儲備液H3N2及H1avN1在冰上融化且在含有健大黴素(Gentamycin)及雙倍濃度之胰蛋白酶的MEM (MEM/Genta/2× 胰蛋白酶)中稀釋。 測試的血清來自第1組(rEHV-1 RacH SEB
)、第2組(空載體)、陽性對照組(經失活多價IAV疫苗接種之豬的血清及陰性對照組的最終血液。 將血清加熱失活且分別在兩個及三個獨立測試中，以1:16開始連續1:2稀釋直至1:4096。IAV稀釋至約100 TCID50/中和反應。中和反應物在37℃、5% CO2
下培育2小時。一式四份地對所用病毒進行反滴定。移除生長培養基且用含有健大黴素及胰蛋白酶之培養基洗滌MDCK細胞，隨後添加中和反應物或反滴定之病毒稀釋液。在將中和反應物或病毒稀釋液添加至MDCK細胞後，VNT及滴定盤分別在37℃/5% CO2下培育1小時。此後，移除接種體且用含有健大黴素及胰蛋白酶之新鮮培養基覆蓋細胞。感染後五天，監測及記錄CPE。測試中實際使用之病毒效價根據Reed及Münch以TCID50/ml形式計算，且報導測試血清預防流感病毒誘導典型CPE的稀釋度，參見下表。 表4：流感H1avN1 VNT結果 
表5：流感H3N2 VNT結果 
為比較獨立測試之結果，藉由將倒數血清稀釋度與由其中和之相應效價相乘來計算中和能力。三個測試之平均值隨後除以100以反映100 TCID50之中和(表3、4及5)。資料彙總且圖解展示於圖29中。 經rEHV-1 RacH SEB
疫苗接種之所有小鼠已產生對抗相應IAV (亞型H3N2及H1avN1之異源病毒株)之中和抗體。因此，兩倍鼻內施用自p455啟動子(H3)控制下之orf70插入位點及並行地自p430啟動子(H1av)控制下之orf1/3插入位點表現IAV之血球凝集素的rEHV-1 RacH-SE成功地刺激BALB/c小鼠之保護性免疫反應。 可得出結論，載體rEHV-1 RacH-SE可用於在鼻內疫苗接種後並行表現兩種不同轉殖基因以刺激免疫反應。 實例10牛之 EHV-1 載體化 施馬倫貝格 (SBV) 病毒疫苗之產生、活體外表徵及活體內測試
一種新出現的崩芽病毒(bunyavirus)為施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)，其為第一種歐洲辛波血清群(Simbu serogroup)病毒(正布尼亞病毒屬(genusOrthobunyavirus
))，當懷孕的動物在妊娠的關鍵階段感染時，可能導致流產、死產及嚴重的胎兒畸形，且其現在愈來愈多地用作研究正布尼亞病毒之模型病毒(Bilk等人,2012)。由於辛波病毒藉由昆蟲媒介傳播且無可用的治療選擇方案，故疫苗接種為疾病控制的主要組成部分。對抗SBV及其他辛波病毒(諸如赤羽病毒(Akabane virus，AKAV)或艾羅病毒(Aino virus))之失活全病毒疫苗為可用的，且已開發對抗SBV之活減毒疫苗(Anonymous, 2013, 2015；Kraatz等人, 2015；Wernike等人, 2013b)，然而，此等疫苗中無一者允許區分野外感染及經疫苗接種之動物(DIVA原則)。直到最近才在致死性小動物攻擊模型及牛中測試基於來自SBV糖蛋白Gc之胺基端的234個胺基酸(aa)的DIVA相容性次單位疫苗(Wernike等人, 2017)。當作為表現質體遞送或在哺乳動物細胞培養系統中表現時，Gc結構域在至多66%之動物中賦予保護，而經連接於相關AKAV之相應結構域之SBV的Gc結構域免疫的所有動物均受完全保護(Wernike等人, 2017)。為研究rEHV-1 RacH-SE作為載體疫苗在牛中之應用，將SBV-Gc之234個胺基端aa插入至orf70(US4)插入位點中且在新穎之p455啟動子及71pA聚腺苷酸信號控制下表現並在牛中的疫苗接種-攻擊試驗中進行測試。表現源於 施馬倫貝格 病毒 (SBV) 糖蛋白 c (Gc) 之抗原之重組 EHV-1 的產生
施馬倫貝格病毒(SBV)糖蛋白c (Gc)之編碼區的234個胺基酸部分經密碼子使用最佳化以便在EHV-1中表現，且另外經修飾以實現有效轉運及插入至經感染細胞之質膜中。為此，將來源於A型流感病毒(IAV)血球凝集素(HA)亞型H1N2 (A/豬/義大利/116114/2010 (H1N2)，Genbank寄存編號ADR01746.1)之信號肽編碼序列以及來自HA之跨膜錨(TM)及細胞質C端分別附接至5'及3'端。另外，將GS連接子HMGGSGGGGSGGGGSGGGT (SEQ ID NO:30)插入於Gc部分與HA-TM結構域之間。合成DNA (SEQ ID NO:31)且次選殖於pU70-455-71K71之NotI/KpnI位點中，pU70-455-71K71為藉由RED介導之BAC pRacH-SE重組將轉殖基因表現卡匣插入至EHV-1之orf70 (US4)中的轉移載體。所得質體pU70-455-SBVGc_71K71 (圖30)用XbaI切割以釋放3056 bp DNA片段(SEQ ID NO:32)，將其轉型至攜帶pRacH-SE之大腸桿菌K12 GS1783中。 SEQ ID NO:31：包括用於次選殖之限制性位點的合成DNA序列
SEQ ID NO:32：用於RED重組以產生pRacH-SE-70-455-SBVGc之DNA片段 藉由星號(*)指示限制酶裂解位置
製備重組pRacH-SE-70-455-SBVGc DNA且藉由使用HerculaseTM
之高保真度PCR及PCR產物之Sanger定序確認表現卡匣之正確插入及序列一致性。所用引子參見表6，SEQ ID NO: 33至SEQ ID NO:37。 表6：用於PCR及定序之引子 
重組 EHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc 之 救援及表徵
BAC DNA係由pRacH-SE-70-455-SBVGc之四個不同純系製備。將AI-ST細胞(Boehringer-Ingelheim專有的豬睪丸細胞株)以105
個細胞/孔之密度接種於6孔培養盤(Corning Incorporated - Life Sciences, One Becton Circle, Durham, NC 27712, USA; REF 353046)之含有10% FBS (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany, SAFC, Cat 12003C-1000ml)之MEM (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany, SAFC62892-1000M3056)中。當細胞60-70%匯合時，通常次日，使用MirusTM
mRNA轉染套組(Mirus Bio LLC, 545 Science Drive, Madison, WI 53711 USA)根據供應商說明書用2 μg BAC DNA轉染細胞。簡言之，將200 μl OptimemTM
(Thermo Fisher Scientific)培養基添加至5 ml聚苯乙烯管中。添加DNA且混合。接著添加3 μl Boost試劑且藉由渦漩混合，隨後添加相同體積之轉染試劑且再次藉由渦漩混合。混合物在室溫下培育3分鐘且隨後直接逐滴添加至細胞培養物中。細胞在37℃/5% CO2
下培育五天。將細胞沖洗至培養基中且採集以便在-80℃下儲存。在MEM中製備救援病毒之1:10連續稀釋液且塗覆於6孔培養盤中匯合之AI-ST細胞單層上。在37℃/5% CO2
下吸附1小時後，移除接種體且用含有0.5% Methocel (Methyl cellulose Ph.Eur., Fluka 64632-500G)及5% FBS (MEM-Methocel)之半固體培養基覆蓋細胞。在37℃/5% CO2
下培育兩至三天(第1代)後，將距離相鄰空斑儘可能遠的個別空斑以10 μl之體積抽吸且接種於6孔培養盤中之新AI-ST細胞培養物中。培育經感染細胞兩至三天，直至觀察到大量CPE(第2代)。將細胞沖洗至培養基中且採集以便在-80℃下儲存。重複此空斑純化程序兩次。加工經三次空斑純化之病毒感染的AI-ST細胞以分別用於間接免疫螢光分析(IFA)或西方墨點法。 將由經感染細胞製備之病毒DNA用作使用HerculaseTM
之高保真度PCR的模板。藉由Sanger定序分析所獲得之PCR產物且確認具有理論序列之插入區與BAC之相應PCR產物序列的一致性。間接免疫螢光分析
用連續稀釋於MEM中之經三次空斑純化之病毒感染24孔培養盤(Corning Incorporated - Life Sciences, One Becton Circle, Durham, NC 27712, USA; REF 353047)中之AI-ST細胞。自細胞吸出生長培養基且用250 µL經稀釋之病毒(稀釋度10-2
至10-7
)覆蓋細胞。細胞在37℃/5% CO2
下培育1小時以吸附病毒，隨後移除接種體且用1000 µL MEM-Methocel/孔覆蓋細胞並在37℃/5% CO2
下培育兩天。當用顯微鏡觀察到空斑形成時，細胞經加工以用於IFA。抽吸培養基且用1 ml PBS (Gibco Life Technologies, Paisley PA49RF, UK, DPBS (1x) REF 14190-136) /孔洗滌細胞一次。移除PBS且藉由添加1毫升/孔-20℃冷的乙醇(Carl Roth GmbH, Schoemperlenstr. 3-5, D-76185 Karlsruhe, Art. Nr. 5054.1)固定細胞並在室溫下培育30分鐘。抽吸乙醇且風乾細胞。細胞在室溫下用1毫升/孔PBS復水10分鐘後，添加稀釋於PBS中之初級抗體(150微升/孔)且在室溫下培育1小時。移除初級抗體且用1 ml PBS/孔洗滌細胞三次，持續2分鐘，隨後添加二級抗體稀釋液(150微升/孔)。在室溫下避光培育1小時後，移除二級抗體稀釋液且用1 ml PBS/孔洗滌細胞三次，持續2分鐘，且最後用500 μl PBS/孔覆蓋以藉由螢光顯微鏡檢查。所用抗體列在表7中。 表7 
西方墨點法 1. 感染：6孔培養盤中三個孔之匯合的AI-ST細胞單層各藉由分別將50 μl及10 μl融化之病毒儲備液直接添加至生長培養基而用感染倍率約為1之rEHV-1 RacH-SE-455-SBVGc之兩種不同空斑分離株(#121.131 P6及#121.232 P6)及rEHV-1 RacH-SE1212 P9之空斑分離株(自親本空BAC pRacH-SE1.2救援)感染。三個孔保持未感染。培育經感染及未感染之細胞兩天且隨後加工用於西方墨點法。 2. 製備溶解物：補充有蛋白酶抑制劑混合液之RIPA緩衝液(RIPA+PI)製備如下：將0,7ml 10× RIPA溶解緩衝液Millipore目錄號20-188添加至6,3ml H2
0, Fisher Scientific目錄號BP2470-1中且將1錠劑Complete TM
微型蛋白酶抑制劑混合液(Roche目錄號11 836 153 001)溶解於7 ml 1×RIPA緩衝液中。 將未感染之對照物刮入培養基中且將來自三個重複孔之懸浮液彙集在15 ml離心管中並置於冰上。將經感染細胞沖洗入培養基中且將來自三個重複孔之懸浮液彙集在15 ml離心管中並置於冰上。藉由在4℃下以1000×g離心5分鐘使細胞沈降。小心地抽吸清液層且使細胞集結粒再懸浮於RIPA +PI中(未感染之細胞在300 μl中，經感染細胞在150 μl中)。懸浮液在冰上培育30分鐘且每10分鐘進行渦旋。將懸浮液轉移至1.5 ml微量離心管中且藉由在4℃下在微量離心機中以15000 rpm離心10分鐘而使未溶解的材料沈降。將澄清的清液層轉移至新的1.5 ml微量離心管中且儲存在-80℃下直至使用。 3. SDS-PAGE及在耐綸膜上轉移：材料 ：
