KR101749130B1

KR101749130B1 - 레오바이러스과 바이러스의 백신용 바이러스 균주를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR101749130B1
Application number: KR1020157036407A
Authority: KR
Inventors: 폴리 로이; 마크 보이체
Original assignee: 런던 스쿨 오브 하이진 앤 트로피컬 메디신
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2017-06-20
Also published as: WO2009068870A1; EP3037526B1; JP5619614B2; CA2706603C; CN101970645A; EP2215221B1; US8673315B2; CN109825517A; KR20160003896A; EP2215221A1; JP2014239683A; JP5908948B2; ZA201004531B; US20100322971A1; KR101718497B1; US20140134209A1; JP2011504367A; EP3037526A3; EP3037526A2; MX2010005701A

Abstract

본 발명인 레오바이러스과에 속하는 바이러스의 변형된 바이러스 균주를 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 오르비바이러스 속의 백신용 바이러스 균주와 관한 것이다.

Description

레오바이러스과 바이러스의 백신용 바이러스 균주를 제조하는 방법{METHOD FOR PRODUCING VACCINAL VIRAL STRAIN OF A VIRUS OF THE REOVIRIDAE FAMILY}

본 발명은 레오바이러스과(Reoviridae)에 해당하는 바이러스의 변형된 바이러스 균주를 생산하는 방법에 관한 것으로, 특히, 오르비바이러스(Orbivirus) 속의 백신 바이러스 균주에 관한 것이다.

레오바이러스과의 바이러스들은, 이중 나선 RNA(dsRNA; double stranded RNA)로 이루어진 게놈을 가지며, 많은 질병을 일으킨다. 오르비바이러스는 상기 레오바이러스과의 바이러스로서, 역시 전염병(widespread disease) 일으킨다. 오르비바이러스의 예들로는 아프리카 말 병 바이러스(AHSV; African Horse Sickness Virus), 가축 유행성 출혈성 질환 바이러스(EHDV; Epizootic Hemorrhagic Disease Virus(EHDV) 및 블루텅 바이러스( BTV; Bluetongue Virus)가 있다.

AHSV, EHDV 및 BTV는 반추동물의 비접촉 전염성 바이러스성 질병이며, 곤충을 매개체로 흔하게 퍼져있다. AHSV는 보통 말, 노새, 당나귀 및 얼룩말에 영향을 미치고, EHDV는 보통 사슴, 소, 및 양에 영향을 미치며, 그리고BTV는 보통 소, 양, 염소, 버팔로, 사슴, 단봉낙타, 및 영양에 영향을 미친다.

BTV 바이러스는 야생 반추동물 및 가축에 있어서 곤충을 매개로 하여 최근에 생겨난 병원체이며 유럽 농업에 혹독한 경제적 충격을 준 바 있다. BTV는 양, 염소 및 소에 질병을 일으키며 일부 품종의 양에 대해서는 치사율이 70%에 이른다. BTV는 등에모기 속의 등에모기 몇몇 종에 의해 포유류 숙주 사이에서 전염되며, 그것의 지리학적 영역을 정한다. BTV는 많은 열대 및 아열대 나라의 풍토병이나, 1998년 유럽 본토로 유입된 이래로 흔한 일이 되었으며, 2007년에는 영국만큼 북쪽까지 다다랐다. 분자 전염병학 연구들은 여섯 가지(BTV1, 2, 4, 8, 9, 및 16)의 서로 다른 혈청형이 적어도 8가지의 개별적인 사건에 대해, 적어도 3가지의 다른 경로를 통해, 1998년 이후 유입되었으며, 1998년 이래 대부분의 해마다 새로운 유입이 일어났다. BTV 영역의 증가에 대해 가능한 직접적인 원인은 곤충 매개체의 개체수의 분포 및 크기가 증가한 것과 새로운 매개체 종에 따른 BTV의 전염이 있으며, 중앙 유럽 및 북유럽에서 흔하다. 상기 곤충 매개체를 통해 넓은 거리에 걸쳐 빨리 확산되는 것과 관련된 가축이나 야생 반추동물에 대한 진단 미확정 전염병의 존재 때문에 BTV가 유럽의 풍토병이 되는 것을 막는 데 실패하였다. 따라서, BTV는 이제 모든 유럽 국가에서 가축에 대한 상당한 위협을 의미한다. 네 가지의 BTV 혈청들은 이제 유럽에서 흔하며, 180만 마리의 동물들이 죽음에 이르렀다.

생백신과 비활성 백신을 적은 수의 혈청형에 사용하는 방식으로 백신으로 BTV을 제어하는 것이 유럽에서 시도되었다. 두 타입의 백신은 유럽의 몇 영역에 대해 약간 보호하였으나, 결함들이 알려졌다. 생 독성약화 BTV 백신은 몇 가지 결함이 있는바: 1) 전형적인 블루텅병의 병리학적 증상들의 발전에 이르는 것을 적게 지연시키고 2) 독성으로 되돌아가거나 상기 곤충 매개체를 통해 유포되는 야생형 바이러스로 재조합(re-assortment)되고 3)자연적으로 감염된 동물들과 예방 접종된 동물들을 구별하는 것이 불가능해져서 예방 접종된 동물들로부터 감염된 것의 구별법(DIVA; differentiation of infected from vaccinated animals)을 사용하는 전략을 사용하지 못하게 하며, 그리고 4) 새로 순환하는 형청형들의 독성약화 균주들을 생상하는데 시간이 지연된다.

비활성백신은 유럽에서 BTV2와 BTV4를 제어하는 데 사용되어 왔다. 이러한 것들은 비활성화, 각 배치(batch)의 비활성 여부의 확인, 및 면역원성에 관련하여 비용이 많이 소요되는 문제점이 있다.

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BTV ssRNA가 보조 바이러스를 사용하지 않아도 감염성이 있다는 것과 BTV가 세포로부터 회복될 수 있다는 것은 본 발명자들에 의해 보고된 바 있다(Boyce, M. 및 Roy, P. 2007). 이 문서는 본 명세서에 그 전체가 포함된다.

본 발명의 목적은 레오바이러스과에 속하는 바이러스의 바이러스 균주를 변형시키는 것, 특히, 생 독성약화 백신을 제조하는 것과 관련된 공지된 결함 중 일부 또는 모든 결함을 감소시키거나 제거하는 데 있다.

본 발명은 레오바이러스과에 속하는 바이러스의 바이러스 균주를 생산하는 방법을 제공하는 바, 상기 방법은:

상기 레오바이러스과 바이러스에 돌연변이를 도입하여 필수유전자의 기능이 파괴되도록 하는 단계;

세포에 바이러스 게놈으로부터 유도되고 상기 돌연변이를 포함하는 바이러스성 단일나선 RNA(ssRNA; single stranded RNA)를 형질전환(transfection)하는 단계; 및

상기 백신용 바이러스 균주를 생산하도록 상기 형질전환된 세포를 적절한 조건에서 배양하는 단계를 포함하고,

상기 세포는 상기 필수 바이러스 유전자의 기능을 보완하여 상기 백신용 바이러스 균주가 상기 세포 내에서 복제되도록 하는 것을 특징으로 한다.

상기 용어 "백신용 바이러스 균주"는 일반적으로 야생형 바이러스에 의해 감염되는 특정 숙주에 면역성을 주기 위한 백신에 사용되는 적절한 바이러스 균주를 의미한다. 백신용 바이러스 균주는 비-병원체성이고 감염을 일으키지 않는 종류이다. 따라서, 일반적인 상기 야생형 바이러스에 관련해서는 질병을 일으키지 않는다. 백신용 바이러스 균주의 개념은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 야생형 바이러스는, 그것들이 완전한 감염을 야기하는 일 없이 독성이 약화되거나 비활성화된 바이러스를 이용하여 면역이 된 숙주에서 면역 반응을 일으키도록, 독성이 약화되거나 비활성화될 수있다. 이는 만약 숙주가 상기 야생형 바이러스에 노출되었을 때효과적으로 면역 반응을 일으키도록 한다.

본 발명에 따르면, 상기 바이러스는 레오바이러스과에 속하는 임의의 바이러스일 수 있다. 바람직하게는 상기 바이러스는 로타바이러스(Rotavirus), 콜티바이러스(Coltivirus), 또는 오르비바이러스(Orbiviru) 속(genus)에 속한다. 더 바람직하게는, 상기 바이러스는 상기 오르비바이러스 속에 속한다. 더욱 바람직하게는, 상기 바이러스는 BTV, AHSV 또는 EHDV이다. 가장 바람직하게는, 상기 바이러스는 BTV이다.

많은 바이러스는 많은 수의 서로 다른 혈청형을 갖는다. 예를 들어, BTV는 24개의 서로 다른 혈청형을 갖는다. 서로 다른 혈청형들은 약간씩 다른 단백질들을 가질 수 있으며, 상기 서로 다른 게놈들에 함유된 많은 수의 유전자들에 있어서는 많이 다를 수 있다. 더욱이, 이후에는 아직 발견되지 않은 혈청형들이 개발될 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 카테고리에 정의된 한도, 예를 들어, BTV의 정의된 한도 내에 있는 것으로서 공지되거나 아직공지되지 않은 모든 가능한 바이러스의 혈청형들을 포함하도록 의도되었다.

상기 용어 "필수 유전자"는 상기 바이러스가 병원성이기 위한 필수적인 유전자를 의미한다. 상기 필수 유전자의 기능이 파괴되었을 때, 결과적인 백신용 바이러스 균주는 비병원성이다. 상기 필수 유전자의 기능은 상기 유전자로 돌연변이를 도입함으로써 파괴할 수 있다. 적어도 하나의 필수 유전자의 기능이 파괴되어야만 한다. 바람직하게는 적어도 하나 이상의 필수 유전자의 기능이 파괴된다. 이것은 상기 바이러스가 병원성 표현형으로 복귀할 수 없는 것을 확실히 하도록 돕는다. 바람직하게는, 상기 필수 유전자, 또는 각 필수 유전자에서의 돌연변이는 상기 필수 유전자 서열의 대부분에 영향을 주는 광범위한 돌연변이이다. 다시 한번, 이것은 상기 바이러스가 병원성 표현형으로 복귀할수 없도록 확실하게 돕는다. 상기 바이러스가 비병원성 표현형으로 변환되도록 만들 수 있는 임의의 필수 유전자에 있어서 상기 돌연변이가 있을 수 있다. 바람직하게는, 상기 돌연변이는 효소 단백질에 도입될 수 있으며, 예를 들어, 중합효소, 헬리카제(helicase) 또는 캡핑 효소(capping enzyme)에 도입될 수 있다. 선택적으로, 비구조단백질이 비활성화될 수 있다. 이것은 DIVA 전략(strategy)에 사용될 수 있다. 이것은 감염된 동물들과 백신을 맞은 동물들로 구별한다. 예를 들어, NS1으로 인코딩된 상기 유전자가 BTV 내에서 제거된 경우, 상기 백신용 균주는 상기 백신을 맞은 동물내에서 NS1을 발현시키지 않을 것이다. 따라서, 상기 백신을 맞은 동물에서는 NS1에 대한 항체 반응이 나타나지 않을 것이다. 이것이 상기 동물내에서 NS1이 발현되고 항체 반응이 일어나는 일반적인 감염과 다른 점이다. 감시하는 동안, NS1에 대한 항체가 검출된다는 것은 상기 동물이 백신 균주가 아니라 야생형 BTV에 감염되었다는 것을 나타낸다. 또한, 표지 항원(marker antigen)을 인코딩하는 유전자가 상기게놈에 도입될 수 있다. 이것은 상기 동물이 백신을 맞았다는 것을 나타내는 명백한 항원성 표지가 될 수 있다.

상기 돌연변이는 상기 유전자나 상기 각 유전자에 적절한 임의의 방식으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연 변이는 상기 바이러스의 게놈에 도입될 수 있다. 이 게놈으로부터 제조된 ssRNA 전사체(transcript)는 또한 상기 돌연변이를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 돌연 변이는 상기 ssRNA에 직접 도입될 수 있다. 이는, 예를 들어, ssRNA의 부분을, 상기 부분에 대응하면서 돌연변이를 포함하는 인공적으로 제조된 ssRNA로 치환시킴으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포를 형질전환하는 데 사용된 상기 ssRNA는 완전히 인공적으로 제조될 수 있다. 상기 완전히 인공적으로 제조된 ssRNA는 필수 유전자나 필수 유전자들에 있어서의 돌연변이와 함께 상기 전체 바이러스 게놈에 대응될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에 있어서, cDNA 클론은 상기 바이러스 게놈의 일부로 만들어질 수 있다. 선택적으로, cDNA 클론은 상기 전체 바이러스 게놈으로 만들어질 수 있다. 다음으로 돌연변이들은 예를 들어, 다양한 서로 다른 돌연변이들로서 cDNA의 라이브러리를 생성할 수 있도록, 상기 cDNA 클론에 도입될 수 있다. 이제, 이러한 cDNA 클론들로부터의 전사체는 세포를 형질전환하는 데에 사용된 상기 ssRNA로서 사용될 수 있다. 따라서, 상기 ssRNA의 일부분은 cDNA 클론으로부터 만들어질 수 있다. 선택적으로, 상기 세포를 형질전환하는 데 사용된 전체 ssRNA는 cDNA 클론으로부터 만들어질 수 있다.

상기 돌연변이는 상기 유전자의 기능을 파괴하는 데 적절한 임의의 돌연변이일 수 있다. 상기 돌연 변이는, 예를 들어, 비기능성 단백질이 상기 돌연변이된 유전자에 의해 생성되는 결손형 또는 삽입형 돌연변이일 수 있다. 바람직하게는 상기 바이러스에 대량 결손형 돌연변이가 도입될 수 있다.

ssRNA가 형질전환된 세포는 ssRNA가 형질전환되는 데 적당하고 바이러스 균주를 배양하는 데 적절한 임의의 세포일 수 있다. 상기 세포는 바이러스 증폭 허용세포이다. 바람직하게는, 상기 세포는 BHK 21 세포l, Vero 세포, 293T 세포, BSR 세포(특정 BHK 21 세포의 클론), HeLa 세포, C6/36 세포 (Aedes albopictus로부터 유도된 모기 세포주), 또는 KC 세포(자연 곤충 매개체 Culicoides sonorensis로부터 유도된 깔다구 세포주)이다. 더 바람직하게는, 상기 세포는BSR 세포이다.

