JP2019533438A - 新しいプロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、37 C.F.R. 1.821〜1.825に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
A.技術分野
本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に適した(ベクター)ワクチン、特に新規のプロモーター配列、発現カセットおよびベクターの分野に関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
ウマの病原体、ウマアルファヘルペスウイルス1型(ウマ流産ウイルス、EHV−1)は、ヘルペスウイルス目の、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス亜科のバリセロウイルス属に属する。およそ150,000塩基対の二本鎖DNAゲノムを有する大きなエンベロープウイルスである。バリセロウイルス亜属の他の重要なメンバーは、ヒトアルファヘルペスウイルス3型(水痘帯状疱疹ウイルス)、ブタアルファヘルペスウイルス1型(仮性狂犬病ウイルス)、ウシアルファヘルペスウイルス1型(感染性気管支炎ウイルス)、およびウマアルファヘルペスウイルス4型(ウマ鼻肺炎ウイルス、EHV−4)(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)EHV−1およびEHV−4は風土性であり、世界中のウマに影響を及ぼす。EHV−4は、上気道に、大抵は軽度の感染を引き起こすが、EHV−1は、株および宿主の免疫状態によって呼吸器症状から流産および致死性の脳脊髄障害の範囲の疾患を含む全身感染を引き起こし得る。EHV−1に対して使用許諾を得た2つの改変生ワクチン(MLV)がアメリカおよびヨーロッパで現在入手可能であり、それぞれRhinomune(商標)(Boehringer Ingelheim)およびPrevaccinol(商標)(MSD)である。両方とも、弱毒化のためにブタ上皮細胞において256回継代された、古典的に弱毒化したEHV−1 RacH株を含有する(Ma et al. 2013)。弱毒化のメカニズムは、分子レベルで調査されてきた。Osterrieder et al. (1996)は、RacHがorf67の2つのゲノムコピーを欠如し、1つのコピーの回復が毒性を回復させるのに十分であったことを示した。さらに、免疫抑制ウイルスタンパク質をコードするorf1のコード配列の90%より多くを除去する1283bpの欠損を持つ。他の変異もまた、弱毒化に影響するが、これまでのところ詳細には調査されていない。これら全てのことから、RacHは非常に安全なワクチン株である。ワクチン接種動物における継代による毒性への復帰は、仮に可能だとしてもその可能性が極めて低いからである。
しかしながら、さらなる外因性プロモーター無しで発現されるトランスジェニックタンパク質の量は、通常比較的少ない。したがって、そのようなベクター、特に組換えEHV−1 RacHからトランスジェニックタンパク質を発現するために使用され得るさらなるプロモーターに対する、満たされていない要求がある。
本発明は、導入遺伝子発現のための新しい制御核酸配列/プロモーター配列、免疫原性組成物、ワクチン、および当技術分野の欠点を克服する関連方法を提供する。
ヘルペスウイルスを含む様々なベクター系での高レベルの導入遺伝子発現を駆動するために広く使用される確立されたプロモーター配列は、HCMV(Boshart et al. 1985; Foecking and Hofstetter 1986)またはマウスサイトメガロウイルス(MCMV;Dorsch-Hasler et al. 1985)の最初期遺伝子のプロモーター配列、または例えばSV40ラージT抗原プロモーターなど、サルウイルス40(SV40)のような腫瘍ウイルスの強力なプロモーター、ならびに他多数(例えば、Kim et al. 1990)である。そのような強力なプロモーターは、様々な細胞培養系で自律的に機能するため、細胞生物学者に好まれた。ウイルス複製に関して、感染細胞は、ウイルス機能によってウイルス複製機構へと形質転換される。複製の生物学およびヘルペスウイルスの形態形成はよく理解されている。感染後、非常にわずかな遺伝子(α−遺伝子)のみが転写され、最初期タンパク質(IEp)へと翻訳される。これらのIEpは、DNAポリメラーゼおよびその他多くのようなウイルス酵素をコードするβ遺伝子の転写活性化因子である。ウイルスゲノム複製の開始は、ウイルス構造タンパク質をコードするβ−およびγ−遺伝子が転写されているウイルス複製の後期の開始をマークする(Fields, 2013)。しかしながら、改良されたベクターワクチンは、オプションとして上記の自律的な強力なプロモーターが見られず、特に腫瘍ウイルス由来のものは不利な安全性プロファイルを有する。したがって、EHV−1 β−およびγ−遺伝子のもののような、ウイルス複製に関して高い活性を有するプロモーターを提供する必要がある。内部相同組換えのリスクが起こることなく、したがって遺伝的不安定性なく、1つのベクター分子に2回同一のDNA配列を使用することはできないため、本発明は、EHV−4の公表されたゲノム配列由来の新しい代替えのプロモーター配列を提供する(ウマアルファヘルペスウイルス4株 NS80567、完全ゲノム、Accession AF030027、Version AF030027.1 GI:2605950、1998年5月21日)。EHV−1遺伝子との遺伝子の配列同一性は55〜84%の範囲内である。
さらに、本発明によって提供された新しいプロモーター配列は、イヌアデノウイルス(CAdV)のような他のベクター背景においても効果的であることが示される。
重要なことに、CAGまたはCMV5プロモーター配列のいずれかがE3領域に位置する発現カセットに存在した場合、組換えCAdVのレスキューは達成されなかった。これは、発現カセットのサイズが観察された実験的なゲノムサイズ制限を超えなかったため、配列特異的であるようである。したがって、本発明の新しいEHV−4由来プロモーター配列、例えばp430およびp455は、導入遺伝子発現を促進するだけでなく、ウイルスレスキューの重要なステップも支持し、したがって、先行技術のプロモーター配列を考えると有利である。
一般に、本発明は、4pgG600(配列番号1)もしくは4pMCP600(配列番号2)またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む、プロモーター配列/制御核酸配列を提供し、前記プロモーター配列は目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。
さらなる特定の態様では、機能的断片は、4pMCP600(配列番号2)のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって(少なくとも)78%である(またはより高い)。好ましくは、4pMCP600(配列番号2)の機能的断片は、p455(配列番号4)と名付けられた断片である。別の態様では、配列同一性は(少なくとも)70%、80%、85%、好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%である。
プロモーター配列は目的の配列、好ましくは目的の遺伝子または抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および/または外来性配列、目的の遺伝子または抗原コード配列に作動可能に連結しており、
前記プロモーター配列/制御核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列は、好ましくは異種プロモーター配列/制御核酸配列、より好ましくは外来性プロモーター配列/制御核酸配列である。特定の態様では、発現が増大される。
特定の態様では、発現カセットは、組換え、異種および/または外来性発現カセットである。別の特定の態様では、プロモーター配列/制御核酸配列は、組換え、異種および/または外来性プロモーター配列/制御核酸配列である。
本発明は、本発明に記載の発現カセットを含むウイルスベクターまたはウイルス構築物などのベクターにさらに関する。好ましくは、前記ベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
プロモーター配列は目的の配列、好ましくは目的の遺伝子または抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および/または外来性配列、目的の遺伝子または抗原コード配列に作動可能に連結しており、
前記プロモーター配列/制御核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列は、好ましくは異種プロモーター配列/制御核酸配列、より好ましくは外来性プロモーター配列/制御核酸配列である。特定の態様では、発現が増大される。好ましくは、前記ベクターは免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
特定の態様では、ベクターは、組換え、異種および/または外来性ベクターである。別の特定の態様では、プロモーター配列/制御核酸配列は、組換え、異種および/または外来性プロモーター配列/制御核酸配列である。
本発明に記載の発現カセットおよび/または本発明に記載のベクターのさらなる特定の態様では、機能的断片または誘導体(プロモーター配列/制御核酸配列の)は、4pgG600(配列番号1)のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって(少なくとも)72%(またはより高い)である。好ましくは、4pgG600(配列番号1)の前記機能的断片は、p430(配列番号3)と名付けられた断片である。
本発明に記載の発現カセットおよび/または本発明に記載のベクターのさらなる特定の態様では、前記発現カセットおよび/または前記ベクターは1つまたは複数のさらなる制御配列、例えば終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、またはIRESおよび/または2aペプチドのような制御エレメントを含む。
特定の態様では、本発明に記載のベクターは異種および/または外来性ベクターである。
a.本発明に記載のプロモーター配列および/または制御核酸配列を用意するステップ、
b.ステップa)の前記プロモーター配列を、EHV−1、EHV−4、ブタアルファヘルペスウイルス1型(仮性狂犬病ウイルス、PrV)およびウシアルファヘルペスウイルス1型(ウシヘルペスウイルス1型、BHV−1)のようなバリセロウイルスなどのヘルペスウイルス科、CAdV(イヌアデノウイルス)などのアデノウイルス科(AdV)、アデノ随伴ウイルスのようなパルボウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルス科、およびポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルス由来のベクター骨格であって、好ましくはヘルペスウイルスに由来し、より好ましくはEHV−1またはEHV−4であるベクター骨格に組み込むステップ
を含む、ベクター、好ましくはウイルスベクターを産生する方法にさらに関する。