BioRad Criterion TGX無染色劑預製凝膠，4-20%，26孔，目錄號_567-8095；Bio Rad Precision Plus雙色標記，目錄號161-0374；Bio Rad Precision Plus全藍標記，目錄號161-0373；Bio Rad Trans Blot Turbo轉移套組，Midi格式目錄號170-4159；Bio Rad 4× Laemmli樣品緩衝液(目錄號161-0747) (Bio Rad Laboratories GmbH, Heidemannstrasse 164, D-80939 München)；TGS操作緩衝液(Sambrook等人)，阻斷溶液1：含5% FBS之PBST (Sambrook等人)；PBST。在不添加還原劑之情況下製備樣品。樣品在冰上融化且與1體積之4× Lämmli緩衝液混合，在96℃下煮沸6分鐘且保持在室溫下直至凝膠裝載。凝膠在230 mA下操作30分鐘且隨後組裝以使用BioRad Trans Blot Turbo系統電轉移。轉移設定成2,5 A 25 V 10分鐘。膜在無菌蒸餾H2
O中沖洗且在4℃下用25 mL阻斷溶液含5% FBS之PBST培育30分鐘。抗體培育及偵測
材料：Immun-Star WesternC化學發光套組(Bio Rad Laboratories GmbH, Heidemannstrasse 164, D-80939 München)目錄號170-5070 初級抗體： A：SBV-Gc蛋白質特異性單株抗體(Wernike等人, 2015a) 1:20 B：針對EHV-1 gpII之小鼠單株抗體Ai2G7 (Boehringer Ingelheim專有) 二級抗體：過氧化物酶結合之山羊抗小鼠，(Jackson Immune Research #115-035-146) 1:5000 所有培育均在足夠的體積中在恆定攪動下進行。將抗體稀釋於5% FBS/TBST中。初級抗體在4℃下培育隔夜。移除抗體溶液且用TBST洗滌墨點三次，持續5-10分鐘。經稀釋之二級抗體與墨點一起在室溫下培育1小時，移除且用TBST洗滌墨點三次，持續5-10分鐘。將墨點置於透明的塑膠薄片保護器上。1 ml +1 ml混合過氧化物及Lumino/強化子溶液(各墨點總計2 ml)，用移液管移取於墨點上且培育3至5分鐘。此後，將膜置於ChemiDocXRS成像系統(Bio Rad Laboratories GmbH, Heidemannstrasse 164, D-80939 München)中且使用Image Lab軟體記錄信號。病毒滴定
在感染前一天，將AI-ST細胞以2×104
個細胞/孔接種於96孔盤(Corning Incorporated - Life Sciences, One Becton Circle, Durham, NC 27712, USA; REF 353072)之補充有10% FBS之MEM中。將病毒儲備液快速融化且置於冰上。在MEM中製備10個連續1:10稀釋液，每個稀釋液1.2 ml體積。將100微升/孔之病毒稀釋液添加至細胞，每個稀釋液一個垂直列的8個孔。各培養盤之垂直列11及12藉由添加100微升/孔MEM充當培養基對照物。一式三份地進行滴定且細胞在37℃/5% CO2
下培育5天。用顯微鏡檢查細胞培養物且記錄觀察到EHV-1 RacH典型CPE之孔。效價根據Reed及Muench (1938)之方法以TCID50/ml形式計算。 用於疫苗接種之重組EHV-1的表徵 藉由西方墨點法及雙重免疫螢光分析(DIFA)顯示經修飾之SBV Gc234在經感染細胞中之表現，用於rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc 121.232之空斑分離。使用多株馬抗EHV抗血清及單株抗SBV抗體之DIFA證實轉殖基因在明顯100%的經rEHV-1感染之細胞中的表現。當進行經rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232感染之細胞的DIFA時，用馬抗EHV抗血清(紫色)染色之EHV-1抗原陽性細胞亦結合針對SBV Gc之單株抗體。在非還原條件下進行的西方墨點法證實經修飾之SBVGc234在經重組EHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc感染之細胞中的表現。進行用針對SBV Gc之單株抗體或針對EHV-1 gpII之單株抗體探測經感染或未感染細胞之溶解物的西方墨點法。雖然EHV-1 gpII在所有經感染細胞中表現，但SBV Gc僅在經rEHV-1RacH-SE-70-455-SBVGc感染之細胞中，而不在經空載體rEHV-1 RacH-SE1212感染之細胞中表現。在模擬感染之細胞的溶解物中未偵測到病毒蛋白質。用對抗EHV-1之gpII的單株抗體培育平行墨點證實在轉染後救援重組病毒期間藉由自我切除程序修復orf71 (US5)。由經三次空斑純化之分離株rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232培養之P7病毒原液在AI-ST細胞中複製達到1.85×109
TCID50/ml之極高效價，表明轉殖基因之表現不會削弱此細胞株中之EHV複製。呈TCID50/ml形式之rEHV-1RacH-SE-70-455-SBVGc_121.232之六次滴定的平均值得到1.85×109
TCID50/ml，標準差為1.28×109
TCID50/ml。動物及實驗設計
4隻德國馴養品種之牛相隔三週經108
TCID50
rEHV-SBV-Gc疫苗接種兩次；另4隻牛保持作為未經疫苗接種之對照物。在第二次免疫後三週，所有動物皮下接種以2×0.5 ml僅在牛中繼代之SBV野毒株(Wernike等人, 2012)。在整個研究期間，每日量測直腸體溫且由獸醫檢查動物之臨床徵象。每隔一週採集血清且藉由市售基於N之ELISA (ID Screen®施馬倫貝格病毒競爭, ID vet, France)及藉由如先前所述之針對SBV分離株BH80/11之微量中和測試(Wernike等人, 2013a)來分析。藉由評定3天後之細胞病變效應進行評估；一式四份地測試所有樣品且根據Behrens及Kaerber以ND50
形式計算抗體效價。另外藉由針對EHV病毒株RacH (rEHV-SBV-Gc組及未經疫苗接種之對照動物)之微量中和測試分別分析在免疫日、攻擊感染日及研究結束時採集的血清。 在攻擊感染後的前10天，在每日基礎上另外採集血液樣品。使用King Fisher 96 Flex (Thermo Scientific, Braunschweig, Germany)與MagAttract Virus Mini M48套組(Qiagen, Hilden, Germany)之組合根據製造商說明書自此等樣品提取病毒RNA且藉由基於S區段之即時RT-PCR進行測試(Bilk等人, 2012)。 實驗方案已由可靠的國家倫理委員會審查且經主管部門(德國羅斯托克梅克倫堡-前波莫瑞州農業食品安全及漁業局(State Office for Agriculture, Food Safety and Fisheries of Mecklenburg-Vorpommern, Rostock, Germany)，參考LALLF M-VTSD/7221.3-1.1-004/12)批准。臨床觀測結果及病毒 RNA 偵測
在整個研究期間，無一隻動物顯示任何相關的SBV特異性臨床徵象且在直腸量測時，所有動物之體溫保持在正常範圍內。 自攻擊感染後第一天或第二天起，在各未經疫苗接種之對照動物的血清樣品中連續四天可偵測到病毒RNA。在整個採樣時段中，來自rEHV-SBV-Gc組之所有經疫苗接種之動物藉由定量RT-PCR顯示降低的病毒RNA濃度(圖31A)。在整個採樣時段中，rEHV-SBV-Gc組之兩隻動物藉由定量RT-PCR測試完全呈陰性(圖31A)。在經rEHV-SBV-Gc免疫之兩隻動物中，分別以降低的水準偵測到SBV基因組三天或五天。抗體反應
在未經疫苗接種之對照動物中，在攻擊感染之前，藉由血清中和測試未偵測到SBV特異性抗體。在感染後一或兩週，在所有未經疫苗接種之動物中偵測到高效價的中和抗體(圖31B)。 與未經疫苗接種之對照組相比，在經rEHV-SBV-Gc免疫之四頭牛的兩頭中，在攻擊感染當天可偵測到SBV特異性中和抗體。在此組剩餘的兩隻動物中，在攻擊感染之前未偵測到SBV特異性中和抗體，但在感染後兩週存在中和抗體(圖31B)。所有四隻經疫苗接種之動物中SBV特異性中和抗體的效價均低於攻擊對照物，表明攻擊病毒之病毒複製效率低，且因此支持定量RT-PCR資料。EHV 中和測試
在MEM中以1:5開始製備血清的兩倍稀釋液。將50 μl含有100 TCID50之SBV的MEM及50 μl稀釋的血清在96孔細胞培養盤中培育2小時。此後，添加100 μl新鮮製備的BHK細胞(在含有10%胎牛血清的MEM中)的懸浮液且培養盤在37℃/5% CO2
下培育3-4天。藉由光學顯微鏡評估細胞病變效應。所有血清均一式兩份地測試，且根據Behrens (個人通信)修改的Kaerber (1931)以ND50形式計算抗體效價。如圖32中所示之結果表明用rEHV-1 RacH-SE-70-455-SBVGc接種牛使得載體病毒的複製足夠有效以誘導特異性免疫反應。在四隻動物EHV-1中之一者中，在初次疫苗接種後三週可偵測到極低效價的中和抗體(1:4)。在兩次疫苗接種後，在第二次施用後三週，所有四頭牛均已產生效價為1:128之中和抗體。由此結果可推斷，EHV-1 RacH亦可具有作為牛之疫苗載體的功能。 實例11由 rEHV-1 RacH-SE_B 及 rEHV-1 RacH-SE_D 組成之四價豬 IAV 疫苗對抗豬崽中之豬 IAV H3N2 攻擊的功效
為研究在豬崽中作為載體化疫苗之特性，在第二項接種疫苗-攻擊研究中測試由rEHV-1 RacH-SE_B (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-p455-H3，參見圖13)及rEHV-1 RacH-SE_D (rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430- H1hu-70-p455-H1pdm，參見圖27)組成之四價豬IAV疫苗。 在此第二項研究中，來自未經疫苗接種之母豬且在第一次疫苗接種時藉由使用H3特異性ELISA (圖36)及藉由病毒中和測試(資料未展示)針對豬IAV特異性抗體測試呈血清學陰性之豬崽經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價疫苗接種兩次。動物分別在其生命第一週(研究第0天，SD0)第一次及在其生命第四週(研究第21天，SD21)第二次以每一疫苗株、動物及疫苗接種2 ml劑量中含1×10^7 TCID50之劑量分別肌肉內且隨後肌肉內(2×IM)、或首先鼻內且隨後肌肉內(IN+IM)、或兩次鼻內(2×IN)疫苗接種。未經疫苗接種之組充當陰性對照物且另一個未經疫苗接種之組充當攻擊對照物。在其生命第十一週(研究第69或70天，SD42/43)，除陰性對照物之外的所有動物均受2×10^7 TCID50之H3N2豬IAV攻擊病毒株(歐洲野生病毒分離株R452-14，其H3與rEHV-1 RacH-SE_B中所用H3疫苗抗原異源)的氣管內施用劑量攻擊。未經疫苗接種且未經攻擊之動物充當陰性對照物(neg. ctrl.)，而未經疫苗接種但經攻擊之動物充當攻擊對照物(chall. ctrl.)。在疫苗接種時及疫苗接種後以及在攻擊前，在不同時間點獲取血液樣品。 在攻擊後一天，殺死每組一半的動物且每隻動物分別獲取每個左肺及每個右肺三個肺樣品。隨後，測定每隻動物每克肺組織勻漿之感染性豬IAV效價作為每隻動物左肺及右肺的平均值，其各由彙集的每個左肺或右肺三個樣品之勻漿獲得且分別相對於左肺或右肺之三個樣品的總重量標準化。在攻擊後三天對每組剩餘的一半動物執行相同程序。對於所有疫苗接種組，自該組中之個別動物在攻擊後第一天(CH+1)獲取之樣品所獲得的感染性豬IAV效價的中值在與攻擊對照組相比時統計學上顯著降低，而來自陰性對照組之所有動物均未在其肺勻漿中顯示感染性豬IAV病毒效價(圖33)。此外，對於所有疫苗接種組，自該組中之個別動物在攻擊後第3天(CH+3)獲取之樣品所獲得的感染性豬IAV效價的中值在與攻擊對照組相比時統計學上顯著降低，而來自陰性對照組之所有動物均未在其肺勻漿中顯示感染性豬IAV病毒效價(圖34)。