상기 세포를 형질전환하는 데 사용된 상기 ssRNA는 상기 바이러스 게놈의 전사체이며, 또한 상기 돌연변이를 포함한다. 상기 전사체는 돌연변이를 포함하는 상기 바이러스의 dsRNA게놈으로부터 직접 얻을 수 있다. 선택적으로, 상기 전사체는 상기 바이러스 게놈으로부터 간접적으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 전사체는 상기 바이러스 게놈의 cDNA 클론으로부터 생성될 수 있으며, 상기 cDNA 클론은 돌연변이를 포함한다. 레오바이러스과 바이러스들, 예를 들어, BTV에 있어서, 바이러스 ssRNA는 바이러스 단백질 합성을 위한 mRNA로서, 그리고 새로운 게놈성 dsRNA의 합성을 위한 템플릿으로서 제공되는 바이러스 입자에 의해서 감염된 세포의 세포질 내에서 합성된다. 본 발명에 따른 상기 ssRNA는 이러한 기능을 나타내고, 이에 따라, 상기 ssRNA의 돌연변이는 상기 dsRNA 게놈을 합성하는 동안 상기 백신용 바이러스 균주에 병합된다.

상기 ssRNA는 원하는 상기 바이러스의 면역학적 관련 단백질을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스가 BTV일 때, 바람직하게는 상기 ssRNA는 관심있는 혈청형으로부터 VP2와 VP5를 인코딩한다. 몇몇 실시예들에 있어서, 상기 ssRNA는 많은 수의 서로 다른 바이러스 혈청형으로부터 면역학적으로 중요한 다양한 단백질들을 인코딩할 수 있다. 이러한 ssRNA는 많은 수의 서로 다른 바이러스 혈청형에 대항하여 백신을 접종하는데 사용된다.

바람직하게는, 상기 세포를 형질전환하는 데 사용된 상기 바이러스 ssRNA는 단독ssRNA(isolated ssRNA)일 수 있다. 이는 상기 ssRNA가 실질적으로 다른 바이러스 구성요소로부터, 예를 들어, 바이러스 입자들, 바이러스 dsRNA 및 바이러스 단백질로부터 자유롭다는 것을 의미한다.

상기 형질전환된 세포는 백신용 바이러스 균주를 제조하는 데 적합한 임의의 적절한 조건하에서 임의의 적절한 방식으로 배양될 수 있다. 세포를 배양하는 이러한 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.

상기 세포를 형질전환하는 단계는 바람직하게는 둘 또는 그 이상의 형질전환 단계를 포함하는 바, 여기서,

(1) 상기 바이러스 캡시드의 내층을 조립(assembly)하는 데 필요한 최소 구성요소를 인코딩하는 ssRNA를 이용하여 상기 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 제1 형질전환 단계 및

(2) 상기 바이러스 게놈의 전사체고 상기 돌연변이를 포함하며, 이에 따라 상기 바이러스를 조립하는 데에 필요한 모든 구성요소를 인코딩하는 ssRNA를 이용하여 상기 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 제2 형질전환 단계를 포함한다.

두 번의 형질 전환을 수행함으로써 생성된 바이러스의 레벨이 ~ 10배로 증가된다는 것이 확인되었다. 또한, 게놈을 패키지하기 위해 필요한 적어도 하나의 바이러스 구성 요소가 상기 제1 형질전환 단계에서 형질전환된 ssRNA에 의해 인코딩되지 않는다는 것을 명확히 함으로써, 생성된 바이러스의 레벨이 ~ 100폴드 이상으로 증가된 바, 이는 단지 단일 형질전환 단계만으로 얻어진 것이다. BTV로 수행할 때에는, 바이러스 구성요소 VP2, VP5, VP7 및 NS3 중 적어도 하나가 상기 제1 형질전환단계에서 형질전환된 ssRNA에 의해 인코딩되지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 제1 형질전환 단계 동안 바이러스 구성 요소 VP2, VP5, VP7 및NS3 모두가 빠지는 것이 바람직하다.

상기 제1 형질전환 단계와 상기 제2 형질전환 단계 사이에는 상기 바이러스 캡시드의 내층을 조립하는 데 시간이 충분하도록 시간 간격이 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 제1 및 상기제2 형질전환 단계 사이에 적어도 6시간, 더 바람직하게는 12시간, 가장 바람직하게는 18시간의 간격이 있는 것이 좋다.

상기 세포는 상기 필수바이러스 유전자의 기능을 보완한다. 이는 상기 세포이 상기 비활성 필수 유전자의 복제를 포함하도록 변형되었다는 것을 의미한다. 결과적으로, 상기 필수 유전자에 의해 생성된 상기 단백질은 상기 바이러스의 ssRNA로부터가 아니라 상기 세포로부터의 mRNA로부터 발현되며, 이에 따라, 상기 유전자의 기능은 상기 세포에 의해 보완된다. 이는 상기 바이러스를 복제하는 데 필요한 모든 필수 단백질이 상기 세포 내에 존재하도록 보장한다. 따라서, 상기 백신용 바이러스 균주는 상기 세포 내에서 자유롭게 복제할 수 있다. 그러나, 만약 상기 백신용 바이러스 균주가 세포를 보완하기 보다는 세포를 감염시키는 경우, 상기 필수 유전자의 단백질 산물이 존재하지 않게 되며 이에 따라 상기 백신용 바이러스 균주는 반복적으로 복제될 수 없을 것이다. 상기 백신용 바이러스 균주는 예를 들어, 백신이 접종된 숙주 내에서 단일 복제 사이클을 겪는다. 하나 이상의 필수 유전자의 기능이 파괴될 때, 상기 세포은 각 필수 바이러스 유전자의 기능을 보완한다.

바람직하게는, 백신용 바이러스 균주를 제조하는 방법은 상기 백신용 바이러스 균주를 상기 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. 이 단계는 임의의 적절한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 방법들은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 백신용 바이러스 균주들은 바이러스 플라크(plaque)로부터 분리될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 레오바이러스과에 속하는 바이러스 게놈으로부터 유도되어 분리된 바이러스 ssRNA를 제공하며, 여기서 상기 ssRNA는 필수 유전자의 기능을 파괴하는 돌연변이를 포함하며, 상기 바이러스 ssRNA는 세포를 형질전환하는 상기 방법에서 사용되는 데 적합하다.

본 발명은 또한 상술한 방법에 의해 제조된 백신용 바이러스 균주를 제공한다.

본 발명은 또한 레오바이러스과 바이러스의 필수 유전자를 발현하는 세포를 제공하며, 이는 본 발명에 따른 상기 ssRNA로부터 백신용 바이러스 균주를 복제하는 것을 가능하게 한다.

본 발명은 본 발명에 따른 ssRNA에 감염된, 본 발명에 따른 상기 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 치료용으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 백신용 바이러스 균주를 제공한다.

본 발명은 또한 치료용으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 분리된 바이러스 ssRNA를 제공한다.

본 발명은 또한 레오바이러스과 바이러스에 대항해서 동물에 백신접종에 사용하기 위한 본 발명에 따른 백신용 바이러스 균주를 제공한다.

본 발명은 또한 레오바이러스과 바이러스에 대항해서 동물에 백신접종에 사용하기 위한 본 발명에 따른 분리된 바이러스 ssRNA를 제공한다.

본 발명은 동물에게 본 발명에 따른 상기 백신용 바이러스 균주의 유효량을 전달하는 단계를 포함하는, 레오바이러스과 바이러스에 대항해서 동물 백신접종 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 동물에게 본 발명에 따른 상기 분리된 바이러스 ssRNA의 유효량을 전달하는 단계를 포함하는, 레오바이러스과 바이러스에 대항해서 동물 백신접종 방법을 제공한다.

레오바이러스과 바이러스들로부터 분리된 바이러스 ssRNA가 감염성이기 때문에, 상기 분리된 바이러스 ssRNA 자체는 동물 백신접종에 사용될 수 있다. 상기 ssRNA는 적절한 임의의 방식으로 동물의 세포나 세포들에 도입될 수 있으며, 상기 세포나 세포들에 의해 전사될 수 있다. 이에 따라 바이러스 단백질들이제조될 수 있으며 바이러스 입자들을 생성할 수 있을 것이다. 그러나, 상기 바이러스로부터의 ssRNA 내에 있는 필수 유전자의 기능은 파괴되기 때문에, 상기 바이러스 ssRNA는 기능성 바이러스 입자들을 완전하게 생성할 수는 없을 것이다. 결과적으로, 상기 바이러스는 돌연변이 된 상기 필수 유전자의 종류에 따라, 한번의 복제 사이클을 완성할 수 있을 것이다.

백신접종이 있을 때, 상기 백신이 접종되는 동물은 상기 레오바이러스과 바이러스의 종류와 그것이 감염시키는 특정 동물들에 따라 달라질 수 있다. 상기 바이러스가 AHSV일 때, 상기 동물은 말, 노새, 당나귀 또는 얼룩말 중에서 선택된다. 상기 바이러스가 EHDV일 때, 상기 동물은 사슴, 소, 또는 양 중에서 선택된다. 상기 바이러스가 BTV일 때, 상기 동물은 소, 양, 염소, 버팔로, 사슴, 단봉낙타 및 영양 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용된 운반체(carrier), 항원보강제(adjuvant) 또는 매개체(vehicle)와 조합된 본 발명에 따른 상기 백신용 바이러스 균주를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용된 운반체(carrier), 항원보강제(adjuvant) 또는 매개체(vehicle)와 조합된 본 발명에 따른 상기 분리된 바이러스 ssRNA 를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

약학적으로 허용된 운반체, 항원보강제, 및 매개체는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 약학적으로 허용된 운반체, 항원보강제, 및 매개체는 이온교환제들(ion exchangers), 알루미나, 알루미늄 스테아레이트 (aluminum stearate), 레시틴(lecithin), 인간 혈청 알부민(human serum albumin)과 같은, 혈청 단백질들(serum proteins), 포스페이트와 같은 완충 물질들, 글리신(glycine), 소르브산(sorbic acid), 포타슘 소르베이트(potassium sorbate), 포화 식물산 글리세라이드 혼합물(glyceride mixtures of saturated vegetable fatty actids)의 일부, 물, 프로타민 설페이트(protamine sulfate)와같은, 염 및 전해질, 디소듐 히드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 포타슘 히드로겐 포스페이트(potassium hydrogen phosphate), 소듐 클로라이드, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 세포룰로스계 물질들, 소듐 카르복시메틸세포룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방(wool fat)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 백신용 바이러스 균주, 분리된 바이러스 ssRNA 또는 약학적 조성물은 경구 복용이나, 비경구 복용, 또는 흡입하는 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 백신용 바이러스 균주, 분리된 바이러스 ssRNA 또는 약학적 조성물은 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 백신용 바이러스 균주, 분리된 바이러스 ssRNA 또는 약학적 조성물은 기존의 임의의 비독성의 약학적으로 허용된 운반체, 항원보강제 또는 운반체와 함께 제형될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 비경구(parental)는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 윤활막내(intrasynovial), 복장내(intrasternal), 수막공간내(intrathecal), 병변내(intralesional), 두개내(intracranial) 주사 또는 주입기술을 포함할 수 있다.

상기 백신용 바이러스 균주, 분리된 바이러스 ssRNA 또는 약학적 조성물은 주사 가능한 조제물의 형태일 수 있는 바, 예를 들어, 주사 가능한 수용액이나 유질 현탁액일 수 있다. 상기 현탁액은 (예를 들어 Tween 80과 같은)적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁용제를 이용한 공지의 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 주사가능한 조제물은 또한 비독성 비경구로 허용가능한 희석제나 용매에 있어서의, 예를 들어, 1,3-부탄디올에 있어서의 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 채용될 수 있는 허용가능한 운반체 및 용액들 중 만니톨, 물, 링거액, 등장성(isotonic) 소듐 클로라이드 용액이 채용될 수 있다. 이에 더해, 무균의, 고정유(fixed oil)는 일반적으로 용매나 현택 매질로 채용된다. 이를 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 임의의 무자극성 고정유가 채용될 수 있다. 올레산과 그것의 글리세라이드 유도체들과 같은, 지방산은 주사 가능한 것들을 제조하는 데 유용하며, 올리브유나 피마자 유, 특히 이들의 폴리옥시에틸레이트된 버전들의 경와 같은, 약학적으로 허용 가능한 자연산 오일들도 유용하다. 이러한 오일 용액들이나 현탁액들은 또한 긴 사슬 알코올 희석제나 분산제, 또는 Pharmacopoea Helvetica에 개시된 이와 유사한 알코올을 함유할 수 있다.

상기 백신용 바이러스 균주들, 분리된 바이러스 ssRNA 또는 약학적 조성물은 캡슐, 타블렛, 및 액상 현탁액 및 용액들을 포함하는 경구 투여 가능한 임의의 투여형(dosage form)으로 경구투여될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 경구용 타블렛의 경우, 일반적으로 사용되는 운반체들로는 락토스와 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제로는 마그네슘 스테아레이트와 같은 것이있으며, 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여하기 위한 유용한 희석제는 락토스와 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수용 현탁액로 경구 투여될 때, 상기 활성 성분은 에멀전화제 및 현탁액제와 결합된다. 만약 필요하다면, 임의의 당화제 및/또는 기호제 및/또는 착색제가 추가될 수 있다.

동물에 전달되는 상기 백신용 바이러스 균주의 양은 표준 기법을 이용하여 결정될 수 있으나, 일반적으로 상기 전달되는 양은 10,000 내지 1,000,000,000 감염유발량단위/ml의 범위 내에 있어야 한다.

본 발명은 또한 상기한 방법에 의한 상기 분리 ssRNA와 상기 ssRNA 내에서 돌연변이된 필수 유전자를 보완하는 세포를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 레오바이러스과에 속하는 바이러스의 필수 유전자를 확인하는 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은:

상기 레오바이러스과 바이러스에 돌연변이를 도입시켜 유전자의 기능이 파괴되도록 하는 단계;

바이러스 게놈으로부터 유도되고 상기 돌연변이를 포함하는 바이러스 ssRNA로 세포를 형질변환하는 단계; 및

상기 형질변환된 세포를 적절한 조건하에서 배양하는 단계를 포함하고,

상기 형질변환된 세포를 배양한 후에 생성된 상기 바이러스가 병원성일 경우 상기 바이러스 유전자는 필수 유전자가 아닌 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 레오바이러스과에 속하는 바이러스의 변형된 바이러스 균주를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:

상기 레오바이러스과 바이러스에 변형부(modification)를 도입하는 단계;

상기 바이러스 게놈으로부터 유도되고 상기 변형부를 포함하는 바이러스 ssRNA로 세포를 형질변환하는 단계; 및

상기 변형된 바이러스 균주를 생산하기 위해 상기 형질 전환된 세포를 적절한 조건하에서 배양하는 단계를 포함하며,

상기 세포은 상기 변형된 바이러스 균주를 상기 세포에 치환시키는 것을 특징으로 한다.

