MXPA05001644A - Replicones de pestivirus que no expresan proteina c y/o e1, y particulas virales infecciosas que los contienen y pueden usarse en vacunas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona nuevos genomas de ARN pesticidas (replicones) que son capaces de replicarse, y pueden ser empaquetados en particulas virales infecciosas en celulas que complementan la(s) proteina(s) ausentes, pero no producen progenie de virus infecciosos. Estos replicones pueden ser utiles para propositos de vacunas. Los replicones codifican la mayoria, preferiblemente todas, las proteinas envolventes del virus, mientras, pro otro lado, no seran capaces de producir progenie de virus infecciosos. La presente invencion proporciona un replicon pestiviral, preferiblemente del virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV, segun siglas en ingles), la cual expresa todas las proteinas estructurales excepto una proteina funcional C o E1. Preferiblemente, al menos parte de la secuencia codificadora de la proteina E1 o C ha sido borrada de dicho replicon. Los presentes inventores probaron por primera vez, que las proteinas estructurales C y E1 son esenciales para la formacion de pestivirus infecciosos. Ademas se mostro que la eliminacion de C y E1 no afecta la habilidad de auto-replicacion del ARN. Las proteinas Capsidas o E1 pueden ser trans-complementadas eficientemente usando lineas de celulas que expresan constitutivamente proteinas pestivirales estructurales. Los viriones resultantes son capaces de infectar celulas objetivo bovinas y transferir las replicones sin generar progenie de virus competente para replicacion. En otras palabras, no se produce progenie de virus infeccioso. Los virrones complementados son indistinguibles de los pestivirus de tipo salvaje en los experimentos de neutralizacion de virus. No se detectaron recombinaciones de virus que produjeran virus infecciosos de tipo salvaje en ninguno de los experimentos de complementacion. Los virus complementados pueden usarse para la inmunizacion segura y eficaz contra el BVDV.

Description

REPLICONES DE PESTIVIRUS QUE NO EXPRESAN PROTEÍNA C Y/O El.