因此，經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗疫苗接種分別統計學上顯著降低豬崽在用異源豬IAV H3N2病毒株攻擊後一天及三天的豬IAV肺負荷。因此，本文所述之疫苗有效對抗豬體內之豬IAV。 此外，在研究第0天(SD0，在第一次疫苗接種前)、在研究第21天(SD21，在第二次接種疫苗前)及在研究第42或43天(SD42/43，在施用攻擊材料前)取自於研究動物之血清係藉由對針對重組表現之豬IAV H3抗原的免疫球蛋白G (IgG)具有特異性的酶聯免疫吸附分析(ELISA)來分析，該重組表現之豬IAV H3抗原與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源。雖然來自陰性對照組之血清的平均OD值僅給出所有量測時間點的極低值，但來自疫苗接種組之血清在兩次肌肉內施用(2× IM；SD21及SD42/43)後、在第一次鼻內且隨後肌肉內施用(IN+IM；SD42/43)後及在兩次鼻內施用(2× IN；SD42/43)後表現出強烈的OD值增加；圖36。因此，經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗疫苗接種分別在豬崽體內引發針對由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3的血清學免疫反應。 另外，在研究第28天(SD28)自取自於研究動物之血液純化外周血液單核細胞(PBMC)。PBMC隨後用感染倍率為1之H3N2豬IAV攻擊病毒株R452-14 (H3N2 MOI 1)或用濃度為1 µg/ml之與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源的重組表現之豬IAV H3抗原(rH3 1µg/ml)再刺激。使用經再刺激之PBMC，進行干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)，且分別將所獲得之值相對於10^
6個細胞標準化且計算作為每組之平均值(圖38)。雖然來自攻擊對照組(充當此測試之陰性對照物，動物未經疫苗接種)之經再刺激之PBMC在任一次再刺激後顯示每組之平均斑點低於45個，來自經疫苗接種之動物的經再刺激之PBMC在任一次再刺激後分別顯示在兩次肌肉內施用後每組平均斑點超過85個，在第一次鼻內且隨後肌肉內施用(IN+IM)後超過100個斑點及在兩次鼻內施用(2× IN)後超過150個斑點(圖38)。因此，經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種在豬崽體內分別引發對抗由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3及對抗用於異源攻擊病毒感染之豬IAV H3N2 R452-14的細胞免疫反應。 因此，豬崽經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種在豬崽體內誘導可偵測的血清學及細胞免疫反應，且藉由統計學上顯著降低在異源豬IAV攻擊後一天及三天肺勻漿中之豬IAV負荷來證明疫苗功效。 實例12由 rEHV-1 RacH-SE_B 及 rEHV-1 RacH-SE_D 組成之四價豬 IAV 疫苗對抗具有母系來源抗體之豬崽中之豬 IAV H3N2 攻擊的功效
為研究作為載體疫苗在豬崽中之特性，在第三項疫苗接種-攻擊研究中測試由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗。 在此第三項研究中，使用由在妊娠期間經針對豬IAV之市售失活疫苗接種兩次之母豬生產且餵養初乳及乳汁的豬崽。在第一次疫苗接種經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價疫苗接種兩次時，藉由使用H3特異性ELISA (圖37)及藉由使用市售豬IAV特異性抗體ELISA (IDEXX Influenza A (Virus Antibody Test) ®
; IDEXX, Westbrook, Maine 04092, USA)按照製造商的測試建議對豬崽之豬IAV特異性抗體血清學測試呈陽性(資料未展示)。動物分別在其生命第一週(研究第0天，SD0)第一次及在其生命第四週(研究第21天，SD21)第二次以每一疫苗株、動物及疫苗接種2 ml劑量中含1×10^7 TCID50之劑量分別肌肉內且隨後肌肉內(2×IM)、或首先鼻內且隨後肌肉內(IN+IM)、或兩次鼻內(2×IN)疫苗接種。未經疫苗接種之組充當陰性對照物且另一個未經疫苗接種之組充當攻擊對照物。在其生命第十一週(研究第69或70天，SD69/70)，除陰性對照物之外的所有動物均受2×10^7 TCID50之H3N2豬IAV攻擊病毒株(歐洲野生病毒分離株R452-14，其H3與rEHV-1 RacH-SE_B中所用H3疫苗抗原異源)的氣管內施用劑量攻擊。未經疫苗接種且未經攻擊之動物充當陰性對照物(neg. ctrl.)，而未經疫苗接種但經攻擊之動物充當攻擊對照物(chall. ctrl.)。在疫苗接種時及疫苗接種後以及在攻擊前，在不同時間點獲取血液樣品。 在攻擊後五天，殺死動物且每隻動物分別獲取每個左肺及每個右肺三個肺樣品。隨後，測定每隻動物每克肺組織勻漿之感染性豬IAV效價作為每隻動物左肺及右肺的平均值，其各由彙集的每個左肺或右肺三個樣品之勻漿獲得且分別相對於左肺或右肺之三個樣品的總重量標準化。對於所有疫苗接種組，自該組中之個別動物在攻擊後第五天(CH+5)獲取之樣品所獲得的感染性豬IAV效價的中值在與攻擊對照組相比時統計學上顯著降低，而來自陰性對照組之所有動物均未在其肺勻漿中顯示感染性豬IAV病毒效價(圖35)。因此，經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗疫苗接種分別統計學上顯著降低豬崽在用異源豬IAV H3N2病毒株攻擊後五天的豬IAV肺負荷。因此，本文所述之疫苗有效對抗豬體內之豬IAV。 此外，在研究第0天(SD0，在第一次疫苗接種前)、在研究第21天(SD21，在第二次接種疫苗前)及在研究第35天(SD35，在第二次接種疫苗後兩週)取自於研究動物之血清係藉由對針對重組表現之豬IAV H3抗原的免疫球蛋白G (IgG)具有特異性的酶聯免疫吸附分析(ELISA)來分析，該重組表現之豬IAV H3抗原與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源。雖然來自陰性對照組之血清的平均OD值僅給出SD21及SD35的極低值，但來自疫苗接種組之血清在兩次肌肉內施用(2× IM；SD35)後、在第一次鼻內且隨後肌肉內施用(IN+IM；SD35)後及在兩次鼻內施用(2× IN；SD35)後表現出強烈的OD值增加；圖37。因此，經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗疫苗接種分別在豬崽體內引發針對由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3的血清學免疫反應。 另外，在研究第28天(SD28)自取自於研究動物之血液純化外周血液單核細胞(PBMC)。PBMC隨後用感染倍率為1之H3N2豬IAV攻擊病毒株R452-14 (H3N2 MOI 1)或用濃度為1 µg/ml之與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源的重組表現之豬IAV H3抗原(rH3 1µg/ml)再刺激。使用經再刺激之PBMC，進行干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)，且分別將所獲得之值相對於10^
6個細胞標準化且計算作為每組之平均值(圖39)。雖然來自攻擊對照組(充當此測試之陰性對照物，動物未經疫苗接種)之經再刺激之PBMC在任一次再刺激後顯示每組之平均斑點低於15個，來自經疫苗接種之動物的經再刺激之PBMC在任一次再刺激後分別顯示在兩次肌肉內施用後每組平均斑點超過30個，在第一次鼻內且隨後肌肉內施用(IN+IM)後超過55個斑點及在兩次鼻內施用(2× IN)後超過65個斑點(圖39)。因此，經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種在豬崽體內分別引發對抗由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之豬IAV血球凝集素H3及對抗用於異源攻擊病毒感染之豬IAV H3N2 R452-14的細胞免疫反應。 因此，豬崽經由rEHV-1 RacH-SE_B及rEHV-1 RacH-SE_D組成之四價豬IAV疫苗接種在豬崽體內誘導可偵測的血清學及細胞免疫反應，且藉由統計學上顯著降低在異源豬IAV攻擊後五天肺勻漿中之豬IAV負荷來證明疫苗功效。 本文中所揭示及主張之所有組合物及方法均可根據本發明製備及執行，無需過多實驗。雖然已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應清楚變化可在不背離本發明之概念、精神及範疇的情況下施加於本文所述之組合物及方法及方法之步驟或步驟順序。更特定言之，顯而易知在化學上及生理上相關之某些藥劑可取代本文所描述之藥劑，同時獲得相同或類似結果。熟習此項技術者顯而易見之所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所界定之本發明之精神、範疇及概念內。 參考文獻 以下參考文獻特定地以引用的方式併入本文中，以致其對本文所闡述之彼等提供例示性程序或其他細節補充。 1. Allwinn R, Geiler J, Berger A, Cinatl J, Doerr HW.2010
. Determination of serum antibodies against swine-origin influenza A virus H1N1/09 by immunofluorescence, haemagglutination inhibition, and by neutralization tests: how is the prevalence rate of protecting antibodies in humans? Med Microbiol Immunol. 199(2):117-21. doi: 10.1007/s00430-010-0143-4. Epub 2010 Feb 17. 2.Anonymous
(2013). VMD authorizes SBV vaccine for use in the UK. The Veterinary record172, 543 3.Anonymous
(2015). Schmallenberg virus vaccine. The Veterinary record177, 321 4.Bilk
S, Schulze C, Fischer M, Beer M, Hlinak A, Hoffmann B (2012). Organ distribution of Schmallenberg virus RNA in malformed newborns. Veterinary microbiology159, 236-238 5. Boshart M, Weber F, Jahn G, Dorsch-Häsler K, Fleckenstein B, Schaffner W.1985
. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41(2):521-30. 6. Bustin, S.2000.
Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology25
(2): 169-193. 7. Charoensawan, V., Wilson, D., Teichmann, S.A.2010
