KR100810820B1

KR100810820B1 - 안전한 돌연변이 바이러스 백신

Info

Publication number: KR100810820B1
Application number: KR1020067002112A
Authority: KR
Inventors: 시아오-쿤 완 웰치; 제이 그레고리 캘버트; 마이클 케이. 오하라; 쥬에메이 카오
Original assignee: 화이자 프로덕츠 인크.
Priority date: 2003-07-29
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2008-03-06
Also published as: PT1651263E; BRPI0413107A; JP4662931B2; PL1651263T3; IL173338A0; ATE489107T1; NZ545612A; US7361357B2; CA2533877A1; ES2355276T3; ZA200600585B; NO20060931L; WO2005021034A3; RS20060045A; US20050053621A1; SI1651263T1; TW200514568A; ES2355276T9; EP1651263A2; EA009391B1

Abstract

본 발명은 안전한 백신 및 이러한 백신의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 백신은 동일한 과의 둘 이상의 생(live) 돌연변이 바이러스 또는 이러한 바이러스를 암호화하는 핵산 분자를 함유하며, 두 바이러스 또는 암호화 핵산은 각각 바람직한 표현형을 제공하는 돌연변이를 함유하고, 바이러스내의 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 이들 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 서로 재조합할 수 없다.

바이러스 백신, 돌연변이, 암호화 핵산, 플라비비리다에

Description

안전한 돌연변이 바이러스 백신{SAFE MUTANT VIRAL VACCINES}

본 발명은 일반적으로 바이러스 감염에 대하여 동물에게 투여하기에 적합한 백신에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 안전한 백신 및 이러한 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 백신은 동일한 과의 둘 이상의 생(live) 돌연변이 바이러스 또는 이러한 바이러스를 암호화하는 핵산 분자를 함유하며, 이들 바이러스 또는 암호화 핵산은 각각 바람직한 표현형을 제공하는 돌연변이를 함유하고, 바이러스내의 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 이들 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 서로 재조합할 수 없다.

플라비비리다에(Flaviviridae) 과 바이러스는 페스티바이러스(Pestivirus), 플라비바이러스(Flavivirus) 및 헤파시바이러스(Hepacivirus) 속으로 이루어진다. 페스티바이러스 속은 소의 바이러스성 설사 바이러스 1(BVDV-1), BVDV-2, 전형적인 돼지 콜레라 바이러스, 및 보더병(Border disease) 바이러스 종에 의해 대표된다. 과 일원의 비리온(virion)은 약 9.5 내지 12.3kb의 양성가닥 RNA 게놈을 캡슐화한다. 게놈 RNA는 연속된 긴 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF)을 함유하는데, 이는 세포 및 바이러스의 프로테아제에 의해 가공되어 성숙한 바이러스 단백질을 생성하는 폴리단백질로 해독된다. 페스티바이러스의 일원인 경우, ORF는 약 3900개의 아미노산의 폴리단백질을 암호화하는데, 이는 다음의 성숙한 바이러스 단백질로 해독과 동시에 그리고 해독후에 가공된다(5'로부터 3'으로): N ^pro , C, E ^rns , E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B.

페스티바이러스의 몇몇 일원들 사이에서 조직 배양 세포에 대한 그의 효과, 즉 세포병원성(cytopathic, cp) 및 비세포병원성(noncytopathic, ncp)을 근거로 하여 두 생물형이 존재한다. 게놈 분석 결과, cp 페스티바이러스의 게놈에서 때때로 바이러스 서열의 중복, 게놈 재배열 및(또는) 바이러스 서열의 결실을 동반하는 세포 서열의 삽입이 나타났으나, 상응하는 ncp 페스티바이러스의 RNA에서는 그렇지 않았다. 이는 cp 페스티바이러스가 RNA 재조합에 의해 ncp 페스티바이러스로부터 진화함을 나타낸다.

BVDV는 소의 널리 분포된 병원체이다. BVDV-1은 보통 면역적격(immunocompetent) 동물에서 매우 약한 설사를 일으키지만, BVDV-2는 혈소판감소증, 출혈 및 급성 폐사성 질병을 일으킬 수 있다. BVDV는 임신한 소의 태반을 지나갈 수 있어서 영구적으로 감염된(persistently infected, PI) 송아지를 태어나게 할 수 있다(맘퀴스트(Malmquist)의 문헌[J. Am. Vet. Med. Assoc. 152:763-768(1968)]; 로스(Ross) 등의 문헌[J. Am. Vet. Med. Assoc. 188:618-619(1986)]). 바이러스 감염된 송아지는 바이러스에 대하여 면역내성(immunotolerant)이고, 남은 여생동안 영구적으로 바이러스 감염증을 앓는다. 이들은 점막 질환 발생의 원인을 제공하고(리스(Liess) 등의 문헌[Dtsch. Tieraerzti. Wschr. 81:481-487(1974)]) 폐렴 또는 장 질환과 같은 질환을 일으키는 미생물에 의한 감염증에 매우 걸리기 쉽다(바버(Barber) 등의 문헌[Vet. Rec. 117:459-464(1985)]). 두 유전자형의 바이러스 모두 두 가지 생물형, cp 또는 ncp중 하나로서 존재할 수 있다. cp 또는 ncp BVDV로 감염된 세포는 둘다 NS2-3을 발현하지만, NS3은 cp BVDV로 감염된 후에만 검출되기 때문에, cp 표현형은 NS3의 발현과 상호관련이 있다. NS3은 NS2-3의 C-말단 부분에 등방향성이다. NS3의 발현은 cp BVDV에 대하여 관찰된 게놈 변화의 결과인 것으로 보인다.

