ES2355276T3 - Vacunas virales mutantes y seguras. - Google Patents
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia, en la que cada virus contiene una mutación en el genoma viral y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones, y en la que dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) mutantes.
Description
Campo de la Invención
La presente invención se refiere en general a vacunas adecuadas para su administración a animales contra infecciones víricas. Más específicamente, la presente invención se refiere a vacunas seguras y a procedimientos de preparación de dichas vacunas. Las vacunas de la presente invención contienen al menos dos virus mutantes vivos de 5 la misma familia o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que cada uno de los virus o los ácidos nucleicos codificantes contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).
Antecedentes de la Invención 10
La familia de virus Flaviviridae consiste en los géneros Pestivirus, Flavivirus y Hepacivirus. El género Pestivirus está representado por las especies del virus de la diarrea viral bovina 1 (BVDV-1), BVDV-2, virus de la fiebre porcina clásica y virus de la enfermedad de la frontera. Los viriones de los miembros de la familia encapsulan genomas de ARN de cadena positiva de aproximadamente 9,5 a 12,3 kb. Los ARN genómicos contienen fases de lectura abierta (ORF) largas contiguas que se traducen a poliproteínas que se procesan por proteasas celulares y virales para dar origen a las 15 proteínas virales maduras. Para miembros de Pestivirus, la ORF codifica una poliproteína de aproximadamente 3900 aminoácidos, que se procesa cotraduccionalmente y postraduccionalmente en las siguientes proteínas virales maduras (de 5’ a 3’): Npro, C, Erns, E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B.
Se encuentran dos biotipos entre algunos miembros de Pestivirus basándose en su efecto sobre células de cultivo tisular, en concreto citopatógenos (citopáticos o cp) y no citopatógenos (no citopáticos o ncp). Los análisis del 20 genoma pusieron de manifiesto inserciones de secuencias celulares, a veces acompañadas por duplicación de secuencias virales, reorganizaciones genómicas y/o deleciones de secuencias virales en los genomas de pestivirus cp, pero no en los ARN de los pestivirus ncp correspondientes. Esto sugiere que los pestivirus cp han evolucionado a partir de pestivirus ncp por recombinación del ARN.
El BVDV es un patógeno de ganado ampliamente distribuido. Habitualmente, el BVDV-1 produce sólo diarrea 25 leve en animales inmunocompetentes, mientras que el BVDV-2 puede producir trombocitopenia, hemorragias y enfermedad mortal aguda. El BVDV es capaz de atravesar la placenta del ganado bovino gestante y puede dar como resultado el nacimiento de terneros persistentemente infectados (PI) (Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc. 152; 763-768 (1968); Ross, y col., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188: 618-619 (1986)). Los terneros virémicos son inmunotolerantes al virus y persistentemente virémicos durante el resto de sus vidas. Proporcionan una fuente de brotes de enfermedad de las 30 mucosas (Liess, y col., Dtsch. Tieraerzti. Wschr. 81: 481-487 (1974)) y están altamente predispuestos a la infección con microorganismos causantes de enfermedades tales como neumonía o enfermedades entéricas (Barber, y col., Vet. Rec. 117: 459-464 (1985)). Los virus de cualquier genotipo pueden existir como uno de los dos biotipos, cp o ncp. El fenotipo cp se correlaciona con la expresión de NS3, puesto que las células infectadas con BVDV cp o ncp expresan ambas NS2-3, mientras que la NS3 se detecta sólo después de la invención con BVDV cp. La NS3 es colineal a la parte C-35 terminal de NS2-3. La expresión de NS3 parece ser el resultado de alteraciones genómicas observadas para BVDV cp.
Las vacunas virales disponibles actualmente incluyen vacunas virales vivas atenuadas o muertas, vacunas de vectores vivos, vacunas de subunidades y vacunas de ADN o ARN. Véase Roth y col., “New Technogy For Improved Vaccine Safety And Efficacy”, Veterinary Clinics North America: Food Animal Practice 17(3): 585-597 (2001). La atenuación de virus puede conseguirse por irradiación UV, tratamiento químico o alto número de pases en serie in vitro. 40 Se desconoce el número, la posición y la naturaleza de las mutaciones inducidas por estos procedimientos por ausencia de análisis de la secuencia genómica. La atenuación también puede conseguirse generando alteraciones genéticas definidas, por ejemplo, la deleción específica de secuencias virales que se sabe que confieren virulencia, o la inserción de secuencias en el genoma viral. Una preocupación con respecto al uso de vacunas virales vivas atenuadas es que los virus mutantes atenuados tienen el potencial de recombinarse in vivo para eliminar la mutación o mutaciones 45 atenuantes, restaurando de este modo la virulencia. Por ejemplo, en presencia de una cepa de campo (de tipo silvestre) virulenta, los virus atenuados que tienen deleciones en el genoma viral tienen el potencial de recombinarse con la cepa virulenta para restaurar la secuencia delecionada. Véase, por ejemplo, Roth y col., anteriormente. También se ha observado que los pestivirus citopáticos que tienen inserciones celulares dan origen a virus no citopáticos en cultivo celular por deleción de las secuencias celulares, posiblemente a través de recombinación de ARN. Véase, por ejemplo, 50 Baroth y col., “Insertion of cellular NEDD8 coding sequences in a pestivirus”, Virology. 278(2): 456-66, (2000), y Becher y col., “RNA recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of letal disease”, Journal of Virology 75(14): 6256-64 (2001). Cuando se desee incluir dos virus mutantes atenuados de la misma especie, género o familia en una composición de vacuna, existe la preocupación de que los dos
virus puedan recombinarse en el animal vacunado, eliminando de este modo las mutaciones atenuantes. Véase, por ejemplo, Glazenburg y col., “Genetic recombination of pseudorabies virus: evidence that homologous recombination between insert sequences is less frequent than between autologous sequences”, Archives of Virology, 140(4): 671-85 (1995).