. Genomic repertoires of DNA-binding transcription factors across the tree of life. Nucleic Acids Res. 38(21):7364-77 8. Colle, C.F. 3rd, O'Callaghan, D.J.1995
. Transcriptional analyses of the unique short segment of EHV-1 strain Kentucky A. Virus Genes;9(3):257-68. 9. Dorsch-Häsler, K., Keil, G.M., Weber, F., Jasin, M. Schaffner, W., and Koszinowski, U.H. 1985. A long and complex enhancer activates transcription of the gene coding for the highly abundant immediate early mRNA in murine cytomegalovirus. PNAS Vol. 82: 8325-8329. 10. Drummer, H.E., Studdert, M.J., Crabb, B.S.1998
. Equine herpesvirus-4 glycoprotein G is secreted as a disulphide-linked homodimer and is present as two homodimeric species in the virion. J. Gen. Virol. 79: 1205-1213 11. Fields, B, Knipe, D.M.; and Howley, P.M. 2013. Virology. 6th
ed. Philadelphia; Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams&Wilkins 12. Foecking, M.K., Hofstetter, H.1986
. Powerful and versatile enhancer-promoter unit for mammalian expression vectors. Gene 45(1):101-5. 13. Goodwin, E.C. & Rottman, F.M.1992
. The 3'flanking sequence of the bovine growth hormone gene contains novel elements required for efficient and accurate polyadenylation. J.Biol.Chem. 267: 16330-16334. 14. Hübert, P. H., Birkenmaier, S., Rziha, H.-J. and Osterrieder, N. (1996), Alterations in the Equine Herpesvirus Type-1 (EHV-1) Strain RacH During Attenuation. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 43: 1-14. doi:10.1111/j.1439-0450.1996.tb00282.x 15.Kärber
, G (1931) Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Archiv f experiment Pathol u Pharmakol.;162:480-483 16. Kim, D.W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S.1990
. Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene 16;91(2):217-23. 17.Kraatz
F, Wernike K, Hechinger S, König P, Granzow H, Reimann I, Beer, M (2015). Deletion mutants of Schmallenberg virus are avirulent and protect from virus challenge. J Virol89, 1825-1837 18. Luke, GA and Ryan, MD.2013
. The protein coexpression problem in biotechnology and biomedicine: virus 2A and 2A-like sequences provide a solution.Future Virology, Vol. 8, No. 10, Pages 983-996. 19. Ma, G., Eschbaumer, M., Said, A., Hoffmann, B., Beer, M., Osterrieder, N.2012.
An equine herpesvirus type 1 (EHV-1) expressing VP2 and VP5 of serotype 8 bluetongue virus (BTV-8) induces protection in a murine infection model. PLoS One. 2012;7(4):e34425. doi: 10.1371/journal.pone.0034425. Epub 2012 Apr 12. 20. Ma, G., Azab, W., Osterrieder, N.2013.
Equine herpesviruses type 1 (EHV-1) and 4 (EHV-4)--masters of co-evolution and a constant threat to equids and beyond. Vet Microbiol. 167(1-2):123-34. 21. Nolan, T. Rebecca E Hands, R.E., and BustinS.A.2006
. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nature Protocols 1: 1559-1582 22. Osterrieder, N., Neubauer, A., Brandmüller,C., Kaaden, O.R., and O'Callaghan, D.J.1996
. The equine herpesvirus 1 IR6 protein influences virus growth at elevated temperature and is a major determinant of virulence. Virology 226:243-251. 23. Ptashne, M.2014
.The Chemistry of Regulation of Genes and Other Things
The Journal of Biological Chemistry Vol. 289, ( 9) 5417-5435. Reed, L.J., and Muench, H.1938
. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. (27) 3; 493-497. 24.Reed
LJ and Muench H (1938). A simple method estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene 27(3) 493-497 25. Rosas, C.T., Konig, P., Beer, M., Dubovi, E.J., Tischer, B.K., Osterrieder, N.,2007a
. Evaluation of the vaccine potential of an equine herpesvirus type 1 vector expressing bovine viral diarrhea virus structural proteins. J. Gen. Virol. 88 (3), 748-757. 26. Rosas, C.T., B.K. Tischer, G.A. Perkins, B. Wagner, L.B. Goodman, N. Osterrieder.2007b
. Live-attenuated recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) induces a neutralizing antibody response against West Nile virus (WNV) Virus Research, 125 , pp. 69-78. 27. Rosas, C.T., Van de Walle, G.R., Metzger, S.M., Loelzer, K., Dubovi, E.J., Kim, S.G., Parrish, C.R., Osterrieder, N.,2008
. Evaluation of a vectored equine herpesvirus type 1 (EHV-1) vaccine expressing H3 haemagglutinin in the protection of dogs against canine influenza. Vaccine 26 (19), 2335-3234. 28. Said, A., Elke Lange, E., Beer, M. Damiani, A., Osterrieder, N.2013
. Recombinant equine herpesvirus 1 (EHV-1) vaccine protects pigs against challenge with influenza A(H1N1)pmd09 Virus Research 173: 371- 376 29.Sambrook
J and Russell DW (2001). Molecular Cloning, 3rd ed. Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; ISBN 978-087969-577-4 30. Shaner, N.C., Campbell, R.E., Steinbach, P.A., Giepmans, B.N., Palmer, A.E., Tsien, R,Y.2004.
Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. Dec;22(12):1567-72. Epub 2004 Nov 21. 31. Tischer, B.K., von Einem, J., Kaufer, B., Osterrieder, N.,2006
. Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli. Biotechnol. Tech. 40, 191-197. 32. Tischer, B.K., Kaufer, B.B., Sommer, M., Wussow, F., Arvin, A., and Osterrieder, N. A Self-Excisable Infectious Bacterial Artificial Chromosome Clone of Varicella-Zoster Virus Allows Analysis of the Essential Tegument Protein Encoded byORF9.