현재 이용가능한 바이러스 백신으로는 약독화 생 바이러스 또는 사(killed) 바이러스 백신, 생균-벡터화 백신, 서브유닛(subunit) 백신, 및 DNA 또는 RNA 백신이 있다. 로쓰(Roth) 등의 문헌["New Technology For Improved Vaccine Safety And Efficacy", Veterinary Clinics North America: Food Animal Practice 17(3): 585-597(2001)]을 참조한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품 처리, 또는 시험관내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법에 의해 유도된 돌연변이의 수, 위치 및 성질은 게놈 서열 분석없이 미지 상태이다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듬으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실, 또는 바이러스 게놈내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다. 약독화 생바이러스 백신의 사용에 관한 하나의 우려는 약독화된 돌연변이 바이러스가 생체내에서 재조합하여 약독화 돌연변이(들)를 없앰으로써 독성을 회복할 가능성을 갖는다는 것이다. 예를 들어, 독성(야생형) 야외주의 존재하에, 바이러스 게놈에 결실을 갖는 약독화 바이러스는 독성 균주와 재조합하여 결실된 서열을 회복할 가능성을 갖는다. 예컨대, 로쓰 등의 상기 문헌을 참조한다. 세포 서열 삽입을 갖는 세포병원성 페스티바이러스는 또한 세포 배양에서, 아마도 RNA 재조합을 통한 세포 서열의 결실에 의해 비세포병원성 바이러스를 생성시키는 것으로 관찰되었다. 예컨대, 바로쓰(Baroth) 등의 문헌["Insertion of cellular NEDD8 coding sequences in a pestivirus", Virology. 278(2): 456-66, (2000)] 및 베커(Becher) 등의 문헌["RNA recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of lethal disease", Journal of Virology 75(14): 6256-64(2001)]을 참조한다. 백신 조성물에 동일한 종, 속 또는 과로부터의 두 약독화 돌연변이 바이러스를 포함시키는 것이 바람직한 경우, 백신접종된 동물내에서 두 바이러스가 재조합함으로써 약독화 돌연변이를 없앨 수 있다는 우려가 있다. 예컨대, 글라첸부르크(Clazenburg) 등의 문헌["Genetic recombination of pseudorabies virus: evidence that homologous recombination between insert sequences is less frequent than between autologous sequences", Archives of Virology, 140(4): 671-85(1995)]을 참조한다.

동물을 바이러스 감염으로부터 보호하는 안전하고 효과적인 백신을 개발하는 것이 여전히 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 동일한 과의 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스 또는 이러한 바이러스를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 안전한 백신을 제공하는데, 이때 바이러스 또는 암호화 핵산은 각각 바람직한 표현형을 제공하는 돌연변이를 함유하고, 바이 러스내의 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 이들 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 서로 재조합할 수 없다.

본 발명은 또한 동일한 과, 속 또는 종의 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스를 선택 또는 구성함으로써 안전한 바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공하는데, 각각의 바이러스는 바람직한 표현형을 제공하는 돌연변이를 함유하고, 바이러스내의 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 이들 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 상동 재조합할 수 없다.

본 발명은 또한 본 발명의 백신 조성물을 동물에게 투여함으로써 동물을 바이러스 감염으로부터 보호하는 방법을 제공한다.

도 1은 BVDV-1 균주 NADL 및 BVDV-2 균주 53637의 NS2-3 영역으로부터 세포 삽입 서열 및 측면 바이러스 서열의 정렬을 나타낸다.

본 발명에 따라, 독특하게도 바이러스의 동일한 게놈 부위에 돌연변이를 함유하는, 동일한 과의 생 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 서로 재조합할 수 없음이 인식되었다.

따라서, 하나의 실시양태에서 본 발명은 동일한 과의 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스 또는 이러한 바이러스를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 안전한 백신 조성물을 제공하는데, 이때 바이러스내의 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 이들 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 서로 재조합할 수 없다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 전술한 바와 같이 안전한 바이러스 백신의 제조 방법을 제공한다. 특히, 안전한 백신은 동일한 과, 속 또는 종의 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스를 선택 또는 구성함으로써 제조되는데, 이때 각각의 바이러스는 바람직한 표현형을 제공하는 돌연변이(예를 들어, 독성의 약독화, 세포 향성 또는 생물형의 변화, 종 향성의 변화 또는 외래 유전자 카세트(cassette)의 발현)를 함유하고, 바이러스내의 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 이들 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 상동 재조합할 수 없다.

"백신" 또는 "백신 조성물"이란 용어는 동물에게 접종되면, 바이러스의 병원성 변형물에 대한 완전 또는 부분 면역을 유도하거나 또는 바이러스의 병원성 변형물에 의해 초래된 질환의 증상을 완화시키는, 생 돌연변이 바이러스를 함유하는 조성물을 가리킨다. 바이러스에 대한 백신 조성물의 보호 효과는 일반적으로 환자에게 면역 반응, 세포-매개성 또는 체액성 면역 반응, 또는 이들의 혼합 반응을 유도함으로써 달성된다. 일반적으로 말하자면, 바이러스 감염 발병률의 폐지 또는 감소, 증상의 개선, 또는 감염된 환자로부터의 바이러스의 제거 촉진은 백신 조성물의 보호 효과를 나타낸다.

"동물"이란 조류, 예를 들어 닭, 칠면조, 집물새, 및 임의의 포유동물, 예를 들어 소, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이 및 말을 포함함을 뜻한다.

본원에 사용된 "바이러스", "바이러스 분리주" 또는 "바이러스 균주"란 바이러스 게놈 DNA 또는 RNA, 관련 단백질, 및 다른 화학적 구성성분(예: 지질)을 함유하는 바이러스 입자 또는 비리온을 가리킨다.

"바이러스를 암호화하는 핵산 분자" 또는 "바이러스의 핵산 분자"란 RNA 또는 DNA 형태의, 바이러스의 게놈 핵산 분자를 뜻한다.

"돌연변이"란 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환, 또는 이들의 혼합을 포함함을 뜻한다. 본 발명에 따라, 돌연변이는 바람직하게는 바람직한 표현형, 예를 들어 독성의 약독화, 세포 향성 또는 생물형의 변화, 종 향성의 변화, 또는 외래 유전자 카세트의 발현을 제공한다. 특히 바람직한 돌연변이는 약독화된 독성을 제공하는 돌연변이다.