Continúa existiendo la necesidad de desarrollar vacunas eficaces y seguras que protejan a los animales frente 5 a infecciones víricas.
Sumario de la Invención
La presente invención proporciona vacunas seguras que contienen al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que cada virus o el ácido nucleico codificante contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus residen en el mismo 10 sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).
La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de una vacuna viral segura por selección o construcción de dos o más virus mutantes vivos de la misma familia, género o especie, en el que cada virus contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio 15 genómico, de modo que los virus mutantes no pueden experimentar recombinación homóloga para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).
La presente invención proporciona además un procedimiento de protección de un animal frente a infecciones víricas por administración al animal de una composición de vacuna de la presente invención.
Breve Descripción de los Dibujos 20
Figura 1. Alineamiento de las inserciones celulares y secuencias virales flanqueantes de las regiones NS2-3 de BVDV-1 cepa NADL y BVDV-2 cepa 53637.
Descripción Detallada de la Invención
Se ha reconocido excepcionalmente de acuerdo con la presente invención que virus mutantes vivos de la misma familia, que contienen mutaciones en el mismo sitio genómico de los virus, no pueden recombinarse entre sí para 25 eliminar las mutaciones.
Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona composiciones de vacunas seguras que contienen al menos dos, es decir, dos o más, virus mutantes vivos de la misma familia, o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus 30 mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).
En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una vacuna viral segura, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En concreto, se prepara una vacuna segura por selección o construcción de dos o más virus mutantes vivos de la misma familia, género o especie, en la que cada virus contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable (por ejemplo, atenuación de la virulencia, alteración del biotipo 35 o tropismo celular, alteración del tropismo de especie o expresión de un casete génico extraño) y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden experimentar recombinación homóloga entre sí para eliminar las mutaciones. En concreto, dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV).
El término “vacuna” o “composición de vacuna” se refiere a una composición que contiene virus mutantes vivos 40 que, tras su inoculación a un animal, induce una inmunidad parcial o completa contra la versión patógena de los virus, o alivia los síntomas de enfermedades causadas por las versiones patógenas de los virus. Los efectos protectores de una composición de vacuna contra un virus se consiguen normalmente induciendo en el sujeto una respuesta inmune, una respuesta inmune humoral o mediada por células, o una combinación de ambas. Hablando en general, la supresión o reducción de incidencias de infección vírica, la mejoría de los síntomas o una eliminación acelerada de los virus de los 45 sujetos infectados son indicativas de los efectos protectores de la composición de vacuna.
Por “animal” se entiende que incluye aves, por ejemplo, pollos, pavos, aves acuáticas domésticas y cualquier mamífero, por ejemplo, ganado bovino, ovino, porcino, cabras, perros, gatos y caballos.
Los términos “virus”, "aislados virales" o “cepas virales”, como se usan en el presente documento, se refieren a
partículas virales o viriones que contienen ADN o ARN genómico viral, proteínas asociadas y otros constituyentes químicos (tales como lípidos).
Por “molécula de ácido nucleico que codifica un virus” o “molécula de ácido nucleico de un virus” se entiende la molécula de ácido nucleico genómico del virus, en forma de ARN o ADN.
Por “mutación” se entiende que se incluye la deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, o una 5 combinación de las mismas. De acuerdo con la presente invención, la mutación confiere preferentemente un fenotipo deseable, por ejemplo la atenuación de la virulencia, la alteración del biotipo o tropismo celular, la alteración del tropismo de especie o la expresión de un casete génico extraño. Son mutaciones especialmente preferidas las que confieren una virulencia atenuada.
Por “atenuación” se entiende que el virus ha perdido parte o toda su capacidad para proliferar y/o causar 10 enfermedad en un animal infectado con el virus. Por ejemplo, un virus atenuado puede ser un virus que sea incapaz de replicarse en absoluto o que se limite a una o unas pocas rondas de replicación, o de tropismo celular o tisular restringido, cuando está presente en un animal en el que puede replicarse una versión patógena de tipo silvestre del virus atenuado.