J. Virol.81 (23),2007
, 13200-13208. 33. Tischer, B.K, Smith, G.A.,and Osterrieder, N. in: Jeff Braman (ed.),In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition
, Methods in Molecular Biology, vol.
634,DOI 10.1007/978-1-60761-652-8_30, © Springer Science+Business Media, LLC2010
, Chapter 30:En Passant
Mutagenesis: A Two Step Markerless Red Recombination System. 34. Thompson, S.R.2012.
Tricks an IRES uses to enslave ribosomes. Trends Microbiol. Nov;20(11):558-66. 35. Trapp, S., von Einem, J., Hofmann, H., Kostler, J., Wild, J., Wagner, R., Beer, M., Osterrieder, N.,2005
. Potential of equine herpesvirus 1 as a vector for immunization. J. Virol. 79, 5445-5454. 36. Trombetta CM, Perini D, Mather S, Temperton N, Montomoli E.2014
.Overview of Serological Techniques for Influenza Vaccine Evaluation: Past, Present and Future. Vaccines (Basel) 13;2(4):707-34. doi: 10.3390/vaccines2040707. 37. Wellington, J.E., Allen, G.P., Gooley, A.A., Love, D.N., Packer, N.H., Yan, J.X., Whalley, J.M.1996.
The highly O-glycosylated glycoprotein gp2 of equine herpesvirus 1 is encoded by gene 71. J Virol. 70(11):8195-8. 38.Wernike
K, Aebischer A, Roman-Sosa G, Beer M, (2017). The N-terminal domain of Schmallenberg virus envelope protein Gc is highly immunogenic and can provide protection from infection. Scientific reports.2017 Feb 13;7:42500. 39.Wernike
K, Eschbaumer M, Breithaupt A, Hoffmann B, Beer M (2012). Schmallenberg virus challenge models in cattle: infectious serum or culture-grown virus? Veterinary research43, 84 40.Wernike
K, Eschbaumer M, Schirrmeier H, Blohm U, Breithaupt A, Hoffmann B, Beer M, (2013a). Oral exposure, reinfection and cellular immunity to Schmallenberg virus in cattle. Veterinary microbiology165, 155-159 41.Wernike
K, Nikolin VM, Hechinger S, Hoffmann B, Beer M (2013b). Inactivated Schmallenberg virus prototype vaccines. Vaccine31, 3558-3563
以下圖式形成本說明書之一部分且包括在此以進一步展示本發明之某些態樣。參照此等圖式中之一或多者，結合本文中呈現之特定實施例之詳細描述，可更好地理解本發明。 圖1. orf70插入位點之示意圖 UL = 特有長區段 US = 特有短區段 IR = 內部反向重複序列 TR = 末端反向重複序列 gG = 糖蛋白G gpII = 糖蛋白II orf = 開放閱讀框架 bp = 鹼基對。 圖2. 比較野生型(wt) EHV-1病毒株ab4及減毒疫苗株EHV-1 RacH之orf1/3區的示意性圖解。 圖3. 啟動子動力學實驗之qPCR結果。 3.a中之圖形展示編碼必需糖蛋白D之orf72的轉錄動力學。此等資料用於使mCherry之轉錄動力學資料(3.b中之圖形)標準化。 圖4. 兩個獨立啟動子動力學實驗之qPCR結果：描繪轉錄活性與值的正相關性。將在感染後不同時間之mCherry qPCR結果的標準化Ct值自t=0時之相應平均Ct值減去。展示兩個在兩種不同細胞株中之實驗。 圖5. 用於將表現卡匣p455-H3-71插入至EHV-1 RacH之orf70中之轉移質體的質體圖譜。3 ' 端 ORF69
側接上游插入位點之病毒基因組DNA序列3 ' 端 ORF70
側接下游插入位點之病毒基因組DNA序列p455
驅動轉殖基因表現之啟動子H3
轉殖基因(IAV血球凝集素)71pA
聚腺苷酸化序列I-Sce1
I-Sce1之裂解位點啟動子 aph
驅動卡那黴素抗性基因表現之原核啟動子Kana
卡那黴素抗性orfORI
質體載體之複製起點Apr
安比西林抗性基因EcoRI 、 SalI 、 NotI 、 HindIII 、 KpnI 、 BamHI 、 XbaI
指示限制性核酸內切酶裂解位點 圖6. 放大orf70插入區之rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3基因組的示意性圖解。 orf69：orf70中插入位點上游之第69號開放閱讀框架；p455：本文所述之新穎之啟動子，參見例如實例1；H3：轉殖基因流感病毒血球凝集素；71pA：新穎之聚腺苷酸化序列；Δorf70：含有orf71之啟動子的orf70之其餘部分，其編碼結構性病毒糖蛋白II (gpII)。 圖7. 間接免疫螢光分析：經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3感染之VERO-細胞的間接免疫螢光分析 24 h p.i.細胞用乙醇固定且風乾。使用針對H3之商業單株抗體作為初級抗體及FITC結合的兔抗小鼠IgG作為二級抗體，藉由螢光顯微術展示經重組EHV-1 RacHSE-70-p455-H3感染之細胞中的H3。 圖8. 西方墨點法：經不同繼代之rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3或對照物rEHV-1 RacH-SE感染或模擬感染之細胞的西方墨點法。左側的墨點用針對EHV-1之gpII的單株抗體Ai2G7培育。右側的複製墨點用針對A型流感血球凝集素H3之商業兔高免疫血清(PA5-34930)培育。條帶之附註： 1：經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P5感染之細胞 2：經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P10感染之細胞 3：經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P15感染之細胞 4：經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3 P20感染之細胞 5：經rEHV-1 RacH-mC70感染之細胞 6：未經感染之細胞。 圖9a及9b. 病毒效價： 圖形展示經疫苗接種或未經疫苗接種之豬的肺樣品在攻擊後的病毒負荷 Inact = 市售失活疫苗 EHV= rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3。 圖10. 用於將表現卡匣p430-H1av-BGH插入至EHV-1 RacH之orf1/3中之轉移質體的質體圖譜。側接序列 A
側接上游插入位點之病毒基因組DNA序列側接序列 B
側接下游插入位點之病毒基因組DNA序列p430
驅動轉殖基因表現之啟動子H1av
轉殖基因(IAV血球凝集素)BGHpA
聚腺苷酸化序列I-Sce1
I-Sce1之裂解位點啟動子 aph
驅動卡那黴素抗性基因表現之原核啟動子Kana
卡那黴素抗性orfORI
質體載體之複製起點Apr
安比西林抗性基因EcoRI 、 SalI 、 NotI 、 HindIII 、 KpnI 、 BamHI
指示限制性核酸內切酶裂解位點 圖11. 放大orf1/3插入區之rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av基因組的示意性圖解。 Δorf1：插入位點上游之開放閱讀框架1的其餘部分；p430：本文所述之新穎之啟動子，參見例如實例1；H1av：轉殖基因流感病毒血球凝集素；BGHpA：牛生長激素聚腺苷酸化序列；orf3：插入位點下游之開放閱讀框架3。 圖12. 經rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av感染之細胞的西方墨點法及免疫螢光展示轉殖基因之表現。 H1av = rEHV-1 RacH-SE1/3-p430-H1av SE = rEHV-RacH-SE (對照物) 模擬物 = 未感染細胞(對照物) 圖13. 放大兩個插入區之rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av- 70-p455-H3 (rEHV-1-RacH-SEB
)基因組的示意性圖解。 Δorf1：插入位點上游之開放閱讀框架1的其餘部分；p430：新穎之啟動子；H1av：轉殖基因流感病毒血球凝集素；BGHpA：牛生長激素聚腺苷酸化序列；orf3：插入位點下游之開放閱讀框架3。 orf69：orf70中插入位點上游之開放閱讀框架69；p455：新穎之啟動子；H3：轉殖基因流感病毒血球凝集素；71pA：新穎之聚腺苷酸化序列；Δorf70：含有orf71之啟動子的orf70之其餘部分，其編碼結構性病毒糖蛋白II (gpII)。 圖14. 西方墨點法：經rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1av-70-455-H3 (B)、空載體rEHV-1 RacH-SE (SE)感染或模擬感染(對照)之細胞的西方墨點法。複製墨點用針對H3 (H3)之商業兔高免疫血清(PA-34930)、針對H1 (H1)之商業兔高免疫血清(PA-34929)或針對EHV-1 gpII (gpII)之單株抗體Ai2G7培育。 圖15：經CAV2 CMVie CPV VP2感染之AI-ST 2015細胞的流動式細胞量測分析：感染後72小時。 圖16：具有新穎之EHV-4啟動子的rCAV-2：經感染之AI-ST 2015細胞的流動式細胞量測分析：感染後48小時。 圖17：具有新穎之EHV-4啟動子的rCAV-2：經感染之E1B MDCK (新穎之rCAV-2)細胞中CPV VP2蛋白質表現的點漬墨法分析 1° = 1/50 a-CPV-FITC mAb (VMRD) 2° = 1/1.000山羊抗小鼠IgG過氧化物酶(JIR) A) 原始點漬墨法資料 B) 由點漬墨法產生之半定量資料：對於定量，使用ImageJ軟體(Burger, W., Burge, M.J. (編), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York)分析點漬墨。將圖像顏色反轉以減去所記錄之各點的背景及積分密度。值如下分配+及-標示：「++++」 = ＞800000，「+++」 = 500000至800000，「++」 = 300000至499999，「+」 = 120000至299999，「+/-」 = 80000至119999及「-」 = ＜80000。 圖18：經rCAV-2 p455 RabG感染之細胞中的RabG偵測：在＜1%之經原始rCAV-2 CMVie RabG感染之細胞中偵測到表現。 圖19：經rCAV-2 p455 RabG感染之細胞中的RabG偵測：A)經感染之AI-ST 2015細胞中CPV VP2表現之IFA，B) AI-ST 2015細胞中RabG表現之IFA，C) BIVI 2011 MDCK細胞中RabG表現之IFA - 對RabG及CAV-2進行雙重染色。 圖20. 各組在攻擊前及攻擊後1、2及3天之平均體溫。誤差條，標準差。按照研究日自左至右：陰性對照組(neg. ctrl.)、攻擊對照組(chall. ctrl.)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之動物(1× EHV-1)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之動物(2× EHV-1)或經失活豬IAV疫苗接種兩次之動物(2× 死疫苗)。 圖21. 各組在攻擊後一天及三天的平均肺得分。誤差條，標準差。陰性對照組(neg. ctrl.)、攻擊對照組(chall. ctrl.)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之動物(1× EHV-1)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之動物(2× EHV-1)或經失活豬IAV疫苗接種兩次之動物(2× 死疫苗)。 圖22. 在攻擊日採集之動物血清對抗豬IAV H3攻擊病毒株R452-14之倒數血清中和(SN)效價。20，偵測極限。陰性對照組(neg. ctrl.)、攻擊對照組(chall. ctrl.)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之動物(1× EHV-1)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之動物(2× EHV-1)或經失活豬IAV疫苗接種兩次之動物(2× 死疫苗)。 圖23. 在豬IAV攻擊施加後一或兩天獲取之BALF的IL-1β結果。各點表示每一隻動物所測定之值。陰性對照組(Neg. Ctr.)、攻擊對照組(Chall. Ctr.)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之動物(1× EHV-1)、經RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次之動物(2× EHV-1)或經失活豬IAV疫苗接種兩次之動物(2× 死疫苗)。 圖24. 在第2次疫苗接種後7天再刺激之PBMC的IFNγ-ELISpot結果。(A)未經疫苗接種之對照組；(B)經失活豬IAV疫苗疫苗接種兩次；(C)經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次；(D)經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種兩次。對於僅經rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3疫苗接種一次之動物，再刺激對應於第1次疫苗接種後7天。各點表示在給定時間點及在用特定刺激物再刺激後每一隻動物所測定的值。對於再刺激，使用對應於rEHV-1 RacH-SE-70-p455-H3中之H3疫苗抗原重組表現之豬IAV HA (HA_V)、對應於攻擊病毒株R452-14之H3重組表現之豬IAV HA (HA_CH)、稀釋HA_V及HA_CH之培養基(RPMI)、空EHV-1載體RacH-SE (EHV-1空)、疫苗RacH-SE-70-p455-H3 (EHV-1-H3)、豬IAV H3N2攻擊病毒株R452-14 (H3N2)、用於生長R452-14之來自未感染細胞之細胞清液層(MDCK)或重組表現之豬IAV核蛋白(NP)。 圖25. 轉移質體pU1/3-p430-H1hu-BGHKBGH之示意性圖譜。 圖26：轉移質體pU70-p455-H1pdm-71K71之示意性圖譜。 圖27：放大orf1/3及orf70插入區之rEHV-1 RacH-SE-1/3-p430-H1hu-70-p455-H1pdm (rEHV-1 RacH-SE_D)的線性雙股DNA基因組。 圖28：經rEHV-1 RacH-SE_B