"약독화"란 바이러스가 바이러스로 감염된 동물에서 증식하고(증식하거나) 질환을 초래하는 그의 능력중 일부 또는 전부를 잃었음을 뜻한다. 예를 들어, 약독화된 바이러스는, 약독화된 바이러스의 야생형 병원성 변형물이라면 복제를 일으킬 수 있는 동물에 존재하는 경우, 전혀 복제를 할 수 없거나, 복제가 1회 또는 몇 회로 한정되거나, 또는 세포 또는 조직 향성이 제한된 바이러스일 수 있다.

약독화된 바이러스는 바이러스의 병원성에 관련된 유전자 또는 유전자들내에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 이러한 돌연변이를 또한 본원에서 "약독화 돌연변이(들)"라고 한다. 약독화된 바이러스는 UV 조사, 약품 처리, 또는 시험관내 야생형 병원성 바이러스의 고차 연속 계대배양에 의해 야생형 병원성 바이러스로부터 생성될 수 있다. 또 다르게는, 약독화된 바이러스는 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열에 특정 결실을 일으키고, 바이러스 게놈에 서열을 삽입하거나, 바이러스 게놈에 하나 이상의 돌연변이 지점을 만듬으로써 야생형 병원성 바이러스로부터 생성할 수 있다. 약독화된 바이러스는 동물로부터 얻어진 바이러스 분리주일 수 있고, 분리주는 인공적 수단이 아닌 사건, 예컨대 숙주 동물에서 일어나는 사건(예: 재조합)을 통해 바이러스의 야생형 병원성 변형물로부터 유도된다.

본 발명의 백신 조성물에 존재하는 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스는 동일한 게놈 부위에 존재하는 돌연변이를 함유한다. "동일한 게놈 부위"란, 바이러스의 게놈 뉴클레오타이드 서열이 정렬될 때, 바이러스 게놈내 돌연변이가 서로 중복되어 돌연변이를 없애도록 바이러스 게놈 사이에 상동 재조합이 일어날 기회가 없음을 뜻한다. 달리 말하면, 바이러스의 게놈 뉴클레오타이드 서열이 정렬될 때, 정렬된 바이러스 게놈의 서열이 돌연변이 서열인, 정렬된 서열의 하나 이상의 연속된 부분이 있다. 당업자가 사용할 수 있는, 핵산 서열을 비교하고 정렬하는 다수의 컴퓨터 프로그램이 있다. 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예컨대, 또 다른 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 핵산 서열에 갭(gap)이 도입된다). 예를 들어, 알츌(Altschul) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 기술된 NBLAST 및 XBLAST 프로그램, 알츌 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]에 기술된 갭 도입(Gapped) BLAST 프로그램, 및 알츌 등의 상기 1997년 문헌에 기술된 PSI-Blast 프로그램. BLAST, 갭 도입 BLAST 및 PSI-BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 개개 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 변수가 사용될 수 있다(http://www.ncbi.nim.nih.gov 참조).

일반적으로 말하자면, 본 발명의 요지, 즉 동일한 백신 조성물내에 동일한 게놈 부위에 돌연변이를 갖는 동일한 과의 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스를 포함하는 본 발명의 요지를, 바이러스 게놈이 상동 재조합을 허용하기에 충분한 서열 동일성을 갖는 임의의 과의 돌연변이 바이러스에 적용한다. 15 뉴클레오타이드 정도의 뉴클레오타이드 동일성은 효율적인 상동 재조합을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다(내기(Nagy) 및 부야르스키(Bujarski)의 문헌[J. Virol. 69:131-140, 1995]).

본 발명은 특히 플라비비리다에 과의 바이러스에 적용된다. 플라비비리다에 과는 페스티바이러스, 플라비바이러스 및 헤파시바이러스 속으로 이루어진다. 플라비비리다에 과 일원의 비리온은 약 9.5 내지 12.3kb의 양성가닥 RNA 게놈을 캡슐화한다. 연속된 긴 개방 판독 프레임을 함유하는 게놈 RNA는, 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 가공되어 성숙한 바이러스 단백질을 생성하는 폴리단백질로 해독된다.

바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물의 돌연변이 바이러스는 동일한 속의, 동일하거나 상이한 종으로부터 얻는다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 페스티바이러스 속의 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스를 함유한다. 페스티바이러스 속은 소 바이러스성 설사 바이러스 1형(BVDV-1), 소 바이러스성 설사 바이러스 2형(BVDV-2), 전형적인 돼지 콜레라 바이러스, 및 보더병 바이러스 종에 의해 대표된다. ORF는 약 3900개의 아미노산의 폴리단백질을 암호화하는데, 이는 다음의 성숙한 바이러스 단백질로 해독과 동시에 그리고 해독후에 가공된다(5'로부터 3'으로): N ^pro , C, E ^rns , E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B.

보통, BVDV는 RNA 형태의 게놈을 갖는다. RNA는 클로닝에 사용하기 위하여 DNA로 역전사될 수 있다. 따라서, 본원에서 핵산 및 BVD 바이러스 서열에 대한 언급은 바이러스 RNA 서열로부터 유도된 바이러스 RNA 서열 및 DNA 서열을 둘다 포함한다. 편의를 위하여, 이후 서열 목록에 서술된 BVDB의 게놈 서열은 오직 DNA 서열을 가리킨다. 각각에 상응하는 RNA 서열은 당업자라면 쉽게 안다.

더 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 세포병원성 BVDV-1 및 세포병원성 BVDV-2를 함유하고, 이때 세포병원성 생물형과 관련된 두 바이러스내의 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 두 돌연변이 바이러스는 돌연변이를 없애도록 재조합할 수 없다.