변형된 바이러스 균주를 제조하는 방법은 상기 백신용 바이러스 균주를 제조하는 방법에 관련에서 정의되었다. 그러나, 상기 바이러스 균주는 다른 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스 균주는 하나 이상의 유전자를 상기 게놈에 가하고 하나 이상의 유전자를 상기 게놈으로부터 없애고, 상기 게놈 내의 제어 서열을 변화시키는 등의 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 이에 더해, 필수 유전자의 기능이 파괴되지 않은 경우에는, 적절한 임의의 세포가 상기 변형된 바이러스의 생산에 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 상기 세포를 형질변환하는 단계는 2회 또는 그이상의 형질변환 단계들을 포함하는 바:

(1) 상기 바이러스의 캡시드의 내층을 조립하는 데 필요한 최소 구성요소를 인코딩하는 ssRNA를 이용하여 상기 세포를 형질전환하는 것을 포함하는 제1 형질변환 단계; 및

(2) 상기 바이러스 게놈의 전사체며 또한 상기 변형부을 포함하여, 이에 따라 상기 바이러스를 조립하는데 필요한 모든 구성요소를 인코딩하는 ssRNA를 이용하여 상기 세포를 형질변환하는 것을 포함하는 제2 형질 변환 단계를 포함한다.

상기 정의된 바와 같이 상기 두 번의 형질변환 단계를 수행하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 상기 변형된 바이러스 균주를 제조하는 방법은 상기 바이러스 균주를 상기 세포로부터 분리하는 것을포함한다.

본 발명은 또한 레오바이러스과에 속하는 바이러스로부터 유도되며 변형부를 포함하는 분리된 바이러스 ssRNA를 제공하는 바, 상기 바이러스 ssRNA는 상술한 세포의 형질변환 방법에 적절하다.

본 발명은 또한 상술한 방법에 의해 제조된 변형된 바이러스 균주를 제공한다.

본 발명은 또한 치료용으로 사용되는 본 발명에 따른 변형된 바이러스 균주를 제공한다.

본 발명은 또한 치료용으로 사용되는 본 발명에 따른 변형된 바이러스 ssRNA를 제공한다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 운반체, 항원보강제 또는 매개체와 결합한 본 발명에 따른 상기 변형된 바이러스 균주를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 운반체, 항원보강제 또는 매개체와 결합한 본 발명에 따른 상기 변형된 바이러스 ssRNA를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명인 레오바이러스과에 속하는 바이러스의 변형된 바이러스 균주를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 이하에서 도면을 참조하여 예를 드는 방식으로 상세히 설명된다.
도 1은 BTV의 두 개 혈청형으로부터 코어 유도된 전사체들로 동시-형질전환(co-transfection)한 BSR 세포들로부터 회복된 재조합 자손 게놈을 도시한 것이다. 게놈 dsRNA는 9 %의 비변성(non-denaturing) 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작(run)한다. (A). 동시 전사된 BTV-1 및 BTV-9 전사체로 BSR 세포들을 동시-형질전환함으로써 유도된 구조(rescue)된 BTV로부터의 DsRNA이다. 레인(lane) 1-3은, 양 부모 전사체 제조물들로부터의 게놈 단편(segment)들을 포함하는 플라크 정제된 바이러스들이다. 화살표들은 최소 개수의 단편들에 기여한 부모로부터의 단편들을 나타낸다. BTV-1 dsRNA및 BTV-9 dsRNA 표지 레인들을 표시되었다. (B). 제조 후 혼합된 BTV-1 및 BTV-9 전사체들로 BSR 세포들을 동시-형질전환함으로써 유도된 구조된 BTV로부터의 DsRNA이다. 레인 1-2는, 양 부모의 전사체 제조물들로부터의 게놈 단편들을 포함하는 플라크 정제된 바이러스들이다. 화살표들은 최소 개수의 단편들에 기여한 부모로부터의 단편들을 나타내었다.BTV-1 dsRNA 및 BRV-9 dsRNA 표지 레인들을 지시하였다.
도 2는 T7 BTV (플라스미드 클론)들을 개략적으로 나타낸 도면이다. T7 플라스미드들은 전사동안 T7 (프로모터) 및 BTV 3'의 말단 서열을 정의하는 BsmBI, BsaI 또는 BpiI 제한 효소 부위에 인접한 전장(full length) BTV 게놈 단편을 포함한다. 상기 BTV 게놈 단편의 5' 및 3' 말단에서의 서열들 및 인접한 서열들 T7 프로모터(이탤릭체), 보존된 BTV 게놈 단편 5' 및 3' 말단 서열들(볼드체), 및 BsmBI 부위(밑줄)이 도시되었다.
도 3은 플라스미드 유도된 BTV-10 단편 10을 포함하는 재조합 자손 게놈들을 보여준다. (A). 9 %의 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작하고, BTV-10 단편T7 전사체 및 코어-유도된 BTV-1 전사체들로 BSR 세포들을 동시-형질전환함으로써 회복된 BTV로부터 추출된 게놈 dsRNA이다. 레인들1-5는 회복된 플라크들로부터 유도된 바이러스 RsRNA이다. 레인들1, 2, 및 5는, 재조합물들이며, 더 빠르게 이동하는 BTV-10 단편10 게놈 단편을 지시하는 화살표들을 표시하였다. 레인들 3 및 4는, 야생형 BTV-1이다. BTV-1 DsRNA 및 BTV-10 DsRNA 표지 레인들도 표시되었다. (B-D). 단편 10 RT-PCR 산물들의 서열 전기영동도들이 표시되었다. 전체 바이러스 dsRNA로부터의 단편 10 표적 서열들은 BTV10_S10_259F 및 BTV10_S10_611R 프라이머들을 이용하여 RT-PCR에 의해 증폭된다. 증폭된 표적들은 BTV10_S10_259F를 이용하여 서열 분석된다. (B). BTV-10이다. (C). 도입된 BTV-10 단편을 포함하는 BTV-1에 관한 것이다. (D). BTV-1이다.
도 4는 도입된 표지 돌연변이(Introduced Marker Mutation)를 가지는 플라스미드 유도된BTV 단편 10을 포함하는 재조합 자손 게놈들을 나타낸다. (A). 9 %의 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작하는 도입된 HaeII 부위를 가진BTV-10 단편 10을 포함하는 플라크들로부터의 게놈 dsRNA이다. 레인들 1-3은, 더 빠르게 이동하는 BTV-10 단편 10을 포함하는 3개의 플라크 재조합들로부터의 바이러스 RsRNA이다. BTV-1 dsRNA 및 BTV-10 dsRNA 마커 레인들도 나타내었다. (B). 단편 10 RT-PCR 산물들의 HaeII 분해를 나타내었다. HaeII-분해된 RT-PCR 산물들은 단편 10 프라이머들 BTV10_S10_259F 및 BTV10_S10_611R을 사용하여 게놈dsRNA로부터 증폭되었으며, 2% 아가로스 겔 상에서 분리되었다. U는 분해되지 않은 RT-PCR 산물, D는 HaeII 분해된 RT-PCR 산물이다. 레인들 1은, 템플릿이 없는 경우, 레인들 2는, BTV-10이고, 레인들 3은, 도입된 BTV-10 단편 10을 가진 재조합물, 레인들 4는, 도입된 HaeII 부위 포함 BTV-10 단편 10을 가진 재조합물, 레인들5는, BTV-1이다. M은 bp에서 나타낸 크기를 갖는, StyI-분해 파지 λ DNA 표지들이다. RT-PCR 산물의 크기및 분해 단편들은 bp에서 왼쪽에 도시하였다. (C 및 D). 단편10 RT-PCR 산물들의 서열 전기영동도들이 표시되었다. 전체 바이러스 dsRNA로부터 단편 10 표적 서열들은 BTV10_S10_238F 및 BTV10_S10_654R 프라이머들을 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 표적들은 BTV10_S10_238F을 사용하여 서열 분석되었다. (C). 도입된 BTV-10 단편 10을 가진 재조합이다. (D). 도입된 HaeII 부위 포함 BTV-10 단편 10을 가진 재조합이다. 화살표는 도입된 점돌연변이를 나타낸다.
도 5는 플라스미드 도입된 BTV-10 단편 2 및 5를 포함하는 이중 재조합 자손 게놈들을 보여준다. (A). BTV-10 단편 5 T7 전사체, BTV-10 단편 2 T7 전사체, 및 코어 유도된 BTV-1 전사체들로 BSR 세포를 동시-형질전환시킴으로써 회복된 BTV로부터의 게놈 게놈 dsRNA이다. 9 %의 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작하는 자손 플라크들로부터의 게놈 dsRNA이다. 레인들 1-3은, 3개의 정제된 재조합물들로부터의 바이러스 dsRNA이다. 화살표들은 더 느리게 이동하는 BTV-10 단편 2 및 단편 5를 지시한다. BTV-1 dsRNA 및 BTV-10 dsRNA 표지 레인들이 지시되었다. (B 및 C). 단편 2 및 단편 5 RT-PCR 산물들의 제한 분해 분석이다. 단편 2 및 5로부터 표적 구역들이 게놈 dsRNA로부터 RT-PCR증폭되었고, BTV-10 단편에 대해 특이적인 제한 효소들을 가지고 분해되었으며, 1.5% 아가로스 겔 상에서 분리되었다. (B). 단편 2 RT-PCR 산물들의 SacI 분해이다. SacI는 혈청형 10의 단편 2에 대해 특이성을 가지며, 표적 서열에서 두 부위를 가진다. RT-PCR 산물들은 BTV10_L2_727F 및 BTV10_L2_1523R 단편 2 프라이머들을 이용하여 게놈 dsRNA로부터 증폭된다. U는 분해되지 않은 RT-PCR 산물, D는 SacI 분해된 RT-PCR 산물이다. 서로 다른 혈청형들 사이의 상기 단편의 낮은 상동성으로 인해, 프라이머 쌍이 BTV-1 단편 2를 증폭시키지 않는다는 것을 유의해야 한다. 레인들 1은, BTV-1이고, 레인들 2는, BTV-10이고, 레인들 3은, BTV-10 단편2 및 5가 도입된 재조합물이다. bp에서 StyI-분해된 파지 λ DNA 표지 크기들을 왼쪽에 도시하였다. RT-PCR 산물의 크기 및 분해 단편들을 bp에서 오른쪽에 도시하였다. (C). 단편 5 RT-PCR 산물들의 DraI 분해이다. DraI은 혈청형 10의 단편 5에게 특이성을 가지며, 표적 서열에 존재하는 두 부위를 가진다. RT-PCR 산물들은 단편 5 프라이머들 BTV10_M5_724F 및 BTV10_M5_1590R을 사용한 게놈 dsRNA으로부터 증폭되었다. U는 분해되지 않은 RT-PCR 산물, D는 DraI 분해된 RT-PCR 산물이다. RT-PCR 반응들에서 템플릿들은 패널 B에 도시된 바와 같다. RT-PCR 산물의 크기 및 분해 단편들은 bp에서 오른쪽에 도시하였다.
도 6은 BTV-1 게놈 단편들의 T7 전사체들을 보여준다. 제한 엔도뉴클레아제 분해된 클론들로부터 생성된 변성 1% 아가로스 겔 전기영동의 BTV-1 T7 전사체들이다. M은 도시된 nt에서 크기를 갖는 1μg ssRNA 표지들 (Promega)이다. (A). 레인 1 단편 1이고, 레인 2 단편 3이고, 레인 3 단편 5이고, 레인 4 단편 7이고, 레인 5 단편 9이다. (B). 레인 1- 단편 2이고, 레인 2 - 단편 4이고, 레인 3 단편 6이고, 레인 4 단편 8이고, 레인 5 단편 10이다.
도 7은 열 개의 T7 전사체들로 형질전환을 시켰을 때 감염 BTV의 회복을 보여준다. (A). 아가로스로 씌워진 형질전환된 BSR 단층이다. 오목부 1는, 4μg BTV-1 T7 전사체들로 형질전환된 BSR다. 오목부2, 형질전환되지 않은 BSR이다. 단층은 고정되었고, 형질전환 후 5일째에 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. (B). 9% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작하는 게놈 dsRNA로서, 패널 A에서 기술된 바대로BSR 단층의 형질전환으로부터 회복된 BTV로부터 추출된 것이다. 레인 1은, BTV-1 보존 바이러스, 레인들 2 및 3은, T7 전사체들로 형질전환하여 유도된 분리 플라크들로부터의 BTV-1이다.
도 8은 열 개의 T7 전사체들을 사용한 표지 돌연변이를 포함하는 감염 BTV의 회수를 보여준다. (A). 아가로스로 씌어진 형질전환된 BSR 단층이다. 오목부 1은, 도입된 BglII 부위를 가진 단편 8 전사체를 포함하는 3μg BTV-1 T7 전사체들로 형질전환된 BSR 단층이다. 오목부 2는, 형질전환되지 않은 BSR이다. 단층은 고정되었으며, 형질전환 후 5일째에 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. (B). 9% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작하는 게놈 dsRNA로서, 패널 A에서 기술된 바대로 BSR 단층의 형질전환으로부터 회복된 BTV로부터 추출된 것이다. 레인 1은, BTV-1 보존 바이러스, 레인들 2 및 3은, T7 전사체들을 가진 형질전환으로부터 유도된 분리 플라크들로부터의 BTV-1이다.
도 9는 열 개의 7 전사체들로부터 생성된 BTV-1에서 도입된 표지 돌연변이의 검출을 보여준다. (A). 단편8 RT-PCR 산물들의 BglII 분해이다. NS2_Bam_T7_F 및NS2_Bam_R 단편 8 프라이머들을 이용하여 게놈 dsRNA로부터 증폭된 BglII 분해된 RT-PCR 산물들로서, 1% 아가로스 겔 상에서 분리되었다. U는 분해되지 않은 RT-PCR 산물, D는 BglII 분해된 RT-PCR 산물이다. 레인들1은, 야생형 BTV-1, 레인들 2-6은, 단편 8 BglII 돌연변이 전사체를 포함하는 형질전환으로부터 유도된 5개의 분리된 플라크들, 레인들7은, 템플릿이 없는 경우이다. bp에서 StyI 분해된 파지 λ DNA 표지의 크기들은 왼쪽에 도시하였다. RT-PCR 산물의 크기 및 분해 단편들은 bp에서 오른쪽에 도시하였다. (B). 단편 8 BglII 돌연변이 전사체를 포함한 형질전환으로부터 단편 8 RT-PCR 산물의 서열 전기영동도이다. 전체 바이러스 dsRNA로부터 단편 8 표적 서열은 패널 A에서 기술된 프라이머들을 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 증폭된 표적은 BTV1_S8_627R을 사용하여 서열 분석되었다. 화살표들은 도입된 점돌연변이들을 지시한다.
도 10은 BTV1 델타 VP6의 생성에서 사용된 pBTV1 S9델타 클론을 보여준다. (A) pBTV1 S9델타 클론에서 유지된 게놈 단편 9의 뉴클레오티드 좌표이다. (B) pBTV1 S9델타는T7 프로모터에 인접한 변형된BTV 게놈 단편 9와 전사 동안 BTV 3' 말단 서열을 정의하는 BsmBI 제한 효소 부위를 포함한다. (C) BTV 게놈 단편의 3' 및 5' 말단에서의 서열들 및 인접한 서열들이 도시되었다: T7 프로모터(이탤릭체), 보존된 BTV 게놈 단편 5' 및 3' 말단 서열들(볼드체); 및 BsmBI 부위(밑줄).
도 11은 BTV1 델타 VP6이 보완 BSR VP6 세포주에서 CPE를 생산하는 것을 보여준다. 단층들은 0.1 MOI에서 감염되었고, 그 모양은 위상 콘트라스트 현미경 검사(phase contrast μscopy)를 이용하여 감염 후 48시간 동안 기록되었다. (A) BTV1 델타 VP6로 감염된 BSR VP6 세포들이다. (B) 야생형 BTV-1으로 감염된 야생형 BSR 세포들이다. (C) (모크(Mock))감염된 BSR 세포들이다.
도 12는 BTV1 델타 VP6이 보완 BSR VP6 세포주에서 플라크들을 생산하는 것을 보여준다. 바이러스주의 10배 희석액이 오목부 1부터 오목부 6까지 융합성 세포 단층들을 감염시키기 위해사용되었다. 감염된 단층들이 고형 배지로 씌워졌으며, 72 시간 후 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. (A) BTV1 델타 VP6로 감염된 BSR VP6 세포들이다. (B) 야생형 BTV-1으로 감염된 야생형 BSR 세포들이다.
도 13은 BTV1 델타 VP6가 더 작은 게놈 단편에 의해 대체된 게놈 단편 9를 가지는 것을 보여준다. (A) 9% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작하는 게놈 dsRNA이다. 화살표는 BTV1 델타 VP6에 존재하는 새로운 게놈 단편을 지시한다. 게놈 단편 수들은 오른쪽에 나타내었다. (B) EcoT7_S9_F 및 EcoBsmB_S9_R 프라이머들을 사용하여 지시된 소스들로부터 유도된 게놈 dsRNA부터 생성된 RT-PCR 산물들로서, 1% 아가로스 겔 상에 용해되었다. DNA 표지들의 크기는 염기 쌍들로 도시되었다.
도 14는 BTV1 델타 VP6이 감염된 BSR 또는 C6/36 세포들에서 감염 자손을 생산하지 않는 것을 보여준다. 감염 자손을 생산하는 것은 보완 BSR VP6 세포주 상에서 플라크 분석에 의해 72 시간 이상 간격으로 측정되었다. BSR 세포들에서의 BTV1 델타 VP6 및 야생형 BTV-1의 그래프는 (A), 또는 C6/36 세포들에서의 그래프는 (B)이다.
도 15는 BTV1 델타 VP6이 비보완 BSR 세포들에서 바이러스 단백질을 발현하는 것을 보여준다. BSR 세포들은 3 MOI에서 감염되었고, 감염 후 도시된 수 시간에서 수확되었다. NS2 발현은 SDS PAGE에의해 검출되었으며, NS2 특이적 항원으로 면역블로팅(immunoblotting)하였다. (A) BTV1 델타 VP6으로 감염된 BSR이고 (B) 야생형 BTV-1로 감염된 BSR이다. 염색 전 단백질 분자량 표지들의 크기들이 kDa로 도시되었다.
도 16은 BTV1 S10GFP가 S10 단편을 대체하는 더 큰 게놈 단편을 가진 것을 보여준다. (A) 11% 비변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 동작하는 게놈 dsRNA이다. 화살표는 BTV1 S10GFP에 존재하는 새로운 게놈 단편을 도시한다. 게놈 단편 수들은 오른쪽에 도시하였다. (B) 도시된 소스들로부터 유도된 게놈 dsRNA부터 생성된 RT-PCR 산물들로서, 1% 아가로스 겔 상에서 용해되었다. DNA 표지들의 크기는 염기 쌍들로 도시하였다.
도 17은 BTV 게놈으로부터 표지 항원의 발현을 보여준다. C6/36 은BTV1 S10GFP로 감염되었거나 (A 및 B), 또는 모크 감염되었다 (C and D). 감염 후 5일째에 세포들은 4% w/v 파라포름알데하이드에 고정되었고, 그들의 모양은 위상 콘트라스트 (A 및 C), 또는 UV 광(B 및 D) 하에서 기록되었다.
도 18은 이중형질전환이 코어 유도된 전사체들로부터의 바이러스의 회복을 증가시키는 것을 보여준다. 융합성 BSR 세포 단층들은 BTV 코어로부터 합성된 200ng 바이러스 ssRNA로 1회 형질전환되거나(오목부 1) 또는 2회 형질전환(오목부 2)되었다. 오목부들은 본 명세서에 기술된 바대로 아가로스로 씌워졌다.
도 19는 이중형질전환이 플라스미드 유도된 전사체들로부터의 바이러스의 회복을 증가시키는것을 보여준다. 융합성 BSR 세포 단층은 2μg 플라스미드 유도된 T7 전사체들로 1회 형질전환되거나 (오목부 1) 또는 2회 형질전환(오목부 2)되었다. 오목부들은 본 명세서 기술된 바대로 아가로스로 씌워졌다.
도 20은 제1 형질전환으로부터의 게놈 단편들 2, 5, 7 및 10의 탈락이 플라스미드 유도된 전사체들로부터 바이러스의 회복을 증가시키는 것을 보여준다. 융합성 BSR 세포 단층들은, 제1 형질전환에서, 열 개의 7 전사체들의 완전 보완체(complete complement)로 형질전환되거나 (오목부 1), 또는 단편 2, 5, 7 및 10이 부족한 T7 전사체들의 세트로 형질전환 (오목부 2)되었다. 두 오목부들은 제2 형질전환에서 열 개의 T7 전사체들의 완전 보완체로 형질전환되었다. 100ng의 각 T7 전사체가 두 형질전환에 사용되었다