a.請求項9から19に記載のベクターを、請求項21に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
b.適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
によって特徴づけられ、
c.前記宿主細胞を回収するステップ、
によって特徴づけられていてもよい、宿主細胞を調製する方法にさらに関する。
上記に列挙したように、哺乳動物の宿主細胞株は通常、アール塩およびウシ胎仔血清が補足された最小必須培地(MEM)などの哺乳動物細胞培養のための培地で浸したプラスチック製の組織培養器中で培養される。哺乳動物細胞株は5%CO2および湿度およそ80%を補足した一定の雰囲気下で、37℃のインキュベーター内で保管される。昆虫細胞株は、昆虫細胞培養培地で浸したプラスチック製の組織培養器中で培養され、インキュベーター内の一定の雰囲気下で、27℃で保管される。」
本発明は、制御核酸配列としての、4pgG600(配列番号1)もしくは4pMCP600(配列番号2)またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片または機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸配列の使用にさらに関し、前記核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。特定の態様では、発現が増大される。
本発明は、制御核酸配列としての、p430(配列番号3)もしくはp455(配列番号4)またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的誘導体またはその相補的なヌクレオチド配列を含む核酸配列の使用にさらに関し、前記核酸配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。特定の態様では、発現が増大される。
本発明は、本発明に記載のベクター、宿主細胞からなり、トランスフェクション試薬および指示リーフレットからなっていてもよいキットにさらに関する。
本発明は、0.01〜0.001のM.O.I.で使用してもよい、免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、本発明に記載のベクターまたは本発明に記載の真核生物の宿主細胞株または本発明に記載の真核生物の宿主細胞の使用にさらに関する。
a.本発明に記載の発現カセットおよび/または
b.本発明に記載のベクター、および/または
c.本発明に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび/または例えばウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)等の、本発明に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、
を含み、ならびに
d.薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤を含んでもよく、好ましくは前記担体が経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適している、
免疫原性組成物にさらに関する。
特定の態様では、前記免疫原性組成物はウイルスを含む。別の特定の態様では、前記免疫原性組成物は感染性ウイルスを含む。
a.本発明に記載の発現カセットおよび/または
b.本発明に記載のベクター、および/または
c.本発明に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび/または例えば改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)等の、本発明に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、および
d.薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤を含み、好ましくは前記担体が経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適しており、
e.前記ワクチンがアジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物にさらに関する。
a.本発明に記載のベクターを、本発明に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
b.適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
c.感染細胞および/またはベクターおよび/またはウイルス成分を回収するステップ
を含み、
d.ステップc)の回収物を精製するステップ
を含んでもよく、
e.前記回収物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法にさらに関する。
本発明は、動物において病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を減らすまたは予防する方法での使用のための、または動物において病原体の感染を処置または予防する方法での使用のためのものであり、好ましくは前記動物がブタまたはウシなどの食物生産動物である、本発明に記載の免疫原性組成物または本発明に記載のワクチンにさらに関する。
本発明は、本明細書に記載のように免疫原性組成物またはワクチンを食物生産動物などの動物に投与するステップを含む、食物生産動物などの動物を免疫する方法をさらに提供する。
特定の態様では、免疫は、家畜において特別なウイルス感染の発生率の減少または特別なウイルス感染によって引き起こされるまたは特別なウイルス感染と関連する臨床徴候の重症度の低減をもたらす。
本発明は、それを必要とする食物生産動物などの動物において、ウイルスによって引き起こされる臨床徴候の処置または予防の方法を提供し、方法は、本明細書に記載のように治療有効量の免疫原性組成物またはワクチンを動物に投与するステップを含む。
好ましくは、臨床徴候は、処置していない(免疫していない)が、特別なブタA型インフルエンザウイルスに続いて感染した動物と比較して、少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも60%、なおより好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、なおより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%低減される。
本発明は、
a)前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
b)本発明に記載の免疫原性組成物または本発明に記載のワクチン
を含み、
c)指示リーフレット
を含んでもよい、動物において病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくはブタまたはウシなどの食物生産動物にワクチン接種するための、および/または動物において病原体と関連するまたは病原体によって引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすためのキットにさらに関する。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるはずであるが、あらゆる潜在的な多義性がある場合には、本明細書で提供した定義は、任意の辞書の定義または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書では、特に言及しない限り、「または(or)」の使用は「および/または(and/or)」を意味する。さらに、用語「含む(including)」ならびに「含む(includes)」および「含まれる(included)」など他の形態の使用は限定されない。本明細書で参照した全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
用語「ベクター」は、当技術分野で公知のように、遺伝材料を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、DNAまたはRNAのいずれかから構成されるまたはDNAまたはRNAのいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはDNAから構成される。いくつかの実施形態では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養でも宿主動物でもウイルスベクターの複製に機能を持たない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の特定の態様に従って、ベクターは、遺伝材料の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクションのため、ワクチン、例えばDNAワクチンとしての使用のため、または遺伝子発現目的のためなど、様々な態様のために使用され得る。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列によって導かれるように細胞におけるタンパク質の生合成を記載する用語である。特定の態様では、ベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する1つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである「発現ベクター」であってよい。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムからの配列を組み込むことができる。配列は、それらの自然な形態に組み込まれることができ、または任意の方法で改変され、所望の活性を得ることができる。例えば、配列は、挿入、欠損または置換を含むことができる。
好ましいウイルスベクターは、EHV−1またはEHV−4またはPrV(仮性狂犬病ウイルス)またはBHV−1(ウシヘルペスウイルス1)のような他のバリセロウイルス由来などのヘルペスウイルスベクターを含む。
用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は交換可能に使用することができる。
用語「構築物」は、本明細書で使用する場合、人工的に生成されたプラスミド、BAC、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能であり任意の核酸を指す。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、5つの生物学的に生じる塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基から構成される核酸も特別に含む。
「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、翻訳開始シグナルまたはATGもしくはAUGなどの開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、DNAまたはRNAのいずれかの核酸配列の長さを指す。