BVDV-1 및 BVDV-2는 BVDV의 밀접하게 관련된 두 유전자형을 대표한다. 두 바이러스의 뉴클레오타이드 서열은 전체 게놈에 걸쳐 약 70%의 동일성을 공유하고, NS2-3 영역에서는 약간 더 높은 비율의 동일성을 공유한다. BVDV-1과 BVDV-2의 바이러스 게놈 사이의 동일성 비율은, 적어도 NS2-3 영역에서, 상동 재조합을 허용하기에 충분하다고 생각된다.

BVDV-1은 보통 동물에서 매우 약한 설사를 일으키지만, BVDV-2는 혈소판 감소증, 출혈 및 급성 폐사성 질병을 일으킬 수 있는 높은 독성을 갖는 바이러스이다 (코라피(Corapi) 등의 문헌[J. Virol. 63:3934-3943]; 볼린(Bolin) 등의 문헌[Am. J. Vet. Res. 53:2157-2163]; 펠레린(Pellerin) 등의 문헌[Virology 203:260-268, 1994]; 리드패쓰(Ridpath) 등의 문헌[Virology 205:66-74, 1994]; 카먼(Carman) 등의 문헌[J. Vet. Diagn. Invest. 10:27-35, 1998]). 두 유형의 바이러스는 MAb 판넬(panel)에 의해 그리고 동물에서 길러진 바이러스-특이성 항혈청을 사용한 교차중화에 의해 결정되는 뚜렷한 항원성을 갖는다(코라피 등의 문헌[Am. J. Vet. Res. 51:1388-1394, 1990]). 두 유전자형의 바이러스 모두 두 가지 생물형, 세포병원성(cp) 또는 비세포병원성(ncp)중 하나로서 존재할 수 있다. cp 바이러스는 배양된 세포에 대하여 세포병원성 효과(예컨대, 세포 용해)를 유도하지만, 비세포병원성 바이러스는 그렇지 않다.

BVDV-1 및 BVDV-2에 대한 보호를 제공하는 백신을 제조하는 것이 바람직하다. 그러나, 두 바이러스간의 고도의 서열 동일성 때문에, 동일한 백신 조성물에 포함되는 세포병원성 생 BVDV-1 및 세포병원성 생 BVDV-2가 백신접종된 동물내에서 서로 재조합하여 비세포병원성 바이러스를 생성할 수 있다는 가능성이 있다. BVDV-1과 BVDV-2의 재조합이 보고된 바 있다. 예컨대, 리드패쓰 등의 문헌[Virology 212:259-262(1995)]을 참조한다. 면역적격이 발생하기 전에 ncp 바이러스에 의한 임신된 소 태아의 감염은 잉태 기간 내내 소 태아가 바이러스에 감염된 상태가 되고 송아지가 태어나면 영원히 감염된 상태일 수 있다. 이러한 송아지는 cp BVDV로 초감염되면 점막 질환으로 죽을 수 있다. 따라서, 동일한 게놈 부위에 돌연변이를 갖는 생 cp BVDV-1 및 생 cp BVDV-2를 함유하는 본 발명에 의해 제공되는 백신 조성물은 BVDV-1 및 BVDV-2 둘다에 대하여 동물을 보호하기에 특히 바람직하다.

하나의 실시양태에서, 동물로부터 얻어진 BVDV cp 분리주를 본 발명의 백신 조성물에 사용할 수 있다. BVDV-1 및 BVDV-2의 cp 분리주는 보고된 바 있고, 당업자에게 이용가능하다(예컨대, BVDV-1 NADL(ATCC# 제VR1422호 또는 제VR-534호), BVDV-2 53637 균주(ATCC에 제PTA-4859호로서 기탁됨), 및 리드패쓰 및 네일(Neill)의 문헌[J. Virol. 74:8771-8774 (2000)]에 기술된 것과 같은 2형 야외 분리주). 지금까지 보고된 cp 분리주는 전형적으로 이종 서열, 예컨대 특히 유비퀴틴 암호화 서열(진뱅크(Genbank) 등록 번호 제M96687호 또는 드 모에르루제(De Moerlooze) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 74:1433-1438(1993)]), 소 NEDD8 암호화 서열(바로쓰의 상기 문헌), 또는 보스 타우루스(Bos taurus) DnaJ1 암호화 서열(이후 실시예에 기술됨)의 삽입을 함유한다.

다른 실시양태에서, cp BVDV는, 예컨대 특정 바이러스 서열을 결실시키거나, 특정 바이러스 게놈 부위에 서열을 삽입하거나, 또는 하나 이상의 치환을 일으키거나, 또는 이들을 혼합하여 BVDV 게놈을 명확하게 변화시킴으로써 생성된다.

특정 게놈 부위에 이종(즉, 바이러스에 대하여 외래인) 서열을 삽입하여 cp BVDV를 생성하는 경우, 삽입되는 서열의 성질은 일반적으로 본 발명에서 중요하지 않다. 또한, 삽입은 약독화된 표현형을 생성하는 한, 임의의 특정 부위에 한정되지 않는다. cp 분리주내의 이종 서열은 종종 NS2-3 영역에서 발견되므로, NS2-3 영역, 특히, 예컨대 BVDV-1 NADL 균주의 아미노산 잔기 #1679 내지 #1680(번호매김은 발표된 게놈 서열 진뱅크 등록번호 제M31182호, 서열 4에 근거함)에 상응하는 추정되는 NS2-3 절단 부위를 둘러싸는 부분이 삽입하기에 바람직한 장소이다.

