JP4662931B2 - 安全な突然変異ウイルスワクチン - Google Patents
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Description
BVDV2の53637株における細胞由来の挿入物の位置の決定
BVDV2−53637からのNS2−3領域におけるあらゆる細胞由来の挿入物の位置を同定しマッピングするために、この領域の配列の一部を決定した。ウイルスRNAから、フォワードプライマー53637U1(5’−CGTCCACAGATGGTTTGGT−3’;配列番号1)、および、リバースプライマー53637L(5’−GGCTATGTATTGGACGTAACCC−3’;配列番号2)を用いて670塩基のRT−PCR産物を増幅した。このRT−PCR産物を精製し、配列解析した(配列番号3)。BVDV1−NADL(Genbank登録番号M31182、配列番号4)と並べたところ、著しい類似性が観察された(図1)。ウイルスは両方とも、Bos taurusのDnaJ1遺伝子から誘導された挿入物をインフレームで含む。NADLの場合、この挿入物は、90個のアミノ酸(270個のヌクレオチド)の長さであり、NADLポリタンパク質中のグリシン−1536とプロリン−1627との間に位置する。これらの位置は、SD−1のような非細胞変性のBVDV1株(Genbank登録番号AAA42860、配列番号6)のグリシン−1536とプロリン−1537に対応しており、これは、NADLにおけるゲノムの改変は、単なる挿入であって、それに伴うウイルスのフランキング配列の欠失または複製がないことを示す。BVDV1−NADLのように、BVDV2−53637におけるBos taurusのDnaJ1遺伝子部分の挿入が存在する。この細胞由来の挿入物は、さらに長く(131個のアミノ酸、393個のヌクレオチド)、BVDV1−NADLにおける挿入に対して両方向に伸長している。NS2−3領域内での細胞由来の挿入物の位置は、2種ウイルスで同一である。BVDV1−NADLとは異なり、BVDV2−53637の挿入物は、ウイルスのフランキング配列の5個のアミノ酸(15個のヌクレオチド)の欠失を伴う。挿入物の5’末端の端にある3個のアミノ酸残基がなく、一方で、挿入物の3’末端の端にある2個のアミノ酸残基がない。細胞由来の挿入物が2種のワクチンウイルスにおいて同じゲノム位置にあるため、それらは、非細胞変性のキメラウイルスを生産するための挿入を欠失させて相同組換えすることができない。
共に継代させたBVDV1−NADL/BVDV2−53637培養物で、非細胞変性のBVDVウイルスを検出する試み
2種のワクチンウイルスが組換えを起こして検出可能なレベルの非細胞変性のBVDVが生産されるかどうかを決定するために、これらのウイルスを感染しやすい細胞で共培養し、高感度のヘミネステッド(hemi−nested)RT−PCR分析を用いて、過量のなお細胞由来の挿入物を含む長い細胞変性産物のなかから、潜在的非細胞変性ウイルスを検出した。インビトロで異種間の組換えが起こる可能性を高めるために、6−ウェルプレート中で、各ウイルスを、感染多重度2〜4で、密集したBK−6細胞に同時に植え付けた(1実験あたり12反復した)。2〜3日共培養した後、細胞の凍結と融解を2回繰り返し、細胞の死細胞片を低速での遠心分離で除去した。次に、得られた上清液を、次の代の接種材料として用いた。数回の研究で、全7回の連続した継代を行った。継代の間、BVDV1−NADLはBVDV2−53637より迅速に成長したが、7回継代後でも、II型ウイルスがネステッドRT−PCRを用いて検出された。高感度のヘミネステッドRT−PCR分析を、あらゆる非細胞変性ウイルスを検出するための試みに用いた。
Claims (14)
- ウイルスはそれぞれ、ウイルスのゲノムに突然変異を含み、該ウイルス中の突然変異は、突然変異ウイルスが互いに組換えを起こして突然変異が除去されないようにゲノムの同じ部位に存在する、同じ科の少なくとも2種の生きた突然変異ウイルスを含み、そしてここで生きた突然変異ウイルスの2種は突然変異ウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)である、ワクチン組成物。
- 2種の生きた突然変異ウイルスは、突然変異ウシウイルス性下痢ウイルス1型(BVDV−1)、および、突然変異ウシウイルス性下痢ウイルス2型(BVDV−2)からなる、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 2種の生きた突然変異ウイルスは、細胞変性性の(cp)BVDV−1、および、cpBVDV−2からなり、これらはいずれも弱毒化されている、請求項2に記載のワクチン組成物。
- cpBVDV−1およびcpBVDV−2はいずれも、細胞変性性のバイオタイプを引き起こすNS2−3領域に突然変異を含む、請求項3に記載のワクチン組成物。
- cpBVDV−1は、BVDV−1のNADL株であり、cpBVDV−2は、BVDV−2の53637株である、請求項4に記載のワクチン組成物。
- ウシヘルペスウイルス−1、ウシRSウイルス、パラインフルエンザウイルス−3、カンピロバクター・フィタス、レプトスピラ・カニコラ、レプトスピラ・グリポティフォーサ、レプトスピラ・ハージョ、レプトスピラ・イクテロへモリジア、レプトスピラ・ポモナ、または、マンヘミア・ヘモリチカの少なくとも1種をさらに含む、請求項2に記載のワクチン組成物。
- 獣医学的に許容できる担体をさらに含む、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 同じ科の2種の生きた突然変異ウイルスを選択または構築することを含み、ここで、該
ウイルスはそれぞれ、突然変異を含み、該ウイルス中の突然変異は、突然変異ウイルスが相同組換えを起こして突然変異が除去されないようにゲノムの同じ部位に存在し、そしてここでウイルスは突然変異BVDVからなる、安全なウイルスワクチンを製造する方法。 - 突然変異は、欠失、挿入、置換、または、これらの組み合わせから選択される、請求項8に記載の方法。
- 突然変異は、毒性の弱毒化、細胞の親和性またはバイオタイプの変更、種の親和性の変更、外来遺伝子カセットの発現、または、これらの組み合わせから選択される表現型を付与する、請求項8に記載の方法。
- 2種の生きた突然変異ウイルスは、突然変異BVDV−1、および、突然変異BVDV−2からなる、請求項8に記載の方法。
- 2種のBVDVはいずれも、細胞変性のバイオタイプを引き起こすNS2−3領域に突然変異を含む、請求項1に記載の組成物。
- 突然変異は挿入である、請求項1に記載の組成物。
- 突然変異は挿入である、請求項9に記載の方法。
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