、RacH-SE_D
、RacH-SE
感染或未感染(對照
)之細胞的西方墨點。複製墨點用針對H3之多株兔高免疫血清(PA5-34930)、針對H1之多株兔高免疫血清(PA5-34929)或對抗EHV-1糖蛋白II (gpII)之單株抗體(Ai2G7)培育。所有抗體產生預期的圖案，證實所需抗原H3及H1之表現且不同病毒之複製效率相當，如由所有經感染細胞樣品中EHV-1 gpII之極類似的染色所判斷。 圖29：小鼠血清之A型流感病毒中和測試的結果。*誤差條指示標準差。 圖30：轉移質體pU70-455-SBVGc_71K71之圖譜。 圖31：A)用於偵測SBV病毒基因組之未經疫苗接種之對照牛(上圖)及經rEHV-SBV-Gc疫苗接種兩次之動物(下圖)之定量RT-PCR的結果。對於每組未經疫苗接種及經疫苗接種之動物，分別由不同類型的線及符號來標識個別動物。動物1以具有黑色實心圓之黑線描繪(對應於圖27B中之黑色條)。動物2以具有灰色實心三角形之灰色虛線描繪(對應於圖27B中之淺灰色條)。動物3以具有空心方形之虛線描繪(對應於圖27B中之白色條)。動物4以具有灰色實心菱形之灰色虛線描繪(對應於圖27B中之深灰色條)。B)未經疫苗接種之對照牛(上圖)及經rEHV-SBV-Gc疫苗接種兩次之動物(下圖)的血清中和測試結果。對於每組未經疫苗接種及經疫苗接種之動物，分別由不同條顏色/填充(自黑色經淺灰色及深灰色至白色)來標識個別動物。動物1以黑色條描繪(對應於圖27A中具有黑色實心圓之黑線)。動物2以淺灰色條描繪(對應於圖27A中具有灰色實心三角形之灰色虛線)。動物3以白色條描繪(對應於圖27A中具有空心方形之黑色虛線)。動物4以深灰色條描繪(對應於圖27A中具有灰色實心菱形之灰色虛線)。 圖32：EHV中和測試。自相應組中同一動物之樣品獲得的所有結果以相同的灰色色調展示：一個動物由黑色填充條表示、另一個動物由淺灰色填充條表示、第三個動物由白色條表示且第四個動物由深灰色條表示。 圖33：以在攻擊後一天殺死之動物的每g肺組織的TCID50確定豬IAV肺效價。neg. ctrl.，陰性對照組；chall. ctrl.，攻擊對照組；2× IM，肌肉內經疫苗接種兩次之組；IN+IM，第一次鼻內及第二次肌肉內經疫苗接種之組；2× IN，鼻內經疫苗接種兩次之組。資料點指示個別動物所獲得之平均值。中間水平線分別指示組平均值。上部及下部水平線分別指示標準差。各組成對統計學比較之p值在下方給出且藉由分別使用曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)及使用標準軟體設置之Windows軟體GraphPad Prism® 7.02, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA 92037, USA的t檢驗計算。 圖34：以在攻擊後三天殺死之動物的每g肺組織的TCID50確定豬IAV肺效價。neg. ctrl.，陰性對照組；chall. ctrl.，攻擊對照組；2× IM，肌肉內經疫苗接種兩次之組；IN+IM，第一次鼻內及第二次肌肉內經疫苗接種之組；2× IN，鼻內經疫苗接種兩次之組。資料點指示個別動物所獲得之平均值。中間水平線分別指示組平均值。上部及下部水平線分別指示標準差。各組成對統計學比較之p值在下方給出且藉由分別使用曼-惠特尼檢驗及使用標準軟體設置之Windows軟體GraphPad Prism® 7.02, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA 92037, USA的t檢驗計算。 圖35：以在攻擊後五天殺死之動物的每g肺組織的TCID50確定豬IAV肺效價。neg. ctrl.，陰性對照組；chall. ctrl.，攻擊對照組；2× IM，肌肉內經疫苗接種兩次之組；IN+IM，第一次鼻內及第二次肌肉內經疫苗接種之組；2× IN，鼻內經疫苗接種兩次之組。資料點指示個別動物所獲得之平均值。中間水平線分別指示組平均值。上部及下部水平線分別指示標準差。各組成對統計學比較之p值在下方給出且藉由分別使用曼-惠特尼檢驗及使用標準軟體設置之Windows軟體GraphPad Prism® 7.02, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA 92037, USA的t檢驗計算。 圖36：對針對重組表現之豬IAV血球凝集素H3抗原之豬免疫球蛋白G (IgG)具有特異性之酶聯免疫吸附分析(ELISA)結果，該抗原與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源。對於測試，各孔用100 ng重組表現之H3塗佈。分別成對量測樣品，由成對量測值計算樣品平均值，且由樣品平均值計算組值。chall. ctrl.，攻擊對照組(充當陰性對照物)；2× IM，肌肉內經疫苗接種兩次之組；IN+IM，第一次鼻內及第二次肌肉內經疫苗接種之組；2× IN，鼻內經疫苗接種兩次之組。誤差條指示標準差。研究天數(SD)以圖例形式指示於圖形右側。 圖37：對針對重組表現之豬IAV血球凝集素H3抗原之豬免疫球蛋白G (IgG)具有特異性之酶聯免疫吸附分析(ELISA)結果，該抗原與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源。對於測試，各孔用100 ng重組表現之H3塗佈。分別成對量測樣品，由成對量測值計算樣品平均值，且由樣品平均值計算組值。chall. ctrl.，攻擊對照組(充當陰性對照物)；2× IM，肌肉內經疫苗接種兩次之組；IN+IM，第一次鼻內及第二次肌肉內經疫苗接種之組；2× IN，鼻內經疫苗接種兩次之組。誤差條指示標準差。研究天數(SD)以圖例形式指示於圖形右側。 圖38：干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)之結果。在研究第28天(SD28)自取自於研究動物之血液純化外周血液單核細胞(PBMC)。PBMC隨後用感染倍率為1之H3N2豬IAV攻擊病毒株R452-14 (H3N2 MOI 1)或用濃度為1 µg/ml之與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源的重組表現之豬IAV H3抗原(rH3 1µg/ml)再刺激。使用經再刺激之PBMC，進行干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)，且分別將所獲得之值相對於10^
6個細胞標準化且計算作為每組之平均值。chall. ctrl.，攻擊對照組(充當陰性對照物)；2× IM，肌肉內經疫苗接種兩次之組；IN+IM，第一次鼻內及第二次肌肉內經疫苗接種之組；2× IN，鼻內經疫苗接種兩次之組。誤差條指示標準差。 圖39：干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)之結果。在研究第28天(SD28)自取自於研究動物之血液純化外周血液單核細胞(PBMC)。PBMC隨後用感染倍率為1之H3N2豬IAV攻擊病毒株R452-14 (H3N2 MOI 1)或用濃度為1 µg/ml之與由疫苗株rEHV-1 RacH-SE_B表現之H3同源的重組表現之豬IAV H3抗原(rH3 1µg/ml)再刺激。使用經再刺激之PBMC，進行干擾素γ特異性酶聯免疫吸附斑點分析(IFNγ ELISpot)，且分別將所獲得之值相對於10^
6個細胞標準化且計算作為每組之平均值。chall. ctrl.，攻擊對照組(充當陰性對照物)；2× IM，肌肉內經疫苗接種兩次之組；IN+IM，第一次鼻內及第二次肌肉內經疫苗接種之組；2× IN，鼻內經疫苗接種兩次之組。誤差條指示標準差。
<110> 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司(BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH)
<120> 新穎之啟動子
<130> P01-3202
<140> TW 106131994
<141> 2017-09-18
<150> EP 16189780.6
<151> 2016-09-20
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒4
<400> 1
<210> 2
<211> 600
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒4
<400> 2
<210> 3
<211> 430
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒4
<400> 3
<210> 4
<211> 449
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒4
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 特異性針對orf72之第1130號引子
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 特異性針對orf72之第1131號引子
<400> 6
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 特異性針對mCherry之第1079號引子
<400> 7
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 特異性針對mCherry之第1080號引子
<400> 8
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orf70插入區之人工序列核酸PCR引子1017
<400> 9
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orf70插入區之人工序列核酸PCR引子1018
<400> 10
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orf1/3插入區之人工序列核酸PCR引子1007
<400> 11
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orf1/3插入區之人工序列核酸PCR引子1008
<400> 12
<210> 13
<211> 417
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 13
<210> 14
<211> 431
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 14
<210> 15
<211> 417
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 15
<210> 16
<211> 431
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 16
<210> 17
<211> 283
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 17
<210> 18
<211> 144
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 18
<210> 19
<211> 801
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 19
<210> 20
<211> 801
<212> DNA
<213> 馬疱疹病毒1
<400> 20
<210> 21
<211> 4435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉移質體pU-mC70-BGH之核苷酸序列
<400> 21
<210> 22
<211> 5191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉移載體pU70-p455-71K71之核苷酸序列
<400> 22
<210> 23
<211> 6892
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉移質體pU70-p455-H3-71K71之核苷酸序列
<400> 23
<210> 24
<211> 4977
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉移載體pU-1-3-p430-BGHKBGH之核苷酸序列
<400> 24
<210> 25
<211> 6678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轉移質體pU1-3-p430-H1av-BGHKBGH之核苷酸序列