cp BVDV-1은 동물로부터 얻어진 cp BVDV-2 분리주에서 확인된 돌연변이를 흉내낸 명확한 게놈 변화를 만듬으로써, 이들 바이러스가 동일한 게놈 부위에서 cp 생물형과 관련된 돌연변이를 가지도록 생성될 수 있다. 유사하게는, cp BVDV-2는 동물로부터 얻어진 cp BVDV-1 분리주에서 확인된 돌연변이를 흉내낸 명확한 게놈 변화를 만듬으로써 생성될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 NADL(cp BVDV-1 분리주) 및 BVDV-2 53637(cp BVDV-2 분리주)을 함유하고, 이때 두 cp 분리주는 각각 세포병원성 생물형을 일으키는 돌연변이를 동일한 게놈 부위에 함유한다. BVDV-1 NADL 균주의 게놈 서열은 서열 4에 기술되어 있고, BVDV-2 53637 균주는 ATCC에 제PTA-4859호로 기탁되어 있다. 두 분리주는 NS2-3 영역에 삽입 서열을 갖는다. 약독화된 cp BVDV-1은 아미노산 위치 1536번에 글리신 잔기를 암호화하는 코돈의 세번째 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 위치 #4993(NADL 서열 번호매김)에 티미딘의 보스 타우루스(Bos Taurus) DnaJ1 암호화 서열 의 삽입을 함유한다. 약독화된 cp BVDV-2는 동일한 게놈 부위에 보스 타우루스 DnaJ1 암호화 서열의 삽입을 함유한다.

본 발명에 따라, 본 발명의 백신 조성물에 사용되는 cp BVDV 분리주는 약독화되었으므로 비병원성이다. 약독화의 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 또한 이하에 기술되어 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 약독화된 BVDV-1 및 약독화된니 BVDV-2를 함유하는데, 이때 두 바이러스의 약독화 돌연변이는 동일한 게놈 부위에 존재하여, 두 돌연변이 바이러스는 약독화 돌연변이를 없애도록 재조합할 수 없다.

약독화 BVDV는 바이러스의 병원성 변형물을 시험관내에서 UV 조사, 약물 처리, 또는 고차 연속 계대배양하여 생성된다. 이러한 방법에 의해 생성된 돌연변이의 성질 및 게놈 위치를 결정하기 위하여 서열 분석이 수행될 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환, 또는 이들의 혼합의 형태일 수 있다. 또 다르게는, 약독화된 BVDV는, 예컨대 특정 바이러스 서열을 결실시키거나, 특정 바이러스 게놈 부위에 서열을 삽입시키거나, 또는 하나 이상의 치환을 일으키거나, 또는 이들을 혼합하여, BVDV 게놈을 명확하게 변화시킴으로써 생성된다.

전술된 바와 같이, 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 위한 생 돌연변이 바이러스는 동일한 과, 속 또는 종일 수 있고, 바이러스 게놈은 상동 재조합을 허용하기에 충분한 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 백신 조성물에 사용하기에 적당한 바이러스의 혼합물의 추가의 비제한적인 예로는 상이한 유형의 폴로바이러스(pollovirus)의 혼합물, 전염성 기관지염 바이러스의 다수의 생 돌연변이 균주의 혼합물, 뉴캐슬(Newcastle)병 바이러스의 다수의 생 돌연변이 균주의 혼합물, 개 아데노바이러스-1 및 개 아데노바이러스-2의 혼합물, 말 허피스바이러스-1 및 말 허피스바이러스-4의 혼합물, 독감 바이러스의 다수의 생 돌연변이 균주의 혼합물, 고양이 칼리시바이러스의 다수의 생 약독화 균주의 혼합물, 로타바이러스의 다수의 혈청형의 혼합물, 리노바이러스의 다수의 혈청형의 혼합물, 구제역 바이러스의 다수의 혈청형의 혼합물, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 유럽 및 북미 유전자형의 혼합물, 전염성 파부리키우스낭병 바이러스의 표준 및 변형 균주의 혼합물이 있다.

본 발명에 따르면, 바이러스 입자는 백신에 사용하기에 바람직한 형태이지만, 동일한 과, 속 또는 종의 돌연변이 바이러스를 암호화하는 핵산 분자는 백신에 직접 사용될 수 있다. DNA 또는 RNA 분자는 "네이키드(naked)" 형태로 존재할 수 있거나 또는 세포 흡수를 촉진하는 제제(예컨대, 리포솜 또는 양이온성 지질)와 혼합될 수 있다. 핵산(DNA 또는 mRNA)을 이용하는 백신 및 백신접종 과정은 당업계에 널리 기술되어 있고, 그 예는 미국 특허 제5,703,055호, 미국 특허 제5,580,859호, 미국 특허 제5,589,466호, 국제 특허 공개공보 WO 98/35562호, 및 램세이(Ramsay) 등의 문헌[Immunol. Cell Biol. 75:360-363, 1997]; 데이비스(Davis)의 문헌[Cur. Opinion Biotech. 8:635-640, 1997]; 매닉칸(Manickan) 등의 문헌[Critical Rev. Immunol. 17: 139-154, 1997]; 로빈슨(Robinson)의 문헌[Vaccine 15(8): 785-787, 1997]; 로빈슨 등의 문헌[AIDS Res. Hum. Retr. 12(5): 455-457, 1996]; 라이(Lai) 및 베네트(Bennett)의 문헌[Critical Rev. Immunol. 18:449-484, 1998]; 및 보겔(Vogel) 및 사버(Sarver)의 문헌[Clin. Microbiol. Rev. 8(3): 406-410, 1995]이고, 이들 모두 본원에 참조로 인용되어 있다.