실시예들

백신 설계를 위한 새로운 접근법으로서 본 발명자들에 의해 개발된 새로운 역 유전학(reverse genetics)이 이용된다. 그것은 블루텅 바이러스 전사체들이 형질전환 [1]에 의해 감염성이라는 발견에 기초한 것으로, 복제된 버전의 바이러스 유전자들로 표적 단편(segment)들의 대체하는 것을 기반으로 한다. 상기 방법은 복제된 유전자들로부터 유도된 BTV 단편들의 (박테리오파지) T7 시험관내(in vitro) 전사체들과 혼합된 BTV 전사체들로 바이러스 허용 세포들을 형질전환하는 새로운 접근법을 사용한다. 대체 게놈 단편들을 포함하는 바이러스는 바이러스 플라크들을 스크리닝함으로써 분리된다. 이 역전사 유전학의 새로운 방법은 레오바이러스과에 사용된 기존의 역 유전학 기술과 다른 바 : 1) Roner et al. [3]의 보조 바이러스-의존 방법은 포유류의 오르토레오바이러스에 성공적으로 적용되었다. 바이러스 전사체들 및 바이러스 dsRNA는 T7 시험관내(in vitro) 전사체들과 혼합되고, 보조 바이러스 감염을 사용하여 구해진다. 2) Komoto et al. [2]의 보조 바이러스-의존 방법은 로타바이러스의 캡시드 단백질을 변경하기 위해 사용하였다. 상기 T7 전사체는 우두 T7 RNA 중합효소 시스템을 사용하여 세포에서 생성되고, 보조 바이러스 균주를 사용하여 회복된다 그리고 3) Kobayashi et al. [4]의 플라스미드를 이용한 방법은 포유류의 오르토레오바이러스 유전자들에 돌연변이를 만들기 위해 사용하였다. 모든 상기 바이러스 게놈 단편들은 우두 T7 RNA 중합효소 시스템을 사용하여 세포에서 생성된다.

보편적인 환경의 다른 바이러스 단백질들을이용하여 관심사인 혈청형으로부터 면역 관련 BTV 단백질들(VP2 및 VP5)을 함유한 백신 균주들을 생산하기 위해서 역 유전학을 이용한 새로운 접근법이 사용된다. 이것은, 역 유전학에 의해, 광범위한 돌연변이를 통해 하나 이상의 필수 바이러스 유전자들을 비활성화시키는 것과 결부되며, 보완 세포주(complementing cell line)에 의해 제공된다. 생산된 바이러스는 단지 보완 세포주 내에서만 성장될 수 있고, 백신 접종된 동물의 세포들과 같은, 다른 세포들 내에서는 일회 복제만 가능하다. 역전사 유전학에 의한 하나 이상의 BTV 효소 단백질(중합효소, 헬리카제 및 캡핑 단백질)이나 또는 양자택일적으로 BTV 비구조적 바이러스 단백질을 표적(target)으로 하는 것은 감시 목적을 위해 DIVA 전략을 이용할 수 있게 한다. 상기 새로운 접근법은 또한 독성이 부족하게 약화되는 문제를 제거하고, 새 균주들의 독성 약화와 관련하여, 백신 균주 생산에 대해 새로운 혈청형을 식별하는 데 지연되는 시간을 줄인다. 병원성으로의 복귀 가능성은 표적 바이러스 유전자들에 광범위한 돌연변이들을 사용함으로써 크게 감소된다. 감염성 바이러스를 생산하는 야생형 바이러스들로의 재분류 가능성은 또한 백신이 접종된 동물에서는 백신 균주가 단지 일회의 복제 주기를 겪는다는 사실에 의해 크게 감소된다. 상기 새로운 접근법은 또한 비활성화된 백신들과 관련된 백신 배치들의 비활성화 여부를 확인할 필요를 제거한다.

본 기술은 BTV를 위한 DISC(disabled infectious single cycle) 백신을 생산하기 위해 이용되었으며, 여기서 필수 유전자(V6)가 역 유전학 시스템을 통해 조작되었고, 대량 결손을 통해 그것의 기능이 파괴되었다. 상기 V6 결손 돌연변이 (BTV1 델타 VP6)는 인 트랜스(in trans) V6 단백질을 공급하는 보완세포주와 결합한 역 유전학 기술을 사용하여 회복되었다. BTV1 델타 VP6의 성장 특성을 의 특성화 하는 것은 BTV DISC 백신용 필연적인 특성들 즉, i)비보완 포유류 세포들(non-complementing mammalian cells)에서의 바이러스 단백질의 발현 ii)비보완 포유류 또는 곤충 세포주들에서 생성된 검출 가능한 감염 바이러스가 없음 및 iii)보완 VP6 세포주에서 로버스트 복제를 갖는 것을 보여준다. 게다가, 외래 단백질/펩타이트 바이러스 발현을 만드는 능력은 NS3 유전자의 중심에 삽입된eGFP(enhanced green fluorescent protein)을 갖는 BTV와 결합한 NS3 보완 세포주를 사용하여 입증되었다. 이것은 감염된 동물로부터 백신 접종된 동물들을 구분(즉, DIVA(distinguishing infected and vaccinated animals) 개념)하도록 백신 접종된 동물들에 감지가능한 면역학적 표지를 함유한 백신 균주를 생산할 수 있게 한다.

물질 및 방법들

세포주들 및 바이러스.

BSR 세포들 BHK-21의 클론은 35℃, 5% CO2 하에서 5% v/v FBS(foetal bovine serum)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양되었다.

BTV 주(BTV stock)들은 0.1의 MOI (multiplicity of infection)에서 BSR 세포들을 감염시키고, 감염 후 3-4일에 배지를 수확하여 생산하였다. 바이러스 주들은 4℃에서 저장되었다.

BTV 코어들의 정제.

BSR 배양은 0.02-0.1 MOI에서 BTV로 감염되었다. 전사적으로 활성 BTV-1 코어들은 상술한 바와 같이 정제되었고, 4℃에서 저장되었다[1].

*시험관내 (In Vitro) BTV mRNA 의 합성 및 정제.

BTV 코어들은 BTV 코어 전사 완충액 (pH8.0의 100mM의 트리스 HCl, 4mM의 ATP, 2mM의 GTP, 2mM의 CTP, 2mM의 UTP, 500μM의 S-아데노실메티오닌, 6mM의 DTT, 9mM의 MgCl₂, 0.5U/μl의 RNasin? Plus [Promega]) 내에서 30℃에서 5-6시간 동안 40μg/ml에 배양되었다.

BTV 코어 유도된 mRNA들은 상술한 방법을 사용하여 정제되었고, -80℃에서 저장되었다 [1].

BTV -1 게놈 단편들의 RT- PCR 증폭.

각 BTV-1 게놈 단편의 CDNA 복제들은 FLAC 방법을 사용하는 서열 비의존성 방법(sequence independent manner)으로 바이러스 dsRNA로부터 증폭되었다[18]. 간단히 말해, 헤어핀 고정 프라이머(hairpin anchor primer)는 기술된 바대로 바이러스 dsRNA에 결찰되었고, 10U/μl, 55℃에서 1시간 동안 SuperScript™ III (Invitrogen)으로 겔 정제된 게놈 단편들로부터 cDNA 합성이 이어졌다. PCR 증폭은 KOD 핫 스타트 DNA 중합효소 (Novagen)와 함께 5' 포스포릴화된 FLAC 2 프라이머 (5'GAGTTAATTAAGCGGCCGCAGTTTAGAATCCTCAGAGGTC3')를 사용하여 수행되었다. PacI 및 NotI 부위들은 볼드체로 나타내었다.

BTV 전사체 합성을 위해 사용된 T7 플라스미드 클론들.

*CDNA 플라스미드 클론들은 BTV-10 게놈 단편 10 (pNS3BsmBI), 단편 5 (pVP5BsmBI), 및 단편 2 (pVP2BsmBI), 그리고 상기 BTV-1 게놈의 열 개의 모든 단편들용으로 구성되었다. 도입된 HaeII 부위 (pNS3Hae)를 포함하는 BTV-10 단편 10 클론의 돌연변이 버전과 도입된 BglII 부위 (pBTV1S8Bgl)를 포함하는 BTV-1 단편 8 클론의돌연변이 버전이 또한 구성되었다. 각 플라스미드 클론에서의 기능적인 카세트는 상기 BTV 게놈 단편은 이러한 구성요소들 사이에 위치하며, T7 프로모터와 BsmBI, BsaI, 또는 BpiI 부위를 포함하였다. 각 클론에서의 BTV 게놈 단편은 BTV 게놈 단편에 대응되는 mRNA 가닥과 같이 정확히 동일한 서열을 갖도록 BsmBI, BsaI, 또는 BpiI 로 분해된 플라스미드로부터 유도된 T7 전사체가 예측되게 하기 위해 상기 다른 서열 구성요소들에 비례하여 위치되었다 (도 2).

cDNA 플라스미드 클론들로부터 BTV 전사체들의 합성.