<400> 25
<210> 26
<211> 566
<212> PRT
<213> A型流感病毒
<400> 26
<210> 27
<211> 566
<212> PRT
<213> A型流感病毒
<400> 27
<210> 28
<211> 566
<212> PRT
<213> A型流感病毒
<400> 28
<210> 29
<211> 564
<212> PRT
<213> A型流感病毒
<400> 29
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS連接子
<400> 30
<210> 31
<211> 947
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括次選殖限制性位點之截短之糖蛋白c(Gc)之合成DNA序列
<400> 31
<210> 32
<211> 3060
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於RED重組產生pRacH-SE-70-455-SBVGc之DNA片段
<400> 32
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 33
<210> 34
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 34
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 35
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 36
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 37
Claims (39)
- 一種啟動子序列，其包含與4pgG600(SEQ ID NO.1)、4pMCP600(SEQ ID NO.2)、p430(SEQ ID NO.3)、p455(SEQ ID NO：4)或其互補核苷酸序列具有95%之序列一致性及/或同源性之序列，其中該啟動子序列可操作地連接於異源所關注核苷酸序列、所關注基因及/或所關注抗原編碼序列。
- 如請求項1之啟動子序列，其中該啟動子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及其互補核苷酸序列。
- 一種表現卡匣，其包含選自由以下組成之群之啟動子序列：與4pgG600(SEQ ID NO.1)、4pMCP600(SEQ ID NO.2)、p430(SEQ ID NO.3)、p455(SEQ ID NO：4)及其互補核苷酸序列具有95%之序列一致性及/或同源性之序列，其中該啟動子序列可操作地連接於所關注核苷酸序列，其中該啟動子序列引起該所關注核苷酸序列之表現，由此該啟動子序列為異源啟動子序列及/或外源啟動子序列。
- 如請求項3之表現卡匣，其中該啟動子序列選自由以下組成之群：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4及其互補核苷酸序列。
- 一種載體，其包含如請求項3之表現卡匣。
- 如請求項5之載體，其中該載體包含一或多個其他調控序列、聚腺苷酸化信號、IRES調控元件及/或2a肽調控元件。
- 如請求項5之載體，其中該載體為重組、及/或異源及/或外源載體。
- 如請求項5之載體，其中該載體為病毒載體，其選自由以下組成之群：疱疹病毒科(Herpesviridae)、水痘病毒屬(Varicelloviruses)、腺病毒科(Adenoviridae，AdV)、腺相關病毒科、桿狀病毒科(Baculoviridae)及慢病毒科(Lentiviridae)。
- 如請求項5之載體，其中該載體為病毒載體且為疱疹病毒科之成員、及/或α疱疹病毒屬之成員、及/或水痘病毒亞屬之成員、及/或馬α疱疹病毒1(EHV-1)。
- 一種產生載體之方法，其包含：a.提供啟動子序列，其包含4pgG600(SEQ ID NO.1)、4pMCP600(SEQ ID NO.2)、p430(SEQ ID NO.3)、p455(SEQ ID NO：4)或其互補核苷酸序列，其中該啟動子序列引起所關注核苷酸序列及/或所關注抗原編碼序列之表現，及b.將來自步驟a)之該啟動子序列整合至來源於病毒之載體主鏈中，該病毒選自由以下組成之群：疱疹病毒科、水痘病毒屬、腺病毒科(AdV)、細小病毒科(Parvoviridae)、桿狀病毒科、反轉錄病毒科 (Retroviridae)及痘病毒科。
- 一種包含載體之真核生物宿主細胞株，其中該載體包含選自由以下組成之群之啟動子序列：與4pgG600(SEQ ID NO.1)、4pMCP600(SEQ ID NO.2)、p430(SEQ ID NO.3)、p455(SEQ ID NO：4)或其互補核苷酸序列具有95%之序列一致性及/或同源性之序列，其中該啟動子序列可操作地連接於選自由以下組成之群之所關注核苷酸序列：所關注基因、異源及/或外源所關注序列、及所關注抗原編碼序列，其中該啟動子序列引起該所關注核苷酸序列之表現，由此該啟動子序列為異源啟動子序列及/或外源啟動子序列，其中該宿主細胞株為選自以下組成之群之哺乳動物細胞株或昆蟲細胞株：PK/WRL細胞株、RK13細胞株、MDBK細胞株、ST細胞株、AI-ST細胞株、VERO細胞株、Sf9細胞株、Sf21、Sf+細胞株、MDCK細胞株及/或其衍生物。
- 一種製備宿主細胞之方法，其包含：a.用載體感染容許感染真核生物宿主細胞株，其中該載體包含選自由以下組成之群之啟動子序列：4pgG600(SEQ ID NO.1)、4pMCP600(SEQ ID NO.2)、p430(SEQ ID NO.3)、p455(SEQ ID NO：4)及其互補核苷酸序列，其中該啟動子序列可操作地連接於選自由以下組成之群之所關注核苷酸序列：所關注基因、異源及/或外源所關注序列、及所關注抗 原編碼序列，其中該啟動子序列引起該所關注核苷酸序列之表現，由此該啟動子序列為異源啟動子序列及/或外源啟動子序列，以及b.在適合之條件下培養a)之該等經感染細胞，及/或c.收集該宿主細胞。
- 一種包含4pgG600(SEQ ID NO.1)、4pMCP600(SEQ ID NO.2)、p430(SEQ ID NO.3)、p455(SEQ ID NO.4)或其互補核苷酸序列之核酸序列作為啟動子序列的用途，其中該核酸序列引起選自由以下組成之群之所關注核苷酸序列之表現：所關注基因及所關注抗原編碼序列。
- 一種套組，其包含如請求項5至1中任一項之載體、宿主細胞及說明書引刷品。
- 如請求項14之套組，其進一步包含轉染劑。
- 一種如請求項5至9中任一項之載體或如請求項11之真核生物宿主細胞株用於製造免疫原性組合物或疫苗之用途。
- 如請求項16之用途，其中使用之M.O.I.為0.01至0.001。
- 一種免疫原性組合物，其包含a.如請求項3或4之表現卡匣，及/或 b.如請求項5至9中任一項之載體，及/或c.由如請求項3或4之表現卡匣表現之多肽及/或由如請求項5至9中任一項之載體表現之多肽，及/或d.醫藥學或獸醫學可接受之載劑或賦形劑。
- 如請求項18之免疫原性組合物，其中該多肽係病毒、經修飾之活病毒、病毒樣顆粒(virus like particle；VLP)或其類似物。
- 如請求項18之免疫原性組合物，其中該載劑適於經口、皮內、肌肉內或鼻內施用。
- 如請求項18之免疫原性組合物，其包含病毒。
- 如請求項18至21中任一項之免疫原性組合物，其用於減少或預防由動物感染病原體引起之臨床徵象或疾病的方法或用於治療或預防動物感染病原體之方法中。
- 如請求項22之免疫原性組合物，其中該動物為產食性動物。
- 如請求項23之免疫原性組合物，其中該動物為豬。
- 一種疫苗或醫藥組合物，其包含a.如請求項3或4之表現卡匣，及/或 b.如請求項5至9中任一項之載體，及/或c.由如請求項3或4之表現卡匣表現之多肽及/或由如請求項5至9中任一項之載體表現之多肽，及d.醫藥學或獸醫學可接受之載劑或賦形劑，及/或e.佐劑。
- 如請求項25之疫苗或醫藥組合物，其中該多肽係經修飾之活病毒、病毒樣顆粒(VLP)或其類似物。
- 如請求項25之疫苗或醫藥組合物，其中該載劑適於經口、皮內、肌肉內或鼻內施用。
- 如請求項25至27中任一項之疫苗或醫藥組合物，其用於減少或預防由動物感染病原體引起之臨床徵象或疾病的方法或用於治療或預防動物感染病原體之方法中。
- 如請求項28之疫苗或醫藥組合物，其中該動物為產食性動物。
- 如請求項29之疫苗或醫藥組合物，其中該動物為豬。
- 一種製備用以降低與感染相關或由感染引起之一或多種臨床徵象之發生率或嚴重程度之免疫原性組合物或疫苗的方法，其包含以下步驟：a.用載體感染容許感染真核生物宿主細胞株，其中該載體包含選自 由以下組成之群之啟動子序列：與4pgG600(SEQ ID NO.1)、4pMCP600(SEQ ID NO.2)、p430(SEQ ID NO.3)、p455(SEQ ID NO：4)及其互補核苷酸序列，其中該啟動子序列可操作地連接於選自由以下組成之群之所關注核苷酸序列：所關注基因、異源及/或外源所關注序列、及所關注抗原編碼序列，其中該啟動子序列引起該所關注核苷酸序列之表現，由此該啟動子序列為異源啟動子序列及/或外源啟動子序列，b.在適合之條件下培養a)之該等經感染細胞，c.收集b)之經感染細胞及/或載體及/或病毒成分，以及d.使步驟c)之收集物與醫藥學上可接受之載劑混合。
- 如請求項31之方法，其中在與醫藥學上可接受之載劑混合前純化步驟c)之收集物。
- 一種如請求項18至24中任一項之免疫原性組合物或如請求項25至30中任一項之疫苗或醫藥組合物的用途，其用於製造用於使動物免疫以對抗由病原體引起之臨床疾病的藥劑，其中該藥劑不會引起感染之臨床徵象，但能夠誘發使該動物免疫以對抗該病原體之致病性形式的免疫反應。
- 如請求項33之用途，其中該動物為產食性動物。
- 如請求項34之用途，其中該動物為豬或牛。
- 一種套組，其用於給動物接種疫苗以對抗與動物體內之病原體相關之疾病及/或降低與動物體內之病原體相關或由動物體內之病原體引起之一或多種臨床徵象的發生率或嚴重程度，包含：a)能夠向該動物投與疫苗之分配器；及b)如請求項18至24中任一項之免疫原性組合物或如請求項25至30中任一項之疫苗或醫藥組合物。
- 如請求項36之套組，其進一步包含說明書印刷品。
- 如請求項36或37之套組，其中該動物為產食性動物。
- 如請求項38之套組，其中該動物為豬或牛。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040109873A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-06-10 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | gM-negative EHV-mutants without heterologous elements |
Family Cites Families (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US382425A (en) | 1888-05-08 | Brandt | ||
| US2909462A (en) | 1955-12-08 | 1959-10-20 | Bristol Myers Co | Acrylic acid polymer laxative compositions |
| US3857423A (en) * | 1971-12-27 | 1974-12-31 | W Ronca | Topical medicament kit with interlocking components |
| US4394448A (en) | 1978-02-24 | 1983-07-19 | Szoka Jr Francis C | Method of inserting DNA into living cells |
| US4769331A (en) | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
| US5338683A (en) | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| US5833975A (en) | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
| US5364773A (en) | 1991-03-07 | 1994-11-15 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| US5174993A (en) | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
| US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
| US5505941A (en) | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
| US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
| US4708871A (en) | 1983-03-08 | 1987-11-24 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Antigenically active amino acid sequences |
| US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| DE3584341D1 (de) | 1984-08-24 | 1991-11-14 | Upjohn Co | Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa. |
| US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
| IL84154A0 (en) | 1986-10-16 | 1988-03-31 | Microgenesys Inc | Polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected insect cells and vaccines against acquired immune deficiency syndrome containing the same |
| GB8717430D0 (en) | 1987-07-23 | 1987-08-26 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