Un virus atenuado puede tener una o más mutaciones en un gen o genes que estén implicados en la 15 patogenicidad del virus. Dichas mutaciones también se denominan en el presente documento “mutaciones atenuantes”. Un virus atenuado puede producirse a partir del virus patógeno de tipo silvestre por irradiación UV, tratamiento químico o alto número de pases en serie del virus patógeno de tipo silvestre in vitro. Como alternativa, un virus atenuado puede producirse a partir del virus patógeno de tipo silvestre realizando una deleción específica de secuencias virales que se sabe que confieren virulencia, una inserción de secuencias en el genoma viral, o realizando una o más mutaciones 20 puntuales en el genoma viral. Un virus atenuado puede ser un aislado viral obtenido a partir de una animal, obteniéndose dicho aislado de la versión patógena de tipo silvestre del virus a través de acontecimientos distintos de medios artificiales, por ejemplo, acontecimientos que hayan tenido lugar en un animal huésped tales como recombinación.
Los dos o más virus mutantes vivos presentes en las composiciones de vacunas de la presente invención 25 contienen mutaciones que residen en el mismo sitio genómico. Por “mismo sitio genómico” se entiende que cuando las secuencias de nucleótidos genómicas de los virus se alinean, las mutaciones en los genomas virales se solapan entre sí de modo que no existen oportunidades de recombinación homóloga entre los genomas virales para eliminar las mutaciones. En otras palabras, cuando las secuencias de nucleótidos genómicas de los virus se alinean, existe al menos una porción contigua de las secuencias alineadas en la que las secuencias en los genomas virales alineados son 30 secuencias mutantes. Existen varios programas informáticos que comparan y alinean secuencias de ácido nucleico que un experto en la materia puede usar. Las secuencias se alinean con el fin de una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una secuencia de ácido nucleico para un alineamiento óptimo con una segunda secuencia de ácido nucleico). Por ejemplo, los programas NBLAST y XBLAST, como se describen en Altschul, y col., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410, el programa BLAST con huecos, como se describe en Altschul y col., 1997, Nucleic 35 Acids Res. 25: 3389-3402 y el programa PSI-Blast, como se describe en Altschul y col., 1997, anteriormente. Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con huecos y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) (véase http://www.ncbi.nim.nih.gov).
Hablando en general, el concepto de la presente invención, es decir, la inclusión en la misma composición de vacuna de dos o más virus mutantes vivos de la misma familia que tienen mutaciones en el mismo sitio genómico, es 40 aplicable a virus mutantes de cualquier familia en la que los genomas virales tengan una identidad de secuencia suficiente para permitir la recombinación homóloga. Se ha demostrado que una identidad de nucleótidos tan pequeña como de 15 nucleótidos puede conducir a una recombinación homóloga eficaz (Nagy y Bujarski. J. Virol. 69: 131-140, 1995).
La composición de vacuna de la presente invención contiene dos o más virus mutantes vivos del género 45 Pestivirus, en concreto BVDV. El género Pestivirus está representado por las especies del Virus de la Diarrea Viral Bovina tipo 1 (BVDV-1), Virus de la Diarrea Viral Bovina tipo 2 (BVDV-2), virus de la fiebre porcina clásica y virus de la enfermedad de la frontera. La ORF codifica una poliproteína de aproximadamente 3900 aminoácidos, que se procesa cotraduccionalmente y postraduccionalmente en las proteínas virales maduras siguientes (de 5’ a 3’): Npro, C, Erns, E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B. 50
Comúnmente, el BVDV tiene un genoma en forma de ARN. El ARN puede someterse a transcripción inversa en ADN para su uso en la clonación. Por lo tanto, las referencias hechas en el presente documento a ácido nucleico y secuencias virales de BVD incluyen tanto secuencias de ARN viral como secuencias de ADN derivadas de las
secuencias de ARN viral. Por comodidad, las secuencias genómicas de BVDV como se representan en la LISTA DE SECUENCIAS a continuación en el presente documento sólo se refieren a las secuencias de ADN. La secuencia de ARN correspondiente para cada una será fácilmente evidente para los expertos en la materia.
En una realización más preferida, la composición de vacuna de la presente invención contiene un BVDV-1 citopático y un BVDV-2 citopático, en la que las mutaciones en ambos virus asociadas con el biotipo citopático residen 5 en el mismo sitio genómico, de modo que los dos virus mutantes no pueden recombinarse para eliminar las mutaciones.
El BVDV-1 y BVDV-2 representan dos genotipos estrechamente relacionados de BVDV. Las secuencias de nucleótidos de los dos virus comparten una identidad de aproximadamente el 70% sobre el genoma total, y un porcentaje de identidad ligeramente superior dentro de la región NS2-3. Se cree que el porcentaje de identidad entre los genomas virales de BVDV-1 y BVDV-2, al menos en la región NS2-3, es suficiente para permitir la recombinación 10 homóloga.