T7 플라스미드 클론들은 BsmBI, BsaI, 또는 BpiI로 분해되었고, 그 후에 페놀/클로로포름으로 한 번, 클로로포름으로 한 번 추출되었다. 각각의 분해된 플라스미드는 0.15M 나트륨 아세테이트의 존재 하에서 이소프로판올로 침전되었다. DNA 펠릿(pellet)들은 70% (v/v) 에탄올로 두 번 세척되었고, pH8.0의 10mM 트리스 HCl에서 1μg/μl로 용해되었다. 5' 캡 유사체(analogue)를 가진 전사체들은 mMESSAGE mMACHINE? T7 ULTRA Kit (Ambion)을 사용하여 분해된 T7 플라스미드 클론들로부터 생성되었으며, 안티-역 유사체(anti-reverse analogue)와 rGTP의 비는 4:1로 사용하였다. T7 BTV 전사체들은 페놀/클로로포름으로 한번 추출되고 그 다음 클로로포름으로 한번 추출되었다. 병합되지 않은 rNTPs는 제조자의 지침에 따라 μspin™ G-25 컬럼들 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 분별법에 의해 제거되었다. 상기 T7 BTV 전사체들은 0.15M 나트륨 아세테이트의 존재 하에서 동일 부피의 이소프로판올을 이용하여 침전되었다. RNA (펠릿)들은 70% (v/v) 에탄올에서 두 번 세척되었고, 살균 디에틸피로카보네이트 (DEPC) 처리된 물에 용해되었으며, -80℃에서 저장되었다.

변성 아가로스 겔 전기영동.

정제된 BTV ssRNA는 포름알데히드의 존재하에서 MOPS (morpholinepropanesulfonic acid) 전기영동 완충용액에서 1% 아가로스의 전기영동에 의해 표준 기술[19]을 사용하여 분석되었다.

하나나 두 개로 cDNA 유도된 게놈 단편들을 가지는 BTV 로 회복시키기 위한 배양 세포들의 형질전환.

코어를 전사함으로써 유도된 BTV mRNAs는, 0.1U/μl RNasin? Plus (Promega)의 존재 하에서, Opti-MEM?I에 하나 이상의 T7 BTV 전사체들과 혼합되었다. 상기 RNA 혼합물은 Lipofectamine™ 2000 시약 (Invitrogen)과 혼합 전에 20℃에서 30분 동안 배양되었다(하기 참조). 6 오목부 플레이트(6 well plates)에서의 융합(Confluent) BSR 단층들은 제조자의 지침에 따라 Lipofectamine™ 2000 시약을 사용하여 각 T7 BTV 전사체 0.75μg와 혼합된 1.5μg BTV mRNA로 형질전환되었다. 형질전환후 4시간 경과 시에 배양 배지는 최소 필수 배지 (MEM minimal essential medium), 2% FBS, 1.5% w/v 아가로스형 VII (Sigma)로 구성된6ml 오버레이로 교체되었다. 분석물(Assay)은 플라크들이 나타나도록 35℃, 5% CO2 하에서 72-96시간 동안 배양되었다.

cDNA-유도된 게놈 단편들로부터 BTV 전체를 회복하기 위한 배양된 세포들의 형질전환.

T7 BTV 전사체들의 전체 게놈 세트를 생산하기 위해, 300-400ng의 각 T7 BTV 전사체가 상술한 바와 같이 혼합되었다. BSR 단층들의 형질전환은 상기 기술한 바대로 수행되었다.

형질전환-유도 BTV 플라크들로부터 dsRNA 제조.

각 플라크는 500μl DMEM, 5% FBS에 넣어지고, 200μl가 1.5x10⁶ BSR 감염을 위해 사용되었다. 감염된 세포는 BTV를 증폭하기 위해 35℃, 5% CO₂ 하에서 72-96 시간동안 배양되었다. 바이러스 dsRNA는 이미 기술된 바와 같이[1] 감염된 BSR 세포들로부터 정제되었다.

도입된 게놈 단편들을 포함하는 재조합들용 형질전환 유도된 BTV 플라크들의 스크리닝.

도입된 상기 게놈 단편이 폴리아크릴아미드 겔 상에서 서로 다른 비율로 이동되는 곳에서, 트리스/글리신 완충용액 (pH8.3)에서 9% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 dsRNA의 전기영동으로 스크리닝이 행해졌다. 겔은 브롬산 에티디움으로 30분 동안 후-염색되었다. 이동률 기준에서 스크리닝이 불가능한 곳에서는, RT-PCR (역전사 중합효소 연쇄 반응)과 이어서 제한 엔도뉴클레아제 분해가 재조합물들과 야생형 BTV 사이의 판별을 위해 이용되었다. CDNA는 100ng 열 변성바이러스 dsRNA로부터 표적 구역에 인접한 전방 및 후방 프라이머들을 사용하여 55℃에서 1시간 동안 SuperScript™ III (Invitrogen)로 합성되었다. 표적 구역은 Taq DNA 중합효소를 이용하여 동일한 전방 및 후방 프라이머들로 PCR 증폭되었고 제한 엔도뉴클레아제로 분해되었다.. 결과물들은 트리스-보레이트-EDTA 완충용액에 브롬산 에티디움(ethidium)을 포함하는 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 용해되었다. RT-PCR 결과물들의 서열 분석은 MWG 바이오테크의 수치 판독 서비스(Value Read service)[20]를 사용하는 ABI 3730XL 서열 장치들의 염색 종료자(dye terminator)들을 이용하여 수행되었다.

pNS3Hae 및 pBTV1S8Bgl 의 구성.

PNS3BsmBI가 Weiner et al [17]의 방법에 의해S10_mt_Hae_409F 및 S10_mt_Hae_409R 프라이머들을 사용하는 위치-지정 돌연변위 유발법에 의해 추가 HaeII 부위를 갖도록 변경되었다. 유사하게 야생형 BTV-1 S8 클론이 BglII 부위를 도입하도록 5'BTV1_S8_BglII 및 3'BTV1_S8_BglII 프라이머들을 사용하여 변경되었다. 클론들은 HaeII 또는 BglII 분해에 따라 도입된 부위의 존재 여부를 확인하도록 스크리닝되었고, 발현 카세트는 MWG 바이오테크의 수치 판독 서비스를 사용하여 후천성 돌연변이가 아닌 것을 포함하는 클론들을 구별하기 위해 서열 분석되었다.

프라이머들 .

돌연변이성 프라이머들이 pNS3BsmBI로부터 pNS3Hae를 생성하기 위해 사용되었다:

S10_mt_Hae_409F (5'CTACTAGTGGCTGCTGTGGT A GCGCTGCTGACATCAGTTTG3') 및 S10_mt_Hae_409R (5'CAAACTGATGTCAGCAGCGC T ACCACAGCAGCCACTAGTAG3').

돌연변이성 프라이머들이 야생형 BTV-1 S8 클론으로부터 pBTV1S8Bgl를 생성하기 위해 사용되었다:

5'BTV1_S8_BglII (5'GATTTACCAGGTGTGATGAG A TC T AACTACGATGTTCGTGAAC3') 및 3'BTV1_S8_BglII (5'CGAACATCGTAGTT A GA T CTCATCACACCTGGTAAATCGGGC3').

돌연변이성 염기들에는 밑줄을 그었으며, 제한 부위들은 볼드체로 나타내었다

RT-PCR 증폭 및 BTV-10 단편 10의 서열 분석을 위한 프라이머들: BTV10_S10_238F (5'GGAGAAGGCTGCATTCGCATCG3'), BTV10_S10_654R (5'CTCATCCTCACTGCGTCATTATATGATTGTTTTTTCATCACTTC3'), BTV10_S10_259F (5'GGAGAAGGCTGCATTCGCATCG3'), BTV10_S10_611R (5'CTCATCCTCACTGCGTCATTATATGATTGTTTTTTCATCACTTC3').

BTV-10 단편 5로부터의 RT-PCR 증폭을 위한 프라이머들: BTV10_M5_724F (5'ATGACAGCAGACGTGCTAGAGGCGGCATC3') 및 BTV10_M5_1590R (5'GCGTTCAAGCATTTCGTAAGAAGAG3').

BTV-10 단편 2로부터 RT-PCR 증폭을 위한 프라이머들: BTV10_L2_727F (5'CCGTACGAACGATTTATATCCAGC3') 및 BTV10_L2_1523R (5'TACTAATTCAGAACGCGCGCC3').

BTV-1 단편 8의 RT-PCR 증폭을 위한 프라이머들: NS2_Bam_T7_F (5'CGGGATCCTAATACGACTCACTATAGTTAAAAAATCCTTGAGTCA3') 및 NS2_Bam_R (5'CATGGGATCCGGACCGTCTCCGTAAGTGTAAAATCCCC3').

BTV-1 단편 8 서열분석을 위한 프라이머: BTV1_S8_627R (5'CAGCTTCTCCAATCTGCTGG3').

BTV VP6 또는 NS3 단백질 발현하는 안정한 세포주들 구성.

BTV-10 VP6 및 BTV-1 NS3을 위한 코딩 구역들이 pCAGG/VP6 및 pCAGG/NS3 각각을 획득하기 위해, PCR에 의해 증폭되고 퓨로마이신 선별 가능 플라스미드 pCAGGS/MCS-PM1 [29]로 복제되었다. BSR 세포들은 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen)을 사용하여 pCAGG/VP6 또는 pCAGG/NS3으로 형질전환 되었고, 형질전환 후 48시간이 될 때 트립신 처리되었고, 7.5?g/ml에서 퓨로마이신으로 선택되었다. 분리된 내성 콜로니들이 배양되었고, VP6 또는 NS3 단백질의 발현이 적절한 항체를 사용하여 면역블로팅(immunoblotting)에 의해 검사되었다. VP6 및 NS3 발현주들은 BSR VP6 및 BSR NS3으로 지정되었다.

보완 BSR VP6 또는 BSR NS3 세포주를 이용한, BTV 의 회복.

뉴클레오티드들 301-743 (out of 1049nt)이 외부 구조 결손(out of frame deletion)된 BTV-1 단편 9 클론이 pBTV1 S9delta로 구성되었다. (도 10). 해당 돌연변이 바이러스 BTV1 델타 VP6는 형질전환 동안 야생형 BSR 세포들의 장소에BSR VP6 세포주를 사용하여, 회복되었다. 유사하게, NS3 유전자 센터에 삽입된 eGFP을 가진 BTV-1 단편 10 클론이 pBTV1 S10GFP으로 구성되었다. 해당 GFP 발현 바이러스 BTV1 S10GFP는 형질전환 동안 BSR NS3 세포주를 사용하여, 회복되었다.

BTV1 델타 VP6 및 BTV1 S10GFP 의 운반(passaging).

BTV1 델타 VP6가 BSR VP6 세포주 상에 운반[繼代]되었고, 또한 역가(titre)가 플라크 분석물에 의해 BSR VP6 세포주를 사용하여 결정되었다. BTV1 S10GFP은 BSR NS3 세포주 상에 운반되었고, 또한 역가가 BSR NS3 세포주를 사용하여 플라크 분석물에 의해 결정되었다.

BTV1 델타 VP6 다단계 성장 곡선들.

*BSR 또는 C6/36 세포들은 각각 250μl 의 DMEM 또는 L15 배지의 열 두 개의 오목부(well)가 있는 접시들에서 0.5 MOI에서 감염되었다. 오목부들은 1ml의 PBS로 3회 세척되었고, 1ml 성장 배지에서 표준 성장 조건 하에서 배양되었다. 오목부들은 시간 간격을 두고 수확되었고, 전체 바이러스가 BSR VP6 보완 세포주의 플라크 분석물 역가측정에 의해 결정되었다.

프라이머들 .

EcoT7_S9_F (5'CTAGGAATTCTAATACGACTCACTATAGTTAAAAAATCGCATATGTCAGCTGC3').

EcoBsmB_S9_R (5'CAGTGAATTCGTCTCCGTAAGTGTAAAATCGCCCTACG3')

BTV1S10T7EcoRI (5'CGGAATTCTAATACGACTCACTATAGTTAAAAAGTGTCGCTGCCATGCTA3')

NS3BsmBi rev (5'GTAAGTGTGTAGTATCGCGCACC3')

결과

2개의 혈청형들로부터의 BTV RNAmRNA 로 동시 형질전환한 게놈 단편 재조합 형질전환 단편

증폭 허용 세포들의 형질전환을 통한 코어 유도된 전사체로부터의 감염성 BTV의 회복이 증명되었다[1]. BTV를 위한 역 유전학 시스템(reverse genetics system)을 얻기 위한 목적으로, cDNA 유도된 게놈 단편들을 도입하기 이전에, 하나의 BTV 혈청형으로부터 다른 것으로 게놈 단편들을 도입하는 것은 중간 단계로서 연구되었다. 감염성 코어 유도된코어 전사체들은 전술된 바와 같이 BTV-1과 BTV-9(BTV-9)로부터 준비되었다[1]. 상기 2개의 혈청형들로부터의 전사체들은 동일한 전사 반응에서 동시에 생성되거나, 개별적으로 준비되고 그 다음에 혼합된다. 융합 BSR 단층들은 상기 전사체 혼합물들로 형질전환되었고, 바이러스는 상기 플라크들 결과물로부터 증폭되었다. 상기 dsRNA는 각 증폭된 플라크로부터 정제되었으며 비-변성PAGE 겔들 상에 전기 영동시킴으로써 게놈 단편들의 유래(origin)가 결정된 바, 일부 게놈 단편들이 다른 분리주들(isolates)들로부터 식별되게 하였다. BTV-1과 BTV-9로부터 동시 합성된 전사체들이 사용될 때, 전사체들의 양쪽 부모 소스들로부터의 게놈 단편들[재조합들]을 갖는 자손 바이러스들이 생성되었다(도1A).레인1은 BTV-9처럼 이동하는 단편들의 유전적 배경에서의 BTV-1(BTV-1)의 단편 1과 단편4을 가지는 재조합을 포함한다. 유사하게, 레인2는 BTV-1(BTV-1)의 유전적 배경에서 BTV-9(BTV-9)의 상기 단편 3을 가지는 재조합을 포함한다. 그리고 레인3은 BTV-1의 유전적 배경에서 BTV-9의 단편 1을 가지는 재조합을 포함한다. BTV-1과 BTV-9 전사체들이 개별적으로 준비되어 형질전환 이전에 혼합되었을 때, 재조합 자손 바이러스들 또한 생성되었고, 전사체들의 동시 합성(co-synthesis)은 재조합이 발생하는 데에는 필수적이지 않다는 것을 나타낸다.(도 1B) 이러한 데이터는 바이러스 전사체들의 혼합물에 의한 형질전환이 개별적인 소스로부터의 게놈 단편들을 BTV의 게놈에 도입하기 위한 실행 가능한 전략이라는 것을 증명했다.