用語「転写」は、細胞でのmRNAの生合成を記載する。
発現、力価または生産性増加は、本発明に記載の異種ベクターを使用することによって得ることができる。これは、追加の選択可能マーカーとして、1つまたは複数の蛍光タンパク質(例えばGFP)または細胞表面マーカーを含有する組換え宿主細胞のFACSアシスト選択などの他の手法と組合せることができる。発現増加を得る他の方法、および使用することができる異なる方法の組合せも、例えばクロマチン構造(例えば、LCR、UCOE、EASE、アイソレーター、S/MARs、STARエレメント)の操作のためのcis活性エレメントの使用、(人工)転写因子の使用、内在性または異種および/または外因性遺伝子発現を上方制御するための天然または合成剤による細胞の処置、mRNAまたはタンパク質の安定性(半減期)の改善、mRNA翻訳の開始の改善、エピソーム性プラスミドの使用による遺伝子用量の増加(複製オリジンとしてウイルス配列の使用に基づく、例えばSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、EBV、またはBPV)、DNAコンカテマーに基づく増幅促進配列またはin vitro増幅システムの使用に基づく。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの調節下で転写されるmRNAの定量によって間接的に測定される。mRNAは、内因性の標準と比較して、RTqPCRによって定量される。
「転写制御エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、転写一次産物、すなわちmRNA前駆体に組み込まれる最初の核酸に相当する構築物の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてよい。
用語「非天然型」は、この文脈において天然には生じない抗原などの目的の任意の配列または遺伝子、例えば異なる種由来の抗原などの目的のハイブリッド配列もしくは配列もしくは遺伝子、または人工的な変異、挿入、欠損等により天然の産物ではない、抗原などの目的の配列もしくは遺伝子を意味する。
したがって、用語「異種ベクター」は、異種または外因性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。用語「組換えベクター」は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
用語「ウマ(equid)」または「ウマ(equine)」または「ウマ(equin)」は、ウマ、ロバ、およびシマウマを含み、好ましくはウマである、ウマ科を意味するまたはウマ科に属する。さらに、用語「ウマ(equid)」または「ウマ(equine)」または「ウマ(equin)」は、ウマ科のメンバーのハイブリッドも包含する(例えば、ラバ、ケツテイ等)。
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
用語「EHV−1」は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス1型を意味する。EHV−1の非限定的な参照配列は、例えば野生型EHV−1株ab4(Genbank受入番号AY665713.1)またはRacH(Hubert 1996)。
用語EHV−4は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス4型を意味する。
用語「ORF70に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス1型オープンリーディングフレーム70をコードする位置で、ゲノムDNAにDNA断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、ORF70の5’の801塩基対の欠損をもたらし、3’端の残りの423bpは無傷なままで残すが、orf70遺伝子産物糖タンパク質Gの発現を無くす。EHV−1を含むいくつかのアルファヘルペスウイルスの糖タンパク質Gは、感染細胞から分泌され、炎症促進性サイトカインの結合によって免疫調節性タンパク質として機能することが示された。ウイルスベクターでのその発現が無くなると、無傷な糖タンパク質Gを発現する野生型EHV−1と比較した場合、ウイルス感染の免疫原性を増大させるはずである。
用語「ORF1/3に挿入された」は、ワクチン株EHV−1 RacHの弱毒化手順中の継代での偶発的な欠損によって、ORF1の90%および全ORF2を含む1283bpの断片が欠失する位置で、ウイルスゲノムにDNA断片が挿入されたことを意味する。この挿入部位は、この位置からの導入遺伝子の発現がウイルスの複製と干渉する可能性が極端に少ないと予測されたため、選択された。
「免疫原性または免疫学的組成物」は、組成物に対する細胞または抗体媒介性免疫応答の宿主での免疫学的応答を引き出す少なくとも1つの抗原、またはその免疫原性部分を含む物質の組成物を指す。
用語「食物生産動物」は、例えば、ブタ、ウシ、家禽、魚等、ヒトによる消費のために使用される動物を意味し、好ましくは、食物生産動物はブタおよびウシを意味し、最も好ましくはブタである。用語「食物生産動物」は、ウマなどのウマ科を除外する。
用語「感染多重度(M.O.I.)」は、どのくらいのウイルス調製物の感染単位、例えばTCID50が、細胞当たり使用され培養細胞に感染するかを記載する。例えば、0.01のM.O.I.は、1つの感染ユニットが接種される培養容器中100個の細胞全てを意味する。
用語「DNAワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」は、適切な医薬組成物を使用する遺伝材料の直接接種を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「不活性化」、「死菌」または「KV」は交換可能に使用される。
用語「生ワクチン」は、生きた生物または複製可能なウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
「弱毒化」は、病原体の毒性を低下させることを意味する。本発明では、「弱毒化」は「非病原性」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、感染の臨床徴候を引き起こさないが標的動物における免疫応答を誘導することはできるように毒性を低下させたものであるが、弱毒化ウイルス、特に請求項のようにEHV−1 RacHウイルスベクターを感染させた動物における臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化していないウイルスまたは病原体を感染させ、弱毒化ウイルスを受けていない「対照群」の動物と比較して低下することも意味し得る。この場合、用語「低下する/低下した」は、上記で定義された対照群と比較して少なくとも10%、好ましくは25%、さらにより好ましくは50%、なおより好ましくは60%、さらにより好ましくは70%、なおより好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、および最も好ましくは100%の低下を意味する。したがって、例えば請求項のように弱毒化ウイルスベクターなどの、弱毒化した非病原性病原体、特に請求項のようにEHV−1(好ましくはRacH)ウイルスベクターが、改変生ワクチン(MLV)または改変生免疫原性組成物の生成に適している。
本明細書では、「有効用量」は、限定はされないが、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味する。
「長期にわたる防御」は、少なくとも3週間、より好ましくは少なくとも3ヵ月、なおより好ましくは少なくとも6ヵ月にわたって持続する「改善された有効性」を指す。家畜の場合、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
本明細書で使用する場合、用語「ウイルス血症」は、動物、特に哺乳動物、トリ、または昆虫の血流中でウイルス粒子が複製および/または循環する状態として特に理解される。
用語「ワクチン接種(vaccination)」または「ワクチン接種すること(vaccinating)」またはその変形は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、動物に投与されると、動物における免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
「死亡率」とは、本発明の文脈では、感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
組成物を投与する対象は、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えば、ニワトリ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット、を含む動物であることが好ましく、最も好ましくは、哺乳動物はブタである。
本発明の製剤は、有効な免疫量の1つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫量の1つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は投与の形式に適したものであるべきである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
投与の好ましい経路としては、限定はされないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲料水での投与、最も好ましくは単回用量が望ましい。当業者は、本発明の組成物が、1用量、2用量、またはそれ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることを理解するであろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、所望の処置の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物は、1回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヵ月にわたって毎日、異なる投与量、例えば、約103〜108TCID50(上記のウイルス力価を参照)で投与することができる。本発明の特定の態様では、特に生ウイルス/生ワクチンに関して、投与量は約103〜108TCID50である。
以下の配列は、本発明において本明細書に詳細に記載され、開示される。
プロモーター:
配列番号1 EHV−4 600bp デオキシリボ核酸配列 4pgG600
配列番号2 EHV−4 600bp デオキシリボ核酸配列 4pMCP600
配列番号3 EHV−4 430bp デオキシリボ核酸配列 pG430
配列番号4 EHV−4 449bp デオキシリボ核酸配列 p455
配列番号5 orf72に特異的なプライマー番号1130
配列番号6 orf72に特異的なプライマー番号1131
配列番号7 mCherryに特異的なプライマー番号1079
配列番号8 mCherryに特異的なプライマー番号1080