Habitualmente, el BVDV-1 sólo produce diarrea leve en animales, mientras que el BVDV-2 son virus con alta virulencia que pueden producir trombocitopenia, hemorragias y enfermedad mortal aguda (Corapi y col., J. virol. 63: 3934-3943; Bolin y col., Am. J. Vet. Res. 53: 2157-2163; Pellerin y col., Virology 203: 260-268, 1994; Ridpath y col., Virology 205: 66-74, 1994; Carman y col., J. Vet. Diagn. Invest. 10: 27-35, 1998). Los dos tipos de virus tienen una 15 antigenicidad diferente determinada por un panel de MAb y por neutralización cruzada usando antisueros específicos de virus generados en animales (Corapi y col., Am. J. Vet. Res. 51: 1388-1394, 1990). Los virus de cualquier genotipo pueden existir como uno de los dos biotipos, citopatógeno (citopático o cp) o no citopatógeno (no citopático o ncp). Los virus cp inducen efectos citopáticos (por ejemplo, lisis celular) en células cultivadas, mientras que los virus no citopáticos no lo hacen. 20
Es deseable preparar vacunas que proporcionen protección contra tanto BVDV-1 como BVDV-2. Sin embargo, debido al alto grado de identidad de secuencia entre los dos virus, existe la posibilidad de que un BVDV-1 citopático vivo y un BVDV-2 citopático vivo incluidos en la misma composición de vacuna puedan recombinarse entre sí en el animal vacunado para dar virus no citopáticos. La recombinación entre BVDV-1 y BVDV-2 se ha documentado. Véase, por ejemplo, Ridpath y col., Virology 212: 259-262 (1995). La infección del feto en ganado bovino gestante con virus ncp 25 antes de que se desarrolle la inmunocompetencia puede dar como resultado que el feto permanezca virémico durante todo el periodo de gestación y el nacimiento posterior de un ternero que permanece persistentemente virémico. Dicho ternero puede morir de enfermedad de las mucosas tras una superinfección con un BVDV cp. Por consiguiente, las composiciones de vacunas proporcionadas por la presente invención que contienen BVDV-1 cp vivo y BVDV-2 cp vivo que tienen mutaciones en el mismo sitio genómico son especialmente deseables para proteger a los animales frente a 30 tanto BVDV-1 como BVDV-2.
En una realización, los aislados de BVDV cp obtenidos de animales pueden usarse en la composición de vacuna de la presente invención. Se han descrito aislados cp tanto de BVDV-1 como de BVDV-2 y están disponibles para los expertos en la materia, por ejemplo, las cepas NADL de BVDV-1 (ATCC nº VR1422 o VR-534), 53637 de BVDV-2 (depositada en la ATCC como PTA-4859) y aislados de campo de tipo 2 tales como los descritos por Ridpath y 35 Neill, J. Virol 74: 8771-8774, (2000). Los aislados cp descritos hasta la fecha contienen típicamente una inserción de una secuencia heteróloga, por ejemplo, una secuencia codificante de ubiquitina (número de acceso de Genbank M96687 o De Moerlooze y col., J. Gen. Virol. 74: 1433-1438, (1993)), una secuencia codificante de NEDD8 bovina (Baroth y col., anteriormente) o una secuencia codificante de DnaJ1 de Bos taurus (como se describe en los Ejemplos a continuación en el presente documento), entre otras. 40
En otra realización, se genera un BVDV cp por realización de alteraciones definidas en el genoma de BVDV, por ejemplo, por deleción de secuencias virales específicas, inserción de secuencias en un sitio genómico viral específico o realización de una o más sustituciones, o combinaciones de las mismas.
Cuando se genera un BVDV cp por inserción de una secuencia heteróloga (es decir, extraña para el virus) en un sitio genómico específico, la naturaleza de la secuencia a insertar generalmente no es crítica para la presente 45 invención. Además, la inserción no se limita a ningún sitio particular siempre que la inserción dé como resultado un fenotipo atenuado. Como las secuencias heterólogas en los aislados cp se encuentran con frecuencia en la región NS2-3, la región NS2-3, especialmente la parte que rodea al supuesto sitio de escisión de NS2-3 que corresponde, por ejemplo, a los restos aminoacídicos nº 1679 a nº 1680 de la cepa NADL de BVDV-1 (la numeración se basa en la secuencia genómica publicada con el Nº de acceso de Genbank M31182, SEC ID Nº: 4) es una localización preferida 50 para las inserciones.
Puede generarse un BVDV-1 cp por realización de una alteración genómica definida que imite la mutación identificada en un aislado de BVDV-2 cp obtenido de un animal, de modo que estos virus tengan mutaciones asociadas
con el biotipo cp en el mismo sitio genómico. De forma similar, puede generarse un BVDV-2 cp por medio de la realización de una alteración genómica definida que imite la mutación identificada en un aislado de BVDV-1 cp obtenido de un animal.