| EP0386185A1 (fr) | 1988-07-29 | 1990-09-12 | IntraCel Corporation | Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo |
| CA2003300A1 (en) | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Franklin Volvovitz | Skin test and test kit for aids |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| ES2116269T3 (es) | 1989-03-21 | 1998-07-16 | Vical Inc | Expresion de secuencias exogenas de polinucleotidos en un vertebrado. |
| US5552143A (en) | 1989-03-24 | 1996-09-03 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| US5591439A (en) | 1989-03-24 | 1997-01-07 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| GB9001766D0 (en) | 1990-01-25 | 1990-03-28 | Univ Court Of The University O | Vaccines |
| US5616326A (en) | 1990-01-25 | 1997-04-01 | The University Court Of The University Of Glasgow | Recombinant canine adenovirus 2 (CAV-2) |
| ATE189702T1 (de) * | 1990-08-01 | 2000-02-15 | Res Corp Technologies Inc | Das für das pferde herpes-virus typ 1 glykoprotein d, kodierende gen, sein genprodukt, antikörper und ihre verwendung |
| DE69233158T2 (de) | 1991-03-07 | 2004-05-13 | Connaught Technology Corp., Greenville | Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe |
| US5997878A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-07 | Connaught Laboratories | Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses |
| DE4110962A1 (de) * | 1991-04-05 | 1992-10-08 | Bayer Ag | Equine herpesviren (ehv), die fremd-dna enthalten, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in impfstoffen |
| US5643578A (en) | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
| US6193983B1 (en) | 1992-06-01 | 2001-02-27 | The University Of Melbourne | Equine herpesvirus glycoproteins |
| US5741696A (en) | 1992-08-07 | 1998-04-21 | Syntro Corporation | Recombinant equine herpesviruses |
| US5801029A (en) | 1993-02-16 | 1998-09-01 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia |
| IL108915A0 (en) | 1993-03-18 | 1994-06-24 | Merck & Co Inc | Polynucleotide vaccine against influenza virus |
| FR2705361B1 (fr) | 1993-05-18 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| ES2310924T3 (es) | 1993-07-13 | 2009-01-16 | Centelion | Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. |
| FR2711670B1 (fr) | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
| US5820868A (en) | 1993-12-09 | 1998-10-13 | Veterinary Infectious Disease Organization | Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system |
| EP0740704A1 (en) | 1994-01-27 | 1996-11-06 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of dna transcription unit |
| DK0758397T3 (da) | 1994-04-29 | 2005-10-10 | Baxter Healthcare Sa | Rekombinante poxvira med fremmede polynucleotider i essentielle regioner |
| FR2725726B1 (fr) | 1994-10-17 | 1997-01-03 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
| FR2727689A1 (fr) | 1994-12-01 | 1996-06-07 | Transgene Sa | Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral |
| IL116816A (en) | 1995-01-20 | 2003-05-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof |
| FR2730504B1 (fr) | 1995-02-13 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| FR2731710B1 (fr) | 1995-03-14 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique |
| AU711702B2 (en) | 1995-03-23 | 1999-10-21 | Cambridge University Technical Services Limited | Vectors for gene delivery |
| FR2732357B1 (fr) | 1995-03-31 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
| FR2735789B1 (fr) | 1995-06-23 | 1997-07-25 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant |
| US6090393A (en) | 1996-07-03 | 2000-07-18 | Merial | Recombinant canine adenoviruses, method for making and uses thereof |
| US6156567A (en) | 1996-07-03 | 2000-12-05 | Merial | Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters |
| JP2002512501A (ja) | 1996-07-03 | 2002-04-23 | メリアル インコーポレイテッド | 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ） |
| US6183752B1 (en) | 1997-02-05 | 2001-02-06 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy |
| DE19830141A1 (de) | 1998-07-06 | 2000-01-13 | Regine Heilbronn | Rekombinante Herpesviren für die Erzeugung rekombinanter Adeno-Assoziierter-Viren |
| HUP0102861A3 (en) | 1998-07-31 | 2005-03-29 | Akzo Nobel Nv | Attenuated equine herpesvirus |
| ATE386127T1 (de) | 1999-04-08 | 2008-03-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Verbesserung der immunantwort als anwendung in impfstoff und gentherapie |
| WO2001042481A2 (en) | 1999-12-07 | 2001-06-14 | Genethon Iii | Canine adenovirus vectors for the transfer of genes into target cells |
| EP1118670A1 (en) | 1999-12-07 | 2001-07-25 | Genethon III | Canine adenovirus vectors for the transfer of genes in targeted cells |
| WO2008032796A1 (fr) | 2006-09-13 | 2008-03-20 | Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. | Nouveau vaccin canin |
| DE10233064A1 (de) | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | gM-negative EHV-Mutanten ohne heterologe Elemente |
| FR2845395B1 (fr) | 2002-10-08 | 2008-05-30 | Agronomique Inst Nat Rech | Vecteurs adenoviraux recombinants et leurs applications |
| WO2007081336A1 (en) | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins |
| JP2009531464A (ja) | 2006-03-29 | 2009-09-03 | メリアル リミテッド | 連鎖球菌に対するワクチン |
| WO2008064488A1 (en) | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Variation Biotechnologies Inc. | Influenza vaccine formulation |
| WO2009120339A2 (en) | 2008-03-24 | 2009-10-01 | President And Fellows Of Harvard College | Vectors for delivering disease neutralizing agents |
| US8466271B2 (en) | 2008-07-23 | 2013-06-18 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co, Kg | Regulatory elements |
| US20130197612A1 (en) | 2010-02-26 | 2013-08-01 | Jack W. Lasersohn | Electromagnetic Radiation Therapy |
| TW201823465A (zh) | 2016-09-20 | 2018-07-01 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 新穎豬流感疫苗 |
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| HUE064133T2 (hu) | 2016-09-20 | 2024-03-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Kutya adenovírus vektor |
| CN109790550B (zh) | 2016-09-20 | 2024-02-09 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 新颖的启动子 |
-
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Nagesha, H.S., Crabb, B.S. & Studdert, M.J. Analysis of the nucleotide sequence of five genes at the left end of the unique short region of the equine herpesvirus 4 genome. Archives of Virology 128, (1993) 143–154 * |
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