Y PARTÍCULAS VIRALES INFECCIOSAS QUE LOS CONTIENEN Y PUEDEN USARSE EN VACUNAS La presente invención se refiere a replicones de pestivirus que no expresan todas las proteínas estructurales del virus, partículas infecciosas que contienen dichos replicones, un método para producir dichas partículas virales infecciosas y vacunas que contienen dichas partículas virales. Los animales pueden ser protegidos contra pestivirus por medio de vacunación, sin embargo, las vacunas convencionales de virus vivos inactivadas o modificadas tienen desventajas con respecto a seguridad, así como también a eficacia. En consecuencia, deben ser desarrollados nuevos tipos de vacunas. Los pestivirus pueden dividirse en dos biotipos diferentes: virus citopatogénicos (cp) y virus no citopatogénicos (ncp), respectivamente. El virus de diarrea viral bovina (BVDV, según siglas en inglés de Bovine Viral Diarrhea Virus), un miembro del género Pestivirus dentro de la familia Flavivlridae es el agente causante de la diarrea viral bovina, una enfermedad del ganado económicamente importante en el mundo entero. Las especies de virus relacionadas de cerca genética y estructuralmente, son el Virus de Fiebre Clásica del Cerdo (CSFV, según siglas en inglés de Classical Swine Fever Virus) y el Virus de Enfermedad Terminal Bovina (BDV, según siglas en inglés de Border Disease Virus). Los pestivirus pueden inducir enfermedades severas con marcadas pérdidas económicas en el mundo entero. Las pérdidas económicas principales causadas por infecciones con BVDV son fertilidad reducida, abortos, y la generación de partos persistentemente infectados, que pueden desarrollar "Enfermedad de Mucosa" fatal. Dado que el cp de BVDV induce apoptosis y muerte celular y expresa la proteína 3 no estructural (NS3, según siglas en inglés de Non-Structural Protein 3), la inoculación con ncp de BVDV conduce a infección persistente de cultivos de células y la expresión de NS3 no es detectable. El genoma de pestivirus consiste en un ARN de una sola hebra de orientación positiva. El ARN tiene una longitud de aproximadamente 12.3 kb y contiene un marco de lectura abierto (ORF, según siglas en inglés de Open Reading Frame) grande, que está flanqueado por regiones no transcritas (NTR, según siglas en inglés de Non-Translated Regions) en ambos extremos del genoma. El ORF pestiviral es transcrito en una poli proteína, que es procesada co- y post-traslacionalmente en 11 (ncp de BVDV) o 12 (cp de BVDV) proteínas maduras mediante proteasas virales y celulares. Los viriones de pestivirus consisten en cuatro proteínas estructurales, una proteína cápsida (C) y tres proteínas envolventes (ERNS, E1, E2). Los anticuerpos de BVDV son dirigidos contra ERNS, E2 y NS3. La neutralización de actividad fue demostrada predominantemente en los anticuerpos específicos para E2. Los estudios acerca de la replicación de pestivirus han sido facilitados considerablemente por sistemas de genética reversa y el descubrimiento de los ARN subgenómicos que se replican autónomamente (replicones) (4, 26). Los genomas de pestivirus con pérdida de segmentos se describieron primero como partículas que interferían en forma defectuosa (DI) para el BVDV y CSFV (24, 27). Desde entonces se han publicado muchos reportes con relación a la replicación de pestivirus. Ha sido reportada la trans-complementación de proteínas estructurales de virus de la familia Flaviviridae. Los ARN de pestivirus auto-replicantes son importantes herramientas para una comprensión de la replicación, ensamblaje y salida de virus. Puede usarse la frans-complementación de partes del genoma borradas, por ejemplo, para la identificación de los elementos írans-actuantes de un genoma pestiviral. Los requisitos mínimos para la replicación de ia CSFV fueron investigados, por ejemplo, creando genomas de CSFV defectuosos con ausencia de las secuencias de genes para las proteínas estructurales. Se encontró que los genomas defectuosos de CSFV todavía se replicaban y podían ser empaquetados en partículas virales cuando se introducían en células SK-6 junto con el ARN ayudante A187-CAT (Moser y coinvestigadores, J. Virol., 7787-7794, 1999). Ha sido descrito un genoma de BVDV defectuoso replicante autónomamente que carece de los genes codificadores C, Ems, E1, E2, p7 y NS2 (Behrens y coinvestigadores, J. Virol., 72, 2364-2372, 1998). Para el virus Kunjin (KUN) se empaquetaron en viriones replicones con pérdida de segmentos en las regiones estructurales, usando un sistema en donde se transfectaron células BHK-21 mediante dos electroporaciones consecutivas, primero con los replicones KUN mutados, y a continuación con un replicón de Virus del Bosque Semlike con expresión de proteínas estructurales KUN (Khromykh y coinvestigadores, J. Virol., 72(7), 5967-5977, 1998). Para la CSFV ha sido reconocido que los viriones defectuosos trans-complementados que contenían replicones Ems borrados podrían servir potencialmente como base para vacunas. Se generaron y frans-complementaron replicones de CSFV con pérdida de segmentos Erns usando una línea de células de riñon de cerdo (SK6) que expresa constitutivamente ERNS de CSFV. Los viriones resultantes fueron capaces de infectar células SK6 sin la producción de progenie de virus infecciosos y pudieron ser pasados en las células SK6 que expresan Erns. Los cerdos fueron protegidos contra el inicio de la CSFV letal después de la inmunización con los viriones complementados (40) Hasta ahora, hay sólo pocos reportes sobre la trans-complementación de los replicones de BVDV. Se encontró que los defectos en las regiones codificadores para las proteínas no estructurales NS3, NSNS4a, NS4B y NS5B no son complementables, mientras que los defectos en la unidad NS5A pudieron ser complementados en trans (Grassmann y coin, J. Virol., 75, 7791-7802, 2001). (4, 18, 36). La frans-complementación de E2 y/o p7 de BVDV, usando líneas celulares que expresan constitutivamente E2 y/o p7 de BVDV por complementación también ha sido descrita (Harada y coinvestigadores, J. Virol., 74, 9498-9506, 2000). La presente invención proporciona nuevos genomas de ARN pestiviral (replicones) que son capaces de replicarse, y pueden ser empaquetados en partículas virales infecciosas en células que complementan la(s) proteínas perdida(s), pero no producen progenie de virus infecciosos. Estos replicones pueden ser útiles para propósitos de vacunas. A pesar de que era conocido en la técnica que todos los genes que codifican proteínas estructurales de un pestivirus pueden ser borrados sin afectar la habilidad para replicarse (Behrens y coinvestigadores, supra), este muíante que ha perdido todas las proteínas estructurales, no será apropiado para propósitos de vacunas. Una vacuna principalmente apunta a invocar una respuesta inmune. Una vacuna, por otra parte, debe ser capaz de provocar una respuesta inmune, mientras que, por otro lado, por supuesto no debe invocar la enfermedad (viral) en el animal inoculado o en los animales que estén en contacto con él. La respuesta inmune inducida, usualmente está dirigida principalmente contra las proteínas envolventes del virus. Pero, si fuera a usarse un replicón en el cual todas las secuencias estructurales, más particularmente, todas las proteínas envolventes, han sido borradas, estas proteínas no serían producidas a partir del replicón y no se obtendría respuesta inmune a estas proteínas. Los presentes inventores apuntan a proporcionar un replicón que todavía codifique la mayoría de las proteínas envolventes del virus, preferiblemente todas, mientras, por otro lado, no sea capaz de producir progenie de virus infecciosos. La presente invención proporciona un replicón de un pestivirus, preferiblemente el virus de diarrea viral bovina (BVDV), el cual expresa todas las proteínas estructurales de la BVDV, excepto una proteína funcional C y/o E1. Preferiblemente al menos parte de la secuencia codificadora de la proteína E1 o C ha sido borrada de dicho replicón. Un replicón es una molécula de ARN auto-replicante. En este caso la molécula de ARN es el genoma ARN del virus de BVD, por ejemplo de un clon de ADNc de BVDV como pA/BDV/ins- ( eyers y coinvestigadores, J. Virol. 70:8606-8613, 1996). El ARN de BVDV contiene un ORF que es transcrito en una poiiproteína, la cual es procesada en proteínas maduras por medio de proteasas virales y celulares. En la construcción de replicones mutados debe tenerse cuidado de no introducir un marco de lectura dentro del ORF del BVDV. Además, cuando las secuencias codificadoras de las proteínas estructurales son borradas, las secuencias que codifican algunos aminoácidos terminales N y/o C pueden ser retenidas para asegurar el procesamiento post trancripcional apropiado del polipéptido precursor (se retienen los sitios de corte de proteasa) . Por ejemplo, la cepa cápsida NCP7 (proteína C) de BVDV es codificada por los aminoácidos (AA) 169-270. Aproximadamente 25 aminoácidos en el término C (AA245-270) funcionan como una señal de secuencia para la translocación de la poliproteína ERNSE1E2, y como un ancla supuesta de la proteína cápsida. La secuencia de señal en el término C de la proteína cápsida es esencial para un procesamiento adicional de la poliproteína aguas abajo. En el caso en donde la expresión de una proteína C funcional se evita borrando parte del gene que codifica la proteína C, la secuencia codificadora que codifica la parte de la proteína esencial para procesamiento adicional aguas abajo debe ser retenida preferiblemente. Para la proteína C, aproximadamente 32 AA debe ser retenida preferiblemente en el término N. La longitud exacta de las secuencias necesaria para el procesamiento aguas abajo puede variar por cepa o tipo de célula. La proteína envolvente E1 de la cepa NCP7 del BVDV es codificada por los aminoácidos 498 a 692. Aproximadamente 33 aminoácidos en el término C (AA660 a 692) funcionan como una secuencia de señal para la translocación de la proteína envolvente E2, y como una supuesta ancla de la proteína envolvente E1. Sin embargo, puede usarse otras secuencias de señal o las secuencias análogas de otras especies de pestivirus (por ejemplo, CSFV) en lugar de, por ejemplo, la secuencia de BVDV. Para los mutantes E1 de BVDV en el término N ninguna AA funciona como una secuencia de señal. Tanto para los mutantes C como para los E1, son concebibles varias formas de construcción de replicones, que no expresan las proteínas funcionales. Por ejemplo, este tipo de mutaciones puede ser creado por deleciones parciales en donde las secuencias de señal son retenidas, o deleciones parciales o completas en donde las . secuencias de señal son reemplazadas por secuencias de señal análogas, o mutaciones en donde sólo se efectúan intercambios del par base. Los presentes inventores probaron por primera vez, que tanto las proteínas estructurales C como las E1 son esenciales para la formación de pestivirus infecciosos. Adicionalmente se mostró que la pérdida de segmentos de C y de E1 no produce impacto en la habilidad de auto-replicación del ARN. Usando líneas celulares que expresan proteínas pestivirales estructurales constitutivamente, las cápsidas o proteínas E1 pueden ser ¡frans-complementadas eficientemente. Los viriones resultantes son capaces de infectar células objetivo y de transferir los replicones sin generar progenie de virus infecciosos competentes para replicación. Los viriones complementados son indistinguibles del pestivirus tipo salvaje en experimentos de neutralización de virus y pueden ser completamente neutralizados mediante, por ejemplo en el caso de BDV, un suero específico para BVDV y también por un suero específico para BVDV E2. No se detectaron recombinaciones que proporcionan virus de BVDV infecciosos de tipo salvaje en ninguno de los experimentos de complementación. Los virus complementados pueden ser usados para la inmunización segura y eficaz contra un pestivirus, tal como BVDV.