En una realización preferida, la composición de vacuna de la presente invención contiene NADL (un aislado de BVDV-1 cp) y 53637 de BVDV-2 (un aislado de BVDV-2 cp), en la que los dos aislados cp contienen cada uno una 5 mutación en el mismo sitio genómico que da como resultado el biotipo citopático. La secuencia genómica de la cepa NADL de BVDV-1 se expone en la SEC ID Nº: 4 y la cepa 53637 de BVDV-2 se depositó en la ATCC como PTA-4859. Ambos aislados contienen una inserción en la región NS2-3. El BVDV-1 cp atenuado contiene una inserción de una secuencia codificante de DnaJ1 de Bos taurus 3’ de la timidina en la posición de nucleótido nº 4993 (numeración de secuencia de NADL), que es el tercer nucleótido del codón que codifica el resto de glicina en la posición aminoacídica 10 1536. El BVDV-2 cp atenuado contiene una inserción de una secuencia codificante de DnaJ1 de Bos taurus en el mismo sitio genómico.
De acuerdo con la presente invención, los aislados de BVDV cp empleados en la presente composición de vacuna se han atenuado y por lo tanto no son patógenos. Los expertos en la materia conocen procedimientos de atenuación y también se describen a continuación en el presente documento. 15
En otra realización, la composición de vacuna de la presente invención contiene un BVDV-1 atenuado y un BVDV-2 atenuado, en la que las mutaciones atenuantes en ambos virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los dos virus mutantes no pueden recombinarse para eliminar las mutaciones atenuantes.
Un BVDV atenuado se genera por irradiación UV, tratamiento químico o alto número de pases en serie de la versión patógena del virus in vitro. Puede realizarse un análisis de secuencia para determinar la naturaleza y la 20 localización genómica de las mutaciones generadas mediante estos procedimientos. La mutación puede ser en forma de una deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, o una combinación de las mismas. Como alternativa, un BVDV atenuado se genera realizando alteraciones definidas en el genoma de BVDV, por ejemplo, por deleción de secuencias virales específicas, inserción de secuencias en un sitio genómico viral específico o realización de una o más sustituciones, o combinaciones de las mismas. 25
Como se ha descrito anteriormente, los virus mutantes vivos para su uso en la composición de vacuna de la presente invención pueden ser de la misma familia, género o especie, en la que los genomas virales tienen una identidad de secuencia suficiente para permitir la recombinación homóloga. Los ejemplos adicionales de combinaciones de virus apropiadas para usar en la composición de vacuna de la presente invención incluyen, pero sin limitación, combinaciones de diferentes tipos de poliovirus, combinaciones de múltiples cepas mutantes vivas de virus de la 30 bronquitis infecciosa, combinaciones de múltiples cepas mutantes vivas de virus de la enfermedad de Newcastle, combinaciones de adenovirus 1 canino y adenovirus 2 canino, combinaciones de herpesvirus 1 equino y herpesvirus 4 equino, combinaciones de múltiples cepas mutantes vivas de virus influenza, combinaciones de múltiples cepas atenuadas vivas de calicivirus felino, combinaciones de múltiples serotipos de Rotavirus, combinaciones de múltiples serotipos de Rhinovirus, combinaciones de múltiples serotipos de virus de la glosopeda, combinaciones de los genotipos 35 europeo y norteamericano del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, combinaciones de cepas convencionales y variantes del virus de la bursitis infecciosa.
De acuerdo con la presente invención, aunque las partículas virales son la forma preferida para su uso en las vacunas, también pueden usarse moléculas de ácido nucleico que codifican virus mutantes de la misma familia, género o especie directamente en vacunas. La molécula de ADN o ARN puede presentarse en forma “desnuda” o puede 40 combinarse con un agente que facilite la captación celular (por ejemplo, liposomas o lípidos catiónicos). Se han descrito bien en la técnica vacunas y procedimientos de vacunación que utilizan ácidos nucleicos (ADN o ARNm), por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.703.055, Patente de Estados Unidos Nº 5.580.859, Patentes de Estados Unidos Nº 5.589.466, Publicación de Patente Internacional WO 98/35562 y por Ramsey y col., 1997, Immunol. Cell Biol. 75: 360-363; Davis, 1997, Cur. Opinion Biotech. 8: 635-640; Manickan y col., 1997, Critical Rev. Immunol. 17: 139-154; 45 Robinson, 1997, Vaccine 15(8): 785-787; Robinson y col., 1996, AIDS Res. Hum. Retr. 12(5): 455-457; Lal y Bennett, 1998, Critical Rev. Immunol. 18: 449-484; y Vogel y Sarver, 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8(3): 406-410, incorporándose todas en el presente documento por referencia.