配列番号9 orf70挿入領域の人工配列核酸PCRプライマー1017
配列番号10 orf70挿入領域の人工配列核酸PCRプライマー1018
配列番号11 orf1/3挿入領域の人工配列核酸PCRプライマー1007
配列番号12 orf1/3挿入領域の人工配列核酸PCRプライマー1008
配列番号13 左(Up70)隣接領域(417bp)
配列番号14 右(Up71)隣接領域(431bp)
配列番号15 ヌクレオチド127264〜127680に位置する、野生型EHV−1株ab4(Genbank受入番号AY665713.1)の隣接領域左(orf70上流)
配列番号16 ヌクレオチド128484〜128913に位置する、野生型EHV−1株ab4(Genbank受入番号AY665713.1)の隣接領域右(orf71上流)
配列番号17 REDシステムにおけるトランケートした隣接領域:左(Up70)隣接領域(283bp)=417bpの「クラシカルな」隣接領域の3’の283bpと同一
配列番号18 REDシステムにおけるトランケートした隣接領域:右(Up71)隣接領域(144bp)=431bpの「クラシカルな」隣接領域の5’の144bpと同一
配列番号19 野生型ab4(Genbank受入番号AY665713.1)ゲノム配列の欠損部分、ヌクレオチド127681〜128482
配列番号20 RacHゲノム配列の欠損部分(完全なゲノム配列が公知ではないため、ヌクレオチド番号が入手できない)
配列番号21 トランスファープラスミドpU−mC70−BGHのヌクレオチド配列
配列番号22 トランスファーベクターpU70−p455−71K71のヌクレオチド配列
配列番号23 トランスファープラスミドpU70−p455−H3−71K71のヌクレオチド配列
配列番号24 トランスファーベクターpU−1−3−p430−BGHKBGHのヌクレオチド配列
配列番号25 トランスファープラスミドpU1−3−p430−H1av−BGHKBGHのヌクレオチド配列
配列番号26 ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2))] GenBank:ADR01746.1 H1pdm
配列番号27 ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))] GenBank:ABS50302.2 H3:
配列番号28 ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))]GenBank:AFR76623.1 H1av:
配列番号29 ヘマグルチニン[A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/4675/2003(H1N2))]GenBank:ADK98476.1* H1hu
*アミノ酸531(X、終止コドンは、発明者らによってIに変更された)に注意されたい
配列番号30 GSリンカー配列
配列番号31 サブクローニングのための制限酵素部位を含む合成DNA配列
配列番号32 pRacH−SE−70−455−SBVGcを生成するRED組換えに使用されるDNA断片
配列番号33 up70 F プライマー
配列番号34 up71 R プライマー
配列番号35 seq455−F1 プライマー
配列番号36 SBV Gc F1 プライマー
配列番号37 SBV Gc R1 プライマー
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の1つまたは複数を本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組合せて参照することによってよりよく理解することができる。
新しいプロモーターの同定および構築
適切なプロモーター配列を同定する戦略は以下の通りであった:2つの公知のorfの上流のEHV−4配列の600bp断片が、それらをEHV−1ゲノムのそれぞれの配列断片とアラインすることによってまず分析された。選ばれた遺伝子は主キャプシドタンパク質(MCP)をコードするorf42、糖タンパク質G(gG)をコードするorf70であった。主キャプシドタンパク質は、ビリオンの最も豊富な構成成分の1つであり、新しく合成されたウイルスDNAのパッケージングの準備ができるとすぐに細胞核でのキャプシドのアセンブリーに必要とされる。したがって、そのプロモーターは、ウイルス複製サイクルの初期および後期に活性であると予測される。糖タンパク質Gに関して、その遺伝子(orf70)も複製サイクルの初期および後期に活性であることが公知である(Colle et al. 1995, Drummer et al. 1998)。配列同一性は、推定のMCPプロモーターでは82.2%であり、推定のgGプロモーターでは82.3%であった。これらの違いは、一方では相同組換えを防ぐのに十分大きく、他方ではEHV−1複製中に転写活性化を可能にするのに十分小さいと考えられた。プロモーター活性を試験するため、600bpのDNA断片4pgG600
短くなったプロモーターを含有するmCherryレポータープラスミドが細胞培養にトランスフェクトされ、蛍光顕微鏡によって調べられた。p430活性は、600bpバージョン(4pgG600)のものに相当したが、p455の活性は4pMCP600の活性よりも著しく増大された。この結果は、2つのプロモーターの600bpバージョンを使用するトランスフェクション/重感染実験の結果と一致し、つまり、同じ細胞におけるEHV−1複製の存在が、4pMCP600プロモーターのトランス活性化のメカニズムを提供し、その活性を強く増大させるが、4pgG600プロモーターのトランス活性化は見られたが明白ではなかった。
VERO(V)またはPK/WRL(P)細胞での2つの実験は直接比較できないが、PK/WRL細胞でのより高い発現レベルは、通常感染性ウイルスの10倍高い力価を生じるEHV−1複製のためのPK/WRL細胞の優れた許容度を最も反映するようである。
EHV−由来プロモーターp430、p455およびegGpの活性は、使用した細胞株の感染後の各時間でほぼ同じであり、それらの挿入部位または使用したポリA(BGHまたは71pA)とは無関係であり、CMV−およびMCMVプロモーターの活性はPK/WRL細胞でより高い。VERO−EU細胞では、MCMVプロモーターのみがより高い活性を持つことが示され、CMVプロモーターはEHV−プロモーターよりも優れていなかった。
これらの実験から、EHV−4プロモーターp430およびp455は、EHV−1 RacH骨格で使用され、orf1/3およびorf70挿入部位の両方から、挿入された導入遺伝子の発現を駆動するのに適していたと結論づけられた。
組換えEHV−1ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築における新しいp455プロモーターの使用
p455プロモーター
最初の動物実験のため、ブタ起源A型インフルエンザウイルス(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、GenBank受入番号:ABS50302.2)由来のインフルエンザヘマグルチニンH3亜型が使用された。そのコード配列は合成およびサブクローニングされて、トランスファーベクターpU70−p455−H3−71K71を生成し、H3を新しいp455プロモーターおよび新しい71pAポリアデニル化シグナルの調節下に置き、orf70への挿入のための組換え領域を有するカセットをフレーム調整した(図5)。
RED組換えシステムを使用するen−passant変異導入によって(Tischer et al. 2006)、発現カセットp455−H3−71がpRacH−SEのorf70に挿入され、pRacH−SE70−p455−H3が生成された(図6)。
p455プロモーターおよび血清学的応答の評価を使用する動物実験の概念の証明(POC I)
試験動物:組入れ基準および実験デザイン
A型インフルエンザ無感作の雌ブタから生まれた10匹の子ブタの5つの群が、表2に要約したようにPOC−I実験に含まれた。
1×107 TCID50のrEHV−1 RacH−SE−70−p455−H3による2回のワクチン接種は、異種IAV、H3N2亜型によるチャレンジ感染に対してブタを完全に保護した。
EHV−1ベクターRacH−SEがブタのワクチン接種に適しており、新しいプロモーター455が、ワクチン接種したブタにおいてIAVヘマグルチニンの免疫原性発現の駆動に機能的であることが実証された。
組換えEHV−1ベクターワクチンおよび組換えウイルスの構築における新しいp430プロモーターの使用
p430プロモーター
新しく同定されたp430プロモーターは、H1N1ウイルス((A/swine/Gent/132/2005(H1N1)、GenBank受入番号AFR76623.1)由来の別のインフルエンザヘマグルチニンの発現を駆動するために使用された。このウイルス単離株のヘマグルチニン遺伝子はトリIAVに由来するため、H1avと呼ばれる。H1avは合成、およびトランスファーベクターのorf1/3挿入領域にサブクローニングされ、pU1/3−p430−H1av−BGH_K_BGHを生成した。H1avの発現は、p430プロモーターおよびウシ増殖ホルモン(BGH)ポリAシグナルの調節下に置かれた(図10)。
RED組換えシステムを使用するen−passant変異導入によって(Tischer et al. 2006)、発現カセットp430−H1av−BGHはpRacH−SEのorf1/3に挿入され、pRacH−SE1/3−p430−H1avが生成された(図11)。
EHV−1 gpIIをコードするorf71の回復は、モノクローナル抗体Ai2G7(BI所有)を使用するIFAおよびウェスタンブロットによって確認された(データは示さない)。H1avの正確なプロセシングおよび輸送、ならびに感染細胞の細胞膜上の局在は、トリの赤血球を使用する赤血球吸着試験によって評価された(データは示さない)。PK/WRL細胞においてTCID50/mlとして決定されたピーク力価は、親ウイルスRacH−SEの力価と同じ範囲であり、導入遺伝子発現は、ウイルス複製に有害効果を持たなかったことを示している(データは示さない)。
抗体PA−34929によって75kDaの広帯域の移動の特異的検出は、その配列から予測されるように、組換えHA糖タンパク質の予測される出現と一致する。モノクローナル抗体C102による細胞膜の明らかな染色は、予測される細胞内局在に則している(図12)。
感染細胞の赤血球吸着の明確な表現型は、導入遺伝子タンパク質の効果的な発現を示し、EHV−1ベクター感染細胞の細胞表面上の機能的HA三量体の形成を示唆するウェスタンブロットおよび免疫蛍光法による知見を支持する。
組換えEHV−1ベクターワクチンにおける並行する2つの挿入部位での2つの新しいプロモーターp455およびp430の使用
2つの新しいプロモーターが並行して使用され得ることを示すため、組換えEHV−1 RacHは2つの異なるA型インフルエンザウイルス亜型の2つの異なるヘマグルチニンを発現するように生成された。
H3(PA5−34930)およびH1(PA5−34929)に対する市販のポリクローナル抗体の交差反応性の特異性および欠如は、単一インサートウイルスrEHV−1 RacH−SE−70−p455−H3およびrEHV−1 RacH−SE−1/3−p430−H1avを感染させた感染細胞のウェスタンブロットによって確かめられた(データは示さない)。