동일한 과, 속 또는 종으로부터의 둘 이상의 생 돌연변이 바이러스 이외에, 백신 조성물은 다른 항원 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기에 적당한 다른 항원 성분의 비제한적인 예로는 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제의 형태 또는 유전공학 기법 또는 화학 합성에 의해 얻어진 항원 분자 형태의, 병원성 세균(예: 미코플라스마 히오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumonia), 하에모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 하에모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 악티노바실루스 플루로뉴모니에(Actinobacillus pleuropneumonie), 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 만헤미아 하에몰리티카(Mannhemia haemolytica), 미코플라스마 보비스(Mycoplasma bovis), 미코플라스마 갈라나시에움(Mycoplasma galanacieum), 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 미코박테리움 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 클로스트리디알 종(Clostridial spp.), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis), 스트렙토코쿠스 수이스(Streptococcus suis), 스태필로코쿠스 아루레우스(Staphylococcus aureus), 에리시펠로트릭스 루소파티아에(Erysipelothrix rhusopathiae), 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 푸소박테리움 네크로포룸(Fusobacterium necrophorum), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 라우소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 리케치아 리케치(Rickettsia richettsii), 보렐리아 종(Borrelia spp.), 에를리치아 종(Ehrlichia spp.), 클라미디아 종(Chlamydia spp.), 브루셀라 종(Brucella spp.), 비브리오 종(Vibrio spp.), 살모넬라 엔테리카 세로바스(Salmonella enterica serovars), 렙토스피라 종(Leptospira spp.)); 병원성 진균(칸디다(Candida)); 프로토조아(예: 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum), 네오스포라 카니움(Neospora canium), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 에이메리아 종(Eimeria spp.), 바베시아 종(Babesia spp.), 기아르디아 종(Giardia spp.)); 기생충(예: 오스테르타지아(Ostertagia), 코오페리아(Cooperia), 하에몬쿠스(Haemonchus), 파시올라(Fasciola))으로부터 제조된 항원을 포함한다. 추가의 항원으로는 변형된 생(약독화된) 바이러스 제제, 불활성화된 전체 또는 부분 바이러스 제제, 또는 유전공학 기법 또는 화학 합성에 의해 얻어진 항원 분자 형태의, 병원성 바이러스, 예를 들어 마렉병 바이러스, 전염성 파부리키우스낭병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 계두 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 전염성 후두기관지염 바이러스, 세망내피 바이러스, 개 파보바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 개 허피스바이러스, 개 코로나바이러스, 개 파라인플루엔자-5, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 허피스 바이러스, 고양이 칼리씨바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 전염성 복막염 바이러스, 말 허피스바이러스, 말 관절염 바이러스, 말 전염성 빈혈 바이러스, 동부형 말 뇌염 바이러스, 서부형 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 소 코로나바이러스, 소 허피스바이러스-1,3,6, 소 파라인플루엔자 바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 우역 바이러스, 구제역 바이러스, 광견병 바이러스, 아프리카 돼지 콜레라 바이러스, 돼지 파보바이러스, PRRS 바이러스, 돼지 써코바이러스, 독감 바이러스, 돼지 수포병 바이러스, 태첸(Techen) 열바이러스, 위광견병 바이러스를 포함한다. 추가의 약독화된 생 바이러스가 사용되는 경우, 이러한 추가의 바이러스는 바람직하게는 전술된 두 주요 약독화 바이러스와 다른 과이어야 한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 BVDV-1 NADL 균주로부터 유도된 약독화된 cp BVDV-1, BVDV-2 53637 균주로부터 유도된 약독화된 cp BVDV-2(이때 두 cp 분리주는 각각 동일한 게놈 부위에 cp 생물형과 관련된 돌연변이를 함유함), 및 불활성화되거나 또는 변형된 생 형태의 하기 항원 성분중 하나 이상을 함유하는 백신 조성물을 제공한다: 소 허피스바이러스-1, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스-3, 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그리포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 하드조(Leptospira hardjo), 렙토스피라 익테로하에모라지아에(Leptospira icterohaemorrhagiae), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 또는 만헤미아 하에몰리티카(Mannhemia haemolytica).

또한, 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "수의학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 또한 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 보조제, 안정제, 희석제, 보존제, 항세균제 및 항진균제, 등장제, 흡착지연제 등을 포함한다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장제는 특히 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민을 포함한다. 백신 조성물은 추가로 하나 이상의 다른 면역조절제, 예컨대 인터류킨, 인터페론 또는 기타 사이토킨을 포함할 수 있다.

백신 조성물에 사용하기에 적합한 보조제의 비제한적인 예로는 특히 리비(RIBI) 보조제 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)), 알룸, 알루미늄 히드록사이드 겔, 수중유형 유화액, 유중수형 유화액(예: 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제, 블록 공중합체(조지아주 아틀란타 소재의 CytRx), SAF-M(캘리포니아주 에머리빌 소재의 키론(Chiron), 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제, 사포닌, 퀼(Quil) A, 콜레스테롤, QS-21(매사츄세츠주 캠브리지 소재의 캠브리지 바이오테크 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.)) 또는 다른 사포닌 분획), 모노포스포릴 지질 A, 아비리딘 지질-아민 보조제, 이 콜리(E. coli)(재조합 또는 그외)로부터 얻은 열-불안정성 장독소, 콜레라 독소, 또는 무라밀 디펩티드가 있다.

전형적으로, 생 돌연변이 바이러스는 백신에 체적 약 0.5 내지 약 5㎖의 양내에 투여량당 백신 입자 약 1×10⁶ 및 약 1×10⁸개의 양으로, 수의학적으로 허용가능한 담체와 함께 존재한다. 보호 효과를 제공하기에 효과적인 백신 조성물내 바이러스의 자세한 양은 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다. 바이러스의 DNA 또는 RNA 분자를 백신에 사용하는 경우, 핵산의 양은 일반적으로 약 0.1㎍/㎖ 내지 약 5.0㎎/㎖이어야 한다.

본 발명의 백신 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 주사 용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 만들어지거나, 또는 동결건조 기법을 사용하여 동결건조 형태로 만들어질 수 있다. 동결건조 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되고, 보조제의 존재 또는 부재하에 안정화 용액, 예컨대 염수 또는(및) HEPES에서 재구성될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 백신 조성물내 바이러스의 병원성 변형물에 의해 초래된 질환을 치료하거나 예방하기 위하여 동물에 투여될 수 있다. 따라서, 바이러스에 의해 초래된 질환에 대하여 동물을 백신접종하는 방법도 또한 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명을 실시함에 있어서, 본 발명의 백신 조성물은, 바람직하게는 비경구 경로에 의해 동물에 투여되지만, 다른 투여 경로, 예컨대 경구, 경비, 근육내, 림프절내, 피내, 복강내, 피하, 직장 또는 질 투여 또는 이들 경로의 혼합 경로도 사용될 수 있다. 상승 처방이 필요할 수 있고, 투여 처방은 최적의 백신접종을 제공하도록 조절될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 제한하려는 것은 아니다.