Además de dos o más virus mutantes vivos de la misma familia, género o especie (específicamente BVDV), las composiciones de vacunas pueden incluir otros componentes antigénicos. Otros componentes antigénicos apropiados 50 para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación, antígenos preparados a partir de bacterias patógenas tales como Mycoplasma hyopneumonia, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuls, Bordetella bronchiseptica, Bacillus anthracis, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Mycoplasma bovis, Mycoplasma galanacieum, Mycoplasma gallisepticum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium
paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Campylobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Listeria monocytogenes, Rickettsia rickettsii, Borrelia spp., Ehrlichia spp., Chlamydia spp., Brucella spp., Vibrio spp., serovariedades de Salmonella enterica, Leptospira spp.; hongos patógenos tales como Candida; protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp.; helmintos 5 tales como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola; en forma de una preparación celular parcial o completa inactivada o en forma de moléculas antigénicas obtenidas por técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Los antígenos adicionales incluyen virus patógenos tales como virus de la enfermedad de Marek, virus de la bursitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la anemia del pollo, virus de la viruela aviar, virus de la leucosis aviar, virus de la laringotraqueítis infecciosa, virus reticuloendotelial, parvovirus canino, virus del moquillo 10 canino, herpesvirus canino, coronavirus canino, parainfluenza-5 canino, virus de la panleucopenia felina, herpesvirus felino, calicivirus felino, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la peritonitis infecciosa felina, herpesvirus equino, virus de la arteritis equina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la encefalitis equina occidental, virus de la encefalitis equina venezolana, virus del Nilo Occidental, virus de la gastroenteritis transmisible, coronavirus bovino, herpesvirus bovinos 1, 3, 6, virus parainfluenza bovino, virus respiratorio 15 sincitial bovino, virus de la leucosis bovina, virus de la peste bovina, virus de la glosopeda, virus de la rabia, virus de la fiebre porcina africana, parvovirus porcino, virus PRRS, circovirus porcino, virus influenza, virus de la enfermedad vesicular porcina, virus de la fiebre de Techen, virus de la pseudorrabia, en forma de preparación viral viva modificada (atenuada), una preparación de virus parcial o completo inactivado o en forma de molécula antigénicas obtenidas por técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Cuando se usan virus vivos atenuados adicionales, dichos virus 20 adicionales deberían ser preferentemente de una familia diferente de la de los dos virus atenuados principales, como se ha descrito anteriormente.
En una realización preferida, la presente invención proporciona una composición de vacuna que contiene un BVDV-1 cp atenuado derivado de la cepa NADL de BVDV-1, un BVDV-2 cp atenuado derivado de la cepa 53637 de BVDV-2, en la que los dos aislados cp contienen cada uno una mutación asociada con el biotipo cp en el mismo sitio 25 genómico, y al menos uno (es decir, uno o más) de los componentes antigénicos siguientes, en forma viva modificada o inactivada: herpesvirus bovino 1, virus respiratorio sincitial bovino, virus parainfluenza 3, Campylobacter fetus, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona o Mannhemia haemolytica.
Además, las composiciones de vacunas de la presente invención pueden incluir uno o más vehículos 30 veterinariamente aceptables. Como se usa en el presente documento, un “vehículo veterinariamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen 35 albúmina, entre otros. Las composiciones de vacunas pueden incluir además uno o más agentes inmunomoduladores diferentes tales como, por ejemplo, interleucinas, interferones u otras citocinas.
Los adyuvantes adecuados para su uso en las composiciones de vacunas incluyen, pero sin limitación, el sistema adyuvante RIBI (Ribi inc.), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, tales como, por ejemplo, adyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero de bloque (CytRx, 40 Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), adyuvante AMPHIGEN, saponina, Quil A, colesterol, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) u otras fracciones de saponina, monofosforil lípido A, adyuvante de amina lipoidal Avridina, enterotoxina termolábil de E. coli (recombinante o de otro modo), toxina colérica o muramil dipéptido, entre muchos otros.
Típicamente, un virus mutante vivo está presente en una vacuna en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 45 y aproximadamente 1 x 108 partículas de virus por dosis, con un vehículo veterinariamente aceptable, en un volumen de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5 ml. La cantidad exacta de virus en una composición de vacuna eficaz para proporcionar un efecto protector puede determinarse por un veterinario experto. Cuando la molécula de ADN o ARN del virus se usa en la vacuna, la cantidad de los ácidos nucleicos debería estar generalmente entre aproximadamente 0,1 g/ml y aproximadamente 5,0 mg/ml. 50
Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden prepararse de diversas formas dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las composiciones de vacunas pueden prepararse en forma de dispersiones o soluciones acuosas estériles adecuadas para uso inyectable, o prepararse en formas liofilizadas usando técnicas de secado por congelación. Las composiciones liofilizadas se mantienen típicamente a aproximadamente 4ºC y pueden reconstituirse en una solución estabilizante, por ejemplo, solución salina o HEPES, con o sin adyuvante. 55
Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden administrarse a una animal para tratar o prevenir una enfermedad causada por las versiones patógenas de los virus en las composiciones de vacunas. Por lo tanto, también se describen procedimientos de vacunación de un animal frente a una enfermedad causada por un virus.