図14に示されるように、導入遺伝子H3とH1avの両方は、二重インサート組換えrEHV−1 RacH−SE−1/3−p430−H1av−70−p455−H3(B)を感染させた細胞培養中で並行して発現された。導入遺伝子発現は安定であり、PK/WRL細胞の継代11回まで試験されたウイルス力価を損なわなかった(データは示さない)。
新しいp455およびp430プロモーターを使用するrCAV−2ベクターワクチン
方法
以下のrCAV−2を感染させたAI−ST 2015細胞
1.CAV−2 CMVie BRSV(抗CAV2の陽性対照;抗VP2の陰性対照)
2.CAV−2 p430 CPV VP2(非スプライシング A1−2−1)
3.CAV−2 p430 CPV VP2(Gen 0.95 D1−5−1)
4.CAV−2 p455 CPV VP2(Gen0.95 E1−8−1)
5.CAV−2 p430 RabG (n)
6.CAV−2 p455 RabG (n)
免疫蛍光分析(IFA)
AI−ST2015細胞は、感染の72時間後にCytofix/Cytopermにより固定され、抗CPV VP2−FITC(mAb)、抗RabG−FITC(mAb)および抗CAV−2−FITC(ブタ抗血清)(VMRD)によって染色される。
AI−ST2015細胞は、感染の48および72時間後にCytofix/Cytopermにより固定され、細胞は抗CAV−2−FITC、抗CPV VP2−FITC(VMRD)、CPVに対するブタ高度免疫血清(Benchmark)および抗RabG−FITC(Novus)によって染色される。
CPV VP2のドットブロット
感染E1B MDCK(rCAV−2の)細胞由来の澄ませた(6000×g、5分)組織培養上澄み液/ライセート(凍結/解凍)は、装置への添加前にPBSによって段階希釈され、吸引によってPVDFに吸着される。次のステップは、TBST中の5.0% BioRad Blotting Grade Blockerに30分暴露され、一次抗体に1.0時間暴露され、TBSTで3回洗浄され、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート二次抗体(抗マウスおよび抗ブタ、Jackson ImmunoResearch)に1.0時間暴露され、TMBによって可視化される。定量のため、ドットブロットは、ImageJソフトウェアを使用して分析される(Burger, W., Burge, M.J. (Eds.), 2008. Digital Image Processing: An algorithmic introduction using Java. Springer-Verlag, New York)。画像カラーは、反転されてバックグラウンドを引き、記録された各ドットの密度を統合される。値は、以下のように+および−表記で割り当てられる:「++++」=>800000、「+++」=500000〜800000、「++」=300000〜499999、「+」=120000〜299999、「+/−」=80000〜119999、および「−」=<80000。
rCAV−2ワクチンウイルス感染細胞によるウイルス様粒子(VLP)の生成は、イヌアデノウイルス(CAV−2)ワクチン効率に重要な因子であり得る。CMVie−駆動CPV VP2発現カセットを含有するrCAV−2はレスキューされ得るが、rCAV−2 CMVie CPV VP2感染細胞での実質的なVP2発現(VLP生成のため)は、従来のCMVieプロモーターを使用して達成できなかった。CMV5プロモーターを含有するrCAV−2 VP2ウイルスはレスキューできなかった。
結論として、IFA、FCおよびドットブロットは、感染AI ST 2015細胞におけるrCAV−2によるCPV−VP2導入遺伝子の強いEHV−4プロモーター駆動発現を実証する。これらの結果は、EHV−1以外のベクターにおけるEHV−4プロモーターの有用性を確認する。
第2のCAV−2構築物は、本発明の新しいEHV−4由来p455プロモーターを使用して生成された。感染細胞による発現が従来のCMVieプロモーターを使用して観察されなかったため、rCAV−2 RabG(n)が選択された。
この実験の目的は、rCAV−2 p455 RabG(n)−感染AI−ST 2015細胞によるEHV−4プロモーター駆動RabGタンパク質発現の測定によって、第2の導入遺伝子、RabG(膜タンパク質)を有するrCAV−2に関して新しいEHV−4プロモーターの活性を確認することであった。
結論として、IFAおよびFCデータは、感染AI ST細胞によるrCAV−2によるRabG導入遺伝子のEHV−4プロモーター駆動発現を実証する。これらの結果は、EHV−1以外のベクターにおける本発明のEHV−4プロモーターの有用性をさらに確認する。
ブタのための一価のEHV−1ベクターA型インフルエンザウイルスワクチン(H3ワクチン)の生成、in vitro特性決定、およびin vivo試験
血清型H3のブタIAVインフルエンザウイルスヘマグルチニン(配列番号27)(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2)、GenBank受入番号:ABS50302.2)が、ブタのワクチン研究のために試験される抗原として選ばれた。ブタIAVに対するこの新しいワクチンは、1つのブタIAV HAタンパク質のみを発現するため、例えば、ブタIAV野外株に感染した動物ではブタIAVタンパク質NPまたはNAに対する抗体が検出されるが、本明細書に記載のワクチンによってのみワクチン接種された動物では検出されないことによってDIVA特性を提供する。そのコード配列は、合成およびサブクローニングされ、トランスファーベクターpU70−p455−H3−71K71を生成し、H3は新しいp455プロモーター、および新しい71pAポリアデニル化シグナルの調節下に置かれ、orf70への挿入のための組換え領域によってカセットがフレームに合わされた(図1および図5)。
RED組換えシステムを使用するen−passant変異導入によって、発現カセットp455−H3−71がpRacH−SEのorf70に挿入され、pRacH−SE70−p455−H3が生成された。
PK/WRL細胞は、pRacH−SE70−p455−H3をトランスフェクトされ、組換えウイルスrEHV−1 RacH−SE70−p455−H3がレスキューされ、2回プラーク精製された(図6)。
モノクローナル抗H3抗体およびウマ抗EHV抗血清を使用するP20を感染させた細胞におけるウイルスプラークの二重免疫蛍光法(dIFA)によって、事実上全てのEHV−1誘導プラークがH3も発現することが確認された(データは示さない)。全ての試験により、組換えEHV−1 Rac−SE−70−p455−H3の安定性を確認した。
ブタIAVチャレンジウイルス適用後の体温上昇を調べる場合、非ワクチン接種動物はチャレンジ1日後に約1℃の体温上昇を示した。RacH−SE−70−p455−H3ワクチンにより2回ワクチン接種した群では、チャレンジ1日後のこの体温上昇は防がれた(図20)。
ブタIAVチャレンジウイルス適用後1または3日で殺された動物からの平均ブタIAV肺力価は、陰性対照は肺試料においてブタIAVを示さないが、チャレンジ対照は5より多い(3日目)から7logより多い(1日目)範囲の肺組織g当たりのウイルス力価を示すことを示した。全く対照的に、群平均値は、RacH−SE−70−p455−H3ワクチンで1回ワクチン接種した群では、約2logまたはそれより少なくなるまで強く減少し、RacH−SE−70−p455−H3ワクチンで2回ワクチン接種した群では、検出できないレベルまで減少した(図22)。
ブタのための四価のEHV−1ベクターA型インフルエンザウイルスワクチンの生成、in vitro特性決定、およびin vivo試験
以下に記載したように、記載した本発明では、H1N2、H3N2、H1N1トリ、およびH1N1パンデミックブタIAV亜型/血清型に由来する記載した4つのブタIAVヘマグルチニン(HA)抗原が、2つの組換えEHV−1ベクターウイルスによって発現される。ブタIAVに対するこの新しい四価のワクチンは、ブタIAV HAタンパク質のみを発現するため、例えば、ブタIAV野外株に感染した動物ではブタIAVタンパク質NPまたはNAに対する抗体が検出されるが、本明細書に記載のワクチンによってのみワクチン接種された動物では検出されないことによってDIVA特性を提供する。
新しい四価のブタIAVワクチンは、in vitroで特性決定され、ブタIAVに対するその効果をin vivoで試験される。
抗体PA−34929によって75kDaの広帯域の移動の特異的検出は、その配列から予測されるように、組換えHA糖タンパク質の予測される出現と一致する。モノクローナル抗体C102による細胞膜の明らかな染色は、予測される細胞内局在に則している。
次に、2つの異なるA型インフルエンザウイルスの亜型/血清型の2つの異なるヘマグルチニンを発現する組換えEHV−1 RacH−SEが生成された。
導入遺伝子H3とH1avの両方は、二重インサート組換えrEHV−1 RacH−SE_Bを感染させた細胞培養中で並行して発現された。導入遺伝子発現は安定であり、PK/WRL細胞の継代11回まで試験されたウイルス力価を損なわなかった。
2つの挿入部位および2つの新しいプロモーターを有する増強されたEHV−1ベクターは、2つのインフルエンザウイルスヘマグルチニンを並行して発現することが示された。IFAによって決定された細胞内局在およびウェスタンブロットによって決定されたSDS−PAGEでの移動度は、文献から公知のA型インフルエンザウイルス感染細胞において発現された真正のヘマグルチニンに相当した。
次に、ヘマグルチニンH1hu、配列番号29(A/swine/Italy/4675/2003(H1N2);GenBank受入番号ADK98476.1)およびH1pdm、配列番号26(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2);GenBank受入番号ADR01746.1)を発現する、第2の二重インサートrEHV−1 RacHが生成された。
H1pdmのコード配列は合成およびサブクローニングされ、トランスファーベクターpU70−p455−H1pdm−71K71を生成し、H1pdmを新しいp455プロモーターおよび新しい71pAポリアデニル化シグナルの調節下に置かれ、orf70への挿入のための組換え領域によってカセットがフレームに合わされた(図26)。
組換えrEHV−1の遺伝的および表現型安定性は、細胞培養の継代によって示され、5回の継代ごとにウイルス力価を決定した。挿入領域の配列は10回の継代ごとに、ならびに導入遺伝子の発現はウェスタンブロットによって確認された(データは示さない)。発現忠実度は、メトセル−オーバーレイ下のプラークの二重IFAによって評価され、抗EHV抗体および導入遺伝子特異的抗体によって染色されたプラークがカウントされた(データは示さない)。
二価のrEHV−1 RacHベクターワクチンによってワクチン接種されたマウスにおける2つの抗原に対する中和抗体応答の誘導
発現された導入遺伝子がブタ以外の別の種で免疫原性で有り、抗体の中和が鼻腔内適用による2つの抗原のうちのいずれか1つに対して誘導されることを実証するため、rEHV−1 RacH SE B(rEHV−1 RacH−SE−1/3−p430−H1av−7−p455−H3、図13参照)がBalb/cマウスの免疫化に使用された。