실시예 I

BVDV2 균주 53637내 세포 서열 삽입의 위치 결정

BVDV2-53637로부터의 NS2-3 영역의 서열중 일부를 결정하여, 영역내 임의의 세포 서열 삽입 위치를 확인하고 지도화하였다. 포워드 프라이머(forward primer) 53637U1(5'-CGTCCACAGATGGTTTGGT-3'; 서열 1) 및 리버스 프라이머(reverse primer) 53637L(5'-GGCTATGTATTGGACGTAACCC-3'; 서열 2)을 사용하여, 바이러스 RNA로부터 670 염기 RT-PCR 생성물을 증폭하였다. RT-PCR 생성물은 정제되어 서열 분석을 위해 제출되었다(서열 3), BVDV1-NADL(진뱅크 등록번호 제M31182호, 서열 4)과 함께 정렬되는 경우, 눈에 띄는 유사성이 관찰되었다(도 1). 두 바이러스는 보스 타우루스 DnaJ1 유전자로부터 유도된 프레임내 삽입을 함유한다. NADL의 경우, 삽입은 길이가 90 아미노산(270 뉴클레오타이드)이고, NADL 폴리단백질에서 글리신-1536과 프로필-1627 사이에 존재한다. 이들 좌표는 SD-1(진뱅크 등록번호 제AAA42860호, 서열 6)과 같은 비세포병원성 BVDV1 균주에서 글리신-1536과 프롤린-1537에 상응하며, 이는 NADL의 게놈 변화가 동시 결실 또는 측면 바이러스 서열의 중복이 없는 간단한 삽입임을 나타낸다. BVDV1-NADL과 마찬가지로, BVDV2-53637에 보스 타루루스 DnaJ1 유전자 일부의 삽입이 있다. 세포 삽입 서열은 더 길며(131 아미노산, 393 뉴클레오타이드), BVDV1-NADL내 삽입에 비하여 양 방향으로 연장된다. NS2-3 영역내의 세포 서열 삽입의 위치는 두 바이러스에서 동일하다. BVDV1-NADL과는 달리, BVDV2-53637 삽입은 측면 바이러스 서열의 5 아미노산(15 뉴클레오타이드)의 결실이 수반된다. 삽입의 5' 말단쪽 옆에 3개의 아미노산 잔기가 없고, 삽입의 3' 말단쪽 옆에 2개의 아미노산 잔기가 없다. 세포 서열 삽입은 두 백신 바이러스에서 동일한 게놈 위치에 있기 때문에, 이들은 삽입 서열을 삭제하여 비세포병원성 키메라 바이러스가 생성되도록 상동 재조합할 수 없다.

실시예 II

동시 계대배양된 BVDV1-NADL/BVDV2-53637 배양물내 비세포병원성 BVDV 바이러스를 검출하기 위한 시도

두 백신 바이러스가 검출가능한 수준의 비세포병원성 BVDV를 생성하도록 재조합할 수 있는지를 결정하기 위하여, 바이러스를 감수성 세포에서 동시배양하고, 민감성 반-네스트화(hemi-nested) RT-PCR 분석을 사용하여 여전히 세포 삽입을 함유하는 과량의 긴 세포병원성 생성물 중에 있을 수 있는 비세포병원성 바이러스를 검출하였다. 시험관내 유형간 재조합 가능성을 증가시키기 위하여, 각각의 바이러스를 6-웰 평판내 융합 BK-6 세포에 2 내지 4회의 감염 배수로(실험당 12 복제) 동시에 접종하였다. 동시배양한 지 2 내지 3일 후, 세포를 동결 및 해동을 2회 행하고, 세포 파편을 저속 원심분리에 의해 제거하였다. 그 다음, 생성된 상청액을 다음 계대배양을 위한 접종액으로서 사용하였다. 수차례의 실험에서 총 7회의 연속 계대배양을 수행하였다. 계대배양동안, BVDV1-NADL은 BVDV2-53637보다 더 빨리 증식하였지만, II형 바이러스는 네스트화 RT-PCR을 사용하여 7회 계대배양 후에 여전히 검출할 수 있다. 임의의 비세포병원성 바이러스를 검출하기 위한 시도로 민감성 반-네스트화 RT-PCR 분석을 사용하였다.

제1회차의 RT-PCR에서, 포워드 프라이머 53637U1(서열 1) 또는 NADL4744(5'-CGTGGCTTCTTGGTACGGG-3', 서열 7)를 리버스 프라이머 53637L(서열 2) 또는 NADL5305(5'-AGCGGTATATTGTACAAAGCCA-3', 서열 8)와 함께 사용하였다. 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 4가지의 모든 조합을 사용하여 BVDV1, BVDV2 및 유형간 재조합체를 검출하였다. RT-PCR 생성물의 예상 크기는 세포병원성 BVDV1-NADL의 경우 562bp이고, 세포병원성 BVDV2-53637의 경우 670bp이었다. 비세포병원성 바이러스는, 검출가능한 수준으로 존재하는 경우, 292bp(BVDV1-NADL) 또는 277bp(BVDV2-53637)의 제1회차 생성물을 생성하는 것으로 예상된다. 유형내 재조합체는 재조합 부위의 위치에 따라 모체중 하나와 크기가 유사하거나, 중간 길이의 것일 것이다. 비세포병원성 BVDV는 제1회차의 RT-PCR 후 전혀 검출되지 않았다.