En la práctica de los presentes procedimientos, una composición de vacuna de la presente invención se administra a un animal, preferentemente por vías parenterales, aunque también pueden usarse otras vías de 5 administración, tales como, por ejemplo, por vía oral, intranasal, intramuscular, intra-ganglio linfático, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, rectal o vaginal, o por una combinación de vías. Pueden ser necesarios regímenes de refuerzo y el régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar una vacunación óptima.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante, pero de ningún modo se limita a, los ejemplos siguientes. 10
EJEMPLO I
Determinación de la Posición de la Inserción Celular en la Cepa 53637 de BVDV2
Se determinó una porción de la secuencia de la región NS2-3 de BVDV2-53637 para identificar y mapear la localización de cualquier inserción celular en la región. Se amplificó un producto de RT-PCR de 670 bases a partir del ARN viral usando el cebador directo 53637U1 (5’-CGTCCACAGATGGTTTGGT-3’; SEC ID Nº: 1) y el cebador inverso 15 53637L (5’-GGCTATGTATTGGACGTAACCC-3’; SEC ID Nº: 2). El producto de RT-PCR se purificó y se sometió a análisis de secuencia (SEC ID Nº: 3). Cuando se alineó con BVDV1-NADL (número de acceso de Genbank M31182, SEC ID Nº: 4), se observaron similitudes sorprendentes (FIGURA 1). Ambos virus contienen una inserción en fase de lectura derivada del gen DnaJ1 de Bos taurus. En el caso del NADL, la inserción es de 90 aminoácidos (270 nucleótidos) de longitud y se localiza entre la glicina 1536 y la prolina 1627 en la poliproteína de NADL. Estas coordenadas 20 corresponden a la glicina 1536 y la prolina 1537 en las cepas de BVDV1 no citopáticas, tales como SD-1 (número de acceso de Genbank AAA42860, SEC ID Nº: 6), indicando que la alteración genómica en la NADL es una simple inserción sin ninguna deleción o duplicación concomitante de las secuencias virales flanqueantes. Como en el BVDV1-NADL, existe una inserción de una porción del gen DnaJ1 de Bos taurus en el BVDV2-53637. La inserción celular es más larga (131 aminoácidos, 393 nucleótidos), extendiéndose en ambas direcciones respecto a la inserción en el 25 BVDV1-NADL. La localización de la inserción celular dentro de la región NS2-3 es idéntica en los dos virus. A diferencia del BVDV1-NADL, la inserción del BVDV2-53637 se acompaña de una deleción de 5 aminoácidos (15 nucleótidos) de secuencias virales flanqueantes. Están ausentes tres restos aminoacídicos que flanquean el extremo 5’ de la inserción, mientras que están ausentes dos restos aminoacídicos que flanquean el extremo 3’ de la inserción. Debido a que las inserciones celulares están en la misma posición genómica en los dos virus vacunales, no pueden experimentar una 30 recombinación homóloga para delecionar la inserción para generar un virus quimérico no citopático.
Ejemplo II
Intentos para Detectar Virus BVDV No Citopáticos en Cultivos Co-Pasados de BVDV1-NADL/BVDV2-53637
Para determinar si los dos virus vacunales son capaces de recombinarse para generar niveles detectables de BVDV no citopático, los virus se cocultivaron en células susceptibles y se usó un ensayo de RT-PCR semianidada 35 sensible para detectar virus no citopáticos potenciales de entre un exceso de productos citopáticos más largos que todavía contienen el inserto celular. Para aumentar la probabilidad de recombinación intertípica in vitro, cada virus se inoculó simultáneamente sobre células BK-6 confluentes en placas de 6 pocillos a una multiplicidad de infección de 2-4 (12 repeticiones por experimento). Después de 2-3 días de cocultivo, las células se congelaron y se descongelaron dos veces y se eliminaron los residuos celulares por centrifugación a baja velocidad. El líquido sobrenadante resultante se 40 usó después como inóculo para el siguiente pase. Se realizaron un total de siete pases en serie en varios estudios. Durante los pases, el BVDV1-NADL creció más rápidamente que el BVDV2-53637, pero el virus de tipo II todavía era detectable después de siete pases usando RT-PCR anidada. Se empleó un ensayo de RT-PCR semianidada sensible en un intento por detectar cualquier virus no citopático.
En la primera ronda de RT-PCR, se usaron los cebadores directos 53637U1 (SEC ID Nº: 1) o NADL4744 (5’-45 CGTGGCTTCTTGGTACGGG-3’, SEC ID Nº: 7) junto con los cebadores inversos 53637L (SEC ID Nº: 2) o NADL5305 (5’-AGCGGTATATTGTACAAACGGA-3’, SEC ID Nº: 8). Las cuatro combinaciones de cebadores directo e inverso se usaron para detectar BVDV1, BVDV2 y recombinantes intertípicos. El tamaño esperado del producto de RT-PCR era de 562 pb para el BVDV1-NADL citopático y de 670 pb para el BVDV2-53637 citopático. Si estuvieran presentes virus no citopáticos a niveles detectables, se esperaría que produjeran productos en la primera ronda de 292 pb (BVDV1-NADL) 50 o 277 pb (BVDV2-53637). Los recombinantes intertípicos deberían ser de un tamaño similar al de uno de los precursores, o de una longitud intermedia, dependiendo de la localización del sitio de recombinación. Nunca se detectaron BVDV no citopáticos después de la primera ronda de RT-PCR.