AI−ST細胞には、感染の24時間後に空ベクターBAC pRacH−SE1.2.からレスキューされたウイルスであるrEHV−1 RacH−SE1212を、0.001の多重感染度(MOI)で感染させ、特有のプラークが観察され、細胞は間接免疫蛍光法(IFA)のために処理された。PBS中で1:50に希釈された最終的な血液の3つの群全ての血清(2回目のワクチン接種後14日で得た)が試験された。陽性対照として、EHV−1ワクチン接種したウマの血清が、1:500希釈で使用された。二次抗体は、マウス血清には、市販のFITCコンジュゲートウサギ抗マウスIgG、ウマ血清にはCy5コンジュゲートヤギ抗ウマIgGであり、1:200希釈で使用された。抗体結合は蛍光顕微鏡によって評価された。全てのワクチン接種マウスは、IFAにおいて、rEHV−1 RacH−SE−感染細胞に反応性の抗体を発生した。非感染細胞には、試験した血清のいずれも結合しなかった。マウスの陰性対照群からの血清は、感染細胞にも非感染細胞にも、特異的な結合を示さなかった。データは以下の表に要約する。
A型インフルエンザウイルス(IAV)(A/swine/Italy/7680/2001(H3N2))または(A/swine/Gent/132/2005(H1N1))のいずれかに由来する発現された導入遺伝子に対する保護免疫の誘導を示すため、マウス血清は、それぞれのウイルスに対する中和活性について試験された(Allwinn et al. 2010; Trombetta et al. 2014)。中和試験に使用されるIAVは、2014年からドイツでのブタからの単離株、特に、A/swine/Germany/AR452/2014(H3N2)およびA/swine/Germany/AR1181/2014(H1N1)であった。これらは、ワクチン標的が由来する株とは異種であるため、マウス血清によるこれらのウイルスの任意の中和は、rEHV−1ワクチン接種による保護免疫の広く効果的な誘導を示す。陰性対照血清として、インフルエンザウイルス抗体に陰性であることが示されたブタ由来の血清が使用された。
96ウェルプレートでのウイルス中和ならびに逆滴定のためのMDCK細胞は、使用前に、37℃/5%CO2で2日間インキュベートされた。それぞれのIAVストックH3N2およびH1avN1は氷上で解凍され、ゲンタマイシンおよび2倍の濃度のトリプシンを含有するMEM(MEM/Genta/2×トリプシン)で希釈された。
試験した血清は、群1(rEHV−1 RacH SE B)、群2(空ベクター)、陽性対照(不活性化多価IAVワクチンによってワクチン接種されたブタ由来の血清および陰性対照の最終血液に由来した。
ベクターrEHV−1 RacH−SEは、2つの異なる導入遺伝子の並行発現のために使用され、鼻孔内ワクチン接種後に免疫応答を刺激することができると結論づけることができる。
ウシのためのEHV−1ベクターシュマレンベルク(Schmallenberg)ウイルス(SBV)ワクチンの生成、in vitro特性決定およびin vivo試験
出現したブニヤウイルスの1つは、シュマレンベルクウイルス(SBV)、最初のヨーロッパシンブ血清群ウイルス(オルソブニヤウイルス属)であり、妊娠動物が妊娠期間の危機的状況中に感染する場合、流産、死産、および重度の胎児奇形を引き起こすことがあり、これまで、オルソブニヤウイルス研究のためのモデルウイルスとしてますます使用されている(Bilk et al.,2012)。シンブウイルスは昆虫ベクターによって伝染され、処置選択が利用できないため、ワクチン接種が疾患調節の主要な要素である。SBVおよびアカバネウイルス(AKAV)またはアイノウイルスなどのさらなるシンブウイルスに対する、不活性化全ウイルスワクチンが入手可能であり、SBVに対する生弱毒化ワクチンが開発されているが(Anonymous, 2013, 2015; Kraatz et al., 2015; Wernike et al., 2013b)、これらのワクチンのいずれも、野外感染とワクチン接種動物を区別(DIVA原理)できない。最近になって、SBV糖タンパク質Gcのアミノ末端の234アミノ酸(aa)に基づくDIVA互換性サブユニットワクチンが、致死性の小動物チャレンジモデルおよびウシで試験された(Wernike et al., 2017)。発現プラスミドとして送達される場合、または哺乳動物細胞培養系で発現される場合、Gcドメインは動物の66%まで保護を与えるが、関連するAKAVの相当するドメインに結合するSBVのGcドメインによって免疫された全ての動物は完全に保護された(Wernike et al., 2017)。ウシにおけるベクターワクチンとしてのrEHV−1 RacH−SEの適用を調べるため、SBV−Gcの234アミノ末端が、orf70(US4)挿入部位に挿入され、新しいp455プロモーターおよび71pAポリAシグナルの調節下で発現され、ウシのワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
シュマレンベルクウイルス(SBV)糖タンパク質c(Gc)のコード領域の234アミノ酸部分は、EHV−1での発現のためにコドン利用が最適化され、感染細胞の細胞膜への効果的な輸送および挿入を達成するためにさらに改変された。この目的のため、A型インフルエンザウイルス(IAV)ヘマグルチニン(HA)亜型H1N2(A/swine/Italy/116114/2010(H1N2)、GenBank受入番号ADR01746.1)由来の配列をコードするシグナルペプチドならびにそのHA由来の膜貫通アンカー(TM)および細胞質C末端が、それぞれ5’および3’端に結合された。さらに、GSリンカー、HMGGSGGGGSGGGGSGGGT(配列番号30)がGcタンパク質とHA−TMドメインの間に挿入された。DNA(配列番号31)が合成され、BAC pRacH−SEのRED媒介組換えによるEHV−1のorf70(US4)への導入遺伝子発現カセットの挿入のためのトランスファーベクター、pU70−455−71K71のNotI/KpnI部位にサブクローニングされた。生じたプラスミドpU70−455−SBVGc_71K71(図30)は、XbaIで切断され、3056bpのDNA断片(配列番号32)を放出し、pRacH−SEを有する大腸菌K12 GS1783へと形質転換された。
制限酵素切断部分はアスタリスク(*)によって示す
BAC DNAは、pRacH−SE−70−p455−SBVGcの4つの異なるクローンから調製された。AI−ST細胞(Boehringer−Ingelheim所有のブタ精巣細胞株)は、10%FBS(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、ミュンヘン、ドイツ、SAFC、Cat 12003C−1000ml)を含有するMEM(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、ミュンヘン、ドイツ、SAFC62892−1000M3056)中、105個の細胞/ウェルの密度で6ウェルプレート(Corning Incorporated−Life Sciences、One Becton Circle、Durham、NC 27712、USA;REF 353046)に播種された。細胞が60〜70%コンフルエントになった時、通常翌日、供給業者の指示に従って、Mirus(商標)mRNAトランスフェクションキット(Mirus Bio LLC、545 Science Drive、Madison、WI 53711 USA)を使用して、2μgのBAC DNAがトランスフェクトされた。簡潔に言うと、200μlのOptimem(商標)(Thermo Fisher Scientific)培地が、5mlポリスチレンチューブに添加された。DNAが添加され、混合された。次に、3μlのブースト試薬が添加され、旋回によって混合された後に同じ容量のトランスフェクション試薬が添加され、旋回によって再び混合された。混合物は、室温で3分間インキュベートされ、次いで細胞培養に直接滴下添加された。細胞は、5日間37℃/5% CO2でインキュベートされた。細胞は培地中でリンスされ、−80℃での保存のために回収された。レスキューウイルスの1:10段階希釈はMEM中で調製され、6ウェルプレート中のコンフルエントなAI−ST細胞の単層上に置かれた。37℃/5%CO2での1時間の吸着後、接種源は除去され、細胞は、0.5%メトセル(Methyl cellulose Ph.Eur.、Fluka 64632−500G)および5%FBS(MEM−Methocel)を含有する半固体培地でオーバーレイされた。2〜3日間、37℃/5%CO2でインキュベーション後(継代1)、可能な限り近くのプラークと離れて位置する個々のプラークは10μlの容積で吸引され、6ウェルプレートの新しいAI−ST細胞培養に接種された。感染細胞は、大量のCPEが観察されるまで2〜3日間インキュベートされた(継代2)。細胞は、培地でリンスされ、−80℃での保存のために回収された。プラーク精製のこの手順は、2回繰り返された。3回プラーク精製されたウイルスを感染させたAI−ST細胞は、それぞれ間接免疫蛍光法(IFA)またはウェスタンブロットのために処理された。
24ウェルプレート(Corning Incorporated−Life Sciences、One Becton Circle、Durham、NC 27712、USA;REF 353047)中のAI−ST細胞には、MEMで段階希釈された3回プラーク精製ウイルスを感染させた。増殖培地は細胞から吸引除去され、細胞は250μLの希釈ウイルス(希釈率10-2〜10-7)でオーバーレイされた。細胞は、ウイルスの吸着のため、37℃/5%CO2で1時間インキュベートされ、次いで接種源が除去され、細胞は1000μLのMEM−Methocel/ウェルでオーバーレイされ、2日間37℃/5%CO2でインキュベートされた。プラーク形成が顕微鏡で観察された場合、細胞はIFAのために処理された。培地は吸引され、細胞は1mlのPBS(Gibco Life Technologies、Paisley PA49RF、UK、DPBS(1x)REF 14190−136)/ウェルで1回洗浄された。PBSは除去され、細胞は1ml/ウェルの−20℃の冷エタノール(Carl Roth GmbH、Schoemperlenstr.3−5、D−76185 Karlsruhe、Art.Nr.5054.1)の添加および室温での30分間のインキュベーションによって固定された。エタノールは吸引され、細胞は風乾された。室温で10分間、1ml/ウェルのPBSによる細胞の再水和後、PBSで希釈された一次抗体が添加され(150μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートされた。一次抗体が除去され、細胞は、二次抗体希釈(150μl/ウェル)の添加前に、1ml PBS/ウェルによって2分間、3回洗浄された。光から保護された室温での1時間のインキュベーション後、二次抗体希釈が除去され、細胞は1ml PBS/ウェルによって2分間、3回洗浄され、蛍光顕微鏡による精査のために500μl PBS/ウェルで最終的にオーバーレイされた。使用した抗体は表7に列挙される。