La infección de células y animales con los virus trans-complementados da como resultado que los ARN replicadores expresen todas las proteínas codificadas en las células infectadas, pero las cuales no generan partículas virales. Así, los viriones complementados pueden ser usados para la inmunización contra una infección con un pestivirus, tal como BVDV, y pueden proteger animales vacunados de la enfermedad relacionada con el pestivirus. En una modalidad preferida, un replicón de acuerdo con la invención no codifica una proteína funcional C. Esto puede lograrse borrando al menos parte de la secuencia codificadora para la proteína C; en el caso del BVDV, preferiblemente se borra la región codificadora que codifica las posiciones de aminoácidos 201-243 de la proteína C. En otra' modalidad de la presente invención, el replicón no codifica una proteína funcional E1. Para el BVDV, preferiblemente se borra la región codificadora que codifica las posiciones de aminoácidos 498 a 653 de la proteína E1. Se ha encontrado que la proteína C, que es la proteína cápsida del virus, así como también la proteína E1, es esencial para la obtención de virus infecciosos. Los mutantes que carecen de la secuencia codificadora para la proteína C o la E1 por consiguiente no son infecciosos. La ventaja de los mutantes que no codifican una proteína cápsida o E1, pero codifican (envuelven) todas las proteínas responsables de la respuesta inmune (especialmente E2 y Ems) es que la respuesta inmune incluirá todavía una respuesta contra todas las proteínas envolventes, dado que las secuencias codificadoras para todas las proteínas envolventes están presentes todavía. Del mismo modo, parte de la presente invención son partículas virales infecciosas de un pestivirus que contienen un replicón de acuerdo con la invención. Estas partículas pueden ser incorporadas en una vacuna para dicho pestivirus, por ejemplo, BVDV. Un método para la producción de partículas virales de acuerdo con la invención es igualmente parte de la invención. Este método puede incluir los siguientes pasos: a. Proporcionar células que sean permisivas para un pestivirus particular (por ejemplo BVDV) y expresen una proteína pestiviral E1 y/o C, b. Transfectar dichas células con un replicón de acuerdo con la invención, c. Cultivar las células transfectadas obtenidas en el paso b, d. Recolectar las partículas virales del cultivo de células. Preferiblemente las partículas producidas en el paso d se usan para infectar células frescas que son permisivas para un pestivirus particular (por ejemplo BVDV) y expresan nuevamente una proteína pestiviral E1 y/o C. Las células que pueden ser usadas en la producción de las partículas virales de acuerdo con la invención al menos deben ser capaces de expresar la proteína C y/o la proteína E1 de un pestivirus, que puede ser el pestivirus en el cual está basado el replicón, u otro pestivirus. En el caso del BVDV dichas células preferiblemente expresan la proteína E1 y/o la proteína C del BVDV. Ejemplos de líneas de células complementarias apropiadas se discuten en los ejemplos. En el caso del BVDV, estas células son preferiblemente de origen bovino, por ejemplo células de riñon bovino o línea celular esofágica diploide bovina. Las formas mediante las cuales pueden ser introducidas las secuencias codificadoras de un pestivirus tal como el BVDV en dichas células, son conocidas en la materia. Por ejemplo, las secuencias codificadoras para las proteínas estructurales de BVDV (al menos C y/o E1) pueden ser introducidas en dichas células por medio de un plásmido de expresión que codifica dichas proteínas, o por medio de un virus auxiliar. Cuando se pretende que las partículas virales sean usadas en una vacuna, se prefiere el uso de plásmidos de expresión, para evitar métodos de purificación complicados debido a la presencia de un virus auxiliar. Los plásmidos de expresión apropiados son conocidos en la materia. Después de la transfección del replicón de ARN se producen partículas virales infecciosas. Las células pueden hacerse crecer de acuerdo con métodos conocidos en la técnica hasta que se obtiene el título viral. Los virus deben ser recolectados del supernadante del cultivo celular o de los lisatos celulares totales.

Los métodos que se usan para transfectar las células y los diferentes procedimientos de clonación, son conocidos en la técnica (por ejemplo: Sambrock, J & Russel, D.W. Molecular Cloning: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2001). Todas las líneas de células permanentes que son apropiadas para la replicación de pestivirus pueden usarse, preferiblemente células de origen bovino. Preferiblemente las células se usan de forma que puedan ser transfectadas con ADN fácilmente. Las secuencias codificadoras de las proteínas estructurales de la mayoría de los pestivirus contienen sitios de empalme crípticos. En consecuencia, para la mayoría de las cepas de BVDV, puede construirse un marco de lectura sintético abierto (SynORF) eliminando los sitios de empalme para asegurar la expresión con los promotores usando la vía nuclear (por ejemplo, el promotor HCMV). Sin embargo, otros sistemas de expresión (virus, replicones de otros virus, replicones de pestivirus con diferentes deleciones) pueden proporcionar las proteínas borradas para la trans-complementación. Una vacuna que contiene partículas virales infecciosas de acuerdo con la invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable, es igualmente parte de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1 Representación esquemática de las construcciones generadas. Los cuadros oscuros representan la región estructural del BVDV. Las líneas punteadas muestran las regiones borradas y los números indican la posición del nucleotido en el ARN de longitud completa del BVDV. Las flechas indican sitios de restricción enzimática que flanquean los segmentos perdidos. Las líneas en los extremos izquierdo y derecho indican las regiones no transcritas. Npro, autoproteasa; C proteína cápsida; ERNS, E1 y E2, proteínas envolventes; p7, proteína no estructural; N2 a N55, proteínas no estructurales; 3'-UTR y 5'-UTR, regiones no codificadoras. La escala está dada en kb.

FIGURA 2 Detección de anticuerpos específicos para BVDV después de la inmunización con NCP7_AC_trans e inicio de infección con BVDV tipo 1 usando un sistema ELISA indirecto (A), y un ELISA bloqueador de NS3 (B). Se muestran los valores medios de los grupos de animales. Los títulos de neutralización en el día 62 después de la inmunización son de 1:256 o mayores.

FIGURA 3 Detección de títulos de anticuerpos neutralizantes específicos para BVDV después de la inmunización con NCP7_AC_trans. Se muestran los valores medios de los grupos de animales.

FIGURA 4 Contaje relativo de leucocitos y temperaturas corporales después del inicio de la infección (valores medios) FIGURA 5 Detección de antígeno ERNS para BVDV con un sistema ELISA comercial (Checkit BVD Virus III, Cr. Bommeii AG). Se muestran los valores medios de los grupos de animales.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE R E PLICONES DE BVDV Después del establecimiento de un clon infeccioso CP7 para BVDV, se generó una variante de la construcción con una pérdida de segmentos de una inserción 27 nucleótidos, que permitió la recuperación de ncp de BVDV (26). Con base en esta construcción con expresión de pA/BVDV/ins-, se construyeron replicones mediante deleción de secuencias codificadoras de C y E1 (Figura 1), sin introducir un marco de lectura dentro del ORF del BVDV. Los clones mutantes de BVDV que se muestran en la Figura 1 fueron construidos sobre la base del clon de ADNc de longitud completa pA/BVDV/ins-. La ubicación de sitios de restricción está indicada mediante números sobrescritos que corresponden a sus posiciones de corte en el genoma de BVDV/CP7 (Figura 1).

CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDOS Los plásmidos de NCP7AC y NCP7AE1 fueron construidos por un procedimiento de clonación de dos pasos. Se insertaron dos fragmentos de PCR en el plásmido de pA/BVDV/ins- enriquecido con Xhol209 y Kpnl2447'3797 (Tabla 1). Los plásmidos fueron amplificados en células de E. coli TOP10F' (Invitrogen). Se ejecutaron procedimientos de digestión de enzima de restricción y de clonación de acuerdo con los protocolos estándar. El ADN plásmido fue purificado mediante equipos QIAGEN Plasmid Mini, Midi o Maxi. Los iniciadores usados para la secuenciación (marcados con ÍRD 800) fueron sintetizados especialmente (MWG-Biotech). Los pares de iniciadores para la generación de las construcciones respectivas están resumidos en la Tabla 1. Los replicones resultantes contenían una pérdida de segmentos de una parte de la región cápsida (NCP7AC, posición de aminoácidos 201 a 243 (Fig 1)) o de la región codificadora E1 (NCP7AE1, posición de aminoácidos 498 a 653 (Fig 1)). Todas las deleciones fueron confirmadas por PCR Y secuenciación nucleótida de los clones de ADNc resultantes.

REACCIÓN DE CADENA POLI ERASA (PCR) Y SECUE CIACIÓN Para la PCR, se usó un variador térmico PTC-200 (MJ Research, Inc:). La amplificación basada en ADN se hizo mediante el sistema Expand High Fidelity PCR (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Para la PCR RT, se extrajo el ARN completo de células infectadas con virus usando el reagente TRIZOL (Gibco-Life Technologies). Se amplificó el ADNc del patrón de ARN usando transcriptasa reversa (Promega) y un iniciador específico para secuencia. El ADNc sintetizado fue amplificado con una polimerasa termoestable Taq (Promega) y los productos PCR fueron secuenciados directamente. La secuenciación se llevó a cabo usando un equipo Thermo Sequenase Cycle Sequencing (Amersham Biosciences). Las secuencias nucleótidas fueron leídas con un secuenciador automático COR (MWG Biotech) y fueron analizadas usando el paquete de software Wisconsin versión 9.1 (Genetics Computer Group, EEUU).

TRA SCRI CIÓN IN-VITRO Y ELECTRO FORACIÓN Seguidamente, el replicón de ARN de longitud completa transcrito in-vitro fue transfectado en células PT negativas para BVDV. La transcripción In vitro de construcciones y replicones de ADNc de longitud completa linearizados fue llevada a cabo mediante el sistema de producción de ARN a gran escala RiboMax® (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARN fue estimada mediante teñido con bromuro de etidio después de electroforesis con gel de agarosa. Para las transfecciones, se separó 1 x 107 células PT, PT_805 o KOP-R usando una solución de tripsina, se lavaron con tampón de salina fosfatada sin Ca++/Mg++ (PBS), se mezclaron con 1 a 5 µ9 de ARN sintetizado in-vitro y se electroforaron (dos pulsos a 850V, 25 µ?, 156O) usando una unidad de transfeccion EsyjecT Plus (Equibio).

CARACTERIZACIÓN DE LOS REPLICONES Para la detección de proteínas de BVDV, se usaron los anticuerpos monoclonales (mab) WB210 (Anti-ERNS, CVL, Weybridge). WB215 (anti-E2, CVL, Weybridge), CA3 (anti-E2, Institute for Virology, TiHo Hannover), mab-mix WB103/105 (anti-NS3, CVL, Weybridge), y C16 (anti-NS3, Institute for Virology, TiHo, Hannover) (15, 16, 31). La expresión transitoria de NS3 pudo ser detectada a partir de 24 horas después de la transfeccion por IF para todos los replicones. Adicionalmente, también se demostró la inmunofluorescencia específica para E y E2. Sin embargo, no pudo ser recuperado el recombinante infeccioso BVDV, aún después de pases y copases en serie usando células KOP-R altamente susceptibles (Tabla 2). La intensidad del inmunoteñido específico para NS3 de las células PT transfectadas con NCP7AC y NCP7AE1 fue comparable a la de las células transfectadas con ARN de longitud completa de NCP7 y más del 85% de las células fueron positivas en IF (Tabla 2). La transfección de ARN de longitud completa de NCP7 en células PT dio como resultado títulos de virus de hasta 103 Ul/ml. Tal como se esperaba, la electroforación de células con ARN del prototipo de replicón D19 (4) no condujo a la recuperación del BVDV infeccioso, pero se observó una fuerte inmunofluorescencia después del teñido de NS3. La PCR de RT de las células PT transfectadas con replicones de longitud completa NCP7 demostró la presencia de ARN específico para BVDV del tamaño esperado que contenía las deleciones correctas. En resumen, los genomas de BVDV borrados, los cuales fueron competentes para la replicación, pero carecían de la habilidad para generar progenie de virus, fueron construidos y pudieron ser transfectados eficientemente en células bovinas. t O TABLA 1 : CONSTRUCCIÓN DE REPLICONES DE BVDV replicón deleción deleción iniciador secuencia (5?3') Posición sentido (nt) (aa) (nt) ncp7AC 969-1095 201-243 cp7-204 AAGCCTCGAGATGCCACGTGG 204-224 + (Kpnl2447 C-969R- pnl tctaqqtaccTCTCTGACTCCTTAGGTGTTATC 969-947 mutado) cp7-1096- paqacrataccCTCAAGAGTCGCGCAAGAAAC 1096-1116 + Kpn p7-3804R GTCCTAGGTACCCCTGGGCA 3785-3804 ncp7AE1 1860- 498-653 cp7-204 AAGCCTCGAGATGCCACGTGG 204-224 + (Kpnl2447 2333 cp7-1859R- tcaqqtaccGTGCATATGCCCAAACCATGTC 1859-1838 mutado) Kpnl cp7-2334- caacqqtaccGAATTTGGACCGCTGCTACAACC 1334-2354 + Kpnl P7-3804R GTCCTAGGTACCCCTGGGCA 3785-3804 TABLA 2. REPLICACIÓN Y TRANS-CO PLEMENTACIÓN DE ARN DE BVDV NCP7 CON DELECIONES EN EL MARCO (REPLICONES) 3 Las células PT fueron transfectadas con ARN transcrito in-vitro y teñidas con IF para la expresión de NS3 después de 24 horas. b Las células KOP-R fueron inoculadas con supernadantes no diluidos 24 h, 48 h, y 72 h después de la transfección de las células PT (1 mi por cda 105 células). Las células KOP-R fueron teñidas con mabs específico para NS-3 5 días después de la inoculación. c Se transfectaron células PT_805 con ARN transcrito ¡n-vitro y los supernadantes se titularon luego de 24 horas usando células KOP-R. d Se inocularon células KOP-R usando supernadantes de células PT_805 transfectadas con un título > 108 Ul/ml (1 mi por 105 células). e P indica la deleción de placas de virus después del teñido para NS3 (>10 células). f 0 = sin inmunofluorescencia específica para BVDV; + = señal de IF positiva débil para NS3 y < 50% de células con IF positiva; ++ = señal de IF positiva para NS3 y 50% de células con IF positiva; +++ = señal de IF positiva fuerte para NS3 y > 50% de células con IF positiva. 9 nr = no se realizó.