상보적 DNA 클론(clone)으로부터 유도된 BTV 단편들의 BTV -1의 게놈 내 도입.

cDNA 클론으로부터 유도된 박테리오파지(T7) 전사체에 의한 게놈 단편의 표적 치환은 그 후에 복제된 서열들(sequences)의 BTV 유전자 내 도입을 위한 모델로서 연구되었다. BTV-10(BTV-10)의 단편10 박테리오파지(T7) 전사체의 BTV-1(BTV-1) 내 도입은 PAGE 겔 상에서, BTV-1과 비교하여 더 빠른 이동을을 가진 BTV-10 단편10에 기초하여 플라크들을 빠르게 스크리닝하도록 선택되었다. BTV-10 단편10 T7 전사체는 상기 정확한 3' 말단 서열을 생성하기 위한 BsmBI 부위와 상기 정확한 5' 말단 서열을 생성하기 위한 T7 프로모터를 가지는 pNS3BsmBI로부터 제조되었다(도2). 코어를 전사하여 제조된 BTV-1 전사체들은 BTV-10 단편10 T7 전사체와 혼합되었고, BSR 단층들을 형질전환하기 위해 사용되었다. T7 전사체와 그에 상응하는 코어 유도 mRNA의 몰비 5:1은 가장 좋은 것으로 확인되었고, 모든 실험들에서 사용되었다. BTV-1의 전사체들에 대한 T7 전사체의 비율을 증가시키면 회복된 플라크들의 총 개수가 감소되었다.(데이터 미도시) 1.5㎍의 코어 유도 전사체와 0.75㎍ T7를 이용하여 여섯 개의 오목부를 가진 접시에서의 형질전환시킨 후, 보통 ~50개의 플라크들이 각 오목부로부터 회복되었다. 바이러스는 이러한 플라크들과 상기 정제된 dsRNA로부터 증폭되었다. 게놈 단편10의 유래는 PAGE 겔 상의 dsRNA 전기영동으로 초기에 결정되었다. BTV-10로부터 더 빠르게 이동하는 단편10을 포함한dsRNA 게놈의 프로파일이 플라크 스크리닝을 생육가능한 선택(viable option)으로 만들기에 충분히 높은 빈도(frequency)로 (15~80%) 얻어졌다.(도 3a) 단편10의 정체가 RT-PCR과 이에 이은 타입1과 타입2 사이에 변동성을 보여주는 영역의 서열 분석을 이용하여 확인되었다(도3B,C,D). 이러한 데이타는 플라스미드 유도된 BTV-10의 단편 10이 생(viable) BTV-1로 회복되는 것을 증명했다.

세포가 두 개의 서로 다른 균주로 감염될 때 BTV는 재조합된 자손 게놈들을 자연적으로 제조한다. 두 개의 바이러스들 사이의 자연적 재조합이 상기 단편 10 재조합물의 근원이 될 가능성을 없애기 위해서, 표지로서 도입된 침묵(silent) Hae II 부위(pNS3Hae)를 포함한 BTV-10의 단편10의 클론이 부위가 지정된 돌연변이 pNS3BsmBI에 의해 만들어졌다. BSR 단층들은 BTV-1의 코어유도된 mRNA들과 상기 도입된 돌연변이를 포함하는 BTV-10 단편10 T7 전사체 의 혼합물에 의해 형질전환되고, pNS3Hae로부터 유도된다. 상기 돌연변이 BTV-10의 단편10의 서열을 포함하는 바이러스의 회복은 PAGE 겔들 상에서의 그것의 증가된 이동률에 의해서 초기에 스크리닝되었다(도4A). 상기 Hae II 부위의 상기 BTV 게놈의 단편10내 도입 여부는 플라크 정제된 바이러스로부터의 dsRNA의 RT-PCR과, 이에 이은 Hae II 분해(도 4B), 그리고 PCR 산물을 서열 분석함으로써 확인되었다 (도4C,D). 단편10은 전장 RT-PCR 산물을 서열 분석함으로써, 그것의 전장 모두 pNS3Hae에 인코딩된 상기 단편과 동일하다는 것이 결정되었다(데이터 미도시).

cDNA 클론들로부터 유도된 두 개의 BTV -10의 단편들의 BTV - 1내 동시 도입.

두 개의 게놈 단편들을 동시 변경 여부의 가능성을 평가하기 위해서 BTV-10으로부터의 단편들(단편2와 단편5)을 암호화하는 외부 캡시트 단백질을 BTV-1의 게놈 단편들의 배경(background)내에 도입하는 것이 연구되었다. 이러한 게놈 단편들을 또 다른 혈청형으로부터의 단편들로 치환하는 것은 바이러스의 혈청형이 변경될 수 있도록 할 것이다. BTV-10의 단편2와 단편5로부터 유도된 T7 전사체는 pVP2BsmBI과 pVP5BsmBI 로부터 개별적으로 준비되고, BTV-1의 각 T7 전사체와 그에 상응하는 코어-유도 전사체의 비율이 5:1로 코어-유도 mRNA들과 혼합되었다. 융합 BSR 세포 단층들은 상기 RNA 혼합물과 회복된 플라크들로부터 제조된 ds RNA로 형질전환되었다. 단편2 및 단편5의 유래는 PAGE겔 상에서의 그들의 이동률에 의해 초기에 평가되었다(도5A). BTV-10으로부터의 단편2와 단편5 둘 다 높은 빈도(20-80%)로 함께 회복되었다. 상기 단편들의 정체는 PT-PCT과 이에 이은 제한 분해에 의해 확인되었다(도5B 및 도5C). 상기 단편2 및 단편5의 상기 완전한 서열은 RT-PCR 증폭과 서열 분석에 의해 BTV-10의 그것으로 확인되었다(데이터 미도시). BTV-10으로부터의 단편 2만 또는 단편 5만 포함하는 어떠한 자손도 발견되지 않았으며(독립적인 3번의 실험으로부터 얻은 19개의 플라크 중 0개), 부모 중 하나로부터의 단편2를 그리고 부모 중 다른 하나로부터의 단편5를 포함하는 바이러스들은 생존력이 줄어들거나, 상기 이중 재조합물들보다 낮은 빈도로 생성된다는 것을 제안한다. 오직 단편2만 또는 오직 단편5만 포함된 어떠한 자손(3개의 독립된 실험들로부터 19에서0[0 out of 19] 플라크들)도 회복되지 않았다. 이러한 현상은 BTV-10으로부터의 단편2 또는 단편5의 BTV-1 내로의 도입이 개별적으로 시도되고 어떠한 재조합 자손들도 회복되지 않았을 때 더욱 지지되었다.(데이터 미도시).

전체가 T7 전사체들로부터 기인한 BTV 의 회복.

상기 위의 방법이 BTV 게놈 단편들을 조작하게 하는 생 역 유전학 시스템(viable reverse genetics system)이기 때문에 야생형 플라크들로부터의 재조합 플라크들을 스크리닝하는 것은 느리게 성장한 돌연변이들의 회복을 방해할 수 있다. 상기 이상적인 역 유전학 시스템은 전체가 T7로부터 유래한 전염성 바이러스를 조립할 수 있게 할 것이다. 각 게놈 단편용 생 클론을 가지는 가능성을 최대화하기 위해서 모든 게놈 단편의 RT-PCR 증폭이 dsRNA 주형들을 위해 개발된 서열과 무관한(sequence independent) FLAC 방법을 사용하여 BTV-1의 dsRNA를 가지고 수행되었다[18]. 각 RT-PCR의 산물은 pUC19내에 복제되었고[22], 각 경우에 대표 분자가 복제되었는지 여부를 결정하기 위해서 각 클론의 완전한 서열이 각 RT-PCR의 생성물의 완전한 서열과 비교되었다(데이터 미도시). 상기 복제된 게놈 단편의 상기 끝단들의 200nt 이내에 어떠한 차이가 있거나 코딩 변화가 있었을 때 대체 클론들이 서열 분석되었다. 일단 10개의 클론들의 하나의 완전한 세트가 얻어진다면 각 게놈 단편은 상기 게놈 단편의 바로 윗쪽(uptsream) T7 프로모터와 바로 아랫쪽 제한효소 부위를 도입하기 위해서 높은 정확도(fidelity)의 KOD 핫스타트 DNA 중합효소를 사용하여 PCR 증폭되었다(도2). 이러한 기능적인 카세트들도 pUC19에 복제되었다. 상기 제한 분해 플라스미드 클론들을 사용하여 합성된 T7 전사체들이 1% 변성의 아가로스 겔 상에 용해되었 때 기대된 크기를 가짐이 확인되었다. (도 6A 및 B)

제한 분해 플라스미드들로부터 만들어진 T7은 중량(weight)에 대해 같은 비율로 혼합되고 융합 BSR 단층들을 형질전환하기 위해 총 3-4ug이 사용되었다. 형질전환된 단층들은 아가로스로 씌워졌으며, 플라크들은 형질전환하고 3-6일 후에 나타났다. (도7A). 플라크들로부터 증폭된 dsRNA는 PAGE 겔들 상의 BTV-1주 바이러스와 비교되어 서로 구별되지 않는다는 것이 발견되었으며, BTV-1가 회복되었다는 것을 확인하였다. (도7B). BTV가 T7 전사체들 돌연변이로부터 유도될 수 있다는 것을 더욱 실체화하기 위해서, 도입된 침묵 Bgl II 부위, 즉 pBTV1S8Bgl을 포함하는 BTV-1 단편8 T7 클론의 돌연변이가 만들어졌다. 플라크들은 상기 단편8 Bgl II 표지 전사체가 상기 야생형 S8 전사체를 치환했던 곳에 T7 전사체들의 하나의 완전한 세트로 형질전환함으로써 회복되었다.(도 8A) 플라크들로부터 증폭된 dsDNA는PAGE 겔들 상의 BTV-1주 바이러스와 비교되는 경우 구별되지 않음이 발견되었다. (도8B). 플라크들은 BSR 세포들의 감염 및 BSR NS2_Bam_T7_F와 NS2_Bam_R 프라이머들(primers)을 사용하여 RT_PCR로 증폭된 상기 S8 단편에 의해 증폭되었다. 상기 RT-PCR 산물이 분해된 것은 Bgl II 부위가 도입되었다는 것을 설명하였다(도9A). 상기 RT-PCR 산물들은 BYV1_S8_627R 프라이머를 사용하여 서열 분석되었으며, 상기 표지 서열이 도입되었다는 것이 확인되었다(도9B). 이러한 데이터는 T7 전사체들의 완전한 게놈 세트(genomic set)로부터 BTV를 회복시키는 것이 가능하고, 이 시스템을 사용하여 생 돌연변이들을 도입하는 것이 가능하다는 것을 증명한다.

상기 BTV1 델타 VP6 바이러스의 회복.

DISC 백신 균주를 생성하기 위해서 상기 필수 단백질 VP6에서의 다량의 프레임 외 결손이 야생형 단편9의 클론 내에서 만들어졌으며 pBTV1 S9delta가 생성되었다(도10). 시험관내(in vitro) 합성 T7 전사체들의 완전한 게놈 세트는 전술한 바와 같이 만들어졌으나, 상기 야생형 단편9 전사체 대신에 상기 결손된 단편9 전사체를 포함하였다. 그에 상응하는 돌연변이 바이러스 즉, BTV-1 델타 VP6가, 형질전환 동안에 야생형 BSR 세포들의 부위에서 상기 BSR VP6 세포주를 사용하여, 회복되었다. BTV CPE(Cytopathic effect)와 구별이 불가능한 CPE가 형질전환하고 5일 후에 형질감염된 오목부에서 관찰되었는 바, 감염성 바이러스가 회복되었다는 것을 나타낸다.(데이터 미도시)

BSR VP6 세포주 내에서의 BTV1 델타 VP6 의 복제물.

상기 BTV1 델타 VP6가 상기 BSR VP6 세포주 내에서 강하게 복제할 지에 대한 여부를 확인하기 위해 야생형 BSR 세포들 내에서 야생형 BTV-1 복제가 비교되었다. BTV1 델타 VP6으로 상기 BSR VP6 세포주를 감염시킴으로써 제조된 CPE는 야생형 BTV-1이 야생형 BSR 세포들을 감염시키 위해 사용되어질 경우에 생성된 것과 동등하였으며, BTV1 델타 VP6의 복제에 큰 결점(gross defect)이 없다는 것을 나타내었다. (도11 참조) BTV1 델타 VP6의 플라크 형성 잠재력은 상기 BSR VP6 세포주를 사용하여 평가되었다(도12 참조). 상기 BSR VP6 세포주는 일반적인 모양의 플라크들이 생성되도록 BTV1 델타 VP6의 상기 성장을 보완하는 것으로 확인되었으며, BTV1 델타 VP6의 상기 일반적인 역가측정(titration)을 가능하게 하였다. BTV1 델타 VP6는 상기 BSR VP6 세포주를 사용하여 야생형 BTV-1에 대한 비교 역가들(titres)로 성장될 수 있다(10⁷감염유발량단위/mL 이상). 이러한 데이터는 상기 BTV1 델타 VP6 바이러스가 상기 보완 BSR VP6 세포주 내에서 효과적으로 복제되었다는 것을 증명한다.

BTV1 델타 VP6 의 게놈 단편9의 특성.

BTV1 델타 VP6은 상기 BSR VP6 세포주에서 증식되었으며, 상기 바이러스 이중 가닥 RNA는 이전에 설명된 바와 같이 추출되고 정제되었다. 상기 BTV1 델타 VP6 게놈에는 상기 야생형 S9 단편이 없으며 더 작은 게놈 단편을 포함하는 바, 상기 야생형 S9단편을 상기 삭제된 S9단편으로 치환하는 것에 상응한다. (도13A). BTV1 델타 VP6로부터의 상기 S9단편(EcoT7_S9_F 및 EcoBsmB_S9_R)의 말단들에서 어닐링(annealing)하는 프라이머들을 이용하여 RT-PCR로 증폭되었고, 650nt의 상기 예측한 산물을 생성하였으며, 동일 프라이머들로 서열 분석되었다. 상기 증폭된 게놈 단편의 상기 관찰된 서열은 상기 pBTV1 S9델타에서의 것과 동일했으며(데이터 미도시), 상기 회복된 바이러스가 제대로 조립되었다는 것을 보여준다.

비- 보완세포주들 상의 BTV1 델타 VP6 성장의 특성.

DISC 백신 균주의 중요한 특성은 그것이 상기 숙주 생체에서 복제 주기 를 완성할 수 없어야 하는 것이다. BTV1 델타 VP6에 결점이 있는지의 여부를 평가하기 위해서, BTV가 용이하게 복제할 수 있는 세포주, 상기 포유 동물 세포주 BSR(BHK-21 서브 클론), 그리고 상기 곤충 세포주 C6/36가 포유 동물과 곤충 숙주들을 위한 대용물로써 사용되었다. 양 세포주들은 BTV1 델타 VP6에 의해 감염되었고, 생산된 총 바이러스는 상기 BSR VP6 보완 세포주를 이용하여 플라크 분석을 이용하여, 72시간 이상, 모니터링되었다. 그러나 야생형 BTV-1은 양쪽 세포주들에서 효율적으로 복제되는 것을 보여주었으나, BTV1 델타 VP6은 어느 쪽 세포주에서도 복제되지 않았다. (도14A 및 도14B). 이 데이터는 상기 VP6 단백질이 상기 보충 세포주에 의해 공급되지 않을 때 상기 VP6 유전자를 파괴함으로써 상기 바이러스가 복제하지 못하도록 하는 것을 보여준다.