1.感染:6ウェルプレート中のAI−ST細胞のそれぞれコンフルエントな単層の3つのウェルに、解凍したウイルスストックのそれぞれ50μlおよび10μlを増殖培地に直接添加することによって、2つの異なるプラーク単離株rEHV−1 RacH−SE−455−SBVGc(#121.131 P6および#121.232 P6)およびrEHV−1 RacH−SE1212 P9(親の空BAC pRacH−SE1.2からレスキューされた)のプラーク単離株をおよそ1のM.O.I.で感染させた。3つのウェルは、非感染のままにした。感染細胞および非感染細胞は2日間インキュベートされ、次いでウェスタンブロットのために処理された。
非感染対照は培地にこすり落とされ、3つの反復ウェルからの懸濁液は15ml遠心チューブにプールされ、氷上に置かれた。感染細胞は培地にリンスされ、3つの反復ウェルからの懸濁液は15ml遠心チューブにプールされ、氷上に置かれた。細胞は、5分間、1000×g、4℃で遠心分離により沈降された。上澄み液は注意深く吸引され、細胞ペレットはRIPA+PIに再懸濁された(非感染細胞300μl、感染細胞150μl)。懸濁液は、30分間氷上でインキュベートされ、10分ごとにボルテックスされた。懸濁液は、1.5mlマイクロチューブに移され、非溶解物質は、微量遠心機で10分間、15000rpm、4℃で遠心分離によって沈降された。澄んだ上澄み液は新しい1.5mlマイクロチューブに移され、使用まで−80℃で保存された。
材料:Immun−Star WesternC Chemiluminecent Kit(Bio Rad Laboratories GmbH、Heidemannstrasse 164、D−80939 Munchen)Cat#170−5070
一次抗体:
A:SBV−Gc−タンパク質特異的モノクローナル抗体(Wernike et al., 2015a)1:20
B:EHV−1 gpIIに対するマウスモノクローナル抗体Ai2G7(Boehringer Ingelheim proprietary)
二次抗体:ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス(Jackson Immune Research #115−035−146)1:5000
全てのインキュベーションは、一定の攪拌下、十分な容積で行われた。抗体は5%FBS/TBST中で希釈された。一次抗体は4℃で終夜インキュベートされた。抗体溶液は除去され、ブロットは5〜10分間TBSTで3回洗浄された。希釈した二次抗体は室温で1時間ブロットとインキュベートされ、除去され、ブロットは5〜10分間TBSTで3回洗浄された。ブロットは、透明なプラスチックシートプロテクター上に置かれた。ペルオキシドおよびルミノ/エンハンサー溶液は、1ml+1ml(各ブロットにつき全部で2ml)で混合され、ブロット上にピペッティングされ、3〜5分間インキュベートされた。その後、メンブレンはChemiDocXRS画像システム(Bio Rad Laboratories GmbH、Heidemannstrasse 164、D−80939 Munchen)に置かれ、シグナルはImage Labソフトウェアを使用して記録された。
AI−ST細胞は、感染の1日前に10%FBSを補足したMEM中に2×104個の細胞/ウェルで96ウェルプレート(Corning Incorporated−Life Sciences、One Becton Circle、Durham、NC 27712、USA;REF 353072)に播種された。ウイルスストックは、素早く解凍され、氷上に置かれた。10個の1:10段階希釈がMEM中で、希釈当たり1.2ml容積で調製された。100μl/ウェルのウイルス希釈物が、希釈当たり縦1列の8ウェルの細胞に添加された。100μl/ウェルのMEMの添加によって、各プレートの縦列11および12は培地対照とされた。力価測定は、3回行われ、細胞は5日間37℃/5%CO2でインキュベートされた。細胞培養は顕微鏡で検査され、EHV−1 RacHの典型的なCPEが観察されたウェルが記録された。力価は、ReedおよびMuench(1938)による方法に従ってTCID50/mlとして算出された。
感染細胞における改変SBV Gc234の発現は、rEHV−1 RacH−SE−70−455−SBVGc 121.232のプラーク単離株のウェスタンブロットおよび二重免疫蛍光法(DIFA)によって示された。ポリクローナルウマ−抗EHV−抗血清およびモノクローナル抗SBV抗体によるDIFAは、見かけ上100%のrEHV−1感染細胞で導入遺伝子の発現を確認した。rEHV−1 RacH−SE−70−455−SBVGc_121.232を感染させた細胞のDIFAが実施された場合、ウマ抗−EHV抗血清(紫)によって染色されたEHV−1抗原陽性細胞も、SBV Gcに対するモノクローナル抗体に結合した。非還元条件下で実行されたウェスタンブロットは、組換えEHV−1 RacH−SE−70−455−SBVGcを感染させた細胞における改変SBVGc234の発現を確認した。SBV Gcに対するモノクローナル抗体またはEHV−1 gpIIに対するモノクローナル抗体によってプローブされた感染細胞または非感染細胞のライセートのウェスタンブロットが実施された。EHV−1 gpIIは、全ての感染細胞で発現されたが、SBV GcはrEHV−1RacH−SE−70−455−SBVGcを感染させた細胞でのみ発現され、空ベクターrEHV−1 RacH−SE1212を感染させた細胞では発現されなかった。いずれのウイルスタンパク質も、モック感染細胞のライセートでは検出されなかった。EHV−1のgpIIに対するモノクローナル抗体による並行ブロットのインキュベーションにより、トランスフェクション後の組換えウイルスのレスキュー中に自己切除手順によるorf71(US5)の回復を確認した。3回プラーク精製した単離株rEHV−1 RacH−SE−70−455−SBVGc_121.232から産生されたP7ウイルスストックは、AI−ST細胞において1.85×109 TCID50/mlの非常に高い力価に複製され、導入遺伝子の発現はこの細胞株におけるEHV複製を損なわなかったことを示している。TCID50/mlとしてrEHV−1RacH−SE−70−455−SBVGc_121.232の6回の力価測定の平均は標準偏差1.28×109 TCID50/mlで1.85×109 TCID50/mlをもたらした。
ドイツ家畜品種の4頭のウシは、108TCID50 rEHV−SBV−Gcによって3週間あけて2回ワクチン接種され、4頭の追加のウシが非ワクチン接種対照とされた。2回目の免疫化の3週間後、全ての動物は、ウシにおいて単独で継代された2×0.5mlのSBV野生株を皮下に接種された(Wernike et al., 2012)。全試験中、直腸の体温が毎日測定され、動物は獣医によって臨床徴候を調べられた。血清は週間隔で採取され、市販のN−based ELISA(ID Screen(登録商標)Schmallenberg virus Competition、ID vet、France)および先に記載されたようにSBV単離株BH80/11に対するマイクロ中和試験(Wernike et al., 2013a)によって分析された。評価は、3日後の細胞変性効果のアセスメントによって行われた;全ての試料は四重に試験され、抗体力価はBehrens−Kaerber法に従ってND50として算出された。それぞれ免疫化、チャレンジ感染、および研究の終わりの日に採取された血清は、EHV株RacHに対するマイクロ中和試験によってさらに分析された(rEHV−SBV−Gc群および非ワクチン接種対照動物)。
実験手順は、責任のある国家倫理委員会によって審査され、監督官庁(Mecklenburg−Vorpommernの農業、食品安全性、および水産業州事務所、Rostock、Germany、ref.LALLF M−VTSD/7221.3−1.1−004/12)によって認可された。
動物は試験全体で関連するSBV特異的な臨床徴候を示さず、体温は直腸で測定された場合、全ての動物で正常範囲内のままであった。
チャレンジ感染の1日または2日後から開始して、ウイルスRNAは、4日連続で各非ワクチン接種対照動物の血清試料中で検出された。rEHV−SBV−Gc群からの全てのワクチン接種動物は、試料採取期間全体を通して定量的RT−PCR(図31A)によってウイルスRNA濃度の低下を示した。rEHV−SBV−Gc群の2匹の動物は、試料採取期間全体を通して定量的RT−PCR(図31A)によって完全に陰性であった。rEHV−SBV−Gcによって免疫された2匹の動物では、SBVゲノムはそれぞれ、3日または5日間、低下したレベルで検出された。
非ワクチン接種対照動物では、SBV特異的抗体は、チャレンジ感染前に血清中和試験によって検出されなかった。感染後1週間または2週間から、向上した高力価の中和抗体が全ての非ワクチン接種動物で検出された(図31B)。
血清の2倍希釈が、1:5で開始してMEM中で調製された。100 TCID50のSBVを含有する50μlのMEMおよび50μlの希釈した血清は、96ウェル細胞培養プレートで2時間インキュベートされた。その後、100μlの新しく調製したBHK細胞の懸濁液(10%ウシ胎仔血清を含有するMEM中)が添加され、培養プレートは、37℃/5%CO2で3〜4日間インキュベートされた。細胞変性効果は光学顕微鏡によって評価された。全ての血清は2回ずつ試験され、抗体力価はBehrens(未発表)によって改変されたKaerber(1931)に従って、ND50として算出された。図32に示す結果は、rEHV−1 RacH−SE−70−455−SBVGcによるウシのワクチン接種が、特定の免疫応答を誘導するのに十分効率的なベクターウイルスの複製をもたらしたことを示す。4頭の動物のうち1頭において、EHV−1の非常に低い力価の中和抗体(1:4)が、最初のワクチン接種の3週間後に検出された。2回のワクチン接種後、2回目の適用後3週間で、4頭全てのウシが1:128の力価で中和抗体を産生した。この結果から、EHV−1 RacHはウシのワクチンベクターとしても機能的であり得ることも結論づけられる。
子ブタでのブタIAV H3N2チャレンジに対するrEHV−1 RacH−SE_BおよびrEHV−1 RacH−SE_Dからなる四価のブタIAVワクチンの効果
若い子ブタでのベクターワクチンとしてのその特性を調べるため、rEHV−1 RacH−SE_B(rEHV−1 RacH−SE−1/3−p430−H1av−70−p455−H3、図13参照)およびrEHV−1 RacH−SE_D(rEHV−1 RacH−SE−1/3−p430−H1hu−70−p455−H1pdm、図27参照)からなる四価のブタIAVワクチンが2回目のワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
母系由来抗体を有する子ブタにおけるブタIAV H3N2チャレンジに対するrEHV−1 RacH−SE_BおよびrEHV−1 RacH−SE_Dからなる四価のブタIAVワクチンの効果
若い子ブタにおけるベクターワクチンとしてのその特性を調べるために、rEHV−1 RacH−SE_BおよびrEHV−1 RacH−SE_Dからなる四価のブタIAVワクチンは、第3のワクチン接種チャレンジ試験で試験された。
以下の参考文献は、それにより本明細書に記載のものを補足する例示的な処置上のまたは他の詳細が提供される限りでは、明確に参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (25)