EJEMPLO 2: ESTABLECIMIENTO DE CÉLULAS QUE EXPRESAN C-Ems-E1-E2 ESTABLECIMIENTO DE CÉLULAS PT QUE EXPRESAN C-ER S-E1-E2 Con el fin de realizar estudios de complementación con los replicones de BVDV, se estableció una línea de células bovinas que expresa constitutivamente las proteínas estructurales de BVDV. Las células PT (RIE11 CCVL), una línea permanente de células de riñon bovino, se obtuvieron a partir de la recolección de líneas de células en medicina veterinaria en el Centro de Investigación Federal de Enfermedades Virales de Animales, Insel Riens (CCLV). Las células PT se escogieron debido a su aplicabilidad para la transfeccion de ADN o ARN y para la generación de líneas de células con expresión constitutiva. Las células fueron cultivadas en medio esencial mínimo Dulbecco (D EM, según siglas en inglés de Dulbecco's Minimal Essential Médium), supiementadas con 10% de suero fetal bovino (FBS, según siglas en inglés de Fetal Bovine Serum) libre de BVDV. La región genómica que codifica las proteínas estructurales (C-ERNS-E1-E2) de la cepa PT810 de BVDV (41) fue clonada como un marco de lectura abierto sintético, sintetizado químicamente (Syn-ORF; gentilmente proporcionado por Tobías Schlapp, Bayer AG, Leverkusen). Consistió en 2649 nucleótidos que se extendían desde el nucleótido 890 hasta el 3584 de la secuencia nucleótida de la cepa NADL de BVDV (9) y se insertó en el plásmido de expresión de ADNpc 3.1 (Invitrogen) usando los sitios de restricción Kpnl y Notl. La secuencia nucleótida del ORF sintético había sido cambiada para eliminar los sitios de empalme (35), pero retenía la secuencia de aminoácidos original de la cepa PT810 de BVDV. Adicionalmente, el primer codón del ORF sintético fue cambiado por una metionina para permitir la expresión de la poliproteína bajo el control del promotor inmediato temprano de HCMV presente en el ADNpc 3.1, y se insertó un codón de parada detrás del último codón. La construcción resultante de ADNpc _C-E2 (1µ9) se usó para transfectar células con el reagente SUOEREFECT (Qiagen) a 2 días después de la transfección, se cambió el medio de cultivo celular a DMEM suplementado con 10% de suero bovino y 1 mg de G418 (Gibco, Life Technologies) por mi. Se aislaron colonias resistentes a G418, y se volvieron a colocar en placas varias veces. Después de la selección y pase de G418, se probó la expresión de ERNS y E2 de BVDV en los clones de células resistentes usando mabs WB210 y WB215, respectivamente. Las células positivas fueron clonadas, pasadas bajo selección de G418 y nuevamente se probó su expresión de ERNS y E2. En el análisis IF, el clon PT_805 de célula resistente a G418 contenía más de 90% de células que expresaron ERNS y E2. Durante el pase adicional de células PT_805 durante 6 meses en la presencia de G418, la porción de células que expresaron Erns y E2 permaneció estable.

Experimentos de inmunoprecipitación con mabs específicos para ERNS y E2 mostraron un patrón de proteína idéntico al de las células PT infectadas con BVDV en donde la glicoproteína E1 es co-precipitada con el mab específico para E2 (no se muestran datos). A partir de estos datos y de los obtenidos por secuenciación nucleótida, se concluyó que todas las proteínas estructurales de BVDV fueron expresadas constitutivamente en las células PT_805. La línea de células fue usada para experimentos de trans-complementación y para la generación de viriones infecciosos, así como también para empaquetar y transducir los replicones borrados.

RECUPERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BVDV RECO BINANTE TRA NS-C O M P L E M E N T AD O Para los experimentos de trans-complementación, se transfectó ARN de BVDV replicón o ARN de longitud completa de NCP7 en monocapas de células PT_805 mediante electroforación. Se recolectaron los supernadantes del cultivo de células 24 h, 48 h y 72 h después de la transfección (p.t., según siglas en inglés de post-transfection), se clarificaron por centrifugación (10,000 x g, 5 min) y se titularon usando células OP-R altamente susceptibles. Las células KOP-R (RIE244, CCVL) son células de una línea celular esofágica bovina diploide, obtenidas de la recolección de líneas de células en medicina veterinaria en el Centro de Investigación Federal de Enfermedades Víricas de Animales, lnsel Riems (CCLV). Las células KOP-R fueron seleccionadas debido a su susceptibilidad a infección con BVDV y su utilidad para la propagación de BVDV. Las células fueron cultivadas tal como se describió anteriormente para las células PT. Como un control negativo para la replicacion, se usaron controles de replicacion incompetente (pérdida de segmentos de mutantes NCPANS5 y NCP7A3'ntraatll). El día de la recolección, se vigiló la replicacion de BVDV mediante teñido IF. Los títulos de virus de los virus complementados se determinaron como unidades infecciosas (Ul). Los supernadantes de cultivo de células fueron titulados en triplicado en log-io pasos y se inoculó 1 mi en células KOP-R sembradas en placas de 24 receptáculos. Después de 12 horas de incubación a 37°C, se lavaron las células, se separaron con una solución de tripsina, y se contaron. Una alícuota de las células fue teñida mediante IF usando un mab de BVDV específico para NS3 y se analizaron por citometría de flujo. Las unidades infecciosas (Ul) fueron calculadas de acuerdo con la fórmula: número de células en el receptáculo x % células positivas para IF x factor de dilución = título en Ul/ml Para los cálculos, sólo fueron considerados los receptáculos con >5% y <30% de células positivas a IF. Para todos los replicones y NCP7 de longitud completa, el teñido con NS3 después de la transfección de ARN condujo a patrones de inmunofluorescencia similares a los obtenidos con células PT. Entre 80% y 95% de las células transfectadas fueron reactivas con anticuerpos específicos para NS3. Se detectó BVDV infeccioso recombinante en los supernadantes de células PT 805 transfectadas con NCP7AC, ???7??1 y NCP7, según se mostró mediante infección de células KOP-R. Los títulos de virus de los virus complementados resultantes NCP7AC_trans y NCP7AE1_trans variaron entre 1040 a 1066 Ul/ml a 24 p.t. (Tabla 2). Después de la transfección de ARN de NCP7 de longitud total en las células complementadoras PT_805, pudieron detectarse los títulos de virus de hasta 107·3 Ul/ml a 24 p.t. (Tabla 2). En consecuencia, los títulos de los virus rrans-complementados a partir de los supernadantes recolectados a 24 h p.t. fueron aproximadamente 10000 veces más altos que los títulos de virus obtenidos después de la transfección de ARN de NCP7 de longitud completa en células PT no complementadoras (Tabla 2). Adicionalmente, se detectó BVDV no complementado después del pase de supernadantes del cultivo de células PT_805 transfectadas con ARN replicón D19. (Behrens y coinvestigadores, J. Viro!. , 72, 2364-2372, 1998) en todos los momentos p.t. (Tabla 2). Usando IF de células KOP-R infectadas con NCP7AC_trans y NCP7AE1_trans, se pudo detectar la expresión de ERNS y NS3 (Tabla 2). El patrón de expresión indicó que los supernadantes de las células PT_805 transfectadas contenían virus infeccioso que puede infectar y replicarse en las células KOP-R. Los experimentos de titulación y el teñido posterior demostraron que no ocurrió propagación célula a célula, y que ni el NCP7AC_trans ni el NCP7AE1_trans fueron capaces de formar placas positivas a NS3 o infecciones secundarias en esas células (Tabla 2). En diluciones más altas, sólo las células solas o pequeños focos de células fueron positivas por teñido con IF para NS3. Los experimentos de control con células NCP7 de BVDV o KOP-R dieron como resultado placas de virus positivas como antígeno, según se demostró para ERNS, NS3 y E2. La infección de las células KOP-R con virus trans-complementados pudo ser bloqueada con antisuero neutralizante de BVDV (S-BVD_pos, S.BVD_E2) y no se detectó infectividad después de la inoculación de células KOP-R (100% de neutralización). Para la neutralización de BVDV, se mezcló 100 µ? de suspensión de virus (104 TCID50/ml) en una placa de 24 receptáculos con 50 µ? de suero no diluido e incubado a 37°C. Después de 2 h, las células KOP-R (2 x 104) fueron transferidas a la mezcla e incubadas durante 3 días a 37°C. Seguidamente, la monocapa fue teñida para NS3 de BVDV por inmunofluorescencia (IF) (19). (S-BVD_pos) fue un suero combinado anti-BVDV recolectado de ganado infectado experimentalmente con cepa PT810 de BVDV (3). El título de neutralización homologa de este suero fue 1:4,096. Para la neutralización específica para E2, se usó suero de oveja, inmunizada con un virus de Vaccinia Ankara modificado (MVA) con expresión de E2 (S-BVD_E2; Beer y coinvestigadores, datos no publicados). En una reacción de control, la incubación con un suero de ganado libre de anticuerpos de BVDV (S-BVD_neg) no dio como < O t-A O TABLA 3. NEUTRALIZACIÓN DE VIRUS DE BVD DE TIPO SALVAJE Y COMPLEMNENTA MEDIANTE ANTISUERO ESPECÍFICO PARA BVD a Los virus complementados fueron ajustados a un título de io UI ml b Suero de ganado preparado contra BVDV tipo 1. c Suero de oveja específicamente dirigido contra BVDV tipo 1 E2. d Suero de ganado libre de anticuerpos para BVDV e 0 = sin células positivas para IF, + = más de 100 células positivas para IF por receptáculo.

EJEMPLO 3: ESTABLECIMIENTO DE CÉLULAS PT QUE EXPRESAN C-ERNS (PT 875) MATERIALES Y MÉTODOS Se transfectó un replicón de NCP7AC trans-complementado para inmunización (NCP7_AC trans). Se transfectó ARN de NCP7_AC transcrito ¡n-vitro en células ayudantes PT_805. Se recolectaron los supernadantes de las células ayudantes a 24 horas y 48 horas después de la transfección, y se almacenaron a -70 "C. Los viriones rrans-complementados fueron titulados usando células KOP-R, y se determinaron los títulos en Ul. Las preparaciones de virión usadas para la inmunización fueron sometidas a prueba para identificar contaminantes bacteriales y virales. Adicionalmente, usando el pase de células KOP-R y análisis RT-PCR, se excluyó el BVDV revertido, así como también el BVDV de tipo salvaje.

ANIMALES, PROTOCOLO DE INMUNIZACIÓN, INICIO DE INFECCIÓN. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS, Y OBSERVACIÓN CLÍNICA En este experimento se usaron diez animales (crías de "Simmental") seronegati vos para BVDV y BHV-1 y de edad entre 3 y 5 meses. Cuatro animales fueron vacunados dos veces por vía intramuscular (I.m.) e intranasal (i.n.) con 29 días de distancia. Cada animal del grupo vacunado (animales número 173, 537, 554, 758, 977) recibió 4 mi de suspensión de virus que contenía 108 Ul/ml de NCP7_AC_trans (2 mi i.n. usando un dispensador de aerosol adaptado a una jeringa MUTO®, y 2 mi i.m.). Se usaron cinco crías como controles no vacunados (animales números 97, 99, 172, 610, 611). Todos los animales fueron iniciados con la infección el día 62 despúes de la primera inmunización con la cepa de BVDV de tipo salvaje SE5508 (Wolfmeier y coinvestigadores, Aren. Virol., 142, 2049-2057, 1997) usando un dispensador de aerosol adaptado a una jeringa MUTO®. Cada animal recibió 1 mi de suspensión de virus por vía nasal con un título de 106 TCID50. Se tomaron muestras de tampones nasales y sangre EDTA diariamente durante los primeros 10 días después de cada inmunización y después del inicio de la infección (p. inic.) Se recolectaron muestras adicionales en los días 14, 21 y 28 p.inm./p.inic, respectivamente. Se recolectaron muestras de suero los días 0, 3, 7, 14, 21, 29 p.inm./p.inic. de todos los animales. Se determinaron contajes de células sanguíneas blancas totales (WBC, según siglas en inglés de White Blood Cell) por análisis de distribución de tamaño con un analizador Cell-Cyn3700 (Abbott). Se determinó una puntuación clínica incluyendo temperatura corporal por 14 días después de cada inmunización, y por 28 días después del inicio de la infección.

SEROLOGÍA ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN Se sometió a prueba el suero de todos los animales en una prueba estándar de neutralización de suero (SNT, según siglas en inglés de Serum Neutralisation Test), contra las cepas CP7 y SE5508 de BVDV. Los sueros fueron inactivados (30 min, 36°C) y diluidos log2; 50 µ?) usando medio de cultivo para células (IvlEM, 10% FBS) por triplicado en placas de 96 receptáculos. Se añadió cien TCID50 de BVDV en 50 µ? y las placas fueron incubadas a 37°C. Después de 2 horas de incubación, se añadió 2 x 104 células KOP-R negativas para BVDV por receptáculo en 100 µ? de medio de cultivo celular, y las placas se incubaron durante 5 días a 37°C y 5% de C02. S usaron sueros con anticuerpos positivos y negativos para BVDV como controles, y se confirmó el título de virus por titulación reversa (log10, n=8). Se detectó la infección en las células por teñido con inmunofluorescencia indirecta. Los títulos neutralizantes fueron calculados como los valores geométricos medios de la última dilución recíproca (n = 3) en la cual no se observaron señales de IF.