BTV1 델타 VP6 의 미-보완 BSR 세포들에서의 바이러스 단백질들의 발현.

면역 반응(immune response)을 유도하기 위해서, 모든 DISC 백신은 상기 숙주 생체에 바이러스 단백질을 발현시켜야 한다. BTV1 델타 VP6가 바이러스 단백질들을 발현시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해서 야생형 BSR 세포들이 상기 포유 동물 숙주용 대용물(proxy)로써 사용되었다. 비-구조 단백질 즉, 바이러스 단백질 발현(expression)을 위한 표지로서 NS2의 검출법이 사용되었다. 야생형 BTV-1를 가지는 상기 BTV-1 델타 VP6 바이러스의 단백질 발현과 비교해서, 상기 NS2 단백질은 BTV1 델타 VP6 감염 BSR과 BTV1 감염 BSR 둘다에서 시간에 따라 증가하는 레벨로 발현되었다(도15). 결손바이러스(defective virus)에 대해 예측된 바와 같이, 상기 BTV1 델타 VP6 바이러스로부터의 단백질 발현 레벨은 야생형 BTV-1의 것보다 낮았다. 상기 데이터는 상기 BTV1 델타 VP6 바이러스가 비-보완 BSR 세포들에서 바이러스 단백질을 발현시킨다는 것을 나타낸다.

표지 항원들이 상기 BTV 게놈에 추가될 수 있음.

상기 BTV 게놈으로부터 상기 표지 항원/펩티드(peptide)를 발현시키는 능력에 의해 DIVA 유연 백신 균주(compliant vaccine strain)가 제조될 수 있다 (DIVA: differentiating infected from vaccinated animals). 보완 세포주들과 조합하여 역 유전학적 접근법을 사용하는 것이 가능하다는 것을 증명하기 위해서 NS3와 eGFP의 프레임 내 융합(in frame fusion)을 포함하는 클론, 즉, pBTV1S10GFP 이 만들어졌다. 시험관내(in vitro) 합성 T7 전사체들의 완전한 유전자 세트(genetic set)는 이전에 설명한 바와 같이 만들어졌으나, 상기 야생형 단편10 전사체 대신에 상기 NS3-eGFP 융합 전사체들을 포함한다. 그에 상응하는 돌연변이 바이러스, 즉 BTV1 S10GFP는 설명된 바와 같이, 형질전환하는 동안에 야생형 BSR 세포들의 부위에서 BSR NS3 보완 세포주를 이용하여 회복되었다. 비-보완 C6/36 세포들이 BTV1 S10GFP로 감염되었을 때 eGPF의 발현이 자외선 하의 그것의 형광에 의해 확인되었다. (데이터 미도시).

BTV1 S10GFP 의 게놈 단편10의 특성.

*BTV1 S10GFP의 게놈에는 상기 야생형 S10 단편이 없고 더 큰 단편을 포함하는 바, S10 GFP 융합에 상응한다. (도16A). BTV1 S10GFP로부터의 상기 S10 단편은 상기 S10 단편의 말단들(BTV1S10T7 및 NS3BsmBi rev)에서 어닐링하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 증폭되었고, 예측된 산물 1446nt 이 증폭되었다(도16B). BTV1 S10GFP로부터의 상기 RT-PCR 산물이 서열 분석되었고 상기 eGFP의 상기 존재가 확인되었는 바(도17 참조), 상기 바이러스가 제대로 구성되었다는 것을 나타낸다.

플라스미드 유도 전사체들로부터의 바이러스 회복의 증가된 효율.

플라스미드 유도 T7 전사체들로부터 상기 BTV 회복의 효율을 증가시키는 두 가지 변화들이 만들어졌다. 이들 변화들 둘 다 상술된 형질전환 방법에서 변경된 것(alteration)이다. 각각 개선점은 플라스미드 유도 전사체들로부터 바이러스를 회복시키는 효율에 있어서 0~10 배 증가시키며, 바이러스를 회복에 있어서 이와 더불어 ~100배 증가시킨다.

변형#1, 이중 형질전환:

상기 세포들은, 상술한 바와 같이, 각 경우에 10개의 플라스미드 유도 전사체들의 완전한 세트 하나로 (한 번 대신) 두 번 형질전환된다. 상기 형질전환들은 18시간간격을 두고 수행되는 바, 바이러스 회복에 있어서 ~10배의 증가를 나타내었는 바, 한번의 형질전환을 사용하는 것 이상이었다. BTV 코어들로부터 만들어진 한가닥의 RNA(single-stranded ribonucleic acid: ssRNA)를 사용할 때(도 18)와 10개의 상보적 DNA 클론들로부터 만들어진 완전한 한 세트의 T7 전사체들을 사용할 때(도 19), 상기 이중 형질전환 방법을 사용하여 바이러스를 회복시키는 것이 증가하는 것이 관찰되었다.

변형#2, 첫 번째 형질전환으로부터 게놈 단편들 2,5,7 및 10의 누락(omission).

상기 세포들은 변형#1에서처럼 두 번 형질전환되지만 게놈단편들2, 5, 7 및 10을 인코딩하는 상기 T7 전사체들은 첫 번째 형질전환으로부터 누락된다. 상기 두 번째 형질전환에는 완전한 한 세트의 10개 전사체들을 사용한다. 상기 형질전환들은 18시간 간격을 두고, 상술한 상기 이중 형질전환을 사용하는 것보다 바이러스 회복에 있어서 ~10 배의 더 큰 증가를 가져 온다(도20).

토의

설명된 상기 두 가지 접근법들은 대안적인 BTV용 역 유전학 시스템을 나타내며, 진정(authentic) 바이러스 전사체들과 T7 전사체들의 혼합물 또는 T7 전사체들의 완전한 게놈 세트를 이용한다. 상기 접근법들은 형질전환 허용 세포들에 사용될 때 BTV 전사체들이 감염성이라는 발견을 확장하고, 5' 말단에 캡 유사체(cap analogue)를 갖는 시험관내 합성 T7 전사체들이 코어 입자들로부터 합성된 전사체들용으로 기능적으로 치환될 수 있다는 것을 나타낸다.

두 개의 개별적인 코어 유도 mRNA 제조물들로부터 비롯된 게놈 단편들을 가지는 자손 바이러스의 회복은 진정 바이러스 전사체들을 혼합함으로써 외인(exogenous) 전사체들을 BTV의 게놈에 도입하는 원리를 확립했다(도1B). 형질전환 후 상기 mRNA의 제조물을 혼합하는 것에 대한 관찰은, 표적 돌연변이들을 상기 BTV 게놈에 도입하기 위해, 코어 유도 mRNA와 조합된 플라스미드 유도 전사체들을, 이용할 수 있는 재조합물을 생성하는 데 효율적이다. BTV-1의 상기 게놈 내에 상기 BTV10의 단편10의 전사체를 도입하는 것은 플라스미드 유도 전사체들을 감염성 BTV에 용이하게 도 입하는 것이 가능할 지의 여부를 판단하기 위해 연구되었다. 상기 모델 시스템은 과량의 T7 전사체를 사용하는 것이 개별적인 플라크 실험(practical)을 스크리닝(15-80%)하게 하는 빈도에서 재조합 플라크들을 생성했다는 것을 보여주었다. PAGE 겔들 상에서의 상기 단편10의 ds RNA의 이동율에 따른 플라크들 초기 스크리닝(도 3)은 상기 RT-PCR 산물을 서열 분석함으로써 확인되었다(도3). 상기 T7 전사체와 진정 바이러스 전사체들 사이에 재조합의 높은 효율은 선별용 표지(selectable marker) 접근법이 필요하지 않다는 것을 의미한다. 상기 Hae II 부위 표지 돌연변이를 BTV의 단편10 내에 도입하는 것은 재조합들이 상기 시험관내 합성 단편10의 T7 전사체로부터 유도되었다는 것을 확인시켜주었다 (도4). 상기 Hae II-함유 단편10은 야생형 BTV-10의 단편10과 비슷한 효율로 회복되었다. 단편10의 재조합 바이러스들은 야생형 BTV-1에 비해 큰 복제 결핍(gross replication deficiency)이 없다는 것을 보여주었다(데이터 미도시). 이것은 BTV-10으로부터 게놈 단편10이 RNA 패키징(packaging)과 복제의 레벨들에서 그리고 NS3/NS3A 단백질 기능에 있어서 배경 BTV-1 게놈 단편들과 기능적으로 양립가능하다는 것을 보여준다.

BTV-1의 항원성 중요 외부 캡시드 단백질들(antigenically important outer capsid proteins)을 BTV-10의 cDNA 클론들의 그것들로 치환하기 위해서 상기 BTV 게놈으로 두 개의 T7 전사체들이 동시에 재조합되는 것이 가능하다는 것이, 과량의 양쪽 T7 전사체들을 이용하여 도시되었다. (도5). 상기 BTV10의 단편2 및 단편5를 포함하는 자손 플라크들은 20~80%의 빈도로 회복되었으나, BTV10으로부터의 단편2만 포함하거나 단편5만을 포함하는 재조합물들은 분리되지 않았다. 이것은 BTV10의 단편2 및 단편5이 함께 그에 상응하는 BTV-1의 게놈 단편들에 대해서 기능적으로 대체될 수 있다는 것을 나타내고, 어떤 레벨에서는 이들 두 개의 혈청형들로부터의 단편2 및 단편5 사이가 양립불가능(incompatibility)하다는 것을 나타낸다. 상기 인코딩된 단백질들, 즉 VP2 및 VP5는 상기 바이러스 입자 표면 상에 면역 선택성 가압(selective pressure)에의 노출 때문에 더욱 변하기 쉽다. 우리의 지지하고 있는 설명은 상기 VP2 및 VP5 단백질들은 동시-진화(co-evolve)하였다는 것과 하나의 혈청형으로부터 상기 3차원 구조의 VP2는 또 다른 혈청형으로부터의 상기 VP5와 양립가능할 필요는 없다는 것이다. 이것은 이전에 보고된, BTV 유사 입자들의 생성에 있어서 관찰되었던 일부 혈청형 조합으로부터의 상기 VP2 및 VP5 단백질들이 양립불가능성과 일치한다[23,24]. RNA 패키징 레벨에서 일부 혈청형 조합물들에서의 단편2 및 단편5의 양립불가능성은 다른 가능성을 의미한다. 또 다른 혈청형으로부터 양 외부 캡시드 단백질들을 동시에 도입하는 것은 일관된 유전적 배경에 기초한 다른 형청형들에도 백신 균주들을 생성하는 것의 가능하게 한다. BTV-1 및 BTV-10의 상기 VP2 단백질들 사이의 높은 아미노산 서열 분산(sequence divergence)은 상기 BTV 비리온(virion)의 보존된 코어 상으로 변화된 VP2+VP5 쌍들을 조립하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.

완전한 한 세트의 T7 전사체들로부터의 BTV-1의 회복은 완전히 정의된 게놈을 가진 바이러스가 cDNA 클론들로부터 회복될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 연구되었다. 상기 10개의 T7 전사체들로 BSR 단층들을 형질전환하는 것은 플라크들의 생성을 유도한다고 알려졌다(도7). 상기 S8단편 내에 Bgl II 표지 돌연변이의 회복은 회복된 상기 바이러스가 상기 형질전환들에 사용된 T7 전사체들로부터 유도되었다는 것을 확인시켜 주었다(도8 및 도9). T7 전사체들로부터만 감염된 BTV의 회복은 캡 유사체가 있는 곳에 합성된 T7 전사체들이 상기 복제 주기의 모든 단계에서의 진정한 바이러스 전사체들과 기능적으로 동등하다는 것을 나타낸다. 만약 비리온(virion)들이 생성되어야 한다면, 상기 T7전사체들은 번역되고, 게놈 패키징하는 동안 선택되어야 하고, 음성 가닥 합성(negative strand synthesis)용 템플릿으로서 작용해야 한다. 게다가 음성 가닥 합성 후에, 그 결과인 ds RNA 게놈 단편은 감염의 다음 라운드에서 전사를 위한 능력이 있어야 한다. T7 전사체들로부터의 BTV의 회복은 동등한 양의 코어 유도 바이러스 전사체들이 사용될 때보다 ~100배 적은 플라크들의 회복을 유도한다. 상기 낮은 효율은 캡 유사체의 존재 하에서 생성되는 T7 전사체들의 일부분만이 상기 5'의 말단에 결합된 상기 캡 유사체를 가진다는 사실로부터 유도할 수 있다. 불완전 전사에 더해, 캡이 벗겨진 전사체들은 RNA 패키징, 음성 가닥 합성 중이나, 또는 다음 라운드 감염에서 전사하는 동안 손상될 수 있다. 중요하게도, 캡이 벗겨진 전사체들은 RIG-I(rabies immune globulin)에 의해 인식되는 항원처리세포(pathogen-associated molecular pattern: PAMP)로 알려졌으며 항바이러스 반응(antiviral response)을 유도하는 5' 삼인산 모이어티(triphosphate moiety)를 가진다[25-28]. 선택적으로, 상기 보전된 완전한 말단 서열들(terminal sequences intact)을 가지는 10개의 ssRNA 분자들을 생성하는 것과 연관된 상기 기술적 이슈들은 T7 전사체들에서 관찰되었던 더 낮은 회복에 기여할 수 있다.

플라스미드 유도 전사체들로부터 기인한 BTV의 회복은 일관된 유전적 배경을 가진 BTV 돌연변이들을 생성하게 한다 야생형 플라크들 중 원하는 돌연변이를 위해 플라크들을 선별하는 것이 필요하지 않기 때문에, 이러한 접근법은 저속 복제 표현성을 가진다고 예측되는 회복 돌연변이들에 유용할 것이다. 그러한 경우에서 더 느리게 복제하는 돌연변이들이 회복하는 것을 방해할 수 있는 더 빠르게 복제하는 바이러스 배경은 없을 것이다. 이러한 접근법은 BTV의 일차적/낮은 운반 분리주들을 회복하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 균주들이 세포 배양 조건들에 대해 점차 변화되는 것을 방지한다. 하나의 플라스미드 유도 게놈 단편을 포함하는 재조합물들의 회복은 단일 클론이나 PCR 산물의 구성을 필요로 하며 모든 게놈 단편에도 적용할 수 있다. 이러한 단일구성 접근법은 10개의 클론들의 하나의 완전한 세트를 구성할 필요없이 개별적인 바이러스 유전자들을 연구하는데 사용될 수 있다. 레오바이러스과에 속하는 것들이 재조합물과 T7 둘다 공통적인 복제 전략을 가지기 때문에, 역 유전학적 접근법들만이 역 유전학 시스템이 없는 광범위한 바이러스에 적용될 수 있을 것이다. 두 가지 접근법들에 있어서 시험관내 합성 T7 전사체들을 사용하는 것은 재조합 폭스바이러스(recombinant poxvirus)로 감염시킴으로써 T7 RNA 중합효소를 공급해야 하는 필요성을 없애며, 이는 회복되고 있는 바이러스의 복제를 방해할 수 있다.