과량의 세포병원성 BVDV의 존재하에 비세포병원성 BVDV 검출 감도를 증가시키기 위하여, 네스트화 PCR 이전에 제한효소 분해 단계를 포함시켜 세포병원성 바이러스로부터 유도된 큰 NS2-3 주형을 파괴하였다. Mspl 및 Dral의 혼합이 선택되었는데, 이는 이들이 보스 타우루스 DnaJ1 삽입물내에서 절단되고 측면 바이러스 서열을 절단하지 않는다는 관찰에 근거한다. 제2회차(반-네스트화)의 PCR에서, 포워드 프라이머 53637U2(5'-TGCACGATCTGTGAAGGGAAAGAA-3', 서열 9) 또는 NADL4844(5'-TGCACTGTATGTGAGGGCCGAGAG-3', 서열 10)를 동일한 두 리버스 프라이머 53637L 또는 NADL5305와 함께 사용하였다. 적당한 프라이머 혼합물을 사용하여, BVDV1 및 BVDV2는 물론 유형간 재조합체를 검출하고자 하였다. RT-PCR 생성물의 예상 크기는 세포병원성 BVDV1-NADL의 경우 462bp이었고, 세포병원성 BVDV2-53637의 경우 570bp이었다(세포병원성 BVDV RT-PCR 생성물의 불완전 분해로 인해 낮은 수준으로 존재함). 비세포병원성 바이러스는, 검출가능한 수준으로 존재하는 경우, 192bp(BVDV1-NADL) 또는 177bp(BVDV2-53637)의 제2회차 생성물을 생성하는 것으로 예상된다. 유형간 재조합체는 재조합 부위의 위치에 따라 모체중 하나와 크기가 유사하거나, 중간 길이의 것일 것이다. 비세포병원성 BVDV는 제2회차의 PCR 후에 전혀 검출되지 않았다. 몇몇 개별 반응에서, 다양한 크기의 이상한 밴드가 나타났다. 100 내지 300bp의 모든 밴드는 가능한 비세포병원성 생성물인 것으로 간주되고 DNA 서열 분석을 위해 제출되었다. 모든 경우에서, 이상한 밴드는 PCR중 잘못된 프라이밍(priming)의 결과이었다. 어느 실험에서도 비세포병원성 바이러스의 증거는 없었다.

서열번호	기재내용
1	포워드 프라이머 53637U1
2	리버스 프라이머 53637L
3	BVDV2 균주 53637의 NS2-3 영역으로부터의 670 염기 RT-PCR 생성물
4	BVDV1-NADL의 게놈 서열 (진뱅크 등록번호 제M31182호)
5	BVDV1-NADL의 폴리단백질 서열 (진뱅크 등록번호 제AAA42854호)
6	비세포병원성 BVDV1 균주 SD-1의 폴리단백질 서열 (진뱅크 등록번호 제AAA42860호)
7	포워드 프라이머 NADL4744
8	리버스 프라이머 NADL5305
9	포워드 프라이머 53637U2
10	리버스 프라이머 NADL4844

서열목록 전자파일 첨부

Claims

두 생(live) 돌연변이 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)를 포함하고, 각각의 바이러스가 바이러스 게놈에 돌연변이를 함유하며, 상기 바이러스내 돌연변이가 동일한 게놈 부위에 존재하여 이들 돌연변이 바이러스가 돌연변이를 없애도록 서로 재조합할 수 없는 것인 백신 조성물.
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제1항에 있어서, 두 생 돌연변이 바이러스가 돌연변이 소 바이러스성 설사 바이러스 1(BVDV-1) 및 돌연변이 소 바이러스성 설사 바이러스 2(BVDV-2)로 이루어진 것인 백신 조성물.
제4항에 있어서, 두 생 돌연변이 바이러스가 세포병원성(cytopathic; cp) BVDV-1 및 cp BVDV-2로 이루어지고, 둘다 약독화되어 있는 것인 백신 조성물.
제5항에 있어서, cp BVDV-1 및 cp BVDV-2가 둘다 세포병원성 생물형을 생성하는 NS2-3 영역 내 돌연변이를 포함하는 것인 백신 조성물.
제6항에 있어서, cp BVDV-1이 BVDV-1 NADL이고, cp BVDV-2가 BVDV-2 53637인 백신 조성물.
제4항에 있어서, 소 허피스바이러스-1, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스-3, 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그리포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 하드조(Leptospira hardjo), 렙토스피라 익테로하에모라지아에(Leptospira icterohaemorrhagiae), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona), 또는 만헤미아 하에몰리티카(Mannhemia haemolytica)중 하나 이상을 추가로 포함하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 백신 조성물.
각각의 바이러스가 돌연변이를 함유하며, 바이러스내 돌연변이가 동일한 게놈 부위에 존재하여 이들 돌연변이 바이러스가 돌연변이를 없애도록 상동 재조합할 수 없는, 동일한 과의 두 생 돌연변이 바이러스를 선택하거나 구성하는 것을 포함하며, 상기 바이러스가 돌연변이 BVDV로 이루어지는 것인, 안전한 바이러스 백신을 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 돌연변이가 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 혼합중에서 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 돌연변이가 독성의 약독화, 세포 향성 또는 생물형의 변화, 종 향성의 변화, 외래 유전자 카세트(cassette)의 발현 또는 이들의 혼합중에서 선택되는 표현형을 제공하는 것인 방법.
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제10항에 있어서, 두 생 돌연변이 바이러스가 돌연변이 BVDV-1 및 돌연변이 BVDV-2로 이루어진 것인 방법.
제1항에 있어서, 두 BVDV가 모두 세포병원성 생물형을 생성하는 NS2-3 영역 내 돌연변이를 포함하는 것인 백신 조성물.
제1항에 있어서, 돌연변이가 삽입인 백신 조성물.
제11항에 있어서, 돌연변이가 삽입인 방법.