ELISA PARA ANTICUERPOS DE BVDV Se usaron las pruebas ELISA para anticuerpos de BVDV (IDEXX) y la CEDI para anticuerpos de BVDV bloqueadores de NS3 (Diagnóstico CEDI) para determinar el BVDV, así como también los anticuerpos de BVDV específicos para NS3. Ambas pruebas se usaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

AISLAMIENTO DE VIRUS El virus se aisló usando co-cultivo de leucocitos sanguíneos con células KOP-R o inoculación de tampones nasales o monocapas de células KOP-R. Después de un periodo de incubación de a 6 días las células fueron analizadas para identificar NS3 de BVDV usando teñido por IF.

AISLAMIENTO DE VIRUS A PARTIR DE LEUCOCITOS SANGUÍNEOS Después de la hemolisis, se centrifugó sangre EDTA que contenía 1 O7 leucocitos, se lavó dos veces con PBS en hielo y se re-suspendió en 1 mi de PBS. Los cultivos de células KOP-R fueron inoculados usando 106 leucocitos lavados (n=2) en 100 µ? de PBS y se incubaron durante 4 a 6 días. Se detectó el BVDV usando teñido con IF con mab específico para NS3.

AISLAMIENTO DE VIRUS A PARTIR DE TAMPONES NASALES Se estabilizaron los tampones nasales (aproximadamente 100 mg de secreción por tampón) en 1 mi de PBS que contenía antibiótico, y 5% de suero bovino libre de anticuerpos para BVDV. Luego de vorticionar durante 20 segundos, se inoculó una alícuota de 100 µ? en cultivos de células KOP-R (n = 2). Después de un periodo de incubación de 4 a 6 días, se investigó la presencia del antígeno para NS3 de BVDV en las células usando teñido por IF.

ELISA PARA CAPTURA DE ERNS Para la detección del antígeno de BVDV después del inicio de la infección, se sometieron a prueba muestras de sangre de todos los animales con un sistema ELISA para captura de ERNS (Checkit BVDV III, Dr. Bommeli AG, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

RESULTADOS ESTADO DE SALUD DESPUÉS DE LA APLICACIÓN DE NCP7 AC TRANS Todos los animales permanecieron saludables después de la inmunización con NCP7_AC__trans, y no se observó ninguna puntuación clínica anormal. Ni la leucopenia ni las temperaturas aumentadas del cuerpo pudieron ser determinadas (datos no mostrados).

SEROLOGÍA DESPUÉS DE LA INMUNIZACIÓN Todos los animales estaban libres de anticuerpos para BVDV al principio del experimento (ELISA para anticuerpos BVDV y pruebas de neutralización contra el BVDV tipo I y II), y todos los animales control permanecieron negativos al anticuerpo para BVDV hasta el inicio de la infección con BVDV. Después de la primera inmunización con NCP7_AC_trans, todos los animales del grupo de vacuna calificaron positivos para los anticuerpos específicos para NS3 en el día 29 después de la inmunización (valor medio: 66%), pero fueron negativos en una prueba ELISA indirecta para BVDV (valor medio: 0.13). Las respuestas de anticuerpos específicos para NS3 se pudieron detectar tan temprano como a los 14 días después de ia inmunización en e¡ suero de los animales vacunados (figura 2a). Después de la primera inmunización se pudieron detectar los títulos de anticuerpos neutralizantes entre 1:3 y 1:12 contra la cepa SE5508 de BVDV (figura 3). Después de la segunda inmunización, todos los animales inmunizados calificaron positivo tanto en el bloqueo de NS3 como en la prueba ELISA indirecta (figura 2). Los valores medios de ELISA de aproximadamente 100% (ELISA para bloqueo de NS3) y aproximadamente 0.8 (ELISA indirecta) pudieron ser detectados entre los días 7 y 29 después de la segunda inmunización (Fig. 2a y b). En la prueba ELISA indirecta, se pudo observar un claro efecto reforzador (figura 2b).

En el momento de inicio de la infección (día 62 después de la primera inmunización) todos los animales vacunados tenían títulos neutralizantes de 1:256 o más de 1:256 contra las cepas de inicio de BVDV del genotipo I (Fig. 3).

AISLAMIENTO DEL VIRUS A PARTIR DE LEUCOCITOS SANGUÍNEOS Y TAMPONES NASALES DESPUÉS DE LA INMUNIZACIÓN No se pudo aislar ningún BVDV replicante en ninguno de los animales después de la inoculación del NCP7_AC_trans. Todos los ensayos para detección de virus con leucocitos y tampones nasales usando células KOP-R fueron negativos (Tabla 4).

PUNTUACIÓN CLÍNICA, AISLAMIENTO DEL VIRUS Y DETECCIÓN DE ANTIGENO DE BVDV DESPUÉS DEL INICIO DE LA INFECCIÓN Después del inicio de la infección, no se pudieron detectar signos clínicos de infección, ni leucopenia ni fiebre en alguno de los animales vacunados con los replicones trans-complementados (Figura 4a y b). En contraste, la mayoría de los animales de control que no habían sido sometidos a experimentos previamente, desarrollaron signos clínicos de una infección con BVDV con síntomas respiratorios (descarga nasal, tos) y depresión (no se muestran datos). En todos los animales de control se pudo observar una marcada leucopenia entre los días 3 y 8 así como también altas temperaturas corporales de más de 40°C después del inicio de la infección (Fig.4a y b). Se aisló el virus de inicio de BVDV de los leucocitos sanguíneos y de los tampones nasales de todos los animales de control entre los días 2 y 10 después del inicio de la infección 8Tabla 5). Sin embargo, no se pudo aislar BVDV de los leucocitos ni de los tampones nasales del ganado vacunado (Tabla 5). Adicionalmente, la detección del antígeno para Erns con una prueba ELISA para captura de ERNS comercial fue negativa para todos los animales vacunados después del inicio de la infección, pero se determinaron valores de ELISA elevados para todos los animales del grupo control entre los días 5 y 9 (Fig. 5), y tres de los cinco animales de control calificaron positivos con un valor de ELISA de más de 35% (no se muestran los datos).

SE OLOGÍA DESPUÉS DEL INICIO DE LA INFECCIÓN Después de inicio de la infección, todos los animales de control calificaron positivo en los sistemas ELISA (Fig. 2a y b) y la prueba de neutralización (no se muestran datos). Los anticuerpos para BVDV pudieron ser detectados a partir del día 14 despúes del inicio de la infección (Fig. 2a y b). En el grupo vacunado, pudo detectarse un marcado efecto de refuerzo con la prueba ELISA indirecta (valores medios desde 0.8 en el día 0 después del inicio de la infección, hasta 1.9 en el día 28 después del inicio de la infección), pero no con la prueba ELISA para bloqueo de NS3 (Fig. 2a y b).