*대체 역 유전학 전략들은 상기 다른 레오바이러스과의 다른 속들(genera)을 위해 성공적으로 사용되었다[2-4]. 첫 번째 유전자 재조합 기술은 동물의 오르토레오바이러스들(Orthoreoviruses)을 위한 보조 바이러스 시스템(helper virus system)이었다[3]. 이 접근법은 증폭 허용 세포들(permissive cells)의 레오바이러스 감염과 바이러스 dsRNA, 바이러스 mRNA, T7 전사체, 및 시험관 내 번역된 바이러스 mRNA로 형질전환하는 것을 결합하였다. 또 다른 보조 바이러스 접근법은 로타바이러스(rotavirus) 외부 캡시드 단백질을 또 다른 혈청형으로부터의 해당 단백질로 치환하게 하였 [2].상기 도입 게놈 단편의 발현은 생채내(in vivo)에서 재조합(recombinant) T7 백시니아(vaccinia) 바이러스 시스템에 의해서 구동되고, 동등한 보조 바이러스 단백질에 대한 선택성 가압이 항체 선택(antibody selection)을 사용하여 제공된다. 가장 최근의 포유동물 오르토레오바이러스들은 음성 가닥 바이러스들과 함께 첫 번째로 사용된 상기 T7 구동 시스템과 유사한 플라스미드에 기초한 시스템을 사용하여 회복되었다[4]. 이러한 경우에는 10개의 모든 게놈 단편들의 발현이 재조합(recombinant) T7 백시니아(vaccinia) 바이러스 시스템에 의해 생채 내에서 구동되었다. 상기 성공적인 모든 역 유전학적 전략들은 공통적으로 몇 가지 주목할만한 특징들을 가진다. 1) cDNA 클론들로부터 유도된 상기 게놈 단편들은 상기 형질전환된 세포에 메시지 감지 전사체(message sense transcript)들로서 제공된다. 2) 사용된 상기 cDNA 유도 전사체들은 그에 상응하는 바이러스 전사체로써 동일한 5' 말단과 3' 말단 서열들을 가진다. 상기 5'말단은 적절한 서열을 가지는 T7 프로모터를 사용하여 생성되고, 상기 3'말단은 시험관내 제한 효소 부위 또는 생체 내 간염 델타 리보자임(Hepatitis Delta Rybozyme)를 사용하여 생성된다. 레오바이러스과에 속하는 것에서 모든 게놈 단편들은 기능들이 밝혀지고 있는 그들의 맨끝의 5'과 3'의 말단들에 짧게 보존된 서열들을 가진다. 3) 진정 바이러스 전사체들처럼 상기 cDNA 유도 전사체들은, 시험관내 캡 유사체로 또는 생채 내서 백시니아 T7 RNA 중합효소 재조합과 연관된 크로스 캡핑 활동(cross-capping activity)을 통해, 캡이 씌워진다[13]. 감염성 바이러스가 회복하기 위해서 유전자 발현이 자손 코어 입자들의 조립을 충분히 허용해야 하는 바, 그들 스스로 전사적으로 활성이고 유전자 발현의 증폭을 이끌어야 한다. 이러한 불완전한 비리온들을 조립하기 위해서는 높은 수준의 유전자 발현이 필요하고 cDNA 유도 전사체들의 5' 말단에서의 캡 구조의 존재 없이는 그들의 안정성과 번역의 레벨이 많이 감소될 것이다 [14].

바이러스 유전자가 부족한 DISC 바이러스들은 보완 세포주와 상기 BTV 유전자 제조합 기술의 결합을 사용하여 생성되었다. 회복된 상기 바이러스들은 BTV의 DISC 바이러스 백신 균주를 위한 이하의 기준(criteria)을 따른다: 1) 비-보완 포유 동물 세포들에서 바이러스 단백질의 발현(도15); 2) 비-보완 동물 또는 곤충 세포주들에 생성되는 감지할 수 없는 감염성 바이러스 (도14); 그리고 3) 그에 상응하는 보완 세포주를 강력하게 복제하는 것(도12). 이에 더해, 펩티드들 또는 이종 단백질들(foreign proteins)을 발현하기 위한 능력은 상기 NS3 개방 번역 프레임(open reading frame)내 상기 eGFP 단백질의 삽입을 사용하여 증명되었다. 이는 감지될 수 있는 면역학적 표지(immunological marker)를 포함하는 백신 균주들을 생성함으로써 감염된 동물들로부터 백신이 접종된 동물들(vaccinated animals)을 구별할 수 있게 한다., 즉 상기 DIVA 개념(감염된 동물들과 백신 접종 동물들을 구별하는 것)이다.

상기 T7 또는 바이러스 ssRNA는 레오바이러스과에 속하는 것들의 복제 주기에서 두 가지 기능들을 가진다 1)상기 바이러스 단백질들을 생성하기 위해 번역되는 것 그리고 2) 새로운 이중 가닥의 게놈 단편들의 합성을 위한 복제 중간물들로서 작용하는 것. 일반적인 감염과 달리 새로운 전사체들이 계속적으로 감염 코어 입자로부터 합성되지 않기 때문에 하나의 세포에 있어서 구조(rescue)가 성공적이기 위해서, 단일의 형질전환을 사용하며, 상기 전사체들의 일부분이 자손 바이러스 입자를 조립할 때 복제되고 패키지될 수 있도록 남아있어야 한다. 바이러스 회복의 효율성에 있어서 제한적인 단계가 있을 것으로 예측되는바, 일반적인 감염과 달리 새로운 전사체가 감염 코어 입자들로부터 지속적으로 합성되지는 않는다. 형태발생(morphogenesis)이 패키징 단계에 도달되었다고 예측된 시점에, 패키징을 위한 추가 전사체를 도입하도록 두 번째 형질전환이 수행되었다. 바이러스의 회복에서의 예상된 증가분은 바이러스 ss RNA 또는 T7 전사체들을 사용하여 관찰되고, ~10 배로 관찰되었다.

회복의 효율을 더 증가시키기 위해서, 형태발생이 상기 캡시드의 내층의 조립 이상으로 진행될 수 없도록 게놈 단편들이 상기 첫 번째 형질전환으로부터 누락되었다. 이 접근법은 패키징이 발생하도록 예측되는 단계에 조립을 저지하기 위해 채택되었다. 누락된 단편들을 위한 상기 게놈 단편 코딩 배치들은: 단편2가 VP2를 인코딩하고(외부 캡시드), 단편5가 VP5를 인코딩하고(외부 캡시드), 단편7이 VP7을 인코딩하고(캡시드의 중간 층), 그리고 단편10이 NS3을 인코딩하는 것(바이러스 배출구(egress)에 필요함)이다. 단편2, 5, 7 및 10을 누락한 결과 상기 3중층 캡시드의 외부층과 중간층이 합성되지 않으며, 상기 배출구 단백질 NS3이 존재하지 않는다. 전사체들의 하나의 완전한 세트가 상기 두 번째 형질전환에서 제공되어질 때 이러한 방법으로 형태발생을 저지함으로써 ~10배 이상 바이러스의 회복을 증가시켰다는 것이 알려졌다.(도20)

상기 형질전환 프로토콜에로의 이러한 두 가지 개선점들은 단일 형질전환을 사용함으로써 바이러스 회복을 ~100배 증가시키고, 야생형 또는 돌연변이 바이러스들을 안정적으로 회복시킨다. 이러한 개선점들은 상기 보완 세포주들을 사용하여 내재적으로 결손있는 바이러스들을 안정적으로 회복시켰다.

역유전학은, 다른 바이러스들과 마찬가지로, 몇 가지 연구분야들에서 BTV의 이해에 기여할 수 있다. 각각의 시스템을 사용하는 BTV의 상기 게놈내에서 특정한 돌연변이들을 회복하기 위한 능력은 관련된 오르비바이러스들과 BTV들의 분자 해체(molecular dissection)를 위한 새로운 도구를 제공할 뿐만아니라 이러한 바이러스들에 독성약화백신들(attenuated vaccines)을 명확하게 발전시킬 기회를 제공한다. BTV의 단백질 기능의 연구는 거의 재조합 단백질 발현에 기초된다. BTV의 상기 유전자들 내에 특정한 돌연변이들을 도입하는 능력은 복제 바이러스에서 상기 바이러스 단백질들의 기능들에 대한 우리의 더욱 이해하게 할 것이고, 이미 알려진 기능들의 확증(corroboration)하게 할 것이다. 상기 복제, 패키징, 그리고 오르비바이러스(orbivirus) 게놈들의 발현을 조절하는 상기 시스 작용 RNA(cis-acting RNA) 서열들은 매핑되지 않은 상태이며, 이해하기가 어렵다. 역유전학은 이러한 조절 서열(regulatory)을 매핑(mapping)할 수 있게 하고, 그들이 어떻게 작용하는지에 대한 연구를 도울 수 있다. 외부 캡시드 단백질들의 치환은 공통적인 유전적 배경에 기초한 다른 혈청형들에 백신 균주들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 게다가 관련된 오르비바이러스들과 BTV의 병원성(pathogenicity)의 결정인자들(determinants)을 확인하는 것이 가능할 것이고, 독성약화백신 균주들을 증폭시킬 수 있다.

<110> London School of Hygiene & Tropical Medicine <120> Method for Producing Vaccinal Viral Strain of a Virus of the Reoviridae Family <130> P522720PCT <150> US 60/989,991 <151> 2007-11-26 <150> US 61/058,716 <151> 2008-06-04 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 1 gagttaatta agcggccgca gtttagaatc ctcagaggtc 40 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 2 ctactagtgg ctgctgtggt agcgctgctg acatcagttt g 41 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 3 caaactgatg tcagcagcgc taccacagca gccactagta g 41 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 4 gatttaccag gtgtgatgag atctaactac gatgttcgtg aac 43 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 5 cgaacatcgt agttagatct catcacacct ggtaaatcgg gc 42 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 6 ggagaaggct gcattcgcat cg 22 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 7 ctcatcctca ctgcgtcatt atatgattgt tttttcatca cttc 44 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 8 atgacagcag acgtgctaga ggcggcatc 29 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 9 gcgttcaagc atttcgtaag aagag 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 10 ccgtacgaac gatttatatc cagc 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 11 tactaattca gaacgcgcgc c 21 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 12 cgggatccta atacgactca ctatagttaa aaaatccttg agtca 45 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 13 catgggatcc ggaccgtctc cgtaagtgta aaatcccc 38 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 14 cagcttctcc aatctgctgg 20 <210> 15 <211> 53 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 15 ctaggaattc taatacgact cactatagtt aaaaaatcgc atatgtcagc tgc 53 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 16 cagtgaattc gtctccgtaa gtgtaaaatc gccctacg 38 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 17 cggaattcta atacgactca ctatagttaa aaagtgtcgc tgccatgcta 50 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 18 gtaagtgtgt agtatcgcgc acc 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 19 taatacgact cactatagtt aaa 23 <210> 20 <211> 13 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 20 acttactgag acg 13 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 21 gtggctgctg tggttgcgct gctgacatca 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 22 atagcggcgg ttgttgctct gttgacatca 30 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 23 agtggctgct gtggttgcgc tgctgacatc a 31 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 24 agtggctgct gtggtagcgc tgctgacatc a 31 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Bluetongue virus <400> 25 caggtgtgat gagatctaac tacgatgt 28

Claims

블루텅 바이러스의 게놈으로부터 유도된 분리된 바이러스 ssRNA로, 상기 ssRNA는 필수 유전자의 기능을 파괴하는 돌연변이를 포함하고, 상기 필수 유전자는 VP6 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하며,
상기 돌연변이는 VP6 단백질을 인코딩하는 블루텅 바이러스 유전자의 뉴클레오티드 301~743의 결손을 포함하는 분리된 바이러스 ssRNA.
삭제
삭제
VP6 단백질을 인코딩하는 블루텅 바이러스의 필수 유전자를 발현하는 세포로서,
제1항의 ssRNA로부터 백신용 바이러스 균주를 복제할 수 있게 하며,
제1항의 ssRNA로 감염된 세포.
제1항에 따른 분리된 바이러스 ssRNA를 포함하는 백신용 바이러스 균주.
약학적으로 허용가능한 운반체, 항원보강제 또는 매개체와 조합된 제5항의 백신용 바이러스 균주를 포함하는, 백신 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
약학적으로 허용가능한 운반체, 항원보강제 또는 매개체와 조합된 제1항의 분리된 바이러스ssRNA를 포함하는, 백신 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
백신 치료에 사용하기 위한 제5항의 백신용 바이러스 균주.
백신 치료에 사용하기 위한 제1항의 분리된 바이러스 ssRNA.
블루텅 바이러스에 대항하여 동물에 백신을 접종하는데 사용하기 위한 제5항의 백신용 바이러스 균주.
블루텅 바이러스에 대항하여 동물에 백신을 접종하는데 사용하기 위한 제1항의 분리된 바이러스 ssRNA.
제10항에 있어서,
상기 동물은 말, 당나귀, 노새 또는 얼룩말로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신용 바이러스 균주.
제11항에 있어서,
상기 동물은 말, 당나귀, 노새 또는 얼룩말로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 ssRNA.
블루텅 바이러스에 대항하여 인간을 제외한 동물에 백신을 접종하는 방법에 있어서,
상기 방법은 제5항에 따른 백신용 바이러스 균주의 유효량을 상기 동물에게 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신을 접종하는 방법.
블루텅 바이러스에 대항하여 인간을 제외한 동물에 백신을 접종하는 방법에 있어서,
상기 방법은 제1항에 따른 분리된 바이러스 ssRNA의 유효량을 상기 동물에게 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신을 접종하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 인간을 제외한 동물은 소, 양, 염소, 버팔로, 단봉낙타 및 영양 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신을 접종하는 방법.
제15항에 있어서,
상기 인간을 제외한 동물은 소, 양, 염소, 버팔로, 단봉낙타 및 영양 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신을 접종하는 방법.
제1항의 분리된 ssRNA와 상기 ssRNA에서 돌연변이된 상기 필수 유전자를 발현하는 세포를 포함하는 키트.