- 4pgG600(配列番号1)もしくは4pMCP600(配列番号2)またはその相補的なヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその相補的なヌクレオチド配列を含むプロモーター配列であって、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす、プロモーター配列。
- 4pgG600(配列番号1)および4pMCP600(配列番号2)ならびにその相補的なヌクレオチド配列、ならびにその機能的および相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるプロモーター配列を含む発現カセットであって、
プロモーター配列が、目的の配列、好ましくは抗原コード配列などの目的の遺伝子、より好ましくは目的の異種および/または外来性配列、目的の遺伝子または目的の抗原コード配列に作動可能に連結されており、
前記プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列が、好ましくは異種プロモーター配列、より好ましくは外来性プロモーター配列である、
発現カセット。 - 請求項2に記載の発現カセットを含む、ウイルスベクターなどのベクター。
- プロモーター配列の機能的断片が、70%、80%、85%、好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%、99.9%の配列同一性および/または相同性を有する、請求項1に記載のプロモーター配列および/または請求項2に記載の発現カセットおよび/または請求項3に記載のベクター。
- プロモーター配列の機能的断片が、550ヌクレオチド、好ましくは500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430ヌクレオチド、最も好ましくは455または430ヌクレオチドの長さを有し、プロモーター配列の機能的断片が430から550ヌクレオチド、430から500ヌクレオチド、または430から480ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項1または4に記載のプロモーター配列および/または請求項2または4に記載の発現カセットおよび/または請求項3または4に記載のベクター。
- プロモーター配列の機能的断片が、4pgG600(配列番号1)のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって(少なくとも)72%である(またはより高い)、請求項1または4から5に記載のプロモーター配列および/または請求項2または4から5に記載の発現カセットおよび/または請求項3から5に記載のベクター。
- 4pgG600(配列番号1)の機能的断片が、p430(配列番号3)と名付けられた断片である、請求項1または4から6に記載のプロモーター配列および/または請求項2または4から6に記載の発現カセットおよび/または請求項3から6に記載のベクター。
- プロモーター配列の機能的断片が、4pMCP600(配列番号2)のトランケーションまたはその相補的なヌクレオチド配列であり、好ましくは配列同一性が全長にわたって(少なくとも)78%である(またはより高い)、請求項1または4から7に記載のプロモーター配列および/または請求項2または4から7に記載の発現カセットおよび/または請求項3から7に記載のベクター。
- 4pMCP600(配列番号2)の機能的断片が、p455(配列番号4)と名付けられた断片である、請求項1または4から8に記載のプロモーター配列および/または請求項2または4から8に記載の発現カセットおよび/または請求項3から8に記載のベクター。
- ベクターが、1つまたは複数のさらなる制御配列、例えば終結シグナル、ポリアデニル化シグナルまたはIRESおよび/または2aペプチドのような制御エレメントを含む、請求項2および4から9に記載の発現カセットおよび/または請求項3から9に記載のベクター。
- ベクターが、組換え、および/または異種および/または外来性ベクターである、請求項3から10に記載のベクター。
- ベクターが、ウイルスベクターであり、好ましくは、例えばウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV−1)、ウマアルファヘルペスウイルス4型(EHV−4)ならびにPrV(仮性狂犬病ウイルス)およびBHV−1(ウシヘルペスウイルス1)のような他のバリセロウイルスなどのヘルペスウイルス科、CAdV(イヌアデノウイルス)などのアデノウイルス科(AdV)、アデノ随伴ウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルスなどのレンチウイルス科、およびポックスウイルス科からなる群から選択される、請求項3から11に記載のベクター。
- ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス科、好ましくはアルファヘルペスウイルス属、より好ましくはバリセロウイルス亜属のメンバーであり、最も好ましくは前記ベクターがウマアルファヘルペスウイルス1型(EHV−1)である、請求項3から12に記載のベクター。
- ベクター、好ましくはウイルスベクターを産生する方法であって、
a.請求項1または4から9に記載のプロモーター配列を用意するステップ、
b.ステップa)の前記プロモーター配列を、EHV−1、EHV−4、PrV(仮性狂犬病ウイルス)またはBHV−1(ウシヘルペスウイルス1型)のようなバリセロウイルスなどのヘルペスウイルス科、CAdV(イヌアデノウイルス)などのアデノウイルス科(AdV)、アデノ随伴ウイルスのようなパルボウイルス科、バキュロウイルス科、レトロウイルス科、およびポックスウイルス科からなる群から選択されるウイルス由来のベクター骨格であって、好ましくはヘルペスウイルスに由来し、より好ましくはEHV−1またはEHV−4であるベクター骨格に組み込むステップ
を含む方法。 - 請求項3から13に記載のベクターの複製に許容的であることを特徴とする、真核生物の宿主細胞株であって、好ましくは哺乳動物細胞株または昆虫細胞株であり、最も好ましくはPK/WRL細胞株、RK13細胞株、MDBK細胞株、ST細胞株、AI−ST細胞株、VERO細胞株、Sf9細胞株、Sf21、Sfプラス細胞株、MDCK細胞株、および/またはそれらの派生物である、真核生物の宿主細胞株。
- a.請求項3から13に記載のベクターを、請求項15に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
b.適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
c.任意で前記宿主細胞を回収するステップ
によって特徴づけられる、宿主細胞を調製する方法。 - プロモーター配列としての、4pgG600(配列番号1)もしくは4pMCP600(配列番号2)またはそれらの相補的なヌクレオチド配列、またはp430(配列番号3)もしくはp455(配列番号4)もしくはそれらの相補的なヌクレオチド配列などのそれらの機能的断片を含む核酸配列の使用であって、前記核酸配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす、使用。
- 請求項3から13に記載のベクター、宿主細胞、任意でトランスフェクション試薬および指示リーフレットからなるキット。
- 0.01から0.001のM.O.Iで使用してもよい、免疫原性組成物またはワクチンの製造のための請求項3から13に記載のベクターまたは請求項15に記載の真核生物の宿主細胞株の使用。
- a.請求項2または4から9に記載の発現カセット、および/または
b.請求項3から13に記載のベクター、および/または
c.請求項2または4から9に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび/または例えばウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)等の、請求項3から13に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、および
d.任意で薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤(好ましくは前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適している)、
を含み、
好ましくは前記免疫原性組成物がウイルスを含む、
免疫原性組成物。 - a.請求項2または4から9に記載の発現カセットおよび/または
b.請求項3から13に記載のベクター、および/または
c.請求項2または4から9に記載の発現カセットによって発現されるポリペプチドおよび/または例えば改変生ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)等の、請求項3から13に記載のベクターによって発現されるポリペプチド、および
d.薬学的にまたは獣医学的に許容される担体または賦形剤(好ましくは前記担体は経口、皮内、筋肉内、または鼻腔内適用に適している)、
を含み、
e.前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物。 - a.請求項3から13に記載のベクターを、請求項15に記載の真核生物の宿主細胞株に感染させるステップ、
b.適切な条件下で感染細胞を培養するステップ、
c.感染細胞および/またはベクターおよび/またはウイルス成分を回収するステップ、
d.任意でステップc)の回収物を精製するステップ、
e.前記回収物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法。 - 動物において病原体の感染によって引き起こされる臨床徴候または疾患を減らすまたは予防する方法で使用するための、または動物において病原体の感染を処置または予防する方法での使用のためのものであり、好ましくは前記動物がブタなどの食物生産動物である、請求項20に記載の免疫原性組成物または請求項21に記載のワクチン。
- 前記動物において病原体によって引き起こされる臨床疾患に対してブタ、ブタ、またはウシなどの食物生産動物などの動物を免疫する方法であって、請求項20に記載の免疫原性組成物または請求項21に記載のワクチンを動物に投与するステップを含み、前記免疫原性組成物またはワクチンが感染の臨床徴候を引き起こさないが、前記病原体の病原体型に対して動物を免疫する免疫応答を誘導することができる、方法。
- a)前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
b)請求項20に記載の免疫原性組成物または請求項21に記載のワクチン、および
c)任意で指示リーフレット
を含む、動物において病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくはブタまたはウシなどの食物生産動物にワクチン接種するための、および/または動物において病原体と関連するまたは病原体によって引き起こされる1つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を減らすためのキット。
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