DISCUSIÓN Todos los animales vacunados permanecieron saludables después de la inoculación del NCP7__AC_trans. No se pudieron observar síntomas clínicos, y no se detectó fiebre ni leucopenia. Después de la vacunación, no se pudo volver a aislar el BVDV a partir de los tampones nasales ni de los leucocitos sanguíneos. Tomada en conjunto, la ocurrencia de un virus revirtiente similar al NCP7 puede ser excluida. En consecuencia concluimos, que el NCP7_AC_trans es apatogénico para el ganado y actúa como defectuoso en los viriones de segundo ciclo (DISC, según siglas en inglés de Defective In Second Cycle) o como "pseudoviriones" incompetentes para la replicación. Todos los animales de control permanecieron negativos en anticuerpos para el BVDV hasta el inicio de la infección. En contraste, todos los animales vacunados desarrollaron anticuerpos específicos para NS3 después de la primera inmunización, y calificaron positivo en una prueba ELISA de anticuerpos para BVDV después de la vacunación de refuerzo con NCP7_AC_trans. Luego del inicio de la infección con un genotipo 1 de BVDV, todos los animales de control tuvieron una marcada leucopenia y fiebre. Adicionalmente, algunos de los controles desarrollaron síntomas respiratorios y estuvieron deprimidos por varios días. En contraste, ninguno de los animales vacunados desarrolló signos clínicos, o leucopenia, o fiebre después del inicio de la infección. Además, el virus de inicio se volvió a aislar en todos los animales de control durante varios días a partir de leucocitos sanguíneos y tampones nasales. Sin embargo, no se pudo aislar ningún BVDV en cualquiera de los animales vacunados. En consecuencia, concluimos que la inmunización con NCP7_AC_trans proporciona completa protección de los signos clínicos de BVDV, viremia y esparcimiento de virus.

TABLA 4: AISLAMIENTO DE VIRUS A PARTIR DE LEUCICITOS SANGUÍNEOS Y TAMPONES NASALES DESPUÉS DE LA INMUNIZACIÓN CON NCP 7 AC tran s días después de la segunda inmunización a número de inoculaciones positivas con 1 x106 leucocitos (2 inoculaciones por muestra; sin muesras positivas = blanco, 1 muestra positiva = gris claro, 2 muestras positivas = gris oscuro) número de inoculaciones positivas con 10 mg de secreción nasal (2 inoculaciones por muestra; sin muestras positivas = blanco, 1 muestra positiva = gris claro, s muestras positivas, gris oscuro) TABLA 5: AISLAMIENTO DE VIRUS A PARTIR DE LEUCOCITOS Y TAMPONES NASALES DESPUES DE LAINFECCION CON BVDV SE5508 días después del inicio de la infección (dpc) a número de inoculaciones positivas con 1x10e leucocitos (2 inoculaciones por muestra; sin muesras positivas = blanco, 1 muestra positiva = gris claro, 2 muestras positivas = gris oscuro) b número de inoculaciones positivas con 10 mg de secreción nasal (2 inoculaciones por muestra; sin muestras positivas = blanco, 1 muestra positiva = gris claro, s muestras positivas, gris oscuro)

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un replicón de un pestivirus que es incapaz de expresar una o más proteínas estructurales del virus, caracterizado porque dicho replicón expresa todas las proteínas estructurales de un pestivirus excepto una proteína funcional C y/o E1, pero en donde las secuencias codificadoras que codifican la parte de la proteína C y/o E1 esencial para el procesamiento adicional corriente abajo son retenidas o reemplazadas por una secuencia codificadora que codifica secuencias de señal análogas de otras especies pestivirales.

2. Un replicón de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado además porque al menos parte de la secuencia codificadora de la proteína E1 o C ha sido borrada de dicho replicón.

3. Un replicón de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque dicho replicón no codifica una proteína funcional C.

4. Un replicón de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque dicho replicón es del virus de diarrea viral bovina (BVDV).

5. Un replicón de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la región codificadora que codifica las posiciones de aminoácidos 201-243 de la proteína C ha sido borrada.

6. Un replicón de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque dicho replicón no codifica una proteína funcional E1.

7. Un replicón de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado además porque la región codificadora que codifica las posiciones de aminoácidos 498 a 653 de la proteína E1 ha sido borrada.

8. Partícula infecciosa viral de pestivirus, caracterizada porque contiene un replicón de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un método para la producción de partículas virales de un pestivirus, de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho método comprende los siguientes pasos: a. Proporcionar células que son permisivas para el pestivirus y expresan la proteína pestiviral E1 y/o C. b. Transfectar dichas células con ARN de un replicón de, transcrito ¡n-vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 c. Cultivar las células transfectadas obtenidas en el paso b. d. Recolectar las partículas virales de las células cultivadas.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho pestivirus es BVDV.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque dichas células expresan la proteína E1 y/o C del BVDV.

12. Una vacuna que contiene partículas virales infecciosas de acuerdo con la reivindicación 8 y un portador farmacéuticamente aceptable. RESUMEN La presente invención proporciona nuevos genomas de ARN pestivirales (replicones) que son capaces de replicarse, y pueden ser empaquetados en partículas virales infecciosas en células que complementan la(s) proteína(s) ausentes, pero no producen progenie de virus infecciosos. Estos replicones pueden ser útiles para propósitos de vacunas. Los replicones codifican la mayoría, preferiblemente todas, las proteínas envolventes del virus, mientras, por otro lado, no serán capaces de producir progenie de virus infecciosos. La presente invención proporciona un replicón pestiviral, preferiblemente del Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV, según siglas en inglés), la cual expresa todas las proteínas estructurales excepto una proteína funcional C o E1. Preferiblemente, al menos parte de la secuencia codificadora de la proteína E1 o C ha sido borrada de dicho replicón. Los presentes inventores probaron por primera vez, que las proteínas estructurales C y E1 son esenciales para la formación de pestivirus infecciosos. Además se mostró que la eliminación de C y E1 no afecta la habilidad de auto-replicación del ARN. Las proteínas Cápsidas o E1 pueden ser trans-complementadas eficientemente usando líneas de células que expresan constitutivamente proteínas pestivirales estructurales. Los viriones resultantes son capaces de infectar células objetivo bovinas y transferir las replicones sin generar progenie de virus competente para replicación. En otras palabras, no se prod uce progenie de virus infeccioso. Los viriones complementados son indistingui bles de los pestivirus de tipo salvaje en los experimentos de neutral ización de virus. No se detectaron recombinaciones de virus que produjeran virus infecciosos de tipo salvaje en n i ng uno de los experimentos de complementación. Los virus complementados pueden usarse para la inmunización segura y eficaz contra el BVDV.