Para aumentar la sensibilidad de detección de BVDV no citopático en presencia de un gran exceso de BVDV citopático, se incluyó una etapa de digestión con enzimas de restricción antes de la PCR anidada para destruir los moldes de NS2-3 de mayor tamaño derivados de los virus citopáticos. Se seleccionó una combinación de MspI y DraI basándose en la observación de que cortan dentro del inserto de DnaJ1 de Bos taurus pero no cortan en las secuencias virales flanqueantes. En la segunda ronda de PCR (semianidada), se usaron los cebadores directos 53637U2 (5’-5 TGCACGATCTGTGAAGGGAAAGAA-3’, SEC ID Nº: 9) o NADL4844 (5’-TGCACTGTATGTGAGGGCCGAGAG-3’, SEC ID Nº: 10) junto con los mismos dos cebadores inversos 53637L o NADL5305. Se usaron combinaciones de cebadores apropiadas para intentar detectar recombinantes intertípicas, así como BVDV1 y BVDV2. El tamaño esperado del producto de RT-PCR es de 462 pb para el BVDV1-NADL citopático y de 570 pb para el BVDV2-53637 citopático (presente a bajos niveles debido a una digestión incompleta de los productos de RT-PCR de BVDV citopático). Si 10 estaban presentes virus no citopáticos a niveles detectables, se esperaría que produjeran productos en la segunda ronda de 192 pb (BVDV1-NADL) o 177 pb (BVDV2-53637). Los recombinantes intertípicos deberían ser de un tamaño similar al de uno de los precursores, o de una longitud intermedia dependiendo de la localización del sitio de recombinación. Nunca se detectaron BVDV no citopáticos después de la segunda ronda de PCR. En unas pocas reacciones individuales, se observaron bandas aberrantes de diversos tamaños. Todas las bandas de entre 100 y 300 15 pb se consideraron productos no citopáticos potenciales y se sometieron para análisis de secuencia de ADN. En cada caso, la banda aberrante era el resultado de un falso cebado durante la PCR. No había pruebas de virus no citopático en ninguno de los estudios.
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<110> Welch, Siao-Kun Wan, y col. 20
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<212> ADN
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN 5
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<223> cebador oligonucleotídico sintético NADL4844
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10
LISTA DE SECUENCIAS
<110> welch, Siao-Kun wan
Calvert, Jay Gregory
O'Hara, Michael K.
Cao, xuemei K. 15
<120> VACUNAS VIRALES MUTANTES SEGURAS
<130> PC25951A
<140> 60/490.834
<141> 29-07-2003
<160> 10 20
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 19
<212> ADN
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<400> 10
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Una composición de vacuna que comprende al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia, en la que cada virus contiene una mutación en el genoma viral y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden recombinarse entre sí para eliminar las mutaciones, y en la que dos de los virus mutantes vivos consisten en Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) mutantes. 5
- 2. La composición de vacuna de la reivindicación 1, en la que los dos virus vivos mutantes consisten en un Virus de la Diarrea Viral Bovina Tipo 1 (BVDV-1) mutante y un Virus de la Diarrea Viral Bovina Tipo 2 (BVDV-2) mutante.
- 3. La composición de vacuna de la reivindicación 2, en la que los dos virus vivos mutantes consisten en un BVDV-1 citopático (cp) y un BVDV-2 cp, y ambos están atenuados.
- 4. La composición de vacuna de la reivindicación 3, en la que el BVDV-1 cp y el BVDV-2 cp comprenden ambos 10 una mutación en la región NS2-3 que da como resultado un biotipo citopático.
- 5. La composición de vacuna de la reivindicación 4, en la que el BVDV-1 cp es BVDV-1-NADL y el BVDV-2 cp es BVDV2-53637.
- 6. La composición de vacuna de la reivindicación 2, que comprende además al menos uno de entre herpesvirus bovino 1, virus respiratorio sincitial bovino, virus parainfluenza 3, Campylobacter fetus, Leptospira canicola, Leptospira 15 grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona o Mannhemia haemolytica.
- 7. La composición de vacuna de la reivindicación 1, que comprende además un vehículo veterinariamente aceptable.
- 8. Un procedimiento de preparación de una vacuna viral segura que comprende seleccionar o construir dos virus mutantes vivos de la misma familia, en el que cada virus contiene una mutación y las mutaciones en los virus residen en 20 el mismo sitio genómico, de modo que los virus mutantes no pueden experimentar una recombinación homóloga para eliminar las mutaciones, y en el que los virus consisten en BVDV mutante.
- 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha mutación se selecciona de entre una deleción, una inserción, una sustitución o una combinación de las mismas.
- 10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha mutación confiere un fenotipo seleccionado de entre la 25 atenuación de la virulencia, alteración del biotipo o tropismo celular, alteración del tropismo de especie, expresión de un casete génico extraño o una combinación de los mismos.
- 11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los dos virus vivos mutantes consisten en un BVDV-1 mutante y un BVDV-2 mutante.
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